MXPA97002146A

MXPA97002146A - Preparacion de enzimas estabilizadas con sal

Info

Publication number: MXPA97002146A
Application number: MXPA/A/1997/002146A
Authority: MX
Inventors: Carolus Maria Barendse Rudolf; Harz Hanzpeter; Jurgen Betz Roland
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1997-03-20
Publication date: 1997-06-01

Abstract

La presente invención describe métodos para mejorar la estabilidad al procesado y almacenamiento de preparaciones secas de enzimas. En este punto, una sal inorgánica, por ejemplo MgSO4, se disuelve un una solución que contiene la enzima, la cual se seca subsecuentemente, usando por ejemplo deshidratación por aspersión. No solamente la adición de sal mejora el rendimiento de actividad enzimática con el secado, sino también la estabilidad al almacenamiento y procesado de la composición sólida obtenida que contiene la enzima y la sal inorgánica son mejoradas con respecto a la actividad enzimática. La invención describe adicionalmente composiciones sólidas que comprenden las enzimas y sales inorgánicas.

Description

PREPARACIÓN DE ENZIMAS ESTABILIZADAS CON SAL CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona a la conversión de soluciones de enzimas a preparaciones de enzimas sólidas con rendimiento mejorado de secado, y estabilidad hacia el almacenamiento y procesado. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La amplitud del campo de aplicación, y por lo tanto la importancia de las enzimas en la tecnología moderna está creciendo rápidamente. Sin embargo, uno de los mayores inconvenientes de estos compuestos, es su capacidad de desactivación, causada no solamente por extremos de temperatura, pH y similares durante su procesado, sino que también ocurre espontáneamente con el almacenamiento prolongado bajo condiciones de otro modo normales. Los métodos conocidos en la técnica, aplicados frecuentemente para disminuir este problema incluyen el uso de una variedad de aditivos reivindicados para estabilizar enzimas en solución, o la conversión de la enzima a una formulación seca, por medio de liofilizado, secado por aspersión u otras técnicas adecuadas para este propósito. La conversión de una enzima en solución a una forma seca frecuentemente es obligatoria cuando la aplicación así lo demanda ( por ejemplo el mezclado conveniente con otros componentes secos ). Aunque el secado en si mismo es una herramienta valiosa en la mejoría de la estabilidad al almacenamiento de la enzima, la etapa del proceso misma frecuentemente causa una pérdida substancial de la actividad, y el producto REF : 24240 final todavía es susceptible de inactivación. Esta pérdida de actividad durante el almacenamiento o el procesado es fuertemente dependiente del contenido de humedad de la preparación, y ésto por lo tanto tiene que ser controlado más estrictamente, para mantener la tan valiosa estabilidad del producto. Esto también incluye una severa reducción de la selección en los compuestos adecuados para se adición al producto final de la enzima, para la consideración de la estandarización, u otros propósitos. En una variedad de casos, la enzima seca se propone para aplicaciones en las cuales la enzima tiene que ser incorporada en un producto en el cual el contenido de humedad no puede ser controlado tan estrictamente. En estos casos, la estabilidad de la enzima se reduce entonces severamente. Se han hecho varias invenciones en el campo de estabilizar enzimas contra las pérdidas ocurridas durante el secado y el almacenamiento y manejo subsecuentes. La mayor parte de estas invenciones ( tales como las presentadas en la patente ( solicitudes ) US 3515642, EP 0501375A1 y WO 91/14773 ) están relacionadas con la adición de componentes de carbohidrato y, más específico, azúcar o poliol al concentrado de enzimas. También conocida en la técnica es la inclusión de componentes en la formulación, con el objetivo de producir un producto cristalino a la temperatura del almacenamiento, mejorando así la estabilidad de la enzima ( EP 0383569A2 ).

Otra aproximación es la adición a la formulación de uno o varios componentes capaces de absorber la humedad. Esto reducirá la actividad del agua de la preparación final, o prevendrá temporalmente la interacción del agua que penetra desde los alrededores con la enzima misma. El uso de sales orgánicas e inorgánicas como un auxiliar de procesado (por ejemplo para mejorar el comportamiento de flujo del producto) o un agente de carga/estandarización es bien conocido. Sin embargo, el uso de sales inorgánicas para mejorar la estabilidad de las preparaciones secas de enzimas durante su procesado o almacenamiento no parece estar descrito en la técnica. En algunos casos, la desestabilización de las enzimas debido a la adición fué aún específicamente mencionada ( ver por ejemplo Mikhailova et al., 1989, Vestsi Akad Navuk BSSR, Ser. Biyal Navuk 6: 62-65 ). EP 0522269A2 describe la adición de carbonato de calcio insoluble a una solución de enzima que va a ser deshidratada por aspersión. WO 92/11347 describe la incorporación de sales inorgánicas soubles en agua a granulados que contienen enzimas. Las sales inorgánicas solubles en agua deben ser seleccionadas de tal manera que no afecten la estabilidad al almacenamiento del granulado de enzimas. WO 92/11347 proporciona varias sales de sodio y potasio como adecuadas para este propósito. Las sales inorgánicas solubles en agua son sin embargo agregadas a las enzimas en forma seca antes de su granulación por extrusión.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para la producción de formulaciones sólidas de enzimas con rendimientos mejorados de secado, y estabilidad mejorada al almacenamiento y al procesado de los productos resultantes. Esto se logra preparando una solución que comprende una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, preferiblemente una sal inorgánica de un catión divalente, más preferiblemente una sal de zinc, magnesio o calcio, más preferiblemente sulfato de zinc o de magnesio, y subsecuente secado del producto. También puede ser usada para este propósito una combinación de sales, así como una combinación de enzimas. Se prefieren los cationes divalentes, porque proporcionan la mejor estabilidad al almacenamiento y procesado. Se prefiere el sulfato como anión porque proporciona el mejor rendimiento de secado. La invención también proporciona formulaciones sólidas de enzimas obtenidas preparando una solución que comprende una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, preferiblemente una sal inorgánica de un catión divalente, más preferiblemente una sal de zinc, magnesio o calcio, más preferiblemente sulfato de zinc o de magnesio, y subsecuente secado de la solución que comprende la enzima y la sal inorgánica soluble en agua. En el método de la invención, la sal estápresente mientras la enzima está todavía en solución, es decir, antes del secado. No solamente esto resulta en un rendimiento mayor durante el secado, sino también la estabilidad al almacenamiento de la preparación seca de enzima obtenida se mejora, así como también su estabilidad al procesado. La estabilidad al procesado se entiende en la presente que significa la estabilidad de la preparación de enzima durante cualquier manejo de la preparación de enzima diferente del almacenamiento, tal como por ejemplo el mezclado de la preparación de enzima con otros componentes, o durante la aplicación de la enzima. El secado de la solución que contiene la enzima y la sal resultará en una composición sólida que es homogénea con respecto a la distribución de la enzima y la sal. El secado de la solución que contiene la enzima y la sal puede ser logrado por cualquier método de secado disponible para la persona experta, tal como el secado por aspersión, liofilización, secado por vacío, secado en lecho fluido, y secado por microondas. El secado de la solución de enzima-sal también puede ser combinado con métodos de granulación, que comprenden por ejemplo el uso de un secador de lecho fluido o uno de Etapas múltiples (MSD). En el caso del uso de estos métodos de granulación, la persona experta entenderá que la composición obtenida no es necesariamente completamente homogénea. Las partículas obtenidas por lo general consistirán de aglomerados de partículas homogéneas, o consistirán de partículas revestidas con un núcleo homogéneo, con un revestimiento homogéneo y/o combinaciones de los mismos. En cualquier caso, habrá una interdispersión homogénea de la enzima y la sal una con respecto de la otra. Los ejemplos específicos de la invención demuestran que el efecto estabilizante de la sal se incrementa con la dosificación incrementada de la sal a la solución de enzima, hasta que en un cierto punto los incrementos adicionales en la dosificación de la sal ya no producen una mejora adicional en la estabilidad de la enzima. Por esta razón, se agrega a la solución de enzima al menos 5 %, preferiblemente al menos 15 %, más preferiblemente al menos 30 %, todavía más preferiblemente al menos 60 %, y más preferiblemente al menos 90 % (p/p) de sal, en donde la dosificación de sal se expresa como el porcentaje en peso ( p/p ) de sal agregada, basado en el peso de la enzima en solución, que no incluye el peso del agua de cristalización de los cristales de sal. Aunque no existe un límite superior a la adición de la sal desde el punto de vista de la invención, resulta un límite físico de la solubilidad máxima de la sal en el concentrado de enzima. Entonces, solamente pueden ser realizadas proporciones mayores de sal/enzima por la dilución de la solución de enzima, o el uso de una combinación de sales. Otro punto de consideración debe ser la dosificación a la cual se le "disminuye la solubilidad" a la enzima, y esto es dependiendo de ambas cosas, el tipo de sal y la enzima específica bajo consideración. Las combinaciones de sales y enzimas que dan lugar al fenómeno de "disminución de solubilidad" no están excluidas de la invención. La invención puede ser usada con enzimas o mezclas de enzimas de cualquier tipo, que incluyen pero no están limitadas a fitasas y otras fosfatasas, amilasas, proteasas, lipasas y fosfolipasas, celulasas tales como ß-glucanasas, pectinasas, hemicelulasas tales como xilanasas y otras enzimas que degradan la pared celular de plantas, esterasas, rennets (cuajos) tales como proteasas fúngicas o quimosina, y ß-galactosidasas. Va a entenderse que cada vez que se refiera a la enzima o una enzima, también se incluyen en estos términos mezclas de enzimas, sin considerar si tales mezclas son asequibles directamente en una sola fermentación, o mezclando enzimas asequibles en diferentes fermentaciones; y que incluyen adicionalmente enzimas asequibles por fermentación de organismos recombinantes. La enzima preferiblemente se selecciona del grupo que comprende fitasas fúngicas, hemicelulasas fúngicas, celulasas fúngicas y proteasas bacterianas. Más preferiblemente, la enzima se selecciona del grupo que comprende fitasas y endo-xilanasas derivables de un hongo que pertenece al Grupo del Aspergillus niger, definido por Raper y Fennell ( 1965, en: The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, páginas 293-344 ), ß-glucanasas y endo-xilanasas derivables de una especie de Trichoderma, y proteasas derivables de especies de Bacillus. La invención también describe composiciones sólidas que comprenden al menos una enzima y una sal inorgánica, en donde la dosificación de la sal inorgánica es de al menos 5 % ( p/p ) del peso de la(s) enzima(s). Preferiblemente, la sal inorgánica es una sal de un catión divalente, más preferiblemente una sal de zinc, magnesio o calcio, más preferiblemente sulfato de zinc o de magnesio. La dosificación de la sal inorgánica en la composición es de al menos 5 % ( p/p ), preferiblemente al menos 15 %, más preferiblemente al menos 30 %, todavía más preferiblemente al menos 60 %, y más preferiblemente al menos 90 % del peso de la(s) enzima(s). Las enzimas que pueden ser preparadas en composiciones de acuerdo a la invención incluyen todas aquellas mencionadas arriba, particularmente aquellas que se prefieren. En una modalidad adicional de la invención, las composiciones sólidas descritas arriba se usan para preparar una alimentación para animales. La preparación de alimento para animales frecuentemente incluye una etapa de formación de pelets o pelotillas, durante la cual se puede perder una cantidad significativa de actividad de la enzima. El uso de la composición sólida de la invención reduce estas pérdidas en actividad de la enzima durante la formación de pelets o pelotillas. Típicamente, una composición de alimentación para animales comprende materias primas de origen vegetal, que proporcionan energía y metabolitos para el crecimiento. La alimentación se suplementa con minerales y vitaminas, y es común agregar grasa animal y proteínas de origen animal a la alimentación. En todavía otra modalidad de la invención, se describe una composición sólida que comprende una fitasa con una estabilidad al almacenamiento mejorada. La estabilidad al almacenamiento de la fitasa en esta composición sólida es tal que con el almacenamiento durante 8 semanas, preferiblemente en un recipiente cerrado, a 30° C, se pierde menos del 35 %, preferiblemente menos del 20 %, más preferiblemente menos del 10 %, y más preferiblemente menos del 5 % de la actividad inicial de la fitasa. Las composiciones de fitasa pueden comprender un portador orgánico o inorgánico fisiológicamente aceptable ( por ejemplo portadores con base de granos, como afrecho de trigo, harina de trigo, hollejos de arroz, etcétera, otros portadores orgánicos como tapioca, almidón de papa, azúcar de caña, etcétera, portadores inorgánicos como cloruro de sodio, sulfato de potasio, sílice, etcétera ), en combinación con la enzima fitasa, posiblemente combinada con otras enzimas por la consideración de funcionalidades o conveniencias, y agentes para mejorar adicionalmente la apariencia o funcionalidad del producto con respecto a color, comportamiento de flujo, estabilidad física, química o microbiana, olor, sabor, formación de polvo, etcétera. La persona experta entenderá que pueden hacerse composiciones similares para enzimas para alimentación diferentes de las fitasas. Los siguientes ejemplos se proporcionan por vía de ilustración de la invención. EJEMPLOS EJEMPL0 1 Se dividió en dos porciones un concentrado fúngico de fitasa (producido y asequible de Gist-Brocades), que contenía aproximadamente 11 % de enzima por peso. A una porción se agregaron 240 g/l de MgSO4.7H2O. Después de la disolución de la sal, que tuvo por resultado una solución clara, ambas soluciones se secaron por aspersión, usando un secador por aspersión a escala laboratorio Buchi, con una temperatura de entrada de 130° C, y una temperatura de salida de 85° C.

Los polvos resultantes se mezclaron con afrecho de trigo, en una relación de peso de 1:10, para neutralizar cualquier diferencia en la actividad del agua entre las preparaciones. Después de la equilibración, esto se confirmó por la medición de las actividades del agua, y se encontró que ambas eran 0.45 a temperatura ambiente. Los productos finales se almacenaron entonces a 30° C en matraces cerrados, y después del almacenamiento, se analizaron simultáneamente los productos, para determinar- la actividad de la enzima. Después de ocho semanas de almacenamiento, la pérdida de actividad de la preparación sin adición de sal ascendió a 35 %, contra solamente 5 % de pérdida para la preparación con adición de sal. EJEMPLO 2 En porciones separadas de un concentrado de una proteasa alcalina derivada de Bacillus ( producida y asequible de Genencor International Inc. ), que contenía aproximadamente 12 % de proteína de enzima por peso, se disolvieron 0 y 85 g/l de MgS?4.0H2?. Estos concentrados se revistieron entonces sobre un portador de sulfato de sodio, utilizando una máquina para aplicar revestimientos de lecho fluido a escala laboratorio Niro STREA-1. Las pérdidas de actividad para esta etapa del proceso fueron de 28 % y 14 % respectivamente. Las partículas resultantes se mezclaron con un exceso de polvo de detergente comercial que contenía blanqueador para el mercado Europeo, y se incubaron en matraces abiertos a 35° C y 55 % de humedad relativa. Después de 6 semanas de almacenamiento, la actividad restante de la enzima de las preparaciones fué de 42 % con adición de sal, y solamente de 30 % sin adición. EJEMPLO 3 Se disolvieron 240 g/l de MgSO4 7H2? en una porción de concentrado de enzima derivada de Trichoderma (producido y asequible de Gist-Brocades) con un contenido total de materia seca de 25 % por peso, que contenía ambas, una ß-glucanasa y una enzima endo-xilanasa. La solución resultante y el concentrado original se revistieron separadamente sobre un portador de sulfato de sodio, en una máquina para aplicar un revestimiento de lecho fluido Glatt WSG-60. Las pérdidas de actividad en el proceso fueron de 5 % y 10 % para la ß-glucanasa, y de 10 % y 25 % para la endo-xilanasa, con y sin adición de sal, respectivamente. Las partículas resultantes se incubaron a 30° C y 62 % de humedad relativa. Después de 12 semanas de almacenamiento, las pérdidas de actividad para la ß-glucanasa fueron de 10 % y no detectable, y para la endo-xilanasa, las pérdidas de actividad fueron de 10 % y 25 % para cada enzima, con y sin adición de sal, respectivamente. Los granulados también se incorporaron en una mezcla de alimentación, y se sujetaron a un proceso de formación de pelets o pelotillas a escala piloto, a una temperatura de 70° C. Las pérdidas de actividad para la ß-glucanasa ascendieron a 46 % y 59 %, y las pérdidas para la endo-xilanasa, fueron del 37 % y 66 %, con y sin adición de sal, respectivamente.

La mezcla de alimentación usada en el proceso de formación de pelets o pelotillas estaba compuesta de: Componentes % í P ) Maíz 50.00 Alubias (22.9 % de proteína cruda) 3.50 Soya desengrasada (45.5 % de 28.00 proteína cruda) Tapioca 2.38 Harina de animal (58 % de 3.60 proteína cruda) Harina de pescado (72.2 % de 1.00 proteína cruda) Harina de plumas hidrolizada 1.00 Aceite de soya 1.75 Grasa animal 3.50 Premezcla de vitaminas/minerales 3.15 Caliza 0.86 Fosfato de monocalcio 0.96 Cloruro de sodio 0.30 EJEMPLO 4 Se disolvieron cantidades diferentes de sulfato de magnesio en 100 mi de agua desmineralizada, después de lo cual se agregaron a cada porción 100 mi de un concentrado fúngico de fitasa ( producido y asequible de Gist- brocades ) que contenía aproximadamente 17 % por peso de enzima pura. Después del mezclado, las soluciones resultantes se secaron por aspersión, usando un Mini Secador por Aspersión 190 de Buchi a escala laboratorio, con temperaturas de entrada/salida de 140 y 80° C, respectivamente. Los polvos resultantes se mezclaron con afrecho de trigo en una relación de 1:9. Después de la equilibración, se midieron los valores de actividad del agua a 35° C para la muestra de control y para la muestra con la mayor dosificación de sal, para excluir los efectos de la actividad del agua. Las mezclas se incubaron subsecuentemente en botellas cerradas a 35° C por 8 semanas, después de lo cual se midieron las pérdidas de actividad. Los resultados se presentan en la siguiente tabla: dosificación de Actividad del agua Pérdidas por almacenamiento MgS04 de la Mezcla después de 8 semanas a 35° C (g/g de enzima) ( - ) 0 0.292 52 % 0.31 - 37 % 0.61 - 26 % 1.19 - 15 % 1.84 - 15 % 2.38 0.303 17 % EJEMPLO 5 De acuerdo al mismo protocolo mencionado en el ejemplo 4, se usaron diferentes sales, en una dosificación de 80 mmoles por 100 mi de concentrado de fitasa para producir polvos estabilizados de enzima. El mezclado con afrecho de trigo y las pruebas de estabilidad tuvieron lugar análogamente al ejemplo 4. Los resultados se presentan en la siguiente tabla: Actividad del Pérdidas por Pérdidas por Agua Secado por Almacenamiento (-) Aspersión después de 8 Tipo de Sal semanas a 35° C Ninguna 0.29 6% 52% Sulfato de magnesio - 7% 15% cloruro de magnesio 0.30 26% 43% nitrato de magnesio 0.31 32% 27% sulfato de zinc - 5% 9% cloruro de zinc - 48% 5% cloruro de calcio - 40% 18% nitrato de calcio - 44% 13% sulfato de sodio - 11 % 51 % sulfato de potasio - 17% 36% sulfato de amonio - 6% 46% EJEMPLO 6 Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 5, se prepararon tres soluciones que contenían fitasa, que contenían ya sea ninguna sal agregada, sulfato de magnesio, o sulfato de zinc. Estas soluciones se secaron subsecuentemente, usando liofilización en vez de secado por aspersión. La liofilización se realizó congelando las soluciones mixtas de enzima/sal en un matraz, sumergiendo el matraz en nitrógeno líquido, después de lo cuaj se aplicó alto vacío para eliminar el agua. Las preparaciones secas resultantes se molieron en un mortero, y se mezclaron con afrecho de trigo antes de las pruebas de estabilidad por 8 semanas a 35° C en botellas cerradas. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla. Actividad del agua Pérdidas de la Actividad de la mezcla después de 8 semanas Tipo de Sal a 35° C Ninguna 0.31 46 % sulfato de magnesio 0.31 16 % sulfato de zinc - 3 % Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para mejorar la estabilidad al procesado o la estabilidad al almacenamiento de una preparación sólida de enzimas, caracterizado porque se seca una solución que contiene una enzima y una sal inorgánica soluble en agua según, el cual la dosificación de la sal inorgánica es de al menos 5 % ( p/p ) del peso de la enzima.
2. Un método para preparar una composición sólida estable al almacenamiento y estable al procesado que comprende una enzima, el método está caracterizado porque comprende las etapas de: a) preparar una solución que comprende una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la dosificación de la sal inorgánica es de al menos 5 % del peso de la enzima, y b) secar la solución.
3. Un método de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la sal inorgánica comprende un catión divalente.
4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el catión divalente se selecciona del grupo que consiste de zinc, magnesio y calcio.
5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la sal inorgánica comprende un anión sulfato.
6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la enzima se selecciona del grupo que comprende una fitasa, preferiblemente de Aspergillus, una proteasa, preferiblemente de Bacillus, una hemicelulasa, preferiblemente de Aspergillus, una hemicelulasa y una celulasa, ambas preferiblemente de Tríchoderma.
7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el secado de la solución que contiene la enzima y la sal inorgánica comprende el uso de un secador seleccionado del grupo que consiste de un secador por aspersión, un secador de lecho fluido y un liofilizador.
8. Una composición sólida, carcaterizada porque comprende al menos una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la dosificación de la sal inorgánica es de al menos 5 % ( p/p ) del peso de la enzima, y en donde la sal inorgánica comprende un catión divalente.
9. Una composición sólida, asequible: a) preparando una solución que comprende una enzima y una sal inorgánica soluble en agua, en donde la dosificación de la sal inorgánica es de al menos 5 % del peso de la enzima, y b) secando la solución.
10. Una composición sólida de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque la sal es como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
11. Una composición sólida de conformidad con las reivindicaciones 8- 10, caracterizada porque la enzima es como se definió en la reivindicación 6.
12. Una composición sólida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 , caracterizada porque la composición es homogénea con respecto a la distribución de la sal inorgánica y la enzima.
13. Una composición sólida de conformidad con las reivindicaciones 8-11 , caracterizada porque la composición comprende partículas que son homogéneas con respecto a la distribución de la sal inorgánica y la enzima.
14. Una composición sólida de conformidad con las reivindicaciones 8-11 , caracterizada porque la composición comprende un revestimiento que es homogéneo con respecto a la distribución de la sal inorgánica y la enzima.
15. Una composición sólida caracterizada porque comprende una fitasa con una estabilidad al almacenamiento que está caracterizada porque con el almacenamiento de la composición sólida durante 8 semanas a 30° C, se pierde menos del 35 % de la actividad inicial de la fitasa.
16. Una alimentación para animales caracterizada porque comprende una composición sólida como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 8-15.