ES2406758T3 - Polipéptido con una actividad de fitasa y una aumentada estabilidad térmica de la actividad enzimática, así como una secuencia de nucleótidos que codifica éste - Google Patents

Abstract

Molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica,codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una secuencia deADN, que se escoge entre a) unas secuencias de ADN, que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se había obtenidomediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo silvestre, comprendiendo lavariación una combinación de las mutaciones asparagina → arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico → ácido glutámico en la posición 142 (D142E), b) unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con lassecuencias de acuerdo con a), realizándose que la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula anfitriona,va acompañada por unas estabilidades térmica y frente a proteasas aumentadas de la actividad enzimática de laproteína codificada de esta manera.

Description

Polipéptido con una actividad de fitasa y una aumentada estabilidad térmica de la actividad enzimática, así como una secuencia de nucleótidos que codifica éste

El invento se refiere a una molécula de ADN recombinante, que codifica un polipéptido con una actividad de fitasa y con una estabilidad térmica aumentada y una estabilidad proteolítica aumentada de la actividad enzimática, así como al polipéptido codificado como tal. En particular, el invento se refiere a una molécula de ADN recombinante, que codifica un polipéptido con una actividad de fitasa y con una estabilidad térmica aumentada y una estabilidad proteolítica aumentada de la actividad enzimática, habiéndose obtenido la secuencia de ADN mediante una variación de la fitasa de E. coli madura de tipo silvestre, habiendo sido modificadas unas posiciones definidas de aminoácidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre (wt, acrónimo de wild type), o respectivamente estando presentes unas extensiones (= prolongaciones) en los extremos terminales de N y/o C. El invento se refiere además a un procedimiento para la expresión de la fitasa recombinante así como a su utilización en la tecnología de los alimentos y piensos.

El ácido fítico o 1,2,3,4,5,6-hexaquis-dihidrógenofosfato de mioinositol (denominado abreviadamente hexaquisfosfato de mioinositol) es la fuente principal de inositol y la forma primaria de almacenamiento de fosfato en semillas de plantas. En las semillas de leguminosas, aproximadamente un 70 % del contenido de fosfato se presenta como una sal mixta de potasio, magnesio y calcio del ácido fítico. Las semillas, los granos de cereales y las leguminosas son unos componentes importantes de formulaciones de alimentos y piensos, en particular de preparados de piensos para animales; pero también en la nutrición humana van ganando crecientemente en importancia los cereales y las leguminosas.

Las unidades de fosfato del ácido fítico fijan en forma de un compuesto complejo a ciertos cationes divalentes y trivalentes tales como iones de metales, es decir a unos iones importantes desde el punto de vista fisiológico nutritivo, tales como los de calcio, hierro, zinc y magnesio, así como a los elementos traza (oligoelementos) manganeso, cobre y molibdeno. Junto a esto, el ácido fítico fija también proteínas hasta una cierta medida mediante una interacción electrostática.

El ácido fítico y sus sales, los fitatos, frecuentemente no se metabolizan, puesto que no son absorbidos/as desde el tracto gastrointestinal, es decir que ni el fósforo allí contenido ni los iones de metales quelatados, ni las proteínas fijadas están disponibles desde el punto de vista fisiológico de nutrición.

Puesto que el fósforo es un elemento esencial para el crecimiento de todos los organismos, los alimentos y piensos tienen que ser suplementados con un fosfato inorgánico. Muy frecuentemente también tienen que ser suplementados los iones esenciales desde el punto de vista fisiológico de nutrición, tales como los de hierro y calcio. Además, se disminuye el valor fisiológico de nutrición de cualquier dieta, puesto que las proteínas son fijadas por el ácido fítico. Como consecuencia, el ácido fítico es designado frecuentemente como un factor anti-valor nutritivo.

Además, debido a la ausencia de una metabolización del ácido fítico, el fósforo del fitato es segregado a través del tracto gastrointestinal de los animales, lo que conduce a una indeseada impurificación por fosfato del medio ambiente, como consecuencia de lo cual puede llegarse, por ejemplo, a una eutrofización de las aguas y a un crecimiento excesivo de las algas.

El ácido fítico o los fitatos (estas expresiones son utilizadas en lo sucesivo como sinónimas, excepto que se indique otra cosa distinta) pueden ser degradados por las fitasas. Las fitasas catalizan la hidrólisis de un fitato para dar mioinositol y/o mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos así como un fosfato inorgánico. Se establece diferencia entre dos tipos diferentes de fitasas microbianas: 1) la 3-fitasa/mioinositolhexafosfato-3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8; 2) la 6fitasa/mioinositolhexafosfato-6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26. La 3-fitasa hidroliza de manera preferida en primer lugar al enlace de éster en la posición 3, y la 6-fitasa hidroliza de manera preferida en primer lugar al enlace de éster en la posición 6. Las semillas de plantas que contienen ácido fítico, contienen también unas enzimas fitasas endógenas. En el caso de su asimilación, los fitatos que se encuentran en alimentos o respectivamente piensos, son hidrolizables en teoría por las fitasas endógenas de las plantas, por unas fitasas procedentes de la flora intestinal y por unas fitasas procedentes de la mucosa intestinal. Sin embargo, en la práctica el potencial de hidrólisis de las fitasas endógenas de las plantas y de las fitasas que se presentan en el intestino, siempre y cuando que éstas estén presentes, no es suficiente ni con mucho para garantizar de una manera significativa la biodisponibilidad del fósforo combinado en los fitatos. Por lo tanto, a los alimentos o respectivamente piensos se les añaden frecuentemente unas fitasas exógenas.

Las fitasas pueden ser producidas por plantas así como por microorganismos. Entre los microorganismos, se conocen unas bacterias que producen fitasas así como unos hongos y unas levaduras que producen fitasas.

Los productores de fitasas que se presentan en la naturaleza tienen, sin embargo, la desventaja, de que se forma una fitasa sólo en determinadas cantidades y con unas propiedades definidas. Sin embargo, tal como se ha expuesto precedentemente, subsiste una necesidad aumentada de una fitasa en particular para la industria de los alimentos y piensos.

A pesar de que en la industria de los alimentos y piensos subsiste una necesidad aumentada de fitasas y de que la utilización de una fitasa puede ser ventajosa, solamente unas pocas de las fitasas conocidas han encontrado una amplia aceptación en la industria de los alimentos y piensos. Unos típicos reparos se refieren a los costes de producción relativamente altos y/o a la mala estabilidad o respectivamente actividad de la enzima en el entorno deseado de uso. Por lo demás, una enzima de este tipo debe de cumplir una serie de criterios, con el fin de serempleable industrialmente. Éstos comprenden una alta actividad global específica, un bajo valor óptimo del pH, una resistencia frente a las proteasas gastrointestinales así como una estabilidad térmica o respectivamente termoestabilidad. La estabilidad térmica es una premisa importante para un uso industrial exitoso, puesto que, por ejemplo en los procesos de granulación, las enzimas son sometidas a unas temperaturas comprendidas entre 60ºC y 95ºC.

Todas las fitasas microbianas conocidas se despliegan a unas temperaturas comprendidas entre 56ºC y 78ºC (Lehman y colaboradores, 2000), con lo cual ellas pierden su actividad. Por ello, subsiste en particular una necesidad de unas fitasas, que también a unas temperaturas elevadas posean una actividad suficiente desde el punto de vista tecnológico, o respectivamente que no sean desactivadas.

El documento de solicitud de patente internacional WO 01/90333 se refiere a un procedimiento para el mejoramiento del valor nutritivo de un pienso que contiene fitato, siendo puesto en contacto este pienso con una enzima fitasa que tiene una secuencia definida. Esta fitasa posee una estabilidad térmica aumentada.

El presente invento se basa por consiguiente en la misión de poner a disposición un polipéptido con una actividad de fitasa, que tenga una termoestabilidad aumentada o respectivamente que, a unas temperaturas aumentadas, posea una actividad suficiente desde el punto de vista tecnológico. Además, el polipéptido con una actividad de fitasa debe de poseer también una estabilidad proteolítica aumentada.

El polipéptido debe de poder producirse de una manera rentable. En particular, la fitasa debe de ser más estable térmicamente que la enzima de tipo silvestre. La fitasa debe de conservar, además, las propiedades esenciales de la fitasa natural de tipo silvestre de E. coli, pero debe de distinguirse por una termoestabilidad mejorada. Entre las propiedades esenciales de la fitasa natural de tipo silvestre se cuentan en particular la capacidad de mejorar la disponibilidad de fosfato in vivo e in vitro mediante su actividad como fitasa así como también como fosfatasa, su valor óptimo del pH en el entorno ácido, con una alta actividad residual en un entorno fuertemente ácido, así como la idoneidad como un agente coadyuvante de panificación.

El presente invento se basa, además, en la misión de poner a disposición un gen para un polipéptido con una actividad de fitasa, que tenga una termoestabilidad aumentada así como una estabilidad proteolítica aumentada. El polipéptido debe de ser producido de una manera rentable y a un precio barato. En particular, la expresión del polipéptido en microorganismos eucarióticos debe de conducir a un polipéptido con una termoestabilidad aumentada en comparación con la fitasa de tipo silvestre producida de una manera similar. Además, se deben de poner a disposición las secuencias de ADN que codifican el polipéptido, unas correspondientes construcciones artificiales de ADN y unos vectores, así como una fuente para la enzima recombinante, que sea apropiada para la utilización comercial para alimentos y piensos y en procesos industriales, y unas composiciones que contengan la enzima conforme al invento.

Por fin, se encontró sorprendentemente que unas mutaciones en determinadas posiciones de la secuencia de la fitasa de tipo silvestre de E. coli conducen a un aumento intrínseco de la termoestabilidad o respectivamente de la estabilidad térmica así como a un aumento de la estabilidad proteolítica de la proteína fitasa, sin influir desventajosamente sobre las otras actividades y las propiedades esenciales de la fitasa de tipo silvestre de E. coli.

Sorprendentemente, se encontró que una mutación en la posición 74 (K74D) de la secuencia de aminoácidos, y/o una combinación de mutaciones en las posiciones 139 (N139R) y 142 (D142E), y/o una combinación de mutaciones en las posiciones 145 (L145I) y 198 (L198I) y/o una mutación en la posición 200 (V200P) de la fitasa de tipo silvestre de E. coli así como ciertas combinaciones de estas mutaciones conducen a una termoestabilidad mejorada de la proteína fitasa sin perjudicar a los efectos favorables ni a las propiedades esenciales de la fitasa de tipo silvestre de

E. coli. Además, se encontró que la complementación de la fitasa de E. coli por unas secuencias de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori junto al extremo terminal de N o terminal de C, o respectivamente junto a los extremos terminales de N y C, conduce, también en unión con las mutaciones precedentemente mencionadas, a un mejoramiento de la termoestabilidad y de la estabilidad proteolítica de la enzima.

El invento se refiere por consiguiente a una molécula de ADN recombinante que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, abarcando la molécula de ADN recombinante una secuencia de ADN, escogida entre

a) unas secuencias de ADN, que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que ha sido obtenido mediante una variación de la secuencia de la fitasa de tipo silvestre de E. coli madura, abarcando la variación una combinación de las mutaciones asparagina - arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico - ácido glutámico en la posición 142 (D142E),

b) unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias de acuerdo con a),

realizándose que la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula anfitriona, va acompañada por unas estabilidades térmica y frente a las proteasas aumentadas de la actividad enzimática de la proteína codificada de esta manera.

El invento se refiere además a una molécula de ADN recombinante, que está caracterizada por que la secuencia de ADN abarca adicionalmente la variación V200P del polipéptido codificado.

El invento se refiere además a una molécula de ADN recombinante, que está caracterizada por que la secuencia de ADN abarca adicionalmente las variaciones L145I y L198I del polipéptido codificado.

El invento se refiere además a una molécula de ADN recombinante, que está caracterizada por que, como adosamiento junto al extremo terminal de N del polipéptido codificado, ella comprende la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS y/o como adosamiento junto al extremo terminal de C del polipéptido codificado ella comprende la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.

En la bibliografía se han descrito varias fitasas procedentes de E. coli, p.ej. el gen appA, que codifica una fitasa, procedente de E. coli K-12 (Dassa y colaboradores, J. Bacteriol. 172: 5497-5500 (1990). Este gen codifica una proteína periplasmática, que tiene tanto una actividad de fosfatasa ácida como también una actividad de fitasa (véase la cita de Greiner y colaboradores, Arch. Biochim, Biophys. 303: 107-113 (1993)). Son conocidos unos mutantes naturales de esta enzima (compárese p.ej. la cita de Rodríguez y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm. 257: 117-123 (1999)). Fueron asimismo descritos unos mutantes modificados genéticamente de la fitasa de

E. coli, que conducen a una estabilidad térmica aumentada y/o a una actividad específica más alta. Rodríguez y colaboradores (Arch. Biochem. Biophys. 382: 105-122 (2000)) expresaron la AppA de tipo silvestre y varios mutantes producidos mediante una mutagénesis específica para un sitio en Pichia pastoris, con el fin de investigar el efecto de la glicosilación en N sobre la estabilidad térmica de la proteína AppA. A pesar de que la glicosilación no era reforzada, un mutante era más activo a un pH de 3,5 hasta 5,5 y, después de un tratamiento térmico, presentaba más actividad que la proteína de tipo silvestre producida en P. pastoris.

La familia de patentes que se basa en el documento WO 03/057248 contiene los documentos de solicitudes de patentes de los EE.UU. US 2003/0170293 A1 y US 2003/0157646 A1. En ellos se describe la producción microbiana de una fitasa termotolerante para piensos para animales. El mutante (Nov9X) de la fitasa de la cepa B de E. coli (appA) es llevado a expresión en E. coli, Pichia pastoris y Schizosaccharomyces pombe. El mutante Nov9X contiene 8 mutaciones de aminoácidos en comparación con la enzima de tipo silvestre. El mutante tiene una termoestabilidad mejorada en un líquido a 70ºC en comparación con la enzima de tipo silvestre. El anfitrión, en el que se lleva a producción la enzima, tiene también una influencia sobre su termoestabilidad, tal como es implicado por el mismo grupo de trabajo en la solicitud de patente de los EE.UU. US 2003/0157646 A1. El modo de recuento de las posiciones de aminoácidos en el caso de NOV9X es más alto en 2 posiciones que en el presente invento (el W48 de NOV9X corresponde al W46 en el presente invento).

En las solicitudes de patentes internacionales WO 02/095003 y WO 2004/015084 se describen una serie de mutaciones puntuales de la fitasa de E. coli, que, sin embargo, no todas ellas conducen a un aumento de la termoestabilidad. La numeración en el documento WO 2004/015084, en comparación con el presente invento, es más alta en 30 posiciones de aminoácidos.

También el documento de publicación para información de solicitud de patente alemana DE 10 2004 050 410 describe unos mutantes de la fitasa de E. coli, pero con la finalidad de aumentar la eficiencia de la secreción en el caso de la producción en hongos filamentosos. En el mencionado documento no se presentan informaciones acerca del aumento de la termoestabilidad de los mutantes.

Además, la publicación de Garrett y colaboradores: Applied Environ. Microbiol. 2004, 70 (5), 3041-3046, describe unos mutantes de la fitasa de E. coli con unas estabilidades térmica y gastrointestinal aumentadas.

Prácticamente no es posible establecer unas predicciones acerca del efecto de una o varias mutaciones sobre el comportamiento de la actividad enzimática en condiciones de una temperatura aumentada. Por lo general, en el caso de unas temperaturas más altas tiene lugar una desnaturalización o respectivamente un desplegamiento de las estructuras secundaria y terciaria de la proteína.

La estabilidad térmica o respectivamente termoestabilidad de las proteínas es dependiente de un gran número de interacciones. La conformación de unas proteínas es mantenida por un gran número de interacciones débiles. La estabilización puede abarcar a todos los niveles de jerarquía de la estructura proteínica: Un empaquetamiento local

de la cadena de polipéptido, los elementos estructurales secundarios y supersecundarios, los dominios y las subunidades de una proteína multimérica. Existen numerosos motivos, acerca de los que se ha informado en lo que respecta a la estabilidad térmica aumentada de una proteína, siendo los más frecuentes (a) la acumulación de pares de iones dentro de y/o entre las subunidades; (b) un empaquetamiento mejorado del núcleo hidrófobo (por 5 interacciones de van der Waals); (c) unos retículos adicionales constituidos a base de puentes de hidrógeno; (d) una tendencia reforzada a la formación de estructuras secundarias; (e) una estabilización dipolar aumentada dentro de la hélice; (f) una superficie polar aumentada; (g) un número disminuido y un volumen total disminuido de cavidades; (h) la disminución de la tensión conformacional (estabilización de bucles) e (i) la capacidad de resistencia frente a una modificación química (la oxidación de restos de metionina y/o la desaminación de restos de asparagina y glutamina).

10 Dentro del estado de la técnica no se conoce ninguna mención acerca de cómo y de qué manera se debe de modificar deliberadamente la secuencia de la fitasa de tipo silvestre de E. coli, con el fin de conseguir un aumento de la termoestabilidad. Además, el estado de la técnica no contiene ninguna mención acerca de las mutaciones precedentemente mencionadas en la secuencia de la fitasa de E. coli.

15 El estado de la técnica no contiene en particular ninguna mención acerca de que una combinación de mutaciones en las posiciones 139 (N139R) y 142 (D142E) de la fitasa de tipo silvestre de E. coli o unas combinaciones de estas mutaciones puedan conducir a una termoestabilidad mejorada de la proteína fitasa, sin perjudicar a los efectos favorables ni a las propiedades esenciales de la fitasa de tipo silvestre de E. coli.

20 Unas moléculas de ADN recombinante preferidas conformes al invento, con las variaciones conformes al invento de la secuencia de la fitasa de tipo silvestre de E. coli madura, son las construcciones artificiales PhyM2 y PhyM10. Éstas se representan en la siguiente Tabla 1. Las construcciones artificiales PhyM1, PhyM3, PhyM7 y PhyM9 fueron recogidas como un producto de comparación.

25 Tabla 1: Genotipos de las mutaciones PhyM1, PhyM2, PhyM3, PhyM7, PhyM9 y PhyM10

Genotipo

Posición de aminoácidos Secuencia de tipo silvestre Mutaciones

PhyM1

200 E-L-K Val200 S-A-D E-L-K Tyr200 S-A-D

PhyM2

139 D-N-A-Asn139-V-T-D142-A D-N-A-Arg139-V-T-E142-A

142

D-N-A-N139-V-T-Asp142-A D-N-A-R139-V-T-Glu142-A

PhyM3

200 E-L-K Val200 S-A-D E-L-K Pro200 S-A-D

PhyM7

74 L-L-A-Lys74-K-G L-L-A-Asp74-K-G

PhyM9

145 D-A-I- Leu145S-R-A D-A-I-Ile145-S-R-A

198

P-S-E Leu198 K-V-S P-S-E Ile198-K-V-S

PhyM10

74 L-L-A-Lys74-K-G L-L-A-Asp74-K-G

139

N-A-Asn139-V-T-D142-A D-N-A-Arg139-V-T-E142-A

142

N-A-N139-V-T-Asp142-A D-N-A-R139-V-T-Glu142-A

200

E-L-K Val200 S-A-D E-L-K Pro200 S-A-D

Los siguientes plásmidos han sido presentados el 18.10.2006 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos celulares) GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 30 38124 Braunschweig, de acuerdo con las condiciones del Convenio de Budapest.

Plásmido

Número de presentación

pET-PhyM2

DSM 18715

pUC-PhyM3

DSM 18717

pET-PhyM7

DSM 18716

pUC-PhyM9

DSM 18718

pUC-PhyM10

DSM 18719

pPhy2005

DSM 18720

pPhy2006

DSM 18721

Fue sorprendente el hecho de que unas mutaciones, que influyen sobre la superficie hidrófoba de la proteína (PhyM3, PhyM7 y PhyM9), así como unas mutaciones, que introducen un enlace iónico en la hélice D (PhyM2), o 35 respectivamente que estabilizan al bucle B-4 a través de un puente iónico (PhyM7) contribuyen significativamente al aumento de la termoestabilidad de la fitasa de E. coli.

También el adosamiento de unas partes de la secuencia de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori, que conducen en el caso de la fosfatasa ácida a una formación de dímeros y tetrámeros, tenía unos efectos 40 estabilizadores en el caso de la fitasa de E. coli. Lo correspondiente es válido para el adosamiento de partes de la secuencia de la fitasa de Aspergillus niger.

enzimática. Este mejoramiento de la termoestabilidad se puede medir en un líquido mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC acrónimo de Differential Scanning Calorimetry). En particular, el mejoramiento de la termoestabilidad se manifiesta en la actividad residual fuertemente aumentada de los mutantes de la enzima en comparación con la enzima de tipo silvestre, cuando ellos son sometidos a la carga térmica, tal como la que se utiliza en el caso de la granulación de piensos para animales. Además, los polipéptidos conformes al invento poseen también una termoestabilidad aumentada frente a la degradación proteolítica tal como se presenta especialmente en el estómago de aves de corral y de animales monogástricos. Puesto que la fitasa, en el caso de la nutrición de animales, especialmente durante el paso por el estómago, tiene que liberar el fosfato a partir del ácido fítico y de sus productos de degradación, esta estabilidad presenta un interés especial con el fin de mantener a la dosificación de la enzima lo más pequeña que sea posible. A causa de la estabilidad térmica y/o proteolítica aumentada, las fitasas conformes al invento se adecuan en particular para unos usos, en cuyos casos se presentan unas condiciones de temperaturas aumentadas o respectivamente en cuyos casos se debe de contar con una degradación proteolítica aumentada. Unos ejemplos de estos usos son la producción de la enzima, en cuyo caso ésta tiene que ser protegida frente a proteasas de la cepa anfitriona, la producción de un pienso granulado, pero también el uso como una enzima en estado líquido en el caso de la aplicación después de la granulación sobre el pienso granulado. Una estabilidad térmica aumentada permite la aplicación más temprana sobre los gránulos todavía no enfriados tan ampliamente, con lo que se acorta el período de tiempo de evaporación del líquido aplicado. Esto aporta ventajas también desde el punto de vista microbiológico, puesto que entonces el elevado contenido de agua se presenta sólo brevemente en el caso de altas temperaturas, en las que la mayor parte de los gérmenes patógenos no pueden crecer.

La secuencia de ADN que codifica una fitasa conforme al invento comprende la siguiente mutación del polipéptido codificado:

i) una combinación de las mutaciones asparagina - arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico - ácido glutámico en la posición 142 (D142E), y eventualmente

ii) una combinación de las mutaciones leucina - isoleucina en la posición 145 (L145I) y leucina - isoleucina en la posición 198 (L198I), y/o

iii) una mutación valina - prolina en la posición 200 (V200P), y/o

iv) un adosamiento junto a los extremos terminales de N o de C o un adosamiento junto a los extremos

terminales de N y de C de un segmento de la secuencia de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var.

awamori o de la fitasa de Aspergillus niger.

Además, de manera adicional a las mutaciones descritas, puede estar presente un adosamiento junto al extremo terminal de N o C o un adosamiento junto a los extremos terminales de N y C de un segmento de la secuencia de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori. También la presencia a solas de estos segmentos de la secuencia conduce ya a un aumento de la termoestabilidad. En el caso del segmento junto el extremo terminal de N de la fosfatasa ácida procedente de A. niger var. awamori se trata de los primeros 51 aminoácidos de la proteína madura (FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS). Los últimos 4 aminoácidos de este polipéptido reemplazan en este caso a los primeros 4 aminoácidos (QSEP) de la fitasa de E. coli madura. También es posible el adosamiento de algunas partes de este segmento de la fosfatasa ácida. Alternativamente, se puede(n) utilizar también la parte del extremo terminal de N o unas partes de éste, de los primeros 40 aminoácidos de la proteína madura de la fitasa de Aspergillus niger (SCDTVDQGYQ CFSETSHLWG QYAPFFSLAN ESVISPEVPA). El adosamiento a la fitasa de E. coli se puede efectuar también en otros sitios distintos que en la posición 4 descrita, siempre y cuando que la actividad de la enzima permanezca conservada. Para la prolongación junto al extremo terminal de C, los últimos 29 aminoácidos (LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD) de la fosfatasa ácida procedente de A. niger var. Awamori fueron fusionados directamente junto al extremo terminal de C de la fitasa de E. coli. Esta fusión, o respectivamente estas fusiones, puede(n) ir acompañada(s) también por otras mutaciones en la fitasa de E. coli y no está(n) restringida(s) a las mutaciones adicionales expuestas en esta solicitud. Mediante la mutación Lys43Cys se crearía la posibilidad de una formación de puentes de disulfuro entre el nuevo extremo terminal de C y el núcleo de la fitasa de E. coli y, por consiguiente, de una dimerización mejorada. Son posibles otras mutaciones, que favorecen o estabilizan a los puentes de van der Waals, o a los puentes intermoleculares hidrófobos o iónicos y por consiguiente, aumentan la termoestabilidad o la pueden mejorar todavía más. Unos ejemplos de las prolongaciones de la secuencia junto al extremo terminal de N o respectivamente de C son las formas de realización Phy2005 y Phy2006 descritas a continuación.

La termoestabilidad de la fitasa conforme al invento se puede aumentar todavía más en unos productos comerciales, p.ej. mediante adición de ciertas sustancias al material concentrado por ultrafiltración antes de la desecación o granulación. Por ejemplo, una formulación estable de la enzima fitasa conforme al invento se puede producir mediante el recurso de que una mezcla a base de una solución enzimática líquida se rocía sobre un agente de relleno tal como maltodextrina, y entonces se seca la mezcla de reacción, o a la solución enzimática líquida se le añade antes de la desecación 20 % - 60 % de un polvo de leche desnatada (en p/p = peso/peso, referido a la proteína total de la solución enzimática) y/o 1 % - 5 % de propionato de calcio (en p/p, referido a la proteína total de la solución enzimática), y se ajusta el valor del pH a un valor definido, en particular a un pH de 5,2 ± 0,5. La disminución de la humedad y las interacciones de fijación de la fitasa con el agente de relleno o carga protegen a la enzima adicionalmente a su estabilidad definida en su estructura con respecto unas influencias del medio ambiente tales como unas temperaturas extremadas, que pueden aparecer durante la producción del pienso. Las formulaciones secas y líquidas se pueden estabilizar aún más, cuando se disminuye la actividad de unas potenciales enzimas proteolíticas, que pueden estar presentes como productos secundarios en la mezcla líquida de fermentación, que se utiliza para la producción de la enzima conforme al invento.

La secuencia de ADN, correspondiente a la secuencia de fitasa mutada conforme al invento, se puede realizar mediando utilización de unos arbitrarios usos de codones. Así, se puede utilizar, por ejemplo, el uso de codones del microorganismo utilizado para la expresión, pero también se puede utilizar el uso de codones de E. coli o respectivamente de una variante de éste. Además, la secuencia de la fitasa de E. coli mutada conforme al invento puede contener otras variaciones de secuencia. En este caso se pueden llevar a cabo unas variaciones arbitrarias adicionalmente a las mutaciones precedentemente descritas, siempre y cuando que no sea perjudicada desventajosamente la propiedad de la consecución de una estabilidad térmica aumentada y siempre y cuando que sean conservadas la actividad enzimática y otras propiedades esenciales de la fitasa de E. coli de tipo silvestre.

Unas correspondientes variaciones son bien conocidas para un experto en la especialidad dentro del sector de la técnica del ADN recombinante, y éstas abarcan las mutaciones precedentes así como las variaciones ejemplificativas expuestas seguidamente.

Conforme al invento, se pueden utilizar unas moléculas formadas por adición y/o supresión (deleción) del polipéptido modificado conforme al invento. Así, el polipéptido modificado con una actividad de fitasa conforme al invento se puede prolongar mediante adosamiento de otras secuencias junto al extremo terminal de N y/o al extremo terminal de C. De esta manera se pueden producir unas moléculas híbridas, que poseen otras propiedades ventajosas. Por ejemplo, se pueden adosar unas proteínas de fusión o respectivamente unas proteínas secretadas naturalmente en un alto grado, con lo cual se mejora aún más la eficiencia de la secreción. De manera preferida, para esto se utiliza una parte de la proteína CBH2 procedente de Trichoderma reesei, desde el aminoácido Met 1 hasta el Ser 86.

Conforme al invento, se pueden suprimir también unos segmentos de secuencia del polipéptido con una actividad de fitasa, siempre y cuando que no sea perjudicada la propiedad de la estabilidad térmica aumentada mediando conservación de la actividad de fitasa.

Las mutaciones, las elongaciones y los acortamientos se pueden llevar a cabo de una manera en sí conocida según unos procedimientos bien conocidos en el sector especializado.

Las modificaciones, tomadas en consideración precedentemente, del polipéptido con una actividad de fitasa corresponden a unas correspondientes mutaciones o respectivamente modificaciones de la pertinente molécula de ADN. Se pueden tomar en consideración en tal caso también aquellas secuencias, que se hibridan en condiciones relajadas o rigurosas con las secuencias conformes al invento. Como condiciones rigurosas se consideran: una hibridación a 65ºC durante 18 h en una solución de sulfato de dextrano (GenescreenPlus, Dupont), después de esto un lavado de los filtros, en cada caso durante 30 min, primeramente con 6 x SSC, dos veces con 2 x SSC, dos veces con 2 x SSC con SDS al 0,1 % y a continuación con 0,2 x SSC a 65ºC (Membrane transfer and detection methods (Métodos de transporte a través de membranas y de detección), de Amersham).

Además, también se divulgan aquellas secuencias que tienen una homología de por lo menos 70 %, de manera más preferida de por lo menos 80 %, de manera todavía más preferida de por lo menos 90 % y en particular de por lo menos 95 %, con la secuencia de nucleótidos reivindicada o respectivamente con las partes reivindicadas de ésta, siempre y cuando que las respectivas secuencias conduzcan al aumento de la estabilidad térmica del polipéptido con una actividad de fitasa, que ha sido codificado por ellas. De manera preferida, la homología es de 70 a 100 tantos por ciento. La homología se define en este contexto como el grado de la identidad. El grado de la identidad se determina en este caso preferiblemente de tal manera que se averigua el número de los restos de la secuencia más corta, que participa en la comparación, y que posee un “correspondiente” trozo antagonista en la otra secuencia. La homología se determina en este caso preferiblemente de un modo usual mediando utilización de los algoritmos usuales. Para la comparación sólo se aprovechan los ADNc’s (cromosómicos) de las respectivas proteínas maduras. Como secuencias homólogas, se determinan unos trozos antagonistas similares, de manera preferida idénticos, de la secuencia, con ayuda de unos conocidos programas de ordenador. Un ejemplo de un programa de este tipo es el programa Clone Manager Suite, que contiene la parte de programa Align Plus, y que es distribuido por la entidad Scientific & Educational Software, Durham, NC, EE.UU. En este caso, se lleva a cabo una comparación de dos secuencias de ADN tales como las precedentemente definidas, bajo la “Option local alignment” o respectivamente según el método de FastScan-MaxScore, o según el método de Needleman-Wunsch mediando conservación de los valores de defecto (del inglés default). Especialmente, para el cálculo de la homología se usó conforme al invento la versión del programa “Clone Manager 7 Align Plus 5” con las funciones “Compare Two Sequences/Local Fast Scan-Max Score/Compare DNA sequences”. En este caso se utilizaron los algoritmos accesibles a partir de las siguientes fuentes: Hirschberg, D.S. (1975). A linear space algorithm for computing longest common subsequences [Un algoritmo espacial lineal para computar las subsecuencias comunes más largas], Commun Assoc Comput Mach 18:341-343; Myers, E.W. y W. Miller. (1988). Optimal alignments in linear space [Alineaciones óptimas en un espacio lineal]. CABIOS 4:1, 11-17; Chao, K-M, W.R. Pearson y W. Miller. 1992. AIigning two sequences within a specified diagonal band [Alineación de dos secuencias dentro de una banda diagonal especificada]. CABIOS 8:5, 481-487.

5 El invento se refiere, además, también a unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias conformes al invento, así como a unas variantes alélicas de éstas. La degeneración del código genético puede resultar en este caso debido a una degeneración natural o debido a un uso de codones escogido especialmente. Las variantes alélicas que se presentan en la naturaleza se pueden identificar mediando utilización de unas técnicas bien conocidas de la biología molecular, tales como p.ej. la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de unas técnicas de hibridación.

Una secuencia de ADN, que codifica un polipéptido conforme al invento, se puede utilizar para transformar a unas células anfitrionas arbitrarias tales como, por ejemplo, células de hongos, levaduras, bacterias, plantas o mamíferos. Las células transformadas de esta manera se distinguen por una producción y eventualmente una secreción de una

15 fitasa con una termoestabilidad aumentada. La enzima fitasa con una termoestabilidad aumentada, producida de esta manera, conduce también a una liberación eficiente de fosfato a partir de fitatos.

Las expresiones “proteína”, “péptido” y “polipéptido” deben de ser utilizadas de un modo intercambiable. Los conceptos “un polipéptido" o "una enzima con una actividad de fitasa” o “una fitasa” deben de designar a cualquier enzima, que pueda dar lugar a la liberación de un fosfato inorgánico a partir de diferentes fosfatos de mioinositol. Ejemplos de tales substratos de fosfatos de mioinositol (de fitasa) son el ácido fítico y unas sales arbitrarias de éste, por ejemplo, fitato de sodio o fitato de potasio o unas sales mixtas. También unos arbitrarios isómeros de posición de los di-, tri-, tetra- o pentafosfatos de mioinositol pueden servir como substrato de una fitasa. La actividad de fitasa se puede determinar mediando utilización de cualquier sistema de ensayo arbitrario, en cuyo caso se utiliza uno de 25 estos substratos. Una variante de fitasa conforme al invento abarca unas variantes de polipéptidos, que se derivan de una fitasa especial mediante supresión o adición de uno o varios aminoácidos junto al extremo terminal de N y/o terminal de C de la proteína natural, mediante supresión o adición de uno o varios aminoácidos en uno o varios sitios en la proteína natural, o mediante sustitución de uno o varios aminoácidos en uno o varios sitios en la fitasa. La producción de tales variantes es por lo general conocida para un experto en la especialidad. Por ejemplo, se pueden producir unas variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos mediante una mutación en el ADN. Unos procedimientos para realizar una mutagénesis y una modificación de una secuencia de nucleótidos son bien conocidos en el sector especializado (compárense, por ejemplo, las citas de Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

82:488 (1985), de Kunkel y colaboradores, Methods in Enzymol., 154:367 (1987), el documento de patente de los EE.UU. n° 4.873.192, y de Walker y Gaastra, coordinadores de edición, Techniques in Molecular Biology (Técnicas

35 en la biología molecular), Mac Millan PubIishing Company, Nueva York (1983)). Unas menciones acerca de unas adecuadas sustituciones de aminoácidos, que no perjudican a la actividad biológica de la proteína que interesa, se encuentran en el modelo de Dayhoff y colaboradores, Atlas of Protein Sequence and Structure (Atlas de las secuencias y estructuras de proteínas), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. (1978). Se prefieren unas sustituciones conservativas tales como el intercambio de un aminoácido por otro que tiene unas propiedades similares.

Tales aminoácidos intercambiables dentro de un conjunto se exponen en la siguiente Tabla a modo de ejemplo, sin quedar limitado a ellos.

Alifáticos

No polares G A P

I L V

Polares y no cargados

C S T M N Q

Polares y cargados

D E

K R

Aromáticos

H F W Y

45 El invento se refiere también a unas composiciones de ácidos nucleicos o proteínas, aisladas o esencialmente purificadas. En este caso, el concepto de “un polinucleótido/polipéptido aislado y purificado o respectivamente un segmento de éste” designa a un polinucleótido o respectivamente a un polipéptido o respectivamente a un segmento de éstos, que se presenta aislado desde su entorno natural. Un segmento aislado de un poli(ácido nucleico) o un polipéptido se puede presentar en una forma purificada o se puede presentar en un entorno no natural, tal como, por ejemplo, en una célula anfitriona transgénica. Por ejemplo, un segmento de polinucleótido o una proteína, aislado/a

o purificado/a, o una parte biológicamente activa de éste/a, está esencialmente exento/a de otro material o medio de cultivo celular en el caso de una producción según técnicas recombinantes o está esencialmente exento/a de compuestos precursores químicos o de otros compuestos químicos. De manera preferida, un polinucleótido aislado

55 está exento de unas secuencias (de manera preferida de unas secuencias codificadoras de proteínas), que flanquean de un modo natural al ácido nucleico (es decir unas secuencias, que están localizadas junto a los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que procede el ácido nucleico. Por ejemplo, de acuerdo con diferentes formas de realización, la molécula aislada de ácido nucleico contiene menos de aproximadamente 5 kb (kilobases), 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de unas secuencias de nucleótidos, que flanquean de un modo natural a la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula, de la que se deriva el ácido nucleico. Una proteína, que está esencialmente exenta de un material celular, abarca unas composiciones de una proteína o un polipéptido con menos de aproximadamente 70 %, 50 %, 30%, 20 %, 10 % o 5 % (referido al peso en seco) de una proteína impurificadora. Cuando la proteína conforme al invento o un fragmento biológicamente activo de ésta se produce por medios recombinantes, el medio de cultivo abarca de manera preferida menos de aproximadamente 70 %, 50 %, 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (referido al peso en seco) de los compuestos precursores químicos o de las sustancias químicas no proteínicas. Unos fragmentos y unas variantes de las secuencias de nucleótidos conformes al invento o unas proteínas o unos segmentos de proteínas, que son codificadas/os de esta manera, se abarcan asimismo conforme al invento. El concepto de “fragmento” designa a una parte de la secuencia de nucleótidos o a una parte de la secuencia de aminoácidos, y por lo tanto a una parte del polipéptido o de la proteína, que es codificado/a por ésta.

El invento se refiere también a unos casetes de expresión, que se pueden utilizar para la introducción del marco de lectura abierto, que codifica una fitasa conforme al invento, en una célula anfitriona. Ellos abarcan de manera preferida una región de iniciación de la transcripción, que está unida con el marco de lectura abierto. Un casete de expresión de este tipo puede contener un gran número de sitios de corte por restricción para la inserción del marco de lectura abierto y/o de otros ADN’s, p.ej. de una región reguladora de la transcripción y/o de unos genes marcadores seleccionables. El casete de transcripción abarca en la dirección 5’-3’ de la transcripción una región de iniciación de la transcripción y de la traducción, la secuencia de ADN que interesa, y una región de detención de la transcripción y de la traducción, que es funcional en una célula microbiana. La región de terminación puede ser natural en lo que se refiere a la región de iniciación de la transcripción, puede ser natural en lo que se refiere a la secuencia de ADN que interesa o se puede derivar de otra fuente arbitraria.

La expresión “marco de lectura abierto” (ORF, acrónimo de Open Reading Frame) designa a la secuencia de aminoácidos, que es codificada entre el codón de iniciación y el codón de detención de la traducción de una secuencia codificadora. Las expresiones “codón de iniciación” y “codón de detención” designan a una unidad de tres nucleótidos contiguos (codones) en una secuencia codificadora, que especifican la iniciación y la detención de una cadena de la síntesis de proteínas (traducción del ARNm (mensajero)).

El concepto de “unión funcional” designa, en conexión con un ácido nucleico, a un compuesto de unión como una parte constituyente de la misma molécula de ácidos nucleicos en una posición y una orientación adecuadas para la iniciación de la transcripción del promotor. Un ADN en unión funcional con un promotor se encuentra bajo la regulación de la iniciación de la transcripción del promotor. Las secuencias codificadoras pueden estar unidas funcionalmente con la secuencia reguladora en una orientación en el mismo sentido o antisentido (en inglés sense or antisense). En el caso de hacerse referencia a unos polipéptidos, el concepto de "una unión funcional" significa la unión como una parte constituyente del mismo polipéptido, es decir a través de enlaces peptídicos.

Conforme al invento se pueden utilizar unos promotores arbitrarios. El concepto de “promotor” designa a la secuencia de nucleótidos que se encuentra usualmente corriente arriba (en 5’) en lo que se refiere a la secuencia codificadora y que controla la expresión de la secuencia codificadora, poniendo a disposición el reconocimiento para la polimerasa de ARN y otros factores, que son requeridos para una transcripción correcta. El promotor utilizado conforme al invento puede comprender un promotor mínimo, es decir una corta secuencia de ADN a base de una caja TATA y de otras secuencias, que especifican el sitio de iniciación de la transcripción, junto al que están adosados los elementos reguladores para el control de la expresión.

El promotor conforme al invento puede comprender también una secuencia de nucleótidos, que comprende a su vez un promotor mínimo y unos elementos reguladores, que puede controlar la expresión de una secuencia codificadora

o de un ARN funcional. Este tipo de secuencia de promotor se compone de unos elementos próximos y distantes situados corriente arriba, siendo designados los elementos citados en último lugar frecuentemente como intensificadores (del inglés enhancer). Como consecuencia, un intensificador es una secuencia de ADN, que puede estimular a la actividad del promotor y que puede ser un elemento latente en el promotor o un elemento heterólogo insertado, con el fin de reforzar a la altura (al nivel) de expresión o a la especificidad para ciertos tejidos de unpromotor. Éste puede funcionar en las dos orientaciones y puede funcionar incluso en el caso de una localización corriente arriba o corriente abajo desde el promotor. Tanto el intensificador como también otros elementos promotores situados corriente arriba fijan de un modo específico para una secuencia a unas proteínas, que se fijan a un ADN, las cuales promueven sus efectos. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen natural o pueden estar compuestos de diferentes elementos, que se derivan de diferentes promotores presentes en la naturaleza, o incluso pueden estar compuestos también de unos segmentos de ADN sintéticos. Un promotor puede contener también unas secuencias de ADN, que participan en la fijación de unos factores proteínicos, que controlan la eficiencia de la iniciación de la transcripción como respuesta a unas condiciones fisiológicas o debidas al desarrollo.

Los elementos promotores, en particular los elementos TATA, que son inactivos o que poseen una actividad promotora fuertemente disminuida en ausencia de una activación corriente arriba, son designados como promotores mínimos o promotores de núcleo. En presencia de un adecuado factor de transcripción o respectivamente de unos adecuados factores de transcripción, la función del promotor mínimo se encuentra en el hecho de hacer posible la transcripción. Un promotor mínimo o de núcleo se compone, por consiguiente, solamente de todos los elementos fundamentales, que son necesarios para la iniciación de la transcripción, p.ej. de una caja TATA y/o de un iniciador.

El invento se refiere también a los vectores que contienen ADN, conformes al invento,. Estos vectores abarcan unos arbitrarios plásmidos, cósmidos, fagos y otros vectores en una forma bicatenaria o monocatenaria, lineal o circular, que eventualmente pueden ser por sí mismos transmisibles o movilizables, y que o bien pueden transformar a un anfitrión procariótico o eucariótico mediante integración en el genoma celular o bien se presentan fuera del cromosoma (extracromosomalmente) (p.ej. unos plásmidos que se replican autónomamente con un origen de la replicación).

Unos vectores, plásmidos, cósmidos, cromosomas de levaduras artificiales (YACs, acrónimo de Yeast Artificial Chromosomes), cromosomas bacterianos artificiales (BACs, acrónimo de Bacterial Artificial Chromosomes) y unos segmentos de ADN destinados a la utilización para la transformación de células, comprenden por lo general el ADN que codifica una fitasa conforme al invento, así como otro ADN distinto, tal como un ADNc, un gen o unos genes, que deben de ser introducidos en las células. Estas construcciones artificiales de ADN pueden abarcar otras estructuras tales como promotores, intensificadores, poliengarzadores o también genes reguladores, siempre y cuando que éstas/os sean necesarias/os. Uno de los segmentos de ADN o genes, que se había(n) escogido para la introducción en las células, codifica(n) convenientemente una proteína, que es expresada en las células transformadas (células recombinantes), obtenidas de esta manera, lo que conduce a una característica escrutable o seleccionable y/o confiere a la célula transformada un fenotipo mejorado.

La construcción de unos vectores, que se pueden utilizar conforme al invento, es conocida para un experto en la especialidad en este sector a la vista de la divulgación precedente (compárese p.ej. la cita de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: Un Manual de laboratorio] (2a edición, Coldspring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)). El casete de expresión conforme al invento puede contener uno o varios sitios de corte por restricción, con el fin de poner al polinucleótido que codifica la fitasa bajo la regulación de una secuencia reguladora. El casete de expresión puede contener también una señal de terminación en unión funcional con el polinucleótido, así como unas secuencias reguladoras, que se necesitan para la traducción en debida forma del polinucleótido. El casete de expresión, que contiene el polinucleótido conforme al invento, puede ser quimérico, es decir que por lo menos uno de sus componentes es heterólogo, referido a por lo menos uno de los otros componentes. La expresión del polinucleótido en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, de un promotor inducible, de un promotor regulable, de un promotor vírico o de un promotor sintético.

Los vectores pueden contener ya unos elementos reguladores, p.ej. unos promotores, o las secuencias de ADN conformes al invento pueden ser manipuladas de tal manera que ellas contengan tales elementos. Unos elementos promotores adecuados, que se pueden utilizar, son conocidos en el sector especializado, y son, por ejemplo, para Trichoderma reesei el promotor de cbh 1 o cbh 2, para Aspergillus oryzae el promotor de amy, para Aspergillus niger los promotores de xyl, glaA, alcA, aphA, tpiA, gpdA, sucl y pkiA. Unos elementos promotores adecuados, que se pueden utilizar para la expresión en levaduras, son conocidos en el sector especializado y son, por ejemplo, el promotor de pho5 o el promotor de gap para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, y para Pichia pastoris, p.ej. el promotor de aoxl, o el promotor de fmd o el promotor de mox para H. polymorpha.

Un ADN, que es adecuado para la introducción en células, puede contener, junto al ADN conforme al invento, también un ADN, que se había derivado de una fuente arbitraria o que se ha aislado a partir de ésta. Un ejemplo de un ADN derivado es una secuencia de ADN, que había sido identificada como un fragmento útil en un organismo determinado, y que luego había sido sintetizada químicamente en una forma esencialmente pura. Un ejemplo de un tal ADN es una adecuada secuencia de ADN, que se había obtenido por ejemplo mediando utilización de unas endonucleasas de restricción, de tal manera que ella se pueda manipular ulteriormente, por ejemplo amplificar, conforme al invento. Un ADN de este tipo es designado usualmente como ADN recombinante. Por lo tanto, un ADN adecuado abarca un ADN totalmente sintético, un ADN semisintético, un ADN aislado a partir de fuentes biológicas y un ADN derivado de un ARN introducido. Por lo general, el ADN introducido no es ningún componente original del genotipo del ADN del organismo receptor, pero conforme al invento también un gen se puede aislar y modificar eventualmente a partir de un genotipo establecido, y a continuación se pueden introducir múltiples copias del gen en el mismo genotipo, p.ej. con el fin de reforzar la producción de un producto génico establecido.

El ADN introducido abarca sin restricciones un ADN procedente de unos genes, tal como, por ejemplo, de bacterias, levaduras, hongos o virus. El ADN introducido puede abarcar unos genes modificados o sintéticos, unas partes de genes o unos genes quiméricos, inclusive unos genes procedentes del mismo genotipo o de un genotipo diferente.

El ADN utilizado para la transformación conforme al invento puede ser circular o lineal, bicatenario o monocatenario. Por lo general, el ADN se presenta en forma de un ADN quimérico, tal como un ADN plasmídico, que contiene también unas regiones codificadoras, que están flanqueadas por unas secuencias reguladoras, las cuales apoyan a la expresión del ADN recombinante presente en la célula transformada. Por ejemplo, el ADN propiamente dicho puede contener, o se puede componer de, un promotor, que es activo en una célula, que se deriva de una fuente, que se diferencia de la célula, o se puede utilizar un promotor, que ya está presente en la célula, es decir la célula diana de la transformación.

Por lo general, el ADN introducido es relativamente pequeño, de menos que aproximadamente 30 kb, para minimizar la sensibilidad frente a una degradación física, química o enzimática, que aumenta con el tamaño del ADN.

La selección de un adecuado vector de expresión depende de las células anfitrionas. Los vectores de expresión en levaduras u hongos pueden comprender un origen de la replicación, un promotor y un intensificador adecuados, y abarcan también unos/as arbitrarios/as y necesarios/as sitios de fijación a ribosomas, sitios de poliadenilación, sitios de donantes y aceptores de empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias flanqueadoras en 5' no transcritas.

Ejemplos de células anfitrionas adecuadas son: células de hongos de los géneros Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium, etc., tales como, por ejemplo, levaduras, de los géneros Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula, Pichia y similares. Unos sistemas de anfitriones adecuados son, por ejemplo, unos hongos tales como Aspergilli, p.ej. Aspergillus niger (ATCC 9142) o Aspergillus ficuum (NRLL 3135) o Trichoderma (p.ej. Trichoderma reseei QM6a) y unas levaduras tales como Saccharomyces, p.ej. Saccharomyces cerevisiae o Pichia, tales como p.ej. Pichia pastoris o Hansenula, p.ej. H. polymorpha (DSMZ 70277). Tales microorganismos se pueden obtener a partir de unos sitios de presentación reconocidos, p.ej. de la American Type Culture Collection (ATCC), de la Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) o de la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) o de cualesquiera otros sitios de presentación.

El casete de expresión puede contener en la dirección de transcripción 5’-3’ una región de iniciación de la transcripción y de la traducción del polinucleótido conforme al invento y una región de transcripción y terminación, que es funcional in vivo o in vitro. La región de terminación puede ser natural en lo que se refiere a la región de iniciación de la transcripción o puede ser natural en lo que se refiere al polinucleótido o puede ser de otra procedencia. Las secuencias reguladoras pueden estar localizadas corriente arriba (secuencias no codificadoras en 5'), dentro (un intrón) o corriente abajo (secuencias no codificadoras en 3') de una secuencia codificadora, e influyen sobre la transcripción, el procesamiento del ARN o la estabilidad y/o la traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden comprender, sin limitaciones, unos/as intensificadores, promotores, sitios de fijación a represores, secuencias directoras de la traducción, intrones o secuencias de señal de poliadenilación. Ellas pueden comprender unas secuencias naturales o sintéticas así como unas secuencias, que constituyen una combinación de secuencias sintéticas y naturales.

El vector utilizado conforme al invento puede comprender también unas secuencias adecuadas para la amplificación de la expresión.

Ejemplos de unos promotores, que se pueden utilizar conforme al invento, son unos promotores, de los que se sabe que ellos controlan la expresión en las células eucarióticas. Se pueden utilizar cualesquiera promotores con la capacidad para la expresión en hongos filamentosos. Ejemplos de ellos son un promotor, que es inducido fuertemente por un almidón o una celulosa, p.ej. un promotor para glucoamilasa o a-amilasa del género Aspergillus o la celulasa (celobiohidrolasa) del género Trichoderma, un promotor para unas enzimas en la ruta glicolítica del metabolismo, tal como, por ejemplo, la fosfoglicerato cinasa (PGK) y la glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD), etc. Se prefiere el promotor de la celobiohidrolasa I, de la celobiohidrolasa II, de la amilasa, de la glucoamilasa, de la xilanasa o de la enolasa.

Son conocidos dos métodos principales para el control de la expresión, a saber una sobreexpresión y una infraexpresión. Una sobreexpresión se puede conseguir mediante inserción de una o varias copias suplementarias del gen escogido. Para la infraexpresión existen dos métodos principales, que se designan usualmente en el sector especializado como “regulación descendente antisentido (en inglés antisense downregulation)” y “regulación descendente en el mismo sentido (en inglés sense downregulation)”. Por lo general, estos procedimientos se designan como “silenciamiento de genes (en inglés gene silencing)”. Ambos de estos métodos conducen a una inhibición de la expresión del gen diana.

Adicionalmente a la utilización de un promotor especial, otros tipos de elementos pueden influir sobre la expresión de transgenes. En particular, se mostró que ciertos intrones poseen un potencial para el refuerzo de la expresión de transgenes.

El casete de expresión puede comprender todavía otros elementos, por ejemplo los que pueden ser regulados por unos elementos endógenos o exógenos tales como proteínas de dedo de zinc, inclusive unas proteínas de dedo de zinc que se presentan en la naturaleza o unas proteínas de dedo de zinc quiméricas.

El casete de expresión utilizado conforme al invento puede contener adicionalmente unos elementos intensificadores

o elementos promotores situados corriente arriba.

Los vectores destinados a la utilización conforme al invento se pueden construir de tal manera que ellos contengan un elemento intensificador. Las construcciones artificiales conformes al invento comprenden por consiguiente el gen que interesa en común con una secuencia de ADN en 3', que actúa como una señal, a fin de terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del ARNm así obtenido. Se pueden utilizar cualesquiera secuencias de señal, que hacen posible la secreción a partir del organismo anfitrión escogido. Una secuencia de señal preferida es la secuencia de señal de la fitasa procedente de Aspergillus niger o unas secuencias de señal derivadas de ésta para la secreción a partir de hongos filamentosos.

También se puede utilizar una secuencia directora (en inglés leader) especial, puesto que la secuencia de ADN situada entre el sitio de iniciación de la transcripción y el comienzo de la secuencia codificadora, es decir de la secuencia directora no traducida, puede influir sobre la expresión génica. Unas secuencias directoras preferidas comprenden unas secuencias, que controlan la expresión óptima del gen adosado, es decir que comprenden una preferida secuencia directora de consenso, que aumenta o conserva la estabilidad del ARNm, y que impide una iniciación inadecuada de la traducción. La elección de tales secuencias es bien conocida para un experto en la especialidad en este sector.

Con el fin de mejorar la posibilidad de identificar a los transformantes, un gen marcador seleccionable o escrutable se puede recoger en el casete de expresión. Tales genes marcadores son bien conocidos para un experto en la especialidad en este sector.

El casete de expresión o una construcción artificial de vector, que contiene el casete de expresión, se introduce en una célula anfitriona. Están disponibles un gran número de técnicas y éstas son bien conocidas para un experto en la especialidad en el sector para la introducción de construcciones artificiales en una célula anfitriona. La transformación de células microbianas se puede llevar a cabo mediando utilización de un poli(etilenglicol), cloruro de calcio, una infección vírica, DEAE-dextrano, unas infecciones por fagos, una electroporación y otros métodos conocidos para un experto en la especialidad. La transformación de hongos se puede llevar a cabo según Penttilä y colaboradores, Gene 61:155-164, 1987. La introducción de un vector recombinante en levaduras se puede llevar a cabo según unos procedimientos en sí conocidos, inclusive la electroporación, la utilización de esferoplastos, de acetato de litio y otros similares.

Tan pronto como se haya obtenido el casete de expresión conforme al invento o respectivamente la secuencia de ADN conforme al invento, él/ella se puede introducir en unos vectores según unos procedimientos en sí conocidos, con el fin de sobreexpresar el polipéptido codificado en adecuados sistemas de anfitriones. Sin embargo, también se pueden utilizar unas secuencias de ADN como tales, con el fin de transformar a unos adecuados sistemas de anfitriones, y para conseguir una sobreexpresión del polipéptido codificado.

Tan pronto como una secuencia de ADN conforme al invento hubo sido expresada en una célula anfitriona adecuada en un medio adecuado, la fitasa codificada puede ser concentrada y/o aislada según unos procedimientos en sí conocidos o bien a partir del medio, en el caso de que la fitasa sea segregada en el medio, o a partir del organismo anfitrión, en el caso de que la fitasa esté presente intracelularmente p.ej. en el espacio periplasmático. Unos procedimientos conocidos para la separación de los componentes insolubles del medio de cultivo y de la biomasa, seguidos por unos procedimientos para el aumento de la concentración de la fitasa, se pueden usar para la producción de unas soluciones concentradas de la fitasa, o como una preparación previa para la desecación de la fitasa. Por ejemplo, se pueden utilizar unos procedimientos de filtración o unos procedimientos de centrifugación para la separación de los componentes insolubles, seguidos por unos procedimientos de ultrafiltración para el aumento de la concentración, o se usan unos procedimientos de filtración en flujo cruzado (en inglés cross-flow). La desecación se puede efectuar mediante una desecación por congelación (liofilización) y por atomización, unos procedimientos de granulación, una extrusión u otros procedimientos. Se pueden utilizar unos procedimientos conocidos de purificación de proteínas, con el fin de aislar a las fitasas conformes al invento. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes procedimientos de cromatografía o de cromatografía en gel individualmente o en combinación. En dependencia de la célula anfitriona utilizada en el caso de un procedimiento de producción por vía recombinante, la enzima conforme al invento puede ser modificada covalentemente mediante glicosilación, o no. En unas células eucarióticas la glicosilación de las proteínas segregadas sirve para modular el plegamiento de las proteínas, la estabilidad de la conformación, la estabilidad térmica y la resistencia frente a una proteólisis. En lo que se refiere a un uso específico de la fitasa, una variante glicosilada de la enzima se puede preferir con respecto a una variante no glicosilada. Por ejemplo, la utilización de una fitasa glicosilada en un pienso para animales sirve para la protección de la enzima contra una desnaturalización térmica durante la granulación del pienso y contra una desactivación proteolítica al efectuar el paso por el estómago del animal, con lo que se favorece la distribución de la enzima activa en el tracto gastrointestinal y en el sitio de acción. Para unos usos en la elaboración de alimentos, en los que la actividad enzimática es deseada sólo durante la elaboración y no en el producto final, se puede preferir una fitasa inestable térmicamente, es decir no glicosilada, y que es más sensible frente a una degradación proteolítica.

El invento se refiere también a unas composiciones de fitasas, que contienen el polipéptido conforme al invento. Por lo general, las composiciones de fitasas son líquidas o secas. Unas composiciones líquidas contienen la enzima fitasa de manera preferida en una forma purificada o enriquecida. Sin embargo, también se pueden añadir unas sustancias auxiliares tales como, por ejemplo, un agente estabilizador tal como glicerol, sorbitol o mono(propilenglicol), unos aditivos tales como sales, azúcares, sustancias conservantes, agentes para el ajuste del valor del pH, proteínas y un fitato o sales de fosfatos de mioinositol (que son un substrato de fitasa). Unas típicas composiciones líquidas son suspensiones acuosas u oleosas. Las composiciones líquidas se pueden añadir a un alimento o pienso antes o después de una posible granulación o respectivamente etapa de elaboración.

Las composiciones secas pueden ser unas composiciones liofilizadas, secadas por atomización, granuladas o extrudidas, que pueden contener exclusivamente la enzima. Antes de la desecación se pueden añadir también ciertas sustancias con el fin de regular el valor del pH, así como otros aditivos y materiales de relleno tales como maltodextrina, lactosa, polvo de leche desnatada, sales de cationes divalentes tales como las de Mg, Ca, Zn, etc. Las composiciones secas pueden ser unos granulados, que se pueden mezclar fácilmente, por ejemplo, con alimentos o componentes de piensos, o que de manera más preferida forman un componente de una mezcla previa. El tamaño de partículas del granulado de enzima es de manera preferida compatible con el de los otros componentes de la mezcla. Esto hace posible unos medios seguros y convenientes, con el fin de incorporar enzimas, por ejemplo, en alimentos, mezclas previas o piensos procesados/as.

Por ejemplo, se puede preparar una formulación estable de la enzima fitasa conforme al invento mediante el recurso de que una mezcla a base de una solución líquida de la enzima se rocía sobre un agente de relleno tal como maltodextrina, y luego la mezcla se seca, o a la solución líquida de la enzima se le añaden antes de la desecación 20 % - 60 % de polvo de leche desnatada (en p/p referido a la proteína total de la solución de la enzima) y/o 1 % 5 % de propionato de calcio (en p/p referido a la proteína total de la solución de la enzima) y el valor del pH se ajusta a un valor definido, en particular a un pH de 5,2 ± 0,5. La disminución de la humedad y las interacciones de fijación de la fitasa con el agente de relleno protegen a la enzima adicionalmente a su estabilidad definida por su estructura contra unas influencias del medio ambiente tales como unas temperaturas extremadas, que pueden aparecer durante la producción del pienso. Unas formulaciones secas y líquidas se pueden estabilizar adicionalmente, cuando se disminuye la actividad de unas potenciales enzimas proteolíticas, que pueden estar presentes como productos secundarios en la mezcla líquida de fermentación, que se utiliza para la producción de la enzima conforme al invento. La mezcla seca de enzimas, así obtenida, se puede utilizar como un complemento de pienso para la utilización en la cría de aves de corral y de cerdos. Además, una disminución de la suplementación con fosfato conduce a una disminución de la impurificación con fosfato, que, por su parte, disminuye significativamente la carga para el medio ambiente causada por una cría intensiva de animales.

Tan pronto como se haya obtenido un preparado seco de enzimas, se puede producir a partir de éste un granulado por aglomeración en unas etapas adicionales. Para esto, se utiliza un mezclador con altas fuerzas de cizalladura, con el cual el material de relleno y la enzima se aglomeran concomitantemente y se forma un granulado. Unos granulados por absorción se producen revistiendo unos núcleos a base de un material de soporte por medio de la enzima conforme al invento. Unos típicos materiales de relleno son ciertas sales tales como sulfato de disodio. Otros materiales de relleno comprenden caolín, talco, un silicato de magnesio y aluminio y fibras de celulosa. Eventualmente, unos agentes aglutinantes tales como dextrinas se recogen también en el granulado por aglomeración.

Unos típicos materiales de soporte comprenden un almidón, p.ej. en forma de mandioca, patatas y cereales, en particular maíz, arroz y trigo, o unos productos que contienen proteínas, tales como p.ej. una proteína de soja. También se pueden utilizar ciertas sales. El granulado se envuelve eventualmente con una mezcla de revestimiento. Una tal mezcla comprende unos agentes de revestimiento, de manera preferida unos agentes de revestimiento hidrófobos, un aceite de palma deshidrogenado y talco, y eventualmente otros aditivos tales como un carbonato de calcio o caolín con el fin de mejorar la biodisponibilidad en el sitio de acción conforme a las estipulaciones.

Adicionalmente, las mezclas con una fitasa pueden contener otras sustancias tales como agentes conferidores de color, compuestos aromatizantes, agentes estabilizadores, vitaminas, minerales, otras enzimas para alimentos o piensos, y similares. Esto es válido en particular para las denominadas mezclas previas.

Un aditivo para alimentos o piensos es un compuesto esencialmente puro o una composición de varios compuestos, que está destinado/a o es adecuado/a para ser añadido/a a alimentos o piensos. En particular, es una sustancia, que, conforme a su finalidad de utilización, es un componente de un alimento o pienso, o que influye sobre las propiedades de un producto de alimento o pienso. Así, un aditivo de fitasa debe de designar a una fitasa, que no constituye ningún componente natural de las sustancias que se utilizan predominantemente para alimentos y piensos, o que no están presentes en ellos en su concentración natural. Por ejemplo, la fitasa se añade al pienso por separado de las sustancias del pienso, a solas o en combinación con otros aditivos para piensos. Una típica mezcla previa comprende usualmente uno o varios compuestos tales como vitaminas, minerales o enzimas reforzadoras de piensos y unos adecuados vehículos y/o excipientes.

Un aditivo de fitasa presto para el uso es un aditivo, que no es producido in situ en piensos para animales o en alimentos elaborados. Un aditivo de fitasa presto para el uso se puede administrar a los seres humanos o animales directamente o de manera preferida directamente después de la mezcladura con otros componentes del pienso o del alimento. Por ejemplo, un aditivo para piensos de acuerdo con este aspecto del presente invento se reúne con otros piensos y aditivos para piensos mediando obtención de una mezcla previa o de un pienso de complemento. Tales otros componentes de piensos comprenden uno o varios otros suplementos enzimáticos (de manera preferida termoestables), otros aditivos para piensos, piensos minerales y aminoácidos. Los aditivos para piensos (combinados) obtenidos de esta manera, pueden comprender varios tipos diferentes de compuestos y se pueden mezclar luego en su cantidad adecuada con los piensos, tales como soportes y vehículos de cereales y proteínas, mediando formación de un pienso compuesto para animales. La elaboración de estos componentes para dar un pienso para animales se puede llevar a cabo con unos dispositivos de elaboración en sí conocidos tales como una máquina de granulación doble, un granulador con vapor, un expansor o una extrusora.

De manera similar, un aditivo para alimentos de acuerdo con esta forma de realización del presente invento se puede reunir con otros componentes de alimentos, con lo que se producen unos productos alimenticios elaborados. Tales otros componentes de alimentos abarcan uno/a o varios/as suplementos enzimáticos, vitaminas, minerales y elementos traza. El agente de complemento nutritivo combinado, obtenido de esta manera, se puede mezclar luego en una cantidad adecuada con otros componentes de alimentos tales como cereales y proteínas vegetales, con el fin de proporcionar un alimento elaborado. La elaboración de estos componentes para dar un alimento elaborado se puede llevar a cabo mediando utilización de unos dispositivos de elaboración en sí conocidos.

En una forma preferida de realización, las composiciones de fitasas conformes al invento comprenden adicionalmente una cantidad eficaz de una o varias enzimas para alimentos o piensos, de manera preferida escogidas entre alfa-galactosidasas, beta-galactosidasas, laccasas, otras fitasas, fosfatasas, endoglucanasas, en particular endo-beta-1,4-glucanasas, endo-beta-1,3(4)-glucanasas, endo-1,2-beta-glucanasas y endo-1,3-alfaglucanasas, celulasas, xilosidasas, galactanasas, en particular arabinogalactano-endo-1,4-beta-galactosidasas y arabinogalactano-endo-1,3-beta-galactosidasas, enzimas que degradan a las pectinas, en particular pectinasas, pectina esterasas, pectina liasas, poligalacturonasas, arabananasas, ramnogalacturonasas, ramnogalacturonacetil esterasas, ramnogalacturonano alfa-ramnosidasas, pectato liasas, y alfa-galacturonidasas, mananasas, betamanosidasas, mananacetil esterasas, xilanacetil esterasas, proteasas, xilanasas, arabino xilanasas y enzimas lipolíticas tales como lipasas, fosfolipasas y cutinasas.

El aditivo de piensos para animales conforme al invento se administra al animal antes de, o al mismo tiempo que, el pienso. De manera preferida, el aditivo de piensos para animales conforme al invento se administra al animal al mismo tiempo que el pienso.

Una cantidad eficaz de la una fitasa en alimentos o piensos es de aproximadamente 10 - 20.000 PPU*/kg, de manera preferida de 10 - 15.000 PPU/kg, de manera más preferida de 10 - 10.000 PPU/kg, en particular de aproximadamente 50 - 5.000 PPU/kg, en particular de 50 - 2.000 PPU/kg del pienso o alimento.

* PPU = utilización de fósforo de fitasa (acrónimo de Phytase Phosphor Utilization)

El invento se refiere también a la utilización de una fitasa para la elaboración y producción de alimentos y piensos. Los cereales y las harinas para alimentos se pueden tratar enzimáticamente con una fitasa, con el fin de disminuir el contenido de fitina de las materias primas. Unos contenidos disminuidos de fitina mejoran la calidad de los alimentos por el hecho de que se aumenta la disponibilidad de minerales esenciales tales como hierro, calcio y zinc. Adicionalmente al aumento de la calidad de los alimentos, la utilización de una fitasa durante la elaboración puede mejorar la eficiencia global de la producción de los alimentos. Por ejemplo, la adición de una fitasa a copos blancos de soja durante la producción de un material aislado de proteína de soja puede aumentar significativamente el rendimiento y la calidad de la proteína extraíble. En este caso, la fitasa es activa solamente durante la producción y la elaboración, y ya no es activa en el producto final. Este aspecto es importante en particular en el caso de la producción de una masa de panificación y al cocer pan, y en el caso de la producción de otros productos prestos para ser consumidos, constituidos sobre la base de cereales. De un modo similar, se pueden tratar previamente unos componentes de piensos, tales como una harina de soja tostada o una harina de canola, con una fitasa antes del proceso de producción propiamente dicho. La eliminación de factores anti-nutritivos en unos componentes de piensos antes de la producción conduce a una calidad fisiológicamente más alta y a unas más valiosas sustancias constitutivas de piensos para animales. En el caso de estos procedimientos de elaboración, la fitasa es activa durante la producción, y por regla general ya no es activa en el tracto digestivo del animal después de una absorción del pienso tratado.

Adicionalmente a la utilización de una fitasa como un agente auxiliar para la elaboración de piensos, el presente invento se refiere a la utilización de la fitasa conforme al invento como un medio auxiliar de la digestión. Una fitasa en forma de tabletas puede ser ingerida conjuntamente con la ingestión de un alimento, con el fin de distribuir a la enzima activa en el tracto gastrointestinal.

La fitasa conforme al invento puede pasar a emplearse asimismo de manera ventajosa en los casos de animales tanto monogástricos como también poligástricos, en particular en el caso de terneros jóvenes. Los piensos para peces y crustáceos se pueden suplementar asimismo con una fitasa, con el fin de mejorar el aprovechamiento del pienso y disminuir el contenido de fósforo segregado en el caso de una cría intensiva de animales. El pienso conforme al invento se puede administrar también a unos animales tales como aves de corral, p.ej. pollos de engorde, pavos, gansos, patos, así como cerdos, caballos, reses de vacuno, reses de bovino, cabras, perros y gatos, así como peces y crustáceos. Sin embargo, es especialmente preferido que el pienso conforme al invento sea administrado a cerdos o aves de corral.

Unas formulaciones de fitasas conformes al invento se pueden combinar también con otras sustancias constitutivas, con lo cual resultan unas composiciones de piensos nuevas y especialmente ventajosas. Puesto que, como se ha expuesto precedentemente, la disponibilidad de fosfato vegetal es baja en la harina de soja y en los cereales como consecuencia de la fijación al ácido fítico, se añade al pienso un fosfato inorgánico, con el fin de garantizar un abastecimiento adecuado con fósforo de los animales. Sin embargo, estos piensos contienen demasiada cantidad de fosfato total y conducen de esta manera a una contaminación del medio ambiente con fosfato. Especialmente, el pienso para animales conforme al invento comprende la combinación de una fitasa conforme al invento con unas sustancias constitutivas de piensos para animales, con el fin de proporcionar un pienso que tenga unos contenidos esencialmente reducidos de fósforo inorgánico añadido. En una forma de realización preferida, el pienso conforme al invento comprende unas/os típicas/os sustancias constitutivas de piensos, micronutrientes, elementos traza, vitaminas, etc., así como una cantidad eficaz de una fitasa y de fósforo inorgánico, estando comprendidas las cantidades de la fitasa y del fósforo entre 50 y 20.000 unidades de fitasa/kg de pienso y menos que 0,45 % de fósforo inorgánico, de manera preferida con unos contenidos situados entre 100 y 10.000 unidades de fitasa/kg de pienso y menos que 0,225 % de fósforo inorgánico, en particular unos contenidos de 150 - 10.000 unidades de fitasa/kg de pienso y menos que 0,15 % de fósforo inorgánico, en particular unos contenidos de 200 - 20.000 unidades de fitasa/kg de pienso y ninguna adición adicional de fósforo inorgánico.

El invento se refiere también a unos procedimientos para el mejoramiento del aumento del peso y de la capacidad de aprovechamiento del pienso (en inglés Feed Conversion Ratio, FCR = relación de conversión de un alimento) en la nutrición de animales así como a la utilización de las fitasas conformes al invento en estos procedimientos. Una fitasa conforme al invento permite unos aumentos mejorados del peso y una mejorada capacidad de aprovechamiento del pienso, en particular en conexión con un pienso, que contiene poca cantidad de fosfato inorgánico. De acuerdo con el procedimiento conforme al invento, el contenido de fosfato inorgánico en el pienso puede ser reducido por debajo de unos contenidos de 0,45 %, de manera preferida por debajo de 0,225 %. De manera preferida, no se añade nada de fosfato inorgánico. Mediante una aumentada disponibilidad de fosfato como consecuencia de la adición de la enzima conforme al invento, se puede mejorar significativamente la mineralización de los huesos de los animales, lo que tiene una gran importancia en particular en el caso de los animales que crecen rápidamente.

De acuerdo con todavía otra forma de realización, el invento se refiere a la utilización de la enzima conforme al invento al cocer pan (es decir panificar), con lo cual se mejoran la evolución, la elasticidad y/o la estabilidad de la masa de panificación y/o el volumen, la estructura de la miga y/o la resistencia del material panificado frente el fenómeno del asentamiento. A pesar de que el preparado enzimático conforme al invento se puede utilizar para la producción de una masa de panificación o de productos panificados a partir de cualesquiera tipos de harina, p.ej. sobre la base de centeno, cebada, avena o maíz, el preparado enzimático conforme al invento se acreditó como especialmente útil en el caso de la producción de unas masas de panificación o de unos productos panificados a base de trigo o de una proporción esencial de trigo. Los productos panificados, que se pueden producir con un preparado enzimático conforme al invento, comprenden pan, panecillos, baguettes y similares. Para la panificación, el preparado enzimático conforme al invento se puede utilizar con una actividad enzimática adicional tal como p.ej. la de xilanasa, lipasa, amilasa, oxidasa o laccasa, junto a la de fitasa, o se puede utilizar en combinaciones con otras enzimas tales como una lipasa, amilasa, oxidasa (p.ej. glucosaoxidasa o peroxidasa).

Las Figuras adjuntadas ilustran el invento más detalladamente:

Fig. 1:

mapa plasmídico de pET-PhyM2

Fig. 2:

mapa plasmídico de pAB490-PhyM2

Fig. 3:

mapa plasmídico de pUC-PhyM3

Fig. 4:

mapa plasmídico de pAB489-PhyM3

Fig. 5:

mapa plasmídico de pUC-PhyM10

Fig. 6:

mapa plasmídico de pAB600-PhyM10

Fig. 7:

mapa plasmídico de pPhy2005

Fig. 8:

mapa plasmídico de pAB-Phy2005

Fig. 9:

mapa plasmídico de pPhy2006

Fig. 10: mapa plasmídico de pAB-Phy2006

Fig. 11: comparación de las secuencias de unos mutantes individuales conformes al invento así como de unos mutantes de referencia constituidos sobre la base de la secuencia de tipo silvestre (Dassa). Se han resaltado las mutaciones o respectivamente variaciones.

5 Los siguientes Ejemplos ilustran el invento más detalladamente.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Determinación de la actividad de fitasa

La actividad de fitasa se midió en una mezcla de ensayo a base de 0,5 % de ácido fítico (aproximadamente 5 mM), y de citrato de sodio 200 mM, de pH 5,0. Después de una incubación durante 15 minutos a 37ºC, se interrumpió la reacción mediante la adición de un volumen igual de ácido tricloroacético al 15 %. Los iones de fosfato liberados se determinaron cuantitativamente a 820 nm por mezcladura de 100 μl de la mezcla de ensayo con 900 μl de H2O y

15 1 ml de H2SO4 0,6 M, 2 % de ácido ascórbico y 0,5 % de molibdato de amonio, después de haber incubado a 50ºC y de un período de tiempo de 20 min. Como referencia se utilizaron unas soluciones patrón de fosfato de potasio.

Ejemplo 2 - Construcción de los plásmidos pET-PhyM2 y pAB490-PhyM2 (genotipo PhyM2)

La construcción del plásmido pAB490-PhyM2 se efectuó mediante las siguientes etapas:

1. Construcción del pET-PhyM2

El plásmido pET-PhyM2 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli (Dassa y colaboradores 1990, n° de acceso 25 M58740) con las modificaciones de los aminoácidos N139R y D142E.

La secuencia de ADN, que con el codón CAG (Gln) en la posición 1 comprende un marco de lectura abierto de 1.230 pb (pares de bases) y que codifica una enzima con 410 aminoácidos, fue introducida mediando utilización del uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) en el plásmido pET26b(+) (Novagen, Alemania, modificado por Brain, Alemania). Para la realización de las mutagénesis se utilizó un método orientado a oligonucleótidos que está basado en una PCR. Partiendo del plásmido, que contiene el gen que codifica la secuencia de aminoácidos de Dassa de tipo silvestre, para cada triplete que debe de ser reemplazado se sintetizaron dos cebadores complementarios con las respectivas mutaciones, estando localizada la mutación en cada caso en el centro del cebador. Con ayuda de ambos cebadores se amplificó entonces el plásmido total. El plásmido obtenido con las

35 mutaciones para el genotipo M2 tiene la denominación pET-PhyM2.

Para la construcción se utilizaron los siguientes cebadores.

a) Para las mutaciones en la posición 139:

b) Para las mutaciones adicionales introducidas seguidamente en la posición 142:

45 El plásmido se ha representado en la Fig. 1 y ha sido presentado bajo el número de presentación DSM 18715 el 18.10.2006.

2. Construcción de pAB490-PhyM2

Para la construcción del plásmido pAB490-PhyM2 se amplificó el gen PhyM2 que codifica la fitasa de E. coli, a partir del plásmido pET-PhyM2 mediante una PCR. El producto de la PCR fue cortado con las enzimas de restricción SpeI y PacI e insertado en los sitios de corte con SpeI y PacI detrás del fragmento del gen cbhII de T. reesei en el plásmido pAB490. De esta manera resultó un marco de lectura abierto, que codifica la fusión CBHII-KexIII-PhyM2.

55 El plásmido resultante tiene la denominación pAB490-PhyM2 (Fig. 2) y fue cartografiado mediante endonucleasas de restricción. La secuencia de la fitasa fue confirmada mediante secuenciación.

El plásmido pAB490 se basa en pUC18 y contiene el fragmento del gen cbhII (los nucleótidos 1-307 corresponden a los aminoácidos M1 hasta S86, Teeri y colaboradores, 1987, Gene 51: 43-52, n° de acceso 16190) bajo el control del promotor de cbHI y el terminador de cbhI procedentes del plásmido pALK487 (véase el documento WO 94/28117). Un fragmento de EcoRI/SpeI del plásmido PALK424 con una longitud de 4,78 kb, de extremos lisos, (véase el documento WO 93/24621), que contenía el marcador de amdS y las secuencias flanqueadoras en 3' de

5 cbhI, se incorporó en el sitio de corte con StuI junto al extremo de 3’ del terminador de cbhI. Además de esto, se introdujeron otros sitios de corte (con SpeI y PacI) corriente abajo del fragmento del gen cbhII. Estos sitios de corte se utilizaron para la clonación directa de las variantes de la fitasa.

El casete de expresión aislado a partir del plásmido pAB490-PhyM2 contiene el siguiente material genético:

El promotor de cbhI (celobiohidrolasa I): El fragmento de EcoRI/SacII con una longitud de 2,2 kb, que contiene el promotor de cbhI, procede de Trichoderma reesei QM6a. La región de promotor funciona también como un ADN homólogo (en común con el fragmento de 3' de cbhI; véase a continuación), con el fin de controlar la integración del ADN en fase de transformación en el sitio (locus) de cbhI.

15 Un fragmento del gen cbhII: El fragmento del gen cbhII con una longitud de 307 pb con una secuencia de señal está directamente bajo el control del promotor de cbhI.

La secuencia de la fitasa de E. coli, que contiene la mutación de los aminoácidos N139R y D142E, se ha fusionado mediante un sitio de corte con KexII junto al extremo de 3’ del fragmento del gen cbhII. La secuencia Kex contiene los siguientes aminoácidos: RTLVKR.

El terminador de cbhI: El fragmento de BamHI/StuI con una longitud de 0,75 kb, que contiene el terminador de cbhI, se adosó directamente a continuación de la fitasa de E. coli, con el fin de garantizar la terminación de la

25 transcripción.

El gen amdS: El gen, inclusive su promotor y su terminador, se aisló a partir de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 y codifica la acetamidasa (Hynes y colaboradores, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4:475-479). La acetamidasa permite a la cepa crecer mediando utilización de acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se utilizó para la selección de los transformantes

El fragmento de 3' de cbhI: El fragmento (de 1,7 kb, de BamHI/EcoRI, que comienza a 1,4 kb detrás del codón de detención del gen) se aisló a partir de T. reesei ALKO2466. La cepa ALKO2466 procede de la cepa ALKO233 (Harkki y colaboradores, 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). El fragmento de 3' se utiliza en común con la

35 región de promotor, con el fin de integrar de un modo dirigido al objetivo el casete de expresión de la fitasa en el sitio de cbhI mediante una recombinación homóloga.

La secuencia del plásmido pAB490-PhyM2 fue confirmada mediante cartografiado con enzimas de restricción y secuenciación.

Ejemplo 3 - Construcción de los plásmidos pET-PhyM7 y pAB490-PhyM7 (genotipo PhyM7) (como referencia)

El plásmido pET-PhyM7 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli (Dassa y colaboradores 1990, n° de acceso M58740) mediando utilización del uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) con la mutación

45 K74D. La construcción así como la clonación del plásmido pET-PhyM7 se efectuaron de una manera análoga a la producción, descrita en el Ejemplo 2, del plásmido pET-PhyM2. Los cebadores utilizados para la introducción de las mutaciones en la posición de aminoácidos 74 son:

El plásmido pET-PhyM7 ha sido presentado bajo el número de presentación DSM 18716 el 18.10.2006.

La construcción así como la clonación del plásmido pAB490-PhyM7 se efectuaron de una manera análoga a la producción descrita en el Ejemplo 2 del plásmido pAB490-PhyM2. La secuencia del plásmido pAB490-PhyM7 fue confirmada mediante secuenciación. El casete de expresión aislado a partir del plásmido pAB490-PhyM7 contiene,

55 por lo tanto, con la excepción de la nueva secuencia específica de la fitasa del genotipo PhyM7, los mismos elementos que se han descrito en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4 - Construcción de los plásmidos pUC-PhyM3 y pAB489-PhyM3 (genotipo PhyM3)

(como referencia)

mutación V200P. La secuencia de ADN con el codón CAG (Gln) en la posición 1 abarca un marco de lectura abierto con una longitud de 1.230 pb y codifica una enzima con 410 aminoácidos. Se utilizó el péptido de señal con una longitud de 18 aminoácidos de la fitasa de A. niger, con el fin de segregar el mutante de la fitasa de E. coli a partir de Trichoderma reesei.

Partiendo del plásmido, que contiene el gen que codifica la secuencia de aminoácidos de Dassa de tipo silvestre, se llevó a cabo la mutación V200P mediante el método de PCR de una manera análoga al principio de Tomic y colaboradores (1990, Nucleic Acids Research, 18 (6), 1656) y de Valette y colaboradores (1989, Nucleic Acids Research, 17 (2), 723-733). El producto de la PCR fue cortado con AvrII y PacI e insertado en los sitios de corte con SpeI y PacI detrás del promotor de cbhI de T. reesei en el plásmido pAB489. En el plásmido pAB489-PhyM3 resultante de nuevas, el gen para la variante de la fitasa de E. coli PhyM3 con la secuencia de señal modificada de la fitasa de A. niger –MGVSAILLPLYLLSGVTS- (Mullaney y colaboradores, Appl Microbiol Biotechnol, 1991, 35(5), 611-614, n° de acceso M94550) está directamente bajo el control del promotor de cbhI. Se utilizó el péptido de señal con una longitud de 18 aminoácidos de la fitasa de A. niger, con el fin de segregar el mutante de la fitasa de E. coli a partir de Trichoderma reesei. Los 16 pares de bases (CCGCGGACTGCGCATC atg) situados corriente arriba del codón de iniciación, que pertenecen al promotor de T. reesei (Shoemaker y colaboradores 1983, Bio/Technology 1, 691-696), fueron modificados después de la incorporación del fragmento de AvrII-PacI de la fitasa en los sitios de corte con SpeI y PacI en el plásmido pAB489 para dar CCGCGGACTAGGCATC atg.

La construcción artificial pAB489-PhyM3 (Fig. 4) fue confirmada mediante cartografiado y secuenciación.

La construcción del plásmido pAB489 se efectuó mediante las siguientes etapas:

A partir del plásmido pALK487 (véase el documento WO 94/28117), mediante introducción de otros sitios de corte (con SpeI y PacI, CCGCGGACTAGTCCTTAATTAACCGCGG) en el sitio de SacII entre el promotor de cbhI y el terminador de cbhI, se produjo el plásmido pAB487. Los sitios de corte con SpeI y PacI se utilizan para la clonación directa de las variantes de la fitasa. Un fragmento de EcoRI/SpeI con una longitud de 4,78 kb, de extremos lisos, del plásmido pALK424 (véase el documento WO 93/24621), que contenía el marcador de amdS y las secuencias flanqueadoras en 3' de cbhI, se insertó en el sitio de corte con StuI de pAB487, con lo que se obtuvo el vector pAB489.

El casete de expresión aislado a partir de pAB489-PhyM3 contiene el siguiente material genético:

El promotor de cbhI (celobiohidrolasa I): El fragmento de EcoRI/SacII con una longitud de 2,2 kb, que contiene el promotor de cbhI, procede de Trichoderma reesei QM6a. La región de promotor funciona también como un ADN homólogo (en común con el fragmento de 3' de cbhI; véase a continuación), con el fin de controlar la integración del ADN en fase de transformación en el sitio de cbhI.

La secuencia de señal: Se utilizó el péptido de señal modificado de la fitasa de A. niger con el fin de segregar la fitasa de E. coli a partir de Trichoderma reesei.

La fitasa de E. coli con la secuencia de la mutación V200P inclusive la secuencia de señal de la fitasa de A. niger, se insertó entre el promotor de cbhI y el terminador de cbhI.

El terminador de cbhI: El fragmento de BamHI/StuI con una longitud de 0,75 kb, que contiene el terminador de cbhI, se adosó a continuación de la fitasa de E. coli, con el fin de garantizar la terminación de la transcripción.

El gen amdS: El gen, inclusive su promotor y su terminador, se aisló a partir de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 y codifica la acetamidasa (Hynes y colaboradores, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4:475-479). La acetamidasa permite a la cepa crecer mediando utilización de acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se utilizó para la selección de los transformantes.

El fragmento de 3' de cbhI: El fragmento (de 1,7 kb, de BamHI/EcoRI, que comienza a 1,4 kb detrás del codón de detención del gen) se aisló a partir de T. reesei ALKO2466. La cepa ALKO2466 procede de la cepa ALKO233 (Harkki y colaboradores, 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). El fragmento de 3' se utilizó en común con la región de promotor, con el fin de integrar de un modo dirigido al objetivo el casete de expresión de la fitasa en el sitio de cbhI mediante una recombinación homóloga.

El gen de la variante de la fitasa PhyM3 se clonó en el plásmido pAB2004. El plásmido obtenido tiene la denominación pUC-PhyM3 (véase la Fig. 3) y fue presentado como DSM 18717 de acuerdo con las condiciones precedentemente mencionadas.

El plásmido pAB2004 se basa en el plásmido pUC18 y fue producido mediante introducción de otros sitios de corte en los sitios de HindIII-EcoRI.

Ejemplo 5 - Construcción de los plásmidos pUC-PhyM9 y pAB489-PhyM9 (genotipo PhyM9)

(como referencia)

La variante de la fitasa PhyM9 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli (Dassa y colaboradores 1990, n° de

5 acceso M58740) como un gen sintético mediando utilización del uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) con las mutaciones L145I y L198I. La secuencia de ADN con el codón CAG (Gln) en la posición 1 abarca un marco de lectura abierto con una longitud de 1.230 pb y codifica una enzima con 410 aminoácidos.

10 En el plásmido pAB489-PhyM9, el gen que codifica la variante de la fitasa de E. coli PhyM9 con la secuencia de señal de la fitasa de A. niger (MGVSAVLLPLYLLSGVTS) Mullaney y colaboradores, Appl Microbiol Biotechnol, 1991, 35(5), 611-614, n° de acceso M94550) está directamente bajo el control del promotor de cbhI. El péptido de señal con una longitud de 18 aminoácidos de la fitasa de A. niger se utilizó con el fin de segregar el mutante de la fitasa de

E. coli a partir de Trichoderma reesei.

15 La construcción de pAB489-PhyM9 y pUC-PhyM9 se efectuó de una manera análoga a la de los plásmidos pAB489-PhyM3 y pUC-PhyM3 en el Ejemplo 4 y contiene por consiguiente, con la excepción de la secuencia de señal de A. niger y la secuencia específica de la fitasa de E. coli, los mismos elementos genéticos.

20 El plásmido pUC-PhyM9 fue depositado bajo el número de presentación DSM 18718 el 18.10.2006.

Ejemplo 6 - Construcción de los plásmidos pUC-PhyM10 y pAB600-PhyM10, que codifican unos mutantes múltiples (con el genotipo PhyM10)

25 El plásmido pAB600-PhyM10 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli con las modificaciones de los aminoácidos K74D, N139R, D142E y V200P. A partir de los plásmidos pAB490-PhyM2, pAB490-PhyM7 y pAB489-PhyM3 se produjo el gen, que codifica la variante de la fitasa PhyM10 mediante el método de PCR de una manera análoga al principio de Tomic y colaboradores (1990), Nucleic Acids Research, 18 (6), 1656) y Vallette y colaboradores (1989), Nucleic Acids Research, 17 (2), 723-733). El producto de PCR se cortó con SpeI y PacI y se insertó en los sitios de

30 corte con SpeI y PacI en el plásmido pAB600.

El plásmido pAB600-PhyM10 resultante (véase la Fig. 6) fue confirmado mediante cartografiado y secuenciación.

En el plásmido pAB600-PhyM10 se fusionó la secuencia de la fitasa de E. coli por medio de un sitio de corte con

35 KexII junto al extremo de 3’ del fragmento del gen de CBHII. La secuencia de Kex contiene los siguientes aminoácidos RTLVKR.

La construcción del plásmido pAB600 se efectuó mediante las siguientes etapas:

40 El plásmido pAB1280 se basa en pUC18 y contiene el fragmento del gen cbhII (nucleótidos 1-307, que corresponden a los aminoácidos M1 hasta S86, Teeri y colaboradores, 1987, Gene 51: 43-52, n° de acceso 16190) bajo el control del promotor de cbhI y del terminador de cbhI procedentes del plásmido pALK487 (véase el documento WO 94/28117). Además de esto, se introdujeron otros sitios de corte (con SpeI y PacI) corriente abajo del fragmento del gen cbhII. Estos sitios de corte se utilizan para la clonación directa de la variante de la fitasa.

45 A partir del plásmido p3SR2 (Hynes y colaboradores, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4, 475-479) se aisló el gen de la acetamidasa (amdS) mediante el método de PCR como el fragmento de AscI y NruI, y se insertó en el plásmido pAB1280 cortado con AscI/StuI.

50 Para la amplificación del gen amdS de dedujeron los siguientes cebadores a partir de la información de la secuencia

El plásmido obtenido tiene la denominación pAB600 y fue confirmado mediante cartografiado y secuenciación.

55 El gen de la variante de la fitasa PhyM10 se clono en el plásmido pAB2004. El plásmido pUC-PhyM10 se ha representado en la Fig. 5 y ha sido presentado bajo el número de presentación DSM 18719 el 18.10.2006.

Ejemplo 7 - Construcción de los plásmidos pPhy2005 y pAB-Phy2005 (genotipo Phy2005)

La construcción del plásmido pAB-Phy2005 se efectuó mediante las siguientes etapas:

1. Construcción de pPhy2005

El plásmido pPhy2005 contiene la fusión del gen (ap) de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori (Piddington y colaboradores, 1993, Gene 133 (1), 55-62; n° de acceso L02420) y del gen de la fitasa de E. coli mediando utilización del uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) (Dassa y colaboradores 1990, n° de acceso M58740). De esta manera resulta un marco de lectura abierto, que codifica una variante de la fitasa con 457 aminoácidos, habiendo sido reemplazados los primeros cuatro (4) aminoácidos del gen de la fitasa de E. coli por los primeros cincuenta y uno (51) aminoácidos del gen de la fosfatasa ácida. Para la secreción de la proteína que se compone de la fusión de la fosfatasa ácida y de la fitasa de E. coli en T. reesei se utilizó la secuencia de señal de la fosfatasa ácida.

La fusión de la secuencia de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori y de la secuencia de la fitasa de E. coli, producida mediando utilización del uso de codones de T. reesei, fue sintetizada y clonada en el plásmido pUC18. El plásmido pPhy2005 obtenido fue confirmado mediante secuenciación.

El plásmido se ha representado en la Fig. 7 y ha sido presentado bajo el número de presentación DSM 18720 el 18.10.2006.

2. Construcción de pAB-Phy2005

Para la construcción del plásmido pAB-Phy2005, la secuencia de la fusión de la fosfatasa y de la fitasa procedente del plásmido pPhy2005 se cortó con AvrII y PacI y se insertó en el plásmido pAB489 en los sitios de corte con SpeI y PacI detrás del promotor de cbhI de T. reesei . El plásmido resultante tiene la denominación pAB-Phy2005 (Fig. 8) y fue cartografiado mediante endonucleasas de restricción y la secuencia de la fitasa fue confirmada mediante secuenciación.

El pAB-Phy2005 aislado a partir del casete de expresión contiene el siguiente material genético:

El promotor de cbhI (celobiohidrolasa I): El fragmento de EcoRI/SacII con una longitud de 2,2 kb, que contiene el promotor de cbhI, procede de Trichoderma reesei QM6a. La región de promotor funciona también como un ADN homólogo (en común con el fragmento de 3' de cbhI; véase a continuación), con el fin de controlar la integración del ADN en fase de transformación en el sitio de cbhI.

El fragmento del gen de la fosfatasa ácida: El fragmento del gen de la fosfatasa ácida con su secuencia de señal está directamente bajo el control del promotor de cbhI. Los 16 pares de bases (CCGCGGACTGCGCATC atg) situados corriente arriba del codón de iniciación, que pertenecen al promotor de T. reesei (Shoemaker y colaboradores 1983, Bio/Technology 1, 691-696), fueron modificados después de la incorporación del fragmento de AvrII-PacI de la fusión de la fosfatasa y la fitasa para dar CCGCGGACTAGGCATC atg.

El gen de la fitasa de E. coli: El gen sintético de la fitasa de E. coli se ha fusionado directamente junto al extremo de 3’ de la secuencia de la fosfatasa ácida para dar un marco de lectura abierto.

El terminador de cbHI: El fragmento de BamHI/StuI con una longitud de 0,75 kb, que contiene el terminador de cbhI, se adosó directamente a continuación de la fitasa de E. coli, con el fin de garantizar la terminación de la transcripción.

El gen amdS: El gen inclusive su promotor y su terminador se aisló a partir de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 y codifica la acetamidasa (Hynes y colaboradores, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4:475-47). La acetamidasa permite a la cepa crecer mediando utilización de acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se utilizó para la selección de los transformantes.

El fragmento de 3' de cbhI: El fragmento (de 1,7 kb, de BamHI/EcoRI, que comienza a 1,4 kb detrás del codón de detención del gen) se aisló a partir de T. reesei ALKO2466. La cepa ALKO2466 procede de la cepa ALKO233 (Harkki y colaboradores, 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). El fragmento de 3' se utiliza en común con la región de promotor, con el fin de integrar de un modo dirigido al objetivo el casete de expresión de la fitasa en el sitio de cbhI mediante una recombinación homóloga.

Ejemplo 8 - Construcción de los plásmidos pPhy2006 y pAB-Phy2006 (genotipo Phy2006)

La construcción del plásmido pAB-Phy2006 se efectuó mediante las siguientes etapas:

1. Construcción de pPhy2006

Para la construcción del plásmido pPhy2006, el fragmento del gen ap con una longitud de 87 pb, que codifica los 29 aminoácidos, que pertenecen al terminal de C del gen ap de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori, se fusionó 5 directamente junto a la secuencia de ADN que codifica el último aminoácido (leucina) de la fitasa de E. coli, en el plásmido pPhy2005. De esta manera resulta un marco de lectura abierto de 486 aminoácidos.

La fusión Phy2006 procedente de la secuencia de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori y de la secuencia de la fitasa de E. coli producida mediando utilización del uso de codones de T. reesei fue sintetizada y clonada en el

10 plásmido pUC18. La nueva secuencia contenida en el plásmido pPhy2006 obtenido fue confirmada mediante secuenciación.

El plásmido se ha representado en la Fig. 9 y ha sido presentado bajo el número de presentación DSM 18721 el 18.10.2006.

2. Construcción de pAB-Phy2006

La construcción así como la clonación del plásmido pAB-Phy2006 son idénticas a la producción del plásmido pAB-Phy2005 descrita en el Ejemplo 7.

20 La secuencia de la variante de la fitasa pAB-Phy2006 (Fig. 10) fue confirmada mediante secuenciación.

Ejemplo 9 - Transformación de T. reesei

25 El T. reesei RH 3780d fue transformado por separado con los casetes de expresión linealizados, aislados a partir de los plásmidos pAB489-PhyM3, pAB490-PhyM2, pAB490-PhyM7, pAB489-PhyM9, pAB600-PhyM10, pAB-Phy2005 y pAB-Phy2006. Las técnicas utilizadas para la transformación y la manipulación de T. reesei eran las utilizadas según Penttilä y colaboradores (1987, Gene 61: 155-164). Los transformantes fueron seleccionados y purificados dos veces mediante un aislamiento de esporas individuales. Entre todos los transformantes se escogieron aquéllos que

30 tienen la más alta potencia de secreción y se utilizaron ulteriormente en el Ejemplo 10 para la producción de un material enzimático. Los transformantes utilizados están recopilados en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2: Enumeración de los transformantes para otros ensayos en los Ejemplos 10 - 13.

Genotipo

Transformante

Wt (pKDa4)

RH 31071

pKDa2 (V200Y; M1)

RH 31068

PhyM2

RH 31575

PhyM3

RH 31545

PhyM7

RH 31507

PhyM9

RH 31686

PhyM10

RH 31898

Phy2005

RH 31676

Phy2006

RH 31677

35 Ejemplo 10 - Producción de la enzima con los mutantes individuales

A) Producción de soluciones enzimáticas mediante fermentación en matraces de sacudimiento

Los transformantes, que llevan los casetes de expresión de los Ejemplos 2 hasta 8, o respectivamente los

40 transformantes con el plásmido pKDa2 (M1) y pKDa4 (la secuencia de aminoácidos de la fitasa de E. coli de tipo silvestre de acuerdo con Dassa) procedentes del documento DE 10 2004 050 410, se cultivaron en matraces de sacudimiento con regulación del valor del pH en una instalación DASGIP sobre un medio inductor de la celulasa con la siguiente composición: 10,5 % (p/v = peso/volumen) de lactosa, 5,25 % (p/v) de DSG, 0,63 % (p/v) de (NH4)2SO4, el resto agua del grifo, con un ajuste del valor del pH a 4,5 antes de la esterilización. Después de una inoculación, en

45 el matraz de sacudimiento se estableció un gradiente de valores del pH en el transcurso de 5 h a pH 3,3. Los materiales filtrados del cultivo, obtenidos después de una cultivación durante 6 días con una regulación del valor del pH a un pH de 3,3, se utilizaron para la determinación de la actividad de fitasa y para el análisis de la termoestabilidad mediante una calorimetría de barrido diferencial (DSC) (véase el Ejemplo 11).

50 B) Preparación de granulados de enzimas mediante fermentación en biorreactores con una capacidad de 30 l y desecación en un ProCell5

Los transformantes procedentes del Ejemplo 10 A) se cultivaron en el medio procedente del Ejemplo 10 A) en unos biorreactores con una capacidad de 30 l a un valor del pH de 3,2 ± 0,2, a 200 hasta 400 rpm y con una velocidad de 55 aireación de 0,5 vvm. Al final de la fermentación realizada durante 6 días se separó la biomasa mediante filtración y

el material sobrenadante del cultivo transparente se concentró en el factor de 6 por evaporación mediante ultrafiltración (membrana de separación por corte a 30 kDa). El material concentrado se filtró en condiciones estériles y luego se utilizó para la subsiguiente producción de granulados de enzimas.

Los granulados se produjeron a partir de materiales concentrados por UF (ultrafiltración) mediante desecación en un granulador por atomización del tipo ProCell5, de la entidad Glatt Systemtechnik GmbH, Dresden, Alemania. Para esto el valor del pH de los materiales concentrados por ultrafiltración se ajustó a 5,2 y antes de la desecación se añadieron 50 % (p/p) de un polvo de leche desnatada con un contenido de lactosa de 30 % y 9,2 % (p/p) de propionato de Ca, estando ambas adiciones referidas al contenido global de proteínas del material concentrado por ultrafiltración. La mezcla se secó mediante una tobera para dos materiales con un Ø (diámetro) de 1,2 mm y a una presión creciente del aire desde 1,2 hasta 2,2 bares a una temperatura del aire de entrada 80°- 90ºC. Los rendimientos de actividad al realizar la desecación se situaban en el intervalo de 89 a 99 %. Los granulados producidos de esta manera se utilizaron para el ensayo en el Ejemplo 12.

Ejemplo 11- Determinación de la estabilidad térmica mediante DSC

Las muestras procedentes del Ejemplo 10 A) se cambiaron de tampón mediante una columna PD-10 (de Pharmacia) en un tampón de acetato de sodio 100 mM, de pH 5,2. Para esto, se aplicaron 1,5 ml de la muestra y se eluyeron con 3,5 ml de un tampón según las instrucciones del fabricante. Todos los ensayos de DSC se llevaron a cabo en un aparato VP-DSC (de MicroCal Inc., Northampton, MA, EE.UU.), y los datos fueron transferidos a un ordenador con el fin de ser evaluados en éste con ayuda del programa lógico Origin V7.0383 (de OriginLab Corp. Northampton, MA, EE.UU.).

Las muestras fueron desgasificadas antes de la medición durante 20 min en un ThermoVac2 (de MicroCal Inc., Northampton, MA; EE.UU.) y atemperadas a 25ºC en un baño de agua. Las mediciones se efectuaron con los siguientes parámetros: A) Parámetros constantes del aparato:

Volumen de las celdas: 0,51231 ml

Resistencia eléctrica de calentamiento de referencia: 1.009,1 ohms

Resistencia eléctrica de calentamiento de la celda: 1.002,7 ohms

Tasa adiabática: 0,88181

Lectura del valor Delta T: 3,676 B) Los parámetros de barrido en el VP-DSC fueron los siguientes:

Velocidad de barrido (hacia arriba y hacia abajo): 1ºC min-1

Temperatura antes del ciclo de barrido: 25ºC

Período de tiempo de equilibración antes del ciclo: 15 min

Período de tiempo de equilibración después del ciclo: 0 min

Filtro: 10 s

Retroalimentación: ninguna

Temperatura inicial: 25ºC

Temperatura final: 105ºC

Presión en la celda: de 26,1 a 28,7 psi (= de 1,827 a 2,009 bares) La siguiente Tabla 3 muestra la temperatura de fusión Tm (en grados Celsius) y el desplazamiento de la temperatura de fusión LT (en grados Celsius) de las fitasas mutantes de E. coli, que se habían producido según los Ejemplos arriba expuestos, en comparación con la fitasa de E. coli de tipo silvestre (Dassa y colaboradores, 1990) producidos con el mismo sistema de anfitrión que las variantes mutantes de la fitasa de E. coli y una fitasa de E. coli con una mutación (M1) que no es conforme al invento, asimismo producida con el mismo sistema de anfitrión que las variantes mutantes conformes al invento de la fitasa de E. coli.

Tabla 3: Temperatura de fusión Tm [ºC] y desplazamiento de la temperatura de fusión .T [ºC] de las mutantes de la fitasa de E. coli en comparación con la proteína de tipo silvestre, todas ellas producidas en T. reesei de acuerdo con el Ejemplo 10 A

Muestra/genotipo

Fitasa Tm [ºC] LT [ºC]

Tipo silvestre

65,64 --

M1

65,01 -0,63

M2

66,75 +1,11

M3

66,04 +0,40

M7

66,21 +0,57

M9

66,27 +0,63

Phy2005

66,06 +0,42

Phy2006

66,06 +0,42

Los resultados muestran que en el caso de todos los mutantes conformes al invento ha aparecido un aumento de la temperatura de fusión de la proteína, lo que se manifiesta en un desplazamiento positivo de la temperatura del punto de fusión. El aumento de la temperatura del punto de fusión es equivalente a un aumento de la estabilidad térmica.

10 El mejoramiento más alto de la termoestabilidad lo mostraba en este contexto la mutación doble M2 con LT = +1,11ºC. Al contrario que esto, la mutación, descrita en el documento de solicitud de patente alemana DE 10 2004 050 410 destinada al mejoramiento del nivel de secreción (V200Y = M1), mostraba un empeoramiento de la termoestabilidad (LT = -0,63ºC).

15 También las prolongaciones junto al extremo terminal de N o de N y C manifestaron unos mejoramientos de la termoestabilidad. Éstos se sitúan el mismo orden de magnitud que la mutación puntual en el caso de M3.

Ejemplo 12 - Medición de la termoestabilidad en el procedimiento de granulación

20 Los granulados de enzimas producidos de acuerdo con el Ejemplo 10 B) se mezclaron previamente con harina de trigo, del tipo 550, con el fin de obtener 300 g de una mezcla previa que contiene enzimas. Esta mezcla previa se mezcló en el Instituto Biotecnológico del Research Institute for Food and Molecular Biotechnology, Kolding, Dinamarca, con 15 kg de un pienso para animales con el fin de garantizar una dilución óptima para la introducción y mezcladura en 285 kg de un pienso para animales y una actividad enzimática bien determinable en el material

25 granulado. La cantidad empleada del granulado de enzimas condujo a una actividad de la fitasa de aproximadamente 3 hasta 6 unidades enzimáticas por cada gramo de pienso en la mezcla antes del proceso de ensayo. Los 300 kg de pienso fueron tratados en la instalación de granulación experimental, y tienen la composición de la Tabla 4.

30 Tabla 4: Composición del pienso que debe de ser granulado

Componente

[%]

Trigo

hasta 75

Hipro Soja 48

20

Aceite de soja

4,75

Vitaminas/minerales, Beta Avitren 90

0,25

Mezcla previa de enzimas*

300 g

*Contiene una fitasa con los genotipos wt, PhyM1, PhyM2, PhyM3, PhyM7, PhyM9, Phy2005 o Phy2006.

Condiciones de granulación:

35 Mezclador horizontal con un volumen de 700 l, a 48 rpm (revoluciones por minuto). La cantidad, que es mezclada, se sitúa en el intervalo de 80 a 300 kg por h.

Está conectado con el mezclador para el vaciado de este mezclador un tornillo sinfín de transporte horizontal, cuya velocidad de transporte está adaptada a la etapa subsiguiente.

40 A continuación de la mezcladura, en el mezclador horizontal se efectúa un tratamiento térmico en un mezclador de cascada (acondicionador) de Kahl con una longitud de 130 cm, un diámetro de 30 cm, que gira a 155 rpm y con 37 cámaras. El caudal de paso es de 300 kg por h. El pienso y las enzimas están en contacto con un vapor húmedo aproximadamente durante 30 s y en este caso se calientan a una temperatura de 70° a 95ºC. El vapor, que es

45 puesto a disposición por un recipiente de alta presión de Dan Stoker, circula con una sobrepresión de 2 bares a través de una válvula de regulación de la presión hacia el mezclador de cascada. La válvula regula la cantidad de vapor que afluye al mezclador de cascadas y da lugar allí al calentamiento del pienso (inclusive la enzima).

El material acondicionado es granulado por medio de una prensa de Simon Heesen y a continuación es enfriado por el aire en una caja perforada atravesada con un caudal de 1.500 m3 h-1. La prensa de granulación funciona con 500 rpm con una potencia absorbida de 7,5 kW y produce en este caso unos gránulos de 3 x 20 mm.

El tratamiento en el mezclador de cascada dio lugar a una carga térmica de la enzima contenida en el material

5 granulado. A continuación de la producción de los gránulos, se determinó el hallazgo renovado de la actividad de fitasa en el pienso granulado para animales. En la siguiente Tabla 5 se indica el hallazgo renovado de la actividad de fitasa en el pienso granulado para animales en dependencia de la temperatura al realizar el tratamiento.

Tab. 5: Hallazgo renovado de la actividad de fitasa en el pienso después del acondicionamiento a 70° hasta 95ºC y 10 de una subsiguiente granulación. Todas las enzimas fueron expresadas por medios recombinantes con T. reesei.

T [ºC]

Hallazgo renovado de la actividad de fitasa [%]

wt

M1 M2 M3 M7 M9 Phy2005 Phy2006

70

93,0 64,0 103,1 101,6 109,5 108,4 97,6 93,6

75

90,3 47,8 104,9 90,7 88,2 105,0 85,4 90,1

80

46,6 27,8 73,0 43,7 55,5 55,3 32,9 58,6

85

7,8 5,9 37,9 9,2 16,8 11,0 7,6 27,5

90

1,3 0,0 9,7 2,8 5,4 3,0 0,6 11,8

95

0,5 0,0 4,9 0,0 1,4 0,0 1,0 0,5

Los resultados muestran que la modificación de la termoestabilidad, que se encontró mediante una DSC en el caso de las mediciones en un líquido, también se volvió a encontrar en los ensayos "secos" de granulación. El mejoramiento de la termoestabilidad en comparación con la enzima de tipo silvestre no es constante en este caso en 15 todos los mutantes a lo largo de todo el intervalo medido de temperaturas. El M2 mostraba en el ensayo de DSC la estabilidad térmica más alta. También en el ensayo de granulación se consiguió la mejor estabilización mediante una mutación en una región aislada por la mutación doble M2, que introduce un puente iónico en la hélice D de la fitasa de E. coli. El mutante M1 no conforme al invento muestra, igual a como en el ensayo de DSC, un empeoramiento de la termoestabilidad en comparación con la enzima de tipo silvestre expresada en Trichoderma reesei. La mutación 20 M3, que asimismo por sí sola no es conforme al invento, muestra unas propiedades de termoestabilidad similares a las de la enzima de tipo silvestre. La variante Phy2005, que sólo lleva la prolongación en el extremo terminal de N por medio de la parte correspondiente de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori, no es tan estable a más altas temperaturas como la Phy2006, que contiene la prolongación tanto en el extremo terminal de N como también en el extremo terminal de C. Esto apunta al hecho de que estas prolongaciones pueden contribuir muy ciertamente a una

25 acumulación de moléculas de la fitasa de E. coli de una manera análoga a la dimerización de la fosfatasa ácida en condiciones normales y por consiguiente mejorarla termoestabilidad.

Ejemplo 13 - Medición de la estabilidad proteolítica en un procedimiento in vitro

30 Para la determinación de la estabilidad proteolítica in vitro se utilizaron unas muestras de enzimas procedentes del Ejemplo 10 A), es decir unas muestras de los transformantes M1 (la mutación que no es conforme al invento), M2, M3, M7, Phy2005 y Phy2006 producidas con los transformantes de la Tabla 2.

20 ml de una solución de pepsina (Merck 7190), que contiene 20 unidades de proteasa por ml en tampón de glicina

35 HCl (de pH 2,5), estando referida la actividad, según la indicación del fabricante, a la hemoglobina, a un pH de 1,6 y a 25ºC, se atemperaron a 40ºC.

Se añadieron 10 ml de una solución de fitasa (diluida a 1:100) y la solución se completó hasta 50 ml con el tampón y a continuación se incubó a 40ºC, a un pH de 2,5 durante 30 min. La reacción se interrumpió mediante inmersión en

40 un baño de hielo-agua y el valor del pH se aumentó inmediatamente a un pH de 5 con lejía de sosa y la solución se diluyó en este caso hasta 100 ml. La actividad de fitasa se midió entonces de acuerdo con el Ejemplo 1.

10 ml de la solución tratada con pepsina se ajustaron a un pH de 7. Se añadieron 30 ml de una solución de pancreatina (Merck 7130), que contenía 30 unidades de una proteasa (caseína, a un pH de 8,0, 35ºC) en un tampón

45 Tris-HCl 0,05 M (de pH 7,0), la solución se diluyó hasta 50 ml con un tampón Tris-HCl, de pH 7, y la solución se incubó en un baño de agua a 40ºC durante 30 min. La reacción se interrumpió mediante inmersión en un baño de hielo y agua y el valor de pH se disminuyó inmediatamente a un pH de 5 con HCl y la solución se diluyó en este caso a 100 ml. La actividad de fitasa se midió entonces según el Ejemplo 1. Los resultados se representan en la Tabla 6.

50 Tab. 6: Hallazgo renovado de la actividad después de un tratamiento de los mutantes de la enzima con pepsina y a continuación con pancreatina

Genotipo

Actividad residual después del tratamiento con pepsina [%] Actividad residual después del tratamiento con pepsina y pancreatina [%]

PhyM1

84 71

PhyM2

111 85

PhyM3

112 80

PhyM7

101 75

Phy2005

110 99

Phy2006

109 78

Los resultados muestran para todos los mutantes conformes al invento una estabilidad proteolítica muy alta en presencia de pepsina y de pancreatina, en comparación con el mutante comparativo PhyM1, en unas condiciones in vitro, tales como las que se presentan en el estómago de animales monogástricos, p.ej. cerdos. La alta estabilidad proteolítica aquí mostrada ilustra que estos mutantes de la enzima son especialmente adecuados para un empleo en el sector de los piensos para animales.

PROTOCOLO DE SECUENCIAS

<110> AB Enzymes Gmbh

<120> Polipéptido con una actividad de fitasa y una estabilidad térmica aumentada de la actividad enzimática así como la secuencia de nucleótidos que codifica éste

<130> 16936WO

<160> 22

<170> PatentIn Ver. 3.1

<210> 1

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1 ccaactggat aacgcccggg tgaccgacgc cat 33

<210> 2

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 2 atggcgtcgg tcacccgggc gttatccagt tgg 33

<210> 3

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 3 gccaacgtga ccgaggccat cctcagc 27

<210> 4

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 4 gctgaggatg gcctcggtca cgttggc 27

<210> 5

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400>

5 cggactcctg gctgacaagg gatgcccgc 29

<400>

9

<210> 6 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador <400> 6 gcgggcatcc cttgtcagcc aggagtccg

29

<210> 7 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador <400> 7 aggcgcgccc tagtcatcat tggataggca gattactcag

40

<210> 8 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador <400> 8 ggaattctcg cgaaaggcaa caaccagctc acccctgag

39

<210> 9 <211> 1230 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> ADN PhyM2 <220> <221> CDS <222> (1) .. (1230) <223>

<210> 10

<211> 410

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM2

<400> 10

<210> 11

<211> 1230

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM3

<220> 10 <221> CDS

<222> (1) .. (1230)

<223>

<400> 11

<210> 12

<211> 410

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM3

<400> 12 10

<210> 13

<211> 1230

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM7

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1230)

<223>

<400> 13

<210> 14

<211> 410

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM7

<400> 14

<210> 15

<211> 1230

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM9

<220> 10 <221> CDS

<222> (1) .. (1230)

<223>

<400> 15

<210> 16

<211> 410

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM9

<400> 16

<210> 17

<211> 1230

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM10

<220> 10

<221> CDS

<222> (1) .. (1230)

<223>

<400> 17

<210> 18

<211> 410

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN PhyM10

<400> 18

<210> 19

<211> 1371

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN Phy2005

<220> 10 <221> CDS

<222> (1) .. (1371)

<223>

<400> 19

<210> 20

<211> 457

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN Phy2005

<400> 20

<210> 21

<211> 1458

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ADN Phy2006

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (1458)

<223>

<400> 21

<210> 22

<211> 486

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN Phy2006

10 <400> 22

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1. Molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una secuencia de ADN, que se escoge entre

   a) unas secuencias de ADN, que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se había obtenido mediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo silvestre, comprendiendo la variación una combinación de las mutaciones asparagina - arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico - ácido glutámico en la posición 142 (D142E),

   b) unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias de acuerdo con a),

   realizándose que la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula anfitriona, va acompañada por unas estabilidades térmica y frente a proteasas aumentadas de la actividad enzimática de la proteína codificada de esta manera.

2. 2.

   Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente la variación V200P del polipéptido codificado de esta manera.

3. 3.

   Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente las variaciones L145I y L198I del polipéptido codificado.

4. 4.

   Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que como adosamiento junto al extremo terminal de N del polipéptido codificado ella comprende la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS, y/o como adosamiento junto al extremo terminal de C del polipéptido codificado ella comprende la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.

5. 5.

   Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que ella comprende una secuencia escogida entre las secuencias SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:21.

6. 6.

   Polipéptido, que posee una actividad de fitasa y que es codificado por una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5 o que se obtiene mediante expresión de una célula anfitriona transformada con ésta.

7. 7.

   Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que él comprende una secuencia escogida entre las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:22.

8. 8.

   Construcción artificial de ADN con la capacidad para regular la expresión de un gen de fitasa mutado en un anfitrión, después de la introducción en una célula anfitriona adecuada, caracterizada por que ella contiene una secuencia de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5 y un terminador.

9. 9.

   Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que ella posee unas secuencias flanqueadoras en 5' y 3', un promotor y/o unas secuencias de señal y de marcador.

10. 10.

    Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que en el caso del promotor se trata del promotor de la celobiohidrolasa I, de la celobiohidrolasa II, de la amilasa, de la glucoamilasa, de la xilanasa o de la enolasa.

11. 11.

    Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, caracterizada por que en el caso de la secuencia de señal y/o de las secuencias flanqueadoras en 5' y 3' se trata de las secuencias de señal de la fitasa procedente de Aspergillus niger.

12. 12.

    Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que en el caso de las secuencias de señal de la fitasa procedente de Aspergillus niger se trata de las secuencias de señal modificadas de la fitasa procedente de Aspergillus niger.

13. 13.

    Vector con la capacidad de transformar a una célula anfitriona, caracterizado por que él contiene una construcción artificial de acuerdo con las reivindicaciones 8 hasta 12.

14. 14.

    Vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que él se escoge entre el conjunto formado por el plásmido pET-PhyM2, presentado bajo el número de presentación DSM 18715, el plásmido pUC-PhyM10, presentado bajo el número de presentación DSM 18719, el plásmido pPhy2005, presentado bajo el número de presentación DSM 18720, y el plásmido pPhy2006, presentado bajo el número de presentación DSM 18721.

15. 15.

    Célula anfitriona transformada escogida entre hongos, levaduras, bacterias y células de mamíferos, que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5, y que está dotada de la capacidad de expresar un polipéptido con una actividad de fitasa.

16. 16.

    Célula anfitriona transformada de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada por que ella pertenece al género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicillium.

17. 17.

    Procedimiento para la producción de una fitasa, caracterizado por que se cultiva una célula anfitriona transformada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 en unas condiciones, que son favorables para la formación de la fitasa, y se aísla la fitasa producida de esta manera.

18. 18.

    Composición, que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, eventualmente en común con otras sustancias auxiliares y/o activas.

19. 19.

    Composición de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada por que ella es una composición de alimento o pienso o un agente de panificación.

20. 20.

    Utilización de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 para la producción de un preparado destinado al mejoramiento del aprovechamiento de fosfato a partir de la nutrición en los casos de animales y seres humanos o para el mejoramiento de las propiedades reológicas de masas de panificación destinadas a la producción de productos de panificación.

21. 21.

    Utilización de una variación de la secuencia de la fitasa de E. coli madura de tipo silvestre, que comprende una combinación de las mutaciones asparagina - arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico - ácido glutámico en la posición 142 (D142E) para la producción de una molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, que posee unas estabilidades térmica y frente a proteasas aumentadas.

22. 22.

    Utilización de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizada por que la utilización se efectúa en común con la variación L145I y L198I o la variación V200P, o porque la utilización se efectúa en común con la variación del adosamiento junto al extremo terminal de N de la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS y/o la variación del adosamiento junto al extremo terminal de C de la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.