ES2334792T3 - Polipeptidos antimicrobianos. - Google Patents

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Abstract

Polipéptido con actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos: G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z; donde **(Ver fórmula)** donde **(Ver fórmula)** y donde los aminoácidos que componen los polipéptidos son independientemente seleccionados de formas D o L.

Description

Polipéptidos antimicrobianos.
Antecedentes
En los últimos años, la variedad de agentes antimicrobianos ha aumentado sustancialmente, con un aumento paralelo en microorganismos patógenos resistentes. La resistencia ahora es reconocida frente a todos los agentes antimicrobianos clínicamente disponibles. La respuesta a la resistencia antimicrobiana en la comunidad médica ha sido usar antibióticos nuevos o alternativos no usados previamente contra las bacterias resistentes. Este enfoque ha requerido el desarrollo continuo de antibióticos nuevos, bien como modificaciones de compuestos existentes actualmente o como combinaciones de compuestos que pueden inhibir o eludir los mecanismos de resistencia bacteriana.
WO 01/12668 expone péptidos antimicrobianos truncados, que están basados en SMAP29 y RCAP18, pero que contienen una cantidad inferior de residuos de aminoácidos que aún así retienen actividad bactericida. Además, se describen los péptidos sintéticos basados en la proteína SMAP 29 que tienen menos residuos de aminoácidos e incluyen sustituciones.
WO 96/09322 expone el uso de PR-39 y derivados de los mismos, al igual que otra prolina y péptidos antimicrobianos ricos en arginina, colectivamente denominados "sinducinas", en la modulación de cicatrización de heridas.
Tossi et al. "Identification and characterization of a primary antibacterial domain in CAP18, a lipopolysaccharide binding protein from rabbit leukocytes", FEBS Left, Vol. 339 (1-2), 108-112 (1994) expone estudios de predicción de estructura secundaria en CAP18, que identificaron una secuencia de 21 residuos altamente catiónicos con la tendencia a adoptar una conformación alfahelicoidal amfipática, como se observa en muchos péptidos antimicrobianos.
Tossi et al. "Design of synthetic antimicrobial peptides based on sequence analogy and amphipathicity", Eur J Biochem, Vol. 250 (2), 549-558 (1997) expone péptidos antimicrobianos alfa helicoidales, que fueron concebidos comparando las secuencias N-terminales de muchos de estos péptidos de insecto, rana y familias de mamíferos, extrayendo características comunes y creando patrones de secuencias con los cuales diseñar péptidos activos.
Tossi et al. "Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides", Biopolymers, Vol. 55 (1), 4-30 (2000) expone un análisis comparativo de muchas secuencias peptídicas antimicrobianas alfa-helicoidales y proporciona información adicional sobre cómo estos parámetros están distribuidos e interrelacionados.
Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos nuevos que tengan actividad antimicrobiana mejorada y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos.
Resumen
En un primer aspecto la invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos:
G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-R-X_{4}-X_{5}-X_{6}-K-I-X_{7}-X_{8}-K-X_{9}-X_{10}-K-X_{11}-X_{12}-Z;
donde
\vskip1.000000\baselineskip
101 
\newpage
donde
102
En un segundo aspecto la presente invención se refiere a polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un constructo de ácidos nucléicos que comprenden la secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la invención, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en el huésped adecuado.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos de la invención.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos de la invención.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de la invención. El método comprendiendo:
(a)
cultivo de una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y
(b)
recuperación del polipéptido.
Otros aspectos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción a continuación y de las reivindicaciones anexas.
Definiciones
Antes de discutir la presente invención en más detalle, se definirán primero los siguientes términos y convenciones:
Actividad antimicrobiana: el témino "actividad antimicrobiana" es definido en la presente como una actividad que es capaz de matar células microbianas o de inhibir su crecimiento. En el contexto de la presente invención, el término "antimicrobiano" significa que hay un efecto bactericida y/o bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o un efecto virucida, donde el término "bactericida" debe ser entendido como capaz de matar células bacterianas. El término "bacteriostático" debe ser entendido como capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir, inhibir las células bacterianas en crecimiento. El término "fungicida" debe ser entendido como capaz de matar células fúngicas. El término "fungistático" debe ser entendido como capaz de inhibir el crecimiento fúngico, es decir, de inhibir las células fúngicas en crecimiento. El término "virucida" debe ser entendido como capaz de inactivar virus. El término "células microbianas" denota células bacterianas o fúngicas (incluidas las levaduras).
En el contexto de la presente invención, la expresión "inhibir el crecimiento de células microbianas" se utiliza para significar que las células están en el estado de no crecimiento, es decir, que éstas no son capaces de propagarse.
Para los fines de la presente invención, la actividad antimicrobiana puede ser determinada según el procedimiento descrito por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, vol. 137 (2) págs. 167-174 (1991).
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir la cantidad de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa de 1%(p/p); de forma más preferible en una solución acuosa de 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de 0,1%(p/p) de los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana.
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente cuando se añade en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente, cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de forma más preferible, cuando se añade en una concentración de 50 ppm; y en particular, cuando se añade en una concentración de 25 ppm.
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir la cantidad de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa de 1%(p/p); de forma más preferible en una solución acuosa de 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de 0,1%(p/p) de los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana.
Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, añadido en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente añadido en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente añadido en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente añadido en una concentración de 100 ppm; de forma más preferible, añadido en una concentración de 50 ppm; y en particular, añadido en una concentración de 25 ppm.
Los polipéptidos de la presente invención preferiblemente deberían tener como mínimo un 20% de la actividad antimicrobiana del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de la SEC ID NO:2 a la SEC ID NO:57 o aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69. En una forma de realización particular preferida, los polipéptidos deberían tener como mínimo un 40%, tal como al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, tal como al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, tal como al menos un 90%, de forma más preferible al menos un 95%, tal como aproximadamente o al menos un 100% de la actividad antimicrobiana del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de la SEC ID NO:2 a la SEC ID NO:57 o aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69.
Variante alélica: en el presente contexto, el término "variante alélica" denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutación y puede producir polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" según se utiliza en este caso, se refiere a una preparación de polinucleótido, donde el polinucleótido ha sido eliminado de su ambiente genético natural, y de este modo, no tiene otras secuencias codificantes extrañas o indeseadas y está en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de proteínas creadas genéticamente. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo 10% en peso de otro material polinucleótido con el cual está asociado originalmente (se prefieren porcentajes inferiores de otro material polinucleótido, p. ej. como máximo 8% en peso, como máximo 6% en peso, como máximo 5% en peso, como máximo 4% como máximo 3% en peso, como máximo 2% en peso, como máximo 1% en peso, y como máximo ½% en peso). No obstante, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tal como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro tenga como mínimo un 92% de pureza, es decir, que el polinucleótido constituya al menos 92% en peso del material de polinucleótido total presente en la preparación, y se prefieren porcentajes más altos tal como al menos un 94% de pureza, al menos un 95% de pureza, al menos un 96% de pureza, al menos un 96% de pureza, al menos un 97% de pureza, al menos un 98% de pureza, al menos un 99%, y como máximo un 99,5% de pureza. Los polinucleótidos descritos en la presente están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleóidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura", es decir que la preparación de polinucleótido esté esencialmente sin otro material polinucleótido con el cual esté originalmente asociada. En la presente, el término "polinucleótido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polinucleótido aislado" y "polinucléotido en forma aislada".
Modificación/es: en el contexto de la presente invención el término "modificación/es" significa la modificación química del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-R-X_{4}-X_{5}-X_{6}-K-I-X_{7}-X_{8}-K-X_{9}-X_{10}-K-X_{11}-X_{12}-Z; donde X_{1} = L o R; X_{2} = L, V, I o F; X_{3} = R o K; X_{4} = L, V, I o F; X_{5} = R, K, W o G; X_{6} = K, R, G, M, N o E; X_{7} = G, R, K o e; X_{8} = G, R, K o E; X_{9} = L o F; X_{10} = K o R; X_{11} = I, L, F, C o Y; X_{12} = G, A o T; Z = R o X_{13}-X_{14}-I-K-X_{15}-X_{16}-X_{17}-X_{18}-L-V-P; donde X_{13} = q, L o P; X_{14} = K, L, M, L o V; X_{15} = P, un, H, N o d; X_{16} = I o L; X_{17} = R, H, Q o P; X_{18} = I o K; o la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de la SEC ID NO:2 a la SEC ID NO:57 o aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69, donde la/las modificación/es pueden ser amidaciones, tal como la amidación del C-término.
ADNc: el término "ADNc" usado en el presente contexto, intenta cubrir una moléculula de ADN que puede ser preparada por transcripción inversa de una molécula de ARNm madura cortada derivada de una célula eucariótica. El ADNc carece de las secuencias de intrón que normalmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN primaria inicial es un precursor para ARNm y atraviesa una serie de eventos de tratamiento antes de aparecer como ARNm maduro cortado. Estos eventos incluyen la eliminación de secuencias de intrón por un proceso llamado empalme. Cuando el ADNc es derivado de ARNm, en consecuencia carece de secuencias de intrón.
Constructo de ácidos nucléicos: según se utiliza en la presente, el término "contructo de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, mono o bicatenaria, que es aislada de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácidos nucleicos de un modo que, de lo contrario no existiría en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucléicos es sinónimo del término "cassette de expresión" cuando el constructo de ácidos nucléicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
Secuencia de control: el término "secuencias de control " se define en la presente para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea a la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, secuencia de poliadenilación líder, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de transcripción y de traducción. Las secuencias de control pueden ser provistas de ligadores con el fin de introducir sitios específicos de restricción que faciliten la ligadura de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de nucleátidos que codifican un polipéptido.
Operativamente enlazado: el término "operativamente enlazado" es definido en la presente como una configuración en la cual una secuencia de control es apropiadamente colocada a una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de manera que la secuencia de control dirija la expresión de un polipéptido.
Secuencia codificante: según se utiliza en la presente, el término "secuencia codificante" cubre una secuencia de nucleótidos que directamente especifica la secuencia de aminoácidos de su producto de proteína. Los límites de la secuencia codificante generalmente son determinados por un marco abierto de lectura que normalmente se inicia con el codón de iniciación ATG. La secuencia codificante normalmente incluye ADN, ADNc y secuencias de nucleótidos recombinantes.
Expresión: en el presente contexto, el término "expresión" incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido que incluye, de modo enunciativo y no limitativo, transcripción, modificación postranscripcional, traducción y modificación postraduccional. Preferiblemente, la expresión también comprende la secreción del polipéptido.
Vector de expresión: en el presente contexto, el término "vector de expresión" cubre una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de la invención, y que está operativamente enlazado a segmentos adicionales que propician su transcripción.
Célula huésped: el término "célula huésped", según se utiliza en este caso, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible a la transformación con un constructo de ácidos nucléicos.
Los términos, "sonda de polinucleótidos", "hibridización" al igual que las diferentes condiciones de astringencia son definidos en la sección titulada "Polipéptidos con actividad antimicrobiana".
Descripción detallada Polipéptidos con actividad antimicrobiana
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana y en los cuales el polipéptido comprende, preferiblemente consiste en la secuencia de aminoácidos:
G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-R-X_{4}-X_{5}-X_{6}-K-I-X_{7}-X_{8}-K-X_{9}-X_{10}K-X_{11}-X_{12}-Z;
donde X_{1} = L o R; X_{2} = L, V, I o F; X_{3} = R o K; X_{4} = L, V, I o F; X_{5} = R, K, W o G; X_{6} = K, R, G, M, N o E; X_{7} = G, R, K o E; X_{8} = G, R, K o E; X_{9} = L o F; X_{10} = K o R; X_{11} = I, L, F, C o Y; X_{12} = G, A o T; Z = R o X_{13}-X_{14}-I-K-X_{15}-X_{16}-X_{17}-X_{18}L-V-P; donde X_{13} = Q, L o P; X_{14} = K, I, M, L o V; X_{15} = P, A, H, N o D; X_{16} = I o L; X_{17} = R, H, Q o P; X_{18} = I o K; o aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de SEC ID NO:2 a SEC ID NO:57 o aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69.
El término "cualquiera de SEC ID NO:2 a SEC ID NO:57" significa SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4,
SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11,
SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:15, SEC ID NO:16, SEC ID NO:17, SEC ID NO:18, SEC ID NO:19, SEC ID NO:20, SEC ID NO:21, SEC ID NO:22, SEC ID NO:23, SEC ID NO:24, SEC ID NO:25, SEC ID NO:26, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO:29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:31, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:36, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO:40, SEC ID NO:41, SEC ID NO:42, SEC ID NO:43, SEC ID NO:44, SEC ID NO:45, SEC ID NO:46, SEC ID NO:47, SEC ID NO:48, SEC ID NO:49, SEC ID NO:50, SEC ID NO:51, SEC ID NO:52, SEC ID NO:53, SEC ID NO:54, SEC ID NO:55, SEC ID NO:56 o SEC ID NO:57.
El término "cualquiera de SEC ID NO:58 a SEC ID NO:69" significa SEC ID NO:58, SEC ID NO:59, SEC ID NO:60, SEC ID NO:61, SEC ID NO:62, SEC ID NO:63, SEC ID NO:64, SEC ID NO:65, SEC ID NO:66, SEC ID NO:67, SEC ID NO:68 o SEC ID NO:69.
Preferiblemente, los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEC ID NO:2 a la SEC ID NO:57 o la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69. En otra forma de realización preferida, el polipéptido de la presente invención comprende aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de la SEC ID NO:2 a la SEC ID NO:57 o aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69. En una forma de realización preferida adicional, el polipéptido consiste en los aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de la SEC ID NO:2 a la SEC ID NO:57 o los aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69.
Los aminoácidos que componen los polipéptidos de la invención pueden ser seleccionados independientemente de las formas D o L.
Extensión N-terminal
Una extensión N-terminal de los polipéptidos de la invención pueden consistir de manera adecuada de 1 a 50 aminoácidos, preferiblemente 2-20 aminoácidos, especialmente 3-15 aminoácidos. En una forma de realización la extensión de péptido N-terminal no contiene una Arg (R). En otra forma de realización, la extensión N-terminal comprende un sitio de corte de tipo kex2 o kex2 como se definirá con más detalle a continuación. En una forma de realización preferida, la extensión N-terminal es un péptido, que comprende al menos dos residuos de aminoácidos Glu (E) y/o
Asp (D), tales como una extensión N-terminal que comprende una de las siguientes secuencias: EAE, EE, DE y DD.
Sitios Kex2
Los sitios Kex2 (ver, p. ej., Methods in Enzymology vol. 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") y los sitios de tipo kex2 son sitios de reconocimiento di-básicos (es decir, sitios de corte) encontrados entre la región codificante de pro-péptidos y la región madura de algunas proteínas.
La inserción de un sitio kex2 o un sitio de tipo kex2, ha mostrado en casos determinados, que mejora el tratamiento correcto de endopeptidasa en el sitio de corte propéptido dando como resultado niveles aumentados de secreción de proteína.
En el contexto de la invención, la inserción de un sitio kex2 o de tipo kex2 supone la posibilidad de obtener corte en una posición determinada en la extensión N-terminal dando como resultado un polipéptido antimicrobiano que es extendido en comparación con el polipéptido maduro mostrado como la secuencia de aminoácidos: G-X_{1}-X_{2}-X_{3}R-X_{4}-X_{5}X_{6}K-I-X_{7}-X_{8}K-X_{9} X_{10}-K-X_{11}-X_{12}-Z; donde X_{1} = L o R; X_{2} = L, V, I o F; X_{3} = R o K; X_{4} = L, V, I o F; X_{5} = R, K, = K o R; X11 = I, L, F, C o Y; X12 = G, A o T; Z = R o X13 -X14 -I-K-X15 X15 X17 W o G; X_{6} = K, R, G, M, N o E; X_{7} = T, R, K o E; X_{8} = G, R, K o r; X_{9} = L o F; X_{10} X_{18} L-V-P; donde X_{13} = Q, L o P; X_{14} = K, I, M, L o V; X_{15} = P, A, H, N o D; X_{16} = I o L; X_{17} = R, H, Q o P; X_{18} = I o K; o aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de SEC ID NO:2 a SEC ID NO:57 o aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de SEC ID NO:58 a SEC ID NO:69.
Polipéptidos fusionados
Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos escindibles de fusión donde otro polipéptido es fusionado en el N-términal o el C-terminal del polipéptido de la invención. Un polipéptido fusionado es producido fusionando una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidos en la técnica e incluyen el ligamiento de las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén dentro del marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor o promotores y terminador.
Secuencias de nucleótidos y polinucleótidos
La presente invención también se refiere a polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. En particular, la presente invención se refiere a polinucleótidos que consisten en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. Debido a la degeneración del código genético, el experto en la materia fácilmente reconocerá que diferentes secuencias de nucleótidos que codifican cada uno de los polipéptidos de la invención pueden ser preparados. Es bien conocido en la técnica que los nucleótidos componen codones que codifican aminoácidos de los polipéptidos de la invención.
La secuencia de nucleótidos puede ser obtenida por procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de nucleótidos de una ubicación a un sitio diferente donde será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento deseado que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde múltiples copias o clones de la secuencia de nucleótidos será replicada. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.
Además, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser modificada por introducción de sustituciones de nucleótidos que no den lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponda al uso de codón del organismo huésped destinado para la producción de la enzima.
La introducción de una mutación en la secuencia de nucleótidos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por mutagénesis dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Particularmente útil es el procedimiento, que utiliza un vector de ADN bicatenario superenrollado con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario a cadenas opuestas del vector, se extienden durante la variación cíclica de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. Con la incorporación de los cebadores, se genera un plásmido mutado que contiene cortes en bisel. Después de la variación cíclica de la temperatura, el producto es tratado con DpnI que es específico para ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y para seleccionar ADN sintetizado conteniendo una mutación. También se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica. Para una descripción general de sustitución de nucleótidos, ver, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Constructos de ácidos nucleicos
La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulada en una variedad de modos para propiciar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de nucleótidos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.
La secuencia de control puede ser una secuencia de promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de nucleótidos. La secuencia de promotor contiene secuencias de control transcripcional, que media la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluidos los promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede ser obtenido de genes que codifican polipétidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, gen alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gen alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gen de penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y gen procariótico de betalactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Otros promotores son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, o glucoamilasa de (glaA) Aspergillus niger o Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae) y promotores híbridos, mutantes y truncados de los mismos.
En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para las células huéspedes de levadura son descritas por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control puede también ser una secuencia del terminador de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.
Los terminadores preferidos para células huéspedes fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillusde niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huéspedes de levadura son descritas por Romanos et al., 1992, supra.
La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al término 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. En la presente invención se puede utilizar cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped de elección.
Líderes preferidos para las células huéspedes fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
Líderes adecuados para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato-quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al 3' terminal de la secuencia de nucleótidos y que, transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. En la presente invención se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes fúngicas filamentosas son obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa glucosidasa de Aspergillus niger.
Las secuencias de poliadenilación útiles para las células huéspedes de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifique una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino de un polipéptido y dirija el polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede contener intrínsecamente una región codificante del péptido señal naturalmente enlazada en marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es foránea a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal foráneo puede ser requerida donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una región codificante del péptido señal. De forma alternativa, la región codificante del péptido señal foráneo puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para aumentar la secreción del polipéptido. No obstante, en la presente invención se puede utilizar cualquier región codificante del pétido señal que dirige el polipétido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección.
Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes fúngicas filamentosas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa.
Los péptidos señal útiles para las células huéspedes de levadura son obtenidas de los genes para factor alfa Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes del péptido señal útiles son descritas por Romanos et. al., 1992, supra.
La secuencia de control también puede ser una región codificante del propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido generalmente está inactivo y puede ser convertido en un polipéptido maduro activo por ruptura catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido puede ser obtenida de los genes para proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, proteasa neutra (npr7) de Bacillus subtilis, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
Donde están presentes tanto el péptido señal como las regiones de propéptido en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.
También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que causan que la expresión del gen sea activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida de la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas de operador lac, tac y trp. En la levadura, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, se pueden utilizar el promotor de TAKA alfa amilasa, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son los que permiten amplificación genética. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrofolato-reductasa que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido estaría operativamente enlazada con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden el constructo de ácidos nucléicos de la invención. Las distintas secuencias de control y nucleótidos anteriormente descritos pueden ser unidos para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. De forma alternativa, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser expresada insertando la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucléicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante está localizada en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual el mismo será introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial.
El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, introducido en la célula huésped, es integrado en el genoma y replicado con el/los cromosoma/s en que ha sido integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que será introducido en el genoma de la célula huésped o un transposón.
Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen, cuyo producto proporciona resistencia a virus o biocidas o resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos y similares.
Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), nlaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferase), trpC (antranilato sintasa) y equivalentes de los mismos.
Para el uso en una célula de Aspergillus se prefieren los el genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.
Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento o elementos que permiten la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de nucleótidos adicionales permiten al vector ser integrado en el genoma de la célula huésped en una ubicación o ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integradores deberían contener preferiblemente un número suficiente de nucleótidos, tal como 100 a 1500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1500 pares de bases y, de forma más preferible, 800 a 1500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integradores pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integradores pueden ser secuencias de nucleótidos codificantes o no codificantes. En cambio, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector además puede comprender un origen de replicación que permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110; pE194; pTA1060 y pAM\beta1 que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que hace su funcionamiento sensible a la temperatura en la célula huésped (ver, p. ej., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Más de una copia de una secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. Se puede obtener un aumento en la cantidad de copias de la secuencia de nucleótidos integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable y amplificable con la secuencia de nucleótidos donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y de ese modo copias adicionales de la secuencia de nucleótidos, pueden ser seleccionadas cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
Los procedimientos usados para enlazar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son conocidos por el experto en la técnica (ver, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).
Células huéspedes
La presente invención también se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos de la invención, que es ventajosamente usado en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos de la presente invención es introducido en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se autoduplica como se describe anteriormente.
La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo no unicelular,p. ej., un eucariota.
Células unicelulares útiles son las células bacterianas tales como bacterias gram positivas que incluyen, de modo enunciatito y no limitativo, una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o Streptomices murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En una forma de realización preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis. En otra forma de realización preferida, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico.
La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplasto (ver, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (ver, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).
La célula huésped puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta, o fúngica.
En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos", según se utiliza en este caso, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (según lo definen Hawksworth et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) al igual que el Oomycota (según se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).
En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" según se utiliza en este caso incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura de los Hongos Imperfectos (Blastomycetes). Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura será definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9,1980).
En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.
En una forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización preferida, la célula huésped de levadura es una célula Kluyveromyces lactis. En otra forma de realización preferida, la célula huésped de levadura es una célula Yarrowia lipolytica.
En otra forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como lo definen Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos son caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae que es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de una especie, de modo enunciativo y no limitativo, de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma.
En un más forma de realización preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra forma de realización preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otra forma de realización preferida, la célula madre fúngica filamentosa es una célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). En otra forma de realización preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de los protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus son descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium son descritas por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
Métodos de producción
La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en matraz de agitación, de fermentación a pequeña escala o gran escala (incluidas las fermentaciones continuas, discontinuas, alimentadas o de estado sólido) en laboratorio o en fermentadores industriales realizado en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, puede ser recuperado de lisatos celulares.
Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimátco, o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido como se describe en este caso.
El polipéptido resultante puede ser recuperado por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluidos, de modo enunciativo y no limitativo, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica inlcuidos, de modo enunciativo y no limitativo, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., enfoque isoeléctrico preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (ver, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).
Plantas
La presente invención también se refiere a una planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido puede ser recuperado de la planta o parte de planta. De forma alternativa, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido recombinante puede ser usada como tal para mejorar la calidad de un alimento o alimentos, p. ej., mejorar el valor nutritivo, la apetencia y las propiedades reológicas o para destruir un factor antinutritivo. El polipéptido, planta o parte de planta recuperado también puede ser usado para mejorar o alterar la flora digestiva en animales y ganado.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot.) o monocotiledónea (una monocot.). Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de prados (poa pratense, Poa), hierba forrajera tal como festuca, lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, p. ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y mazorca (maíz).
Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, patata, remolacha azucarera, leguminosas, tales como altramuces, guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia de las Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.
Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raiz, frutas, semillas y tubérculos. También, tejidos de planta específicos, tales como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y citoplasma son considerados una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, es considerada una parte de la planta.
También se encuentra incluido dentro del campo de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de la planta y células vegetales.
La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención puede ser construida conforme a métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal es construida incorporando uno o más constructos de expresión que codifiquen un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y propagando la planta o célula vegetal modificada resultante en una planta o célula vegetal transgénica.
Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención enlazado operativamente con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o parte de planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huéspedes en las cuales el constructo de expresión ha sido integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (éste depende del método de introducción de ADN que se utilice).
La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias de promotor y terminador y opcionalmente secuencias señal o de tránsito es determinada, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea que el polipéptido sea expresado. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, de fase o específica del tejido, y el producto genético puede ser dirigido a un tejido específico o parte de planta como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
Para la expresión constitutiva, se puede usar el promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294). Promotores específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumideros de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vida faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína estructural de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de una proteína de almacenamiento de Brassica napus, u otro promotor cualquiera específico de semillas conocido en la técnica, p. ej., como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de la hoja tal como el promotor de rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102 991-1000, el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus de chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor aldP del gen del arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promo-
tor inducible por herida tal como el promotor pin2 de patata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).
También puede utilizarse un elemento intensificador de promotor para conseguir una expresión más alta de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador de promotor puede ser un intrón que es colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra describen el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para aumentar la expresión.
El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión puede ser elegido de los que se encuentran disponibles en la técnica.
El constructo de ácidos nucléicos es incorporado en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluida la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium turnefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, ver Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38). No obstante, también puede ser usado para transformar monocotiledóneas, aunque generalmente se prefieren otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o de tungsteno revestidas con el ADN transformador) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.
Después de la transformación, los transformantes que tienen incorporado el constructo de expresión son seleccionados y regenerados en plantas enteras según los métodos bien conocidos en la técnica.
La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) el cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
Composiciones
En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden un polipéptido antimicrobiano de la invención.
La composición puede comprender un polipéptido de la invención como el componente polipeptidico más importante, p. ej., una composición monocomponente. De forma alternativa, la composición puede comprender actividades enzimáticas mútiples, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, glicosiltransferasa de ciclodextrina, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolitica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolitica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.
Las composiciones pueden además comprender otro agente farmacéuticamente activo, tal como un agente biocida adicional, tal como otro polipéptido antimicrobiano que muestre actividad antimicrobiana como se ha definido anteriormente. El agente biocida puede ser un antibiótico, como se conoce en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, p. ej. penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, p. ej., cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicósidos; tetraciclina; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. El agente biocida también puede ser un agente antimicótico, incluidos los polienos, p. ej. anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azoles, p. ej. miconazol, quetoconazol, itraconazol y fluconazol.
En una forma de realización el agente biocida es un agente químico no enzimático. En otra forma de realización el agente biocida es un agente químico no polipéptido.
El agente biocida debe ser capaz de reducir la cantidad de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblementé después de 2 horas, de forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa del 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa del 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa del 1%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa del 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa del 0,1%(p/p) del agente biocida.
El agente biocida también puede ser capaz de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, añadido en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente añadido en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente añadido en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente, añadido en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible, añadido en una concentración de 50 ppm; y en particular, añadido en una concentración de 25 ppm.
El agente biocida también puede ser capaz de reducir la cantidad de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de forma más preferible, después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa die 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa del 10%(p/p).
El agente biocida también puede ser capaz de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, añadido en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente añadido en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente añadido en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente añadido en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible, añadido en una concentración de 50 ppm; y en particular, añadido en una concentración de 25 ppm.
Las composiciones pueden comprender un material de portador adecuado. Las composiciones también pueden comprender un vehículo de entrega adecuado capaz de entregar los polipéptidos antimicrobianos de la invención a la localización deseada cuando las composiciones son usadas como un medicamento.
Las composiciones pueden ser preparadas conforme a los métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que se incluirá en la composición puede ser estabilizado conforme a métodos conocidos en la técnica.
Más abajo se presentan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las cuales se utiliza la composición pueden ser determinadas basándose en métodos conocidos en la técnica.
Métodos y Usos
La presente invención también incluye varios usos de los polipéptidos antimicrobianos de la invención. Los polipéptidos antimicrobianos habitualmente son útiles en cualquier localización sometida a contaminación por bacterias, hongos, levadura o algas. Normalmente, las localizaciones están en sistemas acuosos tales como sistemas de agua de refrigeración, agua de enjuague de lavandería, sistemas de aceite tales como aceites de corte, lubricantes, campos de aceite y similares, donde es necesario matar los microorganismos o donde es necesario controlar su crecimiento. No obstante, la presente invención también puede ser usada en todas las aplicaciones para las cuales son útiles las composiciones antimicrobianas conocidas, tales como protección de la madera, látex, adhesivo, cola, papel, cartón, textil, cuero, plástico, enmasillado y piensos.
Otros usos incluyen conservación de alimentos, bebidas, cosméticos tales como lociones, cremas, geles, pomadas, jabones, champús, acondicionadores, antitranspirantes, desodorantes, enjuagues bucales, productos de lentes de contacto, formulaciones enzimáticas o ingredientes alimentarios.
Así, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser útiles como un desinfectante, p. ej., en el tratamiento del acné, infecciones en los ojos o la boca, infecciones cutáneas; en antitranspirantes o desodorantes; en sales de pediluvio; para limpiar y desinfecctar lentes de contacto, superficies duras, dientes (cuidado bucal), lesiones, magulladuras y similares.
En general, está contemplado que los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención sean útiles para la limpieza, la desinfección o la inhibición del crecimiento microbiano en cualquier superficie dura. Ejemplos de superficies, que pueden ser contactadas ventajosamente con los polipéptidos antimicrobianos de la invención son superficies de equipamiento de proceso usado p. ej. plantas de procesamiento de productos lácteos, químicos y farmacéuticos, sistemas de saneamiento de agua, plantas de procesamiento de aceite, plantas de procesamiento de pasta de papel, plantas de tratamiento de agua, y torres de refrigeración. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención deben ser usados en una cantidad que sea eficaz para limpiar, desinfectar o inhibir el crecimiento microbiano en la superficie en cuestión.
Además, está contemplado que los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser usados ventajosamente en un sistema de limpieza en sitio (C.I.P.) para limpiar el equipamiento de proceso de cualquier tipo.
Los polipéptidos antimicrobianos de la invención además pueden ser usados para limpiar superficies y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimentos y en cualquier área donde se preparan y sirven alimentos tales como hospitales, clínicas, restaurantes, especialmente restaurantes de comida rápida, delicatessens y similares. También puede ser usado como un antimicrobiano en productos alimentarios y sería especialmente útil como un antimicrobiano de superficies en quesos, frutas y verduras y alimentos en barras de ensaladas.
También puede ser usado como un agente de conservación o un agente de desinfección en pinturas a base de agua.
Los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención también son útiles para el control microbiano de líneas de agua, y para desinfección del agua, en particular para desinfección de agua industrial.
La invención también se refiere al uso de un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención como un medicamento. Además, un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención también puede ser usado para la producción de un medicamento para controlar o combatir microorganismos, tales como organismos fúngicos o bacterias, preferiblemente bacterias gram positivas.
La composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención pueden ser usados como un agente veterinario antimicrobiano o profiláctico o terapéutico humano. Así, la composición y polipéptido antimicrobiano de la invención pueden ser usados en la preparación de agentes terapéuticos veterinarios o humanos o agentes profilácticos para el tratamiento de infecciones microbianas, tales como infecciones fúngicas o bacterianas, preferiblemente infecciones bacterianas gram positivas. En particular, las infecciones microbianas pueden estar asociadas con enfermedades pulmonares incluidas, de modo enunciativo y no limitativo, tuberculosis, pulmonía y fibrosis cística; y enfermedades de transmisión sexual incluidas, de modo enunciativo y no limitativo, gonorrea y clamidia.
La composición de la invención comprende una cantidad eficaz del polipéptido antimicrobiano de la invención.
El término "cantidad eficaz" usado en la presente significa una cantidad del polipéptido antimicrobiano que comprende la secuencia de aminoácidos: G- X_{1}-X_{2}X_{3}R-X_{4}-X_{5}X_{6}-K-I-X_{7}-X_{8}K-X_{9}-X_{10}-K-X_{11}-X_{12}-Z; donde X_{1} = L o R; X_{2} = L, V, I o F; X_{3} = R o K; X_{4} = L, V, I o F; X_{5} = R, K, W o G; X_{6} = K, R, G, M, N o E; X_{7} = G, R, K o E; X_{5} = G, R, K o E; X_{9} = L o F; X_{10} = K o R; X_{11} = I, L, F, C o Y; X_{12} = G, A o T; Z = R o X_{13}X_{14}I-K-X_{15}X_{16}-X_{17}-X_{18}L-V-P; donde X_{13} = Q, L o P; X_{14} = K, I, M, L o V; X_{15} = P, A; H, N o D; X_{16} = I o L; X_{17} = R, H, Q o P; X_{18} = I o K; o la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 1 a 29 de cualquiera de la SEC ID NO:2 a la SEC ID NO:57 o los aminoácidos 1 a 19 de cualquiera de la SEC ID NO:58 a la SEC ID NO:69, que es suficiente para inhibir el crecimiento de los microorganismos en cuestión.
La invención también se refiere a composiciones de cicatrización de heridas o productos tales como bendajes, dispositivos médicos tales como, p. ej., catéteres y otros hasta productos anticaspa para el cabello, tales como champús.
Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención son administradas a un huésped que sufre o tiene predisposición a una infección microbiana. La administración puede ser tópica, localizada o sistémica, según el microorganismo específico, preferiblemente será localizada. Generalmente, la dosis de los polipéptidos antimicrobianos de la invención será suficiente para reducir la población microbiana aproximadamente en un 50% como mínimo, normalmente en 1 log como mínimo y puede ser en 2 o más logs de muertes. Los compuestos de la presente invención son administrados con una dosificación que reduce la población microbiana a la vez que minimiza cualquier efecto secundario. Está contemplado que la composición sea obtenida y usada según las instrucciones de un médico para el uso in vivo. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención son particularmente útiles para matar bacterias gram negativas, incluidas la Pseudomonas aeruginosa y Chlamydia trachomatis; y bacterias gram positivas, incluidos varios estafilococos y estreptococos.
Los polipéptidos antimicrobianos de la invención también son útiles para formulaciones in vitro para matar microbios, particularmente donde no se desea introducir cantidades de antibióticos convencionales. Por ejemplo, se pueden añadir los polipéptidos antimicrobianos de la invención a preparaciones de alimentos de animales y/o humanos; o pueden ser incluidos como un aditivo para cultivos in vitro de células, para prevenir el crecimiento excesivo de microbios en cultivo de tejido.
La susceptibilidad de un microbio particular a la muerte con los polipéptidos antimicrobianos de la invención se puede determinar por prueba in vitro, como se detalla en la sección experimental. Normalmente un cultivo del microbio es combinado con el polipéptido antimicrobiano a concentraciones variables por un periodo de tiempo suficiente para permitir que la proteína actúe, normalmente entre una hora y un día aproximadamente. Luego se cuentan los microbios viables y se determina el nivel de muerte.
Los microbios de interés incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, bacterias gram negativas, por ejemplo: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., por ej. E. coli; Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., por ej. S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., por ej. P. aeruginosa; Yersinia sp., por ej. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; Franciscella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., por ej. V. cholerae, V. parahemolyticus; Campylobacter sp., por ej. C. jejuni; Haemophilus sp., por ej. H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., por ej. B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sp., por ej. N. gonorrhoeae, N. meningitidis, etc. Otras bacterias de interés incluyen Legionella sp., por ej. L. pneumophila; Listeria sp., por ej. L. monocytogenes; Mycoplasma sp., por ej. M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., por ej. M. tuberculosis, M. leprae; Treponema sp., por ej. T. pallidum; Borrelia sp., por ej. B. burgdorferi; Leptospirae sp.; Rickettsia sp., por ej. R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., por ej. C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Helicobacter sp., por ej. H. pylori, etc.
Los patógenos no bacterianos de interés incluyen patógenos fúngicos y protozoos, por ej. Plasmodia sp., por ej. P. falciparum, Trypanosoma sp., por ej. T. brucei; schistosomas; Entaemoeba sp., Cryptococcus sp., Candida sp., por ej. C. albicans; etc..
Se pueden emplear varios métodos para la administración. La formulación polipeptídica puede ser administrada oralmente, o puede ser inyectada intravascularmente, subcutáneamente, peritonealmente, por aerosol, oftálmicamente, intra-vejiga, tópicamente, etc. Por ejemplo, los métodos de administración por inhalación son bien conocidos en la técnica. La dosificación de la formulación terapéutica variará mucho, dependiendo del polipéptido antimicrobiano específico que será administrado, la naturaleza de la enfermedad, la frecuencia de administración, la forma de administración, la eliminación del agente del huésped, y similares. La dosis inicial puede ser más grande, seguida de dosis de mantenimiento más pequeñas. La dosis puede ser administrada con frecuencia semanal o bisemanal, o fraccionada en dosis más pequeñas y administradas una o varias veces a diario, semi-semanalmente, etc. para mantener un nivel de dosificación eficaz. En muchos casos, la administración oral requerirá una dosis más alta que si se administra por vía intravenosa. Los enlaces de amida, al igual que los términos amino y carboxi, pueden ser modificados para lograr estabilidad superior en la administración oral. Por ejemplo, el término carboxi puede ser
amidado.
Formulaciones
Los compuestos de esta invención pueden ser incorporados en una variedad de formulaciones para la administración terapéutica. Más particularmente, los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas por combinación con portadores o diluyentes apropiados farmacéuticamente aceptables y pueden ser formulados en preparaciones en forma sólida, semi-sólida, líquida o gaseosa, tal como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, cremas, espumas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalaciones, geles, microesferas, lociones y aerosoles. Como tal, la administración de los compuestos se pude conseguir de varias maneras, incluida la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, traqueal, etc. Los polipétidos antimicrobianos de la invención pueden ser sistémicos después de la administración o pueden ser localizados por el uso de un implante u otra formulación que actúe para retener la dosis activa en el sitio de implantación.
En una forma de realización, una formulación para uso tópico comprende un agente quelante que reduce la concentración eficaz de cationes bivalentes, particularmente calcio y magnesio. Por ejemplo, agentes tales como citrato, EGTA o EDTA pueden ser incluidos, donde se prefiere el citrato. La concentración de citrato usualmente será de 1 a 10 mM aproximadamente.
Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados solos, en combinación entre sí, o pueden ser usados en combinación con otros compuestos conocidos (p. ej., perforina, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, etc.). En formas de dosificación farmacéutica, los compuestos pueden ser administrados en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ejemplificadores y no son restrictivos de ningún modo.
Para preparaciones orales, los compuestos pueden ser usados solos o en combinación con aditivos apropiados para hacer comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con ligadores, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegradores, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si es necesario, con diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, conservantes y agentes aromatizantes.
Los compuestos pueden ser formulados en preparaciones para inyecciones disolviéndolos, suspendiéndolos o emulsionándolos en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceite vegetal u otros aceites similares, glicéridos de ácido alifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, de ser necesario, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.
Los compuestos pueden ser utilizados en la formulación de aerosol para ser administrados vía inhalación. Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en propulsantes presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
Los compuestos pueden ser usados como lociones, por ejemplo para prevenir infección de quemaduras, por formulación con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.
Además, los compuestos pueden ser hechos en supositorios mediante la mezcla con una variedad de bases tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados rectalmente vía un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se funden a temperatura corporal pero que son solidificados a temperatura ambiente.
Las formas de dosificación unitaria para administración oral o rectal tales como jarabes, elixires y suspensiones pueden ser proporcionadas donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, pastilla o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más compuestos de la presente invención. De forma similar, las formas de dosificación unitaria para inyección o administración intravenosa puede comprender el compuesto de la presente invención en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal u otro portador farmacéuticamente aceptable.
Los implantes para las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Los implantes son formulados como microesferas, tiras, etc. con polímeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, los polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero erosionable que es bien tolerado por el huésped. El implante que contiene los polipétidos antimicrobianos de la invención es colocado en proximidad al sitio de infección, de modo que la concentración local de agente activo es aumentada en relación al resto del cuerpo.
El término "forma de dosificación unitaria", según se utiliza en este caso, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la presente invención dependen del compuesto particular empleado y el efecto que se desea conseguir, y la farmacodinámica asociada al compuesto en el huésped.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, están fácilmente disponibles al público. Además, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ajustadores y amortiguadores de pH, agentes de tonicidad, estabilizadores, agentes de humidificación y similares, están fácilmente disponibles al público.
Dosificaciones típicas para la administración sistémica variarán de 0,1 pg a 100 miligramos por kg de peso del sujeto por administración. Una dosificación típica puede ser un comprimido tomado de dos a seis veces a diario, o una cápsula o comprimido de liberación por tiempos tomados una vez al día y con un contenido proporcionalmente más alto de sustancia activa. El efecto de liberación por tiempos puede ser obtenido por materiales de cápsula que se disuelven a valores de pH diferentes, por cápsulas que se liberan lentamente por presión osmótica, o por cualquier otro medio conocido de liberación controlada.
Los expertos en la técnica apreciarán que los niveles de dosis pueden variar como una función del compuesto específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a efectos secundarios. Algunos de los compuestos específicos son más potentes que otros. Las dosificaciones preferidas para un compuesto determinado son fácilmente determinables por los expertos en la técnica por una variedad de medios. Un medio preferido es medir la fuerza fisiológica de un compuesto determinado.
El uso de liposomas como vehículo de entrega es un método de interés. Los liposomas se fusionan con las células del sitio objetivo y entregan el contenido del lúmen intracelularmente. Los liposomas son mantenidos en contacto con las células por tiempo suficiente para la fusión, usando varios medios para mantener el contacto, como aislamiento, agentes aglutinantes y similares. En un aspecto de la invención, los liposomas son diseñados para ser aerosolizados para administración pulmonar. Los liposomas pueden ser preparados con proteínas purificadas o péptidos que median la fusión de las membranas, tal como el virus Sendai o virus de la gripe, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de lípidos formadores de liposomas conocidos, incluidos los lípidos catiónicos o zwitteriónicos, tal como fosfatidicolina. El lípido restante normalmente será lípidos neutros o acídicos, tales como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol y similares.
Para preparar los liposomas, se puede utilizar el procedimiento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Brevemente, los lípidos y la composición del lúmen que contiene péptidos son combinados en un medio acuoso apropiado, convenientemente, un medio de solución salina donde los sólidos totales estarán en la gama de aproximadamente 1-10 por ciento en peso. Después de una agitación intensa por breves periodos de tiempo, de aproximadamente 5-60 seg., el tubo es colocado en un baño de agua tibia, de aproximadamente 25-40ºC y este ciclo es repetido de 5 a10 veces aproximadamente. La composición luego es sonicada por un periodo de tiempo conveniente, generalmente de aproximadamente 1-10 seg. y luego puede ser agitada por agitación vorticial. El volumen luego es expandido añadiendo el medio acuoso, generalmente aumentando el volumen de aproximadamente 1-2 veces, seguido de agitación y enfriamiento. Este método permite la incorporación en el lúmen de moléculas de alto peso molecular.
Formulaciones con otros aqentes activos
Para el uso en los métodos de sujeto, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser formulados con otros agentes farmacéuticamente activos, particularmente otros agentes antimicrobianos. Otros agentes de interés incluyen una amplia variedad de antibióticos, según se conocen en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, p. ej. penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta lactamasa, cefalosporinas,p. ej., cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicósidos; tetraciclina; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc.
Los agentes antimicóticos también son útiles, incluidos los polienos, p. ej. anfotericina B, nistatina; 5-flucosin y azoles, p. ej. miconazol, cetoconazol, itraconazol y fluconazol. Fármacos antituberculosos incluyen isoniazida, etambutol, estreptomicina y rifampicina. Las citoquinas también pueden ser incluidas en una formulación de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, p. ej. interferón gamma, factor alfa de necrosis tumoral, interleuquina 12, etc.
Síntesis in vitro
Los péptidos antimicrobianos de la invención pueden ser preparados por síntesis in vitro, usando los métodos convencionales conocidos en la técnica. Se encuentran disponibles varios aparatos comerciales sintéticos, por ejemplo sintetizadores automatizados por Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Al usar sintetizadores, los aminoácidos de origen natural pueden ser sustituidos con aminoácidos artificiales, particularmente isómeros D (o formas D) p. ej. D-alanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas laterales con diferentes longitudes o funciones, y similares. La secuencia particular y el modo de preparación estarán determinados según conveniencia, economía, pureza requerida, y similares.
El enlace químico puede ser proporcionado para varios péptidos o proteínas comprendiendo funciones convenientes para la unión, tal como grupos amino para formación de amida o de amina sustituida, p. ej. aminación reductiva, grupos tiol para formación de tioéter o de disulfuro, grupos carboxilo para formación de amida, y similares.
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De ser necesario, se pueden introducir varios grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, lo cual permite la conexión con otras moléculas o una superficie. De este modo, las cisteínas pueden utilizarse para hacer tioéteres, histidinas para conectar a un complejo de ión metálico, grupos carboxilo para formar amidas o ésteres, grupos amino para formar amidas y similares.
Los polipéptidos también pueden ser aislados y purificados conforme a métodos convencionales de síntesis recombinante. Un lisado puede ser preparado del huésped de expresión y el lisado purificado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de purificación. En su mayor parte, las composiciones que son usadas comprenderán al menos el 20% en peso del producto deseado, más usualmente al menos aproximadamente el 75% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente el 95% en peso, y para fines terapéuticos, normalmente al menos aproximadamente el 99,5% en peso, en relación con contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, los porcentajes estarán basados en el total de proteínas.
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Alimento para animales
La presente invención también está dirigida a métodos para usar polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana en alimentos para animales, al igual que para composiciones de alimentos y aditivos alimenticios que comprenden los polipéptidos antimicrobianos de la invención.
El término animal incluye todos los animales, incluidos los seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes, tales como vacas, ovejas y caballos. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, p. ej. cerdos o puercos (incluidos, de modo enunciativo y no limitativo, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); las aves de corral tales como pavos y pollo (incluidos, de modo enunciativo y no limitativo, pollos de engorde, ponedoras); terneros jóvenes y peces (incluido, de modo enunciativo y no limitativo, el salmón).
El término alimentos o composición de alimentos significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada o destinada para la ingesta por parte de un animal.
En el uso según la invención, el polipéptido antimicrobiano puede ser administrado como alimento al animal antes, después o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.
En una forma de realización particular, el polipéptido antimicrobiano, en la forma en la cual es añadido al alimento, o estando incluido en un aditivo alimentario, es bien definido. Bien definido significa que la preparación del polipéptido antimicrobiano tiene al menos un 50% de pureza según se determina por cromatografía de exclusión por tamaños (ver el ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares, la preparación de polipéptido antimicrobiano tiene al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos 95% de pureza según lo determina este método.
Una preparación de polipéptido antimicrobiano bien definido resulta ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente al alimento un polipéptido antimicrobiano que esencialmente no interfiere ni contamina otros polipéptidos antimicrobianos. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes y la capacidad de optimizar la dosificación según el efecto deseado.
No obstante, para el uso en alimentos para animales, el polipéptido antimicrobiano no necesita ser puro; puede p. ej. incluir otras enzimas, en cuyo caso podría ser denominada una preparación de polipéptido antimicrobiano.
La preparación de polipéptido antimicrobiano puede ser (a) añadida directamente al alimento (o usada directamente en un proceso de tratamiento de proteínas vegetales), o (b) puede ser usada en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos alimenticios o premezcia que es posteriormente añadida al alimento (o usada en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación de polipéptido antimicrobiano original, así sea usado según (a) o (b) mencionados.
Las preparaciones de polipéptido antimicrobiano con purezas de este orden de magnitud son obtenibles en particular usando métodos recombinantes de producción, mientras que no son tan fácilmente obtenidos y también están sujetos a una variación entre totes mucho más alta cuando el polipéptido antimicrobiano es producido por métodos de fermentación tradicional.
La preparación de polipéptido antimicrobiano de este tipo puede ser mezclada por supuesto con otras enzimas.
El término proteínas vegetales según se utiliza en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluya al menos una proteína derivada u originada de un vegetal, incluidas las proteínas modificadas y derivados de proteína. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60% (p/p).
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Las proteínas vegetales pueden ser derivadas de fuentes de proteína vegetal, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.
En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, p. ej. semilla de soja, altramuz, guisante, o judía.
En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, p. ej. remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.
Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son semilla de colza y repollo.
La semilla de soja es una fuente de proteína de vegetal preferida.
Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, mazorca (maíz), arroz y sorgo.
El polipéptido antimicrobiano puede ser añadido al alimento en cualquier forma, sea como un polipéptido antimicrobiano relativamente puro o en aditivo con otros componentes destinados a la adición a alimento para animales, es decir, en forma de aditivos de alimentos para animales, tales como las denominadas premezclas para alimentos para animales.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones para el uso en alimento para animales, tales como alimento para animales, y aditivos de alimentos para animales, p. ej. premezcla.
Aparte del polipéptido antimicrobiano de la invención, los aditivos de alimentos para animales de la invención contienen al menos una vitamina soluble en grasa, y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o al menos un oligoelemento, y/o al menos un macromineral.
Además, ingredientes opcionales de aditivos de alimentos son agentes colorantes, compuestos aromáticos, estabilizadores, y/o al menos otra enzima seleccionada entre las fitasas EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26; xilanasas EC 3.2.1.8; galactanasas EC 3.2.1.89; y/o betaglucanasas EC 3.2.1.4.
En una forma de realización particular, estas otras enzimas son bien definidas (como se define más arriba para las preparaciones de polipéptido antimicrobiano).
Ejemplos de otros péptidos antimicrobianos (AMP's) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina 1, Tanatina, Defensina, Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), y variantes, o fragmentos de los mismos que retienen actividad antimicrobiana.
Ejemplos de otros polipéptidos antifungicidas (AFP's) son los péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, al igual que variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO02090284.
Normalmente las vitaminas solubles en grasa y agua, al igual que los oligoelementos forman parte de una denominada premezcla para la adición al alimento, mientras que los macrominerales normalmente son añadidos separadamente al alimento. Cualquiera de estos tipos de composición, enriquecido con un polipéptido antimicrobiano de la invención, es un aditivo de alimento para animales de la invención.
En una forma de realización particular, el aditivo para alimentos para animales de la invención está destinado a estar incluido (o se describe que tiene que ser incluido) en dietas para animales o alimento a niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente 0,05 a 5,0%; 0 0,2 a 1,0% (% significa g de aditivo por 100 g de alimento). Este es el caso en particular para las premezclas.
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A continuación se presentan las listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:
Ejemplos de vitaminas solubles en grasa son vitamina A, vitamina D3, vitamina E y vitamina K, p. ej. vitamina K3.
Ejemplos de vitaminas solubles en agua son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, p. ej. Ca-D-pantotenato.
Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodina, selenio y cobalto.
Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.
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Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con ave de corral y lechones/cerdos) se presentan en la tabla A de WO 01/58275. Requisito nutritivo significa que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.
En la alternativa, el aditivo de alimento para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro, etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este componente individual, al menos, es incluido en el aditivo de la invención en una cantidad tal que proporcione una concentración en alimento dentro de la gama indicada en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de la tabla A.
La presente invención también se refiere a composiciones de alimentos para animales. Las dietas o las composiciones de alimento para animales tienen un contenido de proteína relativamente alto. Las dietas para aves de corral y cerdos pueden ser caracterizadas como se indica en la tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden ser caracterizadas como se indica en la columna 4 de esta tabla B. Además, este tipo de dietas para peces normalmente tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.
Una composición de alimento para animales según la invención tiene un contenido de proteína bruta o de 50-800 g/kg, y además comprende al menos un polipéptido antimicrobiano como se reivindica en la presente.
Además, o en la alternativa (para el contenido de proteína bruta indicado arriba), la composición del alimento para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.
En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).
La proteína cruda es calculada como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir, proteína cruda (g/kg)= N (g/kg) X 6,25. El contenido de nitrógeno es determinado por el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
La energía metabolizable puede ser calculada basándose en la publicación de NRC Nutrient requirements in swine, novena edición revisada 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.
El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas completas para animales es calculado basándose en tablas alimentarias tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
En una forma de realización particular, la composición de alimento para animales de la invención contiene al menos una fuente de proteína o proteína vegetal tal como se ha definido anteriormente.
En otras formas de realización particulares, la composición de alimentos para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-10% de harina de pescado; y/o 0-20% de lactosuero. Las dietas para animales pueden ser fabricadas p. ej. como alimento triturado (no granulado) o alimento granulado. Normalmente, los materiales de alimento molidos son mezclados y cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales son agregadas según las especificaciones para las especies en cuestión. Las enzimas pueden ser añadidas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación enzimática sólida normalmente es añadida antes o durante la fase de mezcla; y una preparación enzimática líquida normalmente es añadida después de la fase de granulación. La enzima también puede ser incorporada en un aditivo de alimento o premezcla.
La concentración enzimática final en la dieta está dentro de la gama de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo en la gama de 5-30 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal.
El polipéptido antimicrobiano puede ser administrado en una o más de las siguientes cantidades (gamas de dosificación): 0,01-200; o 0,01-100; o 0,05-100; o 0,05-50; o 0,10-10 - todas estas gamas son en mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg (ppm) de alimento.
Para determinar los mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg de alimento, el polipéptido antimicrobiano es purificado a partir de la composición alimentaria, y la actividad específica del polipéptido antimicrobiano purificado es determinada usando un ensayo pertinente (ver debajo de actividad antimicrobiana, sustratos y ensayos). La actividad antimicrobiana de la composición alimentaria como tal también es determinada usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg de alimento.
Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína de polipéptido antimicrobiano en aditivos alimenticios. Por supuesto, si está disponible una muestra del polipéptido antimicrobiano usada para preparar el aditivo del alimento o el alimento, la actividad específica es determinada a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar el polipéptido antimicrobiano de la composición alimentaria o el aditivo).
Composición de detergente
Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser añadidos y así convertirse en un componente de una composición de detergente.
La composición de detergente de la invención puede ser formulada por ejemplo como una composición de detergente de lavado a mano o a máquina incluida una composición de aditivo de lavandería adecuada para el pretratamiento de telas manchadas y una composición de suavizante de telas añadido al enjuague, o ser formulada como una composición de detergente para el uso doméstico en operaciones de limpieza generales de superficies duras, o ser formuladas para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina.
En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende los polipéptidos antimicrobianos de la invención y un tensioactivo. El aditivo de detergente al igual que la composición de detergente puede comprender una o más enzimas adicionales tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, un arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa (tal como una lacasa), y/o una peroxidasa (tal como una haloperoxidasa).
En general, las propiedades de la/s enzima/s elegida/s deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la/s enzima/s debería/n estar presente/s en cantidades eficaces.
Proteasas: las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Los mutantes modificados químicamente o creados de proteínas están incluidos. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus, p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (p. ej. de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.
Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
Lipasas: lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados de proteínas están incluidos. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces), por ejemplo de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (J P 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422).
Otros ejemplos son variantes de lipasa tal como las descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.
Amilasas: amilasas (alfa y/o beta) adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados de proteínas están incluidos. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa amilasas obtenidas de Bacillus, p. ej. una cepa especial de B. licheniformis, descrita en más detalle en GB 1,296,839.
Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.
Celulasas: celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados de proteínas están incluidos. Celulasas adecuadas incluyen celulasas de géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej. las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 y WO 89/09259.
Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas neutras o alcalinas que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de las celulasas de este tipo son las celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
Peroxidasas/oxidasas: las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados de proteínas están incluidos. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p. ej. de C. cinereus y variantes de las mismas como las descritas en WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.
La/s enzima/s de detergente puede ser incluidas en una composición de detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado p. ej. como un granulado, un líquido, una mezcla, etc. Formulaciones preferidas de aditivo de detergente son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o mezclas.
Los granulados no pulverulentos pueden ser producidos, p. ej., como se describe en US 4106991 y 4661452 y pueden ser revestidos opcionalmente por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli(etileno óxido) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento formador de película adecuados para la aplicación por técnicas de lecho fluidificado son proporcionados en GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Enzimas protegidas pueden ser preparadas según el método descrito en EP 238216.
La composición de detergente de la invención puede ser en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, un comprimido, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo normalmente hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.
La composición de detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluso semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los agentes tensioactivos normalmente están presentes a un nivel del 0,1% al 60% en peso.
Cuando están incluidos en el mismo, el detergente normalmente contiene aproximadamente del 1% a aproximadamente el 40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de alfa-sulfo ácido graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.
Cuando está incluido en el mismo, el detergente normalmente contiene aproximadamente del 0,2% a aproximadamente el 40% de un tensioactivo no-iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxialquilo, o derivados de N-acilo N-alquilo de glucosamina ("glucamidas").
El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), alcohol polivinílico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema blanquedor que puede comprender una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato que puede ser combinada con un activador del blanqueamiento formador de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De forma alternativa, el sistema blanquedor puede comprender peroxiácidos de p. ej. tipo amida, imida o sulfona.
La/s enzima/s de la composición de detergente de la invención puede/n ser estabilizada/s usando agentes estabilizantes convencionales, p. ej., un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico y la composición puede ser formulada como se describe en, p. ej., WO 92/19709 y WO 92/19708.
El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como, p. ej., acondicionadores de tela incluidas arcillas, activadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de suciedad, agentes antirredesposición de suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de decoloración o perfumes.
Actualmente está contemplado que en las composiciones de detergentes cualquier enzima, y los polipéptidos antimicrobianos de la invención, pueden ser añadidos en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, preferiblemente 0,05-10 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, más preferiblemente 0,1-5 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado, y de forma más preferible 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado.
Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden adicionalmente ser incorporados en las formulaciones de detergente descritas en WO 97/07202.
La presente invención es descrita posteriormente por los siguientes ejemplos; no se debe interpretar que los mismos limiten el ámbito de la invención.
Ejemplos
Los productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de grado reactivo al menos.
Ejemplo 1 Clonación, expresión y evaluación de la actividad de un polipéptido antimicrobiano (Cat1) Clonación del gen sintético que codifica Cat1
Para producir el polipéptido antimicrobiano Cat1 (SEC ID NO:3) para ensayos de actividad antimicrobiana, un gen sintético fue hecho (ver abajo) e insertado en el vector de expresión pET31b+ (Novagen Inc.). El gen sintético fue constituido por oligonucleótidos específicamente diseñados (Cebador1 y Cebador2).
Gen sintético que codifica Cat1 (SEC ID NO:70):
100
Cebador1 (SEC ID NO:72):
1
Cebador2 (SEC ID NO:73):
2
La digestión enzimática de sitios de endonucleasa de restricción flanqueantes (AlwNl/Aval) nos permitió clonar este gen sintético como un constructo de fusión en pET31 b+ (procedimientos estándares según lo describe el fabricante, New England BioLabs Inc.). Todos los protocolos estándares han sido descritos en otro lugar (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, 1989).
Transformación y expresión de Cat1 en E. coli
pET31b+ recombinante fue transformado en E. coli Novablue como lo describe el fabricante (Novagen). El plásmido fue preparado por Mini Columnas QlAprep (Qiagen Inc.) y ordenado por secuenciación automatizada usando cebadores específicos del plásmido (Cebador3 y Cebador4):
Cebador3 (SEC ID NO:74):
TGCTA GTTAT TGCTC AGCGG
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Cebador4 (SEC ID NO:75):
ACCGT AGTTG CGCCC ATCG
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El plásmido fue transformado en E. coli BLR-DE3 según el fabricante (Novagen). Las bacterias fueron cultivadas en medio LB a OD_{600} \sim0.8 y la síntesis de proteína recombinante fue iniciada por 1 mM de IPTG (isopropil beta-D-Tiogalactopiranósido). Después de 3 horas de inducción, las bacterias fueron cosechadas, resuspendidas en 1/10 de tampón de volumen A (50 mM Tris-HCI, 1 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, pH 8) y lisadas por ruptura de presión (1500 mBar). El granulado resultante fue lavado dos veces en tampón B (50 mM de Tris-HCI, 10 mM de EDTA, 0.5% TritonX-100, 100 mM de NaCl, pH 8). Todos los protocolos estándares han sido descritos en otro lugar (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, 1989).
Purificación de Cat1 de cuerpos de inclusión de E. coli
El granulado resultante de la purificación mencionada contenía cuerpos de inclusión purificados. Para liberar el péptido del socio de fusión KSI, se realizó hidrólisis ácida en un sitio Asp-Pro creado genéticamente, introducido N-terminalmente al gen que codifica Cat1. Los cuerpos de inclusión fueron resuspendidos en 100 mM de fosfato sódico (pH 2,3) e incubados durante toda la noche a 85 grados Celsius. El sobrenadante resultante contenía el péptido (PAE-Cat1). La muestra fue neutralizada añadiendo 100 mM de fosfato sódico (pH 12,3) Para madurar el péptido, el péptido fue tratado con una glutamil- endopeptidasa I (de B. licheniformis). El péptido madurado fue confirmado por espectrometría de masa y después purificado por procedimientos cromatográficos estándares.
Actividad antimicrobiana por ensayo de microdilución en caldo de NCCLS (MIC & MBC)
Según las pautas de NCCLS para la prueba de susceptibilidad de compuestos antimicrobianos nuevos, se encontró un amplio espectro de actividad de Cat1 (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Quinta Edición Estándar Autorizada. Documento NCCLS M7-A5 (ISBN 1-56238-394-9)). Las siguientes cepas de bacterias fueron susceptibles a Cat1 (MIC<64 \mug/ml): Bacillus subtilis (ATCC6633), Micrococcus luteus (ATCC9341), Staphylococcus epidermidis (DSM1798), Enterococcus faecalis (DSM2570), Pseudomonas aeroginosa (ATCC27853), Bortadella bronchiseptica (ATCC4617), Eschericia coli (ATCC10536), Klepsiella pneumoniae (ATCC10031), Salmonella choleraesuis (DSM9220) y Proteus mirabilis (ATCC7002). La concentración bactericida mínima (MBC) fue en una gama similar, indicando que la actividad de Cat1 es bactericida.
En otra campaña, las MIC específicas de Cat1 fueron determinadas contra una variedad de cepas microbianas pertinentes a infecciones de heridas. Como se recomienda en el mencionado protocolo NCCLS, las cepas fueron cultivadas en Caldo Muller-Hinton ajustado por cationes. La concentración de máxima evaluada fue 32 \mug/ml. Los resultados en la tabla 1 muestran que Cat1 es un antibiótico de amplio espectro con actividades potentes contra una gama de diferentes bacterias gram negativas y gram positivas.
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TABLA 1
3
4 
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Valores de MIC balo diferentes condiciones de pruebas
Las concentraciones mínimas inhibitorias de Cat1 también fueron determinadas usando caldo Mueller-Hilton (MHB) ajustado por cationes en el ensayo de dilución en microcaldo, donde MHB fue usado con diferentes modificaciones como se representa en la tabla 2 de más abajo. El organismo de prueba seleccionada fue Pseudomonas aeroginosa (ATCC 27853).
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TABLA 2
5
6
Cinética de muerte
El nivel de muerte de Cat1 fue determinado en MHB usando Pseudomonas aeroginosa (ATCC 27853) como el organismo de prueba. Las bacterias fueron incubadas con Cat1 (a concentración 4 x MIC). En diferentes puntos temporales, diferentes diluciones de la preparación fueron colocadas en placas y se determinó una estimación de células viables (CFU/ml). Los resultados en la tabla 3 indican que Cat1 mata répidamente las bacterias, con una reducción cercana a 3 log en CFU dentro de 30 minutos.
TABLA 3
7
Actividad antimicrobiana por ensayo de difusión radial (MEC)
Una versión modificada de un protocolo previamente publicado ha sido aplicado en la detección de actividad antimicrobiana (Lehrer et al., (1991) Ultra sensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides J Immunol Methods 137: 167-173). Las bacterias objetivo (10^{6} unidades formadoras de colonias (CFU)) fueron añadidas a 10 ml de capa base de agarosa (1% de electro-endósmosis de agarosa baja, 0,03% de caldo con tripticasa de soja, 10 mM de fosfato sódico, pH 7,4, 37 grados Celsius). La suspensión fue solidificada en una placa de Petri INTEGRID (Becton Dickinson Labware). Un punzón para gel de 3 mm fue usado para hacer agujeros en la capa base de agarosa (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia). Las muestras fueron añadidas a los agujeros e incubadas a 37 grados Celsius, 3 horas. Un recubrimiento fue vertido encima y la placa fue incubada durante toda la noche (medio LB, 7,5% de Agar). La actividad antimicrobiana fue vista como zonas de aclaramiento bacteriano alrededor de los pocillos. Las células vivas fueron contracoloreadas añadiendo 10 ml, 0,2 mM de MTT (azul de tiazolilo 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromuro).
Este ensayo reveló un espectro de actividad similar y concentraciones según lo determinó el protocolo NCCLS (párrafo anterior). Se descubrió que las siguientes especies de bacterias son susceptibles (concentración eficaz mínima (MEC)<64 \mug/ml): Bacillus subtilis (ATCC6633), Enterococcus hirae (ATCC10541), Micrococcus luteus (ATCC9341), Staphylococcus aureus (ATCC29737), Staphylococcus epidermidis (DSM 1798), Enterococcus faecalis (DSM2570), Pseudomonas aeroginosa (ATCC27853), Bortadella bronchiseptica (ATCC4617), Eschericia coli (ATCC10536), Klepsiella pneumoniae (ATCC10031), Salmonella choleraesuis (DSM9220) y Proteus mirabilis (ATCC7002).
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Ejemplo 2 Evaluación de actividad antimicrobiana
Una gama de polipéptidos sintéticos antimicrobianos fue expresada en E. coli TOP10 (Invitrogen) usando arabinosa como inductor, como se describe en el ejemplo 1 de la solicitud de patente internacional WO 00/73433 (con modificaciones menores). La expresión de los polipéptidos antimicrobianos de la invención resultó en la inhibición del crecimiento de las células huéspedes.
Brevemente, los cultivos nuevos cultivados durante toda la noche en medio RM conteniendo 0,2% de glucosa y ampicilina (100 \mug/ml) fueron diluidos 300 veces en 150 microlitros de RM con 0,2% de glicerol y ampicilina (100 \mug/ml) y concentraciones diferentes de arabinosa (0, 0,01% o 0,1%) en una placa de microtitulación e incubados a 37 grados Celsius con agitación vigorosa. La curva de crecimiento fue vigilada midiendo OD450 usando un lector Bioscreen C Microbiology (Thermo Electron Corporation) en intervalos de 30 minutos durante 14 horas (ver Protocolo de Invitrogen del catálogo de vectores pBAD/gIII A, B y C, números V450-01 para composición de tampón y de los medios).
El porcentaje de inhibición del crecimiento fue calculado como la medición de OD del punto final de cada muestra dividida por la medición de OD de punto final obtenida de células que contienen el vector de control y multiplicado por 100. La fórmula es la siguiente:
8
donde "OD blanco" corresponde a la OD de un pocillo vacío.
Las secuencias de aminoácidos de Cat1 y variantes sintéticas mejoradas seleccionadas están catalogadas en las tablas 4, 5 y 6.
TABLA 4
9
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TABLA 5
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TABLA 6
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Los resultados mostrados en las tablas 4, 5 y 6 indican convincentemente que todos los polipéptidos evaluados exhiben fuerte actividad antimicrobiana.
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Ejemplo 3 Actividad antimicrobiana en comparación con cepas bacterianas (MIC & MEC)
La actividad antimicrobiana de los polipéptidos de la invención fue analizada usando el Ensayo de caldo de microdilución (ver ejemplo 1) con el medio de Caldo Mueller Hinton (MHB). Cuatro cepas bacterianas diferentes fueron evaluadas en Micrococcus luteus (ATCC 9341), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 10536) y Klebsiella pneumoniae (DSM681). La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos y la concentración inhibitoria mínima (MEC, microgramo/ml) obtenida está presentada en la tabla 7 a continuación.
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TABLA 7
15 
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La actividad antimicrobiana de los polipéptidos de la invención también fue analizada en un ensayo de difusión radial (ver ejemplo 1) usando condiciones mínimas. Dos cepas bacterianas fueron evaluadas en esta disposición; Staphylococcus carnosus y Escherichia coli Top10. La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos y la concentración eficaz mínima (MEC, microgramo/ml) obtenida está presentada en la tabla 8 a continuación.
TABLA 8
16
Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA_MISC
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<222> (3)..(3)
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<223> Xaa = leucina, isoleucina, valina o fenilalanina
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<220>
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<222> (4)..(4)
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<222> (6)..(6)
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<220>
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<223> Péptido sintético antimicrobiano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
65 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
66 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
67 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
68 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
69 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
70 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
71 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
72 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
73 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = leucina o arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = leucina o fenilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = arginina o lisina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = leucina o fenilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = arginina, lisina o glicina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = arginina, lisina o ácido glutamico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = glicina o lisina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = lisina, arginina o ácido glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = leucina o fenilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = alanina o treonina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = lisina o arginina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17).. (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = isoleucina o leucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
74 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
75 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
76 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm
77 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
78 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
79 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
80 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
81 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
82 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
83 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
84 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético antimicrobiano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
85 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen Cat1 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
86 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen Cat1 sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
87 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cebador 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
88 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cebador 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
89 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cebador 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctagttat tgctcagcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cebador 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgtagttg cgcccatcg 
\hfill
19

Claims (22)

1. Polipéptido con actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos:
G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-R-X_{4}-X_{5}-X_{6}-K-I-X_{7}-X_{8}-K-X_{9}-X_{10}-K-X_{11}-X_{12}-Z;
donde
\vskip1.000000\baselineskip
1000 
\vskip1.000000\baselineskip
donde
\vskip1.000000\baselineskip
1003 
\vskip1.000000\baselineskip
y donde los aminoácidos que componen los polipéptidos son independientemente seleccionados de formas D o L.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos, como lo expone la SEC ID NO:58,
G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-R-X_{4}-X_{5}-X_{6}-K-I-X_{7}-X_{8}K-X_{9}-X_{10}-K-X_{11}-X_{12}-R;
donde
\vskip1.000000\baselineskip
1001 
\vskip1.000000\baselineskip
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos, como se expone en la SEC ID NO:2,
G-X_{1}-X_{2}X_{3}-R-X_{4}-X_{5}-X_{6}-K-I-X_{7}-X_{8}-K-X_{9}-K-K-X_{10}-G-X_{11}-X_{12}-I-K-X_{13}-X_{14}-X_{15}X_{16}-L-V-P;
\newpage
donde
\vskip1.000000\baselineskip
1002 
\vskip1.000000\baselineskip
4. Polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en los aminoácidos 1 a 29 de la SEC ID NO:2 o aminoácidos 1 a 19 de la SEC ID NO:58.
5. Polinucleótido que tiene una secuencia de nucleóidos que codifica el polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Constructo de ácidos nucléicos que comprenden la secuencia de nucleátidos definida en la reivindicación 5 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.
7. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos definido en la reivindicación 6.
8. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos definido en la reivindicación 6.
9. Método para la producción de un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el método comprendiendo:
(a) cultivo de una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 8 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y
(b) recuperación del polipéptido.
10. Composición que comprende un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
11. Composición según la reivindicación 10, que además comprende un agente biocida adicional.
12. Método, que no es un método para el tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, para matar o inhibir el crecimiento de células microbianas comprendiendo la puesta en contacto de las células microbianas con un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
13. Composición de detergente que comprende un tensioactivo y un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
14. Polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso como un medicamento.
15. Polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso como un agente antimicrobiano terapéutico o profiláctico veterinario o humano.
16. Uso de un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso en la preparación de un agente terapéutico veterinario o humano para el tratamiento de una infección microbiana o para uso profiláctico.
\newpage
17. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
18. Uso de al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en alimento para animales.
19. Uso de al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la preparación de una composición para el uso en alimento para animales.
20. Aditivo de alimento para animales que comprende
(a) al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y
(b) al menos una vitamina soluble en grasa, y/o
(c) al menos una vitamina soluble en agua, y/o
(d) al menos un oligoelemento, y/o
(e) al menos un macromineral.
21. Aditivo de alimento para animales según la reivindicación 20, que además comprende fitasa, xilanasa, galactanasa, y/o beta glucanasa.
22. Composición de alimento para animales que tiene un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprende al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
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