ES2319768T3 - Polipeptidos antimicrobianos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido con actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos: ** ver secuencia** en donde X1 = L, I, W o M; X 2 = L, F, W o V; X3 = S, G, K, T, R, I, N, D o E; X 4 = K, T, F, I, R, M, L o S; X5 = L o I; X6 = K, G, R, M o E; X7 = K, S, I, R, T o M; X8 = A, K, T, N, R o E; X 9 = A, G, S, I, L, T, V, M o W; X10 = S, R, K o E; X 11 = K, M, R, H, I, N o T; X12 = A, V, I, L, Y, F o T; X 13 = L, A, G, C, F, V o W; X14 = K, Q, A, S, R o E; X15 = H, G, N, R, S, M, I, V o D; X16 = V, I, A o F; G-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-Z; Z = X17 -R-W-L; donde X17 = F, L, R, A, G, V, Y, C o P; y donde los aminoácidos que forman el polipéptido son independientemente seleccionados de las formas D o L.

Description

Polipéptidos antimicrobianos.

Antecedentes

En los últimos años, la variedad de agentes antimicrobianos ha aumentado sustancialmente, con un aumento paralelo en microorganismos patógenos resistentes. La resistencia es ahora reconocida contra todos los agentes antimicrobianos clínicamente disponibles. La respuesta a la resistencia antimicrobiana en la comunidad médica ha sido el uso de nuevos antibióticos o alternativos no usados previamente contra las bacterias resistentes. Este enfoque ha requerido el desarrollo continuo de antibióticos nuevos, bien como modificaciones de compuestos que existen habitualmente o como combinaciones de compuestos que pueden inhibir o derivar los mecanismos de resistencia bacteriana.

Tossi et al. "Design of synthetic antimicrobial peptides based on sequence analogy and amphipathicity", Eur J Biochem, Vol. 250 (2), págs. 549-558 (1997) describieron cuatro péptidos antimicrobianos sintéticos \alpha-helicoidales basados en un estudio de las secuencias N-terminales de péptidos antimicrobianos \alpha-helicoidales de familias de insectos, de ranas y de mamíferos. Tres de estos péptidos fueron derivados de la familia de la catelicidina mamífera.

Hong et al. "Solution structure of a designed amphipathic antimicrobial synthetic peptide, PGAa", Biochem Biophys Res Commun, Vol. 276 (3), págs. 1278-1285 (2000) describieron un estudio del péptido \alpha-helicoidal antimicrobiano sintético, PGAa, que presenta actividad antifúngica y actividad antibacteriana contra gram-positivas. El análisis de la estructura de solución de PGAa fue determinado por espectroscopia CD y RMN.

Huttner et al., "Localization and genomic organization of sheep antimicrobial peptide genes", Gene, Vol. 206 (1), págs. 85-91 (1998) describieron diez péptidos antimicrobianos potenciales de oveja - dos \beta-defensinas y ocho catelicidinas. La disposición genómica de los genes que codifican estos péptidos fue discutida.

Es un objeto de la presente invención el hecho de proporcionar polipéptidos nuevos que tengan actividad antimicrobiana mejorada y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

Resumen

En un primer aspecto la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos:

G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-X_{8}-X_{9}-X_{10}-X_{11}-X_{12}-X_{13}-X_{14}-X_{15}-X_{16}-Z;

donde X_{1} = L, I, W o M; X_{2} = L, F, W o V; X_{3} = S, G, K, T, R, I, N, D o E; X_{4} = K, T, F, I, R, M, L o S; X_{5} =L o I; X_{6} = K, G, R, M o E; X_{7} = K, S, I, R, T o M; X_{8} = A, K, T, N, R o E; X_{9} = A, G, S, I, L, T, V, M o W; X_{10} = S, R, K o E; X_{11} = K, M, R, H, I, N o T; X_{12} = A, V, I, L, Y, F o T; X_{13} = L, A, G, C, F, V o W; X_{14} = K, Q, A, S, R o E; X_{15} = H, G, N, R, S, M, I, V o D; X_{16} = V, I, A o F; Z = X_{17}-R-W-L; donde X_{17} = F, L, R, A, G, V, Y, C o P; y donde los aminoácidos que conforman el polipéptido son independientemente seleccionados de formas D o L.

En un segundo aspecto la presente invención se refiere a polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de la invención.

En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica para el polipéptido de la invención, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

En un cuarto aspecto la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

En un quinto aspecto la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

En un sexto aspecto la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de la invención, el método comprendiendo:

(a)

cultivo de una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b)

recuperación del polipéptido.

Otros aspectos de la presente invención serán aparentes de la descripción siguiente y de las reivindicaciones anexas.

Definiciones

Antes de discutir la presente invención con más detalle, se definirán en primer lugar los términos y convenciones siguientes:

\quad

Actividad antimicrobiana: el término "actividad antimicrobiana" se define aquí como una actividad que es capaz de matar o de inhibir el crecimiento de células microbianas. En el contexto de la presente invención, el término "antimicrobiano" se destina a significar que hay un efecto bactericida y/o bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o un efecto virucida, donde el término "bactericida" debe ser entendido como capaz de matar a las células bacterianas. El término "bacteriostático" debe ser entendido como capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir, de inhibir el crecimiento de las células bacterianas. El término "fungicida" debbe ser entendido como capaz de matar a las células micóticas. El término "fungistático" debe ser entendido como capaz de inhibir el crecimiento fúngico, es decir, de inhibir el crecimiento de células micóticas. El término "virucida" debe ser entendido como capaz de inactivar virus. El término "células microbianas" se refiere a células bacterianas o micóticas (incluidas las levaduras).

En el contexto de la presente invención el término "inhibir el crecimiento de células microbianas" se destina a significar que las células están en el estado de no crecimiento, es decir, que éstas no son capaces de reproducirse.

Para objetivos de la presente invención, la actividad antimicrobiana puede ser determinada según el procedimiento descrito por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) págs. 167-174 (1991).

Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células de Escherichia coli vivas (DSM 1576) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) incubación a 20ºC en una solución acuosa del 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa del 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa del 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa del 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa del 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa del 0,1%(p/p) de los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana.

Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden también ser capaces de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, añadido en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente añadido en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente añadido en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible añadido en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) incubación a 20ºC en una solución acuosa del 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa del 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa del 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa del 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa del 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa del 0,1%(p/p) de los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana.

Los polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana pueden también ser capaces de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, añadido en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente añadido en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente añadido en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible añadido en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

Los polipéptidos de la presente invención deberían preferiblemente tener como mínimo el 20% de la actividad antimicrobiana del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de SEC ID NO:38 a SEC ID NO:46. En una forma de realización particular preferida, los polipéptidos deberían tener como mínimo el 40%, tal como al menos el 50%, preferiblemente al menos el 60%, tal como al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%, tal como al menos el 90%, de la forma más preferible al menos el 95%, tal como aproximadamente o al menos el 100% de la actividad antimicrobiana del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de la SEC ID NO:38 a la SEC ID NO:46.

Variante alélica: en el contexto presente, el término "variante alélica" denota cualquiera de las dos o formas más alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. Variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o puede codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" como se utiliza en este caso se refiere a una preparación polinucleótida, donde el polinucleótido ha sido eliminado de su medio genético natural, y está por lo tanto libre de otras secuencias de codificación extrañas o indeseadas y está en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de producción de proteínas creados genéticamente. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como mucho el 10% en peso de otro material polinucleótido con el cual está originalmente asociado (porcentajes inferiores de otro material polinucleótido son preferidos, p. ej. como mucho el 8% en peso, como mucho el 6% en peso, como mucho el 5% en peso, como mucho el 4%, como mucho el 3% en peso, como mucho el 2% en peso, como mucho el 1% en peso, y como mucho ½% en peso). Un polinucleótido sustancialmente puro puede, no obstante, incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro tenga al menos un 92% de pureza, es decir que el polinucleótido constituya al menos el 92% en peso del material polinucleótido total presente en la preparación, y porcentajes más altos son preferidos tales como al menos el 94% de pureza, al menos el 95% de pureza, al menos el 96% de pureza, al menos el 96% de pureza, al menos el 97% de pureza, al menos el 98% de pureza, al menos el 99%, y como mucho el 99,5% de pureza. Los polinucleótidos descritos aquí están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleótidos descritos aquí estén en "forma esencialmente pura", es decir que la preparación polinucleótida esté esencialmente libre de otro material polinucleótido con el cual está asociado originalmente. Aquí, el término "polinucleótido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polinucleótido aislado" y "polinucleótido en forma aislada".

Modificación(es): en el contexto de la presente invención el término "modificación(es)" se destina a significar cualquier modificación química del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de la SEC ID NO:38 a la SEC ID NO:46 al igual que la manipulación genética del ADN que codifica los polipéptidos. La(s) modificación(s) puede(n) ser sustitución(es) de la(s) cadena(s) lateral(es) de aminoácidos o sustitución(es) en el(los) aminoácidos) de interés tal y como se define en la reivindicación 1. En particular la(s)
modificación(es) puede(n) ser amidaciones, tales como la amidación del C-término.

ADNc: el término "ADNc" cuando se usa en el presente contexto, se destina a cubrir una molécula de ADN que puede ser preparada por transcripción inversa de una molécula de ARNm, madura, dividida, derivada de una célula eucariótica. El ADNc carece de las secuencias de intrones que están normalmente presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN primario inicial es un precursor para ARNm y pasa a través de una serie de eventos de tratamiento antes de aparecer como ARNm maduro dividido. Estos eventos incluyen la eliminación de secuencias de intrones por un proceso llamado de empalme. Cuando el ADNc es derivado de ARNm en consecuencia carece de secuencias de intrones.

Constructo de ácidos nucleicos: cuando se usa aquí, el término "constructo de ácidos nucleicos" significa una molécula de ácido nucleico, bien mono o bicatenario, que es aislado de un gen de origen natural o que ha sido modificado para contener segmentos de ácidos nucleicos de un modo que de lo contrario no existiría en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "cassette de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

Secuencia de control: el término "secuencias de control" se define aquí para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal, y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden ser provistas de enlaces con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligadura de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

Operativamente enlazado: el término "operativamente enlazado" se define aquí como una configuración donde una secuencia de control es colocada apropiadamente en una posición correspondiente a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de manera que la secuencia de control dirige la expresión de un polipéptido.

Secuencia codificante: cuando se usa aquí el término "secuencia codificante" se destina a cubrir una secuencia de nucleótidos, que directamente especifica la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante están generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que normalmente se inicia con el codón de iniciación ATG. La secuencia codificante normalmente incluye ADN, ADNc, y secuencias de nucleótidos recombinantes.

Expresión: en el presente contexto, el término "expresión" incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero sin limitarse a, la transcripción, modificación postranscripcional, traducción, y modificación post-traduccional. Preferiblemente, la expresión también comprende la secreción del polipéptido.

Vector de expresión: en el contexto presente, el término "vector de expresión" cubre una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de la invención, y que está operativamente enlazado a segmentos adicionales que proveen su transcripción.

Célula huésped: el término "célula huésped", como se utiliza en este caso, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación con un constructo de ácidos nucleicos.

Los términos, "sonda polinucleótida", "hibridación" al igual que las varias condiciones de astringencia están definidas en la sección titulada "Polipéptidos con actividad antimicrobiana".

Descripción detallada Polipéptidos con actividad antimicrobiana

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana y donde los polipéptidos comprenden, preferiblemente consisten en la secuencia de aminoácidos:

G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-X_{8}-X_{9}-X_{10}-X_{11}-X_{12}-X_{13}-X_{14}-X_{15}-X_{16}-Z;

donde X_{1} = L, I, W o M; X_{2} = L, F, W o V; X_{3} = S, G, K, T, R, I, N, D o E; X_{4} = K, T, F, I, R, M, L o S; X_{5} = L o I; X_{6} = K, G, R, M o E; X_{7} = K, S, I, R, T o M; X_{8} = A, K, T, N, R o E; X_{9} = A, G, S, I, L, T, V, M o W; X_{10} = S, R, K o E; X_{11} = K, M, R, H, I, N o T; X_{12} = A, V, I, L, Y, F o T; X_{13} = L, A, G, C, F, V o W; X_{14} = K, Q, A, S, R o E; X_{15} = H, G, N, R, S, M, I, V o D; X_{16} = V, I, A o F; Z = X_{17} -R-W-L; donde X_{17} = F, L, R, A, G, V, Y, C o P; o donde los polipéptidos comprenden, preferiblemente consisten en los aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de la SEC ID NO:38 a la SEC ID NO:46.

El término "cualquiera de la SEC ID NO:38 a la SEC ID NO:46" se destina a significar SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO:40, SEC ID NO:41, SEC ID NO:42, SEC ID NO:43, SEC ID NO:44, SEC ID NO:45 o SEC ID NO:46.

En otra forma de realización preferida, el polipéptido de la presente invención comprende los aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de la SEC ID NO:38 a la SEC ID NO:46. En una forma de realización adicional preferida, el polipéptido consiste en los aminoácidos 1 a 21 de alguna de la SEC ID NO:38 a SEC ID NO:46.

Los aminoácidos que componen los polipéptidos de la invención pueden independientemente ser seleccionados de formas D o L.

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Extensión N-terminal

Una extensión N-terminal de los polipéptidos de la invención puede de manera adecuada consistir en 1 a 50 aminoácidos, preferiblemente 2-20 aminoácidos, especialmente 3-15 aminoácidos. En una forma de realización, la extensión peptídica N-terminal no contiene un Arg (R). En otra forma de realización la extensión N-terminal comprende un sitio kex2 o un sitio de seccionamiento tipo kex2 como será definido más abajo. En una forma de realización preferida la extensión N-terminal es un péptido, comprendiendo al menos dos residuos de aminoácidos Glu (E) y/o Asp (D), tal como una extensión N-terminal comprendiendo una de las siguientes secuencias: EAE, EE, DE y DD.

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Sitios Kex2

Los sitios Kex2 (véase, p. ej., Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") y los sitios tipo kex2 son sitios di-básicos de reconocimiento (es decir, sitios de seccionamiento) encontrados entre la región codificante propéptida y la región madura de algunas proteínas.

La inserción de un sitio kex2 o un sitio tipo kex2 ha demostrado en determinados casos que mejora el tratamiento de la endopeptidasa correcto en el sitio de ruptura pro-péptido dando como resultado niveles de secreción de proteína aumentados.

En el contexto de la invención la inserción de un sito kex2 o tipo kex2 supone la posibilidad de obtener el seccionamiento en una posición determinada en la extensión N-terminal dando como resultado un polipéptido antimicrobiano que se extiende en comparación con el polipéptido maduro mostrado como los aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de la SEC ID NO:38 a SEC ID NO:46.

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Polipéptidos fusionados

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles donde otro polipéptido es fusionado en el N-término o en el C-término del polipéptido de la invención o un fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es producido fusionando una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que éstas estén en el marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del(los) mismo(s) promotor(es) y terminador.

Polinucleótidos y secuencias de nucleótidos

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la invención. En particular, la presente invención se refiere a polinucleótidos que consisten en una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la invención. Debido a la degeneración del código genético, el experto en la materia fácilmente reconocerá que diferentes secuencias de nucleótidos que codifican cada uno de los polipéptidos de la invención pueden ser preparadas. Es bien conocido en la técnica que los nucleótidos componen codones que codifican los aminoácidos de los polipéptidos de la invención.

La secuencia de nucleótidos puede ser obtenida por procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de nucleótidos de una ubicación a un sitio diferente donde será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento deseado que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, inserción del fragmento en una molécula del vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde copias múltiples o clones de la secuencia de nucleótidos serán replicados. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.

La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de un polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución elegida de los residuos aminoácidos posibles tal y como se define en reivindicación 1 en comparación con los aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de la SEC ID NO:38 a SEC ID NO:46. Estas variantes artificiales pueden diferir en alguna vía creada genéticamente del polipéptido aislado de su fuente nativa, p. ej., variantes que difieren en actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, o similar.

Además, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser modificada por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima.

La introducción de una mutación en la secuencia de nucleótidos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por mutagénesis dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Es particularmente útil el procedimiento que utiliza un vector de ADN bicatenario superenrollado con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario con cadenas opuestas del vector, se extiende durante la variación cíclica de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. En incorporación de los cebadores, un plásmido mutado que contiene cortes en bisel es generado. Después de la variación cíclica de la temperatura, el producto es tratado con DpnI que es específica para ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y para seleccionar ADN sintetizado conteniendo una mutación. Otros procedimientos conocidos pueden también ser usados en la técnica. Para una descripción general de sustitución de nucleótidos, véase, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Constructos de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulada en una variedad de vías para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de nucleótidos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidos en la técnica.

La secuencia de control puede ser una secuencia del promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de nucleótidos. La secuencia del promotor contiene secuencias de control transcripcionales, que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y pueden ser obtenidos de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gen de penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y gen de beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa amilasa ácido estable de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.

En un huésped de levadura, los promotores útiles son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP), y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8, 423-488.

La secuencia de control puede también ser una secuencia del terminador de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador es operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención.

Terminadores preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al término 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Los líderes preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Los líderes adecuados para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos y que cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina para ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus Niger.

Las secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura están descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control puede también ser una región codificante del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede intrínsecamente contener una región codificante del péptido señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es foráneo a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal foráneo puede ser requerida donde la secuencia codificante naturalmente no contiene una región codificante del péptido señal. De forma alternativa, la región codificante del péptido señal foráneo puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para aumentar la secreción del polipéptido. No obstante, cualquier región codificante del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de NCIB 11837 de Bacillus, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señales están descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57, 109-137.

Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes filamentosas fúngicas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa.

Los péptidos señales útiles para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes del péptido señal útiles están descritas por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control puede también ser una región codificante del propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede ser convertido a un polipéptido maduro activo por seccionamiento catalítico o autocatalítico del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido puede ser obtenida de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Cuando tanto las regiones del péptido señal como del propéptido están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región de péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.

Puede también ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido con respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que causan que la expresión del gen sea activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas del operador lac, tac, y trp. En levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 puede ser usado. En hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae pueden ser usados como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son los que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrofolato-reductasa que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido sería operativamente enlazada con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden el constructo de ácidos nucleicos de la invención. Las varias secuencias del nucleótido y de control anteriormente descritas pueden ser unidas para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en estos sitios. De forma alternativa, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser expresada insertando la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante está localizada en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial.

El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al ser introducido en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique con el(los) cromosoma(s) donde ha sido integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducidos en el genoma de la célula huésped, o un transposón puede ser usado.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares.

Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos.

Preferidos para el uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de nucleótidos adicionales permiten que el vector sea integrado en el genoma de la célula huésped en una(s) ubica-
ción(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de nucleótidos, tal como 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible 800 a 1.500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por un lado, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede además comprender un origen de replicación que permite que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19; pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110; pE194, pTA1060, y pAMf\beta1 que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CENE. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que hace su temperatura de funcionamiento sensible en la célula huésped (véase, p. ej., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).

Más de una copia de una secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. Un aumento en el número de copias de la secuencia de nucleótidos puede ser obtenido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de nucleótidos donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto copias adicionales de la secuencia de nucleótidos, pueden ser seleccionadas para cultivar las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (véase, p. ej., Sambrook et Al., 1989, supra).

Células huéspedes

La presente invención también se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención, que se usa ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos de la presente invención es introducido en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se duplica como se ha descrito antes.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo no unicelular, p. ej., un eucariota.

Las células unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas incluyendo, pero no limitadas a, una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En una forma de realización preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o de Bacillus subtilis. En otra forma de realización preferida, la célula de Bacillus es una Bacillus alcalofílica.

La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplastos (véase, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), que usa células competentes (véase, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

La célula huésped puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, vegetal, o fúngica.

En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica. "Fungi" como se utiliza en este caso incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como se define por Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) al igual que el Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascosporogénea (Endomycetales), levadura basidiosporogénea, y levadura de los Hongos Imperfectos (Blastomycetes). Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura será definida como se describe en biología y actividades de levadura (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Serie de simposio nº. 9,1980).

En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces,Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

En una forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En otra forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula micótica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se efectúa por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de una especie de, pero no limitada a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma.

En una forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o de Aspergillus oryzae. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En una forma de realización incluso más preferida, la célula madre filamentosa fúngica es una célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Las células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81, 1470-1474. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium están descritas por Malardier et al., 1989, Gene 78, 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en frasco de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, en flujo discontinuo, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y de carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, éste puede ser recuperado de lisados celulares.

Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático, o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático puede ser usado para determinar la actividad del polipéptido como se describe en este caso.

El polipéptido resultante puede ser recuperado por métodos conocidos en la técnica. por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía (p. ej., por intercambio iónico, por afinidad, hidrofóbica, por cromatoenfoque, y de exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas

La presente invención también se refiere a una planta transgénica, parte de la planta, o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido puede ser recuperado de la planta o parte de la planta. De forma alternativa, la planta o parte de la planta conteniendo el polipéptido recombinante puede ser usada como tal para mejorar la calidad de un alimento o alimento, p. ej., mejorando el valor nutritivo, apetecibilidad, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo. El polipéptido recuperado, planta o parte de la planta puede también ser usado para mejorar o alterar la flora digestiva en animales y
ganado.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como la poa de los prados (poa pratense, Poa), hierba forrajera tal como festuca, lolium, hierba de clima templado, tal como agrostis, y cereales, p. ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y (mazorca) de maíz.

Ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, la patata, la remolacha azucarera, las legumbres, tales como las altramuces, el guisante, la judía y la semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tales como la coliflor, la semilla de colza, y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Ejemplos de partes de plantas son tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas, y tubérculos. También tejidos vegetales específicos, tales como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas, y citoplasma están considerados como una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, está considerada como una parte de la planta.

También se incluye dentro del campo de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de la planta y células vegetales.

La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención puede ser construida conforme a métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal es construida incorporando uno o más constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y que propagan la planta modificada resultante o la célula vegetal en una planta transgénica o célula vegetal.

Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente enlazada con secuencias apropiadas reguladoras requeridas para la expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o parte de la planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huéspedes en el que el constructo de expresión ha sido integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto depende del método para la introducción del ADN que se utilice).

La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias del promotor y del terminador y opcionalmente secuencias señal o de tránsito se determina, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde, y cómo se desea que el polipéptido sea expresado. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, fase- o tejido-específica, y el producto genético puede estar dirigido a un tejido o parte de planta específicos tales como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras están, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para la expresión constitutiva, el promotor 35S-CaMV puede ser usado (Franck et al., 1980, Cell 21, 285-294). Promotores órgano específicos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24, 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et Al., 1994, Plant Mol. Biol. 24, 863-878), un promotor semilla-específico, tal como el promotor de la glutelina, prolamina, globulina, o albúmina de arroz (Wu et Al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo graso de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor semilla-específico conocido en la técnica, p. ej., como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor hoja-específico tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor del gen de la adenina metiltransferasa del virus de la chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26, 85-93), o el promotor aldP del gen de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor dañado inducible tal como el promotor pin2 de la patata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22, 573-588).

Un elemento potenciador del promotor puede también ser usado para conseguir una mayor expresión de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra describen el uso del primer intrón del gen de la actina 1 de arroz para potenciar la expresión.

El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión pueden ser elegidos entre aquellos disponibles en la técnica.

El constructo de ácidos nucleicos es incorporado en el genoma de la planta según las técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, BiolTechnology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium turnefaciens es el método elegido para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38). No obstante esto puede también ser usado para transformar monocotiledóneas, aunque generalmente se prefieren otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de oro microscópico o tungsteno revestidas con el ADN transfomante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Después de la transformación, los transformantes que tienen incorporado en su interior el constructo de expresión son seleccionados y regenerados en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad antimicrobiana de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

Composiciones

En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden un polipéptido antimicrobiano de la invención.

La composición puede comprender un polipéptido de la invención como el componente polipeptidíco más importante, p. ej., una composición monocomponente. De forma alternativa, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa.

Las composiciones pueden además comprender otro agente farmacéuticamente activo, tal como un agente biocida adicional, tal como otro polipéptido antimicrobiano que presenta actividad antimicrobiana tal como se ha definido anteriormente. El agente biocida puede ser un antibiótico, como se conoce en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, p. ej. bencilpenicilina, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, p. ej., cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicosidos; tetraciclina; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. El agente biocida puede también ser un agente antimicótico, incluyendo polienos, p. ej. anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azotes, p. ej. miconazol, cetoconazol, itraconazol y fluconazol.

En una forma de realización el agente biocida es un agente químico no enzimático. En otra forma de realización el agente biocida es un agente químico no polipeptídico.

El agente biocida puede ser capaz de reducir el número de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) incubación a 20ºC en una solución acuosa de 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa del 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa del 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa del 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa del 0,1%(p/p) del agente biocida.

El agente biocida puede también ser capaz de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, añadido en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente añadido en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente añadido en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible añadido en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

El agente biocida puede también ser capaz de reducir el número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) incubación a 20ºC en una solución acuosa del 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa del 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa del 5%(p/p); incluso más preferiblemente en una solución acuosa del 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa del 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa del 0,1%(p/p) del agente biocida.

El agente biocida puede también ser capaz de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, añadido en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente añadido en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente añadido en una concentración de 250 ppm; incluso más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible añadido en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

Las composiciones pueden comprender un material portador adecuado. Las composiciones pueden también comprender un vehículo de entrega adecuado capaz de entregar los polipéptidos antimicrobianos de la invención al locus deseado cuando las composiciones son usadas como un medicamento.

Las composiciones pueden ser preparadas conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición polipeptídica puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido para ser incluido en la composición puede ser estabilizado conforme a métodos conocidos en la técnica.

Se proveen ejemplos más abajo de usos preferidos de las composiciones polipeptídicas de la invención. La dosificación de la composición polipeptídica de la invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición pueden ser determinadas basándose en métodos conocidos en la técnica.

Métodos y Usos

La presente invención también comprende varios usos de los polipéptidos antimicrobianos de la invención. Los polipéptidos antimicrobianos son normalmente útiles en cualquier locus sometido a contaminación por bacterias, hongos, levadura o algas. Normalmente, los loci están en sistemas acuosos tales como sistemas de agua de refrigeración, agua de enjuague para lavandería, sistemas de aceites tales como aceites de corte, lubricantes, campos de aceite y similares, microorganismos donde los microorganismos necesitan ser matados o donde su crecimiento necesita ser controlado. No obstante, la presente invención puede también ser usada en todas las aplicaciones para las cuales las composiciones antimicrobianas conocidas son útiles, tales como protección de madera, látex, adhesivo, pegamento, papel, cartón, tela, cuero, plástico, calafateo, y pienso.

Otros usos incluyen conservación de alimentos, bebidas, cosméticos tales como lociones, cremas, geles, pomadas, jabones, champús, acondicionadores, antitranspirantes, desodorantes, enjuague bucal, productos para lentes de contacto, formulaciones enzimáticas, o ingredientes alimentarios.

Así, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser útiles como un desinfectante, p. ej., en el tratamiento de acné, infecciones en el ojo o la boca, infecciones de la piel; en antitranspirantes o desodorantes; en sales de baño para pies; para limpiar y desinfectar lentes de contacto, superficies duras, dientes (cuidado bucal), lesiones, magulladuras y similares.

En general se contempla que los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención sean útiles para limpieza, desinfección o inhibición del crecimiento microbiano en cualquier superficie dura. Ejemplos de superficies, que pueden ser contactadas ventajosamente con los polipéptidos antimicrobianos de la invención son superficies de equipamiento para el procesamiento usado p. ej. queserías, plantas de procesamiento químico o farmacéutico, sistemas de saneamiento del agua, plantas de procesamiento de aceite, plantas de procesamiento de pasta de papel, plantas de tratamiento de agua, y torres de enfriamiento. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención deberían ser usados en una cantidad, que sea eficaz para la limpieza, desinfección o inhibición del crecimiento microbiano en la superficie en cuestión.

Además, se contempla que los polipéptidos antimicrobianos de la invención puedan ser usados ventajosamente en un sistema de limpieza en sitio (C.I.P.) para la limpieza de cualquier tipo de equipamiento de procesamiento.

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden adicionalmente ser usados para limpiar superficies y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimentos y en cualquier área donde se preparan o sirven alimentos tales como hospitales, clínicas, restaurantes, especialmente restaurantes de comida rápida, delicatessens y similares. Puede también ser usado como un agente antimicrobiano en productos alimentarios y sería especialmente útil como un antimicrobiano de superficies en quesos, frutas y verduras y alimentos en barras saladas.

Puede también ser usado como un agente de conservación o un agente de desinfección en pinturas al agua.

Los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención son también útiles para el control microbiano en conductos de agua, y para la desinfección del agua, en particular para la desinfección del agua industrial.

La invención también expone el uso de un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención como un medicamento. Además, un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención pueden también ser usados para la producción de un medicamento para controlar o combatir microorganismos, tales como organismos fúngicos o bacterias, preferiblemente bacterias gram positivas.

La composición y polipéptido antimicrobiano de la invención pueden ser usados como un agente veterinario antimicrobiano o terapéutico humano o profiláctico. Así, la composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención pueden ser usados en la preparación de agentes veterinarios o terapéuticos humanos o agentes profilácticos para el tratamiento de infecciones microbianas, tales como infecciones bacterianas o fúngicas, preferiblemente infecciones bacterianas gram positivas. En particular, las infecciones microbianas pueden estar asociadas a enfermedades pulmonares incluyendo, pero sin limitarse a, tuberculosis, pulmonía y fibrosis cística; y enfermedades de transmisión sexual incluyendo, pero sin limitarse a, gonorrea y clamidia.

La composición de la invención comprende una cantidad eficaz del polipéptido antimicrobiano de la invención.

El término "cantidad eficaz" cuando se usa aquí se destina a significar una cantidad del polipéptido antimicrobiano que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 21 de cualquiera de la SEC ID NO:38 a SEC ID NO:46, que es suficiente para inhibir el crecimiento de los microorganismos en cuestión.

La invención también se refiere a composiciones de cicatrización de una herida o productos tales como dispositivos médicos, de bendaje tales como, p. ej., catéteres y otros para productos capilares anticaspa, tales como champús.

Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención son administradas a un huésped que sufre de o que está predispuesto a una infección microbiana. La administración puede ser tópica, localizada o sistémica, dependiendo del microorganismo específico, preferiblemente será localizada. Generalmente la dosis de los polipéptidos antimicrobianos de la invención será suficiente para reducir la población microbiana al menos aproximadamente un 50%, normalmente al menos un 1 log, y pueden ser por 2 o más logs de muerte. Los compuestos de la presente invención son administrados en una dosificación que reduce la población microbiana mientras que se minimiza cualquier efecto secundario. Está contemplado que la composición será obtenida y usada bajo el control de un médico para el uso in vivo. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención son particularmente útiles para matar bacterias gram negativas, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, y Chlamydia trachomatis; y bacterias gram-positivas, incluyendo varios estafilococos y estreptococos.

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención son también útiles para formulaciones in vitro para matar microbios, particularmente donde no se desea introducir cantidades de antibióticos convencionales. Por ejemplo, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser añadidos a preparaciones alimentarias para animales y/o humanos; o éstas pueden ser incluidas como un aditivo para cultivos in vitro de células, para prevenir el crecimiento excesivo de microbios en el cultivo de tejidos.

La susceptibilidad a la muerte de un microbio particular con los polipéptidos antimicrobianos de la invención puede ser determinada por una prueba in vitro, como se detalla en la sección experimental. Normalmente un cultivo del microbio está combinada con el polipéptido antimicrobiano en concentraciones variables durante un periodo temporal suficiente para permitir que la proteína actúe, normalmente entre aproximadamente una hora y un día. Los microbios viables son luego contados, y el nivel de muerte determinado.

Los microbios de interés incluyen, pero no se limitan a, bacterias gram-negativas, por ejemplo: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., p. ej. E. coli, Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., p. ej. S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp, p. ej. P. aeruginosa; Yersinia sp., p. ej. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; Franciscella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., p. ej. V. cholerae, V. parahemolyticus; Campylobacter sp., p. ej. C. jejuni; Haemophilus sp., p. ej. H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., p. ej. B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sp., p. ej. N. gonorrhoeae, N. meningitidis, etc. Otras bacterias de interés incluyen Legionella sp., p. ej. L. pneumophila; Listeria sp, p. ej. L. monocytogenes; Mycoplasma sp., p. ej. M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., p. ej. M. tuberculosis, M. leprae; Treponema sp., p. ej. T. pallidum; Borrelia sp., p. ej. B. burgdorferi; Leptospirae sp.; Rickettsia sp., p. ej. R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., p. ej. C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Helicobacter sp., p. ej. H. pylori, etc.

Los patógenos no bacterianos de interés incluyen patógenos fúngicos y de protozoo, p. ej. Plasmodia sp., p. ej. P. falciparum, Trypanosoma sp., p. ej. T. brucei; shistosomes; Entaemoeba sp., Cryptococcus sp., Candida sp., p. ej. C. albicans; etc.

Varios métodos para la administración pueden ser empleados. La formulación polipeptídica puede ser dada oralmente, o puede ser inyectada intravascularlmente, subcutáneamente, peritonealmente, por aerosol, oftálmicamente, intra-vejiga, tópicamente, etc. Por ejemplo, los métodos de administración por inhalación son bien conocidos en la técnica. La dosificación de la formulación terapéutica variará mucho, dependiendo del polipéptido específico antimicrobiano que debe ser administrado, la naturaleza de la enfermedad, la frecuencia de administración, la forma de administración, el aclaramiento del agente del huésped, y similares. La dosis inicial puede ser mayor, seguido de dosis de mantenimiento más pequeñas. La dosis puede ser administrada de manera tan poco frecuente como semanal o bisemanalmente, o fraccionada en dosis más pequeñas y administrada una vez o varias veces al día, semi-semanalmente, etc. para mantener un nivel de dosificación eficaz. En muchos casos, la administración oral requerirá una dosis más alta que si se administra por vía intravenosa. Los enlaces amida, al igual que los términos amino y carboxi, pueden ser modificados para una mayor estabilidad en la administración oral. Por ejemplo, el término carboxi puede ser amidado.

Formulaciones

Los compuestos de esta invención pueden ser incorporados en una variedad de formulaciones para la administración terapéutica. Más particularmente, los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas por combinación con portadores o diluyentes apropiados aceptables farmacéuticamente, y pueden ser formulados en preparaciones en formas sólida, semi-sólida, líquida o gaseosa, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, cremas, espumas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas, lociones, y aerosoles. Como tal, la administración de los compuestos puede ser conseguida de varias maneras, incluidas la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intraqueal, etc.. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser sistémicos después de la administración o pueden ser localizados por el uso de un implante u otra formulación que actúa para retener la dosis activa en el sitio de implantación.

En una forma de realización, una formulación para uso tópico comprende un agente quelante que reduce la concentración eficaz de cationes bivalentes, particularmente calcio y magnesio. Por ejemplo, agentes tales como citrato, EGTA o EDTA, pueden ser incluidos, donde se prefiere el citrato. La concentración de citrato usualmente será de aproximadamente 1 a 10 mM.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados solos, en combinación uno con otro, o pueden ser usados en combinación con otros compuestos conocidos (p. ej., perforina, agentes anti-inflamatorios, antibióticos, etc.) en formas de dosificación farmacéuticas, los compuestos pueden ser administrados en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables. Los métodos y excipientes siguientes son meramente ejemplares y de ninguna manera limitadores.

Para preparaciones orales, los compuestos pueden ser usados solos o en combinación con aditivos apropiados para hacer comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegradores, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tal como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, agentes conservantes y aromatizantes.

Los compuestos pueden ser formulados en preparaciones para inyecciones disolviéndolas, suspendiéndolas o emulsionándolas en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos sintéticos alifáticos, ésteres de ácidos alifáticos mayores o propilenoglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.

Los compuestos pueden ser utilizados en formulación de aerosol para ser administrados por inhalación. Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en propulsores presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Los compuestos pueden ser usados como lociones, por ejemplo para prevenir la infección de quemaduras, por formulación con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.

Además, los compuestos pueden ser hechos en supositorios mediante la mezcla con una variedad de bases tales como bases emulsionantes o bases hidrosolubles. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados por vía rectal por medio de un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y politilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal, pero son solidificados a la temperatura ambiente.

Formas de dosificación unitaria para administración oral o rectal tales como jarabes, elixires, y suspensiones pueden ser proporcionadas donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, pastilla o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más compuestos de la presente invención. De forma similar, las formas de dosificación unitarias para inyección o administración intravenosa pueden comprender el compuesto de la presente invención en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal o otro portador farmacéuticamente aceptable.

Implantes para formulaciones de liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Los implantes son formulados como microesferas, bloques, etc. con polímeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero erosionable que es bien tolerado por el huésped. El implante que contiene los polipéptidos antimicrobianos de la invención es colocado en la proximidad del sitio de infección, de modo que la concentración local de agente activo es aumentada con respecto al resto del cuerpo.

El término "forma de dosificación unitaria", como se utiliza en este caso, se refiere a unidades físicamente específicas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo aceptable farmacéuticamente. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la presente invención dependen del compuesto particular empleado y del efecto que debe ser conseguido, y a la farmacodinámica asociada al compuesto en el huésped.

Los excipientes aceptables farmacéuticamente, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, están fácilmente disponibles al público. Además, las sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente, tales como agentes de ajuste del pH y amortiguadores, agentes de tonicidad, estabilizadores, agentes de humidificación y similares, están fácilmente disponibles al público.

Las dosificaciones típicas para la administración sistémica variarán de 0,1 pg a 100 miligramos por kg peso de sujeto por administración. Una dosificación típica puede ser una pastilla tomada de dos a seis veces al día, o una cápsula de liberación en el tiempo o pastilla tomada una vez al día y conteniendo un contenido proporcionalmente más alto de sustancia activa. El efecto de liberación de tiempo puede ser obtenido por materiales de cápsula que se disuelven a valores de pH diferentes, por cápsulas que se liberan lentamente por presión osmótica, o por cualquier otro medio conocido de liberación controlada.

Los expertos apreciarán fácilmente que los niveles de las dosis pueden variar como función del compuesto específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Algunos compuestos específicos son más potentes que otros. Las dosificaciones preferidas para un compuesto dado son fácilmente determinables por los expertos en la técnica por una variedad de medios. Un medio preferido es medir la fuerza fisiológica de un compuesto dado.

El uso de liposomas como un vehículo de entrega es un método de interés. Los liposomas se fusionan con las células del sitio diana y entregan el contenido del lumen intracelularmente. Los liposomas son mantenidos en contacto con las células durante el tiempo suficiente para la fusión, usando varios medios para mantener el contacto, tales como aislamiento, agentes aglutinantes, y similares. En un aspecto de la invención, los liposomas están diseñados para ser aerosolizados para la administración pulmonar. Los liposomas pueden ser preparados con proteínas purificadas o péptidos que median la fusión de membranas, tales como el virus Sendai o el virus de la gripe, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de lípidos que forman liposomas, incluyendo lípidos catiónicos o zwitteriónicos, tales como la fosfatidilcolina. El lípido restante será normalmente lípido neutro o acídico, tal como colesterol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, y similares.

Para preparar los liposomas, puede ser usado el procedimiento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Brevemente, los lípidos y composición de lumen que contiene péptidos son combinados en un medio acuoso apropiado, convenientemente un medio de solución salina donde los sólidos totales estarán en la gama de aproximadamente 1-10 por ciento en peso. Después de períodos cortos de tiempo de agitación intensa, de aproximadamente 5-60 seg., el tubo es colocado en un baño maría caliente, de aproximadamente 25-40ºC y este ciclo es repetido aproximadamente 5-10 veces. La composición es luego sometida a un baño de ultrasonidos durante un periodo temporal conveniente, generalmente de aproximadamente 1-10 seg. y puede ser adicionalmente agitada por agitación en vórtex. El volumen es luego expandido añadiendo un medio acuoso, generalmente aumentando el volumen aproximadamente de 1-2 veces, seguido de agitación y enfriamiento. Este método permite la incorporación en el lumen de moléculas de alto peso molecular.

Formulaciones con otros agentes activos

Para el uso en los métodos dependientes, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser formulados con otros agentes farmacéuticamente activos, particularmente otros agentes antimicrobianos. Otros agentes de interés incluyen una amplia variedad de antibióticos, como se conoce en la técnica. Clases de antibióticos incluyen penicilinas, p. ej. penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, p. ej., cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactamo, etc.; carbapenemos; monobactamos; aminoglicósidos; tetraciclina; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc.

Agentes antimicóticos son también útiles, incluyendo polienos, p. ej. anfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azotes, p. ej. miconazol, cetoconazol, itraconazol y fluconazol. Fármacos antituberculóticos incluyen isoniazida, etambutol, estreptomicina y rifampicina. Las citoquinas pueden también ser incluidas en una formulación de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, p. ej. interferón gamma, factor alfa de necrosis tumoral, interleuquina 12, etc.

Síntesis in vitro

Los péptidos antimicrobianos de la invención pueden ser preparados por síntesis in vitro, usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Varios aparatos comerciales sintéticos están disponibles, por ejemplo sintetizadores automatizados por Applied Biosysttems Inc., Beckman, etc. Usando sintetizadores, los aminoácidos de origen natural pueden ser sustituidos con aminoácidos innaturales, particularmente isómeros D (o formas D) p. ej. D-alanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas laterales que tienen longitudes o funciones diferentes, y similares. La secuencia particular y la forma de preparación será determinada por conveniencia, economía, pureza requerida, y
similares.

La unión química puede ser proporcionada para varios péptidos o proteínas que comprenden funciones convenientes para el enlace, tales como grupos amino para la formación de amida o amina sustituida, p. ej. aminación reductiva, grupos tiol para la formación de tioéter o disulfuro, grupos carboxilo para la formación de amida, y similares.

Si se desea, se pueden introducir varios grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, lo que permite la conexión con otras moléculas o con una superficie. Así las cisteínas pueden utilizarse para hacer tioéteres, las histidinas para conectarse a un complejo de iones metálicos, los grupos carboxilo para formar amidas o ésteres, los grupos amino para formar amidas, y similares.

Los polipéptidos pueden también ser aislados y purificados conforme a métodos convencionales de síntesis recombinante. Un lisado del huésped de expresión puede ser preparado y el lisado puede ser purificado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de purificación. En su mayor parte, las composiciones que son usadas comprenderán al menos el 20% en peso del producto deseado, más normalmente al menos aproximadamente el 75% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente el 95% en peso, y para fines terapéuticos, normalmente al menos aproximadamente el 99,5% en peso, en relación con contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, los porcentajes se basarán en el total de proteína

Alimentos para animales

La presente invención está también dirigida a métodos para usar polipéptidos que tienen actividad antimicrobiana en alimento para animales, al igual que a composiciones de piensos y aditivos para piensos que comprenden los polipéptidos antimicrobianos de la invención.

El término animales incluye todos los animales, incluidos los seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes, tales como vacas, ovejas y caballos. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, p. ej. cerdos o puercos (incluidos, pero sin limitarse a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos y pollos (incluidos, pero sin limitarse a, pollos para asar, ponedores); terneros jóvenes; y peces (incluido, pero sin limitarse a, salmón).

El término pienso o composición de pienso significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada para la ingesta por un animal.

En el uso según la invención el polipéptido antimicrobiano puede ser provisto al animal antes, después, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere ésta última opción.

En una forma de realización particular, el polipéptido antimicrobiano, en la forma en la que se añade al pienso, o cuando se incluye en un aditivo para pienso, está bien definido. Bien definido significa que la preparación polipeptídica antimicrobiana tiene al menos el 50% de pureza según se determina por cromatografía de exclusión por tamaños (véase ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares la preparación polipeptídica antimicrobiana tiene al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos un 95% de pureza según se determina por este método.

Una preparación polipeptídicca antimicrobiana bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente en el pienso un polipéptido antimicrobiano que esté esencialmente libre de interferir o contaminar otros polipéptidos antimicrobianos. El término dosis se refiere correctamente en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y la capacidad de optimizar la dosificación basándose en el efecto deseado.

Para el uso en el alimento para animales, no obstante, el polipéptido antimicrobiano no necesita ser puro; puede p. ej. incluir otras enzimas, en cuyo caso podría ser denominado una preparación polipeptídica antimicrobiana.

La preparación polipeptídica antimicrobiana puede ser (a) añadida directamente al pienso (o usada directamente en un proceso de tratamiento de proteínas vegetales), o (b) puede ser usada en la producción de una o más composiciones intermedias tal como aditivos o premezclas para piensos que posteriormente se añaden al pienso (o se usa en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación polipeptídica antimicrobiana original, si se usa según (a) o (b) arriba.

Preparaciones polipeptídicas antimicrobianas con purezas de este orden de magnitud son en particular obtenibles usando métodos recombinantes de producción, mientras que éstas no son tan fácilmente obtenidas y también sometidas a una variación entre lotes mucho más alta cuando el polipéptido antimicrobiano es producido por métodos de fermentación tradicionales.

Tal preparación polipeptídica antimicrobiana puede por supuesto ser mezclada con otras enzimas.

El término proteínas vegetales como se utiliza en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada a partir de un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivados proteínicos. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es al menos 10, 20, 30, 40, 50, 0 60% (p/p).

Las proteínas vegetales pueden ser derivadas de fuentes de proteína vegetal, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es materia de una o más plantas de la familia Fabaceae, p. ej. semilla de soja, altramuz, guisante, o judía.

En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es materia de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, p. ej. remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son semilla de colza, y repollo.

Semilla de soja es una fuente de proteína de vegetal preferida.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales tal como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (mazorca), arroz, y sorgo.

El polipéptido antimicrobiano puede ser añadido al pienso en cualquier forma, tal como un polipéptido antimicrobiano relativamente puro, o en aditivo con otros componentes destinados a la adición en el alimento para animales, es decir, en forma de aditivos para alimento para animales, tal como las denominadas premezclas para alimento para animales.

En otro aspecto la presente invención se refiere a composiciones para el uso en alimento para animales, tal como alimento para animales, y aditivos de alimento para animales, p. ej. premezclas.

Aparte del polipéptido antimicrobiano de la invención, los aditivos para alimento para animales de la invención contienen al menos una vitamina soluble en grasa, y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o al menos un oligoelemento, y/o al menos un macromineral.

Además, los ingredientes de aditivo para pienso opcionales son agentes colorantes, compuestos de aroma, estabilizadores, y/o al menos otra enzima seleccionada entre fitasas EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26; xilanasas EC 3.2.1.8; galactanasas EC 3.2.1.89; y/o beta-glucanasas EC 3.2.1.4.

En una forma de realización particular estas otras enzimas están bien definidas (como se ha definido arriba para preparaciones polipeptídicas antimicrobianas).

Ejemplos de otros péptidos antimicrobianos (AMP's) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Ovispirina tal como Novispirin (Robert Lehrer, 2000), y variantes, o fragmentos de los mismos que retienen actividad antimicrobiana.

Ejemplos de otros polipéptidos antifungicidas (AFP's) son los péptidos de Aspergillus giganteus, y Aspergillus niger, al igual que variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO 02090384.

Normalmente, las vitaminas solubles en grasa y en agua, al igual que los oligoelementos forman parte de una denominada premezcla prevista para la adición al pienso, mientras que los macrominerales son normalmente añadidos al pienso por separado. Cualquiera de estos tipos de composición, enriquecidos con un polipéptido antimicrobiano de la invención, es un aditivo para alimento para animales de la invención.

En una forma de realización particular, el aditivo para alimento para animales de la invención está destinado a estar incluido (o prescrito como teniendo que ser incluido) en dietas o alimento para animales a niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente 0,05 a 5,0%; o 0,2 a 1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de pienso). Esto es así en particular para premezclas.

A continuación hay unas listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

\quad

Ejemplos de vitaminas solubles en grasa son la vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, p. ej. vitamina K3.

\quad

Ejemplos de vitaminas solubles en agua son la vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, p. ej. Ca-D-pantotenato.

\quad

Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodina, selenio, y cobalto.

\quad

Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con ave y lechones/cerdos) están catalogados en la Tabla A de WO 01/58275. Requisito nutritivo significa que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.

De forma alternativa, el aditivo para alimento para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual está incluido en el aditivo de la invención en una cantidad tal como para proporcionar una concentración-en-pienso dentro de la gama indicada en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de la Tabla A.

La presente invención también se refiere a composiciones de alimento para animales. Las composiciones o dietas de alimento para animales tienen un contenido relativamente alto de proteína. Las dietas para aves y cerdos pueden estar caracterizadas como se indica en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden estar caracterizadas como se indica en columna 4 de esta Tabla B. Además tales dietas para peces normalmente tienen un contenido bruto de grasa de 200-310 g/kg.

Una composición de alimento para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg, y además comprende al menos un polipéptido antimicrobiano como se reivindica aquí.

Además, o de forma alternativa (para el contenido bruto de proteína indicado arriba), la composición de alimento para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50
g/kg.

En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína bruta, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina están dentro de cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).

La proteína bruta es calculada como nitrógeno (N) multiplicada por un factor 6.25, es decir proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno es determinado por el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

La energía metabolizable puede ser calculada basándose en la publicación de NRC Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas para animales completas es calculado basándose en tablas de alimentos para animales tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

En una forma de realización particular, la composición de alimento para animales de la invención contiene al menos una proteína vegetal o fuente de proteína tal como se ha definido anteriormente.

En otras formas de realización adicionales particulares, la composición de alimento para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-10% de harina de pescado; y/o 0-20% de lactosuero. Las dietas para animales pueden p. ej. ser fabricadas como pienso triturado (no granulado) o pienso granulado. Normalmente, los materiales de pienso molidos son mezclados y cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales son agregados según las especificaciones para las especies en cuestión. Las enzimas pueden ser añadidas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación enzimática sólida es normalmente añadida antes o durante la fase de mezcla; y una preparación enzimática líquida es normalmente añadida después de la fase de granulación. La enzima puede también ser incorporada en un aditivo o premezcla alimentario.

La concentración enzimática final en la dieta está en la gama de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo en la gama de 5-30 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal.

El polipéptido antimicrobiano puede ser administrado en una o más de las siguientes cantidades (gamas de dosificación): 0,01-200; o 0,01-100; o 0,05-100; o 0,05-50; o 0,10-10 - todas estas gamas que son en mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg (ppm) de pienso.

Para determinar mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg de pienso, el polipéptido antimicrobiano es purificado de la composición alimentaria, y la actividad específica del polipéptido purificado antimicrobiano es determinada usando un ensayo pertinente (véase bajo actividad antimicrobiana, sustratos, y ensayos). La actividad antimicrobiana de la composición alimentaria como tal es también determinada usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína de polipéptido antimicrobiano por kg de pienso.

Los mismos principios se aplican para determinar mg de proteína de polipéptido antimicrobiano en aditivos de piensos. Por supuesto, si está disponible una muestra del polipéptido antimicrobiano usado para preparar el aditivo de pienso o el pienso, la actividad específica de esta muestra es determinada (sin necesidad de purificar el polipéptido antimicrobiano de la composición alimentaria o el aditivo).

Composición de detergente

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser añadidos a y así convertirse en un componente de una composición de detergente.

La composición de detergente de la invención puede por ejemplo ser formulada como una composición de detergente de lavado a mano o a máquina incluyendo una composición de aditivo para lavandería adecuada para el pretratamiento de tejidos manchados y una composición de suavizante añadida en el enjuague, o ser formulada como una composición de detergente para el uso en operaciones de limpieza doméstica de superficies duras en general, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina.

En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende los polipéptidos antimicrobianos de la invención y un tensioactivo. El aditivo de detergente al igual que la composición de detergente puede comprender una o varias otras enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa (tal como una lacasa), y/o una peroxidasa (tal como una haloperoxidasa).

En general las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deberían ser compatible(s) con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) debería(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.

Proteasas: proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metalo proteasa, preferiblemente una proteasa alcalina microbiana o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (p. ej. de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.

Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.

Lipasas: lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o de origen fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces), p. ej. de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, p. ej. de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, p. ej. de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophyisica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422).

Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como aquellas descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

Amilasas: amilasas adecuadas (alfa y/o beta) incluyen aquellas de origen bacteriano o de origen fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus, p. ej. una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1,296,839.

Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444.

Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o de origen fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej. las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, 5,648,263, 5,691,178, 5,776,757 y WO 89/09259.

Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como aquellas descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y WO 9901544.

Peroxidasas/oxidasas: peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p. ej. de C. cinereus, y sus variantes como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257.

La(s) enzima(s) para detergentes puede(n) ser incluida(s) en una composición de detergente añadiendo aditivos separados conteniendo una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado p. ej. como un granulado, un líquido, un lodo, etc. Las formulaciones de aditivo de detergente preferidas son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o lodos.

Granulados no pulverulentos pueden ser producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden opcionalmente ser revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento formadores de películas adecuados para la aplicación por técnicas de lecho fluidificado están dados en GB 1483591. Preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden ser preparadas según el método descrito en EP 238,216.

La composición de detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente conteniendo hasta el 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

La composición de detergente comprende uno o más tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluyendo semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los tensioactivos están normalmente presentes a un nivel del 0.1% al 60% en peso.

Cuando se incluye en su interior el detergente normalmente contendrá de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de alcohol graso), alcohol etoxisulfato, alcanosulfonato secundario, alfa-sulfo éster metílico de ácido graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.

Cuando se incluye en su interior el detergente normalmente contendrá de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 40% de un tensioactivo no fónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxialquilo, o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina ("glucamidas").

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El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).

El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), poli(vinil alcohol), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} tal como perborato o percarbonato que puede ser combinada con un activador de blanqueamiento formador de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De forma alternativa, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos de p. ej. el tipo amida, imida, o sulfona.

La(s) enzima(s) de la composición de detergente de la invención puede(n) ser estabilizada(s) usando agentes convencionales estabilizantes, p. ej., un poliol tal como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede ser formulada como se describe en p. ej. WO 92/19709 y WO 92/19708.

El detergente puede también contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como p. ej. acondicionadores de tejidos incluyendo arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de suciedad, agentes de antirredeposición de suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de decoloración, o perfumes.

Está actualmente contemplado que en las composiciones de detergentes cualquier enzima, y los polipéptidos antimicrobianos de la invención, pueden ser añadidos en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, preferiblemente 0,05-10 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, más preferiblemente 0,1-5 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, y de la forma más preferible 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado.

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden adicionalmente ser incorporados en las formulaciones de detergentes descritas en WO 97/07202.

La presente invención está posteriormente descrita por los ejemplos siguientes que no deberían ser interpretados como limitadores del ámbito de la invención.

Ejemplos

Los productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales al menos de grado reactivo.

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Ejemplo 1

Clonación, expresión y evaluación de la actividad de un polipéptido antimicrobiano (Gen2) Clonación del gen sintético que codifica Gen2

Para producir el polipéptido antimicrobiano Gen2 (SEC ID NO:2) para ensayos de actividad antimicrobiana, un gen sintético fue hecho (véase abajo) e insertado en el vector de expresión pET31 b+ (Novagen Inc.). El gen sintético fue constituido por oligonucleótidos específicamente diseñados (Cebador1 y Cebador2).

1

La digestión enzimática de sitios de endonucleasa de restricción flanqueantes (AIwNI/Aval) nos permitió clonar este gen sintético como un constructo de fusión en pET31 b+ (procedimientos estándar como se describe por el fabricante, New England Biolabs Inc.). Todos los protocolos estándares han sido descritos en otro lugar (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, 1989).

Transformación y expresión de Gen2 en E. coli

pET31 b+ recombinante fue transformado en Novablue de E. coli como se describe por el fabricante (Novagen). El plásmido fue preparado por Mini Columnas QlAprep (Qiagen Inc.) y secuenciado por secuenciación automatizada usando cebadores plásmidos específicos (Cebador3 y Cebador4):

2

El plásmido fue transformado en BLR-DE3 de E. coli según el fabricante (Novagen). Las bacterias fueron cultivadas en medios LB hasta OD_{600}\sim0,8 y la síntesis de proteínas recombinantes fue iniciada por 1 mM de IPTG (isopropil beta-D-Tiogalactopiranosido). Después de 3 horas de inducción, las bacterias fueron cosechadas, resuspendidas en tampón A de 1/10 volumenes (50 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8) y lisadas por disrupción por presión (1500 mbar). El granulado resultante fue lavado dos veces en tampón B (50 mM de tris-HCl, 10 mM de EDTA, 0.5% TritonX-100, 100 mM de NaCl, pH 8). Todos los protocolos estándares han sido descritos en otro lugar (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, 1989).

Purificación de Gen2 de cuerpos de inclusión en E. coli

El granulado que resulta de la purificación anterior contenía cuerpos de inclusión purificados. Para liberar el péptido del compañero de fusión KSI, la hidrólisis ácida fue realizada en un sitio Asp-Pro creado genéticamente, introducido N-terminalmente en el gen que codifica Gen2. Los cuerpos de inclusión fueron resuspendidos en 100 mM de fosfato sódico (pH 2.3) e incubados durante toda la noche a 85 grados Celsius. El sobrenadante resultante contenía el péptido (PAE-Gen2). La muestra fue neutralizada añadiendo 100 mM de fosfato sódico (pH 12.3). Para madurar el péptido, el péptido fue tratado con una glutamil-endopeptidasa I (de B. licheniformis). El péptido madurado fue confirmado por espectrometría de masa y purificado adicionalmente por procedimientos cromatográficos estándares.

Evaluación de concentración inhibitoria mínima (MIC)

Las concentraciones inhibitorias mínimas de Gen2 fueron determinadas usando caldo Mueller-Hinton ajustado por cationes (MHB) en el ensayo de dilución en microcaldo, donde MHB fue usado con modificaciones diferentes como se representa en la tabla 1 más abajo. El organismo de la prueba seleccionado fue Pseudomonas aeroginosa (ATCC 27853).

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TABLA 1

3

Cinética de muerte

El nivel de muerte de Gen2 fue determinado en MHB usando Pseudomonas aeroginosa (ATCC 27853) como el organismo de prueba. Las bacterias fueron incubadas con Gen2 (a una concentración 4 X MIC). En diferentes puntos temporales, diferentes diluciones de la preparación fueron colocadas en placas y una estimación de células viables fue determinada (CFU/ml). Los resultados en la Tabla 2 indican que Gen2 rápidamente mata las bacterias, con una reducción de aproximadamente 3-log en CFU en 30 minutos.

TABLA 2

4

Actividad antimicrobiana por ensayo de difusión radial (MEC)

Una versión modificada de un protocolo previamente publicado ha sido aplicada en la detección de actividad antimicrobiana (Lehrer et al., (1991) Ultra sensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides J Immunol Methods 137: 167-173). Las bacterias diana (10^{6} unidades formadoras de colonias (CFU)) fueron añadidas a 10 ml de capa base de agarosa (1% de agarosa de baja electro-endósmosis, 0,03% Caldo con tripticasa de soja, 10 mM fosfato sódico, pH 7.4, 37 grados Celsius). La suspensión fue solidificada en una placa de Petri INTEGRID (Becton Dickinson Labware). Un punzón para gel de 3 mm fue usado para hacer agujeros en la capa base de agarosa (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia). Las muestras fueron añadidas a los agujeros e incubadas a 37 grados Celsius, 3 horas. Un recubrimiento fue vertido encima y la placa fue incubada durante toda la noche (medios LB, 7.5% Agar). La actividad antimicrobiana fue vista como zonas de aclaramiento bacteriano alrededor de los pocillos. Las células vivas fueron contracoloreadas añadiendo 10 ml, 0,2 mM de MTT (azul de tiazolilo 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro). Este ensayo reveló actividad antimicrobiana (<64 \mug/ml) de Gen2 tanto contra Bacillus subtilis & Eschericia coli.

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Ejemplo 2

Evaluación de actividad antimicrobiana

Una gama de polipéptidos sintéticos antimicrobianos fue expresada en TOP10 de E. coli (Invitrogen) usando arabinosa como inductor, como se describe en el ejemplo 1 de la solicitud de patente Internacional WO 00/73433 (con modificaciones menores). La expresión de los polipéptidos antimicrobianos de la invención resultó en la inhibición del crecimiento de las células huéspedes.

Brevemente, los cultivos frescos durante toda la noche crecidos en medio RM conteniendo 0,2% de glucosa y ampicilina (100 \mug/ml) fueron diluidos 300 veces en 150 microlitros de RM conteniendo 0,2% de glicerol y ampicilina (100 \mug/ml) y concentraciones diferentes de arabinosa (0, 0,01% o 0,1%) en una placa de microtitulación e incubados a 37 grados Celsius con agitación vigorosa. La curva de crecimiento fue vigilada para medir OD_{450} usando un lector para Microbiología Bioscreen C (Thermo Electron Corporation) en intervalos de 30 minutos durante 14 horas (véase protocolo de Invitrogen de los catálogos de vectores pBAD/gIII A, B y C Nos. V450-01 para composición del tampón y de los medios).

El porcentaje de inhibición del crecimiento fue calculado como la medición de OD del punto final de cada muestra dividido por la medición de OD final obtenida de células que contienen el vector de control y multiplicado por 100. La fórmula es la siguiente:

5

donde "OD de blanco" corresponde a la OD de un pocillo vacío.

Las secuencias de aminoácidos de Gen2 y variantes sintéticas mejoradas seleccionadas están catalogadas en la tabla 3.

TABLA 3

6

Los resultados mostrados en la tabla 3 indican convincentemente que todos los polipéptidos antimicrobianos evaluados presentan fuerte actividad antimicrobiana.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9600787 A [0051] [0093]

\bullet WO 9533836 A [0066]

\bullet EP 238023 A [0093]

\bullet WO 9114772 A [0107]

\bullet WO 0158275 A [0170] [0192] [0193] [0194] [0197]

\bullet WO 9401459 A [0189]

\bullet WO 02090384 A [0189]

\bullet WO 8906279 A [0211]

\bullet WO 8906270 A [0211]

\bullet WO 9425583 A [0211]

\bullet WO 9219729 A [0212]

\bullet WO 9820115 A [0212]

\bullet WO 9820116 A [0212]

\bullet WO 9834946 A [0212]

\bullet EP 258068 A [0213]

\bullet EP 305216 A [0213]

\bullet WO 9613580 A [0213]

\bullet EP 218272 A [0213]

\bullet EP 331376 A [0213]

\bullet GB 1372034 A [0213]

\bullet WO 9506720 A [0213]

\bullet WO 9627002 A [0213]

\bullet WO 9612012 A [0213]

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<110> Novozymes A/S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Polipéptidos antimicrobianos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 10496.204-WO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Versión de patentIn 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético antimicrobiano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen Gen2 sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(57)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211>18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen Gen2 sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del cebador 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del cebador 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del cebador 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctagttat tgctcagcgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del cebador 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtagttg cgcccatcg

\hfill

19

Claims (20)

1. Polipéptido con actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos:

G-X_{1}-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-X_{7}-X_{8}-X_{9}-X_{10}-X_{11}-X_{12}-X_{13}-X_{14}-X_{15}-X_{16}-Z;

donde

X_{1} = L, I, W o M;

X_{2} = L, F, W o V;

X_{3} = S, G, K, T, R, I, N, D o E;

X_{4} = K, T, F, I, R, M, L o S;

X_{5} = L o I;

X_{6} = K, G, R, M o E;

X_{7} = K, S, I, R, T o M;

X_{8} = A, K, T, N, R o E;

X_{9} = A, G, S, I, L, T, V, M o W;

X_{10} = S, R, K o E;

X_{11} = K, M, R, H, I, N o T;

X_{12} = A, V, I, L, Y, F o T;

X_{13} = L, A, G, C, F, V o W;

X_{14} = K, Q, A, S, R o E;

X_{15} = H, G, N, R, S, M, I, V o D;

X_{16} = V, I, A o F;

Z = X_{17} -R-W-L; donde X_{17} = F, L, R, A, G, V, Y, C o P;

y donde los aminoácidos que forman el polipéptido son independientemente seleccionados de las formas D o L.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos como se expone en la reivindicación 1.

3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende el aminoácido de cualquiera de la SEC ID NO:38 a la SEC ID NO:46.

4. Polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en los aminoácidos de cualquiera de la SEC ID NO:38 a la SEC ID NO:46.

5. Polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 5 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

7. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 6.

8. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 6.

9. Método para la producción de un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el método comprendiendo:

(a)

cultivo de una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 8 bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b)

recuperación del polipéptido.

10. Método para matar o inhibir el crecimiento de células microbianas, que no es un método para el tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, comprendiendo la puesta en contacto de las células microbianas con un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

11. Composición de detergente que comprende un tensioactivo y un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

12. Polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso como un medicamento.

13. Polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso como un agente antimicrobiano terapéutico o profiláctico veterinario o humano.

14. Uso de un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la preparación de un agente terapéutico humano o veterinario para el tratamiento de una infección microbiana o para el uso profiláctico.

15. Planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal, que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad antimicrobiana tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

16. Uso de al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en alimentos para animales.

17. Uso de al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la preparación de una composición para el uso en alimento para animales.

18. Aditivo para alimento para animales comprendiendo

(a)

al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y

(b)

al menos una vitamina soluble en grasa, y/o

(c)

al menos una vitamina soluble en agua, y/o

(d)

al menos un oligoelemento, y/o

(e)

al menos un macromineral.

19. Aditivo para alimento para animales según la reivindicación 18, que además comprende fitasa, xilanasa, galactanasa, y/o beta-glucanasa.

20. Composición de alimento para animales que tiene un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido antimicrobiano tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.