ES2664178T3 - Aditivo alimentario que comprende una amidasa para degradar la ocratoxina - Google Patents

Abstract

Una enzima amidasa aislada capaz de degradar la ocratoxina, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15, o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15; o un polipéptido que es producido por la expresión de un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético; o una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.

Description

Aditivo alimentario que comprende una amidasa para degradar la ocratoxina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para degradar micotoxinas. Más específicamente, la invención se refiere a enzimas amidasa y aditivos alimentarios y/o alimenticios que comprenden al menos una amidasa para degradar la ocratoxina, particularmente la ocratoxina A.

Antecedentes de la invención

Las micotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos de hongos que pertenecen, esencialmente, a los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Se pueden producir en una amplia gama de productos agrícolas y en una amplia gama de condiciones agronómicas, ecológicas y post-cosecha en todo el mundo.

Las micotoxinas pueden entrar en la cadena alimenticia en el campo, durante el almacenamiento de un alimento o material alimenticio, o en puntos posteriores de la cadena alimenticia. Su acumulación en alimentos y piensos representa una gran amenaza para la salud humana y animal ya que el consumo de una dieta contaminada con micotoxinas puede provocar efectos teratogénicos, carcinogénicos y estrogénicos o inmunosupresores.

En 1985, la Organización Mundial de la Salud estimó que aproximadamente el 25% de los granos del mundo estaban contaminados por micotoxinas (Jelinek et al., 1989). Es probable que esta cifra haya aumentado desde entonces debido a un aumento en la importación y exportación mundial de granos y cereales y a los cambios en los patrones ambientales y climáticos.

Actualmente hay más de 400 micotoxinas documentadas, pero las micotoxinas de mayor preocupación y, en consecuencia, lasmás estudiadas incluyen: aflatoxina, desoxinivalenol, zearalenona, fumonisina y ocratoxina.

Aunque hay muchas especies de mohos toxigénicos, solo unas pocas micotoxinas se consideran significativas para los seres humanos.

Tres géneros de hongos, Aspergillus, Penicillium y Fusarium están involucrados con mayor frecuencia en los casos de contaminación por micotoxinas. La colonización fúngica, el crecimiento y la producción de micotoxinas generalmente están influenciados por una variedad de factores. Los más importantes son la temperatura y la actividad del agua.

Generalmente, en regiones cálidas, las aflatoxinas son de gran preocupación. Esto se debe a que las especies de Aspergillus que producen estas toxinas encuentran condiciones óptimas presentes en las regiones tropicales. Por el contrario, las especies de Fusarium y Penicillium tienen temperaturas óptimas más bajas y, como resultado, están adaptadas a climas más moderados. Las ocratoxinas, fumonisinas y zearalenona se producen consecuentemente en regiones que proporcionan estas condiciones.

Las ocratoxinas son un grupo de micotoxinas producidas como metabolitos secundarios por varios hongos de las familias Aspergillus o Penicillium y son ácidos orgánicos débiles que consisten en un derivado de una isocoumarina. Hay tres ocratoxinas generalmente reconocidas, denominadas A, B y C. La ocratoxina A es el miembro más abundante de la familia de la ocratoxina y, por lo tanto, la más comúnmente detectada, pero también es la más tóxica. La ocratoxina A (ocratoxina A) es una micotoxina nefrotóxica, teratogénica, hepatotóxica y carcinogénica presente en cereales y otros alimentos ricos en almidón. Además de en los cereales y los productos de cereales, la ocratoxina A también se encuentra en una gama de otros productos alimenticios, como café, cacao, vino, cerveza, legumbres, especias, frutos secos, zumo de uva, riñón de cerdo y otras carnes y productos cárnicos de animales no rumiantes expuestos a piensos contaminados con estamicotoxina. Muchos países han establecido límites en el nivel de ocratoxina A en los alimentos, por lo general entre 1 y 10 ppb (partes por mil millones) dependiendo del tipo y la calidad de los alimentos.

Estructuramolecular de la ocratoxina A 5

La producción de ocratoxina A se debe a una infección fúngica en los cultivos, en el campo durante el crecimiento, la cosecha, el almacenamiento y el transporte en condiciones ambientales favorables, especialmente cuando no se secan adecuadamente.

La ocratoxina A es un compuesto estable que puede hidrolizarse en ocratoxina α (OTα) y L-fenilalanina calentando a reflujo durante 48 h en ácido clorhídrico 6M (Van der Merwe et al., 1965) o con la carboxipeptidasa A (Pitout, 1969). La conversión de OTA en ocratoxina α se considera una forma de reducir su toxicidad ya que comúnmente se sabe que OTα es mucho menos tóxica que la OTA. Además, la semivida de la eliminación de ocratoxina α en el cuerpo (9,6 h) es más corta quela de laOTA (103 h) (Li et al., 1997).

Con el fin de garantizar la inocuidad de los alimentos, se desarrollan diferentes enfoques para prevenir la ingesta de micotoxinas en varias etapas a lo largo de la cadena de producción de alimentos.

Desde la década de 1970 se sabe que la enzima digestiva de los mamíferos, llamada carboxipeptidasa A, es un cable que degrada la OTA, pero que la eficacia de esta enzima es baja. De hecho, en animales que tienen carboxipeptidasa A, tal como el cerdo, la toxicidad de OTA debido a su presencia en la alimentación es un problema. Además, se ha descubierto que la OTA puede inhibir hasta cierto punto la actividad de carboxipeptidasa A.

Antes de la presente invención, no se han descrito soluciones enzimáticas eficientes para degradar las ocratoxinas, incluida la ocratoxina A (OTA). Se han descrito actividades enzimáticas distintas de la carboxipeptidasa para la degradación de OTA, pero hasta ahora nadie ha sido capaz de identificar una proteína que muestre actividad degradadora deOTA.

Se sabe que un producto de lipasa comercial denominado "lipasa Amano™", que es una lipasa cruda producida a partir de A. niger (compañía Amano™, Japón), tiene actividad degradadora de la ocratoxina.

La actividad de degradación de OTA en este producto de lipasa se ha atribuido previamente a una actividad de lipasa o proteasa. Por ejemplo, Maria A. Stander (J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 5736-5739) concluyó que la actividad degradadora de OTA de la lipasa Amano™ resultaba de una lipasa.

Abrunhosa et al., (Biotechnology Lett., 2007, 29, 1909-1914) describen una preparación enzimática aislada de A. niger que tiene actividad degradadora de OTA. Sin embargo, esta preparación enzimática no se purificó hasta un punto en el que la secuencia del componente activo podría determinarse a nivel de aminoácido o ADN. Se han descrito problemas similares en otros casos (Abrunhosa et al., Toxins, [2010], 2, 1078-1099)

Sumario

La presente invención se basa en el trabajo realizado por los inventores para identificar y aislar una enzima que es capaz de degradar eficazmente la ocratoxina, más específicamente, la ocratoxina A (OTA).

Los inventores han descubierto que, contrariamente a su hipótesis inicial, la formamidasa de A. niger y A. nidulans y también la formamidasa que existe en el producto de lipasa Amano™ no tienen actividad hacia la OTA pero, como se esperaba, tienen actividad hacia la formamida.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que una proteína hipotética de 480 aminoácidos, denominada en lo sucesivo amidasa 2, que está codificada por un marco de lectura abierto de A. niger tiene actividad de degradación de ocratoxina y, particularmente, actividad degradante de ocratoxina A.

Además, los inventores también han encontrado sorprendentemente que la amidasa 2 de 480 aminoácidos de longitud completa que comprende la secuencia N-terminal o señal y que tiene un PM de aproximadamente 51 kDa (denominada amidasa 2 sig) tiene actividad degradadora de ocratoxina A así como la amidasa 2 de 438 aminoácidosmaduros secretada que tiene un PM de aproximadamente 47 kDa (denominada amidasa 2mat).

Se ha encontrado que en la amidasa 2 mat, los 42 aminoácidos N-terminales se escinden, es decir, cuando la amidasa 2 se secreta en el medio de cultivo, sus 42aa N-terminales se escinden para formar la amidasa madura 2 (es decir, la amidasa 2 mat) por una peptidasa de A. niger.

Los inventores han aislado y clonado el gen de A. niger que codifica la enzima amidasa responsable de la degradación de la ocratoxina A y han identificado su estructura cristalina. Han identificado que este gen codifica un polipéptido que tiene

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una enzima amidasa aislada capaz de degradar la ocratoxina, más particularmente la ocratoxina A, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15, o una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15; o un polipéptido que se produce por la expresión de un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con la misma, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético; o una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un aditivo alimentario o de alimentación que comprende una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina. Más particularmente, la ocratoxina A.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un alimento o material de alimentación que comprende el aditivo de alimentación de la presente invención.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un alimento o material de alimentación que comprende un alimento o material de alimentación de lapresente invención.

De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para elaborar un aditivo alimentario o de alimentación que comprende mezclar una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable.

De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para reducir la contaminación por ocratoxina en un material que comprende la adición a dicho material de una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina.

De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un material contaminado con ocratoxina y una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina.

De acuerdo con un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para fabricar un alimento o material de alimentación que comprende añadir a un alimento o material de alimentación un aditivo alimentario o de alimentación de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada de la invención

En la descripción que sigue, se entenderá que cualquiera de las características preferidas descritas, es aplicable a cualquier aspecto de la presente invención a menos que se establezca explícitamente lo contrario. Se entenderá además que se prevé que cualquiera de las características preferidas se use en combinación cuando sea apropiado.

Se entenderá además que el término ocratoxina o la expresión una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina en las realizaciones preferidas se refieren a la ocratoxina A o una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina

A.

Como se usa en el presente documento, el término amidasa (amidohidrolasa) se refiere a una enzima de la superfamilia de la amidohidrolasa que puede hidrolizar una amida.

Los inventores han aislado y clonado la enzima amidasa 2 de A. niger responsable de la degradación de la ocratoxina. Esta enzima es particularmente efectiva para degradar la ocratoxina A. Han demostrado que esta enzima se expresa mediante un ORF que codifica una proteína hipotética de 480 aminoácidos de A. niger (An14g02080, Acc No. XP_001400834) que muestra -40% de identidad con ciertas amidasas bacterianas que no están caracterizadas bioquímicamente, especialmente con respecto a su especificidad de sustrato.

La búsqueda en la base de datos indica que esta putativa amidohidrolasa (amidasa 2) tiene 36% de identidad de secuencia de aminoácidos con ciertas dipeptidasas, tales como la carboxipeptidasa Sgx9355e codificada por una secuencia de ADN ambiental aislada del Mar de los Sargazos (Biochemistry 48 (2009): 4567-4576). La estructura 3D de Sgx9355e es conocida y es un miembro de la superfamilia de la amidohidrolasa (AHS). La alineación de secuencia de la amidasa 2 con Sgx9355e sugiere que la amidasa 2 es como unmiembro de la AHS.

Estees un grupo de enzimas quetienen una notablediversidad desustrato con un pliegueestructural debarra (β/α)8 (barril Tim). La mayoría de las enzimas dentro de esta superfamilia catalizan la hidrólisis de los enlaces C-O, C-N o P-O. Ningún miembro dela superfamilia se ha relacionado con la hidrólisis deOTA.

Se entenderá que el término amidasa (es decir, amidohidrolasa) y la expresión amidasa que puede degradar la ocratoxina se usan de manera intercambiable en la presente memoria a menos que se indique específicamente lo contrario o sea evidente a partir del contexto de que se está discutiendo una enzima diferente.

El término amidasa y la expresión amidasa que puede degradar la ocratoxina A se refieren a una enzima que puede descomponer al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% dela ocratoxina A presente en una muestra ala ocratoxina a.

La presente invención proporciona una enzima amidasa aislada, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15, o una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15; o un polipéptido que se produce por la expresión de un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con lamisma, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético; o una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Preferiblemente, la amidasa para uso en cualquier aspecto de la presente invención es una amidasa que degrada al menos la ocratoxina A.

Preferiblemente, las enzimas amidasa de acuerdo con la presente invención comprenden al menos uno, preferiblemente, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, más preferiblemente, nueve de los motivos de secuencia de aminoácidos:

1) x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG, donde los dos residuos de His están en el sitio activo; 2) G-x-T; 3) G-x-x-x-G-P; 4) G-H-x-D donde el residuo de His está en el sitio activo; 5) D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-l-K, donde el residuo Lys está en el sitio activo 6) G-G-V-x-S-x-x-D-x-P, donde el residuo Val está en el sitio activo; 7) V-x-A-H-x-x-G-x-x-G, dondelos dos residuos de His estánen el sitio activo; 8) H-x-x-x-x-D, donde el residuo de His está en el sitio activo; 9) G-V-x-l-x-x-G-T-D, donde el residuo de Asp está en el sitio activo. Preferiblemente, los motivos son: 1) x1-P-G-x2-x3-D-x4-H-x5-H-x6-x7-G, donde los dos restos deHis están en el sitio activo; 2) G-x8-T;

3) G-x9-x10-x11-G-P; 4) G-H-x12-D, donde el residuo de His está en el sitio activo; 5) D-G-x13-X14-X15-C-X16-X17-X18-X19-R-x20-x21-x22-R-x23-x24-A-x25-x26-I-K, donde el residuo de Lys está en el sitio

activo 6) G-G-V-x27-S-x28-x29-D-x30-P, donde el residuo Val está en el sitio activo; 7) V-x31-A-H-x32-x33-G-x34-x35-G, dondelos dos residuos de His están en el sitio activo; 8) H-x36-x37-x38-x39-D, donde el residuo de His está en el sitio activo; 9) G-V-x40-I-x41-x42-G-T-D, donde el residuo de Asp está en el sitio activo; donde: x1= l/m; x2= l/m; x3= w/i; x4= c/v/s/a; x5= cualquier aminoácido; x6= f/y/l; x7= cualquier aminoácido; x8= y/f; x9= t/a/s/v/r;

x10= i/f/a; x11= cualquier aminoácido; x12= g/s; x13= v/e; x14= cualquier aminoácido; x15= e/d/g; x16= cualquier aminoácido; x17= cualquier aminoácido; x18= a/g/t; x19= v/a; x20= cualquier aminoácido; x21= q/m/a; x22= l/i/v; x23= r/h/c; x24= g/n; x25= k/r/t/e/d; x26= cualquier aminoácido; x27=l/m/v/g; x28= cualquier aminoácido; x29= cualquier aminoácido; x30= cualquier aminoácido; x31= a/s/h; x32= c/v/a; x33=h/q; x34=k/r; x35= cualquier aminoácido; x36= g/v/a; x37= s/t/i; x38= y/f/e; x39= l/a/i; x40= cualquier aminoácido; x41= a/v; x42=-l/a.

Se entenderá que la expresión cualquier aminoácido se refiere a uno cualquiera de los aminoácidos G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R o H, o un aminoácido o derivado de aminoácido no natural.

En una realización más preferida, losmotivos son:

1) l/m-P-G-l/m-w-D-c-H-x-H-f-x-G, donde los dos residuos deHis están en el sitio activo;

2) G-y/f-T;

3) G-t-i-x-G-P;

4) G-H-g-D donde el residuo de His está en el sitio activo;

5) D-G-v-x-e-C-x-x-a-v-R-x-q-l-R-r-g-A-k-x-l-K, donde el residuo de Lys está en el sitio activo

6) G-G-V-I/-S-x-x-D-x-P, donde el residuo Val está en el sitio activo;

7) V-a-A-H-c-h-G-k-x-G, dondelos dos residuos de His están en el sitio activo;

8) H-g-s-y-l-D, donde el residuo de His está en el sitio activo;

9) G-V-x-I-a-l-G-T-D, donde el residuo de Asp está en el sitioactivo.

Será evidente para las personas expertas que las enzimas carboxipeptidasas de la técnica anterior que son capaces de degradar la ocratoxina no comprenden ninguno de los motivos citados y no muestran homología de secuencia con las amidasas de la presente invención.

En una realización preferida, la amidasa es una amidasa aislada sustancialmente libre de otros componentes en los medios de cultivo en los que se produce.

En una realización preferida adicional, la amidasa tiene al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de pureza.

En una realización preferida adicional, la amidasa es una amidasa que comprende una estructura de barril tipo Tim distorsionada que incluye un sitio activo que comprende 6 residuos de histidina, 1 residuo de lisina y 1 residuo de ácido aspártico, en donde los residuos de aminoácidos en el sitio activo corresponden a las posiciones H111, H113, H191, K246, H287, H289, H307 y D378 de SEQ ID NO: 1, cuando se comparan la estructura terciaria de la amidasa y la SEQ ID NO: 1.

El experto en la materia entenderá que un barril Tim es un pliegue proteico conservado que consiste en ocho hélices α y ocho hebras β paralelas que se alternan a lo largo de la cadena principal del péptido. Los barriles Tim se consideran pliegues de proteína α/β porque incluyen un patrón alternante de hélices α y cadenas β en un único dominio. En un barril Tim, las hélices y cadenas (generalmente 8 de cada una) forman un solenoide que se curva para cerrarse sobre sí mismo en forma de rosquilla, conocido topológicamente como un toroide. Las hebras β paralelas forman la pared interna de la rosquilla, mientras que las hélices α forman la pared externa de la rosquilla. Cada hebra β se conecta con la siguiente hebra adyacente en el barril a través de un bucle largo derecho que incluye una de las hélices.

La estructura de la amidasa 2 se puede dividir en dos dominios, un dominio catalítico central y un dominio sándwich β más pequeño. El dominio catalítico comprende los restos 107-425, que forman un barril en forma de TIM algo distorsionado de ocho hebras β paralelas (β5-7, 9-13) flanqueadas en la cara externa por hélices α. Un pliegue en el medio del filamento β7 que se produce en el residuo 182 lo divide en dos filamentos separados, β7a y β7b. Este pliegue representa las características que causan la distorsión del barril. Mientras que β7a tiene solo una cadena de barril contigua, β6, la cadena β7b tiene dos vecinos a los que está unida por enlaces de hidrógeno, β8 y β9. El primero representa un elemento estructural secundario que está unido al núcleo del barril sin ser formalmente parte de él. La segunda causa de la distorsión del barril es la ausencia de una interacción canónica de enlaces de hidrógeno de los residuos 375-378 directamente aguas abajo de β13 con la primera cadena de barril β5 que cerraría el círculo. Por lo tanto, la apariencia general del núcleo de dominio se asemeja bastante a un sándwich de hojas β paralelas, una que consta de tres y la otra de siete filamentos. De ellos, 13 hélices (12α y 1 g) del dominio catalítico que siguen directamente a las hebras de barriles y β8 pueden asignarse como hélices de barril, mientras que las cuatro hélices restantes representan elementos de estructura secundaria adicionales que delimitan la parte superior e inferior del barril.

El dominio β-sándwich comprende residuos tanto del extremo N como del extremo C (43-106, 426-480). Los tres filamentos formados por los residuos C-terminales (β14-16) son parte de la mayor de las dos hojas. De las cuatro hebras formadas por los residuos N-terminales, β3 pertenece a la lámina más pequeña, mientras que las hebras largas y fuertemente dobladas β1, β2 y β4 contribuyen a la formación de ambas láminas. Solo β1 y β4 son paralelas entre sí. Los giros helicoidales γ16 y γ17 se insertan entre β14 y β15 y se empaquetan contra el dominio catalítico. Las hélices γ1 y α2insertadas entre β3 y β4 apuntan en la dirección opuesta y están expuestas al disolvente.

El experto en la materia entenderá que la estructura terciaria de una amidasa dada se puede comparar fácilmente con la estructura terciaria de la SEQ ID NO: 1 que tiene las coordenadas mostradas en la Figura 25 usando paquetes de software estándar con sus parámetros por defecto, por ejemplo, PyMOL (www.Pymol.org).

Será más fácilmente evidente para las personas expertas que las enzimas carboxipeptidasas de la técnica anterior que son capaces de degradar la ocratoxina no comprendan una estructura de tipo barril Tim que incluye los residuos especificados en el sitio activo.

En una realización, la amidasa es una enzima de EC 3.5.1.X, según las Recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB), donde X es un número de designación proporcionado por el comité.

La persona experta entenderá que la carboxipeptidasa A y la carboxipeptidasa Y de la técnica anterior se designan en EC 3.4.17.1 y 3.4.16.5, respectivamente.

En una realización preferida, la amidasa es una que degradala ocratoxina A cuando seincuba a pH 3-9 y 21-40ºC.

Será evidente que la capacidad de una enzima amidasa para degradar la ocratoxina A puede determinarse usando el ensayo de degradación deOTA descrito en la sección de los métodos a continuación.

Las amidasas adecuadas comprenden las de Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Talaromyces stipitatus, Neurospora crassa, Streptomyces, por ejemplo, S. roseosporus, Thermotoga lettingae, Salinispora arenicola, Glomerella graminicola, Metarhizium anisopliae y Aspergillus oryzae mostradas como SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14 y 15, respectivamente, o una secuencia que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad con una cualquiera delas SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 11, 13, 14 ó 15.

En realizaciones preferidas de la presente invención, la enzima amidasa para uso en los aditivos, alimentos, productos alimenticios, usos y métodos de la presente invención comprende un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido que comprende la SEQ ID Nº: 2 o un polinucleótido que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 90% , 95%, 98%, 99% de identidad con la SEQ ID NO: 2; o una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene al menos 70%, 75%, 80% , 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con ésta.

En realizaciones preferidas adicionales, la enzima de acuerdo con la presente invención cataliza la rotura del enlace químico de C-N, C-O o P-O, más preferiblemente C-N.

Resultará evidente para la persona experta que pueden realizarse variantes de longitud completa de amidasa 2 usando cualquier técnica bien conocida en la técnica. Se pueden producir variantes más estables resistentes a la escisión de la secuencia señal o N-terminal mutando los enlaces peptídicos responsables de la proteasa en la secuencia peptídica.

Por ejemplo, las mutaciones pueden realizarse en uno o más de los siguientes 71 sitios de la secuencia de 480aa de amidasa 2 mostrada en la SEQ ID NO: 1; estos pueden alterar la sensibilidad a la hidrólisis por peptidasas señal, peptidasas secretadas por el organismo huésped en su medio y pepsina:

18 31 32 33 34 42 55 56 56 64 69 70 78 79 107 114 127 128 139 146 147 156 184 185 194 195 197 202 203 220 236 262 264 269 270 304 317 318 325 335 336 336 337 343 344 351 352 354 355 359 360 374 375 386 387 388 389 390 391 400 412 420 424 425 435 436 440 446 461 462 462 480;

las mutaciones en los siguientes 44 sitios pueden alterar la resistencia a la tripsina: 34 36 48 66 75 88 89 92 99 138 141 155 166 231 232 235 239 240 243 246 256 271 279 282 291 299 303 320 322 330 346 351 361 368 395 405 426 445 451 458 461 464 476;

las mutaciones en los siguientes 90 sitios pueden alterar la resistencia a la quimotripsina: 1 11 16 19 23 32 34 39 53 56 57 65 70 79 90 91 98 103 107 108 112 113 114 120 121 124 128 139 144 147 151 154 157 160 179 185 191 195 203 206 209 215 216 221 236 248 254 262 265 270 287 289 295 305 307 310 316 318 319 325 326 336 337 344 349 352 355 359 360 363 375 387 389 391 398 401 413 421 425 429 436 441 447 455 457 462 463 471 479 480.

Se entenderá además que el polipéptido de 480 aa amidasa 2 o sus variantes pueden estar N-y/u O-glicosilados en cualquiera de sus residuos de asparagina (Asn), serina (Ser) y treonina (Thr) con el fin de mejorar la solubilidad y estabilidad al calor.

Se entenderá que tal como se define en la presente memoria, la expresión condiciones rigurosas se refiere al lavado a 50ºC y 0,2xSSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3citrato pH 7,0}.

Se entenderá que estas condiciones también pueden ser condiciones altamente rigurosas que se definen en este documento comolavado a 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3citrato pH 7,0}.

En otra realización preferida, la enzima amidasa se produce por la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 1, 3, 5-11, 13, 14 ó 15, o una secuencia que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad conla misma.

Más preferiblemente, la amidasa está codificada por un polinucleótido seleccionado de:

a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID Nº: 2 o una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad conla misma;

b) un polinucleótido que difiere de SEQ ID NO: 2 debido a ladegeneración del código genético;

c) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad con lamisma.

En realizaciones preferidas adicionales, la enzima amidasa para uso en la presente invención es recombinante.

En un aspecto preferido de la presente invención, se proporciona un aditivo alimentario o alimenticio que comprende una enzima amidasa que es capaz de degradar la ocratoxina.

Preferiblemente, la enzima amidasa degradará al menos la ocratoxina A.

Más preferiblemente, la enzima amidasa también degradará al menos otra ocratoxina, más preferiblemente, al menosla ocratoxina B.

En una realización adicional, la enzima también degradará al menos derivados de ocratoxina además de la ocratoxina B yla ocratoxina C, y/o al menos un alcaloide del cornezuelo.

Se entenderá que los alcaloides del cornezuelo son compuestos que contienen enlaces amida e incluyen, por ejemplo, ergocornina, ergocorninina, ergocristina, ergocristinina, ergocriptina, ergocriptinina, ergometrina, ergosina, ergotamina y ergotaminina. Estos compuestos son tóxicos para los organismos vivos, incluidos los seres humanos y los animales de granja.

Será evidente para los expertos en lamateria que este alimento o aditivo alimenticio se puede añadir a un alimento o material alimenticio contaminado con ocratoxina para reducir el nivel de la toxina presente en el alimento o material alimenticio consumido por un animal. Se sabe que la ocratoxina A es un contaminante importante de los cereales y otros alimentos ricos en almidón, así como, por ejemplo, café, cacao, vino, cerveza, legumbres, especias, frutos secos, zumo de uva, leche y productos cárnicos de animales no rumiantes. La ocratoxina A es un compuesto nefrotóxico, teratogénico, hepatotóxico y carcinogénico que, si está presente incluso en niveles bajos, puede ser dañino.

En una realización más preferida, el aditivo es un aditivo de alimentación.

En realizaciones preferidas, el aditivo alimentario o alimenticio comprende la amidasa a un nivel de al menos 0,001 g/kg, al menos 0,01 g/kg, al menos 0,1 g/kg, al menos 1 g/kg, al menos 5 g/kg, al menos 7,5 g/kg, al menos 10,0 g/kg, al menos 15,0 g/kg, al menos 20,0 g/kg, al menos 25,0 g/kg. Preferiblemente, el aditivo alimentario o de alimentación comprende la amidasa a un nivel tal que, cuando se agrega a un alimento o material de alimentación, el material de alimentación comprende la amidasa en un intervalo de 1 a 500 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, más preferiblemente 2-50mg/kg o 2-10 mg/kg.

En realizaciones preferidas de la presente invención, la amidasa puede hidrolizar al menos 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 900, 1000 nanomoles de OTA por minuto por mg de proteína a pH 7,0 y 40ºC, cuando OTA está presente a una concentración de 1 μg/ml.

Incluso más preferiblemente, la enzima amidasa también es capaz de degradar al menos otro derivado de ocratoxina u ocratoxina y/o al menos un alcaloide de cornezuelo, más preferiblemente, la ocratoxina B.

Más preferiblemente, la amidasa comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO; 3 o cualquiera de SEQ ID NO: 5-11, 13, 14 ó 15 o una secuencia que tiene al menos 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, de 5 a 11, 13, 14 ó 15.

El experto en la materia entenderá que la enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina A para su uso en la presente invención puede proporcionarse independientemente como composiciones líquidas o sólidas/granuladas.

Preferiblemente, cuando dicha enzima está en forma líquida, dicha enzima se secreta en el medio después del cultivo de una célula que comprende dicha enzima. Preferiblemente, dicho medio está libre de células (es decir, la(s) célula(s) se han separado del medio). Preferiblemente dicho medio está concentrado. Se entenderá que el medio puede granularse para proporcionar una composición enzimática sólida.

Se entenderá además que el aditivo para alimentos o alimenticio según la presente invención se puede proporcionar en forma de una solución o como un sólido, dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.

En una realización adicional, el aditivo se puede usar para tratar previamente un material que se usará como alimento o producto alimenticio.

Por ejemplo, la amidasa puede usarse para tratar líquidos tales como los producidos como subproductos de plantas de etanol. En este caso, el aditivo se agregará a un caldo de fermentación líquido para degradar los contaminantes de ocratoxina A que se encuentran en el medio utilizado para cultivar levadura o microbios para la producción de etanol.

Se entenderá que el caldo se puede secar y alimentar posteriormente a los animales.

En una realización alternativa, el aditivo se puede agregar a la leche, por ejemplo, leche de vaca, contaminada con OTA.

En una realización, el aditivo alimentario o de alimentación según la presente invención está en una formulación líquida adecuada para el consumo, preferiblemente dicha composición líquida comprende además al menos uno de un tampón, una sal, sorbitol y/o glicerol.

Preferiblemente, el aditivo para alimentos o producto alimenticio comprende al menos un vehículo fisiológicamente aceptable.

El vehículo fisiológicamente aceptable se selecciona preferiblemente de al menos uno de maltodextrina, piedra caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na2SO4, talco, PVA y mezclas delosmismos.

En una realización adicional, el aditivo alimentario o de alimentación puede comprender adicionalmente un quelante de iones metálicos. El quelante de iones metálicos puede seleccionarse entre EDTA o ácido cítrico.

En una realización, la enzima amidasa se seca sobre el vehículo fisiológicamente aceptable.

En una realización, el aditivo alimentario o de alimentación se granula o co-granula con otras enzimas.

En realizaciones preferidas, la amidasa para uso en la presente invención puede usarse en combinación con una o más enzimas adicionales. En realizaciones preferidas, la una o más enzimas adicionales se seleccionan del grupo que consiste en aquellas implicadas en la degradación de proteínas que incluyen carboxipeptidasas, preferiblemente carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa Y, proteasas de ácido aspártico de A. niger de PEPAa, PEPAb, PEPAc y PEPAd, elastasa, proteasas de amino peptidasas, pepsina o tipo pepsina, tripsina o tipo tripsina y bacterianas incluyendo subtilisina y sus variantes, y de aquellas involucradas en el metabolismo del almidón, degradación de fibra, metabolismo de lípidos, proteínas o enzimas involucradas en el metabolismo de glucógeno, enzimas que degradan otros contaminantes, acetil esterasas, amilasas, arabinasas, arabinofuranosidasas, exo-y endopeptidasas, catalasas, celulasas, quitinasas, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasas, epimerasas, esterasas, formamidasa, galactosidasas, por ejemplo α-o β-galactosidasas, exo-glucanasas, glucano liasas, endo-glucanasas, glucoamilasas, glucosa-oxidasas, glucosidasas, por ejemplo α-o β-glucosidasas, glucuronidasas, hemicelulasas, hidrolasas, invertasas, isomerasas, lacasas, fenol oxidasas, lipasas, liasas, manosidasas, oxidasas, oxidorreductasas, pectinasas, pectato liasas, pectina acetil esterasas, pectinas depolimerasas, peptidasas, pectinas metil esterasas, enzimas pectinolíticas, peroxidasas, fenoloxidasas, fitasa, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, ribonucleasas, taumatina, transferasas, proteínas de transporte, transglutaminasas, xilanasas, hexosa oxidasa (D-hexosa: (O2-oxidorreductasa, EC 1.1.3.5), fosfatasas ácidas y/u otras o combinaciones de las mismas. Estasincluyen enzimas que, por ejemplo, modulan la viscosidad dela composición o alimentación.

En una realización particularmente preferida, la enzima se usa en combinación con carboxipeptidasa A.

En una realización preferida adicional, la enzima se usa en combinación conla proteasa PEPAd.

En una realización adicional, la amidasa puede usarse en combinación con al menos una de una enzima desintoxicante seleccionada del grupo que consiste en una enzima degradadora de micotoxinas, por ejemplo, aflatoxina destoxizima, zearalenona esterasas, zearalenona lactonasas, fumonisin carboxilesterasas, fumonisin aminotransferasas, aminopoliol amina oxidasas, desoxinivalenol, expoxido hidrolasas, un microorganismo que degrada las micotoxinas, por ejemplo, Bacillus subtilis, B. licheniformis, Lactobacillus o un absorbente (es decir, aglutinantes de micotoxina) que incluyen al menos un polímero, por ejemplo, paredes de células microbianas o un material inorgánico tal como la bentonita.

Se entenderá que el aditivo de alimentación puede ser para cualquier animal adecuado. En una realización preferida, el animal es un animal monogástrico, por ejemplo, aves de corral, cerdo, pescado, mariscos y crustáceos, por ejemplo, camarones, animales de compañía tales como, por ejemplo, gatos o perros. En un ejemplo preferido

alternativo, el animal es un rumiante seleccionado de, por ejemplo, vacas u otros bovinos, ovejas, cabras, camellos, ciervos, llamas, antílopes, alpacas o ñus.

Será evidente para los expertos en la materia que el aditivo alimentario o de alimentación de acuerdo con la presente invención también puede comprender otros componentes tales como agentes estabilizantes y/o agentes de carga y/u otras enzimas.

Preferiblemente, el aditivo alimentario o de alimentación de acuerdo con la presente invención será térmicamente estable para el tratamiento térmico hasta aproximadamente 70ºC; hasta aproximadamente 80ºC; o hasta aproximadamente 95ºC. El tratamiento térmico puede realizarse durante hasta aproximadamente 0,5 minutos; hasta aproximadamente 5 minutos; hasta aproximadamente 10 minutos; hasta aproximadamente 30 minutos; hasta aproximadamente 60 minutos. La expresión térmicamente estable significa que al menos aproximadamente el 75% de los componentes de la enzima que estaban presentes/activos en el aditivo antes del calentamiento a la temperatura especificada todavía están presentes/activos después de que se enfríe a temperatura ambiente. Preferiblemente, al menos aproximadamente 80% de los componentes de la enzima que estaban presentes y activos en el aditivo antes de calentar a la temperatura especificada todavía están presentes y activos después de que se enfríe a temperatura ambiente.

El aditivo para alimentos o producto alimenticio según la presente invención puede tener una vida útil superior a aproximadamente 30 semanas; más de aproximadamente 40 semanas; más de aproximadamente 50 semanas; más de aproximadamente 1 año; más de aproximadamente 1,5 años. La vida útil significa que al menos aproximadamente el 80% delos componentes de la enzimaque estaban presentes y activos en el aditivo, cuando se preparó, están todavía presentes y activos.

Preferiblemente, el método de preparación de un alimento o aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención comprende una etapa de mezclado que comprende mezclar la enzima amidasa que degrada la ocratoxina, preferiblementela ocratoxina A, opcionalmente con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable.

Más preferiblemente, la enzima amidasa también es capaz de degradar al menos otro derivado de ocratoxina u ocratoxina y/o al menos un alcaloide de cornezuelo, más preferiblemente, la ocratoxina B.

En una realización particularmente preferida, el aditivo alimenticio o de alimentación se homogeniza para producir un polvo.

En una realización alternativa preferida, el aditivo alimentario o de alimentación se formula en gránulos como se describe en el documentoWO2007/044968 (denominados gránulos de TPT). En otra realización preferida, cuando el aditivo alimentario o de alimentación se formula en gránulos, los gránulos comprenden una sal de barrera hidratada recubierta sobre el núcleo de proteína. La ventaja de dicho revestimiento de sal es la mejora de la termo-tolerancia, la mejora de la estabilidad de almacenamiento y la protección frente a otros aditivos alimentarios o de producto alimenticios que, de otro modo, tendrían un efecto adverso sobre la enzima.

Preferiblemente, la sal utilizada para el recubrimiento de sal tiene una actividad en agua menor que 0,25 o una humedad constantemayor que 60% a 20ºC.

Preferiblemente, el revestimiento de sal comprende un Na2SO4.

El método de preparación de un alimento o aditivo para alimentación también puede comprender la etapa adicional de granular el polvo. El polvo se puede mezclar con otros componentes conocidos en la técnica. El polvo, o la mezcla que comprende el polvo, se puede forzar a través de una boquilla y las cadenas resultantes se cortan en gránulos adecuados de longitud variable.

Opcionalmente, la etapa de granulación puede incluir un tratamiento con vapor, o etapa de acondicionamiento, antes de la formación de los gránulos. La mezcla que comprende el polvo puede colocarse en un acondicionador, p. ej. un mezclador con inyección de vapor. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura especificada, tal como de60-100ºC, lastemperaturas típicas serían 70ºC, 85ºC, 90ºC o 95ºC. El tiempo deresidencia puede variar de segundos a minutos e incluso a horas. Tales como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5minutos, 10minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.

En un aspecto adicional, se proporciona un alimento o material de alimentación que comprende el aditivo alimentario

o de alimentación de la presente invención. Se entenderá que el aditivo alimentario o de alimentación de la presente invención es adecuado para su adición a cualquier alimento o material de alimentación apropiado.

Será evidente para el experto en la materia que el aditivo alimentario o de alimentación se puede agregar a cualquier alimento o material de alimentación como medida de precaución. Alternativamente, el alimento o el aditivo alimenticio puede agregarse a alimentos o materiales de alimentación que se sabe que son propensos a la ocratoxina, preferiblemente a la ocratoxina A, a la contaminación o a alimentos o productos alimenticios que han demostrado estar contaminados con ocratoxina, preferiblemente la ocratoxina A. Será más evidente para los expertos en la materia que la presencia de ocratoxina, preferiblemente la ocratoxina A, se puede identificar por

cualquier medio adecuado, por ejemplo, HPLC, ELISA o mediante el uso de tiras de detección de ocratoxina disponibles en el mercado (Helica Biosystems, Inc., FullertonCA).

Como se usa en el presente documento, la expresión material de alimentación se refiere al material de alimentación básico que va a consumir un animal. Se entenderá además que esto puede comprender, por ejemplo, al menos uno

o más granos no procesados, y/o materiales vegetales y/o animales procesados, tales como harina de soja o harina de huesos.

En algunas realizaciones, el material de alimentación comprenderá uno o más de los siguientes componentes: a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes tales como maíz o sorgo; b) subproductos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, solubles de grano seco de destilería (DDGS), salvado de trigo, harinillas de trigo, moyuelos de trigo, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, almendra de palma y pulpa de cítricos; c) ensilaje como el ensilaje de maíz; d) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuete, altramuz, guisantes, habas, algodón, canola, harina de pescado, proteína de plasma seco, harina de carne y huesos, proteína de patata, suero de leche, copra, sésamo; e) aceites y grasas obtenidos defuentes vegetales y animales; f) minerales y vitaminas.

Como se usa en el presente documento, la expresión producto alimenticio se refiere a un material de alimentación al que se han añadido uno o más aditivos de alimentación. De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un alimento que comprende el material de alimentación de la presente invención.

La persona experta entenderá que diferentes animales requieren diferentes alimentos, e incluso el mismo animal puede requerir diferentes alimentos, dependiendo del propósito para el que se cría el animal.

Preferiblemente, el producto alimenticio puede comprender materiales de alimentación que comprenden maíz, trigo, cebada, triticale, centeno, arroz, tapioca, sorgo y/o cualquiera de los subproductos, así como componentes ricos en proteínas como medio de soja, harina de semilla de colza, harina de canola, harina de semilla de algodón, medios de semilla de girasol, comidas de subproductos de animales y mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el producto alimenticio puede comprender grasas animales y/o aceites vegetales.

Opcionalmente, el alimento también puede contener minerales adicionales tales como, por ejemplo, calcio y/o vitaminas adicionales.

Como se usa en el presente documento, la expresión material alimenticio se refiere a un alimento básico para ser consumido por un humano. Se entenderá que esto puede comprender material de grano, vegetal o animal.

En algunas realizaciones, el material alimenticio puede comprender uno o más de un producto de cereal o cereal, café, cacao, vino, cerveza, legumbres, especias, frutos secos, zumo de uva, leche, carne o productos cárnicos.

Como se usa en este documento, la expresión producto alimenticio se refiere a un material alimenticio al que se han añadido uno o más aditivos alimentarios. De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un producto alimenticio que comprende el material alimenticio dela presente invención.

En realizaciones preferidas, el alimento o producto alimenticio comprende amidasa a un nivel de aproximadamente 0,001 mg -10 g/kg, 0,01 mg -10 g/kg, 0,1 mg -10 g/kg, 0,1 mg -5 g/kg, 1 mg -5 g/kg, 0,5g -1 g/kg de alimento/producto alimenticio.

Será evidente para los expertos en la materia que para que el aditivo alimentario o de alimentación de la presente invención proporcione las ventajas reivindicadas, el alimento/producto alimenticio debe ser un alimento/producto alimenticio contaminado con ocratoxina, preferiblemente ocratoxina A.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir un producto alimenticio. Los productos alimenticios se producen típicamente en fábricas de producto alimenticios en las que las materias primas se muelen primero hasta un tamaño de partícula adecuado y luego se mezclan con los aditivos apropiados. El producto alimenticio puede entonces producirse como un puré o gránulos; el último típicamente implica un método por el cual la temperatura se eleva a un nivel objetivo y luego el producto alimenticio se pasa a través de un molde para producir gránulos de un tamaño particular. Los gránulos se dejan enfriar. Posteriormente, se pueden agregar aditivos líquidos tales como grasa y enzimas. La producción del producto alimenticio también puede implicar un paso adicional que incluye la extrusión o expansión antes de la granulación, en particular, mediante técnicas adecuadas que pueden incluir al menos el uso de vapor.

El producto alimenticio puede ser un alimento para cualquier animal adecuado. Preferiblemente, el producto alimenticio es para animales domésticos o de granja.

En una realización, el animal es un animal monogástrico, como las aves de corral (por ejemplo, pollos de engorde, ponedoras, reproductoras de engorde, pavos, patos, gansos, aves acuáticas), porcinos (todas las categorías de edad), peces, crustáceos como los camarones, mascotas(por ejemplo, perros, gatos).

En una realización adicional, el animal es un rumiante, tal como un bovino (por ejemplo, vacas, búfalos, bisontes, yaks), ovejas, cabras, camellos, ciervos, llamas, antílopes, alpacas o ñus.

El producto alimenticio puede comprender al menos 0,0001% en peso del aditivo de alimentación. Adecuadamente, el producto alimenticio puede comprender al menos 0,0005%; al menos 0,0010%; al menos 0,0020%; al menos 0,0025%; al menos 0,0050%; al menos 0,0100%; al menos 0,020%; al menos 0,100%, al menos 0,200%; al menos 0,250%; al menos 0,500% en peso del aditivo para alimentación.

En un aspecto adicional, se proporciona el uso de al menos una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina, preferiblemente la ocratoxina A, en la fabricación de un alimento o producto alimenticio para reducir el nivel de contaminación por micotoxinas en el alimento o producto alimenticio.

Preferiblemente, la enzima amidasa también es capaz de degradar al menos otro derivado de ocratoxina u ocratoxina y/o al menos un alcaloide de cornezuelo, más preferiblemente, la ocratoxina B.

Preferiblemente, la al menos una enzima amidasa se formula como un aditivo alimentario o de alimentación. Más preferiblemente, el aditivo alimentario o de alimentación es el aditivo alimentario o de alimentación de acuerdo con la presente invención.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un material contaminado con ocratoxina, preferiblemente ocratoxina A, y una amidasa que degrada la ocratoxina, preferiblementela ocratoxina A, como se describe en la presente memoria.

En una realización preferida de la presente invención, la composición comprende una célula recombinante capaz de expresar la amidasa degradante de la ocratoxina A.

Se entenderá que dicha composición puede comprender cualquier material contaminado con ocratoxina A adecuado. En realizaciones preferidas, la composición comprende un alimento o material de alimentación, un caldo de fermentación o producto de desecho del proceso de fermentación tal como DDGS, agua residual o tierra contaminada.

El experto comprenderá que la contaminación por ocratoxina A de las composiciones distintas de los alimentos y las materias primas puede ser problemática. Por ejemplo, las aguas residuales que contienen ocratoxina A de procesos industriales pueden provocar la contaminación delas vías acuáticas.

También se proporciona mediante la presente invención un método para reducir la contaminación por ocratoxina en un material, que comprende la adición al material contaminado de una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina, preferiblemente la ocratoxina A.

También se proporciona mediante la presente invención un alimento o material de alimentación que se puede obtener mediante los métodos dela presente invención.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la tasa de crecimiento y/o la salud de un animal que comprende alimentar al animal con una cantidad eficaz de un alimento de acuerdo con la presente invención.

Tal como se usa en el presente contexto, el término salud se refiere a una reducción en los efectos perjudiciales en un animal causados por la toxicidad de la ocratoxina que resultan de los niveles de ocratoxina presentes en el producto alimenticio.

Ejemplos

La invención se describirá adicionalmente con referencia a los ejemplos y figuras en los que:

La Figura 1 muestra la capacidad de PEPAd (una proteasa de ácido aspártico Danisco clonada de A niger), lipasa Amano™ y carboxipeptidasa A bovina con las mismas concentraciones de proteína frente a la degradación de OTA. La actividad se expresó en % del área de OT-a (producto de OTA): el área correspondiente al producto dividido por el área total (área del pico deOTA más OT-a).

La figura 2 muestra el porcentaje del área de OT-a y la actividad de lipasa relativa (%) en fracciones de (A): cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)/cromatografía de afinidad con una columna empaquetada de fenil Sepharose (2,6 cm x 10 cm) y gradiente de sulfato de amonio 1 M a 0. (B): Columna Q30 de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) con gradiente de NaCl de 0 a 1M después de HIC.

La Figura 3 muestra el análisis de SDS-PAGE de la fracción de AEX concentrada que tiene la mayor actividad de degradación de OTA. Las bandas indicadas A y B se digirieron en gel con tripsina y los péptidos digeridos se separaron en HPLC defase inversa y se analizaron con MS para laidentificación de los péptidos.

La Figura 4 muestra gráficamente la separación de fracciones activas de OTA por HIC/cromatografía de afinidad después del fraccionamiento con sulfato de amonio. La Figura 4A muestra la HIC o la cromatografía de afinidad en una columna de Fenil Sepharose; la Figura 4Bmuestra HIC en columna de butil Sepharose. La Figura 4C muestra la distribución de la actividad de lipasa y OTA en las fracciones recogidas 2-28 de la columna de Butil Sepharose.

La Figura 5 muestra el análisis por SDS-PAGE de fracciones activas concentradas de OTA después de las etapas de purificación del fraccionamiento de amonio, HIC/afinidad en Fenil Sepharose, HIC en Butil Sepharose, AEX en Source Q30 y separación/concentración de membrana en concentrador Amicon centriprep 10 (corte molecular de 10kDa).

La Figura 6 muestra las actividades presentes en las fracciones AEX separadas por membrana y concentradas de la Figura 5 en formamida (Figura 6A) y OTA (Figura 6B), picos de proteína ensayados a 280 nm.

La Figura 7muestrala construcción del casete de expresión de amidasa 2.

La Figura 8 muestra el análisis SDS-PAGE de proteínas intracelulares de transformantes de A. niger que albergan el gen de Amidasa 2. La banda de proteína de amidasa 2 está indicada por una barra de flecha.

La Figura 9 muestra el análisis por SDS-PAGE de proteínas extracelulares de transformantes de A. niger que albergan el gen de Amidasa 2. La banda de proteína de amidasa 2 está indicada por una barra de flecha.

La Figura 10 muestra el cribado de fracciones intracelulares y extracelulares (caldo de fermentación) de transformantes de Aspergillus niger (1-15) que albergan el gen de la amidasa 2 por su capacidad de descomponer la OTA. 10 μΙ de las fracciones intracelulares o el caldo se mezclaron con 25 μΙ de 1 μg/ml de OTA, 100 μΙ de fosfato sódico (67 mM, pH 7,0) y se incubaron a 40ºC durante 35 min. Al final de la reacción, se añadieron 130 μl de acetonitrilo que contenía un 0,2% de ácido acético para detener la reacción. La mezcla de reacción se filtró y se analizaron 5 μl por análisis RP-HPLC del OTA restante. wt se refiere a la cepa parental utilizada para la transformación; ctrl, se refiere a la reacción en ausencia de transformantes de A. niger.

La Figura 11 muestra el pH óptimo de la amidasa 2 a partir de la preparación intracelular de A. niger transgénica en la degradación de OTA. La mezcla de reacción contenía 5 μl de mezcla de amidasa 2 (una mezcla de las fracciones intracelulares del transformante 3, 4, 7-8, 10-11 y 13-15) con una concentración de proteína de 155 μg de proteína/ml), 0,1 ml de tampón de fosfato 67m ( pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9), 25 μΙ OTA (1 μg/ml). La reacción se realizó a 30ºC durante 60 min y se detuvo mediante la adición de 0,13 ml de acetonitrilo que contenía HAC al 0,2%. Se usó un volumen de inyección de 10 μΙ para el análisis de RP-HPLC del OTA restante después del filtrado.

La Figura 12 muestra la estabilidad térmica de la amidasa 2 a partir de la preparación intracelular de A. niger transgénica. La mezcla de preincubación en un tubo ependorpf de 1,5 ml contenía 5 μl de la mezcla de amidasa 2 (155 μg de proteína/ml) y 45 μl de tampón fosfato 67 mM, pH 7,0. Las muestras se preincubaron a 80ºC durante 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 min. Después de enfriar a 15ºC, se añadieron 50 μΙ de tampón fosfato 67mM y 25 μΙ de OTA (1 μg/ml) para comenzar la reacción, esta se incubó a 30ºC durante 60 min, la reacción se detuvo mediante la adición de 130 μl de acetonitrilo que contenía 0,2% de HAC. Se usó un volumen de inyección de 10 μΙ para el análisis de RP-HPLC de OTA restante después del filtrado.

La Figura 13 muestra la estabilidad del pH y la temperatura de la amidasa 2 a partir de la preparación intracelular de

A. niger transgénica incubada a 70ºC a pH 3-9 en fosfato de sodio 67 mM. La mezcla de reacción contenía 5 μl de mezcla de amidasa 2 (155 μg de proteína/ml), 45 μl de tampón fosfato 67 mM a pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9. Las mezclas de reacción se incubaron a 70ºC durante 30 minutos, antes de que se añadieran 2 μl de OTA 0,5 mg/ml en etanol y 80 μl de Mops 0,2 M, pH 7,0, y las muestras se incubaron a 30ºC durante 60 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 130 μl de acetonitrilo que contenía HAC al 0,2%, se filtró y se analizó mediante RP-HPLC.

La Figura 14 muestra el análisis de la amidasa 2 recombinante purificada del caldo del transformante de A. niger 13 mediante SDS-PAGE en fracciones AEX (A) y mediante espectrometría de masas (B) en la fracción 13 después de AEX.

La Figura 15 muestra la degradación de OTA en función de la concentración de proteína amidasa. La amidasa utilizada se purificó a partir del caldo del transformante 13 (proteína de 438aa denominada amidasa 2 mat).

La Figura 16 muestra el efecto de la concentración de iones de calcio sobre la actividad de la amidasa 2 mat purificada a partir de A. niger transgénico y el producto de lipasa Amano™.

Figura 17. Degradación de OTA por la amidasa 2 extraída de la fracción intracelular (Amidasa 2 sig) de A. niger. No se observa inhibición por CaCl2 o EDTA a amidasa 2 sig.

La Figura 18A muestra la secuencia de aminoácidos de la amidasa 2 (480aa) (SEQ ID Nº: 1) de Aspergillus niger en formato de una letra. Las secuencias subrayadas simples son las obtenidas de la Figura 5; el doble subrayado son las obtenidas de la Figura 8.

La Figura 18B muestra la secuencia de aminoácidos de la amidasa 2 (480aa) más 6 restos de histidina en su terminal C de Aspergillus niger en un formato deletra (SEQ ID NO. 4).

La Figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos de la amidasa 2 (480aa) de Aspergillus niger en formato de tres letras. Las características propias de las amidasas degradantes de OTA se indican como residuos de aminoácidos en negrita y subrayados: residuos conservados (en negrita) y nuevemotivos de secuencia (subrayados).

La Figura 20a muestra la estructura del tetrámero de la proteína de amidasa 2 (SEQ ID NO: 1) formando la estructura de barril tipo TIM distorsionada; bmuestra la estructura de 1 de las 8 subunidades.

La Figura 21muestra la estructura del entorno del sitio activo de la amidasa 2.

La Figura 22muestra las coordenadas cristalinas de un monómero de amidasa 2.

La Figura 23 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pTTT-pyrG13-Amidasa G. graminicola.

La Figura 24 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pTTT-pyrG13-Amidasa M. anisopliae.

La Figura 25muestra un mapa del plásmido de expresión pRAX-Amidasa A. oryzae.

La Figura 26 muestra una alineación de 11 secuencias de amidasa que muestran los 9 motivos de secuencia que son esenciales para la actividad dela amidasa que degrada la ocratoxina.

La Figura 27 muestra una alineación de SEQ ID NO: 1 y carboxipeptidasas A e Y que se sabe que tienen una baja actividad de degradación de ocratoxina.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usadosen la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente cualquier experto habitual en la técnica a la que pertenece esta descripción. Singleton, et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan herramientas con un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta descripción.

Esta descripción no está limitada por los métodos y materiales ejemplares descritos en este documento, y cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba de las realizaciones de esta descripción. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácido nucleico se escriben de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente.

Los títulos proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de esta descripción los cuales pueden disponerse por referencia a la especificación como un todo. En consecuencia, los términos y expresiones definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva como un todo.

Los aminoácidos semencionan en este documento utilizando el nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras

o la abreviatura de una solaletra.

Como se usa en el presente documento, el término "identidad" significa una entidad que tiene una cierta homología con las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos. El término "identidad" en este contexto se refiere al porcentaje de identidad de secuencia entre dos enzimas después de alinear sus secuencias usando algoritmos de alineación como se describe con más detalle acontinuación.

En el presente contexto, se toma una secuencia de aminoácidos homóloga para incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente al menos 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos etc. p.ej. como la secuencia de aminoácidos en cuestión. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones A similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Para las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos, las comparaciones de homología se pueden realizar a simple vista, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos

o más secuencias.

El % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la

otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se llama una alineación "desacoplada". Típicamente, tales alineaciones no acopladas se realizan solo en un número relativamente cortode residuos.

Aunque este es un método muy simple y consistente, no toma en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias idénticas, una inserción o eliminación hará que los siguientes residuos de aminoácidos se desalineen, lo que podría resultar en una gran reducción en % de la homología cuando se realiza una alineación global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta las posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar indebidamente el puntaje de homología global. Esto se logra insertando "huecos" en la alineación de secuencia para tratar de maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada espacio que ocurre en la alineación para que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con la menor cantidad posible de huecos, que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas, logrará una puntuación más alta que una con muchos huecos. Los "costos de huecos de afinidad" se usan normalmente de modo que cargan un costo relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor por cada residuo subsiguiente en el hueco. Este es el sistema de calificación de huecos más comúnmente utilizado. Las altas penalizaciones de hueco producirán, por supuesto, alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores predeterminados cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por hueco predeterminada para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.

El cálculo del % de homología máxima, por lo tanto, primero requiere la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones de huecos. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12, p. 387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed., Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60).

Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, llamada BLAST 2 Sequences también está disponible para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineación en sí mismo no se basa típicamente en una comparación de pares de todo o nada. En cambio, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud escalada que asigna puntajes a cada comparación por pares en función de la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62, la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. Los programas de GCG Wisconsin generalmente utilizan los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministran (consúltese el manual del usuario para obtener más información). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores predeterminados públicos para el paquete GCG o, en el caso de otro software, la matriz predeterminada, como BLOSUM62.

Alternativamente, las homologías porcentuales pueden calcularse usando la característica de alineación múltiple en DNASIS™ (Software Hitachi), en base a un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).

Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software generalmente hace esto como parte de la comparación de secuencia y genera un resultado numérico.

En un aspecto preferible de la presente invención, se usan el siguiente software y configuraciones para calcular la homología/identidad de la secuencia porcentual. Para las secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identidades (homología) o "positivos" se calculan mediante AlignX VectorNTI (Vector NTI Advance 9.1 de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, EE.UU.) para cada posible par de secuencias de aminoácidos. Los ajustes son parámetros predeterminados (penalización de apertura de hueco: 10, penalización de extensión de hueco: 0,1).

Para las secuencias de ácido nucleico, el porcentaje de identidades (homología) o "positivos" se calcula mediante el programa AlignX VectorNTI de Informax Inc. (EE.UU.) para cada posible par de secuencias de ácido nucleico. Los ajustes son ajustes predeterminados para el ADN: penalización de apertura de hueco: 15 y penalización de extensión de hueco: 6,66 (mismos ajustes para alineaciones múltiples).

Preferiblemente, la identidad de aminoácidos (homología) se calcula a través de la secuencia de aminoácidos de longitud completa o del ácido nucleico a un polinucleótido correspondiente que codifica la respectiva secuencia de aminoácidos delongitud completa.

Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de aminoácidos se pueden realizar sobre la base de la similitud en las propiedades de los aminoácidos (tales como la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos) y, por lo tanto, es útil agrupar aminoácidos juntos en grupos funcionales. Los aminoácidos se pueden agrupar según las propiedades de su cadena lateral sola. Sin embargo, es más útil incluir también datos demutación. Los conjuntos de aminoácidos así derivados probablemente se conservarán por razones estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en la forma de un diagrama de Venn (Livingstone C.D. y Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756) (Taylor

W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Se pueden hacer sustituciones conservativas, por ejemplo, de acuerdo con la tabla a continuación que describe un agrupamiento de aminoácidos del diagrama de Venn generalmente aceptado.

CONJUNTO

SUB-CONJUNTO

Hidrofóbico

F W Y H K M I L V A G C Aromático F W Y H

Alifático

I L V

Polar

W Y H K R E D C S T N Q Cargado H K R E D

Cargado positivamente

H K R

Cargado negativamente

E D

Pequeño

V C A G S P T N D Pequeño A G S

La presente invención también abarca la sustitución homóloga (la sustitución y el reemplazo se usan en este documento para indicar el intercambio de un residuo de aminoácido existente, con un residuo alternativo) que puede producirse, es decir, una sustitución uno a uno, básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La sustitución no homóloga también puede ocurrir, es decir, de una clase de residuo a otro, o alternativamente implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (en lo sucesivo en este documento denominada Z), ácido diaminobutírico ornitina (en lo sucesivo en este documento denominada B), norleucina ornitina (en lo sucesivo en este documento denominadaO), piridilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

Los reemplazos también pueden ser hechos por aminoácidos no naturales.

El término "proteína", como se usa en el presente documento, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.

Las expresiones "residuo de aminoácido equivalente a", "aminoácido correspondiente a" y sus equivalentes gramaticales se usan en la presente memoria para referirse a un resto de aminoácido de una proteína que tiene la posición y el efecto similares a los indicados en una secuencia de aminoácidos particular de un proteína particular. El experto en latécnica reconocerála equivalencia de residuos especificados en proteínas comparables.

El término "propiedad" o los equivalentes gramaticales del mismo en el contexto de un polipéptido, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier característica o atributo de un polipéptido que pueda seleccionarse

o detectarse. Estas propiedades incluyen, pero no están limitadas a, la estabilidad oxidativa, especificidad del sustrato, actividad catalítica, estabilidad térmica, temperatura y/o perfil de actividad del pH, estabilidad del procesamiento de alimentación y capacidad de secretarse.

Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "péptido". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "enzima".

La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse a partir de una fuente adecuada, o puede prepararse sintéticamente o puede prepararsemediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en este documento. En la presente descripción y reivindicaciones, se usan los códigos de una letra y tres letras convencionales para los residuos de aminoácidos. El código de 3 letras para aminoácidos, tal como se define de conformidad con la Comisión Conjunta de iUPACIUB sobre Nomenclatura Bioquímica (JCBN). También se entiende que un polipéptido puede codificarse por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

La expresión "secuencia señal" o "péptido señal" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que puede participar en la secreción de las formas maduras o precursoras de la proteína. Esta definición de secuencia de señal es funcional, significa que incluye todas aquellas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de proteína, que participa en la realización de la secreción de proteína. A menudo, pero no universalmente, se unen a la porción N-terminal de una proteína o a la porción N-terminal de una proteína precursora.

Por "fragmento funcional" se entiende un fragmento del polipéptido que conserva las propiedades características de ese polipéptido. En el contexto de la presente invención, un fragmento funcional de una enzima amidasa es un fragmento que retiene la capacidad de escisión de la enzimaamidasa de la proteína completa.

El término "aislado", "recuperado" o "purificado" se refiere a un material que se elimina de su entorno original. La expresión "sustancialmente purificado" significa que el material se ha purificado al menos en un grado sustancial.

En un aspecto, preferiblemente la secuencia de nucleótidos o aminoácidos está en una forma aislada. El término "aislado" significa que la secuencia está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que la secuencia está naturalmente asociada en la naturaleza y tal como se encuentra en la naturaleza.

Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la memoria descriptiva. Antes de que las realizaciones ejemplares se describan con más detalle, se debe entender que esta descripción no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance dela presente descripción estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio también se describe específicamente, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor declarado o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo indicado está abarcado dentro de esta descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se pueden incluir o excluir de forma independiente en el intervalo, y cada intervalo en el que alguno, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos más pequeños también está incluido dentro de esta descripción, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen alguno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en esta descripción.

Debe observarse que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen a los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un gen" incluye una pluralidad de tales agentes candidatos y la referencia a "la célula" incluye la referencia a una o más células y equivalentes de las mismas, conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Las publicaciones discutidas en este documento se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que tales publicaciones constituyen la técnica anterior alas reivindicaciones adjuntas.

Las enzimas para uso en la presente invención pueden producirse mediante el cultivo sólido o sumergido, que incluyen procesos discontinuos, alimentados por lotes y de flujo continuo. El cultivo se lleva a cabo en un medio de crecimiento que comprende un medio de sales minerales acuosas, factores de crecimiento orgánicos, el material fuente de carbono y energía, oxígeno molecular y, por supuesto, un inóculo inicial de una o más especies de microorganismos particulares a emplear.

Además de la fuente de carbono y energía, oxígeno, nitrógeno asimilable y un inóculo del microorganismo, es necesario suministrar cantidades adecuadas en proporciones adecuadas de nutrientes minerales para asegurar el crecimiento adecuado demicroorganismos, maximizar la asimilación del carbono y la fuente de energía mediante las células en el proceso de conversión microbiana, y lograr los rendimientos celulares máximos con la máxima densidad celular en losmedios de fermentación.

La composición del medio mineral acuoso puede variar en un amplio intervalo, dependiendo en parte del microorganismo y el sustrato empleado, como se conoce en la técnica. Los medios minerales deben incluir, además de nitrógeno, cantidades adecuadas de fósforo, magnesio, calcio, potasio, azufre y sodio, en formas iónicas y combinables asimilables solubles adecuadas, y también deben estar presentes preferiblemente ciertos elementos traza tales como cobre, manganeso, molibdeno, zinc, hierro, boro y yodo, y otros, nuevamente en forma soluble asimilable adecuada, todos conocidos en la técnica.

La reacción de fermentación es un proceso aeróbico en el que el oxígeno molecular necesario es suministrado por un gas que contiene oxígeno molecular, tal como aire, aire enriquecido en oxígeno o incluso oxígeno molecular sustancialmente puro, proporcionado para mantener el contenido del recipiente de fermentación con una adecuada presión parcial de oxígeno efectiva para ayudar a las especies demicroorganismos a crecer demanera próspera. En efecto, al usar un sustrato de hidrocarbono oxigenado, se reduce el requerimiento de oxígeno para el crecimiento del microorganismo. Sin embargo, el oxígeno molecular debe suministrarse para el crecimiento, ya que la asimilación del sustrato y el crecimiento correspondiente de los microorganismos es, en parte, un proceso de combustión.

Aunque la velocidad de aireación puede variar en un intervalo considerable, la aireación generalmente se realiza a una velocidad que está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 10, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 7, ~volúmenes (a la presión empleada y a 25ºC) degas quecontieneoxígeno por volumen delíquido en el fermentador

por minuto. Esta cantidad se basa en el aire de contenido de oxígeno normal que se suministra al reactor, y en términos de oxígeno puro los intervalos respectivos serían de aproximadamente 0,1 a 1,7, o preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 1,3 volúmenes (a la presión empleada y a 25ºC) de oxígeno por volumen de líquido en el fermentador por minuto.

La presión empleada para el proceso de conversión microbiana puede variar ampliamente. Las presiones generalmente están dentro del intervalo de aproximadamente 0 a 50 psig (0 a 345 kPa), actualmente preferiblemente de aproximadamente 0 a 30 psig (0 a 207 kPa), más preferiblemente al menos ligeramente sobre la presión atmosférica, como un equilibrio del equipo y el costo de operación frente a la solubilidad del oxígeno lograda. Las presiones superiores a la atmosférica son ventajosas porque tales presiones tienden a aumentar la concentración de oxígeno disuelto en el fermento acuoso, lo que a su vez puede ayudar a aumentar las velocidades de crecimiento celular. Al mismo tiempo, esto se equilibra con el hecho de que las altas presiones atmosféricas aumentan los costos de equipo y operación.

La temperatura de fermentación puede variar un poco, pero para hongos filamentosos como Aspergillus niger o Trichoderma reesei la temperatura generalmente estará dentro del intervalo de aproximadamente 20ºC a 40ºC, generalmente preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 25ºC a 34ºC, dependiendo de la cepa del microorganismo elegido.

Los microorganismos también requieren una fuente de nitrógeno asimilable. La fuente de nitrógeno asimilable puede ser cualquier compuesto que contenga nitrógeno o compuestos capaces de liberar nitrógeno en una forma adecuada para la utilización metabólica por el microorganismo. Aunque se puede emplear una variedad de compuestos fuente de nitrógeno orgánico, tales como hidrolizados de proteínas, generalmente pueden ser utilizados compuestos baratos que contienen nitrógeno tales como amoníaco, hidróxido de amonio, urea y diversas sales de amonio tales como fosfato de amonio, sulfato de amonio, pirofosfato de amonio, cloruro de amonio, u otros diversos compuestos de amonio. El gas amoníaco en sí es conveniente para operaciones a gran escala, y se puede emplear burbujeándolo a través del fermento acuoso (medio de fermentación) en cantidades adecuadas. Al mismo tiempo, dicho amoníaco también se puede emplear para ayudar en el control del pH.

El intervalo de pH en el fermento microbiano acuoso (mezcla de fermentación) debería estar en el intervalo ejemplar de aproximadamente 2,0 a 8,0. Con hongos filamentosos, el pH normalmente está dentro del intervalo de aproximadamente 2,5 a 8,0; con Aspergillius niger o Trichoderma reesei, el pH normalmente está dentro del intervalo de aproximadamente 3,0 a 7,0. Las preferencias de intervalo de pH para ciertos microorganismos dependen de los medios empleados hasta cierto punto, así como del microorganismo particular y, por lo tanto, cambian algo con el cambio en los medios como pueden determinar fácilmente los expertos en la técnica.

Aunque el tiempo medio de retención de la mezcla de fermentación en el fermentador puede variar considerablemente, dependiendo en parte de la temperatura de fermentación y el cultivo empleado, generalmente estará dentro del intervalo de aproximadamente 24 a 500 horas, preferiblemente actualmente de aproximadamente 24 a 400 horas. Preferiblemente, la fermentación se realiza de tal manera que el sustrato que contiene carbono se pueda controlar como un factor limitante, proporcionando así una buena conversión del sustrato que contiene carbono a las células y evitando la contaminación de las células con una cantidad sustancial de sustrato no convertido. Este último no es un problema con sustratos solubles en agua, ya que cualquier rastro restante se elimina fácilmente por lavado. Sin embargo, puede ser un problema en el caso de sustratos no solubles en agua, y requiere etapas adicionales de tratamiento de producto, tales como etapas de lavado adecuadas. Como se describió anteriormente, el tiempo para alcanzar este nivel no es crítico y puede variar con el microorganismo particular y el proceso de fermentación que se lleva a cabo. Sin embargo, es bien conocido en la técnica cómo determinar la concentración de la fuente de carbono en el medio de fermentación y si se ha alcanzado o no el nivel deseado de fuente de carbono.

Aunque la fermentación se puede realizar como una operación discontinua o continua, la operación de lotes alimentados es muy preferible para facilitar el control, la producción de cantidades uniformes de productos y los usos mucho más económicos de todos los equipos. Si se desea, parte o la totalidad del material fuente de carbono y energía y/o parte de la fuente de nitrógeno asimilable, tal como el amoníaco, se pueden añadir al medio mineral acuoso antes de alimentar el medio mineral acuoso al fermentador. Cada una de las corrientes introducidas en el reactor preferiblemente se controla a una velocidad predeterminada, o en respuesta a una necesidad determinable mediante el control, tal como de la concentración del sustrato de carbono y energía, pH, oxígeno disuelto, oxígeno o dióxido de carbono en los gases residuales del fermentador, la densidad celular medible por transmitancia de luz, o similares.

Las velocidades de alimentación de los diversos materiales pueden variarse para obtener una tasa de crecimiento celular lo más rápida posible, consistente con la utilización eficiente de la fuente de carbono y energía, para obtener un rendimiento tan alto de células demicroorganismos conrespecto ala carga de sustrato como sea posible.

En un lote, o en la operación preferida de lote alimentado, todos los equipos, reactores o medios de fermentación, depósitos o recipientes, tuberías, dispositivos de circulación o enfriamiento concomitantes, y similares, se esterilizan inicialmente, usualmente mediante el empleo de vapor, tal como aproximadamente a 121ºC durante al menos

aproximadamente 15 minutos. El reactor esterilizado se inocula luego con un cultivo del microorganismo seleccionado en presencia de todos los nutrientes requeridos, incluido el oxígeno, y el sustrato que contiene carbono. El tipo de fermentador empleado no es crítico, aunque actualmente se prefiere la operación bajo 15L Biolafitte (Saint-Germain-en-Laye, Francia).

La recogida y purificación de las enzimas de la presente invención a partir del caldo de fermentación también se puede realizar mediante procedimientos conocidos per se en la técnica. El caldo de fermentación generalmente contendrá desechos celulares, que incluyen células, diversos sólidos en suspensión y otros contaminantes de biomasa, así como el producto enzimático deseado de la presente invención, que preferiblemente se eliminan del caldo de fermentación por medios conocidos en la técnica. Los procedimientos adecuados para dicha eliminación incluyen técnicas convencionales de separación sólido-líquido tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, diálisis, microfiltración, filtración en vacío rotatoria u otros procesos conocidos, para producir un filtrado libre de células. Puede ser preferible concentrar adicionalmente el caldo de fermentación o el filtrado libre de células usando técnicas tales como ultrafiltración, evaporación o precipitación. La precipitación de los componentes proteináceos del sobrenadante o filtrado puede realizarse por medio de una sal, por ejemplo, sulfato de amonio. La purificación adicional se puede lograr opcionalmente mediante cristalización o mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o procedimientos reconocidos en la técnica similares.

Variantes/derivados

La presente invención también abarca el uso de variantes, homólogos y derivados de cualquier secuencia de aminoácidos de una enzima o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifique dicha enzima.

Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre dos restos de aminoácidos cualquiera de la secuencia que incluyen grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácidos tales como restos de glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma peptoide, será bien comprendida por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, la "forma peptoide" se usa para referirse a residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente de carbono-α está en el átomo de nitrógeno del residuo en lugar de en el carbono-α. Los procesos para preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132

134.

Otros componentes

Los aditivos o composiciones de alimentación de la presente invención se pueden usar en combinación con otros componentes o vehículos.

Vehículos adecuados para enzimas de alimentación incluyen maltodextrina, piedra caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo, salvado de trigo o un componente de trigo, arroz o salvado de arroz, sacarosa, almidón, Na2SO4, talco, PVA y mezclas de los mismos. Además, hay una serie de técnicas de encapsulación que incluyen aquellas basadas en la cobertura de grasa/cera, la adición de gomas vegetales, etc.

Ejemplos de otros componentes incluyen uno o más de: espesantes, agentes gelificantes, emulsionantes, aglutinantes, modificadores de cristal, edulcorantes (incluidos edulcorantes artificiales), modificadores de reología, estabilizantes, antioxidantes, colorantes, enzimas, vehículos, vehículos, excipientes, diluyentes, agentes lubricantes, aromatizantes, colorantes, agentes de suspensión, disgregantes, aglutinantes de granulación, etc. Estos otros componentes pueden ser naturales. Estos otros componentes pueden prepararse mediante el uso de técnicas químicas y/o enzimáticas.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "espesante o agente gelificante", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un producto que evita la separación al reducir o evitar el movimiento de partículas, ya sea gotitas delíquidos inmiscibles, aire o sólidos insolubles.

El término "estabilizador", tal como se usa en este documento, se define como un ingrediente o combinación de ingredientes que impide que un producto(por ejemplo, un producto alimenticio) cambie con el tiempo.

El término "emulsionante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente de producto alimenticio) que impide la separación de emulsiones.

Como se usa en el presente documento, el término "aglutinante" se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimenticio) que se une al producto mediante una reacción física o química.

La expresión "modificador de cristal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimenticio) que afecta ala cristalización de grasa o agua.

"Portadores" o "vehículos" significan materiales adecuados para la administración de compuestos e incluyen cualquier material conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizante o similar, que no sea tóxico y que no interactue con ningún componente de la composición de manera perjudicial.

Los ejemplos de vehículos nutricionalmente aceptables incluyen, por ejemplo, granos, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales y similares.

Los ejemplos de excipientes incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, glicina, almidón, azúcar de leche y polietilenglicoles de alto peso molecular.

Los ejemplos de desintegrantes incluyen uno o más de: almidón (preferiblemente almidón demaíz, patata otapioca), almidón glicolato sódico, croscarmelosa sódica y ciertos silicatos complejos.

Los ejemplos de aglutinantes de granulación incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y goma arábiga.

Los ejemplos de agentes lubricantes incluyen uno o más de: estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.

Los ejemplos de diluyentes incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

Los otros componentes pueden usarse simultáneamente (por ejemplo, cuando están mezclados entre sí o incluso cuando se administran por diferentes rutas) o secuencialmente (por ejemplo, pueden administrarse por diferentes rutas).

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "componente adecuado para el consumo animal o humano" significa un compuesto que se añade o se puede añadir a la composición de la presente invención como un aditivo que puede ser de beneficio nutricional, un sustituto de fibra o tener un efecto generalmente beneficioso para el consumidor.

A modo de ejemplo, los componentes pueden ser prebióticos tales como alginato, xantano, pectina, goma de algarrobilla (LBG), inulina, goma guar, galactooligosacárido (GOS), fructooligosacárido (FOS), lactosacarosa, oligosacáridos de soja, palatinosa, isomalto-oligosacáridos, gluco-oligosacáridos y xilo-oligosacáridos.

Aislados

En un aspecto, preferiblemente la enzima amidasa para uso en la presente invención está en una forma aislada. El término "aislado" significa que la enzima amidasa está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que la enzima amidasa esté naturalmente asociada en la naturaleza y tal como se encuentra en la naturaleza. El término "aislado" puede significar que la enzima amidasa esté al menos sustancialmente libre de al menos otro componente en el medio de cultivo en el que se produce. La enzima amidasa de la presente invención se puede proporcionar en una forma que esté sustancialmente libre de uno o más contaminantes con los que la sustancia podría estar asociada de otramanera o con la que se pueda producir la enzima.

Por lo tanto, por ejemplo, puede estar sustancialmente libre de la(s) célula(s) o uno o más polipéptidos y/omoléculas de ácido nucleico potencialmente contaminantes. La enzima amidasa puede aislarse separando la(s) célula(s) del caldo durante o después de la fermentación, de modo que la enzima amidasa permanezca en el caldo. La enzima amidasa se puede aislar sometiendo el caldo defermentación a separación celular por filtración al vacío.

En una realización, el término aislado significa que la amidasa se aísla del caldo de manera que esté sustancialmente libre de otros componentes en los medios de cultivo en los que se produce.

Purificados

En un aspecto, preferiblemente la enzima amidasa para usar en la presente invención está en forma purificada. El término "purificado" significa que el componente dado está presente en un nivel alto. El componente es deseablemente el componente predominante presente en una composición. Preferiblemente, está presente a un nivel de al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60% o al menos aproximadamente 65%, o al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 99%, siendo dicho nivel determinado sobre una base de peso seco/peso seco con respecto a la composición total bajo consideración. Para algunas realizaciones, la cantidad es al menos aproximadamente 85%, determinándose dicho nivel sobre una base de peso seco/peso seco con respecto a la composición total considerada.

Concentrados

En un aspecto, preferiblemente la enzima amidasa para usar en la presente invención se usa como concentrado. El concentrado puede ser una forma concentrada del medio en el que se ha excretado la enzima. Preferiblemente, el concentrado puede ser una forma concentrada del medio en el que se ha secretado la enzima y en donde la(s) célula(s) se han eliminado.

Materiales y métodos

La ocratoxina A era de Fluka (nº de cat. 32937-5MG). La carboxipeptidasa A de páncreas bovino (Sigma, cat. No. C9268). Todas las otras enzimas que incluyen amidasas y reactivos comerciales disponibles fueron de Sigma, Roche, Merck y Danisco. La lipasa Amano™ era de Amano Enzyme Inc. (Nagoya, Japón). Todos los medios de cromatización que incluyen fenil-, octil-, butil-Sepharose, intercambio aniónico, filtración en gel (columna PD10) y el aparato de purificación de proteínas Akta explorer eran de GE Healthcare. Las microplacas eran de Nunc A/S (Dinamarca) y Corning (EE.UU.). El lector de microplacas era de Biotek (EE.UU.). La harina de maíz se obtuvo del mercado local, mientras que la alimentación basada en maíz de soja se obtuvo de The Danish Technological Institute en Kolding (Dinamarca).

Ensayos de degradación demicotoxinas:

Método paramedir la actividad de formamidasa

Soluciones utilizadas: kit de ensayo de ácido fórmico Megazyme (K-forma 05/06) Botella 1, agregar 4 ml de agua MilliQ para producir tampón de fosfato de potasio pH7,6. Mantener a 5ºC; Botella 2, agregar 5,2 ml de agua para obtener la concentración correcta de NAD (mantenida a -20ºC); Botella 3, es agitado con FDH antes de su uso (se mantuvo a 5ºC). La formamida es un producto líquido al 99,80% de Sigma (F9037) (mantenido a 5ºC) y se usó tal cual sin dilución adicional.

Procedimiento de ensayo: se añaden a microplacas transparentes al UV de área media de 96 pocillos:

10 μΙ de tampón fosfato de potasio (pH 7,6) (Solución 1 del kit),

10 μΙ de NAD (Solución 2 del kit),

2,5 μΙ de ácido fórmico deshidrogenasa (FDH) (Solución 3 del kit),

1,6 μΙ de 100% (v/v) de solución deformamida (de Sigma, F9037),

100 μΙ de aguamilliQ.

A 37ºC en un lector demicroplacas, se lee el aumento de OD a 340 nm cada minuto y se agita antes de cada lectura durante 15-60 minutos. Intervalo de lectura: 1min.

Después de 5 minutos delectura, seagregan 5 μΙ-20 μΙ depreparación deA. niger (dependiendo de la actividad). Se obtiene la velocidad dereacción (pendiente lineal máxima).

Control: no se añadió formamidasa, sino que se añadió tampón o agua o extracto celular que no tenía actividad de formamidasa en su lugar.

Determinación de la degradación enzimática de OTA. Los tampones empleados en el ensayo fueron: tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 4, 4,5, 5 y 5,5); Tampón MES 50 mM (pH 6, 6,5 y 7); 0,2 M de Mops-NaOH) pH 7,0), tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5, 8 y 8,5). La solución de ocratoxina A (OTA) (1 mg/mL) se preparó con 5 mg de ocratoxina A (Sigma, referencia 32937) disuelta en etanol/agua (60/40) y almacenada a -20ºC. Los ensayos de selección se realizaron con 15 μΙ de solución de OTA y diferentes concentraciones de enzima (por ejemplo, 0,1-5 mg/ml) en un volumen final de 300 μΙ. Las reacciones enzimáticas se realizaron a 37ºC durante 20 h + 1 h bajo agitación constante. Las muestras se filtraron utilizando un filtro de jeringa de 0,20 μm para el análisis de HPLC. El aparato de HPLC consistió en una bomba Dionex P580 y un automuestreador Dionex ASI-100 conectado a un detector de fluorescencia Dionex RF-2000 (λex = 333nm; λem = 460nm) y un detector UV Dionex UVD340U a 257 nm. La elución se realizó a través de una columna C18 Nucleosil 100-5 (250x4,6 mm, tamaño de partícula 5μm; Chrompack) con agua/acetonitrilo/ácido acético (100:100:1, v/v/v) a una velocidad de flujo de 0,6ml/min. La columna se mantuvo a 30ºC y se conectó a la columna de protección (C18, 1 mm, tecnologías Optimize). La OTA y sus productos de degradación se controlaron tanto por UV a 235 nm como por fluorescencia (excitación a una emisión de 278 nm a 440 nm).

Ensayo de preparaciones de A. niger para la actividad de OTA. Lamezcla de reacción consistió en 245 μΙ de OTA (1 μg/ml) diluida en tampón pH 7,0 de Mes-NaOH 50 mM y 5 μl de muestra (caldo de A. niger, extracto libre de células, fracciones después del fraccionamiento amoniacal y cromatografía o producto de A. Níger). La reacción se realizó a 40ºC durante 30 min a 2 horas. El calentamiento a 95ºC durante 5 min se usó para detener la reacción. Las muestras se filtraron usando un filtro dejeringa de 0,20 μm y 5 μLinyectado en el aparato de HPLC.

Ensayo de lipasa y esterasa. La actividad de lipasa y esterasa se ensayó usando butirato de p-nitrofenilo (pNPB) adquirido de Sigma como sustrato. Se añadieron cinco microlitros de pNPB 40 mM disueltos en acetonitrilo a 165 μl de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, y 5 μl de solución de enzima y se usaron para probar la degradación de OTA. La densidad óptica se siguió a 410 nm durante 60minutos.

Ensayo de actividad de proteasa (método de la placa Petri). La actividad de la proteasa se confirmó usando placas que contenían 1% de caseína, 1% de agarosa en 100 mM de tampón de dihidrogenofosfato de sodio, pH 6. La placa se incubó durante la noche a 37ºC y la actividad de la proteasa se reveló mediante el desarrollo de un anillo blanquecino alrededor del pocillo que contenía la enzima.

Ensayo de concentración de proteínas La concentración de proteína se determinó con reactivo de ensayo de proteína Bio-rad basado en el método de Bradford según el procedimiento proporcionado por el fabricante. Usando BSA como estándar, la OD semidió en microplacas a 595 nm, cada muestra se dosificó por duplicado.

Purificación de la actividad degradante de OTA de A. niger

Preparación de la muestra: Fraccionamiento de sulfato de amonio. Se disolvieron cinco gramos de enzima lipasa Amano en 100 ml de tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. Se añadió la cantidad de sulfato de amonio correspondiente al 40% de saturación y se disolvieron los cristales. Después de 10 min de centrifugación a 3500 rpm, se recogió el sobrenadante y se añadió sulfato de amonio para alcanzar un 60% de saturación. Los cristales se disolvieron por agitación y la solución se centrifugó de nuevo. El sedimento correspondiente al precipitado de 40% a 60% de saturación de sulfato de amonio se disolvió en 4x40 ml de tricina 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 7 y se filtró con un filtro de 0,22 μm.

Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). La muestra del fraccionamiento de sulfato de amonio se inyectó y se aplicó a una columna de tanto fenil Sepharose FF, butil-u octil-Sepharose CL4B equilibradas con tricina 50 mM que contenía sulfato de amonio 1 M, pH 7 (tampón A). La columna, conectada al sistema purificador Akta, se lavó con tampón A (10 ml/min) y las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de tricina 50 mM (Tampón B). Se recogieron fracciones de 10ml y se usaron para el ensayo de actividad OTA o ensayo deformamidasa.

Cromatografía de intercambio aniónico (AEX). Las fracciones con alta conversión de OTA se combinaron y desalificaron en una columna PD10 equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 (tampón A). La muestra desalinizada se aplicó a una columna Source Q30 equilibrada en tampón A (10 ml/min). La columna se lavó con tampón A y las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M en tampón A (el tampón B es igual que el tampón A que contiene NaCl 1 M). Durante el gradiente, se recogieron fracciones de 5 ml.

Concentración de proteína. Las fracciones con la actividad degradadora de OTA obtenidas por cromatografía de intercambio aniónico se concentraron usando concentradores Amicon Centriprep™ con membrana de celulosa regenerada (cortemolecular 10 kDa).

Determinación óptima del Ph. Se combinaron cinco microlitros de solución de enzima con 245 μl de OTA a 1 μg/ml diluidos en diferentes tampones: tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 4, 4,5, 5 y 5,5); Tampón MES-NaOH 50 mM (pH 6, 6,5 y 7); Tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5, 8 y 8,5). Las reacciones se realizaron a 37ºC durante 30 min y se detuvieron mediante calentamiento a 95ºC durante 5min.

Temperatura óptima. Se mezclaron cinco microlitros de solución de enzima con 245 μl de OTA a 1 ng/ml a pH óptimo y se incubaron a 20, 30, 40, 60, 70ºC durante 30 min. Las reacciones se detuvieron calentando a 95ºC durante 5 min.

Estabilidad de la temperatura. La solución de enzima se incubó a diferentes temperaturas (30, 40, 60, 70, 80 y 90ºC) durante h y se mezclaron 5 μΙ con 245μΙ de OTA a 1 μg/mL para la reacción de degradación de la ocratoxina en condiciones óptimas. Las reacciones se detuvieron calentando a 95ºC durante 5min. El control no fueincubado.

SDS-PAGE. Para separar y analizar las proteínas se usó electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Se mezclaron muestras de 40 microlitros con 10 μl de tampón de carga 5x (que contenía DDT y SDS), y se hirvieron durante 5 minutos. Se cargaron 20 μl en un gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, EE.UU.). La electroforesis se realizó según el procedimiento del fabricante. El gel setiñó con azul brillante de Coomassie.

Espectrometría de masas. La proteína de interés se cortó del gel (como anteriormente) usando un bisturí y se transfirió a un tubo Eppendorf. La proteína se digirió con una enzima (principalmente tripsina). Después de la digestión, los péptidos se extrajeron y analizaron mediante HPLC-MS/MS. Los espectros de MS/MS se buscaron automáticamente en bases de datos de proteínas con el fin de identificarlos y caracterizarlos.

Ensayos de inhibición para formamidasa y amidasa 2. Se disolvió una tableta de cóctel de inhibidor de proteasa (PIC) (Roche Applied Science, Mannhein, Alemania) en 1,5 ml de agua milliQ para obtener una solución madre 7x. Para el ensayo de inhibición de formamidasa, en lugar de 100 μl de agua miliQ normalmente empleada, se mezclaron 20 μl de solución madre 7x PIC y 80 μl de agua milliQ con otros componentes enumerados en la sección de ensayo de actividad de formamidasa. Para la actividad de degradación de OTA, se mezclaron 35 μl de solución

7x PIC con 210 μl de OTA a 1 μg/ml y 5 μl de solución de enzima. Se preparó una solución madre de EDTA 125 mM y se mezclaron volúmenes apropiados para obtener una concentración final de 10 mM y 50 mM con OTA a 1 μg/L y 5 μl de enzima. Para los controles, la solución de inhibidor se reemplaza por agua miliQ para el ensayo de la actividad de formamidasa o por el tampón MES-NaOH, pH7, para la actividad de degradación de OTA.

5 Resultados

Ejemplo 1. Selección según la actividad conOTA

Se investigaron 30 enzimas que incluyen diversas lipasas, proteasas y amidasas por su capacidad para degradar la ocratoxina A (Tabla 1). Solo la carboxipeptidasa A y la lipasa de A. niger (Amano™ A) pudieron descomponer la OTA como se mencionó anteriormente (Pitout, 1969; Stander et al., 2000). Además, la proteasa de ácido aspártico 10 pepAd2 (Danisco) de A. niger mostró una actividad de conversión de OTA aunque esto fue menos eficiente. Para facilitar la comparación de estas tres enzimas, se determinó la concentración de proteína de PEPAd y se prepararon soluciones enzimáticas de carboxipeptidasa A y lipasa A de Amano™ a la misma concentración (1 mg/ml). Se realizó una evaluación cinética de la degradación (Figura 1). La Figura 1 muestra que la cinética de degradación de OTA de la lipasa A de Amano™ y la carboxipeptidasa A fueron similares. Después de 7 h de reacción a 37ºC, no se 15 observó ningún pico de OTA, lo que significa que se obtuvo una conversión completa de OTA. Para PEPAd, no se alcanzó la conversión completa incluso después del 1 día de reacción. El producto de la lipasa A de Amano™ era una mezcla de diferentes enzimas cuya actividad dominante era la lipasa. Además de PEPAd, otras proteasas de ácido aspártico de A. niger de PEPAa, PEPAb y PEPAc (Wang, 2010), elastasa porcina y carboxipeptiasa Y de levadura, todas mostraron cierta actividad con OTA. Esta es la primera vez que las proteasas aspárticas distintas de

20 la metaloproteasa (es decir, carboxipeptidasa A, una proteasa dependiente de Zn2+), la serina proteasa elastasa y la carboxipeptidasa Y han demostrado que pueden degradar la OTA. Otras proteasas, lipasas y amidasas enumeradas en la Tabla 1 no fueron capaces de degradar la OTA (datos no mostrados).

Tabla 1. Enzimas cribadas para la degradación de la ocratoxina A 5

Enzima

Organismo Ref pH Fabricante

Carboxipeptidasa A

Páncreas bovino C9268 7,5 Sigma

Carboxipeptidasa Y

Levadura 12758 7 USB

Carboxipeptidasa Y

Levadura C3888 7 Sigma

Quimotripsina Christian

8 Chymostar Hansen

Elastasa

Prancreas porcino E0258 8,5 Sigma

Endoproteinasa Glu-C

S. Aureus 791156 7,5 Roche Diagnostics

LG12

Bacillus subtilis 7,5 Danisco

Lipasa A Amano™

Aspergillus niger 534781 7,5 Amano™

PROACT Nº 3617

Nocardiopsis prasina 7,5/4 Novozymes

Prolina peptidasa proC

7

Proteasa termolisina

Bacillus thermoproteolyticus rokko P1512 8 Sigma

Proteinase K

Tritirachium album p0390 8 Sigma

Proteasa P3000

Bacillus subtilis 7,5

Tripsina

Páncreas bovino 109819 8 Roche Diagnostic

Fosfolipasa KLM1

7 Danisco

Lipasa 3

5,5 Danisco

Lipasa

Rhizopus arrhizus 62305 8,5 Sigma

Lipasa

Candida cylindracea 62316 6,5 Sigma

Lipasa

Rhizopus niveus 62310 7,5 Sigma

GAP3

Aspergillus Niger 6 Danisco

PEPAa

Aspergillus Niger 6 Danisco

PEPAb

Aspergillus Niger 6 Danisco

Enzima

Organismo Ref pH Fabricante

PEPAc

Aspergillus Niger 6 Danisco

PEPAd1 (eliminación de Cterminal)

Aspergillus Niger 6 Danisco

PEPAd2 (longitud completa)

Aspergillus Niger 6 Danisco

Grindamyl

Aspergillus Niger 7,5 Danisco

Amidasa

Pseudomonas aeruginosa A6691 7 Sigma

Péptido Amidasa

Citrus sinensis 17232 7 Fluka

Amidasa

PLY511 7 Profors

Penicilina amidasa

E. coli 76429 7 Sigma

Ejemplo 2. Purificación de la actividad degradadora de ocratoxina A a partir de un líquido de fermentación de A. niger o caldo filtrado (libre de células).

En primer lugar, se empleó precipitación con sulfato de amonio. Se aplicaron varias concentraciones de sulfato de amonio a un extracto de proteína bruta de A. niger. La actividad de degradación de OTA se determinó tanto en el sobrenadante como en el sedimento. Al aumentar la concentración de sulfato de amonio, la actividad de degradación de OTA se transfirió del sobrenadante al sedimento. Con 60% de sulfato de amonio, toda la actividad de degradación se encontró en el sedimento. Esto demostró que la enzima era capaz de hidrolizar los precipitados de micotoxinas de 40% a 60% de sulfato de amonio. A la misma concentración de sal (60%), una ligera actividad de lipasa permaneció en el sedimento (datos no mostrados).

La fracción de sulfato de amonio del 40% al 60% se empleó como material de partida para la posterior purificación de la enzima que degrada la ocratoxina. La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) seguida de la cromatografía de intercambio aniónico (AEX) como se describió anteriormente se usó para separar la actividad de la lipasa de la actividad de degradación de OTA. La fracción activa se suspendió en 50 mM de tricina-HCl (pH 7,0) que contenía (NH4)2SO4 1 M (Tampón A).

La Figura 2A muestra el porcentaje del área de OT-alfa obtenida después de 1 hora de reacción de las fracciones obtenidas de Fenil Sepharose con OTA. Esta figura muestra un aumento en la actividad de degradación de OTA de la fracción no. 51 a no. 64, mientras que la actividad más alta de lipasa/esterasa se encontró en la fracción no. 65

68. Esta observación indica que la actividad degradadora de ocratoxina aparentemente no tenía nada que ver con la actividad de lipasa/esterasa en el producto de lipasa de Amana™ (previamente se ha indicado que la actividad degradadora de OTA se debía a actividad de lipasa, Stander et al., 2000). La proteína que degrada OTA se eluyó entre 90% y 100% de tampón B (50 mM de tricina-HCl (pH 7,0), lo que indica que el medio de cromatografía defenil-Sepharose aparentemente funcionaba como un medio de afinidad. La OTA también contiene un grupo fenilo y la enzima de degradación de OTA debe ser capaz de unirse al grupo fenilo de la OTA o al medio de separación utilizado en este documento. Con respecto a la actividad lipasa/esterasa, que estaba presente en todas las fracciones obtenidas de esta etapa, se eluyó a 100% de tampón B. Esto no es inesperado porque las lipasas/esterasas realizan la hidrólisis de lípidos y triglicéridos, que son sustratosmuy hidrófobos y que, por tanto, se unen fuertemente conmatrices hidrofóbicas comola fenil-Sepharose.

La Figura 2B muestra el porcentaje del área OT-alfa obtenida después de 30 minutos de reacción de las fracciones AEX con OTA. La actividad máxima de OTA se encontró en la fracción no. 26. Sin embargo, también fue en estas fracciones que la actividad relativa de la lipasa fue la más alta. Esto indica que el paso AEX no fue capaz de separar la lipasa/esterasa de la actividad de degradación de OTA, esto fue utilizado por investigadores anteriores como el único paso de cromatografía en su intento de purificar la actividad de degradación de OTA (Abrunhosa et al., 2007).

En resumen, las figuras 2A y 2B indican que la lipasa/esterasa no es la enzima responsable de la degradación de la OTA (figura 2A) como se ha supuesto anteriormente (Stander et al. (2000) y la separación de la actividad lipasa/esterasa de la actividad de degradación de OTA no fue alcanzada por AEX, que fue practicada por investigadores anteriores en un esfuerzo por purificar la enzima que degrada la OTA de la lipasa de Amano™ (Abrunhosa et al., 2007). Los investigadores anteriores no mostraron que el medio de cromatografía de Fenil Sepharose, normalmente considerado como un medio de cromatografía de interacción hidrófoba que separa las proteínas en función de su diferencia en hidrofobicidad, podría usarse en este caso como un medio de separación de afinidad para la actividad de degradación de OTA.

Después de la purificación por fraccionamiento con sulfato de amonio seguida de cromatografía de HCl/afinidad en Fenil Sepharose y AEX, las fracciones que contenían la actividad de degradación de OTA todavía tenían alguna actividad de lipasa/esterasa. La Figura 4 muestra los resultados del análisis de las fracciones activas en OTA obtenidas en el procedimiento de purificación de AEX de la Figura 2B mediante SDS-PAGE. Se puede ver que en el

gel hay dos bandas principales: A y B. La secuenciación parcial de esas bandas por espectrometría de masas seguida de la búsqueda de homología en la base de datos de proteínas sugiere que la banda A comprende al menos 3 proteínas correspondientes respectivamente a:

1 -Acetamidasa/formamidasa pronosticada de Aspergillus oryzae 45,012 Da (27% de cobertura)

2-Formamidasa de Aspergillus fumigatus 45,277 Da (cobertura del 24%)

3-Formamidasa de Aspergillus nidulans 44,907Da (cobertura del 20%)

Y esa Banda B comprende al menos 3 proteínas correspondientes a:

1 -Glioxilato/hidroxipiruvato reductasa de Aspergillus oryzae 39,603Da (34% de cobertura)

2-Acetilesterasa de Aspergillus awamori 32,640 Da (9% de cobertura)

3-Precursor de endo-1,4-beta-xilanasa A de Aspergillus niger 35,486 Da (17% de cobertura).

A partir de los resultados indicados en la Figura 4, parece probable que la enzima que descompone OTA fuera la formamidasa de A. niger. Las otras enzimas identificadas en teoría no tienen nada que ver con la degradación de OTA. Se llevó a cabo una purificación adicional de la formamidasa de A niger.

Ejemplo 3. Mejora de la purificación de la enzima degradadora de la ocratoxina A

No se logró una mejora adicional para la purificación por HIC y AEX mediante el uso de diferentes tampones intermedios y diferentes programas de gradiente. La purificación usando fenil Sepharose puede considerarse como una etapa de afinidad debido a que la molécula OTA tiene el grupo fenilo, sin embargo, las impurezas tienen alta hidrofobicidad y se unen fuertemente al medio fenil Sepharose y, por lo tanto, se eluyen muy tarde (Figura 4A). Cuando se emplearon octil-y butil-Sepharose, se encontró la fracción de actividad degradadora de OTA en las fracciones de flujo no adsorbidas. Esto indica que tiene baja hidrofobicidad y que su unión fuerte a Fenil Sepharose es de afinidad en la naturaleza (Figura 4A) mientras que las impurezas que tienen alta hidrofobicidad se unen fuertemente y se eluyen más tarde (Figura 4B) como en el caso con Fenil Sepharose.

El procedimiento se mejoró aún más utilizando fraccionamiento con sulfato de amonio (AS), HIC/afinidad en fenil-Sepharose (HIC1), HIC en butil-Sepharose (HIC2) y AEX, la fracción activa se concentró y desaló con un tamiz molecular con corte de 10kDa. Las fracciones 5 y 6 concentradas y desaladas que se muestran en la Figura 4 se analizaron en SDS-PAGE (Figura 5). Las bandas de proteína se aislaron del gel y se digirieron con tripsina. La digestión se separó en RP-HPLC y se analizó mediante MS para identificar laidentidad delas bandas de proteína.

Los resultados de MS indican que después de 4 pasos de purificación, la actividad de degradación de OTA no se limitó a una sola banda, sino que se identificaron las siguientes enzimas (orden de intensidad): Formamidasa (51% de cobertura de secuencia), producto de degradación de formamidasa (causada por proteasa) (30%), secuencia proteínica de A. niger no registrada (An14g02080, XP_001400834) que tiene similitud con la amidasa bacteriana (25%), glutamiltranspeptidasa (17%) y aldosa 1-epimerasa (14%). A partir de estos resultados, se consideró que la enzima identificada que más probablemente descompone OTA es la formamidasa de Aspergillus niger, según lo indican los resultados de las Figuras 3 y 5, seguida de una secuencia proteínica de A. niger no registrada que tiene similitud con la amidasa bacteriana y glutamiltranspeptidasa, todas las tres con actividades hacia el enlace C-N, que existe en lamolécula de OTA.

Ejemplo 4. Caracterización de las enzimasidentificadas quepueden tener el potencial de desintegrar OTA.

En base a los resultados de las Figuras 3, 4, 5 y 6, se realizaron más estudios sobre las dos supuestas enzimas de Aspergillus formamidasa y glutamiltranspeptidasa, y la proteína hipotética An14g02080 (XP_001400834).

La formamidasa putativa de Aspergillus no se ha caracterizado previamente con respecto a sus propiedades bioquímicas, incluida la especificidad del sustrato, aunque se ha clonado de A. nidulans y se expresa como se indica indirectamente por la actividad de la actividad de beta-galactosidasa (Fraser et al., 2001). Se sabe que la formamidasa está involucrada en el metabolismo del glioxilato y el dicarboxilato y también en el metabolismo del nitrógeno. Convierte la formamida en presencia de agua en ácido fórmico (formiato) y amonio (formamida + H2O → formiato + NH3). La presencia de actividad de formamidasa se ensayó usando el kit de ácido fórmico Megazyme como seindica en la sección Materiales y Métodos anterior.

Cuando este ensayo se llevó a cabo con fracciones obtenidas en el paso AEX, se observó formamidasa en fracciones de 25 a 30 (Figura 6A). Esta fuela primera indicación de que los hongos y las preparaciones fúngicas que incluyen el producto de lipasa de Amano™ preparado a partir de A. niger tenían una formamidasa activa que descompone la formamida en ácido fórmico y amonio. Igualmente importante, la actividad formamidasa se purificó usando los pasos de purificación diseñados para purificar la actividad de OTA, lo que sugiere que la formamidasa fúngica descompone la OTA. Cuando las mismas fracciones ensayadas para determinar la actividad formamidasa se analizaron para la degradación de OTA, la conversión aumentó de la fracción 26 a 32 (figura 6B). Como se puede

ver en la Figura 6A y la Figura 6B, las dos actividades estuvieron presentes en las mismas fracciones. A partir de los datos, se formuló la hipótesis de que la formamidasa de A. niger o la formamidasa de Aspergillus que no se había caracterizado anteriormente tenían actividades de degradación deOTA.

Ejemplo 5. Análisis de la actividad de degradación de formamidasa y OTA en transformantes de A. niger que albergan el gen dela formamidasa de A. nidulans

Los transformantes de formamidasa de A. niger se analizaron para determinar la actividad de formamidasa y la actividad de degradación de OTA. Como puede verse a partir de la Tabla 2, se detectó actividad de formamidasa en 12 de 15 transformantes. Sorprendentemente, la formamidasa de A. niger aparentemente no fue capaz de descomponer la OTA como puede verse en los transformantes que tenían una alta actividad de formamidasa pero baja o nula actividad degradadora de OTA. Esto indica que la formamidasa fúngica puede no tener actividad de degradación deOTA, pero se copurificó conla actividad deOTA a través de los 4 pasos de purificación.

Es destacable que al integrar el ADN ajeno como en el caso del gen de la formamidasa de A. nidulans en el genoma de A. niger, los inventores tuvieron éxito mediante un mecanismo desconocido en la creación de transformantes que tienen actividades de degradación de OTA mayores en comparación con la cepa original utilizada para la transformación. Por ejemplo, véanse los transformantes Nº 7, 2, 8, 11 y 15. Téngase en cuenta que el Nº 16 era de tipo salvaje (cepa progenitora). El control fue la reacción sin la adición de caldo. El caldo de fermentación se usó para todos estos ensayos. La mezcla de reacción contenía 10 μl de caldo, 50 μl de OTA (1 μg/ml), 100 μl de fosfato sódico (67 mM, pH 7 o pH 9). Para el control, se reemplazaron 10μΙ del caldo del cultivo de 5 días en una fermentación con matraz agitado con 10 μΙ de agua. Al final de la reacción, se añadieron 160 μl de acetonitrilo para detener la reacción, y sefiltraron y se inyectaron 10 μl para el análisis por HPLC.

Basado en el sorprendente descubrimiento de que la formamidasa de Aspergilli no era capaz de degradar la OTA, los inventores emprendieron investigaciones adicionales para identificar si un segundo candidato para la degradación de OTA, es decir, la hipotética proteína de A. niger (An14g02080, XP_001400834) designada amidasa 2 tenía actividad degradante con OTA.

Ejemplo 6. Construcción de un plásmido de expresión del gen putativo de amidasa 2

El gen putativo de amidasa 2 de Aspergillus niger codifica la proteína amidasa de 480 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). Para construir el plásmido de expresión recombinante para el gen de amidasa 2 de A. niger, se usaron dos cebadores GGAGATCTATCATGGTCCGCCGAATTG y AATCTAGACTAGTGATGGTGATGGTGATGCAGAAAAGGATTACGTG en una reacción de PCR Pfu Ultra II con una plantilla de ADN genómico obtenida de la cepa UVK143 de A. niger (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 39: 738 -743, 1993). La reacción de PCR se realizó durante 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto con los dos cebadores. La extensión final a 72ºC se realizó durante 5 minutos y la reacción se enfrió a 4ºC. La secuencia de nucleótidos dela región de codificación del amplicón de PCR resultante, sin el marcador His, se muestra como SEQ ID NO: 2. El fragmento de PCR se purificó con una columna de centrifugación Qiagen. Se digirió con la enzima de restricción BgllI y Xbal y se clonó en el vector de plásmido pGAPT (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º 6.426.410) que se había digerido con BgllI y Xbal. El plásmido resultante, pGAPT-amidasa 2 (mostrado en la Figura 7) se confirmó mediante secuenciación de ADN que tenía un gen recombinante que comprendía la amidasa 2 de A. niger insertada entre el promotor de glucoamilasa de A. niger y un terminador de glucoamilasa de A. tubingensis. La secuencia de proteína codificada correspondiente se muestra en SEQ ID No. 4 que es idéntica a SEQ ID No. 1, excepto que se añadieron seis residuos de histidina en el extremo C-terminal de la proteína para ayudar a la purificación de la proteína.

Ejemplo 7. Construcción de una cepa de producción de amidasa 2 recombinante

La cepa AP4 de A. niger (Berka et al, Gene 86: 153-162, 1990) se transformó con el plásmido pGAPT-amidasa 2 usando un protocolo de transformación de fusión de protoplastos mediado por PEG. El protocolo de transformación utilizó una modificación del método de Campbell (véase, Campbell et al., Curr. Genet. 16: 53-56 (1989)) con Lysing Enzyme de Trichoderma harzianum (Sigma, L1412). Se obtuvieron más de cien transformantes y se seleccionaron treinta transformantes en placa de MM. La cepa progenitora AP4 de control y quince transformantes se eligieron para hacer crecer primero en placas CMA y los tapones de agar de micelio que contenían tanto micelio como esporas de placas CMA se transfirieron a los matraces agitados que contenían 30 ml de medio de cultivo. Los transformantes se cultivaron durante 6 días a 28ºC. Los gránulos de micelio de la cepa de control AP4 y los quince transformantes se lavaron con agua al menos dos veces. Los sedimentos de micelio se suspendieron en CelLytic Y Cell Lysis Reagent (Sigma, C4482). Las proteínas intracelulares se extrajeron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las suspensiones se centrifugaron y se analizaron 15 μl de los sobrenadantes que contenían proteínas intracelulares extraídas usando geles de SDS-PAGE (Figura 8). Los caldos de cultivo se centrifugaron en una microcentrífuga durante 10 minutos y se analizaron 15 μl del sobrenadante (proteínas extracelulares) usando geles de SDS-PAGE (Figura 8).

Tabla 2. Análisis de la actividad de degradación de formamidasa yOTA en transformantes de A. niger que albergan el gen de la formamidasa de A. nidulans

Transformante de A. niger No. # que alberga el gen de A. nidulans

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Wt Control

Área de pico OTA, a pH9, 19h, 37°C

30 7 23 13 27 20 0 7 10 115 7 37 70 108 8,2 36 168

Área de pico OTA, a pH7, 19h a 37°C

* - - - - - - - - 102 - 0 145 138 0 20 128

Área de pico OTA, a pH9, 45°C 4h

- - 70 55 - - 93 - - 105 52 86 129 116 - 117 116

Área de pico OTA de OTA, a pH7, 45°C 4h

- - 17 17 - - 4,3 - - 104 16 14 118 122 - 76 126

Actividad de formamidasa a pH7 a 37°C

216 23 0 0 325 160 195 104 129 108 4 431 232 0 171 0 0

* no analizado

27 5

La Tabla 3 muestra el medio usado (por litro) para cultivar Aspergillus niger y sus transformantes en matraces siliconados de 250 ml con 30 ml de medio. Las cepas de A. niger se hicieron crecer primero en placas de CMA durante 3-5 días y se transfirieron al matraz 2 cm2 más y se cultivaron a 30ºC durante 5 días. Para el tipo salvaje (cepa de control o cepa parental 620), se suplementaron 0,5mg/ml de uridina.

Sólidos de siembra de maíz

50 g

NaH2PO4·H2O

1 g

MgSO4.7H2O

1,0238173 g

Jarabe de maíz al 50% (p/v) Staley 7350

100 ml

Citrato de Sodio, Dihidrato (Na3C6H5O7·2H2O)

8 g

pH a 5,8 – 6,0

Se rellena el volumen con H2O milliQ.

La cepa se puede cultivar en una placa CMA (por litro):

Dextrosa (Glucosa)

20 g

Extracto de malta BD Bacto

20 g

Peptona BD Bacto

1 g

Agar BD Bacto

20 g

Autoclave y placas pobres

Figura 8. Análisis SDS-PAGE de proteínas intracelulares de A. niger que albergaban el gen de amidasa 2. La banda de proteína de amidasa 2 se indicó mediante una barra de flecha. M. marcadores moleculares, AP4, la cepa progenitora de A. niger. Los transformantes se numeraron del 1 al 15.

La Figura 9 muestra SDS-PAGE de proteínas extracelulares de A. niger que albergaban el gen de Amidasa 2. La banda de proteína de amidasa 2 está indicada por una barra de flecha. Las otras bandas principales por encima de la banda de amidasa 2 fueron α-amilasa y glucoamilasa secretadas por A. niger. Las muestras preparadas para los geles fueron los caldos defermentación de los diferentes transformantes.

Para confirmar que la banda de la amidasa 2 supuesta separada en SDS-PAGE era de hecho el producto del gen de la amidasa, la banda se cortó y se digirió con tripsina mediante digestión en gel. Las digestiones se separaron mediante RP-HPLC y se analizaron mediante espectrometría de masas. Esto reveló 4 secuencias de aminoácidos que se encuentran en la secuencia putativa de amidasa 2 (SEQ ID NO: 1) (Figura 18A). Las cuatro secuencias identificadas fueron:

1.

EALQNGY;

2.

ALPAGEVLGSY;

3.

GAGPL;

4.

SVGPQAPL.

Ejemplo 8. Caracterización de la amidasa recombinante 2 con respecto a su degradación de OTA y parámetros catalíticos bioquímicos

Como se muestra en la Figura 10, tanto las fracciones intracelulares como las extracelulares (caldo) de los 15 transformantes de A niger que albergaban el gen codificante de proteína putativo (amidasa 2) más la cepa progenitora (wt) se analizaron en cuanto a su capacidad de degradar OTA. La Figura 10muestra sorprendentemente que la proteína hipotética que codifica el gen de A. niger de Genbank (An14g02080, Acc No. XP_001400834) codifica una enzima activa que tiene actividad degradadora de OTA y esta enzima activa se encontró tanto intracelular como extracelularmente. Se puede ver que los mejores transformantes son los transformantes 3, 4, 7, 11, 13 y 14 ya que no quedó OTA detectable (es decir, por debajo del nivel detectable de 2 pbb) después de la incubación con las fracciones intracelulares o extracelulares (el caldo). En comparación con la cepa parental (wt) A niger, los transformantes 8, 10 y 15 tambiéntenían una actividad degradadora deOTA mucho mayor.

La amidasa 2 recombinante era activa al menos entre pH 3 y 9 en la degradación de OTA. La Figura 11 muestra que la actividad dela enzimafue lamás alta a pH 7,0 seguida depH 6 y 8; pH 5 y 9.

La amidasa recombinante 2 era aparentemente termoestable como se ve en la Figura 12 ya que más del 80% de la actividad permaneció después de 5-30 min de preincubación a 80ºC en comparación con el control donde no se añadió enzima. La mezcla de reacción de 5 μΙ de enzima más 45 μΙ de fosfato sódico 67 mM (pH 7,0) se incubó a 80ºC durante 0-30 min antes de agregar otros 50 μΙ el tampón fosfato y 25 μΙ de OTA a 1 μg/ml, y se incubó a 30ºC durante 60 min. La reacción se detuvo mediante la adición de 130 μl de acetonitrilo que contenía un 0,2% de ácido acético (v/v). La mezcla de reacción se filtró y se inyectó (10 μl) para el análisis de HPLC. Ctrl fue el control donde no se agregó amidasa.

Además, la amidasa 2 recombinante era bastante estable a 70ºC entre pH 6 y 9. La estabilidad disminuyó con la disminución del pH (Figura 13). La actividad se ensayó a pH 7,0 y 30ºC. La mezcla de preincubación contenía 5 μΙ de mezcla de amidasa 2 (155 μg de proteína/ml), 45 μΙ de tampón de fosfato 67 mM (pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9). Las muestras se preincubaron a 70ºC durante 30 min. Después de enfriar a 30ºC, se añadieron 2 μl de OTA a 0,5 mg/ml en etanol y 80 μl de Mops-NaOH 0,2 M (pH 7,0) y la reacción se incubó a 30ºC durante 60 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 130 μl de acetonitrilo que contenía HAC al 0,2%, se filtró y se inyectó en RP-HPLC con una inyección de 5 μΙ para controlar la OTA restante.

Ejemplo 9. Purificación de la amidasa 2 mat recombinante a partir del caldo de fermentación de A. niger que alberga el gen de la amidasa 2

El caldo del transformante 13 que tenía alta actividad de OTA (Figura 10) se usó para purificar la amidasa 2 mat recombinante mediante fraccionamiento con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad sobre Fenil Sepharose, HIC sobre Butil Sepharose y AEX como se describe a continuación.

1) Fraccionamiento con (NH4)2SO4. A 40 ml del caldo de A. niger que alberga el gen de amidasa 2 de A. niger se añadió (NH4)2SO4 a 40% de saturación mediante agitación. Después de una centrifugación de 10 min a 3500 rpm, se recogió el sobrenadante y se saturó con (NH4)2SO4 anhidro al 60% mediante agitación y la solución se centrifugó de nuevo. El sedimento correspondiente al precipitado entre 40 y 60% de saturación de (NH4)2SO4 se disolvió en 40 ml de tricina-HCl 50 mM (pH 7,0) que contenía 1M de (NH4)2SO4 y se filtró con filtro de 0,22 μm.

2) Interacción hidrofóbica/cromatografía de afinidad Lamuestra filtrada de la etapa anterior se cargó en una columna de Fenil Sepharose FF (2,6x10 cm). Tras un lavado con tricina-HCl (pH 7,0) que contenía (NH4)2SO4 1 M, las fracciones activas se eluyeron en 10 ml por tubo a un caudal de 10 ml/min con un gradiente lineal de Tricina-HCl 50 mM (pH 7,0) de 1 M a 0 M de (NH4)2SO4. La purificación selogró en el sistema purificador Akta.

3) Cromatografía de intercambio aniónico. Las fracciones activas se reunieron y desalaron en una columna PD10 equilibrada en Tris/HCl 20 mM, pH 7,5 (tampón A). La muestra desalinizada se aplicó a una columna Source Q15 equilibrada en tampón A (10 ml/min). La columna se lavó con tampón A y las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M en tampón A. Durante la elución en gradiente, se recogieron fracciones de 5 ml. Las fracciones activas se analizaron en SDS-PAGE (Figura 14A), lo que indica que la amidasa 2 mat se purificó básicamente por homogeneidad. La actividad se relacionó con una banda de proteína que tiene una masa molecular justo por debajo de 49 kDa en la SDS-PAGE (Figura 14). La espectrometría de masas por medición de Maldi-tof indica que esta banda de proteína puede tener una masa de 47214 Da (± 2%) (Figura 14B). La secuenciación Nterminal de la fracción 12 indica que el N-terminal de la Amidasa 2 mat comenzó en STDEAKVTI (SEQ ID NO. 33). Se estima que la longitud total de la amidasa 2 de 480aa con 6 residuos de histidina tiene una masa molecular de

51.983 Da, mientras que la amidasa 2 truncada de 42aa N-terminal con 6 residuos de histidina en su terminal C se supone que tiene una masa de 47.338 Da. Estos indican que la amidasa 2 secretada en el caldo de A. niger, es decir, la amidasa 2 mat es la amidasa 2 que ha sido procesada por una peptidasa señal u otra peptidasa en el caldo de cultivo que se escinde entre el enlace peptídico de Ala-Ser en la Amidasa 2 sig.

Ejemplo 10. Especificidad del sustrato dela amidasa 2

Determinación de Km/Vm:

Utilizando las fracciones obtenidas en el paso AEX de la amidasa 2 mat, las constantes cinéticas de Km y Vm de la enzima que degrada la OTA fueron de 0,29 μM/min y 13 μΜ, respectivamente, utilizando el método de cálculo de Lineweaver-Burk.

Degradación de ocratoxina B:

La solución enzimática de la Amidasa 2 mat obtenida después de AEX se ensayó con la ocratoxina B a la misma concentración en condiciones óptimas durante una hora. La tasa de degradación con la ocratoxina B fue del 8% en comparación conla OTA.

Ejemplo 11. La actividad dela amidasa 2mat pura en la descomposición deOTA

La actividad degradante de la ocratoxina A (OTA) de la amidasa 2 mat purificada del caldo de fermentación de A. niger que albergaba el gen de la amidasa 2 en función de su concentración semuestra en la Figura 15. Puede verse en la Figura 15 que la degradación de OTA fue dependiente de la concentración de amidasa 2 mat. También se

puede ver que después de 30 minutos con una concentración de amidasa 2 mat de 160 ng/ml, la OTA disminuyó en un 83%. A partir de la región lineal de la Figura 15, la actividad específica calculada para la amidasa 2 mat fue de 900 nanomoles deOTA hidrolizada por minuto por mg deproteína a pH 7,0 y 40ºC a una concentración deOTA de 1 μg/ml de mezcla de reacción. La reacción para la Figura 15 se realizó en 0,1 Mops-NaOH (pH 7.0) y 40ºC durante 30 minutos antes de ser detenida añadiendo el mismo volumen de acetonitrilo que contiene ácido acético al 0.2% y se analizó en RP-HPLC en una columna C18 como se describe en la sección Materiales y Métodos.

Ejemplo 12. Diferencias en la sensibilidad respecto al Ca2+ entre la amidasa 2 intracelular y extracelular encontrada en A. niger.

Se observó que la amidasa 2 (es decir, la amidasa 2 mat) purificada a partir del producto de lipasa de Amano™ o del caldo de A. niger transgénico que albergaba el gen de amidasa 2 se inhibieron ambas en alrededor del 40% de su actividad en la hidrólisis de OTA en CaCl2 8 mM (Figura 16), mientras que la fracción intracelular de la amidasa 2 (amidasa 2 sig) de A. niger transgénico no se inhibió apreciablemente por CaCl2 a CaCl2 8 mM (Figura 17). Estos resultados indican que la pérdida del N-terminal de amidasa 2 dio como resultado una sensibilidad a la inhibición de Ca2+. La inhibición por Ca2+ se superó mediante la adición de quelantes divalentes que incluyen EDTA en una base molar igual. También se sabe que la actividad de degradación de OTA en el producto de lipasa de Amano™ es sensible al EDTA. Este ejemplo indica que el uso de la amidasa 2 mat en sistemas que contienen iones divalentes puede ser ayudado mediante la adición de un quelante tal como EDTA. El ácido cítrico y otros ácidos orgánicos como el ácido propiónico se usan ampliamente como aditivos para producto alimenticios y pueden quelar el ion divalente o los iones trivalentes, aliviando su inhibición de la amidasa 2 mat. Por otro lado, el EDTA adicional también inhibió la amidasa 2 mat recombinante (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la amidasa 2 mat puede usarse para la desintoxicación de OTA pero tiene ciertas limitaciones debido a su sensibilidad a iones metálicos divalentes o trivalentes y a quelantes como EDTA, mientras que se descubrió que la amidasa 2 sig es mucho menos sensible a iones de metal divalentes o trivalentes y quelantes como EDTA (ver a continuación) lo que indica la importancia de la longitud total de la amidasa 2 en lugar de la amidasa 2 secretada o procesada o madura (es decir, la amidasa 2 mat) que se encuentra en el caldo deA. niger.

Ejemplo 13. Degradación de OTA por la amidasa 2 extraída de la fracción intracelular (Amidase 2 sig) de A. niger.

Este ejemplo muestra la ventaja de usar la forma menos sensible de amidasa 2, es decir, la amidasa 2 sig. Como puede verse a partir de la Figura 17, CaCl2 20 mM o EDTA 20 mM no inhibieron a la amidasa 2 sig en comparación con la amidasa 2 mat (Figura 16). Esto proporciona una clara ventaja para usar la amidasa 2 sig en aditivos que comprenden un quelante en la degradación de OTA. La reacción contenía 60 μΙ de mops-NaOH (0,2 M, pH 7,0), 20 mM de CaCl2, 20 mM de EDTA, amidasa 2 sig (0,46 μg de proteína) extraída de la célula de A. niger que alberga el gen de la amidasa, 2 μΙ de 25 μg/ml de OTA y agua para un volumen final de 120 μΙ. La reacción se realizó a 37ºC durante 30 min y se detuvo añadiendo 150 μl de acetonitrilo que contenía un 0,2% de ácido acético. La OTA y su producto OT-alfa (= OTa) se analizaron en RP-HPLC en una columna C18 con una inyección de 5 μΙ. El control positivo (PC) no contenía más aditivos que el tampón, la amidasa y OTA. El control blanco contenía solo tampón y OTA.

Ejemplo 14. Degradación de OTA en harina de maíz y DDGS (granos de destiladores desecados con solubles) por la amidasa 2 sig extraída de lafracción intracelular (Amidasa2 sig) de A. niger.

El maíz es el principal transportador deOTA y puede ser transferido y concentrado en los DDGS en la producción de bioetanol. El maíz y los DDGS son ampliamente utilizados como ingredientes de productos alimenticios. El nivel de micotoxinas en los DDGS es el factor habitual quelimita la cantidad de DDGS que se puede agregar al alimento. Los ejemplos en este documento indicanla capacidad dela amidasa 2 sig en degradar OTA en harina demaíz y DDGS:

Para harina de maíz, se añadieron 50 mg de harina de maíz a 210 μΙ de agua, 8 μΙ de OTA (25 μg/ml) y 20 μΙ de amidasa 2 sig (3,1 μg de proteína) mezclado e incubado a 37ºC durante 22 h. La concentración de OTA disminuyó de 800 ppb al inicio a 14 ppb al final. El análisis de OTA por HPLC se describe en la sección de materiales y métodos anterior.

Para los DDGS, se suspendió 1 g en 10 ml de agua, se ajustó el pH a 6,7 con NaOH. A 210 μl de esta suspensión se añadieron 8 μΙ de OTA (25 μg/mi) y 20 μΙ de amidasa 2 sig (3,1 μg de proteína), se mezclaron y se incubaron a 37ºC durante 22 h. La concentración de OTA disminuyó de 800 ppb al inicio a 5 ppb al final. El análisis de OTA por HPLC se describió en la sección de Materiales y Métodos anterior.

Ejemplo 15. Degradación de OTA en leche por amidasa 2mat

Se sabe que muchos productos alimenticios, incluidos la leche y el queso, pueden estar contaminados con OTA. Este ejemplo prueba la degradación deOTA en leche usando la amidasa 2mat.

Leche desnatada (1,5% de grasa, proteína 3,4 g, carbohidratos 4,7g, Calcio 120 mg, Fósforo 95 mg en 100ml) de Aria Foods Amba (Aarhus, Dinamarca) 0,15 ml, 3 μΙ OTA (2,5 μg/ml), 7,5 μΙ de amidasa 2 mat purificada (del caldo de A. niger que alberga el gen de amidasa 2) que contiene 0,22 μg de proteína se mezclaron y se hicieron

reaccionar a 40ºC durante 2,5 h. La OTA disminuyó de 47 ppb al inicio al nivel indetectable (<2ppb) después de una incubación de 2,5 horas. El análisis deOTA por HPLC se describió en la sección de Materiales y Métodos anterior.

Ejemplo 16. Amidasa 2mat en la desintoxicación de OTA en harina demaíz

La mezcla de reacción en tubos eppendorf de 1,5 ml (C1-3) comprendía 60 mg de flor de maíz, 200 μΙ de Mops-NaOH (0,2 M pH 7,0), 40 μl de mezcla de amidasa 2 (que era una mezcla de un volumen igual del caldo del transformante de A. niger con los genes de amidasa 2 3, 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14 y 15), 20 μΙ de OTA (0,5 mg/ml). El volumen total de los tres componentes fue 260 μΙ; la OTA final fue de 38 μg/ml o 38 ppm (ppm, partes por millón). Control: los tubos de control (C-4-6) fueron los mismos que C1-3, excepto que la preparación de amidasa (el caldo) se reemplazó con agua.

La reacción se llevó a cabo a 30ºC con agitación durante 20 h antes dela adición de un volumen igual de acetonitrilo de 260 μΙ que contenía ácido acético al 0,2% para detener la reacción y extraer la OTA. Después de la centrifugación y el filtrado, el filtrado se analizó en HPLC. Los resultados de HPLC indican que la OTA restante era indetectable (menos de 2 ppb), lo que indica que la amidasa 2 mat pudo reducir la OTA en la harina de maíz de 38 ppm a menos de 2 ppb.

Ejemplo 17. Amidasa 2mat en la desintegración deOTA en un producto alimenticio basado en maíz-soja.

Las pruebas de la amidasa 2 mat con un alimento a base de soja-maíz (cuya composición se da en la Tabla 3) contaminado con OTA fue exactamente como la prueba con harina de maíz, es decir, tubos S1-3 (experimental) con el caldo mientras que para los tubos S 5-6 (controles) el agua reemplazó el caldo. Después de 20 horas de incubación, el nivel de OTA seredujo de 38 ppm a 6,6 ppm, una reducción de 6 veces o 82%.

Tabla 3. La composición dela alimentación basada en maíz/soja utilizada

Ingredientes de dieta de maíz

Porcentaje

Maíz

60,01%

Harina de soja 48

31,52%

Aceite de soja

4,00%

Sal

0,40%

DL Metionina

0,20%

Piedra caliza

1,16%

Fosfato dicalcio

1,46%

VIT/MIN

1,25%

Total

100%

Ejemplo 18. Resolución de la estructura cristalina de Amidasa 2

15 cristales de amidasa 2 se obtuvieron como semuestra en la Tabla 4.

Los cristales AM7 y AM15 se difractaron por rayos X y la estructura de estos dos cristales de amidasa 2 (aa 45-480) se resolvió a una resolución de 2,5 A.

Se demostró que la Amidasa 2 tenía una estructura similar a la estructura de Tim Barrel como se muestra en la Figura 20 y el sitio activo como se muestra en la Figura 21. A continuación se presenta un resumen de los datos para la estructura cristalina resuelta para el conjunto de datos de los cristales AM7.

Conjunto de datos: am7

General

Carcasa interna Carcasa externa

Límite de baja resolución

80,00 80,00 2,64

Límite de alta resolución

2,50 7,91 2,50

Fusión R

0,182 0,044 0,611

Fusión R en el contenedor de intensidad superior

0,057 - -

Número total de observaciones

441395 14486 65195

Número total único

46056 1566 6711

Conjunto de datos: am7

General

Carcasa interna Carcasa externa

Media ((l)/sd(l))

9,4 20,5 3,3

Integridad

96,5 93,3 97,6

Multiplicidad

9,6 9,3 9,7

La estructura se resolvió usando Phaser y analizando un conjunto de 5 estructuras más similares.

Se descubrió que el sitio activo de la amidasa 2 (SEQ ID NO: 1) incluye al menos los siguientes residuos: His111, His113, His191, Lys246, His287, His289, His307, Asp378 y Val 253. Puede acomodar al menos dos iones metálicos para fines de catálisis y/o estructura que forman el llamado centro demetal binuclear.

Las coordenadas para un monómero de la enzima que está en forma de un tetrámero semuestran en la Figura 22.

Tabla 4. Conjuntos de cristales y parámetros relacionados

Conjunto

SG Célula Resol./después escal. Fusión R Compl mol/ASU Placa/ Cond. Crist. Líneas de luz/sincrotrón

AM1

P212121 ? 80 112 173 1,85/1,9 15,5/50,6 95,3/97,4 2-4 AM3/C 1 PEG3K, NaAc4,6 ID14-4 ESRF

AM2

P4212 184 184 79 3,19/3,2 16,5/46,4 100/100 2 AM8/B5 PEG3K, K3cit, Tris 8,5 ID29 ESRF

AM3

P4212 183,5 183,5 79,5 2,8/3,4 17,4/43,0 99,9/99,6 2 AM8/B6 PEG3K, K3cit, Bicina 9 ID29 ESRF

AM4

??? ??? 2,9/? ?? ?? ?? AM13/C2 AS, Hepes 7 ID29 ESRF

AM5

P4212 184 184 79 2,9/3,2 17,4/56,5 99,8/99,4 2 AM8/B6 PEG3K, K3cit, Bicina 9 ID29 ESRF

AM6

P4212 184 184 79 2,81/3,5 22,3/50,9 99,7/100 2 AM8/A5 PEG3K, K3cit, Tris 8,5 ID29 ESRF

AM7

P4212 184 184 80 2,5/2,5 18,2/61,1 96,5/97,6 2 AM8/A5 PEG3K, K3cit, Tris 8,5 ID29 ESRF

AM8

I2 213 80 218 2,7/∼3 13,1/66,1 85,8/85,8 8 AM5/A5 PEG3K, K3cit ID29 ESRF

AM9

P4212 183 183 94 2,37/3,1 30,3/84,6 86,7/86,7 2 AM12/B5 PEG3K, K3cit, Tris 8,5 4MF ID14-4 ESRF

AM10

P4212 183 183 94 2,7/2,7 16,3/64,7 94,9/97,8 2 AM8/A6 PEG3K, K3cit, Bicina 9 4MF ID14-4 ESRF

AM11_Zn

P21212 ? 79 111 172,5 ∼2,5 ?? ?? 2-4 AM3/C5 PEG3K, NaAc4,6 Zn ID29 ESRF

AM12

P4212 184 184 79 2,5/2,95 18,3/62,9 91,5/92,8 2 AM15/C6 PEG3K, K3cit, Bicina 9 Zn+4MF ID29 ESRF

AM13

P421 2 184 184 79 AM15/C6 PEG3K, K3cit, Bicina 9 Zn+4MF ID29 ESRF

AM14

P4212 183,5 183,5 79 2,5/3,0 19,7/74,6 96,2/97,2 2 AM15/C6 PEG3K, K3cit, Bicina 9 Zn+4MF ID29 ESRF

AM1 5

I2 213 80 218 2,45/2,5 10,1/35,8 91,0/70,5 8 AM15/B1 PEG3K, K3cit, Cit 5 ID29 ESRF

Tabla 5. Los elementos estructurales de la amidasa 2

Código de colores: blanco = dominio de sándwich más pequeño, gris oscuro = dominio de barril catalítico, gris claro = hebras de barril y hélices de barril; la héliceα7 también se puede considerar una hélice de barril

cadena β nº. residuos cadena β hélice α nº. residuos hélice α hélice γ residuos hélice γ nº.

5 Ejemplo 19. Expresión de amidasas de las especies fúngicas Glomerella graminicola M1.001 y Metarhizium anisopliae ARSEF 23 en Trichoderma reesei.

Para expresar las amidasas de Glomerella graminicola M1.001 y Metarhizium anisopliae ARSEF 23, ambos genes

se sintetizaron como secuencias optimizadas de codones para la expresión en T. reesei y se clonaron en el vector

pDonor221 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) por Life Technologies (Alemania). Se añadieron codones 6xHis en la 10 región codificante 3' de cada gen con fines de purificación. Para permitir la expresión de ambas amidasas en

Trichoderma reesei, sus secuencias codificantes se clonaron en el vector de destino compatible con Gateway, pTTT

pyrG13 (descrito en los documentos WO2010141779A1 y PCT/US 10/57531) a través de la reacción de

recombinación Gateway® LR. Este vector contiene las regiones promotora y terminador derivadas de T. reesei cbhl

que permiten una fuerte expresión inducible de un gen de interés, los marcadores selectivos amdS y pyrG de 15 Aspergillus nidulans que confieren crecimiento de transformantes a la acetamida como única fuente de nitrógeno o

en ausencia de uridina o ambos, y las regiones de los telómeros de T. reesei que permiten el mantenimiento del

plásmido no cromosómico en una célula fúngica. Las regiones promotora y terminadora cbhl están separadas por el

gen de la resistencia al cloranfenicol, CmR, y el gen letal de E. coli, ccdB, flanqueado por los sitios de recombinación

específicos basados en el bacteriófago lambda attR1, attR2. Dicha configuración permite la selección directa de recombinantes que contienen un gen de interés bajo el control de los elementos reguladores cbhl en la orientación correcta a través de la reacción de recombinación Gateway® LR.

Las reacciones de recombinación de LR entre los clones pEntry de cada gen de amidasa y el vector de destino pTTT-pyrG13 se realizaron usando la mezcla de enzima LR clonase™ II según el protocolo de Invitrogen. Los productos de recombinación generados se transformaron en E. coli Max Efficiency DH5a, según lo descrito por el proveedor (invitrogen), y se seleccionaron clones que contenían las construcciones de expresión pTTT-pyrG13-Amidasa G. graminicola y pTTT-pyrG13-Amidasa M. anisoplia en placas agar 2xYT (16 g/l de bacto triptona (Difco, EE.UU.), 10 g/l de extracto de levadura bacto (Difco, EE.UU.), 5 g/l de NaCl, 16 g/l de agar bacto (Difco, EE.UU.) con ampicilina a 100 μg/ml. Después del crecimiento de cultivos bacterianos en medio 2xYT con ampicilina 100 μg/ml, los plásmidos aislados se sometieron a análisis de restricción y se usaron clones con el patrón de restricción correcto para la transformación de la cepa Trichoderma reeei 2830 pyrG negativa eliminada para 4 celulasas principales cbhl, cbhll, egll, eglll (documento WO2010141779A1). Los plásmidos de expresión final pTTT-pyrG13-AmidasaG. graminicola y pTTT-pyrG13-Amidasa M. anisopliae semuestran en la figura 23-25.

0,5-2 μg de cada plásmido de expresión se transformaron en T. reesei usando el método PEG-Protoplast con ligeras modificaciones, como se indica. Para la preparación de protoplastos, las esporas se cultivaron durante 16-24 horas a 24ºC en Trichoderma Minimum Medium MM (20 g/l de glucosa, 15 g/l de KH2PO4, pH 4,5, 5 g/l (NH4)2SO4, 0,6 g/l de MgSO4x7H2O, 0,6 g/L de CaCl2x2H2O, 1 ml de 1000X T. reesei. Solución de elementos traza {5 g/L de FeSO4x7H2O, 1,4 g/L de ZnSO4x7H2O, 1,6 g/L de MnSO4xH2O, 3,7 g/L de CoCI2x6H2O}) con agitación a 150 rpm. Las esporas germinales se recogieron mediante centrifugación y se trataron con 50 mg/ml de solución Glucanex G200 (Novozymes AG, Suiza) para lisar las paredes de las células fúngicas. La preparación adicional de protoplastos se realizó por unmétodo estándar, como se describe por Penttilä et al. [Gene 61 (1987) 155 -164].

En general, las mezclas de transformación que contienen aprox. 1 μg de ADN y 1-5x107 protoplastos en un volumen total de 200 μΙ se trataron con 2 ml de solución de PEG al 25%, se diluyeron con 2 volúmenes de sorbitol 1,2 M/Tris 10 mM, pH 7,5/10 mM de solución de CaCl2, mezclada con 3% de agarosa superior selectiva MM que contiene 1 M de sorbitol y 20 mM de acetamida (el mismo medio mínimo mencionado anteriormente pero con (NH4)2SO4 sustituido con acetamida) y vertido en agarosa selectiva al 2% con acetamida Las placas se incubaron durante 5-7 días a 28ºC antes de que lostransformantes crecieran y comenzaran la esporulación.

Se usó una mezcla de esporas (106 esporas/ml) de una placa de transformación para inocular matraces agitados con medio de producción (por 1 l): medio de producción de glicina (4,7 g/l (NH4)2SO4, 33 g/l de 1,4piperazinabis(ácido propanosulfónico), pH 5,5, 6,0 g/l de glicina, 5,0 g/l de KH2PO4, 1,0 g/l de CaCl2x2H2O, 1,0 g/l de MgSO4x7H2O, 2,5 ml/l de 400X de T. reesei de elementos traza, Glucosa 20 g/L, Sophorosa 6,5 g/L). Como control, la cepa receptora 2830 de T. reesei se cultivó en las mismas condiciones pero en presencia de uridina 10 mM. Después de 5 días de fermentación a 30ºC y 200 rpm, los cultivos se recogieron y se sometieron a análisis enzimático a partir de extractos tanto extracelulares comointracelulares.

Ejemplo 20. Expresión de la amidasa de Aspergillus oryzae en la cepa de Aspergillus niger GICC#2445

Para expresar el gen putativo de amidasa de A. oryzae en Aspergillus niger, la secuencia que codifica la amidasa se amplificó a partir del ADN genómico de Aspergillus oryzae RIB40 (obtenido de Fungal Genetics Stock Collection, FGSC, EE.UU.) usando los cebadores específicos del gen con los sitios attB1 y attB2 en los extremos 5' y 3' para la clonación posterior a través de un enfoque Gateway. Además, el cebador inverso contiene 6 tripletes de codificación de xHis para facilitar la purificación dela proteína expresada.

Se utilizó el siguiente conjunto de cebadores:

Directo 5'

Inverso 5'

Todas las reacciones PCR se amplificaron con una DNA polimerasa de alta fidelidad Phusion (Finnzymes OY, Espoo, Finlandia) en condiciones estándar recomendadas por el proveedor. Después dela separación del fragmento de ADN amplificado en un gel de agarosa al 0,8%, se purificó con un kit de limpieza Nucleospin® Extract PCR (Macherey-Nagel GmbH & co. KG, Duren, Alemania) y 150 ng se recombinaron con el vector pDonor221 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según la recomendación del proveedor. Las colonias de E. coli DH5a con clones pEntry que contienen la amidasa de A. oryzae se seleccionaron en placas de agar 2xYT con kanamicina a 50 μg/ml. Los

plásmidos aislados de células bacterianas se analizaron por su patrón de digestión de restricción para la presencia del inserto y se verificaron mediante análisis de secuencia usando un analizador de secuencia ABI3100 (Applied Biosystems). El plásmido pEntry-Amidasa de A. oryzae resultante se utilizó para la clonación en un vector de destino pRAXdest2, como se describe en la patente US07459299, a través de la reacción Gateway LR posterior según el protocolo de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Los productos de recombinación formados se transformaron en E. coli Max Efficiency DH5, según lo descrito por el proveedor (Invitrogen), y los clones que contenían la construcción de expresión pRAX-Amidasa A. oryzae (Fig.25) se seleccionaron en placas de agar 2xYT (16 g/L Bacto Tryptone (Difco, EE.UU.), 10 g/l de extracto de levadura Bacto (Difco, EE.UU.), 5 g/l de NaCl, 16 g/l de Bacto Agar (Difco, EE.UU.) con ampicilina 100 μg/ml. Después del crecimiento de cultivos bacterianos en medio 2xYT con ampicilina 100 μg/ml, los plásmidos aislados se sometieron a análisis de restricción seguido de secuenciación usando un analizador de secuencia ABI3100 (Applied Biosystems). Además de una secuencia bacteriana, el plásmido de expresión final pRAX2-Amidasa A. oryzae contiene la región codificadora de amidasa de A. oryzae bajo el control del promotor y terminador de glucoamilasa de A. niger, el gen pyrG de Aspergillus nidulans como marcador selectivo y la secuencia AMA1 de A. nidulans para la replicación autónoma en células fúngicas.

Se transformaron 0,5-2 μg de este plásmido en la cepa de A. niger var awamori GICC nº 2445 desarrollada por Genencor usando un procedimiento de transformación común conocido en la técnica o descrito en la patente US07459299. Esta cepa se elimina para el gen glaA de la glucoamilasa endógena y porta una mutación en el gen pyrG que permite la selección de transformantes para la prototrofia de uridina. Los transformantes de A. niger se cultivaron en medio MM (el mismo medio mínimo que se usó para la transformación de T. reesei pero se usó NH4Cl 10 mM en lugar de acetamida como fuente de nitrógeno) durante 4-5 días a 37ºC y una población total de esporas se usaron (106 esporas/ml) de diferentes placas de transformación para inocular matraces agitados con medio de producción (por 1 l): 12 g de Trypton; 8 g de Soyton; 15 g de (NH4)2SO4; 12,1 g de NaH2PO4xH2O; 2,19 g de Na2HPO4x2H2O; 1 g de MgSO4x7H2O; 1 ml de Tween 80; 150 g de maltosa; pH 5,8. Después de 5 días de fermentación a 30ºC y 200 rpm, los cultivos se recogieron y se sometieron a análisis enzimático a partir de los extractos tanto extracelulares como intracelulares.

Ejemplo 21. Amidasas de tres hongos adicionales para la degradación de la ocratoxina

Las secuencias putativas de amidasa de Glomerella graminicola (GMGM), Metarhizium anisopliae y Aspergillus oryzaemostraron actividad en la degradación de la ocratoxina A.

La Tabla 6 muestra la actividad de tres amidasas fúngicas de Glomerella graminicola, Metarhizium anisopliae y Aspergillus oryzae expresadas intracelularmente en Trichoderma reesei y Aspergillus niger. La mezcla de reacción que usa OTA como sustrato consistió en 75 μl de fosfato (67 mM, pH 7), 5 μl de OTA (2,4 μg/ml) y 20 μl de fracción sin células intracelular. La reacción se realizó a 23ºC durante 17 h y se detuvo añadiendo 0,15 ml de acetonitrilo y se analizó en HPLC con un volumen deinyección de 5 μl.

Tabla 6

Cepas/y actividades

Cepa progenitora de Trichoderma reesei utilizada para la transformación Cepa progenitora de Trichoderma reesei transformada con el supuesto gen de amidasa de Glomerella gramicola Cepa progenitora de Trichoderma reesei transformada con el supuesto gen de amidasa de Metarhizium anisopliae Cepa de Aspergillus Niger transformada con el supuesto gen de amidasa de Aspergillus oryzae

Actividad sobre la ocratoxina A expresada como el área del pico de ocratoxina A

12,26 0,68 0,96 8,57

Los datos en la tabla indican que la amidasa de G. gramicola tiene la actividad más alta contra la ocratoxina, mientras quela amidasa de A. oryzae tiene una actividad más baja contra este sustrato.

Ejemplo 22. Comparación de secuencia de secuencias putativas de amidasa

Las comparaciones de secuencias se realizaron en toda la longitud de las secuencias polipeptídicas usando el programa AlignX VectorNTI (InvitrogenCorporation) usando los parámetros por defecto (penalización de apertura de hueco -10, penalización de extensión de hueco 0,1). Como puede verse en la Tabla 7, las supuestas amidasas pueden tener una baja homología global. Sin embargo, como puede verse a partir de la Figura 26, todos los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 y 15 tienen losmismos motivos quela amidasa 2 (SEQ ID NO: 1 y 3).

Las secuencias están alineadas con la versión 5.4.1 de Multalin (F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16: 10881 10890). Parámetros utilizados: blosum62, Peso de hueco: 12, Peso de longitud del hueco: 2, Niveles consenso: alto

= 90%, bajo = 50%, Símbolos consenso: ! es cualquiera de IV, $ es cualquiera de LM, % es cualquiera de FY, # es cualquiera de NDQEBZ. Descripciones de las secuencias y su número de acceso web (en paréntesis):

Además, como se muestra en el Ejemplo 21 (Tabla 6), la SEQ ID NO: 13-15 tiene actividad de degradación de la ocratoxina.

Tabla 7

Secuencia ID NO

% identidad respecto a SEQ ID NO:1 (cadena completa)

SEQ ID NO:5

41,8%

SEQ ID NO:6

42,4%

SEQ ID NO:7

42,4%

SEQ ID NO:8

40,7%

SEQ ID NO:9

36,5%

SEQ ID NO:10

28,2%

SEQ ID NO:11

36,5%

SEQ ID NO:13

56,1%

SEQ ID NO:14

53,4%

SEQ ID NO:15

34,6%

Los motivos de secuencia común delas 11 secuencias tienen el consenso:

1 ) l/m-P-G-l/m-w/i-D-c/v/s/a-H-x-H-f/y/l-xG, donde los dos residuos de His están en el sitio activo;

2) G-y/f-T;

3) G-t/a/s/v/r-i/f/a-x-G-P;

4) G-H-g/s-D donde el residuo de His está en el sitio activo;

5) D-G-v/e-x-e/d/g-C-x-a/g/t-v/a-R-x-q/m/a-l/i/v-R-r/h/c-g/n-A-k/r/t/e/d-x-l-K, donde el residuo Lys está en el sitio activo

6) G-G-V-l/m/v/g-S-x-x-D-x-P, donde el residuo Val está en el sitio activo;

7) V-a/s/h-A-H-c/v/a-h/q-G-k/r-x-G, dondelos dos residuos de His están en el sitio activo;

8) H-g/v/a-s/t/i-y/f/e-l/a/i-D, donde el residuo de His está en el sitio activo;

9) G-V-x-l-a/v-l/a-G-T-D, donde el residuo de Asp está en el sitio activo.

SEQ ID NO: 1, es amidasa 2 de A. niger, SEQ5, proteína hipotética de A. niger (XP_001400981), SEQ ID NO: 6, proteína hipotética de A. flavus (XP__002385313), SEQ ID NO: 7, proteína hipotética de Talaromyces stipitatus (XP_002477972), SEQ ID NO: 8, proteína hipotética de Neurospora crassa (XP_962238), SEQ ID NO: 9, amidohidrolasa putativa de Streptomyces roseosporus (ZP_04712156), SEQ ID NO: 10, amidohidrolasa putativa de Thermotoga lettingae (YP_001470371), SEQ ID NO:11, amidohidrolasa putativa de Salinispora arenicola (YP_001536995), SEQ ID NO: 13, amidohidrolasa putativa de Glomerella graminicola (EFQ25792), SEQ ID NO: 14, amidohidrolasa putativa de Metarhizium anisopliae (EFZ00058), SEQ ID NO: 15, proteína hipotética de Aspergillus oryzae (XP_001826758).

Ejemplo 23. Comparación de secuencias de SEQ ID NO: 1 con carboxipeptidasa que tiene actividad degradadora de ocratoxina

Se conocen dos carboxipeptidasas que tienen baja actividad degradadora de ocratoxina, a saber, carboxipeptidasa A bovina y carboxipeptidasa Y de levadura (Luis Abrunhosa, Robert R. M. Paterson y Armando Venâncio, Biodegradation of Ochratoxin A for Food and Feed Decontamination, Toxins 2010, 2, 1078-1099).

La actividad de degradación dela ocratoxina de estas enzimas ha sido confirmada. Sin embargo, como se puede ver a partir de la Figura 27, estas enzimas no muestran homología con la SEQ ID NO: 1 y no contienen ninguno de los 9 motivos asociados con la capacidad de degradación de la ocratoxina. Además, estas enzimas no tienen la estructura tipo barril Tim de amidasa.

Listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 Amidasa 2 sig de A. niger

SEQ ID NO. 2 Tipo de secuencia: ADN; nombre del ADN: ADN que contiene el gen de la amidasa 2, Longitud: 1443, Organismo:

Aspergillus niger

SEQ ID NO. 3 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: amidasa 2 mat, Longitud: 438, Organismo: Aspergillus niger

SEQ ID NO. 4 Amidasa 2 A. niger + c-terminal 6H

SEQ ID NO. 5 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: homólogo putativo dela amidasa 2, Longitud: 420, Organismo:

Aspergillus niger

SEQ ID NO. 6 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: homólogo putativo dela amidasa 2, Longitud: 419, Organismo:

Aspergillus flavus

SEQ ID NO. 7 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: homólogo putativo dela amidasa 2, Longitud: 405, Organismo:

Talaromyces stipitatus

SEQ ID NO. 8 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: homólogo putativo de la amidasa 2, Longitud: 440, Organismo:

Neurospora crassa

SEQ ID NO. 9 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: homólogo putativo dela amidasa 2, Longitud: 413, Organismo:

treptomyces roseosporus

SEQ ID NO. 10 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: homólogo putativo dela amidasa 2, Longitud: 407, Organismo:

Thermotoga lettingae

SEQ ID NO. 11 Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: homólogo putativo dela amidasa 2, Longitud: 408, Organismo:

Salinispora arenicola

SEQ ID NO. 12. Tipo de secuencia: Proteína; nombre de la proteína: pepAd2 (proteasa), Longitud: 480, Organismo: Aspergillus niger

SEQ ID NO:13 Organismo Glomerella graminícola M1.001 (hongo), 472aa

SEQ ID NO:14 Organismo Metarhizium anisopliae ARSEF 23. 485aa,

SEQ ID NO:15 Amidohidrolasa de A. oryzae

SEQ ID NO:16 Carboxipeptidasa A bovina (419 aa). Acceso: NP_777175. Producto de Sigma no. C0261.

SEQ ID NO:17

Carboxipeptidasa Y de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae), 532 aa, Acceso: EDV11788. Producto de Sigma no. C3888.

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20 6. Pitout, M. J. (1969). The hydrolysis of ochratoxin A by some proteolytic enzymes. Biochem.Pharmacol. 18: 485

491.

7. Stander, M. A., Bornscheuer, U. T., Henke, E., and Steyn, P. S. (2000). Screening of commercial hydrolases for the degradation of ochratoxin A. J. Agric. Food Chem. 48: 5736-5739.

8. Van der Merwe, K. J., Steyn, P. S., and Fourie, L. (1965). Mycotoxins. II. The constitution of ochratoxins A, B, and 25 C, metabolites of Aspergillus ochraceus Wilh. J. Chem. Soc. [Perkin 1] 7083-7088.

9. WHO/FAO (1998). Food irradiation. A Technique for Preserving and Improving the Safety of Food. World Health Organizationin collaboration with the Food and Agricultural Organization, Geneva.

10. Wang, H (2010). Increased production of aspartic proteases in filamentous fungal cells. Documento WO 2010014574(A2).

Listado de secuencias

<110> Danisco A/S 5 <120> Aditivo

<130> P040272WO

<150> US 61/380280

<151>

<150> EP10177410.7 10 <151>

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 480 15 <212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 1

5

<210> <211> <212> <213> 2 1443 ADN Aspergillus niger

<400>

2

5

<210> <211> <212> <213> 3 438 PRT Aspergillus niger

<400>

3

5

<210> <211> <212> <213> 4 486 PRT Aspergillus niger

<400>

4

<210> 5

<211> 420

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 5

5

<210> <211> <212> <213> 6 419 PRT Aspergillus flavus

<400>

6

5

<210> <211> <212> <213> 7 405 PRT Talaromyces stipitatus

<400>

7

5

<210> <211> <212> <213> 8 440 PRT Neurospora crassa

<400>

8

<210> <211> <212> <213>

9 413 PRT Streptomyces roseosporus

5

<400> 9

5

<210> <211> <212> <213> 10 407 PRT Thermotoga lettingae

<400>

10

5

<210> <211> <212> <213> 11 408 PRT Salinispora arenicola

<400>

11

5

<210> <211> <212> <213> 12 480 PRT Aspergillus niger

<400>

12

5

<210> <211> <212> <213> 13 472 PRT Glomerella graminicola

<400>

13

5

<210> <211> <212> <213> 14 485 PRT Metarhizium anisopliae

<400>

14

5

<210> <211> <212> <213> 15 419 PRT Aspergillus oryzae

<400>

15

5

<210> <211> <212> <213> 16 419 PRT Bos taurus

<400>

16

5

<210> <211> <212> <213> 17 532 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

17

5

<210> <211> <212> <213> 18 13 PRT Secuencia artificial

<220> <223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

10

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (1)..(1) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> característica_nueva

<222> (4)..(5)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> característica_nueva

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> característica_nueva

<222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> característica_nueva

<222> (11)..(12)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400> 18

<210>

19

<211>

6

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(2)..(4)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

19

<210>

20

<211>

4

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(3)..(3)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

20

<210>

21

<211>

22

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

5

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (3)..(5) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220> <221> <222> <223>

característica_nueva (7)..(10) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

10

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (12)..(14) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

15

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (16)..(17) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

20

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (19)..(20) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

21

25

<210> <211> <212> <213> 22 10 PRT Secuencia artificial

<220> <223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

30

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (4)..(4) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

35

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (6)..(7) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

40

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (9)..(9) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

22

<210>

23

45

<211> 10

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223> Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221> característica_nueva

<222> (2)..(2)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> característica_nueva

<222> (5)..(6)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> característica_nueva

<222> (8)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400> 23 <220>

<210>

24

<211>

6

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(2)..(5)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

24

<210>

25

<211>

9

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(3)..(3)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(5)..(6)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

25

<210>

26

<211>

13

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<223> Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221> Característica_nueva

<222> (1)..(1)

<223> Xaa puede ser Leu o Met

<220>

<221> Característica_nueva

<222> (4)..(4)

<223> Xaa puede ser Leu o Met

<220>

<221> Característica_nueva

<222> (5)..(5)

<223> Xaa puede ser Trp o Ile

<220>

<221> Característica_nueva

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede ser Cys, Val, Ser o Ala

<220>

<221> característica_nueva

<222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> Característica_nueva

<222> (11)..(11)

<223> Xaa puede ser Phe, Tyr o Leu

<220>

<221> característica_nueva

<222> (12)..(12)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400> 26

<210> 27

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 27

ggagatctat catggtccgc cgaattg 27

<210> 28

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 28

aatctagact agtgatggtg atggtgatgc agaaaaggat tacgtg 46

<210> 29

<211> 7 <210> 34

<212>

PRT

<213>

Aspergillus niger

<400>

29

<210>

30

<211>

11

<212>

PRT

<213>

Aspergillus niger

<400>

30

<210>

31

<211>

5

<212>

PRT

<213>

Aspergillus niger

<400>

31

<210>

32

<211>

8

<212>

PRT

<213>

Aspergillus niger

<400>

32

<210>

33

<211>

9

<212>

PRT

<213>

Aspergillus niger

<400>

33

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 34

gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctca ccatgcaccg gatgctcaca gacgacagac

<210> 35

<211> 71

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 35

<210>

36

<211>

6

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

Característica_nueva

<222>

(2)..(2)

<223>

Xaa puede ser Thr, Ala, Ser, Val o Arg

<220>

<221>

Característica_nueva

<222>

(3)..(3)

<223>

Xaa puede ser Ile, Phe o Ala

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(4)..(4)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

36

<210>

37

<211>

4

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

MISC_FEATURE

<222>

(3)..(3)

<223>

Xaa can be Gly or Ser

<400>

37

<210>

38

<211>

22

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

Característica_nueva

<222>

(3)..(3)

<223>

Xaa puede ser Val o Glu

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(4)..(4)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220> <221> <222> <223>

Característica_nueva (5)..(5) Xaa puede ser Glu, Asp o Gly

5

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (7)..(8) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

10

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (9)..(9) Xaa puede ser Ala, Gly o Thr

15

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (10)..(10) Xaa puede ser Val o Ala

20

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (12)..(12) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220> <221> <222> <223>

Característica_nueva (13)..(13) Xaa puede ser Gln, Met o Ala

25

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (14)..(14) Xaa puede ser Leu, Ile, o Val

30

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (16)..(16) Xaa puede ser Arg, His o Cys

35

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (17)..(17) Xaa puede ser Gly o Asn

40

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (19)..(19) Xaa puede ser Lys, Arg, Thr, Glu o Asp

<220> <221> <222> <223>

característica_nueva (20)..(20) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

45

<400> 38

<210>

39

<211>

10

<212>

PRT

50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221> Característica_nueva

<222> (4)..(4)

<223> Xaapuede serLeu,Met,ValoGly

<220>

<221> característica_nueva

<222> (6)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<220>

<221> característica_nueva

<222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400> 39

<210>

40

<211>

10

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220>

<221>

Característica_nueva

<222>

(2)..(2)

<223>

Xaa puede ser Ala, Ser o His

<220>

<221>

Característica_nueva

<222>

(5)..(5)

<223>

Xaa puede ser Cys, Val o Ala

<220>

<221>

Característica_nueva

<222>

(6)..(6)

<223>

Xaa puede ser His o Gln

<220>

<221>

Característica_nueva

<222>

(8)..(8)

<223>

Xaa puede ser Lys o Arg

<220>

<221>

característica_nueva

<222>

(9)..(9)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

<400>

40

<210>

41

<211>

6

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

<220> <221> <222> <223>

Característica_nueva (2)..(2) Xaa puede ser Gly, Val o Ala

5

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (3)..(3) Xaa puede ser Ser, Thr o Ile

10

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (4)..(4) Xaa puede ser Tyr, Phe o Glu

15

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (5)..(5) Xaa puede ser Leu, Ala o Ile

<400>

41

20

<210> <211> <212> <213> 42 9 PRT Secuencia artificial

<220> <223>

Motivos de secuencia de aminoácidos

25

<220> <221> <222> <223> característica_nueva (3)..(3) Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural

30

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (5)..(5) Xaa puede ser Ala o Val

35

<220> <221> <222> <223> Característica_nueva (6)..(6) Xaa puede ser Leu o Ala

<400>

42

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una enzima amidasa aislada capaz de degradar la ocratoxina, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15, o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15; o un polipéptido que es producido por la expresión de un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético; o una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con lamisma.

2. 2.

   La amidasa según la reivindicación 1, en la quela ocratoxina es la ocratoxina A.

3. 3.

   La amidasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la amidasa tiene una estructura de barril Tim que incluye un sitio activo que comprende 6 restos de histidina, 1 residuo de lisina y 1 residuo de ácido aspártico, en donde los residuos de aminoácidos en el sitio activo corresponden a las posiciones H111, H113, H191, K246, H287, H289, H307 y D378 de SEQ ID NO: 1 cuando se comparan la estructura terciaria de la amidasa y la SEQ ID NO: 1.

4. 4.

   La amidasa según cualquier reivindicación precedente, en la que la enzima amidasa comprende una secuencia polipeptídica que tiene la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó 15 , o una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NOs: 5-11, 13, 14 ó15, o un polipéptido que se produce por la expresión de un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos el 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad con la misma, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético; o una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad con la misma.

5. 5.

   La amidasa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la amidasa hidroliza aproximadamente al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos de 400 a 900 nanomoles de ocratoxina A por minuto y mg de proteína a pH 7,0 y 40ºC.

6. 6.

   Un alimento o aditivo alimentario que comprende una enzima amidasa capaz de degradar la ocratoxina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. 7.

   El alimento o aditivo alimentario según la reivindicación 6, que comprende además al menos un vehículo fisiológicamente aceptable, opcionalmente seleccionado de al menos uno de maltodextrina, piedra caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo, salvado de trigo o de un componente de trigo, de arroz o salvado de arroz , sacarosa, almidón, Na2SO4, talco y PVA ymezclas de los mismos.

8. 8.

   El alimento o aditivo alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el aditivo para alimentación comprende una o más enzimas adicionales, preferiblemente en las que la(s) otra(s) enzima(s) adicional(es) se seleccionan del grupo que consiste en aquellas implicadas en la degradación de proteínas que incluye carboxipeptidasas, preferiblemente carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa Y, proteasas de ácido aspártico de

   A. niger de PEPAa, PEPAb, PEPAc y PEPAd, elastasa, amino peptidasas, pepsina o proteasas tipo pepsina, tripsina

   o tipo tripsina y proteasas bacterianas incluyendo subtilisina y sus variantes, y de las que participan en el metabolismo del almidón, degradación de la fibra, metabolismo de los lípidos, proteínas o enzimas implicadas en el metabolismo del glucógeno, amilasas, arabinasas, arabinofuranosidasas, catalasas, celulasas, quitinasas, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasas, epimerasas, esterasas, galactosidasas, glucanasas, glucano lisasas, endo-glucanasas, glucoamilasas, oxidasas de glucosa, glucosidasas, incluyendo β-glucosidasa, glucuronidasas, hemicelulasas, hexosa oxidasas, hidrolasas, invertasas, isomerasas, enzimas lipolíticas, lacasas, liasas, manosidasas, oxidasas, oxidorreductasas, pectato liasas, pectina acetilo esterasas, pectina despolimerasas, pectina metilo esterasas, enzimas pectinolíticas, peroxidasas, fenoloxidasas, fitasas, poligalacturonasas, proteasas, ramnogalacturonasas, ribonucleasas, taumatina, transferasas, proteínas de transporte, transglutaminasas, xilanasas, hexosa oxidasa (D-hexosa: O2-oxidorreductasa, EC 1.1.3.5), fosfatasas ácidas y/u otras o combinaciones de las mismas.
9. 9. Un alimento o material alimenticio que comprende el aditivo alimenticio de cualquiera de las reivindicaciones 6 a
10. 8.

11. 10.

    Un alimento omaterial alimenticio que comprende el alimento o material alimenticio dela reivindicación 9.

12. 11.

    El producto alimenticio según la reivindicación 10, que comprende uno o más materiales de alimentación seleccionados del grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes como maíz o sorgo; b) subproductos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, solubles de granos secos de destilería (DDGS), salvado de trigo, triturados detrigo, cortes de trigo, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, semilla de palma, y pulpa de cítricos; c) ensilaje; d) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, maní, altramuz, guisantes, habas,

    algodón, canola, harina de pescado, proteína de plasma seco, harina de carne y huesos, proteína de patata, suero de leche, copra, sésamo; e) aceites y grasas obtenidos de fuentes vegetales y animales; f) minerales y vitaminas.

13. 12.

    El Producto alimenticio según la reivindicación 10, en el que dicho producto alimenticio comprende un cereal, por ejemplo maíz, trigo, cebada, sorgo, un producto de cereal, por ejemplo papillas, fideos, pan o pasteles, café, cacao, vino, cerveza, legumbres, especias, frutos secos, zumo de uva, leche, productos lácteos, por ejemplo, queso, carne

    o productos cárnicos.

14. 13.

    Un método de preparación de un alimento o producto alimenticio según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 que comprende añadir a un alimento o material de alimentación un alimento o aditivo de alimentación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

15. 14.

    Un método para preparar un alimento o aditivo alimenticio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que comprende mezclar la amidasa con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable.

16. 15.

    Una composición que comprende un material contaminado con ocratoxina y una enzima amidasa que degrada la ocratoxina de acuerdo con cualquiera delas reivindicaciones 1 a 5.

17. 16.

    La composición según la reivindicación 15 que comprende una o más enzimas adicionales, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en aquellas implicadas en la degradación de proteínas que incluyen carboxipeptidasas, preferiblemente la carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa Y, A. proteasas de ácido aspártico de A. niger, preferiblemente PEPAa, PEPAb, PEPAc y PEPAd, elastasa, amino peptidasas, pepsina o proteasas tipo pepsina, tripsina o tipo tripsina y proteasas bacterianas incluyendo subtilisina y sus variantes, y las de aquellas involucradas en el metabolismo del almidón, degradación de fibras, metabolismo lipídico, proteínas o enzimas implicadas en el metabolismo del glucógeno, amilasas, arabinasas, arabinofuranosidasas, catalasas, celulasas, quitinasas, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasas, epimerasas, esterasas, galactosidasas, glucanasas, glucano lisasas, endoglucanasas, glucoamilasas, glucosa oxidasas, glucosidasas, incluidas β glucosidasa, glucuronidasas, hemicelulasas, hexosa oxidasas, hidrolasas, invertasas, isomerasas, enzimas lipolíticas, lacasas, liasas, manosidasas, oxidasas, oxidoreductasas, pectato liasas, pectina acetil esterasas, pectinas depolimerasas, pectina metil esterasas, enzimas pectinolíticas, peroxidasas, fenoloxidasas, fitasas, poligalacturonasas, proteasas, ramnogalacturonasas, ribonucleasas, taumatina, transferasas, proteínas de transporte, transglutaminasas, xilanasas, hexosa oxidasa (D-hexosa: O2-oxidorreductasa, EC 1.1.3.5) fosfatasas ácidas y/u otras o combinaciones de las mismas, y opcionalmente además que comprenden al menos una de una enzima desintoxicante seleccionada del grupo que consiste en una enzima degradadora de micotoxinas, por ejemplo aflatoxin detoxizma, zearalenona esterasas, zearalenona lactonasas, fumonisin carboxilesterasas, fumonisin aminotransferasas, aminopoliol amina oxidasas, deoxinivalenol expoxido hidrolasas, un microorganismo degradante de micotoxinas, por ejemplo, Bacillus subtilis, o un absorbente (es decir, aglutinantes de micotoxina) que incluyen al menos un polímero, por ejemplo, paredes de célulasmicrobianas o unmaterial inorgánico tal como bentonita.

18. 17.

    La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, en la que dicha composición es una composición de alimentación, un caldo de fermentación o agua residual.

19. 18.

    Un método para reducir la contaminación por ocratoxina de un material que comprende añadir a dicho material una enzima amidasa que degrada la ocratoxina según cualquiera delas reivindicaciones 1 a 5.

20. 19.

    El método según la reivindicación 18, en el que la amidasa hidroliza aproximadamente al menos 100, al menos 200, al menos 300, de al menos 400 a 900 nanomoles de ocratoxina A por minuto y mg de proteína cuando se incuba a pH 7,0 y 40ºC.

21. 20.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19 que comprende además añadir una o más enzimas adicionales, preferiblemente en donde la una o más enzimas adicionales se seleccionan del grupo que consiste en aquellas implicadas en la degradación de proteínas que incluyen carboxipeptidasas, preferiblemente carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa Y, proteasas del ácido aspártico de A. niger de PEPAa, PEPAb, PEPAc y PEPAd, elastasa, amino peptidasas, pepsina o proteasas tipo pepsina, tripsina o tipo tripsina y proteasas bacterianas, incluida la subtilisina y sus variantes, y de las que participan en el metabolismo del almidón, degradación de la fibra, metabolismo lipídico, proteínas o enzimas implicadas en el metabolismo del glucógeno, acetil esterasas, aminopeptidasas, amilasas, arabinasas, arabinofuranosidasas, catalasas, celulasas, quitinasas, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasas, epimerasas, esterasas, galactosidasas, glucanasas, glucano liasas, endoglucanasas, glucoamilasas, glucosa oxidasas, glucosidasas, incluyendo β glucosidasa, glucuronidasas, hemicelulasas, hexosa oxidasas, hidrolasas, invertasas, isomerasas, enzimas lipolíticas, lacasas, liasas, manosidasas, oxidasas, oxidorreductasas, pectato liasas, pectina acetil esterasas, pectina depolimerasas, pectina metil esterasas, enzimas pectinolíticas, peroxidasas, fenoloxidasas, fitasas, poligalacturonasas, proteasas, ramnogalacturonasas, ribonucleasas, taumatina, transferasas, proteínas de transporte, transglutaminasas, xilanasas, hexosa oxidasa (D-hexosa: O2-oxidorreductasa, EC 1.1.3.5), fosfatasas ácidas y/u otras o combinaciones de las mismas, que opcionalmente comprenden además añadir al menos una de una enzima desintoxicante seleccionada del grupo que consiste en una enzima degradadora de micotoxinas, por ejemplo aflatoxina detoxizima, zearalenona esterasas, zearalenona lactonasas, fumonisin carboxilesterasas, fumonisin aminotransferasas, aminopoliol amina

    oxidasas, desoxinivalenol expoxido hidrolasas, un microorganismo que degrada micotoxinas, por ejemplo, Bacillus subtilis, o un absorbente (es decir, aglutinantes de micotoxina) que incluyen al menos un polímero, por ejemplo, paredes de célulasmicrobianas o unmaterial inorgánico tal como bentonita.

    ADN pUC18

    152 153