PT1448595E - Polipéptideos antimicrobianos de pseudoplectania nigrella - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

POLIPÉPTIDEOS ANTIMICROBIANOS DE PSEUDOPLECTANIA

NIGRELLA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polipéptideos com actividade antimícrobiana e a polinucleótidos com uma sequência de nucleótidos para codificar os polipéptideos. A invenção refere-se ainda à construção de ácidos nucleicos, vectores, e células hospedeiras que compreendem a construção dos ácidos nucleicos assim como os métodos para produzir e utilizar os polipéptideos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO invenção prover polipéptideos com polinucleótidos para codificar os E um objecto da presente actividade antimicrobiana e polipéptideos.

RESUMO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto a presente invenção refere-se a um polipéptideo com actividade antimicrobiana, seleccionado do grupo composto por: (a) um polipéptído que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65% de identidade com os aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2; 1 (b) um polípéptideo que está codificado por uma sequência nucleótidos hibidrizado híbrida num um meio adstringent utilizando para a lavagem 0.2 X SSC a 42 °C, com uma sonda polinucleótidos seleccionada do grupo composto por:

(í} a cadeia complementar dos nucleótidos 166 a 285 da SEQ

(ii) a cadeia complementar dos nucleótidos 70 a 285 da SEQ NO:1, e

(iii} a cadeia complementar dos nucleótidos 1 a 285 da SEQ NO : 1; e (c) um fragmento de (a) ou (b) com actividade antimicrobiana.

Num segundo aspecto a presente invenção refere-se polinucleótidos com uma sequência de nucleótidos que codifiq os polípéptideos da invenção.

Num terceiro aspecto a presente invenção refere-se à construo dos ácidos nucleicos que compreendam a sequência de nucleótido que codifique o polipéptido da invenção, ligada funcionalmente uma ou ma is sequências de controlo que dirigem a produção polípéptideo num hospedeiro adequado.

Num quarto aspecto a presente invenção refere-se a um vector expressão recombinante que compreende a elaboração dos ácid nucleicos da invenção. lante resente invenção refere-se a uma :ompreenae a eiaboraçao dos nvençac Ί πτ; sexto aspecto a presente invenção refere-se a um método pa: produção de um polipéptideo da invenção, caracterizado por 5todo compreender: (a) o cultivo de uma estirpe, que na sua forma selvagem é capa: te produzir o polipéptideo, para produzir o polipéptideo; e (b) a recuperação do polipéptideo.

Num sétimo aspecto a presente invenção refere-se a um mél para produzir um polipéptideo da invenção, caracterizado pc método compreender: . v vr 11ci!, (a) o cultivo de uma célula hospedeira recombinante da i ern condições propicias para a produção do polipéptideo; e (b) a recuperação do polipéptideo. À continuação, outros aspectos da presente invenção ser; evidentes com a descrição e com as reivindicações anexas,

DEFINIÇÕES

Antes de mais detalhadamente discutir a presente ínvençãc primeiro serão definidos os seguintes termos e convenções:

Polipéptideo substancíalmente puro: No presente contexto, expressão "polipéptideo substancialmente puro" signifxca ui preparação polipeptídica que quando muito contém 10% em peso c outro material polipéptidíco com o qual está oríginalmen· ód S iã O C 1 â Cl d. (são preferidas percentagens mais pequen aS Q6 O U L· ΪΓ ma terial poiipeptid ico, como por exemplo qi zando ΤΠ 1 1 f ra pç o peso, qua ndo muito 6% em peso, quando muito 5 % em peso, quand muito 4%, quando m uito 3% em peso, quando muito 2% em peso quando mu r t o 1 % em peso, e quando muito 1/2% em pes o), Assim, preferido que ο ρο lipéptideo substancíalment e puro tenha pel menos 92% de pureza, isto é que o polipéptideo constitua pelo menos 92% em peso do material poiipeptídico total presente na preparação, e são preferidas percentagens ma is elevadas como por exemplo pelo menos 94% de pureza, pelo menos 95% de pureza, pelo menos 96% de pureza, pelo menos 96% de pureza, pelo menos 97% de pureza, pelo menos 98% de pureza, pelo menos 99%, e quando murro 99.5% de pureza. Preferencialmente, os polipéptideos descritos na presente invenção estão em formas substancialmente puras. Em particular, é preferido que os polipéptideos descritos na presente invenção estejam na "forma essencíalmente pura", isto e que a preparação poiipeptídica esteja essencialmente livre de outro material polípeptídico com o qual originalmente está associado. Isto pode por exemplo, ser realizado, preparando o polipéptideo mediante métodos lecombinantes bem conhecidos. Aqui, a expressão "polipéptideo substancíalmente puro" e sinónimo das expressões "polipéptideo isolado" e "polipéptideo na forma isolada".

Actividade antimicrobiana:

A expressão "actívidade antimicrobiana" está definida aqui como uma actívidade que é capaz de matar ou de inibir o crescimento das células microbianas. No contexto da presente invenção a expressão "antímícrobiano" pretende significar que há um efeiro bactericida e/ou bacteriostático e/ou fungicida e/ou fungistático e/ou um efeito virulicida, onde a expressão "bactericida" deve ser entendida como capaz de matar as células bacterxanas. A expressão "bacteriostático" deve ser entendida como capaz de inibir o crescimento bacteriano, isto é inibir o crescimento das células bacterianas. A expressão "fungicida" deve ser entendida como capaz de matar as células fúngicas. A expressão "fungistático" deve ser entendida como capaz de inibir o crescimento fúngico, isto é de inibir o crescimento das células fúngicas. A expressão "virulicida" deve ser entendida como capaz de ínactivar os vírus. A expressão "células microbianas" refere-se a células bacterianas ou fúngicas (incluídas as das leveduras). 4

No contexto da presente invenção a expressão "inibir o crescimento das células microbianas" pretende significar que as células estão no estado de não crescimento, isto é, que elas não são capazes de se propagarem. Para os obj ectivos da presente invenção, a actividade antimicrobiana pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito por Lehrer et al. , Journal of Immunological Metnods, Vol . 137 (2) pp. 167-174 (1991).

Os polipéptideos que têm actividade antimicrobiana podem ser capazes de reduzir o número de células vivas de Eschenchia col i (DSM 1576) a 1/100 após uma incubação a 20°C durante 30 mm. numa solução aqupsa de 25%(p/p); preferencialmente numa solução aquosa de 10%(p/p); mais preferencialmente numa solução aquosa de 5%(p/p); inclusive mais preferencialmente numa solução aquosa de 1%(p/p); mais preferencialmente numa solução aquosa de 0.5% (p/p); e em particular numa solução aquosa de 0.1%(p/p) dos polipéptideos com actividade antimicrobiana.

Os polipéptideos com actividade antimicrobiana podem também ser capazes de inibir a excrescência da Escheríchia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25°C num substrato de crescimento microbiano, quando adicionados numa concentração de 1000 ppm; preferencialmente quando adicionados numa concentração de 500 ppm; mais preferencialmente quando adicionados numa concentração de 250 ppm; ainda mais preferencíalmente quando adicionados numa concentração de 100 ppm; mais preferencialmente quando adicionados numa concentração de 50 ppm; e em particular quando adicionados numa concentração de 25 ppm.

Os polipéptideos com actividade antimicrobiana podem ser capazes de reduzir o número de células vivas de Bacillus suhtilis (ATCC 6633) a 1/100 após uma incubação durante 30 mín. a 20°C numa solução aquosa de 25% (p/p); preferencialmente numa solução io 10%(p/p); mais preferencialmente numa solução aquosa /p) ; ainda mais preferencialmente numa solução aquosa de , .. ; mais preferencialmente numa solução aquosa de 5 0.5% (p/p); e em particular numa solução aquosa de 0.1 % (p/p) ; dos polipéptideos com actividade antimicrobiana.

Os polipéptideos com actividade antimicrobiana podem também ser capazes de inibir a excrescência do Bacillus subtílis íATCC 6633) durante 24 horas a 25° num substrato de crescimento microbiano, quando adicionado numa concentração de 1000 ppm; preferencíalmente quando adicionado numa concentração de 500 ppm; mais preferencialmente quando adicionado numa concentração de 250 ppm; ainda mais preferencialmente quando adicionado numa concentração de 100 ppm; mais preferencialmente quando adicionado numa concentração de 50 ppm; e em particular quando adiconado numa concentração de 25 ppm.

Os polipéptideos da presente invenção deverão preferenciaimente ter pelo menos 20% da actividade antimicrobiana do polipéptideo compreendida por* a sequência de aminoácidos mostrada como os amínoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO: 2. Numa forma particularmente preferida de realizar a invenção, os polipéptideos deveriam ter pelo menos 40%, assim como pelo menos 50%, preferencíalmente pelo menos 60%, assim como pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, assim como pelo menos 90%, rnaís preferencialmente peio menos 95%, assim como aproximadamente ou pelo menos 100% da actividade antimicrobiana do polipéptideo compreendido na sequência de aminoácidos mostrada como os aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2.

Identidade: sequências nucleótidos

No presente contexto, a homoiogía entre duas de aminoácidos ou entre duas sequências cie é descrita pelo parâmetro "identidade".

Para os objectivos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada com a utilização do programa FASTA incluída na versão 2 . Ox do pacote do programa FASTA (ver W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysís", PNAS 85:2444- 6

L o uiod ορτχοοχοηυτχοΰ χρχηοχριιι οιαηο op osod uie , %oi uioquoo oqxnui opuer.b omd oquouiTexouexsqns ορτχοοχοηυτχοά um 'uixssq seup^oid θρ oeònpoud op seuioqsxs sou eoxqouob eijequeDus uio epezxTxqn jos eied epenbope euiuoi emnu eqso θ sepeÇosopux no sçppauuoosop οροηοτττροο op sçpusnbss seiqno op θιδιτ poso oiueiuod ο 'ooxqouob xemiBu οτοιυ nos op opeuxuixTO τοχ ορτ ροοχοηυτχοά ο opuo · eppqç^T^nujTod oeóeirpdejd eum e θβ-θιθιθι ηρηζτχχχη inbe oujod opiooe op „ojnd oxuouixexouexsqns ορτηροχοηυτ χοα„ o essoxdxo q ; cuna sq.u9uijejDUP^sqns õpjqmWfõmrffõq

OIJOD ujn op Βοτχοχη exubiiba eum uod οροοτχτροο ospxqdodxxod um o oopxqdodxpod um op ροτχοχο opunjueA nuiq · spppoxjxpoui sopxoe ouxuie op sexouonbos uiod soopxqdodxTod ηηοτρτροο opod no (αρβοχχτροο oopxqdodTTod ou sooòeoxjTpoui uios) sesopuejis nos uiopod ouob op seoòeqnui sq · soodeoAod seu ouisjj jouiyxod umu upqxnsou opod o 'οοόρχιχηιπ ep εοΛΡηχρ oquouixnunqnu obuns ροττοχρ oeòPiisA q · ooTuipssoiuojo snooj ouisoui o ednoo onb ouob um op sbatupuiuite seiunoj sxeui no senp op jonbsjpnb e os-ouoqou ,,ηοχχοχη b^ubtiba,, oessoxdxo e 'oboubaui oquosoud ep opxoquoo op eorpapê οχαρχχρχ • sopxoeouxuie op exouonbos essop oijxoqiEo no/o ouxuie xeupuinoq op sopeuxuixjo sopxoeouxme sxeui no um uiop onb oopxidodjxod um o c: ON QI QaS ep ..oquouibexj,, um 'oquosond eu ορρζχχχχη opuenr) icmusmiõWJj X- χοχ sdeb op oesuoqxo exed oedezxxeuod e o 'gg - χοχ sdeb op oeõpzxTPUod 'opepxquopx ep zxuqeui e χοχ epeziTiqr. oeõenquod ep zxjqeui q -oqxuosop oquouixoxxoque o ouioo bibmbjos op onooed ouisom o o ouiqxjobye omsoui ο ορυηζχχτρη opeuxuixoqop o 'sopxxçoTonu op sexouonbos senp ouquo opepxquepT op neub o

•7- τοχ sdeb op oesuoqxo ep oesezxxeuod e o ‘Zl~ T°õ deb op oedezxxeuod e ObWQSOig T°o epezxTxqn oeõenquod op zxjqeui q · (ge -t9: £81 AborouiAzua ui spoqqoq '..ViSYd pue diS¥d uxtm uosxxeduioo oouonbog OAjqxsuos pue pxdeH,, (0661) uosneoq · q · q o -SvvZ qual está originalmente associado (são preferidas percentagens inferiores de outro material polinucleótido, por exemplo muito 8% em peso, quando muito 6% em peso, quando muito .. em peso, quando muito 4% quando muito 3% em peso, quando muito 2% em peso, quando muito 1% em peso, e quando muito 1/2% em peso' , Um polinucleótido substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas de origem natural, como por exemplo promotores e terminadores. E preferido que c polinucleótido substancialmente puro tenha pelo menos 92% de pureza, isto é que o polinucleótido constitua pelo menos 92% ern peso do material polinucleótido total presente na preparação, são preferidas percentagens mais elevadas como por exemplo pelo menos 94% de pureza, pelo menos 95% de pureza, pelo menos 96% de pureza, pelo menos 96% de pureza, pelo menos 97% de pureza, pelo menos 98% de pureza, pelo menos 99%, e quando muito 99.5% de pureza. Os polinucleótidos descritos na presente invenção preferencialmente estão na forma substancialmente pura. Ern particular, é preferido que os polinucleótidos descritos na presente invenção estejam na "forma essencialmente pura", isto é que a preparação polinucleótida esteja essencialmente livre de outro material polinucleótido com o qual originalmente está associado. Aqui, a expressão "polinucleótido substancialmente puro" é sinónimo das expressões "polinucleótido isolado" e "polinucleótido na forma isolada". ressão ca do s t r a d a o mo d . A ( s } da (s ) e/ou

Modificação(ões} : No contexto da presente invenção a exp "modificação(ões)" significa qualquer modificação quími polipéptídeo compreendida na sequência de amínoácidos mo como os amínoácidos 1 a 4 0 da SEQ ID NO: 2 assim c manipulação genética do ADN que codifica este polipéptídeo modificação(ões) pode(m) ser a(s) substituição(ões) cadeía(s) de amínoácidos, sustítução(ões) , delecção(ões) inserção(Ões) dentro ou no(nos) aminoácido(s) de interesse. 8

Variante artiticial: Quando utilizada na presente invenção, expressão "variante artificial" significa que um polipéptideo com actividade antimicrobiana, foi produzida por um organismo que expressa um gene modificado quando comparado com a SEQ ID NO: 1. 0 gene modificado, a partir do qual a dita variante é produzida quando, é expresso num hospedeiro adequado, é obtido com a intervenção humana por modificação da sequência de nucieótidos descrita na SEQ ID NO:1. ADNc: A expressão "ADNc" quando é utilizado no contexto da presente invenção, destina-se a cobrir uma molécula de ADN que pode ser preparada por transcrição invertida desde uma molécula de ARNm madura, dividida, derivada de uma célula eucariótica. 0 ADNc não tem as sequências do intrão que habí tualmente estão presentes no correspondente ADN genómico. 0 inicial, primário ARN transcrito é um precursor do ARNm e atravessa uma série de eventos de tratamento antes de aparecer como o ARNm maduro e dividido. Estes eventos incluem a eliminação das sequências do intrão por um processo denominaao cie excisão. Assim, quando o ADNc deriva de ARNm consequentemente não tem as sequências de intrões.

Construção dos ácidos nucleicos: Quando utilizada na presente invenção, a expressão "construção dos ácidos nucleicos" significa que uma molécula de ácidos nucleicos, é de cadeia simples ou dupla, que está isolada de um gene de origem natural cu que foi modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de contrário não existiria na natureza. -expressão elaboração de ácidos nucleicos, é sinónimo . · expressão "cassete de expressão" quando a construção dos ácidos nucleicos contém as sequências de controlo requeridas para a expressão de uma 'sequência de codificação da presente invenção. 9

Sequência de controlo: A expressão "sequências de controlo" e definida na presente invenção por incluir todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polípéptideo da presente invenção. Cada sequência de controlo pode ser nativa ou externa da sequência de nucleótidos que codifica o polípéptideo. Estas sequências de controlo incluem, mas não se limitam a uma sequência líder, de polia de nila cão, sequência de propéptideos, promotor, sequência do péptideo sinal, e termínador da transcrição. No mínimo, as sequências de controlo incluem um promotor, e sinais de paragem da transcrição e da tradução. As sequências de controlo podem estar providas de ligações para a 'introdução de sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controlo com a região de codificação da sequência de nucleótidos que codifica um polípéptideo.

Ligado funcionalmente: A. expressão " ligado funcionalmente" é definida na presente invenção como uma configuração onde uma sequência de controlo está apropriadamente colocada numa posição relativa à sequência de codificação da sequência de ADN de forma a que a sequência de controlo dirija a expressão de um polípéptideo.

Sequência de codificação: Quando utilizada na presente invenção a expressão "sequência de codificação" destína-se a cobrir uma sequência de nucleótidos, que directamente especifica a sequência de amínoácídos do seu produto de proteína . Habitualmente, os limites da sequência de codificação estão determinados por um marco de leitura aberto, que habitualmente começa no codão de iniciação ATG. Habitualmente, a sequência de codificação inclui ADN, ADNc, e sequências de nucleótidos recombínantes.

Expressão: No contexto da presente invenção presente, a designação "expressão" incluí qualquer fase implicada na produção do polípéptideo que incluí, mas não se limita á 10 transcrição, à modificação pós-transcripcional, à tradução, a modificação pós-traducional, e à secreção.

Vect.or de expressão: No contexto da presente invenção, a designação "vector de expressão" cobre uma molécula de ADN, linear ou circular, que compreende uma codificação do segmento de um polipéptido da invenção, e que está ligado funcionaimente a segmentos adicionais que provêem a sua transcrição. Célula hospedeira: A designação "célula hospedeira", como é neste caso utilizada, inclui qualquer tipo de célula que com a construção dos ácidos nucleicos é susceptível de se transformar.

As expressões "sonda polinucleótida", "hibrídaçâo" assim como as várias condições de adstringência são definidas na secção intitulada "Polipéptideos com actividade antimicrobiana".

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Polipéptideos com actividade antimicrobian;

Numa primeira forma de realizar a presente invenção esta refere-se a polipéptideos com actividade antimicrobiana e onde os polipéptideos compreendem, preferencialmente estão compostos por uma sequência de aminoácidos com uma certa identidade com os aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID N0:2 (isto é, o polipéptideo maduro) de pelo menos 65%, preferencialmente de pelo menos 701, por exemplo pelo menos o 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, assim como pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, * mais preferencialmente pelo menos 95%, por exemplo pelo menos 96%, assim como peio menos 97%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 98%, assim como pelo menos 99% (daqui para a frente denominados "polipéptideos homóloqos" } . Numa forma de realização interessante, a sequência de aminoácidos quando muito é diferente em dez aminoácidos (por exemplo por dez aminoácidos), em particular quando muito cinco assim como de amínoácídos (por exemplo por cinco aminoácídos), quando muito quatro aminoácidos (por exemplo por quatro aminoácidos), por exemplo de quando muito três aminoácidos (por exemplo por três aminoácidos) dos aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2. Numa forma particularmente interessante de realizar a invenção, a sequência de aminoácidos é quando muito diferente em dois aminoácidos (por exemplo por dois aminoácidos), assim como de um aminoácido dos aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2 .

Preferencialmente, os polipéptideos da presente invenção compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma com actividade antimicrobiana. Noutra forma de realização preferida, o polipéptideo da presente invenção compreende os aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO: 2 . Numa forma de preferida de realizar a invenção adicional, o polipéptideo está composto pelos aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2.

Cs aminoácidos que compõe o polipéptideo da invenção podem independentemente ser seleccionados das formas D ou L. O polipéptideo da invenção pode ser um polipéptideo de tipo selvagem, com actividade antimicrobiana, identificada e isolada de uma fonte natural. Estes polipéptideos de tipo selvagem podem ser especificamente seleccionados por métodos Standard conhecidos na técnica. Além de que, o polipéptideo da invenção pode ser preparado pela técnica da redistribuição do ADN, como a que é descrita em J.E. Ness et al. , Nature Biotechnology 17, 893-896 (1999).

Os presentes inventores isolaram um gene que codifica um polipéptideo com actividade anticrobiana de Pseudoplectania nígrella. A estirpe de Pseudoplectania nigrella que contém o qene foi depositado de acordo com o Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos na ra Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes em 28 . 1997 no Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Upj 12 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands (de forma alternativa P.O.Box 85167, 3508 AD Utrecht, The Netherlands), e foi-lhe designado o número de registo CBS 444.97.

Numa terceira forma de realizar a presente invenção, esta refere-se a polipéptideos com actividade antimicrobiana que são codificados por sequências de nucleótidos que foram hibridizados em condições de adstringência média, mais preferencialmente em condições de adstringência média-alta, ainda ma i s preferencialmente condições de adstringência alta, e ma i s preferencialmente em condições de adstringência muito alta com

uma sonda de polinucleótidos seleccionada do grupo composto por: (i) a cadeia complementar dos nucleótidos 166 a 285 da SEQ ID MO - 1 (li) a cadeia complementar da sequência de ADNc contida nos nucleótidos 70 a 285 da SEQ ID NO:l, e Í111) a cadeia complementar dos nucleótidos 1 a 285 da SEQ ID NO:1 (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989,

Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). A sequência de nucleótidos da SEQ ID NO:1 ou uma subsequêncía da mesma, assim como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da · mesma, pode ser utilizada para desenhar uma sonda de polinucleótidos para identificar e clonar o ADN que codifica os polipéptideos com actividade antimicrobiana das estirpes de diferentes géneros ou espécies de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, estas sondas podem ser utilizadas para a hibridação com o ADNc ou genómíco do género ou espécies de interesse, de acordo com os procedimentos oe Southern blot Standard, para identificar e isolar o gene correspondente nas mesmas. Estas sondas podem ser consideravelmente mais curtas; que a sequência inteira, mas deverão ter pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 25, mals preferencialmente peio menos 35 nucleótidos de comprimento, assim como pelo menos 70 nucleótidos de comprimento. No entanto, é preferido que a sonda de polinucleótidos tenha pelo menos 100 nucleótidos de comprimento. Por exemplo, a sonda de oolinucleótidos pode ter pelo menos 200 nucleótidos de comprimento, pelo menos 300 nucleótidos de comprimento, pe 1 o menos 400 nucleótidos de comprimento ou pelo menos 500 nucleótidos de comprimento. Podem ainda ser utilizadas so nda s rnais compridas, como por exemplo, sondas de poiinucleótidos com peio menos 600 nucleótidos de comprimento, pelo menos 7 00 nucleótidos de comprimento, pelo menos 800 nucleótidos cie comprimento, ou pelo menos 900 nucleótidos de comprimento. Tanto podem ser utilizadas sondas de ADN como de ARN. Habitualmente, as sondas estão marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com J"P, JH, 3sS, biotina, ou avidina) .

Assim, um ADN genómico ou banco de ADNc preparados a partir destes outros organismos podem ser seleccionados pelo ADN que foi hibridizado com as sondas anteriormente descritas e que codifica um polipéptideo com actividade antimicrobiana. O ADN genómico ou outro ADN destes organismos podem ser separados por electroforese em gel de poliacrilamida ou agarose, ou outras técnicas de separação. O banco de ADN ou o ADN separado pode ser transferido e imobilizado, em nitrocelulose ou outros materiais portadores adequados. Para identificar um clone ou ADN que seja homólogo à SEQ ID NO: 1 o material portador com o ADN imobilizado é utilizado num Southern biot,

Para os objectivos da presente invenção, a hibridação indica que a sequência de nucleótidos híbrida numa sonda de nucleótidos marcada que foi hibrídizada na sequência de nucleótidos mostrada na SEQ 1D NO: 1 em condições de adstríngêncía de muito baixa a muito alta. As moléculas nas que a sonda de nucleótidos híbrida nestas condições podem ser detectadas com a utilização de uma película de raios-X ou por qualquer outro método conhecido na 14 técnica. Sempre que a expressão "sonda de polinucleótidos" é utilizada no presente contexto, deve ser entendido que esta sonda contém pelo menos 15 nucleótidos.

Numa forma de realização interessante, a sonda cie POlinucleótidos é a cadeia complementar dos nucleótidos 166 a 285, os nucleótidos 70 a 285, ou os nucleótidos 1 a 285 da SEQ 11 NC:1 .

Noutra forma de realização interessante, a sonda de Doimucleótidos é a cadeia complementar da sequência de nucleótidos que codifica o polipéptideo da SEQ ID NO:2. Numa forma de realização adicional interessante, a sonda de polinucleótidos é a cadeia complementar da SEQ ID NO:1. Noutra forma adicional de realização interessante, a sonda de polinucleótidos é a cadeia complementar da zona de codificação ao polipéptideo maduro da SEQ ID NO:1.

Para sondas compridas com pelo menos 100 nucleótidos de comprimento, as condições de adstringência de muito baixas a mui. to altas estão definidas como pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, 1.0% SDS, 5X Solução de Denhardt, 100 ml de ADN de esperma de salmão cortado e desnaturado, de acordos com os procedimentos standards de Southern blot. Preferencialmente, as sondas compridas com pelo menos 100 nucleótidos não contêm mais de 1000 nucleótidos. Para sondas compridas com pelo menos 10 0 nucleótidos de comprimento, o material portador é finalmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos utilizando 2 X SSC, 0.1 % de SDS a 42°C (adstringência muito baixa), preferencialmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos utilizando 0.5 X SSC, 0.1% de SDS a 42 °C (adstringência baixa) , ma i s preferencialmente lavado três vozes cada um durante 15 minutos utilizando 0.2 X SSC, 0.1% de SDS a 42°C (adstringência média), ainda mais preferencialmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos utilizando 0.2 X SSC, 0.1% de SDS a 55 °C ) adstringência média-alta), mais preferencialmente lavado três 15 vezes cada um durante 15 minutos utilizando 0.1 X SSC, 0.11 de SDS a 60°C (adstringência alta), em particular lavado três vezes cada um durante 15 minutos utilizando 0.1 X SSC, 0.1% de SDS a 68 °C (adstringência muito alta).

Ainda que não é particularmente preferido, podem ser utilizadas sondas mais curtas, como por exemplo sondas que têm aproximadamente de 15 a 99 nucleótidos de comprimento, assim como de aproximadamente 15 a aproximadamente 70 nucleótidos oe comprimento. Para este tipo de sondas curtas, as condições de adstringência são defenidas como pré-hibridaçâo, hibridação, e lavagem pós-hibridação a 5°C até 10°C abaixo da ΊΑ calculada

utilizando o cálculo de Bolton e McCarthy (1962, Proceedinqs of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em 0.9 M de NaCl, 0.09 M de tris-HCl pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0.5% de NP-40,1X

Solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato de sódio monobásico, 0.1 mM de ATP, e 0.2 mg de ARN de levedura por ml segundo procedimentos standards de Southern P1 o t .

Para sondas curtas que têm aproximadamente de 15 nucleótidos a 99 nucleótidos de comprimento, o material portador é lavado uma vez em 6X SCC mais 0.1% SDS durante 15 minutos e duas vezes durante 15 minutos utilizando 6X SSC 5°C a 10°C abaixo do Tr, calculado.

Extensão N-terminal

Uma extensão N-terminal pode adequadamente compreender 1 a 50 airunoácidos, preferencialmente de 2 a 20 ammoácidos, especialmente de 3 al5 aminoácidos._Numa forma de realização, a extensão do péptido N-terminal não contém Arg (R) ._Noutra forma de realizar a extensão N-terminal compreende um sitio cie clivagem kex2 ou do tipo kex2 como será adicionalmente definido mais abaixo. Numa forma de realização preferida a extensão N-terminal é um péptideo, que compreende pelo menos dois resíduos 16 como uma extensão N-terminal amínoóacídos Glu (E) e/ou Asp (D), que compreende uma das seguintes sequências: EAE, EE, DE, DD.

Sitios Kex2

Os sítios Kex2 (ver, por exemplo, Methods in Enzymoiogy Vol 1S5, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") e os sítios do tipo kex2 são sítios de reconhecimento bi-básícos (isto é, sítios de clivagem) que se encontram entre a região de codificação do pro-péptideo e a região madura de algumas proteínas. A inserção de um sítio kex2 ou um sítio do tipo kex2 têm nalguns casos demonstrado que melhoram o processamento correcto da endopeptídase no sítio de clivagem pro-péptideo resultando nuns níveis de secreção de proteínas aumentadas.

No contexto da invenção, a inserção de um sítio kex2 ou do tipo kex2 resulta na possibilidade de obter a clivagem numa determinada posição na extensão N-terminal obtendo-se um polrpéptideo antímicrobiano que foi estendido em comparação com o polrpéptideo maduro mostrado como os aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2. contes para polipéptideos com activídade antimicrobiana

Um polrpéptideo da presente invenção pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer género. Para os objectívos da presente invenção, a expressão "obtido a partir de" como é utilizada neste caso significará que o polrpéptideo codificado oela sequência de nucleótidos é produzido por uma célula onde a sequência de nucleótidos está naturalmente presente ou na que a sequência de nucleótidos foi introduzida. Numa forma preferida de realizar a invenção, o polrpéptideo é segregado extracelularme nteh 17 ido deo de us, ns, 1 u s US, deo de um um

Um ba ba Ba Ba Ba 11 Ba de Sz: po po polipéptídeo da presente invenção pode ser um polipépt cteriano. Por exemplo, o polipéptídeo pode ser um polipéptx cteríano gram positivo como por exemplo um polipéptídeo cilhas, por exemplo um polipéptídeo de Bacillus alkalophil cillus amyloliquefadens, Bacillus brevis, Bacillus circula cillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacil cheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophil cillus subtílis, ou Bacillus thuringiensis; ou um polipépti Streptomyces, como por exemplo, um polipéptídeo reptomyces lividans ou Streptomyces murinus; ou lipéptrdeo bacteriano gram negativo, como por exemplo, lipéptideo de E. coli ou de Pseudomonas sp.

Um polipéptídeo da presente invenção pode ser um polipéptídeo fúngico, e mais preferencialmente um polipéptídeo de levedura como por exemplo um polipéptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichía, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou mais preferencialmente um polipéptídeo filamentoso fúngico como por exemplo um polipéptídeo de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidlum, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penícillíum, Píromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium ou Tn choderma . um e s i, es

Numa forma de realização interessante, o polipéptídeo é polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyc cerevisiae, Saccharomyces díastatícus, Saccharomyces douglasi Saccharomyces kluyverí, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyc ovxformxs. um i, u s um

Noutra forma de realização interessante, o polipéptídeo é polipéptídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awarnor Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Asperqill nidulans, Aspergillus níger, Aspergillus oryzae, Fusari bactridioides, Fusarium cereaiis, Fusarium crookwellense, 18 gramrnum, oxysporum, sambucinum, Fusarium thecioides, lanugmosa , ra crassa, trichoderma reesei, ou

Fusarium culraorum, Fusarium graminearum, Fusarium Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotríchioides, sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium tricho

Fusarium venenatum, Humícola insolens, Humícola Mu cor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospo Penicíliíum purpurogenum, trichoderma harzianum, koningíí, trichoderma 1ongibrachíatum, trichoderma Trichoderma viride.

Numa forma preferida de realizar a invenção, o polipéptídeo é um polipéptideo de Pseudoplectania nigrella, e mais preferencialmente um polipéptideo de CBS 444.97 de Pseudoplectania nigrella, como por exemplo o polipéptideo compreendido na sequência de aminoácidos 1 a 40 da SFQ ID NO:2.

Deve ser entendido que para as espécies mencionadas, a invenção compreende tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonómicos, por exemplo, anamorfos, apesar do nome da espécie pelo que estes são conhecidos. Os técnicos especializados rapidamente reconhecerão a identidade dos equivalentes apropriados.

As estirpes destas espécies estão rapidamente acessíveis ao público em várias coíecções de cultivos, como por exemplo a American Type Culture Coliection (ATCC), Deutsche Sammlung von bikroorganismein und Zellkulturem GmbH (DSM) , Centraalbureau Voor Schimmeicultures (CBS), e Agrícultural Research Service Patent Culture Coliection, Northern Regional Research Center (NRRTc .

Além de que, estes polípéptideos podem ser identificados e obtidos a partir de outras fontes incluídas os microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc..) utilizando as sondas anteriormente mencionadas. As técnicas para isolar os microrganismos dos seus habítats naturais são bem 19 uma sequêncic a de cl (s) sonda(s) , a 0 3 S técnicas que conhecidas na técnica. A sequência de nucleótidos pode ser seguidamente derivada mediante a selecção de forma similar de um banco genómico ou do banco de ADNc de outro microrganismo. Assam que é detectada uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptideo cc cionada utiliza especializados (ver, por exemplo, Sambrook et ai., 1989, supra]

Os polipéptideos codificados pelas sequências de nucleótidos da presente invenção também incluem polipéptideos fundidos o u polipéptideos de fusão de clivagem em que outro polipéptideo é fundido no N-terminal ou no C-terminal do polipéptideo ou de urn seu fragmento. Um polipéptideo fundido é produzido fundindo uma sequência de nucleótidos (ou uma parte desta) que codifica outro polipéptideo até uma sequência de nucleótidos (ou uma parte oesta) da presente invenção. As técnicas para produzir polipéptideos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligar as sequências de codificação que codificam os polipéptideos de modo a que estes estejam dentro da estrutura e que a expressão do polipéptideo fundido seja controlada pelo(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador.

Sequências de polinucleótídos e de nucleótidos A presente invenção refere-se ainda a polinucleótídos que têm uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptideo da invenção. Em particular, a presente invenção refere-se a polinucleótídos que consistem numa sequência de nucleótidos que codifica um polipéptideo da invenção. Numa forma preferida de realizar a invenção, a sequência de nucleótidos é estabelecida na SEQ ID NO:1. Numa forma de realização mais preferida, a sequência de nucleótidos é a região de codificação do polipéptideo maduro da SEQ ID N0:1. A presente invenção abrange ainda os polinucleótídos que têm, preferencíalmente compostos por sequências de nucleótidos que codificam um polipéptideo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou o 20 polípéptideo maduro da devido à degeneração do mesma, que é diferente código genético. da

SEQ ID NO : 1 A presente invenção refere-se ainda a polinucleó tidos que têm, preferencialmente são compostos por uma subsequência da SEQ ID NO: i que codifica fragmentos da SEQ ID NO: 2 com activídade antimicrobiana. Uma subsequência da SEQ ID NO: 1 é uma sequência de nucleótídos abrangida pela SEQ ID NO: 1 excepto porque um ou mais nucleótídos da extremidade 5' e/ou 3' foram eliminados. A presente; invenção refere-se ainda a polinucleótidos que têm, preferencialmente estão compostos por uma sequência de nucleótídos modificada que compreende pelo menos uma modificação na sequência de codificação do polípéptideo maduro da SEQ ID NO: 1, e onde a sequência de nucleótídos modificada codifica um polípéptideo composto pelos amínoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2.

As técnicas utilizadas para isolar ou clonar uma sequência de nucleótídos que codifica um polipéptido são conhecidas na técnica e incluem o isolamento do ADN genómico, a preparação a partir de ADNc, ou uma combinação destas. A clonação das sequências de nucleótídos da presente invenção a partir deste ADN genómico pode por exemplo ser efectuada, utilizando a técnica bem conhecida de reacção em cadeia da polimerase (POR) ou seleccionando anticorpos dos bancos de expressão para detectar os fragmentos de ADN cionados com características estruturais compartidas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR; A Guíde to Methods and Application, Academic Press, New York. Podem ser utilizados outros procedimentos de amplificação como por exemplo a reacção em cadeia da ligase (LCR), a transcrição actívada ligada (DAT) e a amplificação baseada nas sequências de nucleótídos (NASBA). A sequência de nucleótídos pode ser clonada a partir de uma estirpe de uma sequência de nucleótídos que codifica polipéptideos antimicrobianos presente em Pseudoplectania, ou outro organismo ou um relacionado e assim, por exemplo, pode ser uma variante alélíca ou variante de 21 espécies da região de codificação de polipéptideos da sequência de nucleótidos. A sequência de nucleótidos pode ser obtida por procedimentos de cionação standards utilizados em engenharia genética para recolocar a sequência de nucleótidos desde o seu sitio natural a um sitio diferente onde será reproduzida. Os procedimentos de cionação podem compreender a excisão e isolamento de um fragmento desejado que compreenda a sequência de nucleótidos que codifica o polipéptideo, a inserção do fragmento numa molécula do vector, e a incorporação do vector recombinante numa célula hospedeira onde as cópias múltiplas ou ciones da sequência de nucleótidos serão replicados. A sequência de nucleótidos pode ser de origem genómica, ADNc, ARN, semi-síntético, sintético, ou qualquer combinação destas. A presente invenção refere-se ainda a um polinucleótido que tem, preferencialmente que consiste numa sequência de nucleótidos com pelo menos 65% de identidade com os nucleótidos 166 a 235 da SEQ ID NO:1. Preferencialmente, a sequência de nucleótidos tem pelo menos 70% de identidade, por exemplo pelo menos 80% de identidade, assim como pelo menos 90% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade, assim como pelo menos 96% de identidade, por exemplo pelo menos 97% de identidade, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade, assim como pelo menos 99% com os nucleótidos 166 a 285 da SEQ ID NO:1. Preferencialmente, a sequência de nucleótidos codifica um polipéptideo com actrvidade antimicrobiana. O grau de identidade entre duas sequências de nucleótidos é determinado de acordo com o anteriormente descrito ve r a St ecç ão intitulada "Definições ") . Preferencialme nte, a • eq uência de nucleótidos compreende os nucleótidos 166 a 285 cia a:q ID NO : 1 . Numa forma de realização ainda mais preferida, Cl equência de nucleótidos consiste nos nucleótidos 16 6 a 0 Q m z_ i.' -V da EQ ID NO: 1 . 22 A modificação de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptideo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de um polipéptideo, que compreende uma sequência de amínoácidos que tem pelo menos uma substituição, eliminação e/ou introdução quando comparados com os amínoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO: 2. Estas variantes artificiais podem de algum modo ter uma engenharia genética diferente do polipéptideo isolado da sua fonte nativa, por exemplo as variantes que são diferences enquanto à actividade específica, termoestabílidade, pH óptimo, ou similar.

Será evidente que para os técnicos especializados que estas modificações podem ser realizadas fora das regiões críticas para a função da molécula e resultam ainda num polipéptideo activo. Os resíduos dos amínoácidos essenciais para a actividade do polipéptideo codificada pela sequência de nucleótidos da invenção, e consequentemente preferencialmente não submetida a uma modificação, assim como a uma substituição, podem ser identificados segundo os procedimentos conhecidos na técnica, como por exemplo mutagénese dirigida ou o mutagénese de varrimento de alanina (ver, por exemplo Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . Nesta técnica, as mutações são introduzidas em cada resíduo carregado positivamente na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas pela sua actividade antimicrobiana para identificar os resíduos amínoácidos que são fundamentais para a actividade da molécula. Os sítios da ínteracção enzima-substrato podem também ser determinados pela análise da estrutura tridimensional como está determinado pelas técnicas como por exemplo a análise da ressonância magnética nuclear, a cristalografia ou marcação por fotoafinidade (Ver, por exemplo Vos et ai., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Bíology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64). 23

Além de que, uma sequência de nucleótídos que codifica um polipéptideo da presente invenção pode ser modificada por introdução de substituições de nucleótídos sem causar outra sequência de aminoácidos do polipéptideo codificado pela sequência de nucleótídos, mas que corresponde à utilização do codâo do organismo hospedeiro destinado à produção da enzima. mutilação por outro utilizando na sequênc nucleótido quaisquer ia de nucle pode ser re dos ir létodos ótídos para alizado por conhecidos A introdução de uma mudar um nucleótido mutagénese dirigida na técnica. E particularmente útil o procedimento, que utiliza um vector de ADN de duas cadeias enroladas com uma inserção de interesse e dois iniciadores sintéticos que contêm a mutilação desejada. Os iniciadores oliqonucleótidos, cada um complementar às cadeias opostas do vector, se estendem durante a variação cíclica da temperatura mediante ADN polimerase Pfu. Com a incorporação dos iniciadores, um piasmídeo mutado é gerado que contém cortes oblíquos. Após a variação cíclica da temperatura, o produto é tratado com Dpnl que é específico para ADN metilado e hemimetílado para digerir o molde de ADN parental e para seleccíonar o ADN sintetizado contendo a mutilação. Outros procedimentos conhecidos podem também ser utilizados na técnica. Para uma descrição geral sobre a substituição de nucleótídos, ver, por exemplo, Ford et al.r 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. A presente invenção refere-se ainda a um polinucleótido que tem, preferencíalmente que consiste numa sequência de nucleótídos que codifica um polipéptideo com actividade antímicrobiana, e que é niPrrdizado em condições de adstringência muito baixa, p re ferencialmente em condições de adstringência baixa, preferencialmente em condições de adstringência média, preferencialmente em condições de adstringência média ainda mais preferencialmente em condições de adstringência alta, 24 e mais preferencialmente em condições de adstringência muito alta com uma sonda de polinucleótídos seleccionada do grupo composto por: (i) a cadeia complementar dos nucleótidos 166 a 285 da SEQ ID NO: 1, dij a cadeia complementar da sequência de ADNc contida nos nucleótidos 70 a ‘285 da SEQ ID NO: 1, e iiii) a cadeia complementar dos nucleótidos 1 a 285 da SEQ TE NO: 1 .

Como entender-se-á, os pormenores e particularidades enquanto à hibridação das sequências de nucleótidos serão iguais ou idênticos aos aspectos da hibridação discutidos na secção acima intitulada "Polipéptideos com actividade antimicrobiana".

Construção dos ácidos nucieicos .A presente invenção refere-se ainda à construção dos ác: nucieicos que compreendem uma sequência de nucleótidos presente invenção ligada funcionalmente a uma ou mais sequênc' de controlo que dirige(m) a expressão da sequência codificação numa célula hospedeira adequada em condições compatíveis com as das sequências de controlo.

Uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptideo da presente invenção pode ser de várias maneiras manipulada para prover a expressão do polipéptideo. A manipulação da sequência de nucleótidos antes que ela seja introduzida num vector pode ser desejável ou necessária dependendo do vector de expressão. As técnicas para modificar sequências de nucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante são bem conhecidas na especialidade. A sequência de controlo pode ser uma sequência promotora apropriada, uma sequência de nucleótidos que é reconhecida peia 25 célula hospedeira para a expressão da sequência de nucleótidos. A sequência promotora contém sequências de controlo transcripcionais, que mediam a expressão do polipéptideo. O promotor pode ser qualquer sequência de nucleótidos que mostre actividade transcripcional na célula hospedeira escolhida incluídos promotores, mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir dos genes que codificam polipéptideos extra-celulares ou intracelulares tanto homólogos como heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos construtos dos ácidos nucleicos da presente invenção, especialmente numa célula hospedeira bacteríana, são os promotores obtidas a partir do operão lac de E. colí, do gene da agarase (dagA) de Streptomyces alicolor, do gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, do gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, do gene da amilase maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amylolíquefacíens, do gene da lactamase (penP) de Bacillus licheniformis, dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e do gene da beta-lactamase procariótica (Vila-Kamaroff et ai1978, Proceedíngs of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), assim como o promotor tac (DeBoer et al. , 1983, Proceedíngs of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Outros promotores estão descritos em "Usefui proteíns from recombínant bactéria" ín Scíent ífíc American, 1980,242: 74-94; e in Sambrook et ai., 1989, supra.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da construção dos ácidos nucleicos da presente invenção numa célula hospedeira filamentosa fúngica são os promotores obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergíllus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergíllus Níger, alfa-amilase estável ácida de Aspergíllus Níger, glucoamilase (glaA) de Aspergíllus Níger ou de Aspergíllus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, protease 26 alcalina de Aspergillus oryzae, tríose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamídase de Aspergillus nídulans, e protease de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787 , , assim como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus Níger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae), e, os seus promotores rnutantes, truncados e híbridos.

Num hospedeiro de levedura, os promotores úteis são obtidos a partir dos genes para enolase de Saccharomyces cerevlsiae íENO- 1), galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase de Saccharomyces glíceraldeído-3-fosfato ciesidrogenasa (GAP) , e 3-fosfoglicerato quínase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para as células hospedeiras delevedura são descritos por Romanos et ai., 1992, Yeast 8: 423- 4 88 . A sequência de controlo pode ainda ser uma sequência de terminação da transcrição adequada, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência de terminação está ligada funcionalmente à extremidade 3' da sequência de nucleótídos que codifica o polipéptideo. Qualquer termínador que é funcional na célula hospedeira escolhida pode ser utilizada na presente invenção.

Os termínadores preferidos para as células hospedeiras filamentosas fúngicas são obtidas a partir dos genes para TARA arrulase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus mger, antranilato smtase de Aspergillus nidulans, alf a-glucosidase de Aspergillus níger, e protease de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. células hospedeiras da genes para enolase de (CYC1) de Saccharomyces to desidrogenase de

Os termínadores preferidos para as levedura são obtidos a partir dos Saccharomyces cerevisiae, cítocromo C cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfa 27

Saccharomyces cerevísíae. Outros terminadores úteis para as células hospedeiras da levedura são descritas por Romanos et al., 1992, supra. A sequência de controlo pode também ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um ARNm que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está ligada funcionalmente à extremidade 5' da sequência de nucleótídos que codifica o polípéptídeo. Qualquer sequência líder que seja funcional na célula hospedeira escolhida pode ser utilizada na pres.ente invenção. para as células hospedei a partir dos genes para triose fosfato isomerase ra s filamentosas TAKA amilase de de Aspergíllus

Os líderes preferidos fúngicas são obtidas Aspergillus oryzae e nidulans . da levedura são de Saccharomyces de Saccharomyces cerevísíae, e de gliceraldeído-

Os lideres adequados para células hospedeiras obtidos a partir dos genes para enolase cerevísíae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase carevisiae, alfa-factor de Saccharomyces

Saccharomyces cerevísíae álcool desidrogenase 3-fosfato desidrogenase (GAP). A sequência de controlo pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência ligada funcionalmente à extremidade 3' da sequência de nucleótídos e que, quando e transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar os resíduos de poliadenosíne ao ARNm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira escolhida pode ser utilizada na presente invenção.

As sequências da poliadenilação preferidas para as células hospedeiras filamentosas fúngicas são obtidas a partir dos genes cara TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato síntase de Aspergillus nidulans, 28 protease de tipo tripsína de Fusaríum oxysporum, e alfa-glucosidase de Aspergillus Niger. para a s célula Guo and Sherman

As sequências hospedeiras da 1995, Molecular da poliadenilação úteis levedura estão descritas por Cellular Bíology 15: 5983-5990 A sequência de controlo pode também ser uma zona de codificação do péptideo sinal que codifica uma sequência de aminoácidos liqada ao amino terminal de um polipéptideo e dirige o polipéptideo codificado na via secretória da célula . A expremidade 5' da sequência de codificação da sequência de nucleótídos pode intrinsecamente conter uma zona de codificação do péptideo sinal ligado de forma natural na estrutura da leitura da tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipéptideo segregado. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter urna região de codificação do péptideo sinal que é externa à sequência de codificação. A região de codificação do péptideo sinal externa pode ser requerida quando a sequência de codificação não contém de forma natural uma região de codificação do péptideo sinal. De forma alternativa, a região de codificação do péptideo sinal externa pode simplesmente substituir a região de codificação do péptideo sinal natural para aumentar a secreção do polipéptideo. No entanto, qualquer região de codificação do péptideo sinal que dirige o polipéptideo expresso na via secretória de uma célula hospedeira escolhida pode ser utilizada na presente invenção. A região de codificação do péptideo sinal são os nucleótídos 1 a 69 da SEQ ID NO:l que codificam os aminoácidos -55 a -33 da SEQ ID NO:2 (ou os aminoácidos 1 a 23 da SEQ ID NO:3) .

As regiões de codificação do células hospedeiras bacteriana péptideo sinal obtidas a péptideo sinal s sao as partir 29 regiões dos eficazes para as de codificacão do genes para amilase maltogénica de NCIB 11837 de Bacíllus, alfa-amilase de Bacíllus stearothermophilus, subtilisina de Bacíllus licheniformis, beta-lactamasa de Bacíllus licheniformis, proteases neutras ípip r nprS, nprM) de Bacíllus stearothermophilus, e prsA cie Baci......a subtilís. Adicionaimente os péptideos sinal são descritos pot Simonem and Paiva, 1993, Mícrohíologícal Reviews 57: 109-137.

As regiões de codificação do péptideo sinal efrcazes para células hospedeiras filamentosas fúngicas são as regiões de codificação do péptideo sinal obtidas a partir dos genes para TA KA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, protemase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola ínsolens, e iipase de Humicola lanugínosa.

Os péptideos sinal úteis para as células hospedeiras da levedura são obtidos a partir dos genes para o alfa-factor de ,5 acckaromyces cerevis iae e a invertase de Saccharoinyces cerevísuae. Outras regiões de codificação do péptideo sinal utilizadas são descritas por Romanos et al. r 1992, supra. A sequência de controlo pode também ser uma região d° codificação do propéptideo que codifica uma sequência ammoácidos colocada na expressão amino de um polipéptideo. O poiipéptideo resultante é conhecido como uma proenzima ou propoiipéptideo (ou nalguns casos um zimogénio). Habitual: , um propoiipéptideo é geralmente inactivo e pode ser conv num polipéptideo maduro activo por clivagem catalítica ou catalítica do propéptideo do propolipéptideo. A regi codificação do propéptideo pode ser obtida a partir dos .< ..· para protease alcalina (aprE) de Bacíllus subtilís, seromonolisíne InprT) de Bacíllus subtilís, alfa-factor de Saccharoinyces cerevís iae, proteínase aspártica de .· u ; r mieheif e lacase de Mycel iophthora thermophíla (WQ 95/3joi.uj . 30 A região de codificação do propéptideo são os nucleótidos 70 a 165 da SEQ ID NO:1 que codificam os amínoácidos -32 a -1 da SEQ IDNO:2 (ou os aminoácidos 24 a 55 da SEQ ID NO:3).

Quando o péptideo sinal e as regiões do propéptideo estão presentes na expressão amino de um polípéptideo, a região do propéptideo é colocada junto à expressão amino de um polípéptideo e a região do péptideo sinal é colocada junto à expressão amino da região do propéptideo.

Pode também ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitam regular a expressão do polípéptideo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são ps que fazem com que a expressão do gene seja activada ou desativada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluído a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas dos operadores lac, tac, e trp. Na levedura, pode s utilizado o s i s t ema ADH2 ou sistema GAL1 . Nos fung filamentosos, podem ser utilizadas como sequências reguladoras promotor TAKA alfa-amílase, o promotor da glucoamílase de Aspergillus riiger, e o promotor da glucoamílase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação do gene. Nos sistemas eucarióticos, estas incluem o gene da di-hidrofolato-reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes da metalotíoneina que são amplificados com metais pesados. Nesres casos, a sequência de nucleótidos que codifica o polípéptideo seria ligado funcionalmente com a sequência reguladora.

Vectores de expressão A presente invenção refere-se ainda a vectores de expressão recombinantes que compreendem a elaboração de ácidos nucleicos da invenção. As várias sequências de nucleótidos e de controlo anteriormente descritas podem ser unidas entre si para produzir um vector de expressão recombinante que pode incluir um ou ma is sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição da sequência de nucleótídos que codifica o ooiípéptideo nesses sítios. De forma alternativa, a sequência de nucleótídos da presente invenção pode ser expressa inserindo a sequência de nucleótídos ou a construção de ácidos nucleicos que compreenda a sequência num vector apropriado para a expressão. Ao criar o vector de expressão, a sequência de codificação esta localizada no vector de modo a que a sequência de codificação está ligada funcionalmente com as sequências de controlo apropriadas para a expressão. 0 vector de expressão recombinante pode ser qualquer vector (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser conveníentemente submetido a procedimentos de ADN recombinante e pode provocar a expressão da sequência de nucleótídos. Habitualmente, a escolha do vector dependerá da compatibilidade do vector com a célula hospedeira em que o vector é introduzido. Os vectores podem ser piasmídicos lineares ou fechados circulares. O vector pode ser um vector de replicação autónoma, isto é, um vector que existe como uma entidade extracromossómica, cuj a replicação é independente da replicação cromossómica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossómico, um minicromossoma, ou um cromosoma artificial. O vector autorrepli quando xn qenoma e integrado. plasmídeo contenham hospedeira pode conter qualquer meio para assegurar a cação. De forma alternativa, o vector pode ser um que, troduzído na célula hospedeira, seja integrado no replique juntamente com o(s) cromossoma(s) onde foi Além de que, pode ser utilizado um único vector ou ou dois ou ma is vectores ou plasmídeos que juntos o ADN ' total a ser introduzido no genoma da célula , ou um transposão. 32

Os vectores da presente invenção contêm preferencíalmente um ou mais marcadores genéticos que permitem seleccionar facilmenre as células transformadas. Um marcador genético é um gene cujo produto provê resistência biocida ou virica, resistência a metais pesados; prototrofía a auxótrofos, e outros.

Exemplos de marcadores bacterianos que podem ser seleccí onacios são os genes dal de Bacíllus subtil is ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência antibiótica como resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciciina. Mapcadores adequados para as células hospedeiras da levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores genéticos para serem utilizados numa célula hospedeira filamentosa fúngica incluem, mas não se limitam a, amdS (acetamidase), argB (ornitine-carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hygB (higromicina fosfotransferase) , niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidine-5'-fosfato-descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), trpC íantranílato sintase), assim como os seus equivalentes.

Para ser utilizada numa célula de Aspergillus são preferidos os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou de Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vectores da presente invenção preferencialmente contém um elemento(s) que permite(m) a integração estável do vector no genoma da célula hospedeira ou a replicaçâo autónoma do vector na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vector pode depender da sequência de nucleótidos que codifica o polipéptideo ou qualquer outro elemento do vector para a integração estável do vector no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. De forma alternativa, o vector pode conter sequências cie nucleótidos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira. As sequências ce nucleótídos adicionais permitem que o vector seja integrado no genoma da célula hospedeira numa(s) posição{ões) precisa (s) no (s) .cromossoma(s) . Para aumentar a probabilidade de integração numa posição precisa, os elementos a integrar deverão preferencialmente conter um número suficiente de nucleóticos, como por exemplo de 100 a 1,500 pares de bases, preferencialmente de 400 a 1,500 pares de bases, e maus preferencialmente de 800 a 1,500 pares de bases, que sejam muito homólogas à sequência alvo correspondente para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos a intecrar podem ser qualquer sequência que seja homóloga à sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além de que, os elementos a integrar podem ser sequências de nuecieótidos codificantes ou não codificantes. Por outro lado, o vector pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para a replicação autónoma, o vector pode ainda compreender uma origem de replicação que permita que o vector replique autonomamente na célula hospedeira em questão. Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmideos pBR322; pUC19; pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUBUQ; pEl 94; pTA1060, e ρΑΜβ 1 que permitem a replicação em Bacillus. Exemplos de origens de replicação para serem utilizadas numa célula hospedeira da levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6. A origem de replicação pode ser uma com uma mutilação que faça que o seu funcionamento seja sensível à temperatura na célula hospedeira (ver, por exemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of lhe National Academy ‘of Sciences USA 75: 1433) , ser obtida

Mars de uma cópia de uma sequência de nucleótídos da presente invenção podem ser inseridas na célula hospedeira para aumentar a produção do produto genético. Um aumento no número de cópias da sequência de nucleótídos pode ser obtida integrando pelo 34 menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou mediante a inclusão de um gene marcador genético e amplificado com a sequência de nucleótidos em que as células que contêm cópias amplificadas do gene do marcador genético, e oorcanto as cópias adicionais da sequência de nucleótidos, podem ser seleccionadas para cultivar as células na presença do agente genético apropriado.

Cs procedimentos utilizados para ligar os elenensos anteriormente descritos à construção dos vectores de expressão recombinantes da presente invenção são conhecidos pelos técnicos especializados (ver, por exemplo, Sambrook et al. , 1989, supra) . Células hospedeiras A presente invenção refere-se ainda a uma célula hospedeira recombinante que compreende a elaboração de ácidos nucleicos da invenção, que são vantajosamente utilizados na produção recombinante dos polipéptídeos. Um vector que compreende uma sequência de nucleótidos da presente invenção é introduzido numa célula hospedeira por forma a que o vector seja mantido como um integrante cromo,ssómico ou como um vector extracromossómico auto-replícante como o anteriormente descrito. A célula hospedeira pode ser um microrganismo unicelular, por exemplo, uma célula procariota, ou um microrganismo não unicelular, por exemplo, uma célula eucariota.

As células unicelulares utilizadas são as células bacterianas como por exemplo as bactérias gram positivas que incluem, mas não se limitam a, uma célula de Bacíllus, por exemplo, Bacilius a Ikalophílus, Bacíllus amvlol Iquefadens, Bacíllus brevis, Bacíllus circulans, Bacíllus clausii, Bacíllus coaqulans, Bacíllus lautus, Bacíllus lentus, Bacíllus lichemformis, Bacíllus megaterium, Bacíllus stearothermophilus, Bacíllus , e Bacíllus subtil is thuríngiensis; 35 ou uma célula de

Streptomyces, por exemplo Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram negativas como por exemplo E. coli e Pseudomonas sp. Numa forma preferida de realizar a invenção, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus 1icheniformis, Bacillus stearothermophílus, ou Bacillus subtilís. Noutra forma preferida de realizar a invenção, a célula de Bacillus é um Bacillus alcalofilico. A introdução de um vector numa célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efectuada por transformação do protopiasto (ver, por exemplo, Chang and Cohem, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), utilizando células competentes (ver, por exemplo, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: '823-829, ou Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporação (ver, por exemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278). A célula hospedeira pode ser uma célula eucariota, como uma célula de um mamífero, de um insecto, de uma planta, ou urna célula fúngica.

Numa forma preferida de realizar a invenção, a célula hospedeira é uma célula fúngica. "Fungi" como é utilizada neste caso inclui o phyla Ascomycota, Basidíomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como defenida por Hawksworth et al. , in, Ainsworth and Bísby' s Dictlonary of The Fungi, 8 th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assim como o Oomycota (como citado em Hawksworth et ai., 1995, supra, page 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et ai., 1995, supra).

Numa forma mais preferida de realizar a invenção, a célula hospedeira fúngica é uma célula de levedura. "Levedura" como é utilizada neste caso inclui levedura ascosporogenous íEndomycetales) , levedura basidiosporogenouis, e levedura 36 pertencente aos Fungx Imperfecti (Blastomycetes) . Dado que a classificação da levedura pode no futuro ser modificada, para os objectivos desta invenção, a levedura será definida como a descrita em Biology and Actívities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bactenol . Symposíum Series 'No. 9, 1980) .

Numa forma ainda mais preferida de realizar a invenção, a célula hospedeira da levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pi chia, Saccharomyces, Schízosaccharomyces, ou Yarrowia.

Na forma mais preferida de realizar a invenção, a célula hospedeira da levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastatícus, Saccharomyces douglasíi, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norhensis ou Saccharomyces oviformís. Ainda noutra forma mais preferida de realizar a invenção, a célula hospederra da levedura é urna célula de Kluyveromyces lactis. Noutra forma de realização mais preferida, a célula hospedeira da levedura é uma célula de Yarrowia lipoiytíca.

Noutra forma mais preferida de realizar a invenção, a célula hospedeira fúngica é uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (tcomo o defenido por Hawksworth et ai,, .1 995, supra) . Os fungos filamentosos são caracterizados porque uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucano, quitosano, manano, e outros polissacáridos complexos. O crescimento vegetativo dá-se pelo alongamento de bifa e o catabolismo do carbono é estrítamente aeróbico. Pelo contrário, o crescimento vegetativo por leveduras como por exemplo Saccharomyces cerevis iae dá-se por enxerto de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo 37

Numa forma ainda maís preferida de realizar a invenção, a célula hospedeira filamentosa fúngica é uma célula de umas espécies de, mas não limitada a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Toiypocladíum, ou Trichoderma.

Numa forma de realização raais preferida, a célula hospedeira filamentosa fúngica é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetídus, Aspergillus j aponicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Noutra forma de realização mais preferida, a célula hospedeira filamentosa fúngica é uma célula de Fusarium bactrídioides, Fusarium cerealís, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium q raminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium rcseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioid.es, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecíoídes, ou Fusarium venenatum. Numa forma de realização ainda mais preferida, a célula mãe filamentosa fúngica é uma célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. novç . Noutra forma de realização mais preferida, a célula hospedeira filamentosa fúngica é uma célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor mieheí, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestres, Trichoderma harzianum, Trichoderma koníngii, Trichoderma ionqíbrachíatum, Trichoderma reeseí, ou Trichoderma vir ide.

As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que transformação dos implica a formação do protoplasto, protoplastos, e a regeneração da parede celular de certo modo conhecido per se. Os procedimentos adequados para a transformação das células hospedeiras do Aspergillus estão descritos no Pedido de Patente EP 238 023 e em Yelton et ai . , 1 984 , Proceedíngs of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474, Os métodos adequados para transformar espécxes de Fusarium foram descritos por Malardíer et ai., 1989, Gene 78: 38 147- 156 e no Pedido de Patente WO 96/00787. A levedura pode ser transformada utilizando os procedimentos descritos por Becker and Guarente, ín Abelson, J.N. and Simon, Μ.I., editors, Guíde to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods ín Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito ec a 1. / 1983, Journal of Bacteriology 153:163; e Hinnem et ai., 1978, Proceedíngs of the National Academy of Sciences USA 75:1920. Métodos de produção A presente invenção refere-se ainda a métodos para produzir um polipéptideo da presente invenção que compreende: (a) o cultivo de uma estirpe, que na sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipéptideo; e (b) a recuperação do polipéptideo.

Preferencialmente, a estirpe é do género Pseudoplectania, e mais preferencialmente Pseudoplectania nigrella. A presente invenção refere-se ainda a métodos para produzir um polipéptideo da presente invenção que compreende: ía) o cultivo de uma célula hospedeira em condições propicias para a produção do polipéptideo; e (b) a recuperação do polipéptideo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células m cultivadas num meio nutritivo adequado para a produção do polipéptideo utilizando os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco por agitação, fermentação em pequena ou em grande escala (incluindo fermentações continuas, descontinuas, em fluxo descontinuo, ou 39 no estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizadas num meio adequado e em condições que permitem que o polipéprideo seja expresso e/ou isolado. 0 cultivo dá-se num meio nutritivo adequado compreendendo fontes de nitrogénio e carbono e sais inorgânicos, com a utilização de procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados são dísponibi1izados por fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos Pa American Type Culture Collection). Se o polipéptideo é segregado no meio nutritivo, o polipéptideo pode ser dírectamente recuperado do meio. Se o polipéptideo não é segregado, este pode ser recuperado da célula de lísatos.

Os polipéptideos podem ser detectados utilizando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os poiípéptideos. Estes métodos de detecção podem incluir a utilização de anticorpos específicos, a formação de um produto enzímático, ou a desaparição de um substrato enzímático. Por exemplo, um ensaio enzímático pode ser utilizado para determinar a actividade do polipéptideo como o aqui descrito. 0 polipéptideo resultante conhecidos na técnica. Por recuperado do meio nutríti incluído, mas sem limita extracção, secagem por precipitação. pode ser recuperado por métodos exemplo, o polipéptideo pode ser vo por procedimentos convencionais r-se à centrifugação, filtração, pulverização, evaporação, ou

Os poiípéptideos da presente invenção podem ser purificados por uma série de procedimentos conhecidos na especialidade incluídos, mas não limitados à cromatograf ia (por exemplo, cie troca iónica, de afinidade, de exclusão hídrofóbica, de focagem isoeléctrica, e de exclusão celular), procedimentos electroforéticos (por exemplo, focagem isoelécsrica preparatório), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação do sulfato amónio), SDS-page, ou extracção (ver, 40 por exemplo, Proteín Purífication, J.C. Janson and Lars Rydem, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas A presente invenção refere-se ainda a uma planta transgénica, carte da planta, ou célula da planta que foi tra nsformada com uma sequência de nuc leótidos que codifica um pol ípéptídeo com actividade antimicrobiana de acordo com a presente invenção para expressar e produzir o polipéptideo em quantidades recuperáveis. O polipéprideo pode ser recuperado da planta ou de parte da planta. De forma alternativa, a planta ou a parte da planta que contém o polipéptideo recombinante pode ser utilizada como tal para aumentar a qualidade de um alimento ou alimentos para animais, aumentando por exemplo o seu valor nutritivo, apetência, e propriedades reológicas, ou para destruir um factor antinutritivo. 0 polipéptideo recuperado, planta ou parte da planta pode também ser utilizada para aumentar ou alterar a flora digestiva dos animais e gado. (uma dícot) ou de plantas ervas do campo e x emplo Festuca, stis, e cereais, arroz, sorgo, e A planta transgénica pode ser dicotiledónea monocotiledónea (uma monocot). Exemplos monocotiledóneas são ervas, como por exemplo ierva-de-febra, Poa), erva de forragem como por Lolium, pasto temperado, como por exemplo Agro por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, milho.

Exemplos de plantas dicotiledóneas são tabaco, batata, beterraba sacarina, leguminosas, como por exemplo tremoços, ervilhas, feijões e sementes de soja, e plantas crucíferas (da família Erassicaceae), como por exemplo a couve-flor, semente de colza, e o organismo modelo mais próximo Arabídopsis thaliana.

Exemplos de partes da planta são o talo, caule, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos. Os tecidos da planta também 41 específicos, como por exemplo cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas, e citoplasma são considerados como uma parte da planta. Além de que, qualquer célula vegetal, qualquer que seja a origem do tecido, está considerado como uma parte da planta.

Também se inclui dentro do âmbito da presente invenção a progénie destas plantas, partes da planta e células da planta. A planta transgénica ou a célula vegetal que expressa um polipéptideo da presente invenção pode ser construída de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Resumindo, a planta ou célula vegetal está construída incorporando uma ou mais construções que codifica(m) a expressão de um polipéptideo da presente invenção no genoraa hospedeiro da planta e propagando a planta modificada ou célula vegetal resultante numa planta transgénica ou célula vegetal.

Convenientemente, a construção da expressão é uma construção dos ácidos nucleícos ‘que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptideo da presente invenção ligada funcíonalmente com as sequências apropriadas reguladoras requeridas para a expressão da sequência dos nucleótidos na planta ou parte da planta escolhida. Além de que a construção da expressão pode compreender um marcador genético utilizado para identificar células hospedeiras nas que a construção da expressão tenha sido integrado e as sequências de ADN necessárias para introduzir a construção na planta em questão Asto depende do método utilizado para a introdução do ADN). A escolha das sequênc ias reguladoras, como por exemplo sequências do promotor e do termínador e opcionalmente as sequências sinal ou de trâ nsito é por exemplo , determinado, na base de qu ando, onde, e como é desejado que o polipéptideo seja expresso. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipéptideo da presente invenção pode ser constitutiva ou 42 índutível, ou pode ser de desenvolvimento, específica do estado ou tecido, e o produto genético pode ser dirigido a um tecido específico ou parte da planta como por exemplo as sementes ou as folhas. As sequências reguladoras foram, por exemplo, descritas por Tague et al. , 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, pode ser utilizado o promotor 35S-CaMV {Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294). Os promotores orgão-específícos podem por exemplo, ser um promotor dos tecidos vegetatívos de armanezamento como por exemplo sementes, tubérculos de batata, e frutos (Edwards & Coruzzí, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos vegetatívos metabólicos como por exemplo meristemas (Ito et al., 1994 , Plant Mol . Biol. 24: 863-878), um promotor específico das sementes como por exemplo o promotor da glutelina, prolamina, giobulina, ou da albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor da Vicia faba da legumína B4 e o gene da proteína da semente desconhecida da Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo do óleo de sementes (Chem et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor napA da proteína de armanezamento de Brassíca napus, ou qualquer outro promotor específico de sementes conhecido na técnica, por exemplo, como o descrito no Pedido de Patente WO 91/14772. Além de que, o promotor pode ser um promotor específico das folhas como por exemplo o promotor rbcs do arroz ou do tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), o promotor do gene da adenína metiltransferase da chlorella vírus (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor aldP do gene do arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and geral Genetics 248: 668-674), ou um promotor danificado indutível corno oor exemplo o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588) .

Um elemento intensifícador do promotor pode ser também utilizado para obter uma maior expressão da enzima na planta. Por exemplo, 43 o elemento intensificador do promotor pode ser um intrão que esteia colocado entre o promotor e a sequência de nucleótídos que codifica o polipéptideo da presente invenção. Por exemplo, Xu et ai., 1993, supra, descreveram a utilização do primeiro intrão do gene da actina 1 do arroz para aumentar a expressão. O gene do marcador genético e qualquer outra parte da construção da expressão pode ser escolhida entre aqueles que estão disponíveis na técnica. no genoma conhecidas mediada p r vírus, transformaç 1990, Scien ; Shimamoto da na or a ão ce e t A construção dos ácidos nucleicos é incorporada planta de acordo com as técnicas convencionais especialidade, incluída a transformação Agrobacterium, a transformação mediada po microinjecção, o bombardeio de partículas, a biolístíca, e a electroporação (Gasser et ai., 244: 1293; Potrykus, 1930, Biol Technology 8: 535 al., 1989, Nature 338: 274) .

Actualmente, a transferência do gene mediado por Agrobacteríum tumef adens é o método escolhido para gerar dicotiledóneas transgénicas (para revisão, ver Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Bíology 19: 15 — 38) . No entanto este pode também ser utilizado para transformar monocotíiedóneas, ainda que qeralmente para estas plantas são preferidos oucros métodos de transformação. Actualmente, o método escolhido para gerar monocotíIedóneas transgénicas é o bombardeio de partículas (ouro microscópico ou partículas do tungsteno revestidas com ADN de transformação) de caules embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opíníon Biotechnology 5: 158-162; Vasíi et al., 1992, Biol Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação das monocotíiedóneas está baseado na transformação do protoplasto como o descrito por Omiruileh et al., 1993, Plant Molecular Bíology 21: 415-428. 44

Depois da transformação, os transformados que têm no seu interior incorporado a construção da expressão são seleccíonados e regenerados na totalidade das plantas de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. A presente invenção refere-se ainda a métodos para produzir um polipéptideo da presente invenção que compreende: (a) o cultivo de uma planta transgénica ou de uma célula vegetal que compreenda uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptideo com actividade antímicrobiana de acordo com a presente invenção sob condições propícias para a produção do polipéptideo; e (b) a recuperação do polipéptideo. C omposíções

Ainda noutro aspecto adicionai, a presente invenção refere-se a composições, como as composições farmacêuticas, que compreendem um polipéptideo antimicrobiano da invenção. A composição pode compreender um polipéptideo da invenção como o componente polipeptídíco mais importante, por exemplo, uma composição monocomponente. De forma alternativa, a composicâo pode compreender actividades enzimáticas múltiplas, como aminopeptidase, amílase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutínase, ciclodextrina glrcosí Itransí erase, desoxirribonuclease, estera.se, alfa-qalactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa- glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinoiítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxxdase, enzima oroteolitroa, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase . 45

As composições podem adicionalmente compreender outro agente farmaceuticamente activo, como por exemplo um agente biocida adicional, como outro poiipéptideo antimicrobiano que exiba uma actividade antimicrobiana como a que foi anteriormente definida, 0 agente biocída pode ser um antibiótico, como os conhecidos na técnica. Algumas classes de antibióticos incluem as penicilinas, por esxemplo penicilina G, penicilina V, meticilina, oxaciiina, carbenicilma, nafcilina, ampicilma, etc..; penicilinas em combinação com inibidores da beta-lactamase, cefalosporinas, por exemplo cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc. . ; carbapenemos; monobactamos; aminoglicósidos; tetracicline; macrólídos; iincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloramfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicína; etc,., o agente biocida pode também ser um agente untímicótico, incluido polienos, por exemplo anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; e azóis, por exemplo miconazol, ketoconazol, itraconazol e fluconazol.

Numa forma de realização o agente biocida é um agente químico não enzimático. Noutra forma de realização o agente biocida é um agente químico não poiipéptideo. O agente biocida pode ser capaz de reduzir vivas de Escherichia colí (DSM 1576) a minutos de incubação a 20°C numa solução preferencialmente numa solução aquosa preferencialmente numa solução aquosa de preferencialmente numa solução aquosa preferencialmente numa solução aquosa particular numa solução aquosa de 0.1%(p/pí o número das célul 1/100 depois de aquosa de 25%(p/p de 10%(p/p) ; ma 5%(p/p); ainda ma de 1%(p/p); ma de 0.5%(p/p); e do agente biocida.

cl S 30 r s 1 s 1 s em 0 agente biocida de Escherichia substrato de concentração de concentração de pode também ser capaz de inibir a excrescência coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25°C num crescimento microbiano, adicionado numa 1000 ppm; preferencialmente adicionado numa 500 ppm; mais preferencialmente adicionado numa 46 concentração de 2 50 ppm; ainda /idrcionado numa concentração de adicionado numa concentração de adicionado numa concentração de mais preferencialmente quando é 100 ppm; mais prefer 50 ppm; e em particul 2 5 ppm. O agente brocxda. pode também ser capaz de reduzir o número de células vivas de Bacíllus subtil is (ATCC 6633) a 1/100 depois de 30 minutos de incubação a 20°C numa solução aquosa de 2S? (p/'p) ; preferencialmente numa solução aquosa de 10% (p/p) ; rnars preferencialmente numa solução aquosa de 5 %(p/p); ainda mais preferencialmente numa solução aquosa de 1 %(p/p); mais preferencíalmente numa solução aquosa de 0.5%(p/p); e em particular numa solução aquosa de 0.1%(p/p) do agente biocida. O agente bíocída pode também ser capaz de inibir a excrescência cie Bacíllus subtil is (ATCC 6633) durante 24 horas a 2 5 °C num substrato de crescimento microbiano, adicionado numa concentração de 1000 ppm; preferencialmente adicionado numa concentração de 500 ppm; mais preferencialmente adicionado numa concentração de 250 ppm; ainda mais preferencialmente quando e adicionado numa concentração de 100 ppm; mais preferencíalmente adicionado numa concentração de 50 ppm; e em particular quando é adicionado numa concentração de 25 ppm. O polipéptideo antimicrobíano da invenção e o agente biocida da composição podem ser seieccionados de modo a que seja obtido um efeito sinergético antimicrobíano. O polrpéptído antimicrobíano e o agente bxocida da composição pode ser seleccionado de modo a que o número das células vivas de E. coh (DSM 1576), quando são incubados durante 10 minutos a 20°C numa solução aquosa que contém 50% p/p (preferencialmente 25% p/p, mais pr'e f erencíalmente 10% p/p, mais preferencialmente 5.·. p/p) do agente bxocida e 0.5 ppm (preferencialmente 0.1 ppm) ao polipéptideo antimicrobíano, seja reduzido peio menos mais 5:;-(preferencialmente pelo menos mais 10%) quando comparado com a 47 quantidade que é obtida incubações separadas com o antimicrobíano sozinho, isto e peia adição dos agente biocida e é um efeito aditivo resultados o polipéptídeo simples. das C componente enzimático e o agente biocida da composição pode também ser seleccionados de forma a que a excrescência de E. coli (DSM 1576) a 25 °C num substrato de crescimento microbiano que contém 500 ppm (preferencialmente 250 ppm, ma i s preferencialmente 100 ppm, mais preferencialmente 50 ppm) o agente biocida e 0.5 ppm (preferencialmente 0.1 ppm) o polipéptídeo antimícrobiano, são inibidos pelo menos por mais 5 ·. (preferencialmente pelo menos por mais 10%) quando comparados com o que foi obtido adicionando os resultados das incubações separadas com o agente biocida e o polipéptídeo antimicrobiano sozinho, isto é um efeito aditivo simples. O polipéptídeo antimicrobiano e o agente biocida da composição podem também ser seleccionados de forma a que o número das células vivas de Bacillus subtilís (ATCC 6633), quando incubadas durante 10 minutos a 20°C numa solução aquosa que contém 50% p/p (preferencialmente 25% P/Pf mais preferencialmente 10% p/p, ΪΤ13 X S preferencialmente 5% p/p) do agente biocida e 0.5 pprn (preferencialmente 0.1 ppm) do polipéptídeo antimi crobiano f S 3 O reduzidos em pelo menos mais 5% (preferencialmente em pelo menos mais 10%) quando comparados com a quantidade que foi obtida adicionando os resultados das incubações separadas com o agente biocida e o polipéptídeo antimicrobiano színho, isto é, um efeito aditivo simples. O componente enzimático e o agente biocida da composição podem também ser seleccionados de modo a que a excrescência de Bacillus subtílis (ATCC 6633) a 25°C num substrato de ; 0 :rescímento microbiano que contém 500 ppm (preferencialmente ppm, mais preferencialmente 100 ppm, mais preferencialmente 50 ppm) do agente biocida e 0.5 ppm (preferencialmente 0.1 ppm) do polipéptídeo antimicrobiano, sejam inibidos em pelo menos por 48 ma is 5% (preferencialmente em pelo menos por ma is 10%) quando comparado com aquele que foi obtido adicionando os resultados das incubações separadas com o agente biocida e o polipéptideo antimicrobiano sozinho, isto é, um efeito aditivo simples.

As composições podem compreender um material de suporte adequado. As composições podem também compreender um veiculo de administração adequado capaz de administrar os polipéptideos antimicrobianos da invenção no locus desejado quando as composições são utilizadas como um medicamento. composições podem ser preparadas segundo os métodos conhecidos na espe cíalidade e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição do polipéptideo pode estar na forma de um gr anulado ou um microgranulado. O polipéptideo para ser incluído na composíçãc pode ser estabilizado segundo os métodos conhecidos m especialidade. A continuação serão dados exemplos de utilizações preferidas das composições do polipéptideo da invenção. As doses da composição do polipéptideo da invenção e outras condições sob as quais a composição é utilizada podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica. Métodos e Utilizações A presente invenção inclui ainda várias utilizações dos polipéptidos antimicrobianos. Habitualmente, os polipéptideos antimicrobianos são utilizados em qualquer locus contaminado por bactérias, fungos, levedura ou algas. Habitualmente, os loci estão em sistemas aquosos como por exemplo sistemas de água de refrigeração, água dos enxaguamentos das lavandarias, sistemas a óleo como por exemplo óleos de corte, lubrificantes, campos de óleo e outros, em que os microrganismos têm de ser mortos ou nos que o seu crescimento tem de ser controlado. No entanto, a 49 presente invenção pode também ser utilizada em todas as aplicações para as quais as composições antimícrobianas conhecidas são utilizadas, como por exemplo na protecçâo da madeira, latex, adesivo, cola, papel, cartão, tecido, couro, elástico, calafetagem, e nos produtos alimentares.

Outras utilizações incluem a conservação dos alimentos, bebidas, cosméticos como por exemplo loções, cremes, géis, pomadas, sabões, champôs,'amaciadores, antitranspirantes, desodorizantes, produtos para gargarejar, produtos para rentes de contacto, formulações enzimáticas, ou ingredientes alimentares.

Assim, os polipéptideos antimicrobíanos da invenção podem ser utilizados como desinfectante, por exemplo, no tratamento da acne, infecções oculares ou bucais, infecções cutâneas; em antitranspirantes ou desodorizantes; em sais de banho para os pés; para limpar e desinfectar lentes de contacto, superfícies duras, dentes (higiene oral), lesões, feridas e outros.

Em geral, é considerado que os polipéptideos antimíerobianos da presente invenção são utilizados para a limpeza, desinfecção ou inibição do crescimento microbiano em qualquer superfície dura. Exemplos de superfícies, que podem vantajosamente ser postas em contacto com os polipéptideos antimíerobianos da invenção são as superfícies dos equipamentos utilizados por exemplo na Indústria aos lacticínios, na Indústria química ou farmacêutica, sistemas de saneamento de água, Indústria petrolífera, Indústria de celulose e papel, equipamentos para o tratamento de águas, e torres de arrefecimento.Os polipéptideos antimíerobianos oa invenção devrão ser utilizados numa quantidade que sega eficaz para a limpeza, desinfecção ou inibição do crescimento microbiano na superfície em questão. È considerado ainda, que os polipéptideos antimíerobianos invenção podem vantajosamente ser utilizados num sistema 50 limpeza no local, (C.I.P) para limpar qualquer tipo equipamento cie um processo.

Os polipéptideos antimicrobianos da invenção podern adicionalmente ser utilizados para limpar superfícies e utensílios de cozinha na Indústria alimentar e em qualquer área onde os alimentos são preparados ou servidos como por exemplo hospitais, clínicas, restaurantes, especialmente restaurantes de comida rápida, mercearia fina e outros.

Pode também ser utilizado como um antimícrobiano em produtos alimentares e é especíalmente utilizado como uma superfície antimicrobíana nos queijos, frutas e vegetais e alimentos em barra salgados.

Pode também ser utilizado como um agente de conservação ou um agente de desinfecção em pinturas à base de água.

Os polipéptideos antimicrobianos da presente invenção são ainda utilizados para o controlo microbiano das condutas de áqua, e para a desinfecção da água, em particular para a desinfecção da áqua industrial. A invenção refere-se ainda à utilização de um polipéptideo antimicrobiano ou composição da invenção como um medicamente. Adicionalmente, um polipéptideo antimicrobiano ou composição da invenção pode também ser utilizada para o fabrico de um medicamento para· controlar ou combater microrganismos, como por exemplo organismos fúngicos ou bactérias, preferencialmente bactérias grarn positivas. Ά composição e o polipéptideo antímicrobiano da invenção podern ser utilizados como um agente antímicrobiano profiláctico ou terapêutico veterinário ou humano. Assim, a composição e o polipéptideo antimicrobianos da invenção podem ser utilizados na preparação de agentes profilácticos ou terapêuticos veterinários 51 ou humanos para o tratamento de infecções microbianas, como por exemplo infecções bacterianas ou fúngicas, preferencialmente infecções bacterianas gram positivas. Em particular as infeccôes microbianas podem estar relacionadas com doenças pulmonares incluídas, mas sem estar limitadas à tuberculose e frbrose cística; e doenças de transmissão sexual incluindo, mas sem estar limitada à gonorreia e clamídia. a composição da invenção compreende uma quantidade eficaz do polipéptideo antimicrobiano da invenção. icaz" quando é utííí zada na presen car uma quantidade do polipéptld eende â sequência de aminoácid dos 1 cl 40 da SEQ ID NO:2, ou na antímicrobiano que compreende fragmento ou uma variante da mesma, que seja suficiente para inibir o crescimento dos microrganismos em questão. A invenção refere-se ainda a composições ou produtos para a cicatrização de feridas como ligaduras, dispositivos médicos como por exemplo, cateteres e adicionalmente a outros produtos como produtos capilares anti-caspa, como champôs. Síntese m vítro

Os péptideos antímicrobianos da invenção podem ser preparados por síntese in vítro, utilizando os métodos convenciona is conhecidos na especialidade. Vários aparelhos comerciais sintéticos estão disponíveis, por exemplo sintetízadores automatizados de Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. com a utilização dos sintetízadores, os amínoácidos de origem natural podem ser substituídos por amínoácidos não naturais, particularmente D-ísómeros (ou D-formas) por exemplo D-alanina e D-isoleucina, diastereoisómeros, cadeias secundárias com diferentes comprimentos ou funções, e outras. A sequência 52 particular e a forma de a preparar, será determinada de acordo com a conveniência, economia, pureza requerida, e outros.

[0176] 0 aglutinante químico pode ser provido para vários péptideos ou proteínas que compreendam funções convenientes para a união, como os grupos amrno para a formação de amidas ou de atinas substituídas, por exemplo amínação redutiva, grupos tiol para a formação de tioéteres ou dissulfuretos, grupos carboxilos oara a formação de amidas, e outros.

Se é desejável, vários grupos podem ser introduzidos no péptideo durante a síntese ou durante a expressão, o qual permite a união a outras moléculas ou a uma superfície. Assim as cisteínas podem ser utilizadas para fazer tioéteres, as hístídinas para ligarem a um ião metálico complexo, os grupos carboxilos para formar amidas ou ésteres, os grupos amino para formar amidas, e outros.

Os polipéptideos podem ainda ser isolados e purificados de acordo com os métodos convencionais da síntese recombinante. Um lisado pode ser preparado a partir do hospedeiro de expressão e o lisado pode ser purificado por HPLC, cromatografia de exclusão, electroforese em gel, cromatografía de afinidade, ou outra técnica de purificação. Na sua grande maioria, as composições utilizadas compreenderão pelo menos 20% em peso do produto desejado; mais habítualmente pelo menos cerca de 75% em peso, preferencialmente pelo menos cerca de 95% em peso, e para fins terapêuticos, normalmente pelo menos cerca de 99.5% em peso em relação aos contaminantes relacionadas com o método de preparação do produto e a sua purificação. Habitualmente, as percentagens estarão baseadas na proteína total.

Alimentos para animais A presente invenção está também dirigida a métodos para utilizar polipéptideos com activídade antimicrobiana em alimentos para ani.rn.ais, assim como para composições e aditivos de alimentos 53 para animais que compreendem os polipéptídeos antirnícrobianos da invenção. A expressão animâl inclui todos os animais, incluído os humanos. Exemplos de animais não ruminantes, e ruminantes, como vacas, ovelhas e cavalos. Numa forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem animais mono-gástricos, como por exemplo porcos ou suínos (incluídos, mas sem se limitar aos leitões, porcos em crescimento, e bácoras); aves como por exemplo perús e galinhas (incluído mas sem se limitar a frangos para assar, galinhas poedeiras); vitelos jovens; e peixes (incluído o salmão mas sem se limitar a este) . significa qualquer adequada para, ou A expressão alimento ou composição alimentar composto, preparação, mistura, ou composição destinada a ser ingerida por um animal.

Na utilização de acordo com a invenção o polipéptideo antirnícrobi ano pode ser dado ao animal antes, depois, ou ao mesmo tempo que a dieta. A última forma é a preferida.

Numa forma de realização particular, o polipéptideo antimicrobiano, está bem definido na forma em que é adicionado ao alimento, ou quando está a ser incluído num aditivo de alimentos para animais. Bem definido significa que a preparação cio polipéptideo antimicrobiano tem pelo menos 50% de pureza de acordo com o determinado por cromatografía de exclusão molecular (ver o exemplo 12 do Pedido de Patente WO 01/58275) . Noutras formas de realização particulares a preparação do polipéptideo antimicrobiano de acordo com o determinado por este método tem pelo menos um 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 , ou pelo menos 957 ¢:(e pureza .

Uma preparação do polipéptideo antimicrobiano bem definido é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosi ficar 54 correctamente no alimento para animais um polipéptideo antimicrobiano que essencialmente não interfira ou contamine outros polipéptideos antimícrobianos. A expressão dose refere-se correctamente em particular ao objectivo de obter resultados consistentes e constantes, e a capacidade de optimizar as dosagens baseadas no efeito desejado.

No entanto, para ser utilizado em alimentos para animais, polipéptideo antimicrobiano não necessita ser puro; pode por exemplo incluir outras enzimas, e neste caso poderia ser qualificado como preparação do polipéptideo antimicrobiano. A preparação do polipéptideo antimicrobiano pode ser: ía) adicionada directamente ao alimento (ou utilizado directamente num processo de tratamento de proteínas vegetal/, ou ; b) pode ser utilizado na produção de uma ou mais composições intermédias como por exemplo aditivos ou pré-misturas de alimentos para animais que são posteriormente adicionadas aos alimentos para , animais (ou utilizados num processo de oratamento). 0 grau de pureza anteriormente descrito refere-se a pureza da preparação do polipéptideo originai antimicrobiano, se e utilizado de acordo com a alínea (a) ou (b) acima.

As preparações do polipéptideo antimicrobiano com purezas desta ordem são particularmente obtidas utilizando métodos recombmantes de produção, apesar de que estes não são tão facilmente obtidas e também estão submetidas a uma variação lote a lote muito mais alta quando o polipéptideo antimicrobiano e produzido por métodos de fermentação tradicionais. esta preparação do polipéptideo antimicrobiano evidentemente ser misturada com outras enzimas. 55 A expressão, proteínas vegetais, como é neste caso utilizada refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada ou originada de um vegetal, incluídas as proteínas modificadas e derivados proteicos. Nas formas de realização particulares, o conteúdo proteico das proteínas vegetais é pelo menos de 10, 20, 30, 10, 50, ou 60% (p/p)·

As proteínas vegetais podem derivar de fontes proteicas vegetais; como por exemplo leguminosas e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Legumínosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como por exemplo a farinha de soja, farinha de tremoço e farinha de semente de colza.

Numa forma de realização particular, a fonte da proteína vegetal é matéria de uma ou mais plantas da família das Fabaceae, por exemplo semente de soja, tremoço, ervilha, ou feijão.

Noutra forma de realização particular, a fonte da proteína vegetal é matéria de uma ou mais plantas da família das Chenopodiaceae, por exemplo a beterraba sacarina, espinafre ou q u moa .

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são sementes de colza, e o repolho. A semente de soja é a fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais como a cevada, o trigo, o centeio, a aveia, o milho, o arroz, e o sorgo. 0 polipéptideo antimícrobiano pode ser adicionado ao z qualquer forma, seja como um polipéptideo ant j relativamente puro, ou juntamente com outros c 56 destinados a serem adicionados aos alimentos para animais, isca e em forma de aditivos para alimentos para animais, como as denominadas pré-misturas para os alimentos de animais.

Noutro aspecto a presente invenção refere-se a composições para serem utilizadas nos alimentos para animais, como alimentos para animais, e aditivos para alimentos para animais, como por exemplo pré-misturas.

Além do polipéptídeo antimicrobiano da invenção, os aditivos para os alimentos dos animais de acordo com a invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um micromineral, e/ou pelo menos um macrominerai.

Outros ingredientes opcionais de aditivos para alimentos para animais são agentes corantes, compostos de aromas, estabilizadores, e/ou pelo menos outra enzima seleccionada entre as fitases EC 3..1.3.8 ou 3.1.3.26; as xilanases EC 3.2.1.8; as galactanases EC 3.2.1.89; e/ou as beta-glucanases EC 3.2.1.4.

Numa forma de realização particular estas outras enzimas estão bem definidas (como o anteriormente definido para as preparações do polipéptídeo antimicrobiano).

Exemplos de outros péptideos antimicrobianos (AMP's) são CAP18,

Leucocrna A, tritrpticina, Protegr ina-1, Tanatina, Defensina, Ovispirina como a Novispirina (Robert Lehrer, 2000), e variantes, ou fragmentos dos mesmos que retêm a a c 11 v i d a d e antimicrobiana.

Exemplos de outros polipéptideos antifungicidas (AFP's) são xs péptideos Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmentos dos mesmos que retêm a activrdaae antifungícida, como o descrito nos Pedidos de Patentes WO 57 94/01459 e PCT/DK02/00289 [quando publicada substituir WO por o número].

Normalmente as vitaminas solúveis em gordura e em água, assam como os niicromineraís formam parte de uma denominada pré-mistura destinada a ser adicionada aos alimentos dos animais, encruan toque os macroraineraís são normalmente adicionados ao alimento separadamente. Quaisquer destes tipos de composição, quando são enriquecidos com um polipéptideo antimicrobiano da invenção, são aditivos de alimentos para animais de acordo com a invenção.

Numa forma de realização particular, o aditivo de alimentos para animais de acordo com a invenção está destinada a ser incluída (ou prescrito como tendo de ser incluído) em dietas ou alimentos para animais com níveis de 0.01 a 10.0%; mais particularmente de 0.05 a 5.0%; ou de 0.2 a 1.0% (% significando g de aditivo per 100 g de alimento) . Esta percentagem é em particular para as pré-misturas.

As seguintes são listas não exclusivas de exemplos destes componentes:

Exemplos de vitaminas vitamina D3, vitamina E, solúveis em gordura são vitamina A, e vitamina K, por exemplo vitamina K3. vitamina B12, vitamina B6, exemplo Ca-D-

Exemplos de vitaminas solúveis em água são a biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, niacina, ácido fólico e pantotenato, por

Pantotenato.

Exemplos de microminerais são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, seiênio, e cobalto.

Exemplos de macrominerais sao cálcio, fósforo e sódio. 58 com

Os requisitos nutritivos destes componentes (exemplificados aves leitões/porcos) estão catalogados no quadro A do Pedido de

Parente WO 01/58275. Requisito nutritivo significa que estes * componentes deveriam de na dieta serem administrados com as concentrações indicadas.

De forma alternativa, o aditivo de alimentos para animais de acordo com a invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados no quadro A do Pedido de Patente WO 01/58275. Pelo menos quaisquer meios de um ou mais de um, ou dois, ou três, ou quatro etc... até treze, ou até quinze componentes individuais. Mais especificamente, pelo menos este componente individual está incluído no aditivo de acordo com a invenção com uma quantidade para prover a concentração no alimento para animais com o nível indicado na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis do quadro A. A presente invenção refere-se ainda a composições alimentares para animais. As composições ou dietas alimentares para animais têm um teor relativamente alto de proteínas. As dietas para as aves e porcos podem estar caracterizadas como o indicado no quadro B do Pedido de Patente WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas para os peixes podem estar caracterizadas de acordo com o indicado na coluna 4 deste quadro B. Além de que estas dietas para os peixes normalmente têm um teor em gordura bruta de 200-310 kg.

Uma composição de alimentos para animais de acordo com a invenção tem um teor proteico bruto de 50-800 kg, e adicionalmente , compreende pelo menos um polipéptideo dntimicrobiano de acordo com o que é reivindicado na presente invenção.

Adicionalmente, ou de bruta como a indicada acordo com a invenção forma alternativa (ao teor de , a composição alimentar para an tem um teor de energia metaboli 59 10-30 MJ/Kg; e/ou um teor de cálcio de 0.1-200 g/kg; e/ ou um teor de fósforo disponível de 0.1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0.1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0.1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0.5-50 g/kq.

de realizar a invenção, o teor energia metanol1zável, proteína em bruto, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais císteína, e/ou lisina está dentro de quaisquer dos níveis 2, 3, 4 ou 5 do quadro B do Pedido de

Patente WO 01/58275 (R. 2-5). A proteína em bruto é calculada como nitrogénio (N) multiplicado pelo factor 6.25, isto é proteína em bruto (g/kg)=N(g/kg)X6.25. O teor de nitrogénio é determinado pelo método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984 , Offícíal Methods of Analysis 14th eci. ,

of Official Analytical Chemists, Washington DC). A energia metabolizável pode ser calculada baseada em NCR publication Nutrient requírements in swine, nineth revised edition 1988, subommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agrículture, National research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, e European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafísch bedrijf Ponsem & looiien bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. C teor dietético do cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas para animais completas é calculado baseado nas tabelas alimentares como Veevoedertabel 1997, qegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermíddelem, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk

Lelystad, ISBN 90-72839-13-7. 60

Numa forma particular de realizar a composição alimentar cia invenção para animais contém pelo menos uma proteína vegetal ou fonte de proteína como a anteríormente definida.

Noutras formas adicionais de realização particulares, a composição alimentar da invenção para animais contém 0-80 "· milho; e/ou 0-80% sorgo; e/ou 0-70% trigo; e/ou 0-70% Cevacia; e/ou 0-30% aveia; e/ou 0-40% farinha de soja; e/ou 0-10% comida para peixes; e/ou 0-20% soro de leite. As dietas para animais podem por exemplo ser fabricadas como alimentos para animais t r ífurados (não comprimidos) ou comprimidos. Normalmente, as pastas de alimentos moídos para animais são misturadas, e têm adicionadas, em quantidades suficientes vitaminas essenciais e minerais de acordo com as especificações das espécies em questão. As enzimas podem ser adicionadas corno formulações enzimátícas sólidas ou líquidas. Por exemplo, habí tualrnente uma formulação enzimática sólida é adicionada antes ou durante a fase de mistura; e habitualmente uma preparação enzimática líquida é adicionada depois da fase de granulação. A enzima pode ser ainda incorporada num aditivo ou numa pré-mistura alimentar para animais, A concentração da enzima final na dieta tem entre 0.01 e 200 rnq de proteína enzimática por Kg de dieta, por exemplo entre 5 e 30 mg de proteína enzimática por Kg de dieta animai. O poiipéptideo antimicrobiano pode ser administrado numa ou mais das seguintes quantidades (níveis de dosagem): 0.01-200; ou 3.01-100; ou 0.05-100; ou 0.05-50; ou 0.10-10 - t níveis são em mg de proteína do poiipéptideo antimic:

Kg de alimento para animais (ppm).

Para determinar os mgs da proteína do poiipéptideo antimicrobiano por Kg de alimento para animais, o poiipéptideo antimicrobiano é purificado a partir da composição alimentar, o a actívidade específica do poiipéptideo a 61 purificado é determinado utilizando um ensaio relevante (ver ern actividade antímicrobiana, substratos, e ensaios) . A actívrdacie antimicrobiana da composição alimentar para animais foi também determinada utilizando o mesmo ensaio, e baseada nestas duas determinações, a dosagem é calculada em mqs de proteína ao polipéptideo antimicrobíano por Kg de alimento para animais.

Os mesmos princípios são aplicados para determinar os mas de proteína do polipéptideo antimicrobíano nos aditivos alimentares para animais. Evidentemente, se uma amostra do polipéptideo antimicrobíano utilizado para preparar o aditivo do alimento para animais ou o alimento está disponível, a actividade específica desta amostra será determinada (sem necessidade de purificar o polipéptideo antimicrobíano da composição alimentar para animais ou do aditivo).

Composição cio detergente

Os polipéptídeos antimicrobianos da invenção podem ser adicionados, para deste modo serem um componente de uma composição de detergente. A composição de detergente da invenção pode por exemplo ser formulada como uma composição de detergente para lavar à mão ou a máquina incluída uma composição do aditivo para lavandaria adequado para o pré-tratamento de tecidos de cor e urna composição amaciadora adicionada à água de enxaguamento, ou ser formulada como uma composição de detergente para sei' habxtualmente utilizada nas operações de limpeza doméstica de superfícies duras, ou ser formulada para operações de lavar a louça à mão ou à máquina.

Carn aspecto específico, a invenção provê um adrtrvo ue detergente que compreende os poiípéptideos antimicrobianos na invenção e um agente tensio-actívo. 0 aditivo de detergente assim como a composição de detergente pode compreender uma ou 62 mais enzimas como por exemplo uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma amilase, uma carbohidrase, uma celulase, uma pectínase, uma mananase, uma arabínase, uma galactanase, uma xílanase, uma oxídase (como uma lacase), e/ou uma peroxídase ícomo uma haloperoxídase).

Geralmente as propriedades ba(s) enzima(s) escolhida (s) deverão ser compatíveis com o detergente seieccionado, (isto é pH óptimo, compatibilidade com outra enzima e ingredientes não enzimáticos, etc...), e a (s) enzima(s) deverá (ao) de estar presente(s) em quantidades eficazes.

Proteases; As proteases adequadas incluem as de origem animal, vegetal ou microbiano. A origem preferida é a microbiana. Estão incluídos os mutantes modificados quimicamente ou criados geneticamente com proteínas. A protease pode ser uma serina protease ou um metaloprotease, preferencíalmente uma protease alcalina microbiana ou uma protease de tipo tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são as subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtílisína Novo, subtilisma Carisberg, subtilisina 309, subtílísrna 147 e subtilisina 168 (descritas no Pedido de Patente WO 89/06279) . Exemplos de proteases de tipo tripsina são a tripsina (por exemplo de origem suína ou bovina) e a protease de Fusarium descrita nos Pedidos de Patentes WO 89/06270 e WO 94/25583.

Exemplos de proteases utilizadas são as variantes descritas nos Pedidos de Patentes WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente as variantes com substituições numa ou mais das seguintes posições: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120,123,167,170,194, 206, 218, 222, 224, 235 e 274.

Lipases : As iípases adequadas incluem aquelas de origem oactenana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes modificados quimicamente ou criados geneticamente por proteínas. Exemplos cie Iípases utilizadas incluem iipases de Humicola (sinónimo de 63

Thermomyces), por exemplo de H. lanugínosa (T. lanuginosus) como descrito nos Pedidos de Patentes EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. msolens como o descrito no Pedido de Patente WO 96/13580, uma lipase de Pseudomonas, por exemplo de P. alcaligen.es ou P. cseudoal cal igenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 316) , P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, estirpe SB 705 de Pseudomonas sp. (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wísconsínensis iWO 96/12012), uma lipase de Bacillus, por exemplo de B. subtílís (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acra, 1131, 253-360), P. stearothermophilus (JP 64/744992) ou S. pumilus (WO 91/16422) .

Ou t ros exemplos são variantes da 1 ipase como os descritos η o s Pedidos de Patentes WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 10 5, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

Amilases: As (alfa e/ou beta) amilases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes modificados quimicamente ou criados geneticamente peias proteínas. As amilases incluem, por exemplo, as alfa-amilases obtidas a partir de Bacillus, por exemplo uma estirpe especial de B. licheniformis, descrita detalhadamente no Pedido de Patente GB 1,296,839.

Exemplos de amilases utilizadas são as variantes descritas nos Pedidos oe Patentes WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições numa ou ma is das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 12 4, 128 , /33, 154, 156, 391, 408, 181, 188, e 4 4 4 . 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264 , 304 , 3 0 3,

Oelulases: As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes modificados quimicamente ou criados geneticamente. As celulases adequadas incluem celulases dos géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, 64

Fusarium, Thielavia, Ãcremonium, por exemplo as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolans, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum descritas nos Pedidos de Patentes US 4,435,307, US 5,643,263, US 5,691,178, US 5, ’7 7 6, 7 57 e WO 89/09259 .

As celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras que vantajosamente cuidam da roupa de cor. Exemplos destas celulases' são as celulases descritas nos Pedidos de Patentes EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/ 11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes da celulase como os descritos nos Pedidos de PAtentes WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299 .

As peroxidases/oxidases adequadas incluem as de origem vegetai, bacteríana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes criados geneticamente de proteínas ou quimicamente modificadas. Exemplos de peroxidases utilizadas incluem as peroxidases de Coprínus, por exemplo de C. cinereus, e variantes das mesmas como as descritas nos Pedidos de Patentes WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257. Aís) enzima(s) de detergente(s) pode(m) ser incluída(s) numa composição de detergente adicionando os aditivos separadamente que contêm uma ou ma is enzimas, ou adicionando um aditivo combinado que compreenda todas estas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode por exemplo ser formulado como um granulado, um líquido, uma pasta, etc., as formulações do aditivo detergente preferidas são granulados, em particular granulados oao ooivorentos, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou rnisturas .

Os granulados não ooivorentos podem ser produzidos, por exemple;, como o descrito nos Pedidos de Patentes US 4,106,991 e US 65 4,661,452 e podem opcionalmente ser revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento de parafina sâo produtos de óxido de poli(etileno) (poiietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados com 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois etoxilados gordos onde o álcool contém 12 a 20 átomos de carbono e onde há 15 a 80 unidades de óxrao de e ti leno; álcoois gordos; ácidos gordos; e mono e cir e rrigiicérideos de ácidos gordos. Exemplos de materiais de revestimento que formam películas adequadas para serem aplicadas por técnicas de leito fiuidízado são dados no Pedido de Patente GB 1483591. As preparações enzimáticas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas adicionando um poliol corno um propilenoglicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo cm os métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito no Pedido de Patente EP 238,216. A composição de detergente de acordo com a invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, barra, pastilha, pó, qranulado, pasta ou liquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo habi tualmente até 70 % de água e 0-303 de solvente orgânico, ou não aquoso. A composição dê detergente compreende um ou mais agentes tensioactivos, que podem ser não íónicos incluídos os semrpolares e/ou aníónicos e/ou catíónicos e/ou zwitteriónicos . Habitualmente, os agentes tensíoactívos estão presentes numa margem de 0.1 % a 60% em peso.

Quando incluída na presente invenção, o detergente habitualmente contém cerca de 1% a 40% de agente tensioactivo anióníco como cor exemplo o linear alquíibenzeno sulfonato, alfa-oiefinsulfonato, alquíl sulfato (sulfato de álcool gorduroso;, etoxisulfato de álcool, alcano sulfonato secundário, alfa-sulío 66 rnetil éster de ácido gordo, ácido alquil ou alquenilsuccínico cu sabão.

Quando é incluído na presente invenção, o detergente habi tualmente contém cerca de 0.2% a 40% de um agente tensioactivo não iónico como por exemplo etoxílato de álcool, etoxiiato de nonílfenol, alquil poliglicosídeo, óxido de alquil dímetílamina, monoetanolamída de ácido graxo etoxílado, mono-etanolamina de ácido gordo, amída de ácido poiihidroxí alquil gorduroso, ou derivados de N-acilo N-alquil glucosamine ( "qlucamidas") . O detergente pode conter 0-65 % de um construtor de detergente ou um agente complexo como por exemplo zeólito, difosfato, t rífosfato, fosfonato, carboneto, citrato, acido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou siiicatos estratificados (por exemplo SKS-6 de Hoechst). O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetilcelulose, poli(viníIpirrolidona) , poli(etíleno qlicol), álcool de poli(vinilo) , poli(viniIpirídina-n-óxido) , poli ( vim 1 rmidazol) , policarboxí latos corno por exemplo os políacrilatos, copoiímeros de ácido maleico/acrílico e copolimeros de lauril maleico/ácido acrílico. O detergente pode conter um sistema branqueador que pode compreender uma fonte de B2O2 como por exemplo perborato ou oercarbonato que pode ser combinado com um activador da descoloração formador de perácrdo como por exemplo o t: et raacetiletilenodiamína ou nonanoí loxíbencenosul f ona to . De forma alternativa, o sistema branqueador pode compreender peroxíácidos de por exemplo tipo amido, imida, ou sulfona. 67 A (s) enzima(s) da composição detergente da invenção pode(m) ser estabilizada (s) utilizando agentes convencionais estabíiizantes, por exemplo, um poiíol como propilenoglicol ou glicerina, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado do ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado do ácido fenil borónico como ácido 4-íormilfenil borónico, e a composição pode ser formulada como o por exemplo descrito nos Pedidos de Patentes WO 92/19709 e 92/19708 , O detergente pode conter ainda outros ingredientes de detergentes convencionais como por exemplo amaciadores do tecido que incluem argilas, reforçadores da espuma, supressores da espuma, agentes anticorrosívos, agentes de suspensão da sujidade, agentes de reposição anti-sujidade, corantes, bactericrdas, branqueadores ópticos, hidrótropos, inibidores de embacxamento, ou perfumes.

Na presente invenção é considerado que as composições detergentes possam ser adicionadas a qualquer enzima, e aos polipéptideos antímicrobianos da invenção, numa quantidade correspondente a 0.01-100 mq de proteína enzímática por litro de água de lavagem, preferencialmente 0.05-10 mq de proteína enzímática por litro de água de lavagem, maís preferencialmente 0.1-5 mg de proteína enzímática por litro de água de lavagem, e mais preferencialmente 0.1-1 mg de proteína enzímática por irtro cie água de lavagem.

Os polipéptideos antimícrobianos da invenção podem adicionalmente ser incorporados nas formulações de detergentes descritas no Pedido de Patente WO 97/07202. : o n tinuação a exemplos que objectivo da ao presente invenção é adicionalmente descrita com não deverão ser interpretados como limitativos invenção. 68

EXEMPLOS

Os produtos químicos utilizados como tampões e substratos são produtos comerciais com pelo menos qualidades reactivas. EXEMPLO 1 de_um_pol ipépt ideo_antimicrobianc nigrella

Materiais e métodos

um banco de ADNc foi obtido a partir de meios de P. nígrel la induzidos durante 5 dias em meios Mex-1 (protocolo encontrado nos exemplos do Pedido de Patente WO 98/38288) . 0 ARN enriquecido com PolyA foi purificado, o ADNc for sintetizado e o banco foi realizado de acordo com os procedimentos de biologia molecular standards. Um protocolo detalhado sobre o processo qeral pode ser encontrado nos exemplos do Pedido de Patente WO 01/12794 . O vector utilizado para a clonação foi pMhasd, que é mostrado na SEQ ID NO:4 e tem as seguintes características:

Quadro 1, Características do vector pMhasS.

Característica Localização Descrição CDS 365-1156 Resistência à canamicina CDS 2232-2387 Alfa péptideo de beta g a1a c t o s i da s e sinal -10 2189-2192 Shine Dalgarno promotor .2101-2189 Promotor Lac característica 626-650 Iniciador KanPl para sistema mi 5 c BACE

Características notáveis deste restrição EcoRI-Notl próximos promotor Lac. Isto permite que plasmídeo são os sítios cie â região Shine Dalgarno do os ADNcs adaptados a EcoRI-Notl 69 sejam cionados no vector e as construções resultantes sejam actívamente transcritas e traduzidas no hospedeiro de E. coli.

Construção do banco de Pseudoplectania nigrella e capturo de sinais do conjunto cios plasmídeos resultantes do ADNc um coniunto de plasmídeos de ADNc foi obtido a partir de 20,000 a.ransf ormantes totais da ligação do vector pMHasS original rir·· rado dírectamente a partir cie u m das de meios se lectivos de LB olo Qiagen para o isolamento do 0 conjunto de plasmídeos foi e a i transposase MuA segundo a s instruções do fabricante da transposase (Finnizyme, Finland) . Informação geral sobre a captura de sinais assistida por transposões pode ser encontrada no Pedido de Patente WO 01/'77315. A mistura resultante foi precipitada; com etanoi para eliminar o excesso de sal e 1.5 microlitros foram submetidos a electroporação em 20 mícroiítros de células ultracompetentes DH10B segundo o protocolo Standard provido com as células (Gibco-BRL). As, células submetidas a electroporação foram incubadas em meios SOC com agitação (28 graus celsius, 2 horas, 250 rpm) antes de serem colocadas em placas em meios selectivos. Foram utilizados três meios de agar: LB + 50 microgramos pr. ml de canamícina, LB + canamícina + 15 microgramos pr. ml de cloramfencol, ou LB + canamícina + cloranf enicol + 12.5 microgramos pr. ml ampicuma . no meio cerca cie ADNc com e r a d a s da A partir da diluição em placas de electroporação LB+canamicina+cloramfenicol, foi determinado que havia il.5,000 colónias que continham um plasmídeo do banco de uma transposição de SígA2. As 363 colónias foram recup 70 experiência sob uma selecção tripla. As 363 colónias foram réplicas colocadas em placas sob selecção tripla com 50 microgramos pr. ml de ampicilina para seleccionar os capturadores de sinais reais. Um total de 336 colónias foram capazes de crescer sob a concentração de ampicilina aumentada e estas foram minipreparadas segundo o protocolo Qiagen Oiaturbo96 (Qiagen Inc.) . Os plasmídeos foram ordenados de frente para trás e de trás para a frente com os iniciadores (iniciadores A e B) do transposão segundo o procedimento descrito nos exemplos do Pedido de Patente WO 01/77315. A: B : agcgt ttgcg gccgc gatcc ttatt cggtc gaaaa ggatc (SEQ ID NO;16) s (SEQ ID NO: 17)

Para as reacções a sequência de ADN foi obtida num sequencíador capilar AB3700. As sequências foram recortadas para eliminar a sequência do vector e do transposão e os iniciadores A e B leram cada plasmideo ensambiado. Esta leitura resultou em 225 sequências ensambladas que foram agrupadas por homolog ia sequencial em 145 sequências contíguas. As 145 sequências contíguas foram independentemente alinhadas por BLA3T e os resultados foram analisados. Um plasmideo (Plectasina_ 6 _B12) compartia certa homologia do aminoãcido com polipéptideos antimícrobíanos conhecidos (polipéptideos tipo defensina).

Nos seguintes exemplos é feita referência ao poiipéptideo antimicrobiano da invenção como "Plectasina”. EXEMPLO 2

Construção de um vector de expressão do Aspergillus para A sequência de codificação da Plectasina foi amplificada do banco de ADNc anterior (ver exemplo 1 anterior) da seguinte 71 forma: 1 microlítro de ADNc (aproximadamente 10 nanoqrarnos cie ADN; foi utilizado como molde numa reacçâo PCR com os dois 178 e 179.

Iniciador 178: tctgg atcca ccatg caatt tacca ccatc ctctc iSlQ ID NC): 7 )

Iniciador 177; tctct cgagc tagta acact tgcaa acaaa gc )3EQ ID NO: 8 ) i0 pmol de cada iniciador foi utilizado num volume de reacçâo de 100 rmcrolitros . A temperatura de recozimento foi 55 graus celsius, e aumentou a 72 graus celsius durante 1 minuto. Um total de 35 ciclos foram realizados. Foi utilizado o Expand Higri Fidelity PCR System (Roche).

Partes alíquotas da reacçâo de PCR foram separadas em 47 de gel cie agarose. Duas faixas diferentes foram visualizadas: A faixa mais proeminente com um tamanho de aproximadamente 300 bp e uma faixa algo mais débil a aproximadamente 350 bp.

Os dois fragmentos foram digeridos com BamHl e Xhol que cortam as proiecções introduzidas pelos iniciadores da PCR. Os fragmentos ciigeridos foram isolados e cionados em pMT218 8, um piasmídeo de expressão de Aspergillus baseado no plasmicieo pCaHj 527 (ver os exemplos do Pedido de Patente WO 00/70064) construído segundo o descrito no exemplo 7 do Pedido de Patente Dinamarquesa PA 2001 00088. Foi descoberto que o fragmento mais curto continha a sequência de codificação da Plectasma segundo o que tinha sido determinado a partir da experiência da captura cie sinais (ver exemplo 1 anterior) . A sequência deste fragmente; cie PCR mais curro é mostrada como SEQ ID NO: 5 .

Iquaimente, for determinado que a sequência do fragmento cie PCR mais comprido continha a sequência de codificação da Plectasma e uma inserção adicional de 58 bp. Foi observado que a inserção

de 58 bp continha as consensuais de um mtrão 72 fúngico, e a amplificação deste produto foi considerada como a evidência da eliminação incompleta do intrão no conjunto do ARNrrt e do banco de ADNc derivado. A sequência deste fragmento de PCR ma is comprido é mostrada como a SEQ ID NO: 6. 0 plasmideo de expressão de Ãspergillus para o produto da PCR mais curto (SEQ JD NO:5) foi denominado pMT2548. EXEMPLO 3

Expressão da Plectasina em Ãspergillus: 0 PMT2548 foi transformado na estirpe BECh2 de Ãspergillus oryzae (descrita no Pedido de Patente WQ 00/39322) e em MBini18 oe Ãspergillus niger. 30 transformantes de cada estirpe foram re-isolados duas vezes sob condições selectivas e não indutoras em placas mínimas de Cove com sacarose e acetamida. Para testar a expressão da Plectasina, os transformantes cresceram durante 6 dias a 30 graus celsius em tubos com 10 ml de YPM (2% peptona, lt extracto de levedura, 2% maltose). Os sobrenadantes foram realizados em 10% de géis Bis-tris SDS NuPage (Invitroqen) segundo o recomendado pelo fabricante com o tampão MBS em funcionamento para permitir a separação a um nível de Pm baixo. As duas estirpes de Ãspergillus cresceram bem e inclusive induziram a expressão da Plectasina. Uma faixa diferente ao tamanho previsto para a Plectasina foi vista em mais 1ransformantes enquanto que esta faixa não foi vista nas estirpes BECh2 hospedeiras não transformados de A. oryzae e ABinllS de A. niger. Resultou que a faixa de Plectasina foi maior nos t rans f ormantes de BECh2 do que nos trans forrnan tes oe MBxnllS. Foi calculado, muito aproximadamente e somente baseado na intensidade da coloração, que o rendimento nestas conoicões de crescimento era na ordem de 10-50 mq por litro de meio de C Li 1 11 V o . 73 EXEMPLO 4

Clonação da Plectasína no sistema de expressão de Suicidas (SES) O fragmento de Plectasína foi amplificado por PCR com a utilização do ADNc da Plectasína de comprimento máximo corno molde (Plectasína 6_B12) e os iniciadores DR34F e DR3 4R das ligações Ncol e Xbai , DR34F: ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg (SEQ ID NO:9) DR34R: gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc (SEQ ID NO:10) A amplificação da PCR foi efectuada utilizando um PWO AON polímerase segundo o fabricante (Roche Bioscience, CA). O produto da PCR foi digerido com Ncol e Xbal e inserido de forma direccíonal nos plasmídeos PHHA e PHH (descritos nos exemplos do Pedido de Patente WO 00/73433). Os plasmídeos resultantes foram denominados pDR-18-plectasína para a expressão citoplásmica do péptideo e pDRS-18-plectasína para a expressão periplásmica.

Os dois plasmídeos continham a seguinte sequência de amiiioácidos do fragmento de Plectasína: rnGFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY (SEQ ID NO : 11) onde m (metionína) nâo está presente na Plectasína nativa mas foi introduzida como resultado da estratégia de cionação.

Inibição do crescimento de E. coli após a expressão_ou

Plectasína

Para avaliar se o crescimento de E. coli foi inibido no meio líquido após a indução da expressão da Plectasína endógena, foi realizada a seguinte experiência como descrita nos exemplos do 74

Pedido de Patente WO 00/73433. Resumindo, os cultivos frescos de toda a noite das células que continham a pDRS-18-plectasina, ou pDR-18-plectasina, plasmideo pHH ou PHHA foram diluídos 300 vezes em 150 micro litros de LB ou LB com o 0.1 % arabinose numa placa de microtitulaçâo e foram incubadas a 37 graus celsius com agitação vigorosa. A curva de crescimenro foi controlada medindo OD.,:,o a intervalos regulares utilizando um leitor de ELISA. Os resultados mostraram que a Plectasina inibiu 41% o crescimento celular quando dirigido para o períplasma, no entanto, não afectou o crescimento celular expresso no citoplasma (ver quadro abaixo).

Tabla 2. Inibição do crescimento celular.

Construção % Inibição pHH 1 6 % pHH-plectasina (pDRS—18— 41% plectasina) pHHA 12¾ pHHA-plectasina (pDR-18- X j ΐ plectasina) EXEMPLO 5

Cl onação, expressão e valorização da. act ívídade da. Plectasina de F. nigrella em E. coli ] h+

Flonaçao da Plectasina de P. nigrella em pET3

Para produzir Plectasina para os ensaios da antimicroDiana, o ADNc que codifica a Plectasina foi inserido no -sector de expressão pET31 b+ (Novaqen Inc. , WI) . Mediante os oíiçonucleótidos especifícamente desenhados (Inrciadori e o gene da Plectasina foi amplificado por reação . 75 cadeia pela polimerase utilizando o PWO ADN-polímerase segundo o fabricante (Roche Bioscíence, CA).

Imciadorl: attattcagatgctggatcc gaaaaacctgcgtcqcatta rccgcaaaggcatccatatc (SEQ ID NO:12)

Iniciador!: aataatctcgagttattagc catattttttaatgatatgg atgcctttgcggataatgcg ac (SEQ ID NO:13) A digestão enzimática dos sítios de restrição dos aleios da endonuclease (AiwNI / Aval) permitiu-nos clonar este gene como a construção da fusão em pET31b+ (procedimentos Standard segundo estão descritos pelo fabricante (New England Biolabs Inc., MA) . Todos os protocolos Standard foram descritos em qualquer outro 1ugar (Sambrook, Fritsch, and Maniatís, 1989).

Transformação e_expressão da Plectasína de P. nígrella em E. col i pET31b+ recombinante foi transformado em E. coli Novablua é descrito pelo fabricante (Novagen). 0 plasmídeo foi preparado por QlAprep Mini Columns (Qiagen Inc., CA) e ordenado por sequencraçâo automatizada utilizando os iniciadores específicos dos plasmídeos (Iniciador3 e Iniciador/).

Iniciador!: tqctagttat tgctcagcgg (SEQ ID NO:14)

Iniciador4: accgtagttg cgcccatcg (SEQ ID NO:15) 0 plasmídeo foi ,transformado em BLR-DE3 de E. coli segundo o fabricante (Novagen) . As bactérias foram cultivadas num meio de LB até OD6oo ~0.8 e a síntese da proteína recombinante foi iniciada por 1 iíiM de IPTG (isopropii beta-D-Tiogalactopiranosídeo). Depois de 3 horas de indução, as bactérias foram colhidas, ressuspendidas num tampão A com um volume 1/10 (50 rnM tris-HCl, 1 rnM de EDTA, 100 mM de NaCl, pH 3) e lisadas por ruptura da pressão (1500 mbar). O granulado 76 resultante foi lavado duas vezes num tampão B (50 mM tris-HCl, J0 mM de EDTA, 0.5% TritonX-100,100 mM de NaCl, pH 8). Todos os protocolos Standard foram descritos em qualquer outro iuqar {Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989). P urificação da Plectasina de P. nigrella de corpos de inclusão de E. coh O qranulado resultante da purificação anterior continha corpos se inclusão ourificados. Para libertar o péptrdeo dos pares de fusão KSI, a hidrólise do ácido foi realizada num sitio Asp-pro criada por engenharia genética, introduzida N-terminalmente no gene de codificação da Plectasina.

Os corpos de inclusão foram ressuspendidos em 100 mM de fosfato sódico (pH 2.3) e incubados durante toda a noire a 85 graus ceisius. O sobrenadante resultante continha Prolina-Plectasina e a amostra foi neutralizada por 100 mM de fosfato sódico (pH 12.3). A identidade de Prolina-Plectasina foi confirmada por espectrometria de massas. Todos os protocolos standards foram descritos em qualquer outro lugar (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989).

Actividade antímícrobiana por ensaio da difusão radial

Foi aplicada uma versão modificada de um protocolo previamente publicado; na detecção da actividade antimicrobiana (Lehrer et al., (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimrcrobra 1 polypeptides J Immunol Methods 137: 167-173). As bactérias alvo ! unidades de formação de colónias (CFU) foram adicionadas a ml da camada inferior de agarose (1% de agarose de baixa eiectroendosmose, 0.03% num caldo de tripticase de sota, 10 mM de fosfato sódico, pH 7.4,37 graus ceisius). A suspensão foi solidificada numa placa Petri INTEGRID dish (Becton Dickinson Labware, NJ) . 3 mm de Gel Puncher foram utilizados para fazer buracos na camada inferior de agarose (Amersham Pharmacia 77

Biotech, Sweden). As amostras foram adicionadas aos buracos e incubadas durante 3 horas a 37 graus celsius. Uma camada foi vertida na superfície e a placa foi incubada durante toda a noite (meio de LB, 7.5% Agar) . A activídade antimicrobiana foi vista como zonas de claridade bacteriana à volta dos buracos. As células vivas foram manchadas adicionando 10 ml, 0.2 mM de MTT (3- í 4-Dimetíltiazol-2-il) 2-dif eniltetrazolium brometo azul cie tíazolíl azul). Todos os protocolos standards foram descritos em oualquer outro lugar (Sambrook, Fritsch, and Maniatís, 1989). Ãctívídade antimicrobiana da Plectasina contra Bacillus subtil is

Para avaliar a activídade antimicrobiana da Plectasina, os caldos de fermentação de Aspergíllus oryzae recombinante foram aplicados; em diluições em série num ensaio de difusão radial (anteriormente descrito). As zonas mais claras foram, vistas ao restar a amostra contra Bacillus subtilis seguindo o protocolo anterior. A zona de cl aridade maior foi obtida em caldo de fermentaç ão não diluído (15 mm), enquan to que as amos t ras tomadas de Aspergíllus oryzae não recombinante não mostraram activídade antimicrobiana contra Bacillus subtihs.

Plectasina expressa através de corpos de inclusão num. hospedeiro alternativo de E. coli

Para aumentar a quantidade de Plectasina recuperada com activídade antimicrobiana, a Plectasina foi expressa em Origami-PE3 (Novagen Inc.) de E. coli. Esta estirpe tem uma mutilação nos genes que codificam a tioredoxina reductase (trxBi e qlutationa reductase (gor). O plasmídeo pET31 b+ recombinante que codifica a Plectasina foi transformado em Orrgami DE3 de E.colr segundo o fabricante (Novagen). 0 cultivo, expressão e isolamento da Plectasina que contém corpos de inclusão foi efectuada como o descrito acima (transformação e expressão de Plectasina de P. nigrella em E. coli) . A recuperação da Plectasina foi como a descrita acima (Purificação de Plectasina 78 de P, nigrella de corpos de inclusão de E. colí;.

Subsequentemente, o ensaio de difusão radial foi uilizado para aceder à actividade antimicrobiana (ver acima: Actividade antimicrobiana por ensaio de difusão radial).

Gs resultados mostram que a produção de péprideos de Plectasina i _-DE3 de E, coli resulta num aumento de 5 alO vezes a antimicrobiana do péptideo. A actividade biológica uu.ao.iCaaa da Plectasina foi adicionalmente suportada pelo faceo de que foram obtidos resultados iguais os quais expressavam outra defensina, a beta-defensina 3 humana. Concluímos que as estirpes de E. coli que permitem a formação de ligações dissulfureto no citoplasma são geralmente aplicáveis na biossíntese das defensínas biologicamente actívas e noutros péptideos antímicrobianos com pontes de dissulfureto. EXEMPLO 6

Construção do vector de expressão de Saccharomyces cerevisiae para Plectasina

Para avaliar a expressão da Plectasina em S. cerevisiae, foram feitos duas construções diferentes de plasmídeos, pHH3875 e pHH3876. pHH3875 codifica o alfa-líder de S. cerevisiae fundido com a Plectasina madura. A Plectasina pode ser libertada do alfa-líder e portanto amadurecida através de uma sequência de clivagem KEX2. pHH3876 codifica o alfa-líder fundido à pro- reqiâo da Plectasina seguida da Plectasina madura. desta construção, um sítio KEX2 está presente entre o alfa-líder e a cro-região de Plectasina, enquanto que outro sítio KEX2 separa a pro-regiao da Plectasina com a própria Plectasina.

Construção de pHH3875 - KEX2/Plectasina 0 gene da Plectasina foi amplificado numa reacção PCR Standard utilizando os iniciadores pHH3875-Forw e PHH3875-Rev descritos a 79 continuação. C plasmídeo pMT2548 de Aspergillus do Exemplo 2 foi utilizado como molde de ADN na reacção PCR. 0 fragmento resultante de ADN foi purificado usando um kit de purificação de ?CR Qiaquick (Qxagen) e restringido com Xbal e Ciai que cortam as proiecções introduzidas pelos iniciadores. 0 fragmento for ; ·. . onalmente purificado a partir de 2% em gel de aqarose e o num vector de expressão de S. cerevis iae também ingxdo com Xbal e Clal. Este vector transportaddor de 2μ a cie E. coli/levedura emprega o promotor tpi constitutivo para conduzir a expressão da fusão alfa-líder/plectasína, utiliza beta lactamase para selecção fenotipica em E. coli, e transporta o gene POT para a selecção do plasmídeo na btpi levedura (MT663; a/α, Atpi/Atpí, pep4-3/pep4-3).

Iniciador pHH3875-Forw: gaagg ggtat cgatg gctaa gagag gattt ggatg caatg gtcct tgqga Lgagg (SEQ ID N0:18)

Iniciador: PHH3875~Rev: cctag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc C (SEQ ID NO:19)

Construção_de_pHH3876_=_alfa~lider/KEX2/pro- reqião/KEX2/Piectas ína 0 protocolo para a construção de pHH3876 é igual ao de pHH3675 com excepção dos iniciadores do ADN empregue. Para pHH38"6, foram utilizados os iniciadores descritos abaixo:

Iniciador ρΗΗ3876-Forw: caaqg qçtat cgatg gctaa gagag caccc cagcc tgttc ccgag gcrta cgc .SEQ ID NO: 20) 80

Iniciador pHH3876-Rev (igual ao PHH3875-Kev) : crtag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc C (StQ ID NO:21;

Expressão da Plectasína em S. cerevisíae

Os plasmídeos pHH3902 (controlo), pHH3875 e pHH3876 foram transformados na estirpe MT633 de S. cerevisiae usando um protocolo de acetato de iitio. Vários transformantes de pHH3902; PHH3875 e pHH3876, foram seleccionados, dispostos em filas nas placas de SC moldo/agar (contendo agar moído c om SC, 2 s D- glicose, 0.02% treoniná) e incubados a 30 graus Ceisíus até q u e as colónias estivessem desenvolvidas.

Para avaliar a expressão, colónias individuais foram inoculadas em 10 ml de SC liquido moído (contendo SC moído, 2% D-o 1.( '-oso , 0.02% de treoniná), foram incubadas durante 3 dias sob vigorosa a 30 graus Ceisíus. Os sobrenadantes foram r€ em 16% em géis de tricina (Novex) para dar a separação óptima na área de peso molecular baixo. Em paralelo, os sobrenadantes foram concentrados desde 500 microlitros até 20 microlítros usando uma coluna de rotação microcon com um corte de PM de 3kDa. Todas as amostras de pHH387S e pHH3876 mostraram faixas do peptrdeo com o tamanho previsto. As amostras concentradas mostraram as faixas mais proeminentes. foram MAL Dl

Para obter informação mais detalhada, os sobrenadantes analisados usando um espectrómetro de massas de tipo ívoyager DE-pro de Perseptíve Bíosystems).

Para pHH3875, um pico maior foi observado a massas de 4410-4111. Esta é muito aproximada à massa prevista de 4402 para a Plectasína correctamente produzida e processada.

Para pHH3 8 7 6, proeminentes vários picos foram observados. Os dois picos mais foram encontrados a massas de 4411-4413 e 7870- 81 787 1. Novamente o pico 4411 concorda com a Plectasina correctamente processada. 0 pico a 7870 corresponde mars 7 Plectasina semi-processada onde a Pro-regíão não está clivado Plectasina. vários produtos de decomposição com supostamente o pico 7870 foram observados. da Plectasina a partir de pHH3875 e pHH3876

Os sobrenadantes anteríormente descritos foram analisados num ensaio de difusão radial como o descrito no exemplo 5.

Quadro 3. Zona de inibição aproximada (mm).

Plásmideo Normal Concentrado pHH3 902 0 0 pHH3 87 5 5 12 pHH3 87 6 8 14 f Surpreendentemente, pHH3876 produziu a zona de inibição maior indicando ma is produto ou produto com maior actividade quando comparado com pHH3875. -

Rascreio HTP das variantes da Plectasina

Para adicionalmente optrmizar a actividade antimicrobiana da Plectasina, é desejável um ensaio de rastreio de alta capacidade (HTP) para a actividade. Para estabelecer este sistema, as células de levedura que continham o plasmideo de controlo, OHH3902, ou os dois plasmídeos de expressão da Plectasina, ρ Η H 3 8 7 5 e pHH3876, cresceram em placas de mícrotitulaçâo de 96 alvéolos. A uma densidade de célula razoável, cada 5 ou 20 mzcrolitros do cultivo de levedura foram eliminados da placa de rnicrotitulação e utilizados num ensaio de difusão radial como o assento no exemplo 5. Novamente, as zonas de claridade na placa de teste de difusão radial foram evidentes dos sobrenadantes 82 originados a partir das duas estirpes produtoras da Plectasina, cHH3875 e pHH3876. Como foi anteriormente observado, as zonas de claridade foram maiores para os sobrenadantes originados a nartir de pHH3876. Nenhuma zona de claridade foi observada no nlasmídeo de controlo. Isto indica que este simples ensaio oe HTP pode discriminar entre células de levedura que expressam raiveis diferentes de actividades antimi crobiana s, e é travei cara o rastreio das variantes de Plectasina com as actividades desejadas. EXEMPLO 7 í '.onstrução de produção da levedura indutível e sis rastreio HTP para Plectasina - construção de pYES2-3902, (Plectasina) e pHH3887 (Pro-plectasina) tara avaliar os sistemas de expressão índutiveis e o potencial para o estabelecimento de um sistema de selecção por HTP para identificar as variantes da Plectasina com bioactividade melhorada, os vedores de expressão índutiveis que codificam a

pro-plecta foram construídos usando pYES2. p Y E S 2 (Invitrogen) é um vedor de 5.9 kb desenhado para a expressão indutível de proteínas e péptideos recombinantes em

por exemplo um promotor GAL1 de levedura para expressão oe alto nível indutível por galactose e repressão por glicose. A

Três plasrnídeos foram construídos; um plasmídeo de controlo, pYES-3902, e dois plasrnídeos que codificam a Plectasina, pHH3886 e pHH3887. 83

Corno pYES2 é um vector de não fu são, a totalidade das regiões do alfa-líder de pHH3902, pHH3875 e pHH3876 foram amplificadas por PCR numa reacção PCR Standard. Os fragmentos foram realizados em 2 V- qel de; agarose, purificados usando um kit de purifxcacão Qiagen, e restringidos com HíndIII e Xbal, e ligados nos sítios correspondentes no plasmídeo pYES2. Isto coloca o alfa-líder em frente do promotor GAL1 . A mistura de ligação foi trar em E. colí competente. Os transformantes foram recolo filas e vários clones individuais analisados por plasmíc inserção do tamanho correcto. A verificação final foi f sequenciação do AON usando os iniciadores A0P1G7 e AO çlasmídeos foram designados pYES2-3902 (controlo), pHH38 8 6 (Plecrasína) e pHH3887 (Pro-plectasina) . iniciador AOP107: caata taaaa aagct agctt tccg: (SEQ ID NO:22) Iniciador AOP446: ccqgc tgaag ctgct atcgg: (SEQ ID NO:23)

Os três plasmídeos, pYES-3 902, pHH388 6 e pHH3887 foram transformados na estirpe JG169 de levedura, e colocados em placas que continham glicose (0.5%) / galactose (1. > -. A glicose assegura a formação de colónias com um tamanho a^Muado e depois da depleção da glicose, a galactose assegura um crescimento adicional, a indução da transcrição e a produção correspondente da Plectasina. Após a formação das colónias, uma camada fina (aprox. 10e cfu) de uma estirpe indicadora, B. subtilís, cobriu as colónias e as placas foram adicionalmente incubadas durante toda a noite. Como o observado com os outros plasmrdeos de levedura anteriormente descritos, a estirpe de (evedura que continha o plasmídeo de controlo não resultou numa zona de claridade, enquanto que pHH388õ e pHH3887 deram lugar a zonas de claridade. As zonas de claridade maiores foram observadas com pHH3887 que codifica a Pro-plectasina. 84 EXEMPLO 8

Construção da produção da levedura índutível e sistema de rastreío HTP para a Plectasína - construção de bancos de Plectasina mutada

Os bancos de Plectasína mutada foram construídos usando errcr-nrone PCR (tendência ao erro) . Os fragmentos de ADN murados aleatoriamente foram gerados usando os iniciadores pYES-mur e p.HH3885-Rev no molde pHH387S (Pro-plectasina) ou no pHH387 6 s Plectasína) numa reacção PCR que continha 0.5 mM de MnC12. iniciador pYES-mut: raaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgatg gccaagaga 1SEQ ID NO:24)

Iniciador pHH3885-Rev: tqtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga (SEQ ID NO:25)

Os fragmentos foram realizados em 2% de gel de agarose, purificados usando um kit de purificação Qíagen e inseridos no plasmídeo pYES2-3 902. Os plasmídeos foram submetidos a electroporação nas células de levedura competentes JG169.

Os dois bancos diferentes foram colocados em placas de agar grandes (23cm x 23cm) que continham 0.5% de glicose e 1.5% de qaiactose. Após a incubação durante 2 dias a 30 graus Celsius, as placas dos bancos foram cobertas com uma fina camada de agarose que continha aproxidamente 10' cfu de B. subtilis. As placas foram incubadas adicionalmente durante 24 noras a 30 graus Celsius. Cerca de 10,000 colónias foram avaliadas. As colónias de levedura que deram lugar a zonas de claridade significativas foram isoladas para um caracterização adicional. 85

DEPOSITO DO MATERIAL BIOLOGICO O seguinte material biológico foi depositado de acordo com as condições do tratado de Budapeste do Centraalbureau Voor Schirrimelcul tures (CBS), Uppsaialaan 8,3584 CT Utrecht, The

Netherlands (de forma alternativa P.O.Box 85167,3508 AD Utrecht, The Netherlands), e com o seguinte número de depóstio: jepos: Número de inscrição

Data de depósito

Pseudoplectania nigrella CBS 444.97 28 Enero 19 9/ O depósito foi realizado por Novo Nordisk A/S, e mais tarde este foi transferido a Novozymes A/S.

Classificação de Pseudoplectania nígrella:

Eukaryota; Fungí; Ascomycota; Pezizomycotina; Pezizomycet.es ;

Pezizales; Sarcosomataceae; Pseudoplectania. 86 LI3TA DE SEQUENCIAS <11 0> Novozymes A/S 12 0 > Polipéptídeos antimicrobianos i j Π > 10212-WO 25 1 3> Patentln version 3.1 21 0 > Ρ 1 1 > 2 H '· ζ 1 Α > ADN <213> Pseudoplectania nígrella <22 0> t—1 CDS < 2 2 2 > (1) . . (285) < 2 2 3 > <2 2 0> <22 1> sig péptideo < 2 2 2 > íi) ..(69) <2 23> <2 2 0> Λ 0\) mat péptideo < 2 2 2 > (166)..() < 2 2 3 > 4 U U > 1 acg caa ttt acc &CC ate ctc tcc ate ggc ate acc gtc ttc gga ctt Met Gin Phe Γϊιγ Thr lie Leu Ser Ile Gly lie Thr Vâl Phe Gly Leu - 55 -50 ~iS -40 etc aac acc gga gee ttt gea gea ccc cag ect gtt ccc gag gct tac Leu ften Th.r Gly Ala Phe Ala Ala Pro Gin Pro vai Pro Glu Ala Tyr -35 -30 -25 gct gtt tet gat ccc gag gct cat cct gac gat ttt gct sgc atg gat Ala Vai Ser ASp Pro Glu Ala His Pro Asp Aap Phe Ala Gly Met Asp -20 -15 -10 gcg aac caa ctt cag S.S3. cgt gga ttt gga tgc aat ggt cct tgg gat 87

Ala Αεη Gin Leu Gin Lys Arg Gly Phe Gly cys Asr. Gly Pro Trp Asp -5 -1 1 5 gas gat gat atg cag tgc cac aat cac tgc aag tct att aag ggt tac 240 Glu Asp Asp Met Gin cys His Asn Hls Cys Lys Ser Ha Lys Gly Tyr 10 15 20 25 aag gga ggt tat tgt gct aag ggg ggc ttt gtt tgc aag tgt tac tag 2ΘΘ Lye Gly Gly Tyr Cya Ala Lye Gly Gly Phe Vai Cys Lys Cys Tyr 30 35 40

Ala Vai Ser Asp Pro Glu Ala His Pro Asp Asp Pha Ala Gly Met Asp

-20 -15 -1C

Ala Asn cin Leu Gin Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp -5 -11 5

Glu Asp Asp Met Gin Cys Kís Asn His Cys Lys Ser Ile Lya Gly Tyr 10 15 ' 20 25

Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Vai Cya Lys Cys Tyr 30 35 40

< 211 > y 5 <212> PRT <213> Pseudoplectania niqrelia < 2 2 0 >

<221> S_NAL ο 95 PRT ^.2i3> Pseudoplectania nigrella < 4 0 0 > 2 Met Gin PUs Thr Thr ile Leu Ser ile Gly lie -SB -50 -45 Leu Asn Thr Gly Ale. Phe Ala Ala Pro Gin Pro -3S -30 <21 0> <21 2>

Thr Vai Phe Gly Leu -40 Vai Pro Glu Ala Tyr -25 88 . (23)

' 2 2 3 > . 2 2 U > 22 1 > PÉPTIDEO 222> (56)..(95) 1 2 2 3 > <4 00 3

Met Gin phe Thr Thr Ile Leu Ser Ile Gly lie Thr vai Phe Gly Leu 15 10 IS

Leu Asn rhr Gly Ala Phe Ala Ala ?ro Gin Pro Vai Pro Glu Ala Tyr 20 25 30

Ala Vel Ser Aap Pro Glu Ala Hia Pro Aap Aap Phe Ala Gly Met Aap j5 40 <45

Ala Asn Gin Leu Gin Lys Arg Gly Phe Gly Cys Aen Gly Pro Trp Aap 50 55 60

Glu A&p Aap Met Gln*Cys His AStt His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Ç5 70 75 80

Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly 51 y Phe v«l Cys Lys Cys Tyr SS 90 95 ai 2)3 > beq

DM

iasD 89

cgataagcta gcttcacgct gccccaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaageg sq gaacacgtag aaagccagcc cgcagaaaeg gtgctgaccc cçgatgaaog tcagctactg J20 ggccatctgg acaagggaaa aegcaagcgc aaagagaaag caggtagctc gcagcgggcc i$õ tacatggcga cagctagact gggcggtttt atggaeagoa agogaaccgg aattgccagc 240 tggggcgecc cceggtsagg ttgggaagcc otgoaaagta aactggatgg ctttcttgcc 300 gccaaggaCc tg&tggegca ggggatcaag atctgatca* gagacaggat gaggategtc 350 togcatgatt gaaeaag&tg gattgcacge aggttetccg gccgettggg tggagaggct 420 attcggetat gactgggcac aacagacaat cggetgctct gatgccgccg tgttccggct 480 gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgfc caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 540 accccaasat: gaggcagcgc ggctatcgtg gc-ggccacg acgggcgctc cttgcgcagc 600 tgtgctcgac gttgtcacng aagegggaag ggactçgctg ctattgggcg aagtgccggg 660 gcaggatctc cfcgtcatctc accttçctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatge 720 aatgcggcgg rr.gcatsrgc ttg&tccggc taoctgeeca ttcgaecacc aagcgsaaca 780 togcatcgag cgagcacgta ctaggaegga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 840 cgaagagcat caggggctcg cgecagccga actgttegec aggctcaagg cgcggatgcc 900 cgacggcgag catctcgfccg tgacceatgg cgatgcctgc tcgccgaata tcatggtgga 960 aaatggçcgc ttttctggat tcatcgactg tggqçggctg ggtgtggcgg accçccatca 1020 ggaeatagçg ttggctaccc, gtgacattgc tgàâgagctt ggcggcgaat gggctgaccg 2-0B0 cttccccgtg etttacggca tcgcegctcc cgattegeag cgcatcgcct tctategcct n^O 90 tcttgacgag ttettctgag cgggactctg gggttcgcga tgataagctg teaaacatga 1200 ga&ttacaac tt&tatcgta tggggctgac ttcaggtgct acattfcgaag agataaattg 1260 cacfcgaRKtc tagaaatatt ttacc-tgatt aataagatg» tcttcttgag ategctttgg 1320 tctgcgcgca atctcttgct ctgasaaega aaasaccgcc ttgeagggeg gtttttcgaa 13ÔQ ggttctcfcga getaccaact ctttgasccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcaec 1440 aaaacttgtc etttcagttt agccttaacc ggcgeetgac ttcaagacta actcctctaa 1500 atcaateacc agtggctgcc gccagtggtg cttctgcacg tctttceggg ttggactcas 1560 gaegatagtt accggataag gcgcagcggC cggactgaac gggsggttcg tgcatacagt 1620 ccagcttgga gcgaactgcc caccçggesc tgagtgtcag gcgtggaatg agaceaacgc iseo ggccataaca gcggaatgao acoggtaaac cgaaaggcag ga&c&gg&ga gcgcacgagg 1740 gagccgccag gggaaacgcc tggtatcttfc atagtcctgfc cgggtttcgc caccaetgat 1300 ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag sGsggcggag ectatggaaa aacggctttg 1260 ccttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaocg tattaccgcc tttgagtgag 1920 ctgataccgc tegccgcagc cgaaegaccg agogcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 19SQ aagagcgccc aacacgcaaa ocgcctctec ccgcgcgttg gccgatfccat taatgcagct 2040 ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg çaacgcaatt aatgtgagfct 2100 agctcactsa ttaggeaccc· caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 2360 gaatcgtgag cggataacaa tctcacacag gaattcacsg ctatgotage geggccgctc 2220 gacctgcagg catgcaagct tggeactggc cgtcgtttta oaacgtcgtg actgggaaaa 2280 ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cccttcgcca gctggcgtaa 2340 í: agcgaagag gceeggaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga afcggçgaatg 24 00

0> c. .2 1> 303 2 > ADN 91 <213> Pseudoplectania nigrella < 4 0 0 > 5

ggatccacca tgcaatctac caccatcctc tccatcggta tcaecgtOtt cggacttctc SO aacaccggag cctttgcagc accccagcct gttcccgagg cttacgctgt ttctgatccc 120 gaggctcatc ctgacgattt tgctggtatg gatgcgaacc aacttcagaa acgtggattt 180 ggatgcaatg gtccttggga tgaggatgat atgcagtgcc acaatcactg caagtctatt 240 aagggttaea agggaggCta ttgtgctaag gggggctttg tttgcaagtg ttactagctc 300 gag 303 I C > 6 II > 3 61

··· 3 i2> ADN <•..213> Pseudoplectania nigrella <400> 6 ggafcccacca tgcaattfcac caccatcctc tccatcggta tcaecgtett cggacfctctc 60 aaeaccggag cctttgcagc accccagcct gttcccgagg cttacgctgt ttctgatccc 120

gaggctcatc ctgacgattt tgctggtatg gatgcgaaec aacttcagaa acgtggattt iôO ggatgcaatg gtccttggga tgaggatgat atgcagtgcc acasgtaaga atcaettata 240 actatagatt aagccaagag tattggaact gatgataaat agtcactgea agtctattaa 300 gggttacaag ggaggfctatt, gtgct&aggg gggctttgtt tgcaagtgtt actagctega 30o 9 361 < 210 > 7 < 2 11 > 35 < 212 > /A. L) i\l <21 3> Sequência artificial < 2 < 0 > Iniciador 178 < 4 0 0 > η 92 tctggatcca ccatgcaatt taccaccatc ctctc < 2 1 0 > 8 <211> 32 < 2 12 > ADN < 2 13 > < 2 2 0 > Sequência artificial < 2 2 3 > Iniciador 179 <400 > 8 i.ctctcgagc tagtaacact tgcaaacaaa gc <210 > 9 < 2 2 1 > 3 4 < 2 12 > ADN < 2 1 3 > <22 0> Sequência artificial

< 2 2 3 > Iniciador DR3 4F < 4 0 0 > 9 ccgqccatgg gatttggatg caatggtcct tggg 3 < 2 1 0 > 10 <2 11> 48 <212 > ADN < 2 13 > < 2 2 0 > Sequência artificial Ό <P Ό Iniciador DR34R 10 qccqtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc < 210> 11 <: 2 11 > 41 < 2 12 > PRT < 2 1 3 > < 2 2 0 > Sequência artificial < 2 2 3 > rn et-plectasína < 4 0 0 > 11 93

Met Gly Phe Gly Cys Asn, Gly Fro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gin Cys i 5 10 15

His Agn Hls Cys Lyg Ser Ile Lys Gly Tyr Lya Gly Gly Tyr Cys Ala 20 25 30 cys Gly Gly Piie vai Cys cys Cys Tyr 35 40 < 2 1 0 > 12 < 2 11 > 60 < 2 12 > ADN <212> < 2 2 0> Sequência artificiai < 2 2 3 > Iniciadorl < 4 0 0 > 12 attattcaga tgctggatcc gaaaaacctg cgtcgcatta tcc C âtCCc atatc 60 < 2 1 0 > 13 <•211 > 62 < 2 12 > ADN <· 2 13 > <220> Sequência artificial < 2 2 3 > Iniciador2 <4 0 0> 13 aataatctcg agttattagc catatttttt aatgatatgg atg ggataatgcg 60 ac 62 <210 > 14 < 2 11 > 20 < 2 12 > ADN < 2 1 3 > < 2 2 0 > Sequência artificial < 223> IniciadorJ < 4 0 0 > 14 tgctagttat tgctcagcgg < 210 > 15 94 < 2il> 19 < 2 12 > ADN < 2 1 3 > < 2 2 0 > Sequência a-rtificial < 2 2 3 > Inicradorf < 4 0 0 > 15 19 accgtagttg cgcccatcg < 2 1 0 > 16 <211> 2 0 <212 > ADN '·. 213 > <22 0> Sequência artificial < 2 2 3 > Iniciador A < 4 0 0 > 16 aqcgtttgcg gccgcgatcc 20 < 210 > 17

< 211> 21 <212> ADN < 2 1 3 > < 2 2 0 > Sequência artificial < 2 2 3 > Iniciador B < 4 0 0 > 17 c gaaaaggatc c < 2 1 0 > 18 <211> 5 S < 2 1 2 > ADN <2 1 3> o2 2 0> Sequência artificial < 2 2 3 > Iniciador pHH3875-Forw <4 00> 18 qaaggggtat cgatggctaa gagaggattt ggatgcaatg gtccrtggga tgaaq g g

<:210> 19 < 211> 41 -212 > ADN <213> Sequência artificial 95 <22 U> <223> Iniciador pHH3875-Rev < 4 0 0 > 19 cr ragtttct agactagtaa cacttgcaaa caaagccccc c <2 1 0> 20 < 2 11 > 53 <212 > ADN < 2 1 3 > < 2 2 0 > Sequência artificial < 2 2 3 > Iniciador pHH3876-Forw < 4 0 (J > 2 0 gaaggggtat cgatggctaa gagagcaccc cagcctgttc ccgaggctta c 53 < 2 10 > 21 < 2 11 > 41 < 2 12 > ADN < 2 1 3 > <220> Sequência artificial < 2 2 3 > Iniciador pHH3876-Rev < 2 0 0 > 21 cttaqtttct agactagtaa cacttgcaaa caaagccccc c <21 0> 22 < 2 11 > 24 • 1 i 1 > ADN < 2 1 3 > < 2 2 0 > Sequência artificial <2 2 3> Iniciador AOP107 <' 4 0 0 > 22

caatacaaaa aaqctagctt tccg <210> 23 <2 i1> 2 0 <2 12 > ADN <21 3> <22 u> Sequência artificial <2 2 3> Iniciador AOP446 < 4 0 0 > 23 96 20 cggct gaag c 2 i 0 > 2 4 Z j '> s Q 21 2 > ADN 213> Sequên 2 zl 0 > ? 2 3 > 4 U 0 > 24 â ci u l G ctac t 211 > 4 2 2 i 2 > ADN Z 1 Z -> Sequên ,Λ . 223> Inicia 4 0 0 > 2 5 dor pYES-mut igceagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgat .Ciâ. qtaagcqtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga rsboa, 18 de Janeiro de 2007.

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES I. Um Pclipéptideo com activiciade antimicrobiana, seleccicnacd· cc grupo caracterizado por ser composto por: ' aum pclipéptideo que compreende uma sequência de aminoácidos oue tem pelo menos 65% de identidade com os aminoácidos 1 o 4 n da SEQ ID NO:2; d:m um pclipéptideo que está codificado por uma sequência de nucleótidcs que é hibridizado em condições de adstringência media, usando para a lavagem 0,2 x SSC a 42§C, com uma sonda de polinucleótídos seleccionada do grupo composto por: (r) uma cadeia complementar dos nucleótidos 166 a 285 da SEQ ID NO: 1, (ri) uma cadeia complementar dos nucleótidos 70 a 285 da SEQ ID N O : 1, e uiii uma cadeia complementar dos nucleótidos 1 a 285 da SEQ ID NO:1; e iade antimicrobiana um fragmento de (a) ou (b) com act
2. 2. Om polipéptideo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por este compreender uma sequência de aminoácidos oue tem pelo menos 70% de identidade com os aminoácidos 1 a 40 cia SEQ ID 170:2, preferencialmente pelo menos 80% de identidade, oeic menos 85s de identidade, pelo menos 90% de identidaoe, peio menos 95%. de identidade, ou pelo menos 99% de identidade com os aminoácidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2, . 'Jrr, Fclipéptideo de acordo com a reivindi ~c 2, caracterizado por este compreender os aminoácioos la da 2 ΞQ I D MO:2. 4. dm Polxpéprideo de acordo com quaisquer das reivinaicacces oe 1 a 3, caracterizado por este estar composto com os aminoacidos 1 a 40 da SEQ ID NO:2. 1. Um Polrpéptideo de acordo com a reivindicação i, caracterizado por este estar codificado com uma sequência de nucleótxdos que foi hrbndízado sob condições de adstringência média-alta, usando para a lavagem 0.2 x SSC a 55°C, oreferencialmente em condições de adstringência alta, usando para a lavagem 0.1 x SSC a 60°C, com uma sonda de polinucleótidos seleccionada do grupo composto por: : i) uma cadeia complementar dos nucleótidos 166 a 285 da SEQ IC MO : 1, Sn) uma cadeia complementar dos nucleótidos 70 a 285 da SEQ IC MO:1, e dm) uma cadeia complementar dos nucleótidos i a 28o da SEQ ID 7 Urr. pclinucleótido com uma sequência de nucleocidos caracterizado por este codificar o polipéptideo definido em quaisquer das reivindicações de 1 a 6. 1 . orna construção de ácidos nucleicos caracterizado por compreender a sequência de nucleótidos definida na reivmdic u iiqada funcionaimenre a uma ou mais sequências de comício dirigem a produção do polipéptideo num hospedeiro adequaao.
3. 9, Um vector de expressão recombínante caracterizado por este compreender a construção dos ácidos nucleicos definidos na reivindicação 8.
4. 10. Uma célula hospedeira recombínante caracterizada por esta compreender a construção dos ácidos nucleicos definidos na reivindicação 8.
5. 11. Um método para a produção de um polipéptideo como o definido em quaisquer das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por este método compreender: : a) o cultivo de uma estirpe, que na sua forma selvagem é capaz de produzir o polipéptideo, para produzir o polipéptideo; e vo; a recuperação do polipéptideo.
6. 12, Um método para a produção de um polipéptideo como o definido em quaisquer das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por o método compreender: P d Γ cá cí !a; o cultivo de uma célula hospedeira recombínante como o definido na reivindicação 10 sob condições propícias orodacão do polipéptideo; e ui; a recuperação do polipéptideo. "t L.:. Um método para matar ou inibir o crescimento das células rierofcranas que nâo é um mérodo para c tratamento terapêutico cara o corpo humano ou animal, caracterizado por o nercao sr o contacto das células microbianas com um de o antímicrobiano como o definido em quaisquer das ações de 1 a 6.
7. 11. Um Pclipéptrdeo antimrcrobiano como o definido em quaisquer das reivindicações de 1 a 6 caracterizado por este ser utilizado como um medicamento.
8. 15. A utilização de um poiipéptideo antimicrobiano corno o definido em quaisquer das reivindicações de 1 a 6 caracterizado por este ser utilizado na preparação de um agente terapêutico humano ou veterinário para o tratamento de uma infecção microbiana ou para o uso profiláctico.
9. 16. A utilização, de pelo menos um poiipéptideo antimicrobiano como o definido em quaisquer das reivindicações de 1 a 6 caracterizado por este ser utilizado em alimentos para animais. Lisboa, 18 de Janeiro de 2007. Pela Requerente O Agente Oficiai 4