ES2220958T3

ES2220958T3 - Preparados enzimaticos estabilizados con una sal.

Info

Publication number: ES2220958T3
Application number: ES96202071T
Authority: ES
Inventors: Rudolf Carolus Maria Barendse; Hans-Peter Harz; Roland Jurgen Betz
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2016-07-24
Also published as: US5972669A; EP0758018A1; DE69632669T2; PL319347A1; CA2182236A1; CN1159208A; PT758018E; JPH09154576A; AU703007B2; EP0758018B1; AU6073296A; SK40697A3; CZ87497A3; US5827709A; DE69632669D1; NZ299071A; WO1997005245A1; ATE268817T1; DK0758018T3; MX9702146A

Abstract

LA PRESENTA INVENCION DESCRIBE METODOS PARA MEJORAR EL PROCESAMIENTO Y LA ESTABILIDAD AL ALMACENAMIENTO DE PREPARACIONES ENZIMATICAS SECAS. CON ESTE FIN, SE DISUELVE UNA SAL INORGANICA, P.EJ. MGSO{SUB,4}, EN UNA SOLUCION QUE CONTIENE ENZIMA, LA CUAL SE SOMETE POSTERIORMENTE A SECADO, UTILIZANDO P.EJ. SECADO POR PULVERIZACION. LA ADICION DE SAL NO SOLO PROVOCA EL INCREMENTO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA, SINO QUE LA ESTABILIDAD DE PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LA COMPOSICION SOLIDA OBTENIDA, QUE CONTIENE LA ENZIMA Y LA SAL, MEJORAN EN LO REFERENTE A ACTIVIDAD ENZIMATICA. LA INVENCION DESCRIBE TAMBIEN COMPOSICIONES SOLIDAS QUE COMPRENDEN ENZIMAS Y SALES INORGANICAS.

Description

Preparados enzimáticos estabilizados con una sal.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la conversión de soluciones enzimáticas a preparados enzimáticos sólidos con características mejoradas de rendimiento en el secado y estabilidad en su almacenamiento y tratamiento.

Antecedentes de la invención

La amplitud del campo de aplicación y por tanto la importancia de las enzimas en la tecnología moderna se está incrementando de manera rápida. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes de estos compuestos es su aptitud a la desactivación, causada no sólo por valores extremos de temperatura, pH y similares durante el tratamiento, sino que también se presenta de manera espontánea tras el almacenamiento prolongado bajo condiciones por otro lado normales.

Los métodos frecuentemente aplicados y conocidos en la técnica para disminuir este problema incluyen el uso de una variedad de aditivos reivindicados por estabilizar enzimas en solución o la conversión de la solución enzimática a una formulación seca por medio de liofilización, secado por aspersión u otras técnicas adecuadas para esta finalidad. La conversión de una enzima en solución a una forma seca suele ser obligatoria cuando la aplicación así lo demanda (por ejemplo, una mezcla conveniente con otros componentes secos).

Aunque el secado es por si mismo una herramienta valiosa a la hora de mejorar la estabilidad en almacenamiento de las enzimas, la propia etapa del proceso suele causar una pérdida importante de actividad y el producto final es todavía susceptible a la inactivación. Esta pérdida de actividad durante el almacenamiento o tratamiento depende en gran medida del contenido en humedad del preparado, y, por tanto, éste ha de ser controlado de la manera más rigurosa para mantener la estabilidad del producto tan valioso. Esto incluye también una severa reducción a la hora de seleccionar los compuestos adecuados para incorporarse en el producto enzimático final por motivos de normalización o por otros fines.

En diversos casos, la enzima seca está destinada a aplicaciones en donde la enzima ha de ser incorporada en un producto en el cual el contenido en humedad no puede ser controlado de manera tan estricta. En estos casos, la estabilidad de la enzima se reduce entonces de forma severa.

Se han realizado varias invenciones en el campo de la estabilización de enzimas contra las pérdidas durante el secado y posterior almacenamiento y manipulación.

La mayoría de estas invenciones (tal como las presentadas en las patentes (solicitudes) US 3 515 642, EP 0 501 375 A1 y WO 91/14773 están relacionadas con la adición de carbohidratos y, más específicamente, componentes de azúcares o polioles al concentrado enzimático.

También se conoce en la técnica la inclusión de componentes en la formulación con el fin de producir un producto vítreo a la temperatura de almacenamiento, mejorando así la estabilidad de la enzima (EP 0 383 569 A2).

Otro enfoque consiste en la adición a la formulación de uno o varios componentes capaces de ligar humedad. Esto reducirá la actividad en agua del preparado final o evitará temporalmente la interacción del agua que penetra desde el entorno circundante con la propia enzima.

También se conoce el uso de sales orgánicas e inorgánicas como auxiliares del tratamiento (por ejemplo, para mejorar el comportamiento de flujo del producto) o agentes aportadores de volumen/normalizantes. Sin embargo, en la técnica no parece haberse descrito el uso de sales inorgánicas para mejorar la estabilidad de preparados enzimáticos secos durante su tratamiento o almacenamiento. En algunos casos, incluso se ha mencionado de manera específica la desestabilización de la enzima como consecuencia de la adición de la sal (véase, por ejemplo, Mikhailova et al. 1989, Vestsi Akad Navuk BSSR, Ser Biyal Navuk 6: 62-65).

La EP 0 522 269 A2 describe la adición de carbonato cálcico insoluble a una solución enzimática que ha de ser secada por aspersión.

La WO 92/11347 describe la incorporación, en granulados que contienen enzimas, de sales inorgánicas solubles en agua. Las sales inorgánicas solubles en agua deben ser seleccionadas de manera que las mismas no afecten a la estabilidad en almacenamiento del granulado enzimático. La WO 92/11347 proporciona varias sales de sodio y potasio como adecuadas para esta finalidad. Sin embargo, las sales inorgánicas solubles en agua se añaden a las enzimas en forma seca antes de su granulación por extrusión.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un método para la producción de formulaciones enzimáticas sólidas con características mejoradas de rendimiento en el secado y de almacenamiento y tratamiento de los productos resultantes. Esto se consigue mediante el secado de una solución que contiene al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la concentración de la sal inorgánica es de al menos 5% (p/p) del peso de la enzima o de las enzimas, y en donde la sal inorgánica comprende un catión divalente seleccionado del grupo consistente en zinc y magnesio. Más preferentemente, la sal inorgánica es sulfato de zinc o de magnesio. La solución que comprende al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua puede ser preparada antes del secado. Para este fin se puede emplear también una combinación de sales, así como una combinación de enzimas. El zinc y el magnesio proporcionan mejores características de estabilidad en almacenamiento y en el tratamiento. Se prefiere el sulfato como anión debido a que el mismo proporciona el mejor rendimiento en el secado.

La invención proporciona también formulaciones enzimáticas sólidas obtenidas mediante la preparación de una solución que comprende al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la concentración de la sal inorgánica es de al menos 5% del peso de la enzima o de las enzimas, y en donde la sal inorgánica comprende un catión divalente seleccionado del grupo consistente en zinc y magnesio, más preferentemente una sal inorgánica de sulfato de zinc o de magnesio, y posterior secado de la solución.

En el método de la invención, la sal está presente mientras la enzima se encuentra todavía en solución, es decir, antes del secado. No sólo esto da lugar a un mayor rendimiento durante el secado, sino que también se mejora la estabilidad en almacenamiento de los preparados enzimáticos secos obtenidos, así como su estabilidad en el tratamiento. La estabilidad en el tratamiento se entiende aquí como la estabilidad del preparado enzimático durante cualquier manipulación del preparado enzimático distinta del almacenamiento, tal como, por ejemplo, la mezcla del preparado enzimático con otros componentes o durante la aplicación de la enzima.

El secado de la solución que contiene la enzima y la sal se traducirá en una composición sólida que es homogénea con respecto a la distribución de la enzima y de la sal.

El secado de la solución que contiene enzima y sal se puede conseguir por cualquier método de secado disponible para el experto en la materia, tal como secado por aspersión, liofilización, secado en vacío, secado en lecho fluido y secado por microondas. El secado de la solución de enzima-sal se puede combinar también con métodos de granulación que comprenden, por ejemplo, el uso de un lecho fluido o de un secador de múltiples etapas (MSD). En el caso de utilizar estos métodos de granulación, el experto en la materia entenderá que la composición obtenida no es por necesidad completamente homogénea. Las partículas obtenidas consistirán normalmente en aglomerados de partículas homogéneas o consistirán en partículas revestidas con un núcleo homogéneo, con un revestimiento homogéneo y/o combinaciones de ambos. En cualquier caso, existirá una interdispersión homogénea de la enzima y de la sal entre sí.

Los ejemplos específicos de la invención demuestran que el efecto estabilizante de la sal aumenta a medida que lo hace la dosificación de la sal a la solución de enzima, hasta que, en un determinado punto, el incremento adicional de la dosis de sal deja ya de producir mejora alguna en la estabilidad de la enzima. Por este motivo, a la solución de enzima se añade al menos 5%, con preferencia al menos 15%, más preferentemente al menos 30%, todavía más preferentemente al menos 60% y con suma preferencia al menos 90% (p/p) de sal, en donde la dosificación de la sal se expresa como el porcentaje en peso (p/p) de sal añadida basado en el peso de la enzima en solución, sin incluir el peso del agua de cristalización de los cristales de sal.

Aunque no existe un límite superior en cuanto a la adición de la sal desde el punto de vista de la invención, surge un límite físico a partir de la solubilidad máxima de la sal en el concentrado enzimático. Unicamente se pueden conseguir entonces relaciones mayores de sal/enzima mediante dilución de la solución enzimática o mediante el uso de una combinación de sales.

Otro punto a considerar podría ser la dosificación a la cual se "salifica" la enzima, dependiendo esta tanto del tipo de sal como de la enzima específica considerada. No quedan excluidas de la invención las combinaciones de sales y enzimas que dan lugar al fenómeno de "salificación".

La invención se puede emplear con enzimas o mezclas de enzimas de cualquier tipo, incluyendo, pero no de forma limitativa, fitasas o otras fosfatasas, amilasas, proteasas, lipasas y fosfolipasas, celulasas tal como \beta-glucanasas, pectinasas, hemicelulasas tales como xilanasas y otras enzimas degradantes de la pared celular de las plantas, esterasas, cuajos tales como proteasas fúngicas o quimosina, y \beta-galactosidasas. Ha de entenderse que siempre que se haga referencia a la enzima o a una enzima, quedan incluidas también en estos términos las mezclas de enzimas, independientemente de si dichas mezclas se pueden obtener directamente en una sola fermentación o mediante la mezcla de enzimas obtenibles en diferentes fermentaciones; e incluyendo además enzimas que pueden obtenerse por fermentación de organismos recombinantes. La enzima se elige preferentemente del grupo que comprende fitasas fúngicas, hemicelulasas fúngicas, celulasas fúngicas y proteasas bacterianas. Más preferentemente, la enzima se elige del grupo que comprende fitasas y endo-xilanasas derivables de un hongo que pertenece al Grupo Aspergillus niger tal como es definido por Raper y Fennell (1965, en: The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344), \beta-glucanasas y endo-xilanasas derivables de una especie de Trichoderma, y proteasas derivables de especies de Bacillus.

La invención describe también composiciones sólidas que comprenden al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la dosificación de la sal inorgánica es de al menos 5% (p/p) del peso de la enzima o de las enzimas y en donde la sal inorgánica es una sal de un catión divalente seleccionado del grupo consistente en zinc y magnesio. Más preferentemente, la sal inorgánica es sulfato de zinc o de magnesio.

La dosificación de la sal inorgánica en la composición es de al menos 5% (p/p), con preferencia al menos 15%, más preferentemente al menos 30%, todavía más preferentemente al menos 60% y con suma preferencia al menos 90% del peso de la enzima o de las enzimas. Las enzimas que pueden ser preparadas como composiciones de acuerdo con la invención incluyen todas aquellas mencionadas anteriormente, en particular aquellas citadas como preferidas.

En otra modalidad de la invención, las composiciones sólidas anteriormente descritas se emplean para preparar un alimento para animales. La preparación de dicho alimento para animales suele incluir una etapa de granulación durante la cual se puede perder una cantidad importante de la actividad enzimática. El uso de la composición sólida de la invención reduce tales pérdidas de actividad enzimática durante la granulación. Habitualmente, una composición de alimento para animales comprende materias primas de origen vegetal que proporcionan energía y metabolitos para el crecimiento. El alimento es suplementado con minerales y vitaminas y es común añadir grasa animal y proteínas animales al alimento.

Según otra modalidad de la invención, se describe una composición sólida que comprende una fitasa con una estabilidad mejorada en almacenamiento. La estabilidad en almacenamiento de la fitasa en esta composición sólida es tal que, tras el almacenamiento durante 8 semanas, preferentemente en un recipiente cerrado, a 30ºC, se pierde menos del 35%, con preferencia menos del 20%, más preferentemente menos del 10% y con suma preferencia menos del 5% de la actividad inicial de la fitasa. Las composiciones de fitasa pueden comprender un vehículo orgánico o inorgánico fisiológicamente aceptable (por ejemplo, vehículos a base de cereales tales como moyuelo de trigo, harina de trigo, vainas de arroz y similares, otros vehículos orgánicos tales como tapioca, almidón de patata, caña de azúcar y similares, vehículos inorgánicos tales como cloruro sódico, sulfato potásico, sílice y similares), en combinación con la enzima fitasa, combinada posiblemente con otras enzimas por motivos de funcionalidad o conveniencia, y agentes para mejorar aún más la apariencia o funcionalidad del producto con respecto al color, comportamiento de flujo, estabilidad física, química o microbiana, olor, sabor, formación de polvo y similares. El experto en la materia entenderá que pueden prepararse composiciones similares para enzimas alimentarias distintas de la fitasa.

Para ilustrar la invención, se ofrecen los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1

Un concentrado de fitasa fúngica (como el producido y suministrado por Gist-brocades) que contiene aproximadamente 11% en peso de enzima, se dividió en dos porciones. A una de las porciones se añadieron 240 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O. Después de la disolución de sal, lo que dio lugar a una solución limpia, ambas soluciones se secaron por aspersión empleando un secador por aspersión de escala de laboratorio Buchi con una temperatura de entrada de 130ºC y una temperatura de salida de 85ºC.

Los polvos resultantes se mezclaron con moyuelo de trigo en una relación en peso de 1:10 para neutralizar cualquier diferencia en la actividad en agua entre los preparados. Después de alcanzar el equilibrio, esto fue confirmado por medición de las actividades en agua, las cuales resultaron ser ambas de 0,45 a temperatura ambiente.

Los productos finales se guardaron entonces a 30ºC en jarras cerradas y, después del almacenamiento, los productos se analizaron de manera simultánea respecto a la actividad enzimática. Después de ocho semanas de almacenamiento, la pérdida de actividad del preparado sin la adición de sal ascendió a 35%, contra una pérdida de sólo 5% para el preparado con la adición de sal.

Ejemplo 2

En porciones separadas de un concentrado de una proteasa alcalina derivada de Bacillus (como el producido y suministrado por Genencor International Inc.) que contiene aproximadamente 12% en peso de proteína enzimática, se disolvieron 0 y 85 g/l de MgSO_{4}\cdot0H_{2}O. Estos concentrados fueron revestidos entonces sobre un vehículo de sulfato sódico empleando un aparato de revestimiento en lecho fluido de escala de laboratorio Niro STREA-1. Las pérdidas de actividad en esta etapa de tratamiento fueron de 28% y 14% respectivamente.

Las partículas resultantes se mezclaron con un exceso de detergente en polvo comercial conteniendo agentes blanqueantes, destinado al mercado europeo, y se incubaron en jarras abiertas a 35ºC y una humedad relativa del 55%. Después de 6 semanas de almacenamiento, la actividad enzimática remanente de los preparados fue del 42% con adición de sal y de sólo 30% sin adición de sal.

Ejemplo 3

Se disolvieron 240 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O en una porción de un concentrado enzimático derivado de Trichoderma (como el conocido y suministrado por Gist-brocades con un contenido total en materia seca de 25% en peso, que contiene enzimas de \beta-glucanasa y endo-xilanasa. La solución resultante y el concentrado original se revistieron por separado sobre un vehículo de sulfato sódico en un aparato de revestimiento en lecho fluido Glatt WSG-60. Las pérdidas de actividad durante el tratamiento fueron del 5% y 10% para la \beta-glucanasa y del 10% y 25% para la endoxilanasa con y sin adición de sal, respectivamente.

Las partículas resultantes se incubaron a 30ºC y una humedad relativa del 62%. Después de 12 semanas de almacenamiento, las pérdidas de actividad para la \beta-glucanasa fueron del 10% e indetectables y para la endo-xilanasa las pérdidas de actividad fueron del 10% y 25%, para cada enzima con y sin adición de sal, respectivamente.

Los granulados se incorporaron también en una mezcla de alimento y se sometieron a un proceso de granulación a escala piloto a una temperatura de 70ºC. Las pérdidas de actividad de \beta-glucanasa ascendieron a 46% y 59% y las pérdidas de actividad de endo-xilanasa fueron del 37% y 66% con y sin adición de sal, respectivamente.

La mezcla de alimento usada en el proceso de granulación estaba constituida como sigue:

Componentes	% (p/p)
Maíz	50,00
Guisantes (22,9% de proteína en bruto)	3,50
Soja desgrasada (45,5% de proteína en bruto)	28,00
Tapioca	2,38
Harina animal (58% de proteína en bruto)	3,60
Harina de pescado (72,7% de proteína en bruto)	1,00
Harina de plumas hidrolizada	1,00
Aceite de soja	1,75
Grasa animal	3,50
Premezcla vitaminas/minerales	3,15
Piedra caliza	0,86
Fosfato monocálcico	0,96
Cloruro sódico	0,30

Ejemplo 4

Se disolvieron diferentes cantidades de sulfato de magnesio en 100 ml de agua desmineralizada, tras lo cual se añadieron, a cada porción, 100 ml de un concentrado de fitasa fúngica (como el producido y suministrado por Gist-brocades) que contiene aproximadamente 17% en peso de enzima pura. Después de mezclar, las soluciones resultantes fueron secadas por aspersión empleando un aparato de secado por aspersión a escala de laboratorio Büchi 190 Mini con temperaturas de entrada/salida de 140 y 80ºC respectivamente.

Los polvos resultantes se mezclaron con moyuelo de trigo en una relación de 1:9. Después de alcanzar el equilibrio, se midieron los valores de la actividad en agua a 35ºC para la muestra de control y para la muestra con la dosis de sal más alta, para excluir los efectos de la actividad en agua. Las mezclas fueron incubadas posteriormente en botellas cerradas a 35ºC durante 8 semanas, tras lo cual se midieron las pérdidas de actividad.

Los resultados se ofrecen en la siguiente tabla:

1

Ejemplo 5

De acuerdo con el mismo protocolo que el indicado en Ejemplo 4, se han empleado diferentes sales en una dosis de 80 mmol por 100 ml de concentrado de fitasa, para producir polvos enzimáticos estabilizados. La mezcla con moyuelo de trigo y el ensayo de la estabilidad tubo lugar de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 4. Los resultados se ofrecen en la siguiente tabla:

2

Ejemplo 6

Empleando el protocolo descrito en el Ejemplo 5, se prepararon tres soluciones que contienen fitasa y en donde una de ellas no contiene sal, otra contiene sulfato de magnesio y la otra contiene sulfato de zinc. Estas soluciones se secaron posteriormente empleando liofilización en lugar de secado por aspersión. La liofilización se llevó a cabo congelando la soluciones mezcladas de enzima/sal en un matraz y sumergiendo este último en nitrógeno líquido, tras lo cual se aplicó un vacío elevado para separar el agua. Los preparados secos resultantes se trituraron en un mortero y se mezclaron con moyuelo de trigo antes del ensayo de la estabilidad durante 8 semanas a 35ºC en botellas cerradas. Los resultados se ofrecen en la siguiente tabla.

3

Claims

1. Método para la preparación de una composición enzimática sólida estable en el almacenamiento y durante el procesado de la misma, que comprende la etapa de secar una solución que contiene al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la concentración de la sal inorgánica es de al menos 5% (p/p) del peso de la enzima o de las enzimas, y en donde la sal inorgánica comprende un catión divalente seleccionado del grupo consistente en zinc y magnesio.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a) preparar una solución acuosa que comprende al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la concentración de la sal inorgánica es de al menos 5% del peso de la enzima o de las enzimas, y en donde la sal inorgánica comprende un catión divalente seleccionado del grupo consistente en zinc y magnesio; y

b) secar la solución.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la sal inorgánica comprende un anión sulfato.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la enzima o las enzimas se eligen del grupo consistente en una fitasa, una proteasa, una hemicelulasa y una mezcla de una hemicelulasa y una celulasa.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la enzima o las enzimas se eligen del grupo consistente en una fitasa de Aspergillus, una proteasa de Bacillus, una hemicelulasa de Aspergillus y una mezcla de una hemicelulasa y una celulasa ambas de Trichoderma.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el secado de la solución que contiene la enzima o las enzimas y la sal inorgánica comprende el uso de un secador seleccionado del grupo consistente en un secador de múltiples etapas, un secador por aspersión, un secador en lecho fluido y un liofilizador.

7. Una composición enzimática sólida que comprende (i) al menos una enzima y (ii) una sal inorgánica soluble en agua, en donde la concentración de la sal inorgánica es de al menos 5% (p/p) del peso de la enzima o de las enzimas, y en donde la sal inorgánica comprende un catión divalente seleccionado del grupo consistente en zinc y magnesio.

8. Una composición enzimática sólida según la reivindicación 7, en donde la composición consigue la homogeneidad de la enzima o de las enzimas y de la sal inorgánica mediante:

a) preparación de una solución que comprende al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la concentración de la sal inorgánica es de al menos 5% del peso de la enzima o de las enzimas; y

b) secado de la solución.

9. Una composición enzimática sólida según las reivindicaciones 7 u 8, en donde la enzima o las enzimas se eligen del grupo consistente en una fitasa, una proteasa, una hemicelulasa y una mezcla de una hemicelulasa y una celulasa.

10. Una composición enzimática sólida según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la enzima o las enzimas se eligen del grupo consistente en una fitasa de Aspergillus, una proteasa de Bacillus, una hemicelulasa de Aspergillus y una mezcla de una hemicelulasa y una celulasa ambas de Trichoderma.

11. Una composición enzimática sólida según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la sal inorgánica comprende un anión sulfato.

12. Una composición enzimática sólida según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde la composición es homogénea con respecto a la distribución de la sal inorgánica y de la enzima.

13. Una composición enzimática sólida según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde la composición se encuentra en forma de partículas.

14. Una composición enzimática sólida según la reivindicación 13, caracterizada porque la partículas están revestidas.

15. Una composición enzimática sólida según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, que comprende una fitasa que pierde menos del 35% de la actividad enzimática inicial tras el almacenamiento de la composición enzimática sólida durante 8 semanas a 30ºC.

16. Un alimento para animales que comprende una composición sólida como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15.