BR112021004833A2 - composições de ração animal e usos das mesmas - Google Patents

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BR112021004833A2
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polypeptide
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muramidase
amino acids
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Raffaella Aureli
Rual Lopez-Ulibarri
Estefania Perez Calvo
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Dsm Ip Assets B.V.
Novozymes A/S
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Abstract

A presente invenção se refere a uma composição e/ou uma ração animal compreendendo polipeptídeos que têm atividade de muramidase e polipeptídeos que têm atividade de xilanase e uso das mesmas.

Description

“COMPOSIÇÕES DE RAÇÃO ANIMAL E USOS DAS MESMAS” REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada ao presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção
[0002] A presente invenção se refere a uma composição e/ou uma ração animal compreendendo polipeptídeos que têm atividade de muramidase e polipeptídeos que têm atividade de xilanase e uso das mesmas. Descrição da Técnica Relacionada
[0003] Muramidase, também chamada de lisozima, é uma O- glicosil hidrolase produzida como um mecanismo de defesa contra bactérias por muitos organismos. A enzima causa a hidrólise de paredes de célula bacteriana clivando-se as ligações glicosídicas de peptidoglicano; uma molécula estrutural importante nas bactérias. Após deixar suas paredes celulares enfraquecidas por meio da ação de muramidase, ocorre a lise das células bacterianas como resultado da pressão osmótica não balanceada.
[0004] Muramidase ocorre naturalmente em muitos organismos como vírus, plantas, insetos, aves, répteis e mamíferos. Em mamíferos, a Muramidase foi isolada das secreções nasais, saliva, lágrimas, conteúdo intestinal, urina e leite. A enzima cliva a ligação glicosídica entre o carbono número 1 de ácido N-acetilmurâmico e carbono número 4 de N-acetil-D-glucosamina. In vivo, esses dois carboidratos são polimerizados para formar o polissacarídeo de parede celular de muitos microrganismos.
[0005] Muramidase foi classificada em cinco famílias de glicosídeo hidrolase (GH) diferentes (CAZy, www.cazy.org): muramidase de clara de ovo de galinha (GH22), muramidase de clara de ovo de ganso (GH23), muramidase de bacteriófago T4 (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) e muramidases de Chalaropsis (GH25). A muramidase extraída da clara de ovo de galinha (uma muramidase GH22) é o produto primário disponível no mercado e, tradicionalmente, foi apenas referida como muramidase muito embora nos dias de hoje haja muitas outras muramidases conhecidas.
[0006] Os xilanos são hemiceluloses encontradas em todas as plantas terrestres (Popper e Tuohy, Plant Physiology, 2010, 153:373-383). São especialmente abundantes em paredes celulares secundárias e células de xilem. Em gramíneas, com paredes celulares tipo II, os glucurono arabinoxilanos são a hemicelulose principal e estão presentes como fibra dietética solúvel ou insolúvel em muitos produtos alimentícios e de ração baseados em gramíneas.
[0007] As enzimas conhecidas responsáveis pela hidrólise da cadeia principal do xilano são classificadas em famílias de enzima com base na similaridade de sequência (www.cazy.org). As enzimas com principalmente atividade de endo-xilanase foram anteriormente descritas na família de Glicosídeo hidrolase (GH) 5, 8, 10, 11, 30 e 98. As enzimas em uma família compartilham algumas características como dobra em 3D e as mesmas normalmente compartilham o mesmo mecanismo de reação. Algumas famílias de GH têm características de especificidade de substrato estreita ou monoespecífica enquanto outras famílias têm especificidades de substrato amplas.
[0008] As xilanases GH10 e GH11 comercialmente disponíveis são frequentemente usadas para quebrar a cadeia principal de xilose de arabinoxilano. Em ração animal isso resulta em uma degradação da parede celular do cereal com um aprimoramento subsequente na liberação de nutriente (amido e proteína) encapsulado nas células. A degradação de xilano também resulta na formação de oligômeros de xilose que podem ser utilizados para a fermentação na parte posterior do intestino e, portanto, pode ajudar um animal a obter mais energia digerível.
[0009] Há muitos pedidos de patente que revelam a combinação de uma xilanase e uma muramidase em combinação com muitos outros ingredientes de ração e/ou remédios herbais. No entanto, em todos os casos, a muramidase testada é a muramidase da clara do ovo e não é possível discernir se é a combinação de muramidase e xilanase sozinha que fornece qualquer benefício (caso haja) ou a mistura de todos os componentes.
[0010] Foi mostrado no documento WO 2017/001703 que as muramidases microbianas aprimoram o desempenho animal. No entanto, combinando-se diferentes tipos de enzimas frequentemente não resulta em quaisquer resultados benéficos sobre a única enzima, vide T. T. dos Santos et al., “Xylanase, protease and superdosing phytase interactions in broiler performance, carcass yield and digesta transit time”, Animal Nutrition (2017), 3, 121-126 e Adeola e Cowieson, “Opportunities and challenges in using exogenous enzymas to improve nonruminant animal production”, J Anim Sci, (2011), 89, 189-3218.
[0011] O aprimoramento do desempenho de crescimento de animais da fazenda é necessário em um mundo com uma população crescente que consome mais proteína animal, e é o objetivo da presente invenção planejar soluções que ajudem a satisfazer esse desafio.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] A presente invenção se refere a uma composição compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase.
[0013] A presente invenção se refere a uma ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase.
[0014] A presente invenção se refere adicionalmente a um método de aprimorar a digestibilidade em um animal que compreende administrar a um animal a composição ou a ração animal da presente invenção.
[0015] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso da composição ou da ração animal da presente invenção no aprimoramento de digestibilidade em um animal.
VISÃO GERAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0016] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum conforme descrito no documento WO2013/076253 (SEQ ID NO: 4).
[0017] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum conforme descrito no documento WO2013/076253 (SEQ ID NO: 8).
[0018] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus fumigatus conforme descrito no documento WO2011/104339 (SEQ ID NO: 3).
[0019] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichoderma reesei conforme descrito no documento WO2009/102755 (SEQ ID NO: 4).
[0020] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trametes cinnabarina conforme descrito no documento WO2005/080559 (SEQ ID NO: 2).
[0021] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Sporormia fimetaria conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 3).
[0022] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 6).
[0023] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 9).
[0024] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 12).
[0025] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 15).
[0026] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Onygena equina conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 18).
[0027] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Purpureocillium lilacinum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 21).
[0028] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichobolus zukalii conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 24).
[0029] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium citrinum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 27).
[0030] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cladorrhinum bulbillosum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 30).
[0031] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Umbelopsis westeae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 33).
[0032] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zygomycetes sp. XZ2655 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 36).
[0033] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Chaetomium cupreum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 39).
[0034] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cordyceps cardinalis conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 42).
[0035] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium sp. 'qii' conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 45).
[0036] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus sp. nov XZ2609 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 48).
[0037] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 51).
[0038] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 54).
[0039] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Pycnidiophora cf dispera conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 60).
[0040] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermomucor indicae-seudaticae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 63).
[0041] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Isaria farinosa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 66).
[0042] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 69).
[0043] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zopfiella sp. t180-6 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 72).
[0044] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Malbranchea flava conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 75).
[0045] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypholoma polytrichi conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 80).
[0046] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus deflectus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 83).
[0047] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus stictoideus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 86).
[0048] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniochaeta sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 89).
[0049] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Daldinia fissa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 92).
[0050] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rosellinia sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 95).
[0051] SEQ ID NO: 36 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus sp. ZY179 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 98).
[0052] SEQ ID NO: 37 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Curreya sp. XZ2623 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 101).
[0053] SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniothyrium sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 104).
[0054] SEQ ID NO: 39 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 107).
[0055] SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Xylariaceae sp. 1653h conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 110).
[0056] SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 113).
[0057] SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Yunnania penicillata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 116).
[0058] SEQ ID NO: 43 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Engyodontium album conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 119).
[0059] SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metapochonia bulbillosa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 122).
[0060] SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hamigera paravellanea conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 125).
[0061] SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metarhizium iadini conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 128).
[0062] SEQ ID NO: 47 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermoascus aurantiacus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 131).
[0063] SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Clonostachys rossmaniae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 134).
[0064] SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Simplicillium obclavatum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 137).
[0065] SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus inflatus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 140).
[0066] SEQ ID NO: 51 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paracremonium inflatum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 143).
[0067] SEQ ID NO: 52 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Westerdykella sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 146).
[0068] SEQ ID NO: 53 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 155).
[0069] SEQ ID NO: 54 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Gelasinospora cratophora conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 158).
[0070] SEQ ID NO: 55 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Flammulina velutipes conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 221).
[0071] SEQ ID NO: 56 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Deconica coprophila conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 224).
[0072] SEQ ID NO: 57 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rhizomucor pusillus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 227).
[0073] SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 230).
[0074] SEQ ID NO: 59 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 233).
[0075] SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Myceliophthora fergusii conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 3).
[0076] SEQ ID NO: 61 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Mortierella alpina conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 15).
[0077] SEQ ID NO: 62 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium atrovenetum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 27).
[0078] SEQ ID NO: 63 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea saccata conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 257).
[0079] SEQ ID NO: 64 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium thermophilum conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 264).
[0080] SEQ ID NO: 65 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichoderma harzianum conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 267).
[0081] SEQ ID NO: 66 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea minuta conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 291).
[0082] SEQ ID NO: 67 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium sp. ZY287 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 294).
[0083] SEQ ID NO: 68 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Mortierella sp. ZY002 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 297).
[0084] SEQ ID NO: 69 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Metarhizium sp. XZ2431 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 300).
[0085] SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Geomyces auratus conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 303).
[0086] SEQ ID NO: 71 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Ilyonectria rufa conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 306).
[0087] SEQ ID NO: 72 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus conforme descrito no documento WO1994/021785 (SEQ ID NO: 5).
[0088] SEQ ID NO: 73 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Clostridium acetobutylicum conforme descrito em Appl. Environ. Microbiol. 1987, 53(4):644.
[0089] SEQ ID NO: 74 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus conforme descrito no documento WO2005/059084 (SEQ ID NO: 8).
[0090] SEQ ID NO: 75 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Thermotoga maritima MSB8 conforme descrito no documento WO2013/068550 (SEQ ID NO: 1).
[0091] SEQ ID NO: 76 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Ascobolus stictoideus conforme descrito no documento WO2016/095856 (SEQ ID NO: 102).
[0092] SEQ ID NO: 77 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Ustilago maydis conforme descrito no documento WO2016/095856 (SEQ ID NO: 177).
[0093] SEQ ID NO: 78 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Talaromyces emersonii conforme descrito no documento WO2001/42433 (SEQ ID NO: 1).
[0094] SEQ ID NO: 79 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH10 de Talaromyces emersonii conforme descrito no documento WO2002/24926 (SEQ ID NO: 2).
[0095] SEQ ID NO: 80 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Myceliophthora thermophila conforme descrito no documento WO2009/018537 (SEQ ID NO: 41).
[0096] SEQ ID NO: 81 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Lasiodiplodia theobromae conforme descrito no documento WO2016/095856 (SEQ ID NO: 99).
[0097] SEQ ID NO: 82 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Penicillium funiculosum conforme descrito no documento WO1999/57325 (SEQ ID NO: 1).
[0098] SEQ ID NO: 83 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Bacillus subtilis conforme descrito no documento WO2001/66711 (SEQ ID NO: 1).
[0099] SEQ ID NO: 84 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Trichoderma viride conforme descrito no documento WO2002/38746 (Figura 16G).
[0100] SEQ ID NO: 85 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Thermopolyspora flexuosa conforme descrito no documento WO2005100557 (SEQ ID NO: 12).
[0101] SEQ ID NO: 86 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Trichoderma reesei conforme descrito no documento WO1993/24621 (SEQ ID NO: 2).
[0102] SEQ ID NO: 87 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Trichoderma reesei conforme descrito no documento WO1993/24621 (SEQ ID NO: 4).
[0103] SEQ ID NO: 88 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Bacillus subtilis conforme descrito no documento US5306633 (SEQ ID NO: 3).
[0104] SEQ ID NO: 89 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Penicillium funiculosum conforme descrito no documento WO2007/146944 (SEQ ID NO: 79).
[0105] SEQ ID NO: 90 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Thermomyces lanuginosus conforme descrito no documento WO2003/062409 (SEQ ID NO: 2).
[0106] SEQ ID NO: 91 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Dictyoglomus thermophilum conforme descrito no documento WO2011/057140 (SEQ ID NO: 305).
[0107] SEQ ID NO: 92 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Paenibacillus Pabuli conforme descrito no documento WO2005/079585 (SEQ ID NO: 2).
[0108] SEQ ID NO: 93 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Geobacillus stearothermophilus conforme descrito no documento WO2016/095856 (SEQ ID NO: 78).
[0109] SEQ ID NO: 94 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Streptomyces beijiangensis conforme descrito no documento WO2016/095856 (SEQ ID NO: 84).
[0110] SEQ ID NO: 95 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Fusarium oxysporum conforme descrito no documento WO2014/019220 (SEQ ID NO: 8).
[0111] SEQ ID NO: 96 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH11 de Aspergillus clavatus conforme descrito no documento WO2014/020143 (SEQ ID NO: 8).
[0112] SEQ ID NO: 97 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus illinoisensis conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 3).
[0113] SEQ ID NO: 98 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus sp-18054 conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 9).
[0114] SEQ ID NO: 99 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de elephant dung metagenome conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 15).
[0115] SEQ ID NO: 100 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Chryseobacterium sp-10696 conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 27).
[0116] SEQ ID NO: 101 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de elephant dung metagenome conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO:
39).
[0117] SEQ ID NO: 102 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de elephant dung metagenome conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 45).
[0118] SEQ ID NO: 103 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus campinasensis conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 67).
[0119] SEQ ID NO: 104 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus sp-62250 conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 73).
[0120] SEQ ID NO: 105 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus favisporus conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 79).
[0121] SEQ ID NO: 106 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus tundrae conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 85).
[0122] SEQ ID NO: 107 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus sp-62603 conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 91).
[0123] SEQ ID NO: 108 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus sp-62332 conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 103).
[0124] SEQ ID NO: 109 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de Paenibacillus sp-62248 conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 109).
[0125] SEQ ID NO: 110 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH5 de compost metagenome conforme descrito no documento WO2016/005522 (SEQ ID NO: 127).
[0126] SEQ ID NO: 111 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Bacillus subtilis conforme descrito no documento PCT/EP2017/065336 (SEQ ID NO: 1).
[0127] SEQ ID NO: 112 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Bacillus amyloliquefaciens conforme descrito no documento PCT/EP2017/065336 (SEQ ID NO: 2).
[0128] SEQ ID NO: 113 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Bacillus licheniformis conforme descrito no documento PCT/EP2017/065336 (SEQ ID NO: 3).
[0129] SEQ ID NO: 114 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Bacillus subtilis conforme descrito no documento PCT/EP2017/065336 (SEQ ID NO: 4).
[0130] SEQ ID NO: 115 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Paenibacillus pabuli conforme descrito no documento PCT/EP2017/065336 (SEQ ID NO: 5).
[0131] SEQ ID NO: 116 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Bacillus amyloliquefaciens HB-26 conforme descrito no documento PCT/EP2017/065336 (SEQ ID NO: 6).
[0132] SEQ ID NO: 117 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Pseudoalteromonas tetraodonis conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 6).
[0133] SEQ ID NO: 118 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Paenibacillus sp-19179 conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 12).
[0134] SEQ ID NO: 119 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 18).
[0135] SEQ ID NO: 120 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Ruminococcus sp. CAG:330 conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 24).
[0136] SEQ ID NO: 121 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Streptomyces sp-62627 conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 30).
[0137] SEQ ID NO: 122 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Clostridium saccharobutylicum conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 36).
[0138] SEQ ID NO: 123 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Paenibacillus panacisoli conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 42).
[0139] SEQ ID NO: 124 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Human Stool metagenome conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 48).
[0140] SEQ ID NO: 125 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Vibrio rhizosphaerae conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 54).
[0141] SEQ ID NO: 126 é a sequência de aminoácidos madura de uma xilanase GH30 de Clostridium acetobutylicum conforme descrito no documento WO2017/103159 (SEQ ID NO: 60).
DEFINIÇÕES
[0142] Animal: O termo “animal” se refere a qualquer animal exceto seres humanos. Exemplos de animais são animais monogástricos, incluindo, mas sem limitação, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves como perus, patos, codornas, galinha-da-angola, gansos, pombos (incluindo pombos jovens) e galinha (incluindo, mas sem limitação, frangos que servem para corte (referido ao presente documento como frangos de corte), frangos, galinhas poedeiras (referidas no presente documento como poedeiras)); animais de estimação, como gatos e cachorros; cavalos (incluindo, mas sem limitação, de sangue quente, de sangue frio e de sangue morno), crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus) e peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca,
pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de- cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco).
[0143] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura solúvel para, ou destinada para consumo por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados assim como vitaminas, minerais, enzimas, ingredientes microbianos de alimentação direta, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura) enquanto a ração animal para ruminantes geralmente compreende forragem (incluindo fibras e silagem) e pode compreender adicionalmente concentrados assim como vitaminas, minerais, ingredientes microbianos de alimentação direta de enzimas, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura).
[0144] Concentrados: O termo “concentrados” significa ração com altas concentrações de proteína e energia, como farinha de peixe, melaços, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (sejam integrais ou preparados por meio de trituração, moagem, etc., de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), torta de prensagem de semente oleaginosa (por exemplo, de semente de algodão, cártamo, girassol, soja (como farinha de soja), colza/canola, amendoim ou planta oleaginosa da família do amendoim), torta de semente de palma, material derivado de levedura e grãos destiladores (como grãos úmidos de destiladores (WDS)
e grãos secos de destiladores com solúveis (DDGS)).
[0145] Eficiência da ração: O termo “eficiência da ração” significa a quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado à vontade ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. Por "eficiência da ração aumentada" significa que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de consumo de ração em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de aditivo de ração estar presente.
[0146] Forragem: O termo “forragem” conforme definido no presente documento também inclui fibra. Forragem é o material vegetal fresco como feno e silagem de plantas de forragem, gramíneas e outras plantas de forragem, alga do mar, grãos germinados e legumes, ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de plantas de forragem são Alfalfa (luzerna), cornichão perene, brassica (por exemplo, couve- frisada, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo), trevo (por exemplo, trevo alsike, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), gramínea (por exemplo, grama- bermudas, capim, aveia-perene, festucas, cambaleia-grama, prados, panasco, azevém, erva-dos-prados), milho (maís), painço, cevada, aveia, centeio, sorgo, sojas e trigo e vegetais como beterrabas. Forragem inclui adicionalmente resíduos de cultura de produção de grãos (como palha de milho; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resíduos de vegetais como colos de beterraba; resíduos da produção de semente como caules e folhas da soja, colza e outros legumes; e frações do refino de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustível ou outras indústrias.
[0147] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento tem atividade de muramidase.
[0148] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 230 aminoácidos, como pelo menos 235 aminoácidos, pelo menos 240 aminoácidos, ou pelo menos 245 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em um outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 92 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.
[0149] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 180 aminoácidos, como pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos, pelo menos 200 aminoácidos, pelo menos 205 aminoácidos ou pelo menos 210 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em um outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 92 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.
[0150] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, mas sem limitação a, qualquer enzima, variação, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais a mesma está associada por natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor maior forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.
[0151] Atividade de muramidase: O termo “atividade de muramidase” significa a hidrólise enzimática das 1,4-beta- ligações entre resíduos de ácido N-acetilmurâmico e N- acetil-D-glucosamina em um peptidoflicano ou entre resíduos de N-acetil-D-glucosamina em quitodextrinas, resultando em bacteriolise devido à pressão osmótica. A muramidase pertence à classe enzimática EC 3.2.1.17. A atividade de muramidase é tipicamente medida por meio de determinação turbidimétrica. O método se baseia nas alterações na turbidez de uma suspensão de Micrococcus luteus ATCC 4698 induzida pela ação lítica da muramidase. Em condições experimentais adequadas, essas alterações são proporcionais à quantidade de muramidase no meio (conforme INS 1105 do Combined Compendium of Food Additive Specifications da Food and Agriculture Organisation da UN (www.fao.org)). Para os fins da presente invenção, a atividade de muramidase é determinada de acordo com o ensaio de turbidez descrito no exemplo 1 (“Determinação de Atividade de Muramidase”) e o polipeptídeo tem atividade de muramidase se o mesmo mostrar atividade contra uma ou mais bactérias, como Micrococcus luteus ATCC 4698 e/ou Exiguobacterium undea (DSM14481). Como um exemplo, a muramidase GH25 da presente invenção tem pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 1. Como um outro exemplo, a muramidase GH24 da presente invenção tem pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 63.
[0152] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final que segue a tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, como processamento de N-terminal, truncamento de C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.
[0153] Na presente invenção, o polipeptídeo maduro pode ser aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 201 da
SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 13, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 14, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 16, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 19, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 22, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 34, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 36, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 38, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 40, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 42, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 44, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 46, aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 48, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 50, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 51, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 52, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 54, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 56, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 58, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 59, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 60, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 61, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 62, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 63, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 64, aminoácidos 1 a 248 da SEQ ID NO: 65, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 66, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 67, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 68, aminoácidos 1 a 247 da SEQ ID NO: 69, aminoácidos 1 a 250 da SEQ ID NO: 70, aminoácidos 1 a 240 da SEQ ID NO: 71.
[0154] Obtido ou obtenível de: O termo “obtido ou obtenível de” significa que o polipeptídeo pode ser encontrado em um organismo de uma classificação taxonômica específica. De preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do reino Fungi, em que o termo reino é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do filo Ascomycota, em que o termo filo é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do subfilo Pezizomycotina, em que o termo subfilo é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível da classe Eurotiomycetes, em que o termo classe é a classificação taxonômica.
[0155] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não é conhecido, a mesma pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica realizando-se uma busca
BLASTP do polipeptídeo (com o uso, por exemplo, do site do National Center for Biotechnology Information (NCIB) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e comparando o mesmo aos homólogos mais próximos. A pessoa versada na técnica também pode comparar a sequência àquela do pedido conforme depositado. Um polipeptídeo desconhecido que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica que o polipeptídeo conhecido.
[0156] Fibra: O termo “fibra” significa material vegetal seco com altos níveis de fibra, como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de culturas (como paleta, copra, palha, joio, resíduo de beterraba sacarina).
[0157] Identidade de sequência: O parentesco entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro “identidade de sequência”.
[0158] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada com o uso do algoritmo Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443- 453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência, versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido com o uso da opção –nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como a seguir: (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento – Número Total de Lacunas em Alinhamento)
[0159] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa uma preparação que contém no máximo 10 %, no máximo 8 %, no máximo 6 %, no máximo 5 %, no máximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo 0,5 % em peso do outro material de polipeptídeo com o qual é associado de nativa ou recombinantemente. De preferência, o polipeptídeo é pelo menos 92 % puro, por exemplo, pelo menos 94 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 96 % puro, pelo menos 97 % puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % puro, e 100 % puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Isso é alcançado, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos ou por meio de métodos de purificação clássicos.
[0160] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais (diversos) resíduos de aminoácido em uma ou mais (por exemplo, diversas) posições. Uma substituição significa a substituição do aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicional 1, 2, ou 3 aminoácidos adjacentes e imediatamente seguintes ao aminoácido que ocupa a posição.
[0161] Na presente invenção, uma variante de muramidase pode compreender de 1 a 10 alterações, isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações e ter pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da muramidase parental, como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 63.
[0162] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma glucuronoarabinoxilan endo-1,4-beta-xilanase (E.C.
3.2.1.136) que catalisa a endo-hidrólise de ligações de 1,4-beta-D-xilosila em alguns glucuronoarabinoxilanos. A atividade de xilanase pode ser determinada com 0,2 % de AZCL-glucuronoxilano como substrato em 0,01 % de TRITON® X- 100 e 200 mM de fosfato de sódio pH 6 a 37 °C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 µmol de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6 de 0,2 % de AZCL-glucuronoxilano como substrato em 200 mM de fosfato de sódio pH 6. O termo “xilanase” também significa uma 1,4- beta-D-xilano-xilo-hidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos. A atividade de xilanase pode ser determinada com 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em 0,01 % de TRITON® X-100 e 200 mM de fosfato de sódio pH 6 a 37 °C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 µmol de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6 de 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em 200 mM de fosfato de sódio pH 6.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Composição
[0163] Constatou-se surpreendentemente que uma composição que compreende uma muramidase (de preferência, uma muramidase fúngica) e uma xilanase gera um benefício adicional em animais.
[0164] Então, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase.
[0165] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser uma muramidase GH24, de preferência, uma muramidase GH24 fúngica, de preferência, obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe Eurotiomycetes. O polipeptídeo que tem atividade de muramidase também pode ser uma muramidase GH25, de preferência, uma muramidase GH25 fúngica, de preferência, obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe Eurotiomycetes.
[0166] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase pode ser uma xilanase GH10, xilanase GH11, xilanase GH5, de preferência, uma xilanase GH5 da família 21 ou 35 (no presente documento escrita como GH5_21 e GH5_35, respectivamente), ou xilanase GH30, de preferência, uma xilanase GH30 da subfamília 8 (no presente documento escrita como GH30_8).
[0167] De preferência, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é uma muramidase GH24 fúngica que degrada detritos da parede celular de Lactobacillus johnsonii e o polipeptídeo que tem atividade de xilanase é uma xilanase GH10, xilanase GH11, xilanase GH5, xilanase GH5_21, xilanase GH5_35, xilanase GH30 ou GH30_8 xilanase. Com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é obtido ou obtenível a partir do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe Eurotiomycetes.
[0168] De preferência, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é uma muramidase GH25 fúngica que degrada detritos da parede celular de Lactobacillus johnsonii e o polipeptídeo que tem atividade de xilanase é uma xilanase GH10, xilanase GH11, xilanase GH5, xilanase GH5_21, xilanase GH5_35, xilanase GH30 ou GH30_8 xilanase. Com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é obtido ou obtenível a partir do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe Eurotiomycetes.
[0169] De preferência, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase, em que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 33; (ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 63; (bl) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (bu) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) que tem atividade de muramidase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.
[0170] Com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 6,
aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 13, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 14, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 16, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 19, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 22, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 34, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 36, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 38, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 40, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 42, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 44, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 46, aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 48, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 50, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 51,
aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 52, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 54, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 56, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 58, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 59, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 60, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 61, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 62, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 63, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 64, aminoácidos 1 a 248 da SEQ ID NO: 65, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 66, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 67, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 68, aminoácidos 1 a 247 da SEQ ID NO: 69, aminoácidos 1 a 250 da SEQ ID NO: 70 ou aminoácidos 1 a 240 da SEQ ID NO: 71.
[0171] De preferência, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase, em que o polipeptídeo que tem atividade de xilanase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 72; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 73; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 74; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 75; (e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 76; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 77; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 78; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 79; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 80; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 81;
(k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 82; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 83; (m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 84; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 85; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 86; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 87; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 88; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 89; (s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 90; (t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 91; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 92; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 93; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 94; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 95; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 96;
(z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 97; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 98; (ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 99; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 101; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 102; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 103; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 104; (ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 105; (ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 106; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 108; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 109; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 110; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 111;
(ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 112; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 113; (aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 114; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 115; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 116; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 117; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 118; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 119; (aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 120; (ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 121; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 122; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 123; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 124; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 125; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 126;
(bd) uma variante de SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 ou SEQ ID NO: 126 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (be) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba),
(bb), (bc) ou (bd) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bf) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc) ou (bd) que tem atividade de xilanase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.
[0172] Com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 384 da SEQ ID NO: 72, aminoácidos 1 a 288 da SEQ ID NO: 73, aminoácidos 1 a 308 da SEQ ID NO: 74, aminoácidos 1 a 328 da SEQ ID NO: 75, aminoácidos 1 a 337 da SEQ ID NO: 76, aminoácidos 1 a 323 da SEQ ID NO: 77, aminoácidos 1 a 381 da SEQ ID NO: 78, aminoácidos 1 a 386 da SEQ ID NO: 79, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 80, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 81, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 82, aminoácidos 1 a 185 da SEQ ID NO: 83, aminoácidos 1 a 190 da SEQ ID NO: 84, aminoácidos 1 a 220 da SEQ ID NO: 85, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 86, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 87, aminoácidos 1 a 185 da SEQ ID NO: 88, aminoácidos 1 a 264 da SEQ ID NO: 89, aminoácidos 1 a 195 da SEQ ID NO: 90, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 91, aminoácidos 1 a 182 da SEQ ID NO: 92, aminoácidos 1 a 183 da SEQ ID NO: 93, aminoácidos 1 a 299 da SEQ ID NO: 94, aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 95, aminoácidos 1 a 189 da SEQ ID NO: 96, aminoácidos 1 a 537 da SEQ ID NO: 97,
aminoácidos 1 a 547 da SEQ ID NO: 98, aminoácidos 1 a 598 da SEQ ID NO: 99, aminoácidos 1 a 550 da SEQ ID NO: 100, aminoácidos 1 a 828 da SEQ ID NO: 101, aminoácidos 1 a 577 da SEQ ID NO: 102, aminoácidos 1 a 537 da SEQ ID NO: 103, aminoácidos 1 a 536 da SEQ ID NO: 104, aminoácidos 1 a 536 da SEQ ID NO: 105, aminoácidos 1 a 535 da SEQ ID NO: 106, aminoácidos 1 a 536 da SEQ ID NO: 107, aminoácidos 1 a 536 da SEQ ID NO: 108, aminoácidos 1 a 536 da SEQ ID NO: 109, aminoácidos 1 a 536 da SEQ ID NO: 110, aminoácidos 1 a 391 da SEQ ID NO: 111, aminoácidos 1 a 391 da SEQ ID NO: 112, aminoácidos 1 a 392 da SEQ ID NO: 113, aminoácidos 1 a 391 da SEQ ID NO: 114, aminoácidos 1 a 393 da SEQ ID NO: 115, aminoácidos 1 a 391 da SEQ ID NO: 116, aminoácidos 1 a 382 da SEQ ID NO: 117, aminoácidos 1 a 391 da SEQ ID NO: 118, aminoácidos 1 a 383 da SEQ ID NO: 119, aminoácidos 1 a 565 da SEQ ID NO: 120, aminoácidos 1 a 396 da SEQ ID NO: 121, aminoácidos 1 a 392 da SEQ ID NO: 122, aminoácidos 1 a 413 da SEQ ID NO: 123, aminoácidos 1 a 398 da SEQ ID NO: 124, aminoácidos 1 a 372 da SEQ ID NO: 125 ou aminoácidos 1 a 557 da SEQ ID NO: 126.
[0173] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, geralmente, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova York. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly. Outros exemplos de substituições conservativas são G para A; A para G, S; V para I, L, A, T, S; I para V, L, M; L para I, M, V; M para L, I, V; P para A, S, N; F para Y, W, H; Y para F, W, H; W para Y, F, H; R para K, E, D; K para R, E, D; H para Q, N, S; D para N, E, K, R, Q; E para Q, D, K, R, N; S para T, A; T para S, V, A; C para S, T, A; N para D, Q, H, S; Q para E, N, H, K, R.
[0174] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese por varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de única alanina são introduzidas em todo resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de muramidase para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Vide também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por meio de análise física da estrutura, conforme determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron ou marcação por fotoafinidade, em combinação com a mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Vide, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-
904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.
[0175] O documento WO 2013/076253 revelou que resíduos de aminoácido D95 e E97 da SEQ ID NO: 8 do documento WO 2013/076253 são resíduos catalíticos. O documento PCT/CN2017/075960 revela os aminoácidos catalíticos de muramidases 12 GH25. Esse alinhamento pode ser usado para determinar a posição dos aminoácidos catalíticos para as muramidases reivindicadas. Em uma modalidade, nenhuma alteração é feita a um aminoácido que corresponde a E97 e D95 quando se usa SEQ ID NO: 39 para numeração. Os aminoácidos catalíticos para as muramidases de GH24 podem ser determinados alinhando-se as sequências com sequências conhecidas em que o aminoácido (ou aminoácidos) catalítico já foi determinado (vide www.uniprot.org).
[0176] Com mais preferência, a composição da presente invenção compreende um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 e um polipeptídeo que tem atividade de xilanase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 90.
[0177] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado entre 0,1 a 150 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, como 0,5 a 100 ppm, 1 a 75 ppm, 2 a 50 ppm, 3 a 25 ppm, 2 a 80 ppm, 5 a 60 ppm, 8 a 40 ppm, 10 a 30 ppm, 13 a 75 ppm, 15 a 50 ppm, 17,5 a 40 ppm, 25 a 75 ppm ou 30 a 60 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0178] De preferência, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase pode ser dosado entre 0,1 a 150 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, como 0,5 a 100 ppm, 1 a 75 ppm, 2 a 50 ppm, 3 a 25 ppm, 2 a 80 ppm, 5 a 60 ppm, 8 a 40 ppm, 10 a 30 ppm, 13 a 75 ppm, 15 a 50 ppm, 17,5 a 40 ppm, 25 a 75 ppm ou 30 a 60 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0179] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase da composição pode ser formulado como uma formulação sólida; o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição pode ser formulado como uma formulação sólida; ou tanto o polipeptídeo que tem atividade de xilanase quanto o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição podem ser formulados como uma formulação sólida.
[0180] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase da composição também pode ser formulado como uma formulação líquida; o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição também pode ser formulado como uma formulação líquida; ou tanto o polipeptídeo que tem atividade de xilanase quanto o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição também podem ser formulados como uma formulação líquida.
[0181] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender adicionalmente 20 %-80 % de poliol (isto é quantidade total de poliol), de preferência 25 %-75 % de poliol, com mais preferência 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol. De preferência, a formulação líquida compreende 20 %-80 % de poliol, com mais preferência, 25 %- 75 % de poliol, com mais preferência, 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em glicerol, sorbitol, propileno glicol (MPG), etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, 1, 2-propileno glicol ou 1, 3- propileno glicol, dipropileno glicol, polietileno glicol (PEG) que tem um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropileno glicol (PPG) que tem um peso molecular médio abaixo de cerca de 600. Com mais preferência, a formulação líquida compreende 20 %-80 % de poliol (isto é, a quantidade total de poliol), com mais preferência, 25 %- 75 % de poliol, com mais preferência, 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou, com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em glicerol, sorbitol e propileno glicol (MPG).
[0182] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender adicionalmente conservante, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, a formulação líquida compreende 0,02 % a 1,5 % p/p de conservante, com mais preferência, 0,05 % a 1,0 % p/p de conservante ou, com máxima preferência, 0,1 % a 0,5 % p/p de conservante. Com mais preferência, a formulação líquida compreende 0,001 % a 2,0 % p/p de conservante (isto é, quantidade total de conservante), de preferência, 0,02 % a 1,5 % p/p de conservante, com mais preferência, 0,05 % a 1,0 % p/p de conservante ou, com máxima preferência, 0,1 % a 0,5 % p/p de conservante, em que o conservante é selecionado a partir do grupo que consiste em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer combinação dos mesmos.
[0183] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender um ou mais agentes de formulação (como aqueles descritos no presente documento), de preferência, um agente de formulação selecionado a partir da lista que consiste em glicerol, etileno glicol, 1, 2-propileno glicol ou 1, 3- propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, PVA, acetato e fosfato, de preferência, selecionado a partir da lista que consiste em 1, 2-propileno glicol, 1, 3-propileno glicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio.
[0184] Na presente invenção, a formulação sólida pode ser, por exemplo, como um grânulo, pó seco em aspersão ou aglomerado (por exemplo, conforme revelado no documento WO2000/70034). O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgânicos de zinco, sódio, potássio ou cálcio como, por exemplo, como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol).
[0185] De preferência, os agentes de formulação da formulação sólida são selecionados a partir da lista que consiste em cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. De preferência, o agente de formulação é selecionado dentre um ou mais dos seguintes compostos: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio.
[0186] De preferência, a composição da presente invenção é um grânulo de enzima que compreende as enzimas da invenção opcionalmente combinadas com uma ou mais enzimas adicionais. O grânulo é composto de um núcleo, e opcionalmente um ou mais revestimentos (camadas externas) que circundam o núcleo.
[0187] Tipicamente, o tamanho de grânulo, medido como diâmetro esférico equivalente (tamanho médio de partícula baseado em volume), do grânulo é 20-2000 µm,
particularmente, 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
[0188] O núcleo pode ser preparado granulando-se uma mescla dos ingredientes, por exemplo, por meio de um método que compreende técnicas de granulação como cristalização, precipitação, revestimento em recipiente rotativo, revestimento em leito fluidizado, aglomeração de leito fluidizado, atomização giratória, extrusão, perolação, esferonização, métodos de redução de tamanho, granulação em tambor e/ou granulação de alto cisalhamento.
[0189] Métodos para preparar o núcleo podem ser encontrados em Handbook of Powder Technology; Particle size enlargement de C. E. Capes; Volume 1; 1980; Elsevier. Os métodos de preparação incluem tecnologias de formulação de grânulo conhecidas, por exemplo: a) produtos secos em aspersão, em que uma solução que contém enzima líquida é atomizada em uma torre de secagem em aspersão para formar pequenas gotículas que, durante sua descida, a torre de secagem seca para formar um material de particulado que contém enzima; b) produtos em camadas, em que a enzima é revestida como uma camada ao redor de uma partícula de núcleo inerte pré-formada, em que uma solução que contém enzima é atomizada, tipicamente, em um aparelho de leito fluidizado em que as partículas de núcleo pré-formadas são fluidizadas, e a solução que contém enzima adere às partículas de núcleo e secam para deixar uma camada de enzima seca na superfície da partícula de núcleo. As partículas de um tamanho desejado podem ser obtidas desse modo se uma partícula de núcleo útil do tamanho desejado puder ser encontrada. Esse tipo de produto é descrito, por exemplo, no documento WO 97/23606; c) partículas de núcleo absorvidas, em que ao invés de revestir a enzima como uma camada ao redor do núcleo, a enzima é absorvida na superfície do núcleo.
Tal processo é descrito no documento WO 97/39116. d) produtos de extrusão ou peletizados, em que uma pasta que contém enzima é prensada nos péletes ou sob pressão é extrusada através de uma pequena abertura e cortada em partículas que são subsequentemente secas.
Tais partículas têm, usualmente, um tamanho considerável devido ao fato de que o material em que a abertura de extrusão é feita (usualmente uma placa com furos) define um limite na queda de pressão permissível na abertura de extrusão.
Também, as pressões de extrusão muito altas quando se usa uma pequena abertura aumentam a geração de calor na pasta enzimática, que é nociva à enzima; e) produtos perolados, em que um pó que contém enzima é suspenso em cera derretida e a suspensão é aspergida, por exemplo, através de um atomizador de disco giratório, em uma câmara de resfriamento em que as gotículas rapidamente se solidificam (Michael S.
Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; vol. 71; páginas 140-142; Marcel Dekker). O produto obtido é um em que a enzima é uniformemente distribuída por todo um material inerte ao invés de ser concentrada em sua superfície.
Também, US 4.016.040 e US 4.713.245 são documentos relacionados a essa técnica; f) produtos de granulação em misturador, em que um líquido é adicionado a uma composição em pó seco de, por exemplo, componentes de granulação convencionais, sendo que a enzima é introduzida por meio do líquido ou do pó ou ambos.
O líquido e o pó são misturados e à medida que a umidade do líquido é absorvida no pó seco, os componentes do pó seco começarão a aderir e o aglomerado e as partículas irão se constituir, formando granulados que compreendem a enzima.
Tal processo é descrito no documento US 4.106.991 e documentos relacionados EP 170360, EP 304332, EP 304331, WO 90/09440 e WO 90/09428. Em um produto específico desse processo em que vários misturadores de alto cisalhamento podem ser usados como granuladores, granulados que consistem em enzima como enzima, cargas e aglutinantes etc. são misturados com fibras de celulose para reforçar as partículas para render o denominado T- granulado.
As partículas reforçadas, que são mais robustas, liberam menos poeira enzimática. g) redução de tamanho, em que os núcleos são produzidos através de moagem ou trituração de partículas maiores, péletes, tabletes, briquetas etc. que contêm a enzima.
A fração de partícula de núcleo desejada é obtida peneirando-se o produto moído ou triturado.
As partículas sob ou subdimensionada podem ser recicladas.
A redução de tamanho é descrita em (Martin Rhodes (editor); Principles of Powder Technology; 1990; Capítulo 10; John Wiley & Sons); h) granulação de leito fluidizado, que envolve suspender particulados em um fluxo de ar e aspergir um líquido nas partículas fluidizadas por meio de bocais.
As partículas atingidas por gotículas da aspersão ficam úmidas e se tornam pegajosas.
As partículas pegajosas colidem com outras partículas e aderem às mesmas e formam um grânulo;
i) os núcleos podem ser submetidos à secagem, como em um secador de leito fluidizado. Outros métodos conhecidos para secar grânulos na indústria alimentícia ou de detergente podem ser usados pela pessoa versado. A secagem ocorre, de preferência, em uma temperatura de produto de 25 a 90 °C. Para algumas enzimas é importante que os núcleos que compreendem a enzima contenham uma baixa quantidade de água antes do revestimento. Se as enzimas sensíveis a água forem revestidas antes da água em excesso ser removida, a mesma será presa dentro do núcleo e pode afetar a atividade da enzima negativamente. Após a secagem, os núcleos, de preferência, contêm 0,1-10 % p/p de água.
[0190] O núcleo pode incluir materiais adicionais como cargas, materiais de fibra (celulose ou fibras sintéticas), agentes estabilizadores, agentes solubilizantes, agentes de suspensão, agentes de regulação de viscosidade, esferas de luz, plastificantes, sais, lubrificantes e fragrâncias.
[0191] O núcleo pode incluir um aglutinante, como polímero sintético, cera, gordura ou carboidrato.
[0192] O núcleo pode incluir um sal de um cátion multivalente, um agente de redução, um antioxidante, um catalisador de decomposição de peróxido e/ou um componente de tampão ácido, tipicamente como uma mescla homogênea.
[0193] Na presente invenção, o núcleo pode compreender um material selecionado a partir do grupo que consiste em sais (como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou a açúcar ou derivado de açúcar (como por exemplo sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), pequenas moléculas orgânicas, amido, farinha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como filossilicatos de alumínio hidroso). De preferência, o núcleo compreende um mineral de argila como caulimita ou caulim.
[0194] O núcleo também pode incluir uma partícula inerte com a enzima absorvida na mesma, ou aplicada na superfície, por exemplo, através de revestimento em leito fluidizado.
[0195] O núcleo pode ter um diâmetro de 20-2000 µm, particularmente, 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
[0196] O núcleo pode ser circundado por pelo menos um revestimento, por exemplo, para aprimorar a estabilidade em armazenamento, para reduzir a formação de poeira durante a manipulação ou para colorir o grânulo. O revestimento (ou revestimentos) opcional pode incluir um revestimento de sal e/ou cera e/ou farinha ou outros materiais de revestimento adequados.
[0197] O revestimento pode ser aplicado em uma quantidade de pelo menos 0,1 % em peso do núcleo, por exemplo, pelo menos 0,5 %, 1 % ou 5 %. A quantidade pode ser, no máximo, 100 %, 70 %, 50 %, 40 % ou 30 % em peso do núcleo.
[0198] O revestimento tem, de preferência, pelo menos 0,1 µm de espessura, particularmente, pelo menos 0,5 µm, pelo menos 1 µm ou pelo menos 5 µm. Em algumas modalidades, a espessura do revestimento está abaixo de 100 µm, como abaixo de 60 µm, ou abaixo de 40 µm.
[0199] O revestimento deve encapsular a unidade de núcleo formando-se uma camada substancialmente contínua. Uma camada substancialmente contínua deve ser compreendida como um revestimento que tem menos ou nenhum furo, de modo que a unidade de núcleo seja encapsulada ou envolvida com poucas áreas ou nenhuma área não revestida. A camada ou revestimento deve, em particular, ser homogêneo em espessura.
[0200] O revestimento pode conter adicionalmente outros materiais conforme conhecidos na técnica, por exemplo, cargas, agentes antiaderentes, pigmentos, corantes, plastificantes e/ou aglutinantes, como dióxido de titânio, caulim, carbonato de cálcio ou talco.
[0201] De preferência, os grânulos de enzima da invenção podem compreender um núcleo que compreende as enzimas da invenção, um ou mais revestimentos de sal e um ou mais revestimentos de cera. Exemplos de grânulos enzimáticos com múltiplos revestimentos são mostrados nos documentos WO1993/07263, WO1997/23606 e WO2016/149636.
[0202] O revestimento de sal pode compreender pelo menos 60 % em de um sal, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % em peso. O revestimento de sal pode ser conforme descrito nos documentos WO1997/05245, WO1998/54980, WO1998/55599,
WO2000/70034, WO2006/034710, WO2008/017661, WO2008/017659, WO2000/020569, WO2001/004279, WO1997/05245, WO2000/01793, WO2003/059086, WO2003/059087, WO2007/031483, WO2007/031485, WO2007/044968, WO2013/192043, WO2014/014647 e WO2015/197719 ou revestimento polimérico como descritos no documento WO 2001/00042.
[0203] O sal no revestimento pode ter uma umidade constante a 20 °C acima de 60 %, particularmente acima de 70 %, acima de 80 % ou acima de 85 % ou pode ser uma outra forma de hidrato de tal sal (por exemplo, anidrato).
[0204] O sal pode ser um sal inorgânico, por exemplo, sais de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples (menores que 10 átomos de carbono, por exemplo, 6 ou menos átomos de carbono) como citrato, malonato ou acetato. Exemplos de cátions nesses sais são íons de metal alcalino ou metal alcalinoterroso, o íon de amônio ou íons de metal da primeira série de transição, como sódio, potássio, magnésio, cálcio, zinco ou alumínio. Exemplos de ânions incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, sulfito, bissulfito, tiossulfato, fosfato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, hipofosfito, pirofosfato de di- hidrogênio, tetraborato, borato, carbonato, bicarbonato, metassilicato, citrato, malato, maleato, malonato, succinato, sorbato, lactato, formato, acetato, butirato, propionato, benzoato, tartrato, ascorbato ou gluconato. Em particular, sais de metal alcalino ou metal alcalino terroso de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples como citrato, malonato ou acetato podem ser usados.
[0205] Exemplos específicos de sais adequados são NaCl (CH20 °C = 76 %), Na2CO3 (CH20 °C = 92 %), NaNO3 (CH20 °C = 73 %), Na2HPO4 (CH20 °C = 95 %), Na3PO4 (CH25 °C = 92 %), NH4Cl (CH20 °C = 79,5 %), (NH4)2HPO4 (CH20 °C = 93,0 %), NH4H2PO4 (CH20 °C = 93,1 %), (NH4)2SO4 (CH20 °C = 81,1 %), KCl (CH20 °C = 85 %), K2HPO4 (CH20 °C = 92 %), KH2PO4 (CH20 °C = 96,5 %), KNO3 (CH20 °C = 93,5 %), Na2SO4 (CH20 °C = 93 %), K2SO4 (CH20 °C = 98 %), KHSO4 (CH20 °C = 86 %), MgSO4 (CH20 °C = 90 %), ZnSO4 (CH20 °C = 90 %) e citrato de sódio (CH25 °C = 86 %). Outros exemplos incluem NaH2PO4, (NH4)H2PO4, CuSO4, Mg(NO3)2, magnésio acetato, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco e sorbato de zinco.
[0206] O sal pode estar na forma anidra, ou pode ser um sal hidratado, isto é, um hidrato de sal cristalino com água (ou águas) ligada de cristalização, como descrito no documento WO 99/32595. Exemplos específicos incluem sulfato de sódio anidro (Na2SO4), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), hepta-hidrato de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O), hepta-hidrato de sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O), hepta- hidrato dibásico de fosfato de sódio (Na2HPO4.7H2O), hexa- hidrato de nitrato de magnésio (Mg(NO3)2(6H2O)), di-hidrato de citrato de sódio e tetra-hidrato de acetato de magnésio.
[0207] O revestimento de sal pode compreender um único sal ou uma mistura de dois ou mais sais. O sal pode ser solúvel em água, em particular, que tem uma solúvel em água pelo menos 0,1 g em 100 g de água a 20 °C, de preferência, pelo menos 0,5 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 1 g per 100 g de água, por exemplo, pelo menos 5 g per 100 g de água. O sal pode ser adicionado a partir de uma solução de sal em que o sal é completamente dissolvido ou a partir de uma suspensão de sal em que as partículas finas são menores que 50 µm, como menores que 10 µm ou menores que 5 µm.
[0208] Um revestimento de cera pode compreender pelo menos 60 % em de uma cera, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % em peso.
[0209] Exemplos específicos de ceras são polietileno glicóis; polipropilenos; cera de carnaúba; cera de candelila; cera de abelha; óleo vegetal hidrogenado ou sebo animal como polietileno glicol (PEG), metil hidroxi-propil celulose (MHPC), álcool polivinílico (PVA), sebo de boi hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, sementes de algodão hidrogenadas e/ou óleo de soja hidrogenado; álcoois de ácido graxo; monoglicerídeos e/ou diglicerídeos, como estearato de glicerila, em que o estearato é uma mistura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenados e derivados dos mesmos. Uma cera preferencial é o óleo de palma ou óleo de palma hidrogenado.
[0210] O granulado da presente invenção também pode ser produzido como um granulado de não pulverização, por exemplo, conforme revelado nas Patentes Nº US 4.106.991 e
4.661.452 e pode ser opcionalmente revestido por meio de métodos conhecidos na técnica. Os materiais de revestimento podem ser materiais de revestimento de cera e materiais de revestimento de formação de filme. Exemplos de materiais de revestimento de cera são produtos de poli(óxido de etileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados que têm de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento de formação de filme adequados para aplicação por meio de técnicas de leito fluidizado são dados no documento GB 1483591.
[0211] O granulado pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais. Cada enzima estará presente, então, em mais grânulos garantindo uma distribuição mais uniforme das enzimas, e também reduz a segregação física de diferentes enzimas devido aos diferentes tamanhos de partícula. Métodos para produzir cogranulados de múltiplas enzimas são revelados na revelação ip.com IPCOM000200739D.
[0212] Um outro exemplo de formulação de enzimas através do uso de cogranulados é revelado no documento WO 2013/188331.
[0213] A presente invenção também se refere a enzimas protegidas preparadas de acordo com o método revelado no documento EP 238.216.
[0214] Então, de preferência, a presente invenção fornece um grânulo, que compreende: (a) um núcleo que compreende uma xilanase e muramidase de acordo com a invenção, e (b) um revestimento que consiste em uma ou mais camada (ou camadas) que circunda o núcleo.
[0215] Na presente invenção, o revestimento compreende um revestimento de sal conforme descrito no presente documento. De preferência, o revestimento compreende um revestimento de cera conforme descrito no presente documento. Com mais preferência, o revestimento compreende um revestimento de sal seguido por um revestimento de cera conforme descrito no presente documento. Ainda com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase e o polipeptídeo que tem atividade de muramidase são cogranulados.
[0216] Na presente invenção, a composição pode compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados a partir da lista que consiste em um ou mais carreadores. O carreador pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em água, glicerol, etileno glicol, 1, 2- propileno glicol ou 1, 3-propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, maltodextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, farinha de trigo, farelo de trigo, farinha de glúten de milho, amido, caulim e celulose ou qualquer combinação dos mesmos.
[0217] Na presente invenção, a composição pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais;
um ou mais eubióticos; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais, e um ou mais aminoácidos, conforme descrito abaixo. Ração Animal
[0218] No segundo aspecto, a presente invenção se refere a uma ração animal que compreende um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia, sendo a ração animal caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase como definido acima.
[0219] Dietas ou composições de ração animal têm um teor relativamente alto de proteína. As dietas de aves e porcos podem ser caracterizadas conforme indicado na Tabela B do documento WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas conforme indicado na coluna 4 desta Tabela B. Ademais, tais dietas de peixe normalmente têm um teor de gordura bruta de 200-310 g/kg.
[0220] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg. A fonte de proteína pode ser fonte de proteína vegetal e/ou proteína animal.
[0221] As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como farinha de soja, farinha de tremoço, farinha de colza e combinações das mesmas. O teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 % (p/p).
[0222] De preferência, a fonte de proteína vegetal pode ser material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. A fonte de proteína vegetal também pode ser material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são colza e repolho. Na presente invenção, soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz e sorgo.
[0223] Além da proteína vegetal como definido acima, a ração animal da invenção também pode conter proteína animal, como Farinha de Carne e Ossos, Farinha de penas e/ou Farinha de peixe, tipicamente em uma quantidade de 0- 25 %. A ração animal da invenção também pode compreender grão seco de destiladores com solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30 %.
[0224] De preferência, a fonte de proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, soja selvagem, feijão, tremoço, feijão Tepary, feijão-da-Espanha, feijão slimjim, feijão-de-lima, vagem francesa, fava comum (feijão-fava), grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim Spanish, canola, semente de girassol, semente de algodão, colza (semente oleaginosa de colza) ou ervilha ou em uma forma processada como farinha de soja, farinha de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farinha de soja fermentada (FSBM), farinha de girassol, farinha de semente de algodão, farinha de colza, farinha de peixe, farinha de osso, farinha de pena, soro ou qualquer combinação dos mesmos.
[0225] Ademais, ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção pode ter um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg. Na presente invenção, a fonte de energia pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em maís, milho, sorgo, trigo, cevada, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, painço, milheto, milho-da- Itália ou em uma forma processada como milho moído, maís moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moído, painço moído, milho-da-Itália moído, milheto moído, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0226] Ademais, ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção pode ter um teor de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.
[0227] Em particular, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina pode estar dentro de qualquer das faixas 2, 3, 4 ou 5, na Tabela B do documento WO 01/58275 (R. 2-5).
[0228] A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado através do método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analyse 14ª edição, Association of Official
Analytical Chemists, Washington DC).
[0229] A energia metabolizável pode ser calculada com base nos requisitos de Nutrientes da publicação de NRC em suíno, nona edição revisada 1988, subcomitê em nutrição suína, comitê em nutrição animal, junta de agricultura, conselho de pesquisa nacional. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2-6, e o European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países- Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.
[0230] O teor dietário de cálcio, fósforo e aminoácidos disponíveis em dietas animais completas é calculado com base nas tabelas alimentícias como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
[0231] De preferência, a ração animal da invenção contém 0-80 % de maís; e/ou 0-80 % de sorgo; e/ou 0-70 % de trigo; e/ou 0-70 % de cevada; e/ou 0-30 % de aveias; e/ou 0-40 % de farinha de soja; e/ou 0-25 % de farinha de peixe; e/ou 0-25 % de farinha de carne e ossos; e/ou 0-20 % de soro.
[0232] A ração animal pode, por exemplo, ser fabricada como ração amassada (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentícios moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionados de acordo com as especificações para as espécies em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações enzimáticas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração amassada uma formulação enzimática sólida ou líquida pode ser adicionada antes ou durante a etapa de misturação de ingrediente. Para a ração peletizada (líquida ou sólida) a preparação de xilanase/muramidase/enzima também pode ser adicionada antes ou durante a etapa de ingrediente de ração. Tipicamente, uma preparação de enzima líquida compreende a xilanase, a muramidase ou tanto a xilanase quanto a muramidase da invenção opcionalmente com um poliol, como glicerol, etileno glicol ou propileno glicol, e é adicionada após a etapa de peletização, como aspergindo-se a formulação líquida nos péletes. A xilanase e/ou muramidase também pode ser incorporada em um aditivo de ração ou pré-mistura.
[0233] Alternativamente, a xilanase/muramidase pode ser preparada congelando-se uma mistura de solução de enzima líquida com um agente de tamponamento como farinha de soja triturada e, então, liofilizando-se a mistura.
[0234] Na presente invenção, a ração animal pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais eubióticos; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais, e um ou mais aminoácidos, conforme descrito abaixo.
[0235] A concentração de muramidase final na ração está dentro da faixa de 100-1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0236] A concentração de xilanase final na ração está dentro da faixa de 50-500 mg por kg de ração animal, como 60 a 450 mg, 70 a 400 mg, 80 a 350 mg, 90 a 300 mg, 100 a 300 mg, 110 a 250 mg, 120 a 200 mg por kg de ração animal,
ou qualquer combinação desses intervalos.
[0237] A ração animal da presente invenção pode ser produzida por meio de qualquer processo conhecido. Por exemplo, a ração animal da presente invenção é preparada por meio de um processo que compreende as etapas de: (a) misturar um aditivo de ração animal com uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia; (b) tratar opcionalmente com vapor a ração animal de (a) seguido pela prensagem da mistura tratada com vapor para formar péletes; e (c) aspergir opcionalmente uma formulação líquida na ração animal de (a) ou (b).
[0238] No presente processo, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser adicionado na etapa (a) e a xilanase pode ser adicionada na etapa (c). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é adicionado na etapa (c) e a xilanase é adicionada na etapa (a). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase e a xilanase são adicionados na etapa (a). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase e a xilanase são adicionados na etapa (c).
[0239] No presente processo, a ração animal pode ser peletizada por meio de tratamento com vapor da mistura de (a) para obter um teor de umidade abaixo de 20 % em peso da mistura, e prensar a mistura tratada com vapor para formar péletes. De preferência, a ração animal é peletizada através de tratamento com vapor da mistura de (a) para obter um teor de umidade abaixo de 20 % em peso da mistura em que o tratamento com vapor é entre 60 °C e 100 °C quando medido na saída do condicionador, e prensar a mistura tratada com vapor para formar péletes. No presente processo, o tempo de permanência total na etapa b) pode ser entre 1 segundo e 10 minutos. No presente processo, a temperatura dos péletes após a peletização da mistura tratada com vapor pode ser entre 70 °C e 105 °C. Enzimas Adicionais
[0240] Na presente invenção, as composições e/ou a ração animal descrita no presente documento podem incluir opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzimas podem ser classificadas com base no handbook Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992), vide também o site na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informações relativas à nomenclatura de enzimas. É principalmente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número de EC (Comissão de Enzima) foi fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Essa nomenclatura de IUB-MB Enzyme se baseia em sua especificidade de substrato e, ocasionalmente em seu mecanismo molecular; como uma classificação não reflete as características estruturais dessas enzimas.
[0241] Uma outra classificação de determinadas enzimas de glicosídeo hidrolase, como endoglucanase, galactanase, mananase, dextranase e galactosidase é descrita em Henrissat et al, “The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013”, Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (D1): D490-D495; vide também www.cazy.org.
[0242] Então, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção podem compreender pelo menos uma outra enzima selecionada a partir do grupo que consiste em acetilxilan esterase (EC 3.1.1.23), acilglicerol lipase (EC 3.1.1.72), alfa-amilase (EC
3.2.1.1), beta-amilase (EC 3.2.1.2), arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91), celulase (EC 3.2.1.4), feruloil esterase (EC 3.1.1.73), galactanase (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22), beta- galactosidase (EC 3.2.1.23), beta-glucanase (EC 3.2.1.6), beta-glucosidase (EC 3.2.1.21), triacilglicerol lipase (EC
3.1.1.3), lisofosfolipase (EC 3.1.1.5), muramidase (EC
3.2.1.17), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), beta-manosidase (mananase) (EC 3.2.1.25), fitase (EC 3.1.3.8, EC 3.1.3.26, EC 3.1.3.72), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), fosfolipase D (EC 3.1.4.4), protease (EC
3.4), pululanase (EC 3.2.1.41), pectinesterase (EC
3.1.1.11), xilanase (EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.136), beta- xilosidase (EC 3.2.1.37), ou qualquer combinação dos mesmos.
[0243] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender uma galactanase (EC 3.2.1.89) e uma beta-galactosidase (EC
3.2.1.23).
[0244] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção também pode compreender uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26). Exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), NatuphosTM (BASF), NatuphosTM E
(BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), OptiPhos® (Huvepharma), AveMix® Phytase (Aveve Biochem), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.
[0245] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção também pode compreender uma xilanase (EC 3.2.1.8). Exemplos de xilanases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium), Hostazym® X (Huvepharma), Axtra® XB (Xilanase/beta-glucanase, DuPont) e Axtra® XAP (Xilanase/amilase/protease, DuPont), AveMix® XG 10 (xilanase/glucanase) e AveMix® 02 CS (xilanase/glucanase/pectinase, Aveve Biochem), e Naturgrain (BASF).
[0246] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender uma protease (EC 3.4). Exemplos de proteases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products), Winzyme Pro Plus® (Suntaq International Limited) e Cibenza® DP100 (Novus International).
[0247] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também compreende uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1). Exemplos de alfa-amilases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® A e RONOZYME® RumiStar™ (DSM Nutritional Products).
[0248] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender um produto enzimático de múltiplos componentes, como FRA® Octazyme
(Framelco), Ronozyme® G2, Ronozyme® VP e Ronozyme® MultiGrain (DSM Nutritional Products), Rovabio® Excel ou Rovabio® Advance (Adisseo). Eubióticos
[0249] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção pode compreender adicionalmente eubióticos. Os eubióticos são compostos que são projetados para fornecer um equilíbrio saudável da microflora no trato gastrointestinal. Os eubióticos cobrem um número de aditivos de ração diferentes, como probióticos, pré- bióticos, fitogênicos (óleos essenciais) e ácidos orgânicos que são descritos em mais detalhes abaixo. Probióticos
[0250] Na presente invenção, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal pode compreender adicionalmente um ou mais probióticos adicionais. Em particular, a composição de ração animal pode compreender adicionalmente uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer combinação dos mesmos.
[0251] De preferência, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal compreendem adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp,
e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp.
[0252] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507), 22C-P1 (PTA- 6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01 (NRRL-B-50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B-50633), BS 278 (NRRL B- 50634), DSM 29870, DSM 29871, DSM 32315, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA-7547.
[0253] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus pumilus: NRRL B-50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-
50886.
[0254] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623.
[0255] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29869, NRRL B 50607, PTA- 7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL B-50606, NRRL B-50013,
NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147 ou NRRL B-50888.
[0256] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x104 e 1x1014 CFU/kg de matéria seca, de preferência, entre 1x106 e 1x1012 CFU/kg de matéria seca, e, com mais preferência, entre 1x107 e 1x1011 CFU/kg de matéria seca. De preferência, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x108 e 1x1010 CFU/kg de matéria seca.
[0257] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x105 e 1x1015 CFU/animal/dia, de preferência, entre 1x107 e 1x1013 CFU/animal/dia e, com mais preferência, entre 1x108 e 1x1012 CFU/animal/dia. De preferência, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x109 e 1x1011 CFU/animal/dia. Com mais preferência, a quantidade de probióticos é 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal ou aditivo de ração animal.
[0258] Na presente invenção, a uma ou mais cepas bacterianas podem estar presentes na forma de um esporo estável.
[0259] Exemplos de produtos comerciais são Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (mistura de enzima + probiótico, DuPont Animal Nutrition), Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik) e GutCare® PY1 (Evonik). Pré-bióticos
[0260] Os pré-bióticos são substâncias que induzem o crescimento ou a atividade de microrganismos (por exemplo, bactérias e fungos) que contribuem para o bem-estar de seu hospedeiro. Os pré-bióticos são tipicamente compostos de fibra não digeríveis que passam não digeridas através da parte superior do trato gastrointestinal e estimulam o crescimento ou a atividade de bactérias vantajosas que colonizam o intestino grosso agindo-se como substrato para os mesmos. Normalmente, os pré-bióticos aumentam o número ou a atividade de bactérias bífidas e bactérias formadoras de ácido láctico no trato GI.
[0261] Os derivados de levedura (leveduras integrais inativadas ou paredes celulares de levedura) também podem ser considerados como pré-bióticos. Os mesmos frequentemente compreendem manan-oligossacarídeos, beta- glucanos de levedura ou teores de proteína e são normalmente derivados da parede celular da levedura, Saccharomyces cerevisiae.
[0262] Na presente invenção, a quantidade de pré- bióticos pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos de levedura são Yang® e Agrimos (Lallemand Animal Nutrition). Fitogênicos
[0263] Os fitogênicos são um grupo de promotores de crescimento natural ou promotores de crescimento não antibiótico usados como aditivos de ração, derivados de ervas, especiarias ou outras plantas. Os fitogênicos podem ser substâncias únicas preparadas a partir de óleos essenciais/extratos, óleos essenciais/extratos, plantas únicas e misturas de plantas (produtos herbais) ou mistura de óleos essenciais/extratos/ plantas (produtos especializados).
[0264] Exemplos de fitogênicos são alecrim, sálvia, orégano, tomilho, cravo e capim-limão. Exemplos de óleos essenciais são timol, eugenol, meta-cresol, vanilina, salicilato, resorcina, guajacol, gingerol, óleo de lavanda, iononas, irona, eucaliptol, mentol, óleos de hortelã, alfa- pineno; limoneno, anetol, linalol, metil di-hidrojasmonato, carvacrol, ácido propiônico/propionato, ácido acético/acetato, ácido butírico/butirato, óleo de alecrim, óleo de cravo, geraniol, terpineol, citronelol, salicilato de amila e/ou benzila, cinamaldeído, polifenol vegetal (tanino), extrato de açafrão e cúrcuma.
[0265] Na presente invenção, a quantidade de fitogênicos pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são Crina® (DSM Nutritional Products); CinergyTM, BiacidTM, ProHacidTM Classic e ProHacidTM AdvanceTM (todos Promivi/Cargill) e Envivo EO (DuPont Animal Nutrition). Ácidos Orgânicos
[0266] Os ácidos orgânicos (C1–C7) são amplamente distribuídos na natureza como constituintes normais de tecidos vegetais ou animais. Os mesmos também são formados através de fermentação microbiana de carboidratos principalmente no intestino grosso. Os mesmos são frequentemente usados em produção suína ou de aves como uma substituição de promotores de crescimento antibiótico uma vez que os mesmos têm um efeito preventivo nos problemas intestinais como enterite necrótica em galinhas e infecções por Escherichia coli em porcos jovens. Os ácidos orgânicos podem ser vendidos como monocomponente ou misturas de tipicamente 2 ou 3 ácidos orgânicos diferentes. Exemplos de ácidos orgânicos são ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico), ácidos graxos de cadeia média (por exemplo, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico), ácidos di/tricarboxílicos (por exemplo, ácido fumárico), hidróxi ácidos (por exemplo, ácido láctico), ácidos aromáticos (por exemplo, ácido benzoico), ácido cítrico, ácido sórbico, ácido málico e ácido tartárico ou seu sal (tipicamente sal de sódio ou potássio como diformato de potássio ou butirato de sódio).
[0267] Na presente invenção, a quantidade de ácido orgânico pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são VevoVitall® (DSM Nutritional Products), Amasil®, Luprisil®, Lupro-Grain®, Lupro-Cid®, Lupro-Mix® (BASF), n-Butyric Acid AF (OXEA) e Adimix Precision (Nutriad). Aminoácidos
[0268] A composição ou a ração animal da invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que são usados são lisina, alanina, beta- alanina, treonina, metionina e triptofano. Na presente invenção, a quantidade de aminoácido pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal. Vitaminas e Minerais
[0269] Na presente invenção, a composição ou a ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, como uma ou mais vitaminas solúveis em gordura e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Além disso, a composição ou a ração animal pode incluir opcionalmente um ou mais minerais, como um ou mais minerais traço e/ou um ou mais macrominerais.
[0270] Geralmente, vitaminas solúveis em água e em gordura, bem como minerais traço formam parte de uma denominada pré-mistura pretendida para a adição à ração, ao passo que macrominerais geralmente são adicionados separadamente à ração.
[0271] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.
[0272] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina C, vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.
[0273] Exemplos não limitantes de minerais traço incluem boro, cobalto, cloreto, cromo, cobre, fluoreto, iodeto, ferro, manganês, molibdênio, iodo, selênio e zinco.
[0274] Exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, fósforo, potássio e sódio.
[0275] Na presente invenção, a quantidade de vitaminas pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal. De preferência, a quantidade de minerais é 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal.
[0276] Os requisitos nutricionais desses componentes (exemplificados com aves e leitões/porcos) são listados na Tabela A do documento WO 01/58275. Requisitos nutricionais significa que esses componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.
[0277] Alternativamente, a composição ou a ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A do documento WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um dentre, um ou mais de, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, esse pelo menos um componente individual está incluído no aditivo da invenção em tal quantidade de modo a fornecer uma concentração em ração dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A.
[0278] De preferência, a composição ou a ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas abaixo, de preferência, para fornecer uma concentração em ração dentro das faixas especificadas na Tabela 1 abaixo (para dietas de leitão e dietas de frango de corte, respectivamente).
[0279] Tabela 1: Recomendações de vitamina típicas Dieta de frango Vitamina Dieta de leitão de corte
10.000-15.000 8-12.500 IU/kg de Vitamina A IU/kg de ração ração 1800-2000 IU/kg de 3000-5000 IU/kg Vitamina D3 ração de ração 60-100 mg/kg de 150-240 mg/kg de Vitamina E ração ração 2-4 mg/kg de Vitamina K3 2-4 mg/kg de ração ração 2-3 mg/kg de Vitamina B1 2-4 mg/kg de ração ração
Dieta de frango Vitamina Dieta de leitão de corte 6-10 mg/kg de 7-9 mg/kg de Vitamina B2 ração ração 3-6 mg/kg de Vitamina B6 4-8 mg/kg de ração ração 0,03-0,05 mg/kg de 0,015-0,04 mg/kg Vitamina B12 ração de ração Niacina 30-50 mg/kg de 50-80 mg/kg de (Vitamina B3) ração ração Ácido 20-40 mg/kg de 10-18 mg/kg de Pantotênico ração ração 1-2 mg/kg de Ácido fólico 1-2 mg/kg de ração ração 0,15-0,4 mg/kg de 0,15-0,3 mg/kg de Biotina ração ração Cloreto de 200-400 mg/kg de 300-600 mg/kg de colina ração ração Outros ingredientes de ração
[0280] A composição ou a ração animal da invenção pode compreender adicionalmente agentes colorantes, estabilizadores, aditivos de melhora de crescimento e compostos de aroma/saborizantes, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs); espécies geradoras de oxigênio reativo, antioxidantes, peptídeos antimicrobianos, polipeptídeos antifúngicos e compostos de gerenciamento de micotoxina.
[0281] Exemplos de agentes de coloração são carotenoides como beta-caroteno, astaxantina e luteína.
[0282] Exemplos de compostos de aroma/saborizantes são creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftaleto de propilideno, ftaleto de butilideno fataleto, capsaicina e tanino.
[0283] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP’s) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos revelados nos documentos WO 03/044049 e WO 03/048148, assim como variantes ou fragmentos dos expostos acima que retêm atividade antimicrobiana.
[0284] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFP’s) são os peptídeos Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmento dos mesmos que retêm atividade antifúngica, conforme revelado nos documentos WO 94/01459 e WO 02/090384.
[0285] Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados são ácidos graxos poli-insaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docoso-hexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.
[0286] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são produtos químicos como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.
[0287] Os antioxidantes podem ser usados para limitar o número de espécies de oxigênio reativo que podem ser geradas de modo que o nível de espécies de oxigênio reativo esteja em equilíbrio com os antioxidantes.
[0288] Micotoxinas, como desoxinivalenol, aflatoxina, zearalenona e fumonisina podem ser encontradas em ração animal e podem resultar em desempenho negativo ou doença animal. Os compostos que podem gerenciar os níveis de micotoxina, como por meio de desativação da micotoxina ou por meio de ligação da micotoxina, podem ser adicionados à ração para melhorar esses efeitos negativos. Exemplos de compostos de gerenciamento de micotoxina são Vitafix®, Vitafix Ultra (Nuscience), Mycofix®, Mycofix® Secure, FUMzyme®, Biomin® BBSH, Biomin® MTV (Biomin), Mold-Nil®, Toxy-Nil® e Unike® Plus (Nutriad). Métodos de Aprimoramento de Digestibilidade Animal
[0289] No terceiro aspecto, a invenção se refere adicionalmente a um método de aprimoramento de digestibilidade, isto é, de energia, gordura e/ou proteína bruta, de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal a composição ou a ração animal que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase conforme definido acima.
[0290] Na presente invenção, o aprimoramento é comparado à mesma ração, mas exclui o polipeptídeo que tem atividade de muramidase.
[0291] Na presente invenção, a digestibilidade de gordura, proteína bruta e/ou energia pode ser aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %.
[0292] Em uma modalidade preferencial, a invenção se refere adicionalmente a um método de aprimoramento de digestibilidade, isto é, de energia, gordura e/ou proteína bruta, de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 e um polipeptídeo que tem atividade de xilanase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 90. A administração ao animal pode ser feita por meio de composição conforme definido acima, uma coformulação dos polipeptídeos, uma cogranulação dos polipeptídeos, ou qualquer forma de coadministração dos polipeptídeos.
[0293] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase pode ser dosado em um nível de 50-500 mg por kg de ração animal, como 60 a 450 mg, 70 a 400 mg, 80 a 350 mg, 90 a 300 mg, 100 a 300 mg, 110 a 250 mg, 120 a 200 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0294] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0295] Na presente invenção, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); animais de estimação, como gatos e cachorros, peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe- rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão- verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus). Em uma modalidade mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, ave, crustáceos e peixe. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, leitão, porco em crescimento, porca gestante, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto. Uso no Aprimoramento de Digestibilidade Animal
[0296] No quinto aspecto, a invenção se refere adicionalmente ao uso de uma composição ou uma ração animal no aprimoramento de digestibilidade, isto é, de energia,
gordura e/ou proteína bruta, de um animal monogástrico, em que a composição e a ração animal compreendem um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase conforme definido acima.
[0297] Na presente invenção, o aprimoramento é comparado à mesma ração, mas exclui o polipeptídeo que tem atividade de muramidase.
[0298] Na presente invenção, a digestibilidade pode ser aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %.
[0299] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de xilanase pode ser dosado em um nível de 50-500 mg por kg de ração animal, como 60 a 450 mg, 70 a 400 mg, 80 a 350 mg, 90 a 300 mg, 100 a 300 mg, 110 a 250 mg, 120 a 200 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0300] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0301] Na presente invenção, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto);
peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará- grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe- leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus). Em uma modalidade mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, ave, crustáceos e peixe. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, leitão, porco em crescimento, porca gestante, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto.
[0302] A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos.
EXEMPLOS Exemplo 1: Determinação de Atividade de Muramidase
[0303] A atividade de muramidase foi determinada medindo-se a diminuição (queda) na absorvância/densidade óptica de uma solução de Micrococcus lisodeikticus suspenso ATTC nº 4698 (Sigma-Aldrich M3770) medida em um leitor de microplaca (Tecan Infinite M200) a 450 nm. Preparação de substrato de Micrococcus Iysodeikticus
[0304] Antes do uso as células foram suspensas em água desionizada para uma concentração de 10 mg de células/ml e a absorvância/densidade óptica (OD) a 450 nm foi medida. A suspensão celular foi, então, ajustada para que a concentração celular no ensaio de turbidez (180 µl de tampão + 20 µl de amostra + 20 µl de substrato) se igualasse a um OD450 = 1,0. A suspensão celular ajustada foi, então, armazenada à temperatura ambiente antes do uso. As células suspensas foram usadas em 3 horas. Preparação de tampão de ácido cítrico-fosfato pH 4
[0305] 61,45 ml de ácido cítrico a 0,1 M foi medido com 38,55 ml de hidrogenofosfato dissódico a 0,2 M, e o pH foi ajustado com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para pH
4. Medição de atividade antimicrobiana de muramidase no ensaio de turbidez
[0306] A amostra de muramidase a ser medida foi diluída para uma concentração de 50 mg de proteína enzimática/l em água desionizada, e mantida em gelo até o uso. Em uma placa de microtitulação de 96 poços (Nunc) 180 µl de tampão de ácido cítrico-fosfato pH 4 e 20 µl da amostra de muramidase diluída foram adicionados e mantidos frios (5 °C). Para começar a medição de atividade 20 µl do substrato (Micrococcus Iysodeikticus) foram adicionados a cada poço, e a medição cinética de absorvância a 450 nm foi iniciada por 1 hora a 37 °C em um leitor de microplaca. A absorvância medida a 450 nm foi monitorada para cada poço e ao longo do tempo, uma queda na absorvância foi vista se a muramidase tiver atividade de muramidase.
[0307] Seguindo a incubação, a atividade de muramidase contra Micrococcus Iysodeikticus foi determinada como Δ de absorvância a 450 nm (valor de partida - valor final) de cada poço após 1 hora. A significância foi calculada com o uso de Dunnett’s com nível de teste de controle de 0,05 em JMP® versão 12.1.0 de pacote de software estatístico do SAS Institute Inc. Exemplo 2: Teste de frango de corte in vivo
MATERIAIS E MÉTODOS
[0308] O teste (ME-21/16) foi realizado de 30 de agosto a 5 de outubro de 2016, no Research Center for Animal Nutrition (DSM Nutritional Products France, F-68305 Village-Neuf) de acordo com as diretrizes francesas oficiais para experimentos com animais vivos. Animais e alojamento
[0309] Os frangos de corte machos de um dia de idade (Cobb 500) foram fornecidos por um incubatório comercial (Joseph Grelier S.A., Elevage avicole de la Bohadière, F- 49290 Saint-Laurent de la Plaine, França).
[0310] No dia de chegada (dia 1), os frangos foram divididos em peso em grupos de 18 pássaros. Cada grupo foi colocado em uma gaiola de chão com raspas de madeira espalhadas e alocado para um dos diferentes tratamentos. Cada tratamento foi replicado com 8 grupos. Os frangos foram alojados em uma sala com ambiente controlado. A temperatura ambiente foi adaptada à idade dos pássaros. Nos primeiros dias, uma lâmpada de aquecimento elétrica infravermelha adicional foi colocada em cada gaiola. Além do mais, na primeira semana a ração foi oferecida aos pássaros como péletes esmigalhados, depois como ração peletizada. Os pássaros tinham acesso livre à ração e à água.
[0311] No dia 1, uma dose de Paracox-5, uma vacina para cocidiose oral acentuada, (mistura de Eimeria acervulina, E. maxima, E. mitis e E. tenella, MSD Animal Health) foi administrada por meio de alimentação aos pássaros para introduzir um desafio imunológico à cocidiose e juntamente com o desafio nutricional verdadeiro para uma falha na barreira intestinal (Chen et al. 2015).
[0312] Paracox-5 foi diluído em água na taxa de aproximadamente 1000 doses em até 600 ml de água e aspergido uniformemente na superfície de 200 g de ração de partida por gaiola de piso, com o uso de aspersão grossa. A respectiva dieta de cada gaiola foi fornecida após os pássaros consumirem totalmente a ração tratada. Alimentação e tratamentos
[0313] As dietas experimentais (Partida e Crescimento) se basearam em farinha de soja, milho, trigo e centeio como ingredientes principais (Tabela 2). As dietas foram formuladas para conter 211 g/kg de proteína bruta e 12,4 MJ/kg de ME para o período de partida e 191 g/kg de proteína bruta e 12,7 MJ/kg de ME para o período de crescimento.
[0314] Tabela 2: Composição e teores de nutrientes das dietas experimentais basais Período de Período inicial crescimento (22- (dia 0-21) 36) Ingredientes Inclusão (%) Inclusão (%) Trigo 45,00 45,00 Centeio 10,00 10,00
Período de Período inicial crescimento (22- (dia 0-21) 36) Ingredientes Inclusão (%) Inclusão (%) SBM 32,00 26,60 Maís 6,48 10,80 Óleo Vegetal 3,00 3,80 NaCl 0,20 0,20 DL Metionina 0,22 0,22 L-Lisina 0,20 0,22 Calcário 0,90 0,86 Dical Phos 1,00 1,30 V&M 1,00 1,00 TiO2 - 0,10 Provisão Calculada AME, MJ/kg 12,4 12,7 AME, kcal/kg 2963 3034 Proteína Bruta, 21,1 19,1 % Met + Cys, % 0,87 0,82 Lys, % 1,23 1,11 Ca, % 0,70 0,75 P total, % 0,55 0,58 avP, % 0,28 0,32 Teor analisado Proteína bruta 209 183 (%) 1 Pré-mistura de vitamina-mineral fornecida por quilograma de dieta: Vitamina A: 10 000 I.U.; vitamina E: 40 I.U.; vitamina K3: 3,0 mg; vitamina C: 100 mg; vitamina B1: 2,50 mg; vitamina B2: 8,00 mg; vitamina B6: 5,00 mg; vitamina B12: 0,03 mg; niacina: 50,0 mg; pantotenato cálcico: 12,0 mg; ácido fólico: 1,50 mg; biotina 0,15 mg; colina: 450 mg; etoxiquina: 54 mg; Na: 1,17 g; Mg: 0,8 g; Mn: 80 mg; Fe: 60 mg; Cu: 30 mg; Zn: 54 mg; I: 1,24 mg; Co: 0,6 mg; Se: 0,3 mg 2 Energia metabolizável calculada com equação EC baseada em nutrientes brutos analisados de acordo com a fórmula ME (MJ/kg) = ((15,51*proteína bruta+34,31*gordura+16,69*amido+13,01*açúcar)/1000)
[0315] A inclusão de altos níveis de trigo e centeio na dieta, ricos em polissacarídeos não amídicos (NSP), foi usada para criar um desafio nutricional. De fato, a inclusão de NSP em dietas de frangos de corte foi mostrada por ter uma influência prejudicial na utilização de nutrientes aumentando-se a viscosidade de digesta e reduzindo-se a digestibilidade de nutrientes (gordura e proteína) que causaria disbacteriose (Friesen, et al. 1992; Knudsen, 2014).
[0316] Ronozyme HiPhos a 100 mg/kg, Ronozyme ProAct a 200 mg/kg e Carophyl yellow 60 mg/kg (10 % de ApoEster) foram incluídos em todas as dietas basais. As dietas foram alimentadas não suplementadas (controle negativo) ou suplementadas com os seguintes tratamentos:
[0317] Tabela 3: Tratamentos Tratamento Código Produto Dosagem A Co(-) Controle -
Tratamento Código Produto Dosagem 25 000 B Co(-) MUR-25 Muramidase LSU(F)/kg 35 000 C Co(-) MUR-35 Muramidase LSU(F)/kg Xilanase D Co(-) WX (Ronozyme 150 mg/kg WX) 25 000 Co(-) MUR-25 + Muramidase E LSU(F)/kg + 150 WX + Xilanase mg/kg 35 000 Co(-) MUR-35 + Muramidase F LSU(F)/kg + 150 WX + Xilanase mg/kg
[0318] O produto de muramidase foi fornecido pela Novozymes A/S.
[0319] A quantidade adequada dos produtos foi misturada com uma pequena quantidade da ração basal como uma pré- mistura que foi, então, adicionada à ração para obter a concentração final, de acordo com o tratamento. Após a mistura, a ração foi peletizada (3 x 25 mm) em cerca de 70°. Parâmetros experimentais e análises
[0320] No dia 36, seis frangos por réplica foram eutanasiados. Os frangos foram dissecados e o conteúdo da parte terminal do íleo foi coletado. A parte terminal do íleo é definida como 17 cm proximal a um ponto de 2 cm antes doa junção íleo-cecal. A digesta ileal foi amostrada, agrupada a partir dos frangos em uma réplica, seca por congelamento e triturada para análise química. Os níveis de energia e proteína bruta, assim como a concentração de TiO2 como marcador indigestível foram determinados nas amostras de digesta e na ração.
[0321] Em paralelo, todo o conteúdo jejunal foi coletado para medições de viscosidade. Os conteúdos jejunais de dois frangos por gaiola foram agrupados, imediatamente congelados e armazenados a -20 °C até a determinação de viscosidade. As amostras foram subsequentemente tiradas do congelador, descongeladas e centrifugadas a 10 000 g por 10 minutos (a 3 °C). Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado através de um tecido de náilon, o pH do filtrado foi medido e a viscosidade foi determinada. As medições de viscosidade no conteúdo jejunal foram realizadas com um viscosímetro de rotor (Thermo Haake, RotoVisco 1) em uma taxa de cisalhamento de 300 s- 1 por 2 minutos a 38 °C.
[0322] As análises do teor de nutrientes nas amostras de ração foram realizadas de acordo com os métodos padrão (VDLUFA 1976). A análise de nitrogênio foi realizada com um analisador Leco N (CP=N*6,25). As determinações de energia foram realizadas com o uso de um Calorímetro IKA®-Werke (C 2000 básico). A concentração de TiO2 na ração e digesta foram determinadas por meio de Plasma Acoplado por Indução (ICP) de acordo com DIN EN ISO 11885:1997 (DIN EN ISO 1998) após mineralização com H2SO4 / Na2SO4.
[0323] A concentração do marcador na ração e digesta juntamente com o teor de proteína e energia na ração e digesta foram usados para calcular o coeficiente de digestibilidade ileal (AID) aparente de proteína e energia de acordo com a seguinte fórmula:
AID (%) = 100 - [(CMf/CMe) x (CNe/CNf)] x 100 CMf =concentração de marcador na ração; CMe = concentração de marcador na digesta ileal; CNf = concentração de proteína /energia na ração; CNe =concentração de proteína/energia em digesta ileal Análise estatística
[0324] Os dados foram submetidos a análise unifatorial de variância (fator: suplementação enzimática), com o uso do pacote de software estatístico StatGraphics Centurion XVI (Manugistics, Rockwille, MD). Quando os efeitos de tratamento significativos (p < 0,05) foram indicados, as diferenças dentre meios de tratamento foram subsequentemente analisadas com o teste de Newman-Keuls. Resultados e Discussão Digestibilidade
[0325] Os resultados da digestibilidade ileal aparente de proteína bruta (AIDP) e energia (AIDE) e de viscosidade jejunal são apresentados na Tabela 4.
[0326] Tabela 4. Influência de suplementação enzimática dietária em digestibilidade ileal aparente de proteína bruta e energia e em viscosidade jejunal de frangos de corte no dia 36; (Média ± SD) Digestibilidade ileal aparente Jejunal Viscosidade Tratamentos Proteína (%) Energia (%) (m.P.a.s) A 71,62 67,07 a 4,35 B 75,30 70,53abc 3,91 C 70,08 68,45ab 3,73 D 74,57 70.66abc 2,38
Digestibilidade ileal aparente Jejunal Viscosidade Tratamentos Proteína (%) Energia (%) (m.P.a.s) E 76,73 73.28c 2,36 F 75,74 71.96bc 2,38 valor P 0,135 0,0082 < 0,001 abc: Teste de Newman-Keuls: Os meios em uma fileira, que não compartilham um sobrescrito comum, são significativamente diferentes (p<0,05)
[0327] AIDE foi significativamente aprimorada pela adição dos produtos combinados em comparação com NC. Um aprimoramento de 9,3 % e 7,3 % foi registrado com a adição de muramidase em 25 000 LSU(F)/kg ou 35 000 LSU(F)/kg, respectivamente, em combinação com Ronozyme WX.
[0328] A viscosidade do conteúdo jejunal foi significativamente reduzida com suplementação de muramidase em separado ou em combinação. Uma redução significativa de viscosidade de conteúdo jejunal em 14,3 % e 45,3 % foi obtida com a adição de muramidase a 35000 LSU (F)/kg e Ronozyme WX, respectivamente, em comparação com NC. Como esperado, a adição de Ronozyme WX mostrou uma redução significativa maior de viscosidade em comparação com a inclusão de muramidase sozinha. Conclusão
[0329] Um aprimoramento de digestibilidade ileal aparente de proteína e energia também foi registrada com suplementação de muramidase em combinação com Ronozyme WX.
[0330] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ter o escopo limitado pelos aspectos específicos revelados no presente documento, visto que esses aspectos se destinam a ser ilustrações de vários aspectos da presente invenção.
Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção.
De fato, várias modificações da presente invenção além daquelas mostradas e descritas no presente documento ficarão claras para os indivíduos versados na técnica a partir da descrição anterior.
Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas.
No caso de conflito, a presente revelação que inclui definições prevalecerá.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição caracterizada por compreender um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase fúngica GH25.
3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de xilanase é selecionado a partir do grupo que consiste em xilanase GH10, xilanase GH11, xilanase GH5 e xilanase GH30.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3;
(d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 18;
(s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 33;
(ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 48;
(aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 63;
(bl) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (bu) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de
(a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) que tem atividade de muramidase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de xilanase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 72; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 73; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 74; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 75; (e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 76; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 77; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 78; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 79; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 80; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 81; (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 82; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 83; (m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 84; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 85; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 86; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 87; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 88; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 89; (s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 90; (t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 91; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 92; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 93; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 94; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 95; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 96; (z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 97; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 98; (ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 99; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 101; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 102; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 103; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 104; (ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 105; (ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 106; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 108; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 109; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 110; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 111; (ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 112; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 113; (aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 114; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 115; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 116; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 117; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 118; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 119; (aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 120; (ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 121; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 122; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 123; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 124; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 125; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 126; (bd) uma variante de SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 ou SEQ ID NO: 126 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (be) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j),
(k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc) ou (bd) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bf) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc) ou (bd) que tem atividade de xilanase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizada por compreender um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 e um polipeptídeo que tem atividade de xilanase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 90.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados a partir da lista que consiste em um ou mais carreadores; um ou mais eubióticos, como probióticos, pré-bióticos e ácidos orgânicos; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; e um ou mais outros ingredientes de ração.
8. Ração animal que compreende um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia, sendo a ração animal caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de xilanase.
9. Ração animal, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a fonte de proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, soja selvagem, feijão, tremoço, feijão Tepary, feijão-da- Espanha, feijão slimjim, feijão-de-lima, vagem francesa, fava comum (feijão-fava), grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim Spanish, canola, semente de girassol, semente de algodão, colza (semente oleaginosa de colza) ou ervilha ou em uma forma processada como farinha de soja, farinha de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farinha de soja fermentada (FSBM), farinha de girassol, farinha de semente de algodão, farinha de colza, farinha de peixe, farinha de osso, farinha de pena, soro ou qualquer combinação dos mesmos.
10. Ração animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizada pelo fato de que a fonte de energia é selecionada a partir do grupo que consiste em maís, milho, sorgo, trigo, cevada, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass,
painço, milheto, milho-da-Itália ou em uma forma processada como milho moído, maís moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moído, painço moído, milho-da-Itália moído, milheto moído, ou qualquer combinação dos mesmos.
11. Método de aprimoramento de digestibilidade de um animal monogástrico caracterizado por compreender administrar ao animal a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 ou a ração animal conforme definida em qualquer uma das reivindicações 8-10.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a composição ou ração animal é dosada de modo que o polipeptídeo que tem atividade de xilanase está em um nível de 50-500 mg por kg de ração animal, como 60 a 450 mg, 70 a 400 mg, 80 a 350 mg, 90 a 300 mg, 100 a 300 mg, 110 a 250 mg, 120 a 200 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a composição ou ração animal é dosada de modo que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase esteja em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); animais de estimação, como gatos e cachorros, peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe- gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus).
15. Método de aprimoramento de digestibilidade, isto é, de energia, gordura e/ou proteína bruta, de um animal monogástrico caracterizado por compreender administrar ao animal um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 e um polipeptídeo que tem atividade de xilanase que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 90, em que a administração ao animal pode ser feita por meio de uma composição ou ração animal conforme definida nas reivindicações 1-10, uma coformulação dos polipeptídeos, uma cogranulação dos polipeptídeos, ou qualquer forma de coadministração dos polipeptídeos.
16. Uso caracterizado por ser da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 ou a ração animal conforme definida em qualquer uma das reivindicações 8-10 no aprimoramento de digestibilidade de um animal monogástrico.
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