MXPA00000279A - Mezcla de enzimas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sobrenadante de cultivo de la cepa IMI 378536 de Penicillium funiculosum, caracterizado porque el sobrenadante mejora la digestibilidad alimenticia cuando se añade al alimento en comparación con el alimento que no tiene el sobrenadante.

Description

MEZCLA DE ENZIMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un microorganismo novedoso, enzimas novedosas y mezclas de enzimas novedosas. Además, la presente invención se relaciona con la composición de la mezcla de enzimas, su preparación y su uso en las industrias de los forrajes, alimentos y otras, incluyendo, pero sin limitarse a la industria del papel y la industria textil.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enzimas han sido utilizadas durante mucho tiempo para una variedad de diferentes aplicaciones industriales. Se conocen ejemplos en la industria del pan, en la industria del vino y los jugos de frutas (donde las enzimas son utilizadas para degradar pectinas y ß-glucanos), en la industria textil (donde las celulasas son utilizadas para obtener telas celulósicas blandas y lisas) y también, la cual no es la única aplicación, para forrajes de animales. En este caso las enzimas mejoran la digestibilidad de fuentes vegetales . Este último uso permite que el ganado digiera el forraje de manera más eficiente. El valor de un forraje puede ser medido por la FCR (Relación de Conversión de Forraje) , REF.: 32486 una relación nutritiva de la cantidad de forraje consumido en relación a la ganancia de peso del animal. Una disminución en la FCR, para un forraje, indica que el animal gana proporcionalmente más peso para una cantidad dada de forraje; es decir, que el animal es capaz de utilizar el forraje de manera más eficiente. La pobre digestibilidad de los componentes del forraje (almidón, grasa, proteina/aminoácidos) es una característica notable de los forrajes a base de cereal y, por ejemplo, particularmente aquéllos que contienen un alto contenido de cebada o trigo. En esos casos puede ser necesario formular el forraje para que contenga altos niveles de energía y otras fuentes y otros suplementos tales como aminoácidos. Esas enzimas incrementan el valor de la Energía Metabolizable Aparente de los cereales incorporados en los forrajes . Otro método para resolver este problema ha sido agregar suplementos enzimáticos, celulosas, endo-1, 3 ( ) -ß-glucanasas (ß-glucanasas) , endo-1, 4-ß-xilanasas (xilanasas), etc., o mezclas de actividades enzimáticas, para esos forrajes a base de cereal. Los suplementos enzimáticos pueden tener un uso especifico para hidrolizar los ß-glucanos, o para hidrolizar los arabinoxilanos, encontrados en los cereales (típicamente en la cebada y el trigo) . La adición de enzimas tiene diferentes metas. Una ventaja que prueba claramente la eficacia de suplementos enzimáticos para forrajes es la reducción y la viscosidad de los materiales en el intestino de los animales que reciben el forraje a base de cereal que contiene el suplemento enzimático apropiado. La mayor viscosidad ' se debe en parte, a los ß-glucanos y los arabinoxilanos encontrados en la cebada y el trigo. La menor viscosidad, resultante de la acción enzimática, permite una absorción más fácil de los componentes nutricionales en el intestino del animal. La otra ventaja es la liberación de los nutrientes atrapados por las paredes celulares de los cereales disminuyendo el requerimiento de otros suplementos alimenticios costosos. En total el resultado es una reducción significativa del costo del forraje con un efecto similar o benéfico medido por la FCR. Han sido descritas preparaciones de enzimas originadas de una gama de diferentes microorganismos para mejorar la digestibilidad del forraje. Si consideramos la técnica anterior relacionada con el uso de enzimas en forrajes de animales podemos mencionar la Patente Europea No. 0.699.762 la cual describe el uso de una fitasa obtenida de. Schwanniomyces occidentalis. Esta fitasa es una fitasa obtenida de organismos modificados genéticamente mediante la inclusión de un gen clonado que quisiéramos evitar en la presente invención Si consideramos la solicitud de patente WO 96/26398, nuevamente se obtuvo una celulasa modificada mediante la inclusión de una secuencia de ADN extraña en una célula huésped la cual modifica la naturaleza de la cepa original que se eligió de la siguiente lista de microorganismos: - Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus. En la presente invención nuestro objetivo principal fue evitar la inclusión de un gen extraño de microorganismo que es el productor de la enzima. En la solicitud de patente WO 96/05739, se obtuvo una mezcla de enzimas (xilanasa, proteasa y, opcionalmente, ß-glucanasa) de diferentes microorganismos. Los autores dan ejemplos (página 5) de mezclas de enzimas con una relación de actividad de xilanasa a actividad de ß-glucanasa del orden del 1:5. Se ha encontrado que cuando se incluye una xilanasa en una dieta a base de cereal en o alrededor de su nivel de dosis óptima, la copresencia de enzimas que poseen actividad de ß-glucanasa incrementa la FCR del forraje, lo cual por supuesto es ventajoso. En consecuencia, los autores aconsejan ante la presencia del ß-glucanasa, recomendando una relación máxima de actividad de xilanasa a actividad de ß-glucanasa de 1:0-0.25. En algunos casos, para asegurar que todas las actividades enzimáticas relevantes para la aplicación en el forraje son presentes, se hacen preparaciones a partir de preparaciones de más de un microorganismo. En un número de casos se han obtenido preparaciones enzimáticas de microorganismos sometidos a modificación genética utilizando las técnicas del ADN recombinante. Nosotros hemos descubierto y desarrollada un nuevo microorganismo que pertenece a la clase de Penicillí um funi culosum, que contiene nuevas enzimas y una mezcla de actividades enzimáticas que pueden ser utilizadas exitosamente para incrementar principalmente la digestibilidad de forrajes de animales a base de cereal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, la presente invención se relaciona con un microorganismo novedoso derivado de Peni cilli um funi culosum y un método para cultivar este microorganismo y para recuperar las enzimas producidas por este microorganismo . Además, de acuerdo con esta invención, se proporciona nuevas enzimas obtenidas de este microorganismo, secuencias de ácidos nucleicos para las mismas y unas nuevas composiciones que contienen esas enzimas. Además, de acuerdo con esta invención, se proporciona un método para mejora la digestibilidad de los aminoácidos y de los forrajes de animales a base de aminoácidos y cereales. Otro objeto de la presente invención es la reducción de la excreción de fósforo y excreción de amoniaco de la bateria donde los animales son alimentados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. La nueva cepa de Penicillium funículo sum Esta nueva cepa del hongo Peni ci l li um funi cul osum está depositada bajo el número IMI 378536 con Autoridad de Depositario reconocida Internacionalmente bajo un tratado de Budapest (1977), el Instituto Micológico Internacional (IMI), Bakeham Lañe, Englefield Green, Egham Surrey, TW20 9TY, RU .

Filiación La nueva cepa ha sido obtenida del Péni ci l li um funi cul osum IMI 134756 después del tratamiento con radiaciones UV y ß sucesivas de esporas, incluyendo la selección de un medio selectivo. No se ha obtenido modificación genética por las técnicas de ADN recombinante que utilizan la inclusión de ADN o ARN extraño.

Identificación y Tipificación El Penicilli um funi culosum IMI 378536 ha sido caracterizado porque crece sobre el agar de Czapek Dox a 25°C. Las características micromorfológicas de la colonia son típicas del Peni cill i um funi culosum . La identificación del microorganismo como Peni cilli um funi culosum ha sido confirmada en el Instituto Micológico Internacional, Bakeham Lañe, Englefield Gree, Egham, Surrey, TW20 9TY, RU . El crecimiento es como un filtro basal, con crecimiento aéreo, como cuerdas o haces de hifas (funículos), el micelio es blanco con una coloración roja subyacente en el substrato, los márgenes son pálidos por la parte posterior pero coloreados hacia los centros y pueden volverse rojo obscuro. Este penicillium es típico, muestra conidioforos cortos principalmente surgiendo de las células funiculares, biverticiladas, acerosa conidiogenas, los conidios son elípticos y lisos. Los microorganismos son utilizados para la producción en la preparación enzimática de esta invención que crecen bajo condiciones aerobias en un medio en el cual contiene celulosa, licor macerado de maiz, carbonato de calcio y sulfato de amonio.

B . Proceso de fermentación El nuevo hongo se manufactura por fermentación en la cepa depositada por primera vez sobre un medio de cultivo preferiblemente constituido de (en peso) : - licor macerado de maiz 1% a 4% - antiespumante suficiente para evitar la espuma - agua hasta 100% - NaOH suficiente para ajustar el pH a aproximadamente a un pH 3.0 a 6.0 entes de la esterilización del medio; Temperatura de incubación de 27°C hasta 36°C. El medio de producción tiene preferiblemente la siguiente constitución (en peso) : - licor macerado de maiz 0 a 4.0 % celulosa en lote y 0.8 a 14% alimentada - sal de Ca 0 a 0.8% - Sulfato de Amonio 0 a 1.0 % - Antiespumante el suficiente para evitar la espuma - agua suficiente para obtener el 100% - NaOH suficiente para ajustar el pH a un pH de aproximadamente 3.0 a 6.0 antes de la esterilización del medio; - H2S04 suficiente para mantener el pH de aproximadamente 3.0 a 6.0; - Amoniaco como gas o liquido suficiente para mantener el pH a un pH de aproximadamente 3.0 a 6.0; Temperatura de incubación 27°C a 36°C. Para la fermentación, la carga del fermentador con agua suficiente, agregar los ingredientes al agua en un recipiente con agitación, adecuado, agitar hasta que los ingredientes se hayan disuelto. Esterilizar sellando el fermentador o elevando el contenido típicamente 121°C. El recipiente de fermentación es inoculado con el fermentador de cultivo . La fuente principal de carbono que se agrega durante el proceso de fermentación es la celulosa; entre las diferentes fuentes de celulosa preferimos utilizar ARBOCEL, SOLKAFLOC, CLAROCEL, ALPHACEL, FIBRACEL con diferentes grados . El pH durante la fermentación es controlado preferiblemente mediante la adición de ácido sulfúrico u otro ácido, y amoniaco en forma gaseosa o liquida, u otra base.

Al final del tiempo de fermentación, eliminar los sólidos por separación sólido-liquido tal como filtración o centrifugación, recolectar la fase liquida y concentrar por ejemplo por ultrafiltración por medio de una membrana orgánica o mineral. Las enzimas también pueden ser manufacturadas por medio de la tecnología del ADN recombinante y de este modo ser producidas por especies homologas o especies heterólogas recombinantes. El huésped para la transferencia del gen que codifica para la enzima puede seleccionarse de una especie de hongo, una célula bacteriana o una célula vegetal. Puede ser utilizada cualquier técnica convencional para insertar el gen que codifica para la enzima de interés en la célula huésped tal como plásmidos (integrados o no), vectores de fago y vectores virales. Los Peni cilli um funi culosum que comprenden la inclusión o modificación de genes heterólogos del genoma con genes homólogos por inclusión, supresión o modificación de tales genes homólogos son también parte de esta invención . De acuerdo con la invención, la enzima puede ser proporcionada como una preparación de enzima pura aislada o como una preparación cruda tal como el medio de cultivo en el cual a crecido el Penici lli um funi culosum . También puede ser posible incluir esta u otras enzimas en composiciones que contengan más de una enzima, el tipo de la cual dependerá del uso para el que se pretende la composición. Las enzimas agregadas pueden ser seleccionadas por ejemplo de carbohidrasas, lipasas y proteasas.

C. Composiciones de la "mezcla de actividades enzimáticas" 1. Composición liquida Para la composición liquida, después de la adición de los agentes antimi'crobianos se lleva a cabo la medición de la concentración de enzimas y la dilución correcta para reforzar el producto. La composición preferida de la solución liquida en peso es la siguiente: - Productos microbianos como sólidos 4%-10% orgánicos totales - agente antimicrobiano 0, 005%-0, 35' de manera preferible 0,01%-0,25% - sorbitol 20%-50% - agentes anticongelantes eventualmente 0-40% de manera más preferible 15%-40% - Caldo de fermentación filtrado y 0.3 a 76% concentrado - Amortiguado y ajustado a pH de 3 a 5 0.3 a 76% Los antimicrobianos se eligen de productos tales como el ácido sórbico y sus sales, ácido benzoico y sus sales, 4-hidroxibenzoato de metilo y 4-hidroxibenzoato de n-propilo, ácido fumárico, sales y esteres. También pueden ser utilizadas sales como el cloruro de sodio o cloruro de potasio . Los agentes anticongelantes más preferidos son el 1, 2-propandiol, etilen glicol, glicerol. 2. Composición en polvo Para las preparaciones en polvo, la solución concentrada obtenida es secada eventualmente con la presencia de un portador. El polvo obtenido después de secar la solución concentrada en ausencia de un portador puede ser mezclado adicionalmente con un portador adecuado. La composición preferida en forma de polvo es la siguiente : Productos microbianos como sólidos 16%-40% orgánicos totales Portador 59%-83% - otros componentes del caldo de 1% fermentación seco Los portadores preferidos se eligen de harina de trigo, almidón, yeso, maltodextrina, sólidos de maiz, subproductos del procesamiento de cereales tales como partículas de maiz, trigo de calidad media, salvado de trigo, residuos de centeno, mezclas de minerales.

Fr= s strato - Taqua Fr = Tsustrat - Taqua D. Caracteristicas de la enzima ¿prueba ~ -¡- gua ¿prueba ~ ¿agua Obtuvimos mezclas de enzimas novedosas producidas por Peni ci ll i um funi culosum . Estas mezcla de enzimas contiene nuevas enzimas tales como celulasas, ß-glucanasas, xilanasas, enzimas accesorias de la xilanasa tales como la arabinofuranosidasa y feruloil esterasas. 1. Procedimiento La preparación de enzimas se caracterizó por ensayos que incluyen los ensayos para las actividades de celulasa, celobiohidrolasa, ß-glucosidasa, endo-1 , 3 ( ) -ß-glucanasa, laminarinasa endo-1, 4-ß-xilanasa (utilizando diferentes sustratos), ß-xilosidasa, arabinofuranosidasa y feruloil esterasa (utilizando diferentes sustratos). 1. 1. Celulasa por el método DNS CMC El ensayo para la actividad de la celulasa se basó en la hidrólisis enzimática de los enlaces glicosidicos en la carboximetilcelulosa (CMC), un ß-1, glucano. Los productos de la reacción, oligosacáridos de ß-1, glucano, se determinaron a partir del incremento resultante en el valor reductor (como glucosa) . Una solución que contenia 1 ml de una solución de CMC al 1% (peso/volumen) en amortiguador de acetato de sodio 0.1M, pH 5.0 (o a diferentes valores de pH) ; 1 ml de solución de enzima apropiadamente diluida se incubó a 50°C durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 2 ml de una solución de DNS (ácido 3, 5-dinitrosalicilico al 1.6% (peso/volumen), hidróxido de sodio al 1.6% (peso/volumen), (+) -tartrato de sodio y potasio al 30% (peso/volumen) en agua destilada). La solución se mezcló y colocó en un baño de agua hirviente, a 95°C como minimo, durante 5 minutos y a continuación se enfrió a 25°C. Se agregaron 10 ml de agua destilada a la solución y se midió la absorbancia a .540 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso de 2 cm.

El resultado se convirtió a µmoles de azúcar reductora (como glucosa) mediante la comparación con una curva estándar para 2 ml de soluciones de glucosa al 0.00 - 0.04% (peso/volumen) tratadas con solución de DNS en una forma equivalente. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de DNS se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de celulosa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de equivalentes .min"1 de glucosa bajo las condiciones del ensayo (10°C y pH de 5.0 u otro pH) . 1.2 Celobiohidrolasa por el método del p-n±trofenll ß-D-celobiopl anos Ido El ensayo celobiohidrolasa se basó en la hidrólisis enzimática del p-nitrofenil ß-D-celobiopiranósido . Un producto de la reacción, el p-nitrofenol se determinó colorimétricamente . Una solución que contenia 1 ml de un p-nitrofenil ß-D-celobiopiranósido a.l 0.1% (peso/volumen) en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de amortiguador de acetato de sodio 0.2M, pH 5.0; 1 ml de solución de enzima diluida apropiadamente se incubó a 50°C durante 30 minutos.

La mezcla de reacción se detuvo mediante la adición de 4 ml de solución de glicina 0.4M. La solución se mezcló y enfrió a 20°C. La absorbancia se midió a 400 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 1 cm. El resultado se convirtió a µmoles de p-nitrofenol comparando con el coeficiente de extinción molar del p-nirtofenol bajo esas condiciones. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de glicina se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de celobiohidrolasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil ß-D-celobiopiranósido por minuto bajo las condiciones del ensayo (50°C y pH de 5.0). 1. 3 ß-Glucosidasa por el método del p-nitrofenil ß-D-glucopir anos ido El ensayo ß-glucosidasa se basó en la hidrólisis enzimática del p-nitrofenil ß-D-celobiopiranósido. Un producto de la reacción, el p-nitrofenol se determinó colorimétricamente . Una solución que contenia 1 ml de un p-nitrofenil ß-D-celobiopiranósido al 0.1% (peso/volumen) en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de amortiguador de acetato de sodio 0.2M, pH 5.0; 1 ml de solución de enzima diluida apropiadamente se incubó a 50°C durante 30 minutos. La mezcla de reacción se detuvo mediante la adición de 4 ml de solución de glicina 0.4M. La solución se mezcló y enfrió a 20°C. La absorbancia se midió a 400 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 1 cm. El resultado se convirtió a µmoles de p-nitrofenol comparando con el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol bajo esas condiciones. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de glicina se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de ß-glucosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil ß-D-celobiopiranósido por minuto bajo las condiciones del ensayo (50°C y pH de 5.0) . 1. 4 Endo-1 , 3 (4) -ß-glucanasa por el método del ß-glucano de cebada con DNS Un ensayo para la actividad de la endo-1, 3 (4 ) -ß-glucanasa se basó en la hidrólisis enzimática de los enlaces glicosídicos en el ß-glucano de cebada, un ß-1 , 3 ( ) -glucano .

Los productos de la reacción, oligosacáridos de ß-1, 3 (4) glucano, se determinaron a partir del incremento resultante en el valor reductor (como glucosa) . Una solución que contenia 1 ml de una solución de ß-glucano de cebada al 1% (peso/volumen) en amortiguador de acetato de sodio 0.1M, pH 5.0 (o a diferentes valores de pH) ; 1 ml de solución de enzima apropiadamente diluida se incubó a 50°C durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 2 ml de una solución de DNS (ácido 3, 5-dinitrosalicilico al 1% (peso/volumen), hidróxido de sodio al 1.6% (peso/volumen), (+) -tartrato de sodio y potasio al 30% (peso/volumen) en agua destilada) . La solución se mezcló y colocó en un baño de agua hirviente, a 95°C como minimo, durante 5 minutos y a continuación se enfrió a 25°C. Se agregaron 10 ml de agua destilada a la solución y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 2 cm. El resultado se convirtió a µmoles de azúcar reductora (como glucosa) mediante la comparación con una curva estándar para 2 ml de soluciones de glucosa al 0.00 -0.04% (peso/volumen) tratadas con solución de DNS en una forma equivalente. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de DNS se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de endo-1, 3 (4 ) -ß-glucanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de equivalentes .min"1 de glucosa bajo las condiciones del ensayo (10°C y pH de 5.0 u otro pH) . 1. 5 Endo- 1, 3 (4) -ß-glucanasa por el método del azo ß-glucano de cebada Un ensayo para la actividad de la endo-1 , 3 ( 4 ) -ß-glucanasa se basó en la hidrólisis enzimática del ß-glucano de cebada el cual tiene un cromóforo unido (azo ß-glucano de cebada). Los productos de la reacción, los oligómeros que son solubles después de la precipitación con etanol, se determinaron a partir del incremento resultante en la absorbancia a 590 nm. Und solución que contenia 0.5 ml de sustrato de azo ß-glucano de cebada (forma lista para usarse) y 0.2 ml de dilución de enzima (que contenia entre 0.15 a 0.60 unidades .ml"1 en 0.01M de amortiguador de acetato de sodio, 0.01M, pH 4.6) se incubó a 30°C durante 20 minutos exactamente. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 2.5 ml de solución de precipitación (que contenia 18.1 g de acetato de sodio y 3.0 de zinc mezclado con 300 ml de agua destilada cristalina, el pH se ajustó a pH 5.0 con ácido clorhídrico, el contenido se transfirió a un matraz volumétrico de 1 1 y se aforó hasta el volumen con etanol al 96% en volumen/volumen) . La solución se mezcló y dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solución se transfirió a un tubo de centrifuga y se centrifugó a 1000 g durante 10 minutos en una centrifuga de banco. La absorbancia del sobrenadante se midió a 590 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 1 cm. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la Solución de Precipitación se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de endo-1, 3 ( 4 ) -ß-glucanasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza el sustrato para dar una absorbancia de 0.820 unidades a 590 nm, utilizando un sustrato estándar, bajo las condiciones del ensayo (30°C y pH de 4.6). 1. 6 Laminarinasa (endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa) por el método de lamina Ina con DNS El ensayo para la actividad de la laminarinasa (endo-1, 3 (4 ) -ß-glucanasa) se basó en la hidrólisis enzimática de los enlaces glicosidicos en laminarina, un ß-1, 3-glucano .

Los productos de la reacción, oligosacáridos de ß-1, 3 glucano, se determinaron a partir del incremento resultante en el valor reductor (como glucosa) . Una solución que contenia 1 ml de una solución de laminarina al 1% (peso/volumen) en amortiguador de acetato de sodio 0.1M, pH 5.0; 1 ml de solución de enzima apropiadamente diluida se incubó a 50°C durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 2 ml de una solución de DNS (ácido 3, 5-dinitrosalicilico al 1% (peso/volumen), hidróxido de sodio al 1.6% (peso/volumen), (+) -tartrato de sodio y potasio al 30% (peso/volumen) en agua destilada) . La solución se mezcló y colocó en un baño de agua hirviente, a 95°C como minimo, durante 5 minutos y a continuación se enfrió a 25°C. Se agregaron 10 ml de agua destilada a la solución y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 2 cm. El resultado se convirtió a µmoles de azúcar reductora (como glucosa) mediante la comparación con una curva estándar para 2 ml de soluciones de glucosa al 0.00 - 0.04% (peso/volumen) tratadas con solución de DNS en una forma equivalente. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia n-o especifica llevando a cabo una reacción en la cual, la solución de DNS se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de laminarinasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de equivalentes .min"1 de glucosa bajo las condiciones del ensayo (50°C y pH de 5.0). 1. 7 Endo-l, 4-ß-xilanasa por el método del xilano de abedul con DNS Un ensayo para la actividad de la endo-l,4-ß-xilanasa se basó en la hidrólisis enzimática de los enlaces xilosidicos en el xilano de abedul, un ß-1 , 4-xilano . Los productos de la reacción, oligosacáridos de ß-1, 4 xilano, se determinaron a partir del incremento resultante en el valor reductor (como xilosa) . Una solución que contenia 1 ml de una solución de xilano de abedul al 1% (peso/volumen) en amortiguador de acetato de sodio 0.1M, pH 5.0 (o a diferentes valores de pH) ; 1 ml de solución de enzima apropiadamente diluida se incubó a 50°C durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 2 ml de una solución de DNS (ácido 3, 5-dinitrosalicilico al 1% (peso/volumen), hidróxido de sodio al 1.6% (peso/volumen), (+) -tartrato de sodio y potasio al 30% (peso/volumen) en agua destilada) . La solución se mezcló y colocó en un baño de agua hirviente, a 95°C como minimo, durante 5 minutos y a continuación se enfrió a 25°C.

Se agregaron 10 ml de agua destilada a la solución y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 2 cm. El resultado se convirtió a µmoles de azúcar reductora (como xilosa) mediante la comparación con una curva estándar para 2 ml de soluciones de xilosa al 0.00 - 0.03% (peso/volumen) tratadas con solución de DNS en una forma equivalente. La absorbancia de la reacción enzimatica observada se corpgió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de DNS se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de endo-1, 4-ß-x?lanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de equivalentes .mm"1 de xilosa bajo las condiciones del ensayo (50°C y pH de 5.0 u otro pH) . 1. 8 Endo-1 , 4-ß-xilanasa por el método del arabinoxilano de trigo con DNS Un ensayo para la actividad de la endo-l,4-ß-xilanasa se baso en la hidrólisis enzimática de los enlaces xilosidicos en el arabinoxilano de trigo, una arabinosa sustituida por ß-1, 4-x?lano. Los productos de la reacción, oligosacáridos de ß-1, 4-x?lano, se determinaron a partir del incremento resultante en el valor reductor (como xilosa).

Una solución que contenia 1 ml de una solución de arabinoxilano de trigo al 1% (peso/volumen) en amortiguador de acetato de sodio 0.1M, pH 5.0 (o a diferentes valores de pH) ; 1 ml de solución de enzima apropiadamente diluida se incubó a 50QC durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 2 ml de una solución de DNS (ácido 3, 5-dinitrosalicilico al 1% (peso/volumen), hidróxido de sodio al 1.6% (peso/volumen), (+) -tartrato de sodio y potasio al 30% (peso/volumen) en agua destilada). La solución se mezcló y colocó en un baño de agua hirviente, a 95°C como minimo, durante 5 minutos y a continuación se enfrió a 25°C. Se agregaron 10 ml de agua destilada a la solución y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando una 'celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 2 cm. El resultado se convirtió a µmoles de azúcar reductora (como xilosa) mediante la comparación con una curva estándar para 2 ml de soluciones de xilosa al 0.00 - 0.03% (peso/volumen) tratadas con solución de DNS en una forma equivalente . La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de DNS se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de endo-1, 4-ß-xilanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de equivalentes . min"1 de xilosa bajo las condiciones del ensayo (50°C y pH de 5.0 u otro pH) . 1. 9 Endo-1, 4-ß-xilanasa por el método viscométrico del araboxilano de trigo Un ensayo para la actividad de la endo-l,4-ß-xilanasa se basó en la hidrólisis enzimática de una solución de arabinoxilano de trigo estándar, la actividad se determinó por la reducción de la viscosidad relativa contra el tiempo. Una solución que contenia 1 ml de una solución de arabinoxilano de trigo al 1% (pero/volumen) en amortiguador de acetato de sodio 0.1M, pH 5.5 (o a valores de pH diferentes); 3 ml de agua destilada y 1 ml de solución de enzima diluida apropiadamente se inyectó en un microviscosimetro de Haake (utilizando una esfera de vidrio calibrada a 0.1 - 2.0 mPa.s) y se midió el tiempo de caida de la esfera [ Tprueba ) (en ms sobre la longitud de caida definida) cada 30 segundos durante un periodo de 15 - 20 minutos a 30°C. Se midieron los tiempos promedio de caida para la esfera de agua (5 ml de agua destilada) y sustrato (1 ml de una solución de arabonoxilano de trigo al 1% (peso/volumen) en amortiguador de acetato de sodio al 0.1M, pH 5.5 y 4 ml de agua destilada) como Tagua y Ts?stra t0 respectivamente. Los controles se midieron de manera equivalente. Se calculó la fluidez relativa [ Fr) por cada valor de TprUeba como sigue: p?-— ¿sustrato ¿agua ¿prueba ~ ¿agua Se calculó la pendiente de una gráfica de Fr contra el tiempo (e tiempo transcurrido al cual se hizo cada medida de Tprueba ) en relación al cambio de fluidez por minuto [AFr. min'1 y es proporcional a la concentración de enzima. Una unidad de endo-1, 4-ß-xilanasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza al sustrato, reduciendo la viscosidad de la solución, para dar un cambio en la fluidez relativa de 1 (unidad dimensional) .min"1 bajo las condiciones del ensayo (30°C y pH 5.5 u otro pH) . 1. 10 ß-Xilosidasa por el método del p-nitrofenil ß-D-xilopiranósido El ensayo la ß-xilosidasa se basó en la hidrólisis enzimática del p-nitrofenil ß-D-xilopiranósido. Un producto de la reacción, el p-nitrofenol se determinó colorimétricamente . Una solución que contenia 1 ml de un p-nitrofenil ß-D-xilopiranósido al 0.1% (peso/volumen) en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de amortiguador de acetato de sodio 0.2M, pH 5.0; 1 ml de solución de enzima diluida apropiadamente se incubó a 50°C durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 4 ml de solución de glicina 0.4M. La solución se mezcló y enfrió a 20°C. La absorbancia se midió a 400 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 1 cm. El resultado se convirtió a µmoles de p-nitrofenol comparando con el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol bajo esas condiciones. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de glicina se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de xilosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil ß-D-xilopiranósido por minuto bajo las condiciones del ensayo (50°C y pH de 5.0) . 1. 11 a-N-Arabinofuranosidasa por el método del p-nitrofenil a-L-arabino fur anos ido El ensayo la a-N-arabinofuranosidasa (arabinofuranosidasa ) se basó en la hidrólisis enzimática del p-nitrofenil a-L-arabinofuranósido. Un producto de la reacción, ei p-nitrofenol se determinó colorimétricamente . Una solución que contenia 1 ml de un p-nitrofenil a-L-arabinofuranósido al 0.1% (peso/volumen) en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de amortiguador de acetato de sodio 0.2M, pH 5.0; 1 ml de solución de enzima diluida apropiadamente se incubó a 50°C durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 4 ml de solución de glicina 0.4M. La solución se mezcló y enfrió a 20°C. La absorbancia se midió a 400 nm utilizando una celda de vidrio con una longitud de paso óptico de 1 cm. El resultado se convirtió a µmoles de p-nitrofenol comparando con el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol bajo esas condiciones. La absorbancia de la reacción enzimática observada se corrigió para la absorbancia no especifica llevando a cabo una reacción en la cual la solución de glicina se agregó a la mezcla antes de la solución de enzima. Una unidad de actividad de arabinofuranosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil a-L-arabinofuranósido por minuto bajo las condiciones del ensayo (50°C y pH de 5.0). 1.12 Feruroil esterasa por el método FAXX Un ensayo de la feruloil esterasa (ácido ferúlico esterasa) se basó en la hidrólisis enzimática de la 0- [ 5- 0- [ trans-feruloil) -a-L-arabinofuranosil] - (1—»3) -O-ß-D-xilopira-nosil- ( 1—>4 ) -D-xilopiranosa (FAXX). La FAXX se preparó a partir de salvado de trigo hidrolizado enzimáticamente, purificado y caracterizado por RMN. La hidrólisis de la FAXX se midió espectrofotométricamente. La reacción enzimática se siguió a 325 nm, utilizando una celda con una longitud de paso óptico de 1 cm, en una solución que contenia FAXX 0.50mM en amortiguador MOPS 0.1M, pH 6.0 a 37°C. Una unidad de actividad de feruloil esterasa sobre la FAXX se define como la cantidad de enzima que convierte 1 µmol de sustrato a producto por minuto bajo las condiciones del ensayo (37°C y pH 6.0). 1 . 13 Feruroil esterasa por el método Ara¿F Un ensayo de la feruloil esterasa (ácido ferúlico esterasa) se basó en la hidrólisis enzimática de la Ara2F (ácido ferúlico ligado a arabinosa en las posiciones 1,2). El Ara2F se preparó a partir de pulpa de remolacha azucarera hidrolizada enzimáticamente, purificada y caracterizada por RMN. La hidrólisis de la Ara2F se midió espectrofotométricamente . Una reacción enzimática se siguió a 325 nm, utilizando una celda con una longitud de paso óptico de 1 cm, en una solución que contenia Ara2F 0.50mM en amortiguador MOPS 0.1M, pH 6.0 a 37°C. La unidad de actividad de feruloil esterasa sobre el Ara2F se define como la cantidad de enzima que convierte 1 µmol de sustrato a producto por minuto bajo las condiciones del ensayo (37°C y pH 6.0). 1 . 14 Feruoil esterasa por la hidrólisis de metil esteres : métodos del ácido metil ferúlico (MFA) ; ácido metil cafeico (MCA) ; ácido metil sinápico (MSA) ; ácido metil p-cumárico (MpCA) Un ensayo de la feruloil esterasa (ácido ferúlico esterasa) se basó en la hidrólisis enzimática de los metil esteres del ácido ferúlico (MFA) ; ácido cafeico (MCA) ; ácido sinápico (MSA) y ácido p-cumárico (MpCA) . La hidrólisis del metil éster se midió en amortiguador MOPS 0.1M, pH 6.0 a 37°C. Los ensayos se basaron en dos técnicas diferentes. En el método espectrofotométrico la concentración de sustrato de metil éster es de O.lOmM y la hidrólisis del éster se siguió a 325 nm utilizando una celda con una longitud de paso óptico de 1 cm. En este método la concentración del sustrato inicial es limitada. En el método por CLAR, la concentración del sustrato de metil éster es de 1. OmM y la hidrólisis del éster es seguida por la medición de liberación del ácido libre por CLAR después de intervalos de 10 - 30 minutos. En este método no existe limite sobre la concentración del sustrato y las actividades medidas son considerablemente mayores que aquellas para el método espectrofotométrico. Una unidad de actividad de feruloil esterasa se define como la cantidad de enzima que convierte 1 µmol de sustrato a producto por minuto bajo las condiciones del ensayo (37°C y pH 6.0) . 1. 15 Concentración de proteína por medio del ensayo de modificado de Bradford de proteína de unión con azul de Coomassie .

El ensayo de la concentración de proteina se basa en el ensayo modificado de Bradford de proteina de unión con azul de Coomassie utilizando un azul brillante G (azul de Coomassie) medido en un espectrofotometro a 595 nm utilizando cubetas de vidrio de trayectoria de luz de 1 cm. El método (Sigma B6916) se estandariza al utilizar albúmina de suero de bovino (Sigma P 0914) . 1. 16 Punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico. Los puntos isoeléctricos de las proteinas se determinan por métodos estándar utilizando geles de poliacrilamida al 5. prevaciados en forma vertical tales como geles de NOVEX" para un pH de 3-10 (intervalo de funcionamiento pl 3.5-8.5) o pH de 3-7 (intervalo de funcionamiento pl 3.0-6.5) en la minicelda NOVEXR Xcell 11™ El cátodo, ánodo NOVEX" y los amortiguadores de muestra IEF para un pH 3-10 o un pH 3-7 son utilizados. El protocolo estándar NOVEXR para en enfoque isoeléctrico, fijación, y tinción con tinción de azul de Coomassie R-250 y un agente de destinción son utilizados. 1. 17 SDS-PAGE (Electro foresis en gel de poliacrilamida de dodecil fosfato de sodio) La separación analítica y la determinación del peso molecular de proteinas se lleva a cabo por métodos estándar SDS-PAGE. Se utilizan geles de prevaciado NOVEX (Amortiguadores de corrimiento NuPAGE™ geles de Bis-Tris NuPAGE™ o geles de Tris-Acetato NuPAGE™ con NOVEX recomendados) en minicelda N0VEXR Xcell II™ . La preparación de la muestra NOVEXR y los amortiguadores de corrimiento, y los estándares de peso molecular son utilizados. El protocolo estándar NOVEXR para SDS-PAGE, fijación, tinción con tinción de azul de Coomassie R-250 y destinción, son utilizados. 2. Resultados en la mezcla de enzimas 2.1 pH óptimo 2.1.1 Actividad de la endo-1 , 3 (4) -ß-glucanasa El ensayo de la endo-1 , 3 ( 4 ) -ß-glucanasa del Penicilli um funiculosum se llevo a cabo bajo condiciones estándar a 50°C utilizando el método de ß-glucano de cebada con DNS. La actividad de la enzima se midió entre el pH 3.0 y pH 7.0. El pH óptimo para la actividad de la enzima pH 4.0 - 5.0. 2.1.2 Actividad de la endo-1 , 4-ß-xilanasa El ensayo de la endo-1, 4-ß-xilanasa de Penicilli um funi culosum bajo condiciones estándar a 50°C utilizando el método de xilano de abedul con DNS. 2.2.1 Temperatura Óptima 2.2.1 Actividad de la endo-1 , 3 (4) -ß-glucanasa El ensayo de la endo-1 , 3 (4 ) -ß-glucanasa de Peni cil l i um funi culosum se llevó a cabo bajo condiciones estándar a pH 5.0 (el pH óptimo para esta enzima) utilizando el método de ß-glucano de cebada con DNS. La actividad enzimática se midió entre 30 y 70 °C. La temperatura óptima se encuentra entre 50 y 60°C con la mayor actividad siendo medida a 60°C. Los resultados en detalle, son dados en forma de una tabla vs . temperatura. 2.2.2 Actividad de la endo-1 , 4-ß-xilanasa El ensayo de la endo-1, -ß-xilanasa de Peni ci l l i um funiculosum se llevó a cabo bajo condiciones estándar a pH 5.5 y pH 3.5 utilizando el método de xilano de abedul con DNS. La actividad enzimática se midió entre 30 y 70°C. La temperatura óptima se encuentra entre 50 y 60°C con la mayor actividad siendo medida a 50°C para pH 5.5 y a 60°C para pH 3.5. Los resultados en detalle, se da en forma de una tabla vs . temperatura.

Las enzimas producidas por Peni cilli um funi cul osum tienen altos niveles de celulasa, endo-1, 3 (4 ) -ß-glucanasa y otras actividades glicanoliticas . Además, también se caracterizan por tener altos niveles de endo-1 , 4-ß-xilanasa y actividades de enzimas accesorias de la xilanasa. El amplio espectro de enzimas hemicelulóticas es una característica de las preparaciones enzimáticas de este microorganismo. Cada actividad medida puede reportarse como una relación a la mayor actividad para esa preparación. Un ejemplo de los resultados obtenidos se muestra en la tabla A. Esas relaciones pueden cambiar en las preparaciones de diferentes lotes de fermentación.

Tabla A: Actividades relativas a diferentes substratos relevantes Tabla A: Actividades relativas a diferentes substratos relevantes (continuación) Tabla A: Actividades relativas a diferentes substratos relevantes (continuación) Métodos utilizados en las Resultados con Penicillium pruebas funiculosum Endo-1, 4-ß-xilanasa (método 8.67 del arabinoxilano de trigo con DNS, pH 5.5) [1.9] Endo 1, 4-ß-xilanasa (método 9.80 viscométrico con arabinoxilano de trigo, pH 5.5) [1.9] ß-Xilosidasa (método de p- 0.0047 nitrofenil-ß-D- xilobiopiranósido) [1.10] a-N-arabinofuranosidasa 0.0017 ¡método del p-nitrofenil-a-L- arabinofuranósido) [1.11] Feruloil estereasa (método de 0.000254 la FAXX) [1.12] Feruloil esterasa (método del 0.000349 Ara2F) [1.13] Feruloil esterasa (método 0.000135 espectrofotométrico del MFA) [1.14] Tabla A: Actividades relativas a diferentes substratos relevantes (continuación) 3. Propiedad de los componentes en la mezcla de enzimas 3. 1 Método de Purificación Cromatografía de Integración Hidrofóbica La preparación obtenida después de la filtración y concentración de un medio de fermentación, a una concentración de aproximadamente 112.6 mg/ml, se diluyó 1/1 con un Integrador de Cromatografia Hidrofóbica amortiguador (HIC) (amortiguador de fosfato 50 mM, pH 7.0/1.7 M (NH4) 2S04/azida de sodio 0.04%),. se intercambio un amortiguador HIC (PD-10 columnas; Farmacia) . Se aplicaron porciones (10 ml) en la columna (10 x 5 cm diámetro, 200 ml) de HIC de alto funcionamiento de PhenilSepharoseMR (Pharmacia) y se separaron utilizando un gradiente de concentración de sulfato de amonio reductor (NH4)2S04) (1.7 - 0.0 M) a 10 ml/min. Se recolectaron fracciones (10 ml) y se ensayaron para la actividad de la xilanasa. La HIC da dos picos mayores de actividad de xilanasa. El primero, nombrado A, eluyó de la columna cuando la concentración del NH4)2S04 se redujo a aproximadamente a 0.6 M, mientras que el segundo, nombrado B, eluyó a una concentración de M NH4)2S04 a aproximadamente 0.25 M. Las fracciones que comprenden los picos A y B de cada inyección pueden ser reunidas por separado. Cada fracción mayúscula correspondiente al 2.8% de la actividad de xilanasa total mientras que la fracción B correspondió a 97.2% de la actividad de xilanasa total. El rendimiento fue del 77%.

Cromatografía de Intercambio Iónico Las fracciones reunidas para los picos A y B de la HIC donde precipitaron incrementando concentración de (NHy])2S04 con una saturación del 100% seguida por centrifugación (10 OOOxg durante 30 minutos).. Los sedimentos se redisolvieron en amortiguador 'Tris-HCl 20mM de amortiguador, pH 8.0/azida de sodio al 0.04% y se desalaron con el mismo amortiguador utilizando columnas de PD-10. Las muestras (5 ml) fueron aplicadas a una columna de intercambio aniónico Monómero QMR 10/10 (Pharmacia) previamente equilibrado con un amoriguador de Tres-HCl 20 mM, pH 8.0/ácido de sodio al 0.04% y se eluyó a 2 ml/min con una concentración creciente de cloruro de sodio (NaCl (0 - 1 M) en el mismo amortiguador. Se recolectaron fracciones (2ml) y ensayaron para la actividad de la xilanosa.

Pico A: La separación del pico A por cromatografia de intercambio aniónico da un solo pico de actividad de xilanasa la cual eluyó a aproximadamente 0.3M de NaCl. Las fracciones más activas fueron reunidas y analizadas por SDS-PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida dodeciisulfato de sodio) . Esta mostró una sola banda mayor con un peso molecular de 48 kDa. La recuperación de la actividad de xilanasa después de IEF (enfoque isoeléctrico) confirmó que esta banda teñida por Coomassie principal era una xilanasa.

Pico B: La separación del pico B por cromatografia de intercambio iónico da dos picos mayores de actividad xilanasa, uno de los cuales se eluyó al vacio (material no unido; pico B-I) y el otro a NaCl 0.1 M (pico B-II). También hubieron dos picos menores que eluyeron a 0.13 M y 0.19 M de NaCl. Las fracciones activas que corresponden a cada pico fueron reunidas y analizadas por SDS-PAGE, pero ninguna de las muestras estuvo pura.

Cromatografia por filtración en gel Las fracciones reunidas que comprenden B-I y B-II fueron liofilizadas, redisueltas en agua, y desaladas (utilizando columnas PD-10) . Las muestras (0.2ml) se aplicaron a una columna SuperdexMR columna 75 HR (Pharmacia) y se eluyeron a 0.4 ml/minuto con amortiguador de Bis-Tris 20 mM, pH 6.0/NaCL 0.2 M /azida de sodio al 0.04%. Se recolectaron fracciones (0.4 ml) y se ensayaron para la actividad de la xilanasa. 3.2 Propiedades de la xilanasa 3.2.1 Punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico Los puntos isoeléctricos de la proteina se determinaron por los métodos estándar utilizando geles de poliacrilamida al 5% prealineados verticalmente de NOVEX® para pH 3 - 10 y pH 3 - 7. Se utilizaron cátodos, ánodos NOVEX y amortiguadores de muestra e IEF, y un protocolo estándar para el enfoque isoeléctrico, fijando la tinción con tinción de azul de Coomassie R-250 y se destiño. Para la xilanasa A, se utilizó una muestra seguida de MonoQ. Para las xilanasas B-I y B-II, se utilizó una muestra de xilanasa B seguida por HIC. Para cada una de A y B, se cargó una pequeña muestra (10 µl ) en un solo pozo y se cargó una muestra grande (50 µl) en un pozo triple. Después de someter a enfoque las muestras, el gel se cortó a la mitad, de modo que una mitad contenia las dos pequeñas muestras (A+B) y los marcadores del peso molecular (esta mitad se tiñó con Coomasie) , mientras qué la otra mitad contenia la dos muestras grandes. La mitad del gel que contenia las muestras grandes se cortó para separar los dos carriles de muestra, y posteriormente cada carril se fraccionó en piezas de 2 mm. Cada pieza de 2 mm se sumergió por separado durante la noche en amortiguador MOPS 100 mM, pH 6.0/azida de sodio al 0.04%. Las fracciones fueron ensayadas para la actividad de la xilanasa. Para la muestra A de xilanasa, el gel IEF mostró una sola banda mayor con un marcador de pl de 3.55 y una cuantas bandas contaminantes menores. Únicamente se encontró actividad de xilanasa en la fracción correspondiente a esta banda, confirmando la banda mayor de xilanasa. Para la muestra B de xilanasa, el gel IEF teñido indica varias bandas sobre un intervalo de valores de pl . La actividad de xilanasa ocurrió en dos porciones separadas del gel no teñido, y corresponde a las proteinas de pl 4.2 y 4.8. 3.2.2 Peso molecular por SDS-PAGE Para confirmar los pesos moleculares de las xilanasas en el pico B de la HIC, las fracciones con la actividad de xilanasa eluidas del gel IEF fueron desaladas, liofilizadas, y separadas por SDS-PAGE. La PAGE desnaturalizante se efectuó utilizando geles de Tris-glicina al 10% (NOVEX®) con ditiotreitol (DTT 50 mM) incluido en el amortiguador de muestra como un agente reductor. El gel teñido indica que ambas xilanasas estaban puras, con pesos moleculares de 36 kDa y 15 kDa para la xilanasa B-I y la xilanasa B-II respectivamente. Las tres xilanasas purificadas fueron sometidas a análisis por SDS-PAGE: la fracción A de la xilanasa después de la cromatografia de intercambio aniónico, las fracciones de la xilanasa' B-I y B-II después de la cromatografia por filtración sobre gel. La xilanasa A dio una sola banda con un peso molecular de 48 kDa. La xilanasa B-I dio una banda mayor y cuatro menores después de la tinción con Coomasie. Las bandas mayores fueron confirmadas como la xilanasa puesto que son de un peso molecular de 36 kDa. La pureza se estimó al 90%. La xilanasa B-II dio una banda mayor con un peso molecular de 15 kDa y 2-3 bandas menores. Esta xilanasa es aproximadamente 95% pura. 3.2.3 Actividad Enzimática Las pruebas para la medición de la actividad enzimática se describieron anteriormente. 3.2.3.1 Análisis de la xilanasa A [Proteina] 0.4 (mg/ml) nd no determinado n/a no aplicable Actividad de la xilanasa sobre xilano de abedul vs pH Actividad de la xilanasa sobre xilano de abedul vs pH (continuación) 3.2.3.2 Análisis de la xilanasa B-I [ Proteina] 0.096 (mg/mi; nd no determinado n/a no aplicable Actividad de la xilanasa sobre xilano de abedul vs pH Actividad de la xilanasa sobre xilano de abedul vs pH ¡continuación) 3.2.3.3 Análisis de la xilanasa B-II [Proteina] 0.165 (mg/ml) nd no determinado n/a no aplicable Actividad de la xilanasa sobre xilano de abedul vs pH 3.2.4 Secuencias Una modalidad de la presente invención se relaciona con las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de las proteinas descritas anteriormente o sus variantes. Para este propósito, las secuencias para las xilanasas se identificaron a partir de secuencias de aminoácidos de proteinas purificadas (xilanasa A, xilanasa B- I y xilanasa B-II) y de la comparación de secuencias de aminoácido y nucleótido de xilanasas de hongos conocidas. Debe comprenderse para los propósitos de la invención que las variantes se refieren a cualquier polipéptido o cualquier fragmento de proteina, proteina análoga o proteina derivada o mutante de la proteina o polipéptido nativo y que tenga las mismas funciones biológicas que la proteina o polipéptido nativo. Pueden existir diferentes variantes en estado natural. Aquellas variantes pueden ser por ejemplo variaciones alélicas caracterizadas por diferencias en las secuencias de los genes que codifican para la proteina o pueden resultar de diferentes empalmes o de modificaciones de postraducción. Las variantes pueden obtenerse por sustitución, supresión, adición y/o modificación de uno o más de los aminoácidos. Todas las modificaciones son bien conocidas y pueden ser efectuadas por cualesquier métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las variantes son moléculas que tienen por ejemplo más afinidad por su sustrato o que tienen nuevas propiedades biológicas . Otro objeto de la presente invención es también el uso de las secuencias para la expresión de las proteinas o polipéptidos descritos en células huésped de organismos uni o pluricelulares. Para este propósito, las secuencias pueden estar comprendidas en el genoma de un vector. El vector puede ser un plásmido, un fago o un virus. En consecuencia, otra modalidad de la invención, es una célula huésped aislada de un organismo uni o pluricelular, transfectado o infectado por un vector como se describió anteriormente en una modalidad preferida la células huésped es una bacteria. El uso de tales vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico de las proteinas descritas para la expresión de la proteina en cualquier célula huésped es otra modalidad de la presente invención. 3.2.4.1 Secuencias de la Xilanasa C La producción de sondas se basó en comparaciones de secuencias de aminoácidos y nucleótidos de xilanasas de hongos conocidas. Las regiones conservadas fueron identificadas y utilizadas para diseñar cebadores de la PCR, cuyos productos serian utilizados para seleccionar una biblioteca genómica de Peni cilli um funi culosum . Se produjeron dos pares de cebadores degenerados. El primer par fue diseñado para amplificar un producto de 200 pb (aproximadamente) de un gen de la xilanasa tipo B (o tipo 2) . El segundo par se diseñó para amplificar un producto de 250 pb de un gen de la xilanasa tipo A (o tipo 1) . Se produjo una banda de 258 pb con los cebadores 3 y 4. Después de clonar en el pGEMT y secuenciar se encontró que tenia una similitud de secuencia significativa con la xilanasa de hongo tipo A/1. El plásmido que contenia el producto clonado habia sido nombrado pPFXYLA. La secuencia completa de la xilanasa C se muestra en la Figura 1 y en la SEQ ID N°l . 3.2.4.2 secuencias de la xilanasa Bl La secuencia de aminoácidos interna, junto con las alineaciones de la secuencia de otras celobiohidrolasas de hongos se utilizaron para diseñar cebadores de PCR degenerados (SEQ ID N°3) . Se amplificó un producto de 290 pb (SEQ ID N°4) y se clonó en el pGEMT (Promega) para crear el pGEMTCB2 y se secuenció. Como se muestra en la Figura 2, las secuencias cebadoras no están subrayadas. Este producto de la PCR es actualmente utilizado como sonda para seleccionar una biblioteca genómica de Peni ci lli um funi cul osum . 3.2.4.3 secuencias de la xilanasa BII Toda la secuencia del gen de la xilanasa BII incluye 1.3 kb de la región 5' no traducida y corriente arriba y 0.85 kb de la 3' sin traducir, un intrón de 54 pb y 669 pb que codifica para una proteina de 223 aminoácidos. Se utilizó PCR de transcripción invertida (RT-PCR) para probar la existencia del intrón de 54 pb. El ARN total se aisló de micelios de cultivos de Peni cil li um funi cul osum IMI-134756, se cosechó 4 dias después de crecer sobre xilano de avena al 1% (peso/volumen) . Se diseñaron cebadores para amplificar un fragmento de hasta 195 pb del ARN mensajero (249 pb del ADN genómico) y a 433 pb (487 pb con ADN genómico) . El secuenciamiento de 3 kb en el extremo 3' del plásmido (pPFXYNC2), reveló un gen (designado como per A) que contiene dos intrones putativos y codifica para un polipéptido de aproximadamente 570 aminoácidos. El polipéptido mostró una similitud de secuencia significativa en las aminoácido permeasas de hongo. 3.2.4.4 secuencia de la xilanasa A Se obtuvo la secuencia interna de la xilanasa A y está representada por la siguiente secuencia de aminoácidos: AEAINYNQDY 3. 3 Propiedades de la feruroil esterasas 3.3.1 Purificación Esta se llevó a cabo siguiendo el mismo proceso para las xilanasas. La mezcla de enzima contiene al menos dos feruroil esterasas distintas. Una de esas (FaeB) tiene un peso molecular de 38,945 - 41,051 Da por espectrometría de masas (35,450 Da de la secuencia de aminoácidos primaria y 37 kDa por SDS-PAGE). La FaeB tiene un pl de 4.2, es una feruloil esterasa del tipo B y es especifica para los sustratos MpCa y Ara2F (actividad contra MpCa, MCA, MFA y Ara2F; pero no contra MSA y FAXX) . La otra feruloil esterasa (FaseA) tiene un peso molecular de 29 kDa (por SDS-PAGE) . La FaseA tiene un pl de 4.65, es una feruloil esterasa del tipo A y es especifica para los sustratos FAXX y MSA (actividad contra MSA, MCA y FAX pero no contra MpCa Ara2F) . 3.3.2. Punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico Los puntos isoeléctricos de las proteinas se determinaron por los métodos estándar. La mezcla de enzimas se aplicó a una tira ancha (de aproximadamente 20 mm) a un gel de IEF y se sometieron a electroforesis a temperatura reducida (5°C) . Después del enfoque y el afilamiento de la banda, el gel fue cortado a la mitad del carril de la muestra. Una mitad del carril de la muestra y los estándares de IEF fueron fijados, teñidos y desteñidos utilizando el protocolo estándar. La otra mitad del carril fue cortada en secciones de 2 mm de ancho y cada sección se sumergió durante la noche en 1 ml de amortiguador MOPS 100 mM, pH 6.0. Se determinó la actividad de la feruloli esterasa por cada sección de gel utilizando MFA, MpCa, y MSA como sustratos.

El gel de IEF teñido indica la presencia de muchas proteinas en la celulasa con pl que fluctúan del muy ácido (pl 2.4) hasta aproximadamente un pl de 7. La mayoría de las proteinas son acidas (intervalos de pl de 2.4 - 5) . Se detectaron dos picos de actividad de feruloli esterasa en las fracciones cortadas del gel. Uno, que corresponde a la FaeB, tuvo un pl de 4.2 y actividad únicamente contra MFA y MpCa (no MSA) . El otro, que corresponde al FafeA, tuvo un pl de 4.65 y una actividad contra los tres sustratos probados. 3.3.3 Peso molecular de SDS-PAGE Los pesos moleculares se analizaron por SDS-PAGE utilizando geles de Tris-glicina al 10%. Los geles de SDS-PAGE se corrieron, se fijaron, se tiñeron con Tinción de Azul de Coomasie y se destiñeron utilizando el protocolo estándar. La mezcla de enzimas contiene al menos dos feruloil esterasa distintas. Una corresponde a la FaeB (pl 4.2) y tiene un peso molecular de 37 kDa. La otra, que corresponde a la FaeA (pl 4.65) tiene un peso molecular de 29 kDa. Se estimó que el peso molecular de la FaeB es de 34,450 Da a partir de la secuencia primaria de aminoácidos, y de 38,945-41,051 Da por espectrometría de masas. 3.3.4 Actividad de la feruloil esterasa Los ensayos para la actividad de la feruloil esterasa se efectuaron sobre la mezcla de enzimas utilizando el método espectrofotométrico La mezcla de enzimas contiene actividad contra todos los sustratos probados. Con los esteres de metilo, la actividad es mayor contra el MpCa y menos contra el MSA. Las actividades contra Ara2F y FAXX son mayores que contra los esteres de metilo, lo cual es indicativo de que las actividades de la esterasas se deben a las feruloil esterasas y no a las esterasa generales o actividades laterales de las otras esterasas que degradan la pared celular (por ejemplo la acetil xilan esterasa, pectin esterasa) . 3.3.5 Secuencias 3.3.5.1 secuencia de FEA-A De acuerdo con las digestiones con la proteina purificada se obtuvieron las secuencias internas de aminoácidos como se muestra a continuación: Secuencia 1 QYTLTLPSNYNPNK Secuencia 2 AVAVMSGANL Secuencia 3 TEYSG(C/A) DSEHPVWWIAFDGP Secuencia 4 DTFVKDDHCTPTNPPAPAAGSGTHIKYV Se diseñaron varios observadores de PCR degenerados a partir de las secuencias de aminoácidos obtenidas de la proteina purificada. Muchos de los productos principales son clonados en el pGEMT (Promega) y secuenciados. Un plásmido llamado pGEMTD 19 (180 pb) (Figura 3) fue encontrado por la PCR contenia una secuencia que fue reconocible como la secuencia peptidica 4 mostrada anteriormente. Como se muestra en la Figura 3, la secuencia han sido doblemente subrayadas mientras que las secuencias previamente conocidas han sido subrayadas con una linea. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de la FAE-A se describen en la SEQ ID N° 5. 3.3.5.2 Secuencia de la FEA-B Los observadores diseñados de la secuencia peptidica de la FAE-B se utilizaron para amplificar una prueba, que fue posteriormente utilizada para seleccionar una biblioteca genómica de Penicilli um funi culosum . Se aisló un clon de 2291 pb y siendo secuenciado (SEQ ID n°6) . El gen que codifica para un polipéptido de 304 aminoácidos y tiene un intron putativo. La secuencia de aminoácidos se muestran en la figura 4 donde la proteina madura (con una longitud de proteina madura=338) está en negrillas. Esta proteina comprende dos dominios distintos separados por un enlace fuertemente glicosilado. Como se muestra en la Figura 4, el dominio catalítico esta en negrillas, mientras que el dominio lineal está en negrillas doblemente subrayadas y el enlace es representado por una linea negra punteada. La proteina se caracteriza por un motivo de sitio activo putativo (serina=nucleófilo) como se muestra subrayado en la Figura 4 con las triadas catalíticas Putativas: (1) S136/D174/H216 (2) S136/D220/H276 La proteina FAE-B comprende también la secuencia de secreción (353) y 10 cisteinas. 3. 4 Propiedades de las glucanasas La mezcla de enzimas fue sometida a electroforesis sobre gel 2D. La IEF se llevó a cabo utilizando poliacrilamida al 5% moldeado verticalmente del NOVEX ® para pH 3 - 7 (intervalo de funcionamiento de pl 3.0 - 6.5) en el NOVEX® XCell IIRM Mini-Cell. Se utilizaron cátodos y ánodos NOVEX® y amortiguadores de muestra IEF para pH 3 - 7 y el protocolo estándar de NOVEX" para el enfoque isoeléctrico. Un carril se cortó y se sometió a electroforesis en la segunda dimensión utilizando gel de SDS-PAGE Laemmli al 10%. Un segundo carril se separó del gel con 35 fracciones, las tiras de gel se sumergieron en el amortiguador, y las fracciones se ensayaron para determinar la actividad enzimática. El tercer carril se dejó sobre el gel, se fijó con tinción de Azul de Coomassie R-250 y se destiño utilizando el protocolo estándar de NOVEX®. Se encontraron actividades significativas de endo-1, 3 (4) -ß-glucanasa (método del ß-glucano de cebada con DNS) y celulasa (método de CMC con DNS) en las fracciones que corresponden las proteinas con pl 4.2, M.W. 36 kDa y pl 5.4, M.W. 27 kDa. Para eliminar la Xilanasa B-I en una de las fracciones, las fracciones fueron probadas para la actividad utilizando el método del xilano de abedul con DNS. No se detectó actividad de xilanasa en las fracciones que corresponde a actividades de la ß-glucanasa o celulasa.

Lista de dibujos Figura 1: Secuencia de aminoácidos de la xilanasa C de Penicilli um funiculosum Figura 2: Secuencias de nucleótidos y aminoácidos del producto de la PCR de la xilanasa Bl (XynBI) Figura 3: Secuencias de nucleótidos y aminoácidos del producto de la PCR de la Feruloil esterasa A (faeA) Figura 4 : Secuencia de aminoácidos de la proteina (FAE-V o FAE-I) de la Feruloil esterasa B (faeB) de Penicilli um funiculosum E. Usos de la mezcla de enzimas para forrajes para animales Ejemplo 1: Evaluación de la Preparación de Enzimas producidas por Peni cill i um funi culosum para la eficacia sobre el valor de energía (AMEN) de transferencias de dieta mezclada de trigo y de cebada en pollos. El propósito principal de la eficacia demostrada en las enzimas (actividad de la ß-gluconasa: 100 U.kg"1 y actividad de la glucanasa: 1100 U. Kg"1) sobre la energía Metabolizable Aparente corregida para el balance de nitrógeno (AMEN) de una dieta que contiene 50% de trigo y 22% de cebada. Se condujeron experiencias sobre Preparación y Control de Enzimas (actividad de ß-gluconasa: 100 U. kg"1 y actividad de xilanasa: 1100 U. Kg"1) utilizando el Método de Referencia Europea (Bourdilon et al., 1990) con alimentación ad libitum y recolección rectal total entre los 18 y 21 dias de edad. a. Materiales y Métodos Aves : reproducción y condiciones de reproducción Se criaron pollos Ross machos de un dia de edad en jaulas con baterías colectivas hasta los 12 dias de edad. Ellos se alimentaron con una dieta de condición estándar. Al dia 12, las aves se pesaron y distribuyeron igualmente en 10 jaulas individuales para el tratamiento y a continuación fueron alimentados con dietas experimentales para el periodo de adaptación (un minimo de 5 dias) . Se aplicaron programas de temperatura y humedad estándar. El programa de iluminación se mantuvo constante con 23 horas de luz y 1 hora de obscuridad hasta el final del ensayo.

Forrajes: Las aves recibieron una dieta inicial hasta los 12 dias de edad y a continuación forrajes experimentales.

Dietas Experimentales Los forrajes tuvieron 50% de trigo y 22% de cebada (Tabla 1.1). La Preparación de Enzimas se roció sobre 20 kg de migajas. Las recuperaciones de enzimas en el forraje se midió por el método viscométrico (Sabatier y Fish, 1996) .

Medición de la energia metabolizable El balance comenzó en D18 de acuerdo con el siguiente procedimiento: D 17, las aves ayunaron durante la noche; D 18, se pesaron las aves, y se limpiaron bandejas de recolección; D 19, se recolectaron y congelaron las heces; D 20, se recolectaron y congelaron las heces, rápido durante la noche; D 21, se recolectaron y congelaron las heces, se pesaron las aves y se alimentaron nuevamente. Las heces son entonces liofilizadas y trituradas como forraje (Triturador Retsh lmm) . La energia aproximada del forraje y las excreciones se midieron en un calorímetro adiabático IKA C5000. Se determinaron el contenido de proteina (N*6.25, método de Kjeldahl Z130) y lipido (método Z160). Se aplicó una corrección del balance de Nitrógeno utilizando 18% de proteina en la ganancia de peso. b . Resultados y Discusión Energia Metabolizable Aparente corregida para el balance de nitrógeno (AMEN) . Los funcionamiento zootécnicos y Energia Metabolizable se presentan en la Tabla 1.2. Ellos no fueron diferentes a los funcionamientos zootécnicos entre los tratamientos . En los pollos en crecimiento, la Preparación de Enzimas mejora AMEN y de una dieta a base de 50% de trigo y 22% de cebada por 6.2 % (+204 kcal/kg DM (Materia Seca)). Además, la variabilidad y la digestibilidad de la energia disminuyó de 80 a 62 kcal.kg DM. Esta alta mejora demuestra el interés de ambas actividades (xilanasa y ß-glucanasa) producidas por la Penici lli um funi culosum para hidrolizar monosacáridos y almidón de trigo y cebada no solubles.

Tabla 1.1: Ingredientes principales y características analizadas de las dietas experimentales Tabla 1.2. : Efecto de la Preparación de Enzimas producido por Penicillium funiculosum sobre el funcionamiento del crecimiento y la energia metabolizable aparente en pollos que recibieron una dieta a base del 50% de trigo y 22% de cebada.

Tabla 1.2.. Efecto de la Preparación de Enzimas producido por Penicillíum funiculosum sobre el funcionamiento del crecimiento y la energia metabolizable aparente en pollos que recibieron una dieta a base del 50% de trigo y 22% de cebada. (Continuación) Ejemplo 2: Efecto de la Preparación de Enzimas producida por Peni cill i um funi cul osum sobre la digestibilidad del forraje en pollos alimentados con trigo. Se formaron ensayos para determinar el efecto de la Preparación de Enzimas producidas por Peni ci l l i um funi culosum (actividad de ß-glucanasa: 100 U.kg"1 y actividad de la xilanasa: 1100 U. Kg"1) sobre la Energia Metabolizable Aparente (AME) , digestibilidades de proteina y lipido en pollos alimentados con una dieta que contenia 54% de trigo. También se investigó la interacción con la molienda. (1) Control 1 (54% de trigo molido) (2) Control 1 + Preparación de Enzimas (actividad de ß-gluconasa: 100 U.kg"1 y actividad de xilanasa: 1100 U.Kg"1) (3) Control 2 (30 % de trigo entero, 24% de trigo molido) (4) Control 2 + Preparación de Enzimas (actividad de ß-glucanasa: 100 U.kg"1 y actividad de xilanasa: 1100 U.kg"1) De acuerdo al método de Referencia Europea (alimentación ad libitum y recolección total de excreciones de los 18 a los 21 dias de edad) (Bourdillon et al. , 1990). a. Materiales y Métodos Aves : reproducción y condiciones de reproducción Se criaron pollos hembra de un dia de edad en jaulas de bateria colectivas hasta los 12 dias de edad. A continuación se transfirieron a jaulas de baterías individuales para el balance digestivo. Se aplicaron programas de temperatura y humedad estándar. El programa de iluminación fue de 23 horas de luz y 1 hora de obscuridad hasta los 8 dias de edad. Este se modificó entonces a 15h30 de luz, 8h30 de obscuridad debido a un ensayo trial efectuado en el mismo edificio. Forrajes: Las aves recibieron una dieta inicial estándar hasta los 12 dias de edad y a continuación los forrajes experimentales.

Dietas experimentales Las dietas experimentales contenían 54% de trigo. Las características se dan en la Tabla 2.1. Las composiciones de la dieta se reportan en la Tabla 2.2.

Medición de la energia metabolizable aparente El balance comienza el Dia 17 de acuerdo al siguiente programa: D 17, las aves ayunaron durante la noche; D 18, se pesaron las aves, y se limpiaron bandejas de recolección; D 19, se recolectaron y congelaron las heces; D 20, se recolectaron y congelaron las heces, rápido durante la noche; D 21, se recolectaron y congelaron las heces, se pesaron las aves y se alimentaron nuevamente. Las heces son entonces liofilizadas y trituradas como forraje (Triturador Retsh lmm) . La energia aproximada del forraje y las excreciones se midieron en un calorímetro adiabático IKA C5000. Se determinaron el contenido de proteina (N*6.25, método de Kjeldahl Z130) y lipido (método Z160) . También se efectúo un perfil de aminoácidos por CLAP (métodos Z100 para forrajes y Z080 para heces) . El contenido de fósforo de los forrajes y las excreciones se midieron utilizando el método ANFOR (NFV18-106) . b. Resultados y discusión Energia Metabolizable Aparente (AME) El funcionamiento de crecimiento y los datos de la energia metabolizable se' presentan en la Tabla 2.3. El funcionamiento (ganancia de peso, consumo de forraje), fue medido durante el periodo de tres dias, no difiere entre los tratamientos. La AME de la dieta control contiene 54% de trigo molido fue de 3173 kcal/kg. La energia metabolizable de la dieta que contenia la misma cantidad total de trigo pero de la cual el 30% del grano entero, se incrementó a 100 kcal/kg en comparación con el valor teórico. Además, la variabilidad apreciada por la desviación estándar de los diferentes criterios medidos también se redujo con el trigo entero . Las enzimas producidas por Peni ci l li um funi culosum (actividad de ß-glucanasa: 100 U.kg"1 y actividad de xilanasa: 1100 U.kg"1) aumenta el valor de la energia metabolizable de una dieta a base de 54% de trigo en + 3.4% (122 kcal/kg DM) si todo el trigo es molido y por +2.7% (101 kcal/kg DM) si el 30% del trigo es incluido como granos enteros.

Digestibilidad Aparente de los Nutrientes (lipidos, proteinas y aminoácidos) Cuando todo el trigo es triturado, las digestibilidades aparentes de los lipidos y proteinas se incrementan en 7 y 2.7 % respectivamente, con la Preparación de Enzimas de Penicilli um funiculosum . Con parte del trigo como granos enteros, el incremento es menor: +3 y +0.6% respectivamente, debido a una digestibilidad de nutrientes total aumentadas. En realidad, la digestibilidad de los nutrientes con la dieta control que contiene grano entero fue similar a la de la dieta experimental que contiene solo trigo molido pero fue experimentada con preparación de enzimas. Los efectos de la Preparación de Enzimas sobre la digestibilidad de aminoácidos aparentes se presentan en la Tabla 2.4. La mejora con la Preparación de Enzimas alcanza un promedio de +2.9% con todo el trigo como el trigo molido y +1.1% con granos enteros, confirmando el efecto sobre la digestibilidad aparente de la proteina.

Retención aparente de fósforo y excreción de fósforo El efecto de la Preparación de Enzimas sobre la retención aparente de fósforo se presenta en la Tabla 2.5. La retención aparente de fósforo se incrementó significativamente con la adición de Preparación de Enzimas: +8.0%. Este incremento es mayor que aquéllos observados para los otros nutrientes (+2.9 a +3.5% dependiendo del criterio: AME, proteinas, lipidos, aminoácidos) . Tal incremento puede de este modo resultar de la digestibilidad mejorada de los nutrientes (el efecto directo de la xilanasa y la ß- glucanasa) pero también de una mejor acción de la fitasa de trigo. Cuando no se hidrolizan los polisacáridos del almidón, la xilanasa y ß-glucanasa da más accesibilidad al ácido fitico para la fitasa de trigo endógeno. La mejor utilización digestiva del fósforo reduce de este modo la excreción de fósforo: -8% cuando se expresa como g de fósforo con ganancia de peso corporal.

Tabla 2.1: Caracteristicas del trigo (%) Tabla 2.1: Características del trigo (%) (continuación) Tabla 2.2: Composiciones y Caracteristicas de las dietas experimentales Dieta trigo molido trigo entero Composición (%) Trigo molido 53.84 23.84 Trigo entero 0 30.0 Grasa animal 3.52 3.52 Harina de soya 48 18.26 18.26 Harina de Carne y Hueso 5.64 5.64 Chícharos 7.0 7.0 Semilla de colza entera 10.0 10.0 vitaminas/minerales 1.74 1.74 Tabla 2.2: Composiciones y Características de las dietas experimentales (continuación) Dieta trigo molido trigo entero Características (%) ME (kcal(kg) 3173 3.188 Proteina 20.6 20.5 Grasa 9.6 9.6 Lisina 1.05 1.04 Metionina 0.45 0.45 Met + Cys 0.85 0.85 Calcio 0.90 0.90 P Disponible 0.35 0.35 Tabla 2.3: Efecto de la Preparación de Enzimas (actividad de ß-glucanasa: 100 U.kg"1 y actividad de xilanasa: 1100 U.kg"1) sobre la AME de la dieta a base de trigo (54% de trigo molido o 24% de trigo molido + 30% de trigo entero) en pollos de engorda Dietas 1 2 3 4 Trigo Trigo Trigo Trigo molido molido + entero entero + Enzimas Enzimas Ganancia en Peso (g) 172±11.8 170±13.1 167+8.9 165112.0 Consumo de Forraje (g) 282±20.5 272±17.2 274115.5 267114.0 Consumo de Forraje Diario 94±6.8 91±5.7 9115.2 8914.7 FCRJ (g/g) 1.6410.05 1.6010.06 1.6410.05 1.63 10.09 Digestibilidad Aparente de 83.8±1.08a 85.9±1.14b 86.610.77b'- 87.010.80 Proteina (%) Digestibilidad Aparente de 82.212.5a 88.0±2.1bc 86.612. 5b 89.211.25° Lipido (%) AME (kcal/kg de DM) 3577176a 3699185b 3678+35b 3779+341- (kcal/kg) 3194+67 3303+76 3284131 3375131 1: análisis de varianza en un sentido, efecto de a dieta, n = 47; a, b: los valores seguidos por la mismas letras en el subíndice no difieren en p<0.05. 2: análisis de varianza en dos sentidos, n = 47 (trigo: 54% molido y 25% molido + 30% entero; enz: sin o con 0.2 1/t de Xilano) . 3: FCR: Relación de Conversión de Forraje (g de forraje: ganancia en g) .

Tabla 2.4: Efecto de la Preparación de enzimas sobre la digestibilidad aparente de los aminoácidos (%) de una dieta a base de 54% de trigo en pollos de engorda (una muestra de excreción mezclada por tratamiento) Trigo molido Trigo Molido + Entero Témoin Preparación Témoin Preparación de Enzimas de Enzimas Nitrógeno 83.4 85.3 86.4 87.1 ASP 78.6 80.9 82.1 82.7 THR 74.2 75.3 78.0 79.9 SER 79.5 82.1 83.0 83.3 GLU 87.9 89.6 80.7 91.4 Tabla 2.4: Efecto de la Preparación de enzimas sobre la digestibilidad aparente de los aminoácidos (%) de una dieta a base de 54% de trigo en pollos de engorda (una muestra de excreción mezclada por tratamiento) (continuación) Trigo molido Trigo Molido + Entero Témoin Preparación Témoin Preparación de Enzimas de Enzimas PRO 84.8 87.1 87.7 88.7 GLY 77.1 79.9 80.7 82.0 ALA 74.6 76.9 78.2 80.1 VAL 78.6 80.8 81.8 83.0 ILE 80.6 83.0 84.0 85.0 LEU 82.1 84.3 85.3 86.4 TYR 80.9 85.0 83.7 84.4 PHE 83.7 85.9 87.1 87.6 LYS 80.6 83.1 83.9 84.8 HIS 81.7 84.9 85.0 86.0 ARG 84.9 87.6 88.1 89.0 CYS 70.8 72.8 76.5 77.0 MET 87.2 88.5 88.5 89.4 TRP 79.5 82.7 83.3 84.7 Tabla 2.5: Efecto de la Preparación de Enzimas sobre la excreción de fósforo (P) y retención aparente de fósforo de dietas a base de trigo (54% de trigo molido) en pollos de engorda (n=12) Dieta Efecto de la Enzima Trigo Trigo- Preparación de enzimas P Retención Aparente de P 37.9±3.0 40.5±2.8 0.47 P Excretada (g/ave l/3dias) 1.2410.13 1.1410.1 0.071 Excreción de P (g/ganancia 7.210.5 6.7±0.5 0.034 de kg) Ejemplo 3: Evaluación de la Preparación de Enzimas sobre la AMEN de una dieta a base de trigo en pavos de engorda El propósito principal de este ensayo es demostrar la eficacia de la Preparación de Enzimas de Peni ci ll i um funi culosum (actividad de ß-glucanasa: 100 U.kg"1 y actividad de xilanasa: 1100 U.kg"1) sobre la Energia Metabolizable Aparente (AME) de una dieta a base de trigo de acuerdo al siguiente diseño experimental: (1) Control; (2) EP 1: Preparación de Enzimas (actividad de ß-glucanasa : 100 U.kg"1 y actividad de xilanasa : 1100 U.kg"1); (3) EP 2: Preparación de Enzimas (actividad de ß-glucanasa : 150 U.kg"1 y actividad de xilanasa : 1650 U.kg"1); utilizando el Método de Referencia Europeo (Bourdillon et al., 1990) con la alimentación ad libitum y recolección total de excreciones entre los 33 y 37 dias de edad. a . Materiales y Métodos Aves reproducción y condiciones de reproducción Se criaron pavos BUT9 macho de un dia de edad en jaulas en bateria colectivas hasta 20 de edad. A continuación se transfirieron a cajas en bateria individuales para el balance de digestibilidad después de un periodo de adaptación de al menos 7 dias. Se aplicaron programas de temperatura y humedad estándar. El programa de iluminación se mantuvo constante a 23 horas de luz y 1 hora de oscuridad durante las 2 primeras semanas y a continuación se redujo a 15 horas de luz por 9 horas de oscuridad hasta el final -del ensayo.

Forraje: Las aves recibieron una dieta inicial completa estándar de los dos dias de edad hasta los 21 dias de edad y a continuación los forrajes experimentales.

Dietas experimentales Los forrajes tuvieron 47% de trigo y 33% de harina de soya (Tabla 3.1) . El roclo de la enzima se efectuó en 20 g de granulos control.

Medición de la energia metabolizable Al D 21, las aves fueron pesadas y distribuidas igualmente en 10 jaulas individuales por tratamiento y fueron alimentadas entonces con las dietas experimentales. El balance comienza el D 33 de acuerdo al siguiente procedimiento: D 32, las aves ayunaron durante la noche; D 33, se pesaron las aves, se limpiaron las bandejas de recolección; D 34 y D35, se recolectaron y congelaron las heces; D 36, se recolectaron y congelaron las heces, rápido, durante la noche; D 37, se recolectaron y congelaron las heces, se pesaron las aves y se alimentaron nuevamente. Las heces se congelaron entonces y se trituraron como forraje (triturador Retsch de 1 mm) . Se midieron la energia aproximada del forraje y las excreciones en un calorímetro adiabático IKA C5000. La AME se corrigió para el balance N tomando en cuenta la ganancia de peso corporal (g) y su contenido de nitrógeno (21% de proteina cruda). Las heces se liofilizaron y trituraron entonces como forraje (triturador Retsch de 1 mm) . Se midieron la energia aproximada del forraje y las excreciones en un calorímetro adiabático IKA C5000. También se determinó la proteina (N*6.25, método de Kjeldahl Z130 para los forrajes y Z135 para las haces) y se efectuó el perfil de aminoácidos por CLAR (método Z100 para los forrajes y Z080 para las heces . b. Resultados y discusión Energia Metabolizada Aparente (AME) Los funcionamientos zootécnicos y la Energia Metabolizable se presentan en la Tabla 3.2. No hubo diferencia significativa en el funcionamiento en el crecimiento durante el balance entre los tratamientos. En pavos de engorda, la Preparación de Enzimas, mejora la AMEN de una dieta a base de trigo en 2.2 y 5.4% para EP 1 y EP 2 respectivamente. La alta mejora observada demuestra el interés en ambas actividades (xilanasa y ß-glucanasa) contenidas en la Preparación de Enzima a polisacárido no de almidón de trigo' hidrolizado para mejorar el valor de energia de este cereal en pavos de engorda.

Tabla 3.1: Ingredientes principales y características analizadas de las dietas experimentales Tabla 3.2: Efecto de la Preparación de Enzima sobre la energia metabolizable aparente corregida para medir el balance de nitrógeno (AMEN) de una dieta a base de trigo en pavos de engorda (32 a 37 dias) (media ± DE) Control EP 1 EP 2 probabilidad1 n=12 n=12 n=12 efecto efecto de la de la enzima dosis Energía Aproximada 4659 4680 4654 (kcal/kg DM) Ganancia de Peso 341123 338136 337.5157 NS NS Corporal (g) Consumo de forraje 11115.9 10716.3 103112.1 NS NS (g/día) Relación de Conversión 1.6310.09 1.6010.12 1.5910.17 NS NS de Forraje (g/g) DM Fecal (%) 26.115.5 26.512.2 25.914.8 NS NS AME,, (kcal/kg DM): 3025186 3092156 3191134 0.037 0.061 AMEN (kcal/kg) : 2700177 2753150 2840130 0.037 0.061 T~ Análisis de varianza de una via : Efecto de la enzima: n=60, a,b: las medias no seguidas por la mismas letras son significativamente diferentes a p<0.05; Efecto de la dosis: 0.2, 0.3 1/t. 2 Media ± SEM Ejemplo 4: Evaluación de la eficacia de la Preparación de Enzimas producidas por Penicillium funiculosum de una dieta completa de forrajea base de Trigo de cerdos de engorda El objetivo es evaluar el efecto de la suplementación enzimática de dietas a base de trigo sobre la digestión de energia en el intestino delgado de cerdos de engorda. La actividad del nivel normal de la Preparación de Enzimas es de 1100 U.kg"1 para la xilanasa y de 100 U.kg"1 para la ß-glucanasa. a. Materiales y métodos Animales Los tratamientos se probaron de acuerdo a un diseño de cuadro Latino con tres dietas y tres periodos y dos cerdos por periodo de dieta*. Las dietas fueron alimentadas a niveles fijos de acuerdo al peso del credo a través de todo el periodo de la prueba.

Dieta experimental Se alimentó una dieta basada en trigo de baja calidad y balanceada con otros ingredientes de forraje típicos a seis cerdos de engorda (véase la tabla 4.1) . la dieta fue alimentada ya sea: 1. No suplementada (basal); 2. Suplementada (1): con Preparación de Enzimas a un nivel lx (actividad de ß-glucanasa : 100 U.kg"1 y actividad de xilanasa : 1100 U.kg"1); 3. Suplementada (2): con Preparación de Enzimas a un nivel 2x (actividad de ß-glucanasa : 200 U.kg"1 y actividad de xilanasa : 2200 U.kg"1); La dosificación exacta de la dieta se alcanzó diluyendo la Preparación de Enzimas con almidón de maiz para crear una premezcla la cual fue entonces agregada a las dietas según fue apropiado.

Recolección de la muestra Se recolectaron los jugos iliales durante un periodo de 48 horas cada semana de acuerdo a procedimientos estándar en los laboratorios RPNA. Una muestra de jugo ileal de las dietas de prueba se analizó para determinar la energia por medio de una bomba calorimétrica de Sanders para determinar la energia digerible. Se almacenaron alícuotas de las muestras para su análisis posterior si era necesario.

Análisis estadístico La digestibilidad de la energia cruda se calculó a partir de los resultados de la bomba calorimétrica de los jugos ileales, el forraje y los consumos de forraje. Se efectuó el análisis de varianza sobre los cálculos de digestibilidad. l l Tabla 4.1: Especificación de los ingredientes y nutrientes de la dieta basal Porcentaje de inclusión Ingredien tes Trigo 60.0 Cebada 9.7 Chícharos 11.4 0 Harina de pescado 5.0 Harina de girasol (30¡ 10.0 Lisina 0.15 5 Minerales y vitaminas 3.75 Total 100.0 Nutrientes Proteina 14.9 Materia seca 84.9 Energia digerible (kcal/kg) 3150 Fibra 5.1 Lisina digerible 0.8 b . Resultados y discusión La suplementación con xilanasa de las dietas de los cerdos incrementó la digestibilidad de la energia al menos un seis por ciento. Esto indica que la enzima incrementa la degradación de paredes celulares de materia cruda (en particular, trigo) y la liberación de energia adicional en el intestino delgado.

Tabla 4.2: Efecto de la suplementación de la Preparación de Enzima de dietas a base de trigo sobre la digestibilidad de energia de forrajes dados a cerdos de engorda.

Tratamiento no Suplementado Suplementado valor suplementado (1) (2) de p Media (%) 70.1 74.5 75.6 <0.001 Digestibilidad de energía 0.80 0.49 0.45 % de mejoría 6.27 7.87 Ejemplo 5: Efecto de la Preparación de Enzima producido por Penicillium funiculosum sobre el funcionamiento de dietas de paja, el ensilaje de maiz, en ensilaje de heno y pasto en rumiantes . La prueba HFT (Hohenheimer Futterwertesten, Menke et al., 1979, 1988) es una prueba de incubación in vitro que permite la medición de la degradación del material de crudo a través del volumen de gas producido por la fermentación de esos forrajes en un jugo de rumen amortiguado . a. Materiales y Métodos Se incubaron 200 mg de sustrato seco molido con 10 ml de jugo de rumen más 20 ml de amortiguador en jeringas las cuales fueron agitadas suavemente en un rotor en un incubadora de temperatura controlada (39°C). Se registró el volumen de gas producido a las 24 horas. Se utilizaron un blanco (sin sustrato) control de heno estándar y control de concentrado estándar (con un valor conocido de producción de volumen de gas neto) para corregir los resultados y calcular un volumen neto de gas producido en 24 horas. El valor de la energia y OMD (Digestibilidad de Materia Orgánica) de los sustratos se calcularon utilizando el volumen de gas producido en 24 horas y las ecuaciones de predicción propuestas por Menke et al. (1988). El jugo de rumen se recolectó de 2 vacas secas, el rumen se canuló y alimentó a las 8 a.m. y 7 p.m. con una ración compuesta de 6 kg de heno y 2 kg de concentrado (relación 75/25). La recolección del jugo de rumen se realizó justo antes de la alimentación matutina. El jugo de rumen se filtró para evitar el paso de partículas alimenticias y se mantuvo en condiciones anaerobias estrictas. El propósito de este ensayo fue probar el efecto de la aplicación de la Preparación de Enzimas sobre el forraje 15 horas antes de la incubación HFT. Pretratamiento con Preparación de Enzima: la solución de enzima se roció sobre el forraje sobre el piso o la paja, el ensilaje de maiz, el ensilaje de heno y hierba. El roció se realizó con 1 ml de Preparación de Enzima sobre 2 kg de materia seca de forraje. El forraje en el borde (aproximadamente 10 cm) se rechazó para mejora la homogeneidad de la muestra. Después del tratamiento, el forraje se mezcló manualmente y se dejó a temperatura ambiente durante 15 horas después del roció. La incubación HFT se llevó a cabo después de 15 horas de contacto de la Preparación de Enzimas a través de una serie y 6 pretratamientos por réplica. b. Resultados y discusión La producción de volumen de gas neto a las 24 horas se da en la tabla 5.1 para la paja, el ensilaje de maiz, el ensilaje de heno y hierba. La aplicación de celulasa sobre paja a través del pretratamiento da una mejora del volumen neto de gas del 18% de ese control. Para el ensilaje de maiz, esta mejora es del 8%, para el heno, 9.5%, y para el ensilaje de hierba 9%. La OMD se da en la tabla 5.2 para diferentes forrajes antes y después del pretratamiento. La digestibilidad OM mejoró respectivamente para la paja, ensilaje de maiz, ensilaje de heno y hierba vs . Control: 8.5% para la paja, 5% para el ensilaje de maiz, 5.4% para el heno y 5% para el ensilaje de hierba. 15 horas de pretratamiento de los forrajes (paja, ensilaje de maiz, heno, ensilaje de hierba) con Preparación de Enzima mejora la intensidad de la incubación del sustrato de rumen y la digestibilidad OM del sustrato. Tabla 5.1: Producción de volumen de gas neto a las 24 horas Tabla 5.2 OMD Ejemplo 6: Efecto de la Preparación de Enzimas producidas por Penicilliupj funiculosum sobre el funcionamiento de gallinas 2f ponedoras alimentadas con trigo o cebada El propósito de este experimento fue evaluar los efectos de la adición de Preparación de Enzimas sobre los parámetros productivos de gallinas ponedoras alimentadas con dietas a base de trigo o cebada. i5j a . Materiales y métodos Diseño experimental: 4 tratamientos x 8 réplicas x 5 jaulas c 3 gallinas Tratamientos: 1. Control 1 : 60% de trigo 2. Control 1 + Preparación de Enzimas 3. Control 2 : 60% de cebada 4. Control 2 + Preparación de Enzimas Animales, alojamiento y manejo El ensayo se condujo sobre cuatrocientas y ochenta gallinas brown de la cepa o variedad Hy-Line. Se formaron réplicas por cada cinco gallineros, con un alimentador común, es decir un total de treinta y dos réplicas de quince aves cada una . Distribuidas en dos salas idénticas, las réplicas tuvieron luces y ventilación programables. El programa de iluminación comenzó con 14 horas de luz por dia al arribo de las gallinas a las 17 semanas de edad, incrementándose cada dos semanas 30 minutos hasta un máximo de 17 horas de luz por dia. Las gallinas tenían 22 semanas de edad al inicio del experimento el cual transcurrió durante los primeros cinco meses del periodo de poner.

Dietas y alimentación Hubieron dos dietas experimentales basadas en 60% de trigo [ dieta 1 ) y 60% de cebada (dieta 2) , y 10% de harina de girasol. Su composición se muestra en la Tabla 6.2. Las características de los cereales se presentan en la Tabla 6.2.

Controles Análisis quími co : • Muestras de forraje El control de calidad de los forrajes experimentales se efectuó analizando la materia seca, proteina cruda, grasa cruda y cenizas. La actividad de la xilanasa (T-l, T-2) y la actividad de la ß-glucanasa (T-3, T-4) se determinaron en forrajes mezclados. • Mediciones El consumo de forraje y la eficiencia de la alimentación se registraron cada cuatro semanas. Las gallinas fueron pesadas al inicio y al final del experimento. Se registraron diariamente la producción de huevos, el peso de los huevos y el porcentaje de huevos sucios y malos, durante cinco periodos de cuatro semanas cada uno. Se verificó la mortalidad y se registró diariamente, incluyendo la causa de la muerte. b. Resultados y discusión Ensayo de funcionamiento Los parámetros productivos obtenidos durante el ensayo se muestran en las Tablas 6.3 a 6.5. En los primeros dos periodos (de las semanas 22 a 30) y el experimento total el porcentaje de huevos sucios fue afectado estadísticamente por el tratamiento (P>0.005). Los animales alimentados con una dieta de trigo sin enzima produjeron más huevos sucios. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos en el porcentaje de huevos puestos (P>0.05) y en el peso de los huevos (P>0.005) del segundo periodo al final del experimento. Los animales alimentados con dieta de cebada presentaron un mayor porcentaje de producción de huevos y produjeron huevos más pesados que los animales alimentados con trigo. La preparación de enzima parece incrementar esos parámetros pero no significativamente a un nivel de probabilidad del 0.05. En todos los periodos experimentales, el consumo de forraje o alimento de los animales de los tratamientos T-3 y T-4 (dietas de cebada) fue mayor que el consumo de los animales alimentados con dietas de trigo, debido a los niveles de energia de ambas dietas (las dietas de cebada se formularon a 2600 kcal/kg de energia mientras que las dietas de trigo contenían 2800 kcal/kg) . Tomando en cuenta los diferentes valores de energia de ambos tipos de dietas y el consumo de forraje o alimento de los animales, en el periodo total todos los animales presentaron el mismo consumo de energia diariamente. La eficiencia de la alimentación (expresada como g de forraje/g de huevo) de las dietas experimentales durante el primer periodo fue muy alta debido al bajo porcentaje de producción de huevos de las gallinas durante este periodo de tiempo. En los primeros dos periodos, la eficiencia de la alimentación para los tratamientos con trigo fue menor que el obtenido con los tratamientos con cebada; pero en el tercer periodo, cuando se registraron los porcentajes de producción de huevos más altos, ambos tipos de dietas presentaron eficiencias similares. De la semana 34 al final del experimento, las dietas con cebada presentaron mejores eficiencias de la alimentación que los tratamientos con trigo. Las enzimas tienden a mejorar la eficiencia de la alimentación (P>0.05). En el periodo total la ß-glucanasa mejoró la eficiencia de la alimentación de la dieta con cebada (con una P = 0.066) . La Tabla 6.4 muestra que las gallinas ponedoras alimentadas con trigo suplementado con Preparación de Enzimas tienden a exhibir mayores porcentajes de producción (+ 1.5 puntos absolutos), peso promedio de los huevos (+ 0.37 g) y una Relación de Conversión de Forraje menor (-2.7%) que las no suplementadas. La Tabla 6.5 muestra que la adición de Preparación de Enzimas a las gallinas ponedoras alimentadas con cebada mejora la velocidad de producción (+ 4%) , peso promedio de los huevos (+ 0.07%) y una Relación de Conversión de Forraje o Alimento (-5.7%) en comparación con las dietas de cebada control .

Tabla 6.1 Composición de las dieta de gallinas ponedoras experimentales Tabla 6.1 Composición de las dieta de gallinas ponedoras experimentales (continuación) Ingrediente Dieta de Dieta de trigo cebada Harina de girasol, 29% 10.0 10.0 DL-metionina 0.091 0.101 L-lisina HCl 0.111 Carbonato de Calcio 8.595 8.546 Fosfato Dicálcico 1.478 1.517 Sal 0.30 0.30 Premezcla de minerales y vitaminas* 0.40 0.40 Valor nutritivo estimado Energía metabolizable (kcal/kg) 2800 2600 Proteina cruda 16.0 16.41 Grasa cruda 7.41 7.21 Lisina 0.75 0.76 Metionina 0.35 0.35 Tabla 6.1 Composición de las dieta de gallinas ponedoras experimentales (continuación) * )' Un kilo de forraje contiene : 8000UI de Vitamina A : Vitamina D3 : 1600UI : Vitamina E : 5 mg ; Vitamina K3 : 2 mg ; Vitamina Bl : 1.5 mg ; Vitamina B2 : 4 mg ; Vitamina B6 : 3 mg ; Vitamina B12 : 11.8 µg ; Acido fólico : 0.35 mg ; Biotina : 150 µg ; Pantotenato de Calcio : mg ; Acido nicotinico : 20 mg ; Mn : 30 mg ; Zn : 50 mg ; I : 0.3 mg ; Fe : 50 mg ; Cu : 6 mg ; Se : 0.1 mg ; Etoxiquina : 125 mg .

Tabla 6.2 : Composiciones analítica de los cereales Tabla 6.3 Parámetros productivos de las semanas 22 a 42 (protocolo experimental completo) 1. Comparación con gallinas genéticamente perfectas (valor dado por el distribuidor de las gallinas) . Los valores son las media de ocho réplicas de 15 gallinas. Dentro de las columnas, las medias seguidas por un superindices diferente son significativamente diferentes (P < 0.05) .

Tabla 6.4 : Efecto del Xilano sobre el desempeño a la hora de poner huevos de gallinas ponedoras alimentadas con trigo (en valores absolutos1 y porcentajes2 en comparación con el control) Para el periodo de las semanas 22-42 Tabla 6.5: Efecto de la Preparación de Enzimas sobre el desempeño a la hora de poner de gallinas ponedoras alimentadas con cebada (en valores absolutos1 y porcentaje2 comparados con el control) Para el periodo de las semanas 22-42 Bibliografía Bourdillon A., Carré B., Conan L., Duperray J. , Franscesch M., Fuentes M., Hyghebaert G., Jansen W.M.M.A., Leclercq B., Lessire M. , McNab J. , Rigoni., Wiseman J. , 1990. European reference method for the in vitro determination of metabolizable energy with adult cockerels: reproductibility, effect of age, comparison with predicted valúes. Bri tish Poul try Science 31, 567-576.

Sabatier A.M., Fish N.M. 1996. Method of analysis for feed enzymes: metodological problems? Journal of Applied Poul try Research 5, 408-413.

Barrier-Guillot B. Métayer J.P., Bouvarel I., Castamg J., Picard M., Zwick J.L. 1997. Proceedings of the Xi th European Symposium on Poul try Nutri tion, WPSA, Aug 24-28th Faaborg, Denmark, 237-239. Svihus B., Herstad 0. Newman C.W., Newman R.K. 1997. Brí tish Poul try Science 38, 524-529. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante -para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. El Peni ci lli um funi culosum novedoso depositado bajo el tratado de Budapest IMI No. 378536.
2. 2. Una mezcla de enzimas novedosas, caracterizada porque se obtiene de Peni cil li um funi culosum depositado bajo el tratado de Budapest en el Instituto Micológico Internacional bajo el número IMI 378536. 3. Una mezcla de enzimas novedosas, caracterizada porque se obtiene de Peni cilli um funi cul osum IMI 378536, al menos con actividad de xilanasa a un pH óptimo comprendido entre pH
3. 3.0 y 5.0.
4. 4. Una ß-glucanasa, caracterizada porque se obtiene de Peni cill i um funi culosum IMI 378536.
5. 5. Una Feruloil esterasa, caracterizada porque se obtiene de IMI 378536.
6. 6. Una mezcla de enzimas novedosas, caracterizada porque se obtiene de Peni ci ll i um funi culosum IMI 378536 que contiene al menos xilanasas, ß-glucanasas, celulasas y feruloil esterasas.
7. 7. La mezcla de enzimas novedosas de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la relación entre las xilansas, de acuerdo a lo definido por el método del arabinoxilano de trigo con ADN, pH 3.5, y ß-glucanasas/celulasa determinadas por el método de la CMC con DNS, pH 5.0, está comprendida entre 10/1 y 1/4.
8. 8. Una composición liquida novedosa, que se obtiene de Penicillium funiculosum IMI 378536, caracterizada porque comprende: Productos microbianos totales coo sólidos orgánicos 4% - 10%. Agente antimicrobiano 0.005% - 0.35% Sorbitol 20% - 50% - Agentes anticongelantes 0 - 40% Caldo de fermentación filtrado, fermentado 0.3 a 76% Amortiguado y ajustado de pH 3 a 5.
9. 9. La composición liquida novedosa, de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el antihongo y/o antibacteria se eligen del ácido sórbico y sus sales, ácido benzoico y sus sales, 4-hidroxibenzoato de metilo, 4-hidroxibenzoato de n-propilo, ácido fumárico, sus sales y esteres, cloruro de sodio o cloruro de potasio.
10. 10. La composición liquida novedosa de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque el agente anticongelante se elige de 1 , 2-propandiol, etilen glicol, glicerol .
11. 11. Composiciones en polvo novedosas que se obtienen de Penicillium funiculosum IMI 378536, caracterizadas porque tienen la siguiente composición. Porductos microbianos como sólidos orgánicos totales 16% - 40% Portador 59% - 83% Otros componentes de caldo de fermentación secos 1%
12. 12. La composición en polvo novedosa, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque los portadores se eligen de harina de trigo, almidón, yeso, maltodextrina, sólidos de maiz, subproductos del procesamiento de cereales, tales partículas de maiz, trigo de calidad media, salvado de trigo y residuos de centeno.
13. 13. El uso novedoso del producto novedoso de una de las reivindicaciones precedentes para alimentar animales de granja tales como aves de corral, cerdos, rumiantes .
14. 14. El uso novedoso del producto de conformidad con la reivindicación 13, para mejorar la digestibilidad de los cereales, tales como el trigo, cebada, centeno, tritrical, avena, arroz; semillas oleosas, tales como la soya, girasol, colza; y subproductos de cereales, tales como el salvado de trigo.
15. 15. El uso novedoso del producto de conformidad con las reivindicaciones 6 a 12, para hacer disminuir la excreción de fósforo.
16. 16. El uso novedoso del producto de conformidad con las reivindicaciones 6 a 12, para incrementar la utilización digestiva del fósforo.
17. 17. El uso novedoso del producto de conformidad con la reivindicación 1, para mejorar la digestibilidad de los aminoácidos.
18. 18. El uso novedoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones para reducir el amoniaco en el aire de las baterias.
19. 19. El Peni cilli um funi culosum, caracterizado porque comprende inclusiones de genes heterólogos.
20. 20. El Penicilli um funi culosum, caracterizado porque comprende la modificación del genoma con genes homólogos por inclusión, supresión o modificación del gen homólogo .
21. 21. Un polipéptido novedoso, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 1 y la figura 1.
22. 22. Un polipéptido novedoso, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 1.
23. 23. Un polipéptido novedoso, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 4 y la figura 2
24. 24. Un polipéptido novedoso, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 4.
25. 25. Un polipéptido novedoso, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 5 y la figura 3.
26. 26. Un polipéptido novedoso o una variante del mismo, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 5. 27. Un polipéptido novedoso, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 6.
27. Y la figura 4.
28. 28. Un polipéptido novedoso o una variante del mismo, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID n° 6.
29. 29. polipéptidos novedoso, caracterizados porque tienen la siguiente secuencia de aminoácidos interna: AEAINYNQDY.
30. 30. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para el polipéptido xilanasa C o una variante del mismo.
31. 31. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para el polipéptido xilanasa Bl o una variante del mismo.
32. 32. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para el polipéptido feruroil esterasa A o una variante del mismo.
33. 33. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para el polipéptido feruroil esterasa B o una variante del mismo.
34. 34. vectores, caracterizados porque comprenden la secuencia de conformidad con las reivindicaciones 22, 24, 26 y 28 o las reivindicaciones 30 a 33.
35. 35. Los vectores de conformidad con la reivindicación 34, caracterizados porque son plásmidos, fagos o virus.
36. 36. El uso de los vectores de conformidad con la reivindicación 34 para la expresión de polipéptidos novedosos de conformidad con las reivindicaciones 21 a 29 en una célula huésped.
37. 37. Una célula huésped, caracterizada porque es transfectada o infectada por un vector de conformidad con la reivindicación 34.
38. 38. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque se aisla de un organismo uni o pluricelular.
39. 39. El uso de la célula huésped de conformidad con la reivindicación 37, para la producción de polipéptidos novedosos de conformidad con las reivindicaciones 21 a 29 o la mezcla de enzimas de conformidad con las reivindicaciones 2, 6 y 7.