PL209403B1 - Polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, oraz polinukleotyd i konstrukt kwasu nukleinowego zawierąjace sekwencję kodującą taki polipeptyd, rekombinowany wektor ekspresyjny, rekombinowana komórka gospodarz, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób uśmiercania lub hamowania wzrostu komórek drobnoustrojów i zastosowanie polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, oraz polinukleotyd i konstrukt kwasu nukleinowego zawierające sekwencję kodującą taki polipeptyd, rekombinowany wektor ekspresyjny, rekombinowana komórka gospodarz, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób uśmiercania lub hamowania wzrostu komórek drobnoustrojów i zastosowanie polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego.

Celem wynalazku jest dostarczenie polipeptydów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym oraz polinukleotydów kodujących te polipeptydydy.

Wynalazek dotyczy polipeptydu o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, wybranego z grupy obejmującej:

(a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów, która wykazuje co najmniej 70% identyczności z aminokwasami 1-40 SEQ ID NO:2 (b) polipeptyd kodowany przez sekwencję nukleotydów, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanej ostrości, z użyciem 0,2 x SSC w 42°C do przemywania, z sondą polinukleotydową wybraną z grupy obejmują cej:

(i) nić komplementarną do nukleotydów 166-285 SEQ ID NO:1, (ii) nić komplementarną do nukleotydów 70-285 SEQ ID NO:1, oraz (iii) nić komplementarną do nukleotydów 1-285 SEQ ID NO:1.

Korzystnie ten polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów, która wykazuje co najmniej 80% identyczności, co najmniej 85% identyczności, co najmniej 90% identyczności, co najmniej 95% identyczności lub co najmniej 99% identyczności z aminokwasami 1-40 SEQ ID NO:2. Korzystniej polipeptyd zawiera aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2, a najkorzystniej składa się z aminokwasów 1-40 SEQ ID NO:2.

Korzystnie polipeptyd jest kodowany przez sekwencję nukleotydów, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie-wysokiej ostrości, z użyciem 0,2 x SSC w 55°C do przemywania, korzystnie w warunkach wysokiej ostrości, z użyciem 0,1 x SSC w 60°C do przemywania, z sondą polinukleotydową wybraną z grupy obejmującej:

(i) nić komplementarną do nukleotydów 166-285 SEQ ID NO:1, (ii) nić komplementarną do nukleotydów 70-285 SEQ ID NO:1, oraz (iii) nić komplementarną do nukleotydów 1-285 SEQ ID NO:1.

Korzystniej polipeptyd jest kodowany przez sekwencję nukleotydów, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowaniewysokiej ostrości, z użyciem 0,2 x SSC w 55°C do przemywania, a korzystniej w warunkach wysokiej ostrości, z użyciem 0,1 x SSC w 60°C do przemywania, z sondą polinukleotydową, która jest nicią komplementarną do nukleotydów 166-285 SEQ ID NO:1.

Wynalazek dotyczy także polinukleotydu mającego sekwencję nukleotydów, która koduje zdefiniowany powyżej polipeptyd.

Wynalazek dotyczy również konstruktu kwasu nukleinowego zawierającego zdefiniowaną powyżej sekwencję nukleotydów, funkcjonalnie połączoną z jedną lub większą liczbą sekwencji kontrolnych, które kierują wytwarzaniem polipeptydu w odpowiednim gospodarzu.

Wynalazek dotyczy także rekombinowanego wektora ekspresyjnego zawierającego zdefiniowany powyżej konstrukt kwasu nukleinowego.

Wynalazek dotyczy ponadto rekombinowanej komórki gospodarza zawierającej zdefiniowany powyżej konstrukt kwasu nukleinowego.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania zdefiniowanego powyżej polipeptydu, charakteryzującego się tym, że:

(a) hoduje się szczep, który w swojej postaci typu dzikiego jest zdolny do wytwarzania polipeptydu, z wytworzeniem polipeptydu; oraz (b) odzyskuje się polipeptyd.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania zdefiniowanego powyżej polipeptydu, charakteryzującego się tym, że:

(a) hoduje się zdefiniowaną powyżej rekombinowana komórkę gospodarza, w warunkach sprzyjających wytwarzaniu polipeptydu; oraz (b) odzysuje się polipeptyd.

Wynalazek dotyczy także sposobu uśmiercania lub hamowania wzrostu komórek drobnoustrojów, który nie jest sposobem terapeutycznego traktowania organizmu człowieka lub zwierzęcia, chaPL 209 403 B1 rakteryzującego się tym, że komórki drobnoustrojów kontaktuje się ze zdefiniowanym powyżej polipeptydem przeciwdrobnoustrojowym.

Wynalazek dotyczy również zdefiniowanego powyżej polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego do stosowania jako lek.

Wynalazek dotyczy także zastosowania zdefiniowanego powyżej polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego do wytwarzania weterynaryjnego lub stosowanego do leczenia ludzi terapeutycznego środka do leczenia zakażenia drobnoustrojami lub do stosowania profilaktycznego.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania co najmniej jednego zdefiniowanego powyżej polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego w karmie dla zwierząt.

Definicje

Przed przedstawieniem wynalazku bardziej szczegółowo najpierw zostaną zdefiniowane następujące określenia i zastosowane konwencje.

Zasadniczo czysty polipeptyd: W kontekście wynalazku określenie „zasadniczo czysty polipeptyd oznacza preparat polipeptydu zawierający najwyżej 10% wag. innego materiału polipeptydowego z którym jest on natywnie związany (korzystne są niższe udziały procentowe innego materiału polipeptydowego, np. najwyżej 8% wag., najwyżej 6% wag., najwyżej 5% wag., najwyżej 4% wag., najwyżej 3% wag., najwyżej 2% wag., najwyżej 1% wag., oraz najwyżej 0,5% wag.). Tak też, korzystne jest aby zasadniczo czysty polipeptyd był czysty co najmniej w 92%, czyli aby polipeptyd stanowił co najmniej 92% wag. całkowitego materiału polipeptydowego obecnego w preparacie, przy czym wyższe udziały procentowe są korzystne, tak jak czysty co najmniej w 94%, czysty co najmniej w 95%, czysty co najmniej w 96%, czysty co najmniej w 97%, czysty co najmniej w 98%, co najmniej w 99% oraz czysty najbardziej w 99,5%. Ujawnione polipeptydy są korzystnie w zasadniczo czystej postaci. W szczególności, korzystne jest aby polipeptydy tutaj ujawnione były w „zasadniczo czystej postaci, tj. aby preparat polipeptydu był zasadniczo wolny od innego materiału polipeptydowego, z którym jest on natywnie związany. Można to osiągnąć np. przez wytworzenie polipeptydu dobrze znanymi metodami rekombinacji. W opisie, określenie „zasadniczo czysty polipeptyd jest synonimem określeń „wyizolowany polipeptyd oraz „polipeptyd w postaci wyizolowanej.

Działanie przeciwdrobnoustrojowe: Określenie „działanie przeciwdrobnoustrojowe definiuje się tu jako działanie, które jest w stanie uśmiercić lub zahamować wzrost komórek drobnoustrojów. W kontekście wynalazku określenie „przeciwdrobnoustrojowy oznacza, że występuje działanie bakteriobójcze i/lub bakteriostatyczne i/lub grzybobójcze i/lub hamujące wzrost grzyba i/lub wirusobójcze, przy czym określenie „bakteriobójcze należy rozumieć jako zdolny do uśmiercenia komórki bakteryjnej. Określenie „bakteriostatyczne należy rozumieć jako zdolne do zahamowania wzrostu bakterii, tj. hamujące wzrost bakterii. Określenie „grzybobójcze należy rozumieć jako zdolne do uśmiercenia komórek grzyba. Określenie „hamujące wzrost grzyba należy rozumieć jako zdolne do zahamowania wzrostu grzyba, tj . hamujące wzrost komórek grzyba. Określenie „wirusobójcze należy rozumieć jako zdolne do dezaktywacji wirusa. Określenie „komórki drobnoustrojów oznacza komórki bakterii lub grzybów (w tym drożdży).

W kontekście wynalazku określenie „hamujący wzrost komorek drobnoustrojów oznacza, ż e komórki nie są w stanie wzrostu, tj. nie są w stanie rozmnażać się.

Dla celów wynalazku, działanie przeciwdrobnoustrojowe można określić zgodnie z procedurą opisaną przez Lehrer i inni, Journal of Immunological Methods, tom 137 (2) str. 167-174 (1991).

Polipeptydy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym mogą być zdolne do zmniejszenia liczby żywych komórek Escherichia coli (DSM 1576) do 1/100 po 30 minutach inkubacji w 20°C w 25% (wag.) wodnym roztworze; korzystnie w 10% (wag.) wodnym roztworze; korzystniej w 5% (wag.) wodnym roztworze; jeszcze korzystniej w 1% (wag.) wodnym roztworze; najkorzystniej w 0,5% (wag.) wodnym roztworze; a zwłaszcza w 0,1% (wag.) wodnym roztworze polipeptydów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym.

Polipeptydy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym mogą być także zdolne do zahamowania wzrostu Escherichia coli (DSM 1576) przez 24 godziny w 25°C w drobnoustrojowej pożywce wzrostowej, przy dodaniu w stężeniu 1000 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 500 ppm; korzystniej przy dodaniu w stężeniu 250 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 100 ppm; najkorzystniej przy dodaniu w stężeniu 50 ppm; a zwłaszcza przy dodaniu w stężeniu 25 ppm.

Polipeptydy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym mogą być zdolne do zmniejszenia liczby żywych komórek Bacillus subtilis (ATCC 6633) do 1/100 po 30 minutach inkubacji w 20°C w 25% (wag.) wodnym roztworze; korzystnie w 10% (wag.) wodnym roztworze; korzystniej w 5% (wag.) wodnym

PL 209 403 B1 roztworze; jeszcze korzystniej w 1% (wag.) wodnym roztworze; najkorzystniej w 0,5% (wag.) wodnym roztworze; a zwłaszcza w 0,1% (wag.) wodnym roztworze polipeptydów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym.

Polipeptydy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym mogą być także zdolne do zahamowania wzrostu Bacillus subtilis (ATCC 6633) przez 24 godziny w 25°C w drobnoustrojowym substracie wzrostowym, przy dodaniu w stężeniu 1000 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 500 ppm; korzystniej przy dodaniu w stężeniu 250 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 100 ppm; najkorzystniej przy dodaniu do stężenia 50 ppm; a zwłaszcza przy dodaniu w stężeniu 25 ppm.

Polipeptydy według wynalazku powinny korzystnie wykazywać co najmniej 20% aktywności przeciwdrobnoustrojowej polipeptydu składającego się z sekwencji aminokwasów przedstawionej jako aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2. W szczególnie korzystnej postaci, polipeptydy powinny wykazywać co najmniej 40%, np. co najmniej 50%, korzystnie co najmniej 60%, np. co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 80%, np. co najmniej 90%, najkorzystniej co najmniej 95%, np. około lub co najmniej 100% aktywności przeciwdrobnoustrojowej polipeptydu składającego się z sekwencji aminokwasów przedstawionej jako aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2.

Identyczność: W kontekście wynalazku, homologię pomiędzy sekwencjami aminokwasów lub pomiędzy sekwencjami nukleotydów opisuje się parametrem „identyczności.

Dla celów wynalazku, stopień identyczności pomiędzy sekwencjami aminokwasów wyznacza się stosując program FASTA zawarty w wersji 2.0x pakietu programów FASTA (patrz, W.R. Pearson i D.J. Lipman (1988), „Improved Tools for Biological Sequence Analysis, PNAS 85: 2444-2448; oraz W.R. Pearson (1990) „Rapid and Sensitive Seąuence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183:63-98). Zastosowano macierz punktującą BLOSUM50, kara za przerwę wynosiła -12, a kara za wydłużenie przerwy -2.

Stopień identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami nukleotydów wyznacza się stosując ten sam algorytm i pakiet oprogramowania, jak opisany powyżej. Zastosowaną macierzą punktującą była macierz identyczności, kara za przerwę wynosiła -16, a kara za wydłużenie przerwy -4.

Fragment: W stosowanym znaczeniu „fragment SEQ ID NO: 2 oznacza polipeptyd z wydeletowanym jednym lub większą liczbą aminokwasów z N- i/lub C-końca sekwencji aminokwasów.

Wariant alleliczny: W kontekście wynalazku, określenie „wariant alleliczny oznacza którąkolwiek z dwóch lub większej liczby form genu zajmującego to samo locus chromosomalne. Zmienność alleliczna powstaje naturalnie przez mutację i może spowodować polimorfizm w populacjach. Mutacje w genie mogą być ciche (brak zmiany w kodowanym polipeptydzie) lub mogą kodować polipeptydy o zmienionych sekwencjach aminokwasów. Wariant alleliczny polipeptydu jest polipeptydem kodowanym przez wariant alleliczny genu.

Zasadniczo czysty polinukleotyd: Określenie „zasadniczo czysty polinukleotyd w stosowanym tu znaczeniu dotyczy preparatu polinukleotydu, w którym polinukleotyd został usunięty ze swojego naturalnego otoczenia, a zatem jest wolny od innych zewnętrznych lub niepożądanych sekwencji kodujących, oraz jest w postaci odpowiedniej do stosowania w systemach wytwarzania białek metodami inżynierii genetycznej. Tak też, zasadniczo czysty polinukleotyd zawiera najwyżej 10% wag. innego materiału polinukleotydowego, z którym jest on natywnie związany (korzystne są niższe procentowości innego materiału polinukleotydowego, np. najwyżej 8% wag., najwyżej 6% wag., najwyżej 5% wag., najwyżej 4% wag., najwyżej 3% wag., najwyżej 2% wag., najwyżej 1% wag., oraz najwyżej 1/2% wag.). Jednakże zasadniczo czysty polinukleotyd może zawierać naturalnie występujące nie ulegające translacji regiony 5' i 3', takie jak promotory i terminatory. Korzystne jest aby zasadniczo czysty polinukleotyd był czysty co najmniej w 92%, czyli aby polinukleotyd stanowił co najmniej 92% wag. całkowitego materiału polinukelotydowego obecnego w preparacie, przy czym wyższe procentowości są korzystne, tak jak czysty co najmniej w 94%, czysty co najmniej w 95%, czysty co najmniej w 96%, czysty co najmniej w 97%, czysty co najmniej w 98%, co najmniej w 99% oraz czysty najbardziej w 99,5%. Ujawnione polinukleotydy są korzystnie w zasadniczo czystej postaci. W szczególności, korzystne jest aby polinukleotydy tutaj ujawnione były w „zasadniczo czystej postaci, tj. aby preparat polinukelotydu był zasadniczo wolny od innego materiału polinukleotydowego, z którym jest on natywnie związany. W opisie określenie „zasadniczo czysty polinukleotyd jest synonimiczny z określeniami „wyizolowany polinukleotyd oraz „polinukleotyd w postaci wyizolowanej.

Modyfikacja(e): W kontekście wynalazku określenie „modyfikacja(e) oznacza dowolną modyfikację chemiczną polipeptydu składającego się z sekwencji aminokwasów przedstawionej jako aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2, a także genetyczną modyfikację DNA kodującego ten polipeptyd. ModyfiPL 209 403 B1 kacją(ami) może być zastąpienie(a) łańcucha bocznego aminokwasu(ów), podstawienie(a), delecja(e) i/lub insercja(e) interesującego aminokwasu(ów).

Sztuczny wariant: W stosowanym tu znaczeniu określenie „sztuczny wariant oznacza polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, wytworzony przez organizm, który eksprymuje gen zmodyfikowany w porównaniu z SEQ ID NO:1. Zmodyfikowany gen, z którego wytwarzany jest wspomniany wariant przy eksprymowaniu w odpowiednim gospodarzu, uzyskuje się poprzez interwencję człowieka drogą modyfikacji sekwencji nukleotydów ujawnionej w SEQ ID NO:1.

cDNA: Określenie „cDNA w kontekście wynalazku, obejmuje cząsteczkę DNA, która może być wytworzona przez odwrotną transkrypcję z dojrzałej, złożonej cząsteczki mRNA pochodzącej z komórki eukariotycznej. W cDNA brak jest sekwencji intronów, które są zazwyczaj obecne w odpowiadającym jej genomowym DNA. Początkowy, pierwotny transkrypt RNA jest prekursorem mRNA i przechodzi on przez serię etapów obróbki, zanim stanie się dojrzałym, złożonym mRNA. Etapy te obejmują usuwanie intronów w procesie określanym jako splicing. Zatem gdy cDNA jest wyprowadzone z mRNA, brak w nim sekwencji intronów.

Konstrukt kwasu nukleinowego: W stosowanym tu znaczeniu „konstrukt kwasu nukleinowego oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego, jedno- lub dwuniciową, która została wyizolowana z naturalnie występującego genu, lub która została zmodyfikowana tak, aby zawierała segmenty kwasu nukleinowego w postaci, w której nie występuje w naturze. Określenie konstrukt kwasu nukleinowego jest synonimiczny z określeniem „kaseta ekspresyjna, gdy konstrukt kwasu nukleinowego zawiera sekwencje kontrolne wymagane do ekspresji sekwencji kodującej według wynalazku.

Sekwencja kontrolna: Określenie „sekwencja kontrolna definiuje się tutaj jako obejmujący wszystkie składniki, które są potrzebne lub korzystne do ekspresji polipeptydu według wynalazku. Każda sekwencja kontrolna może być natywna lub obca dla sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd. Takie sekwencje kontrolne obejmują, lecz nie wyłącznie, sekwencję li-derową, sekwencję poliadenylacji, sekwencję propeptydu, promotor, sekwencję peptydu sygnałowego oraz terminator transkrypcji. Sekwencje kontrolne obejmują co najmniej promotor oraz sygnały stop transkrypcji i translacji. Sekwencje kontrolne mogą być dostarczone z łącznikami w celu wprowadzenia specyficznych miejsc restrykcyjnych ułatwiających ligację sekwencji kontrolnych z regionem kodującym sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd.

Funkcjonalnie połączona: Określenie „funkcjonalnie połączona definiuje się tu jako konfigurację, w której sekwencja kontrolna jest odpowiednio umiejscowiona względem sekwencji kodującej sekwencji DNA w pozycji takiej, że sekwencja kontrolna kieruje ekspresją polipeptydu.

Sekwencja kodująca: W użytym tu znaczeniu określenie „sekwencja kodująca obejmuje sekwencję nukleotydów, która bezpośrednio określa sekwencję aminokwasów swojego produktu białkowego. Granice sekwencji kodującej są ogólnie wyznaczane przez otwartą ramkę odczytu, która zazwyczaj zaczyna się na kodonie start ATG. Sekwencja kodująca zazwyczaj obejmuje DNA, cDNA oraz rekombinowane sekwencje nukleotydów.

Ekspresja: W kontekście wynalazku, określenie „ekspresja obejmuje jakikolwiek etap towarzyszący wytwarzaniu polipeptydu obejmujący, lecz nie wyłącznie, transkrypcję, modyfikację posttranskrypcyjną, translację, modyfikację posttranslacyjną oraz wydzielanie.

Wektor ekspresyjny: W kontekście wynalazku, określenie „wektor ekspresyjny obejmuje cząsteczkę DNA, liniową lub kolistą, zawierającą segment kodujący polipeptyd według wynalazku, który jest funkcjonalnie połączony z dodatkowymi segmentami, które umożliwiają jego transkrypcję.

Komórka gospodarz: Określenie „komórka gospodarz, w stosowanym tu znaczeniu, obejmuje jakikolwiek typ komórki, który jest podatny na transformację konstruktem kwasu nukleinowego.

Określenia „sonda polinukleotydowa, „hybrydyzacja, a także warunki o różnej ostrości są zdefiniowane w części zatytułowanej „Polipeptydy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym.

Polipeptydy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym

W pierwszej postaci wynalazek dotyczy polipeptydów o dział aniu przeciwdrobnoustrojowym, przy czym polipeptydy zawierają, korzystnie składają się z sekwencji aminokwasów wykazującej stopień podobieństwa do aminokwasów 1-40 SEQ ID NO:2 (tj. dojrzałego polipeptydu) co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, np. co najmniej 85%, jeszcze korzystniej co najmniej 90%, najkorzystniej co najmniej 95%, np. co najmniej 96%, np. co najmniej 97%, jeszcze korzystniej co najmniej 98%, np. co najmniej 99% (nazywane poniżej „homologicznymi polipeptydami). W interesują cej postaci, sekwencja aminokwasów różni się najwyż ej dziesię cioma aminokwasami (np. dziesięcioma aminokwasami), w szczególności najwyżej pięcioma aminokwasami (np. pięcioma

PL 209 403 B1 aminokwasami), np. najwyżej czterema aminokwasami (np. czterema aminokwasami), np. najwyżej trzema aminokwasami (np. trzema aminokwasami) od aminokwasów 1-40 SEQ ID NO:2. W szczególnie interesującej postaci, sekwencja aminokwasów różni się najwyżej dwoma aminokwasami (np. dwoma aminokwasami), np. jednym aminokwasem od aminokwasów 1-40 SEQ ID NO:2.

Korzystnie polipeptydy według wynalazku zawierają sekwencję aminokwasów SEQ ID NO:2; jej alleliczny wariant; lub jej fragment, który wykazuje działanie przeciwdrobnoustrojowe. W innej korzystnej postaci, polipeptyd według wynalazku zawiera aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2. W kolejnej korzystnej postaci, polipeptyd składa się z aminokwasów 1-40 SEQ ID NO: 2.

Aminokwasy tworzące polipeptyd według wynalazku mogą być niezależnie wybrane z postaci D lub L.

Polipeptyd według wynalazku może być polipeptydem typu dzikiego, wykazującym działanie przeciwdrobnoustrojowe, zidentyfikowanym i wyizolowanym z naturalnego źródła. Takie polipeptydy typu dzikiego można poddać określonej selekcji zwykłymi metodami znanymi fachowcom. Ponadto polipeptyd według wynalazku można wytworzyć metodami tasowania DNA, jak opisano w J.E. Ness i inni Nature Biotechnology 17, 893-896 (1999). Ponadto, polipeptyd wedł ug wynalazku moż e być sztucznym wariantem, który zawiera, korzystnie składa się z sekwencji aminokwasów, która ma co najmniej jedno podstawienie, delecję i/lub insercję aminokwasu w porównaniu z aminokwasami 1-40 SEQ ID NO:2. Takie sztuczne warianty można konstruować zwykłymi metodami znanymi w dziedzinie wynalazku, takimi jak ukierunkowana/losowa mutageneza polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasów przedstawioną aminokwasami 1-40 SEQ ID NO:2. W jednej postaci wynalazku, zmiany aminokwasów (w sztucznym wariancie, a także w polipeptydach typu dzikiego) mają niewielkie znaczenie, tj. są to konserwatywne podstawienia aminokwasowe, które nie wpływają w znacznym stopniu na zwijanie i/lub aktywność białka; niewielkie delecje, zazwyczaj od 1 do około 30 aminokwasów; niewielkie wydłużenia N-lub C-końca, takie jak N-końcową resztę metioniny; niewielkie peptydy łącznikowe do około 20-25 reszt; lub niewielkie wydłużenia, które ułatwiają oczyszczanie przez zmianę ogólnego ładunku lub inną funkcję, taką jak trakt poli-histydynowy, epitop antygenowy lub domena wiążąca.

Przykładami konserwatywnych podstawień są podstawienia w obrębie grupy zasadowych aminokwasów (arginina, lizyna i histydyna), kwasowych aminokwasów (kwas glutaminowy i kwas asparaginowy), polarnych aminokwasów (glutamina i asparagina), hydrofobowych aminokwasów (leucyna, izoleucyna, walina i metionina), aromatycznych aminokwasów (fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna) oraz małych aminokwasów (glicyna, alanina, seryna i treonina). Podstawienia aminokwasowe, które ogólnie nie zmieniają aktywności właściwej są znane i opisane przez np. H. Neurath i R.L. Hill, 1979, w The Proteins, Academic Press, Nowy Jork. Najpowszechniej wystę pują cymi wymianami są Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu i Asp/Gly, a także takie same wymiany w drugą stronę.

W interesującej postaci wynalazku, zmiany aminokwasów mają taki charakter, ż e zmienione zostają właściwości fizykochemiczne polipeptydów. Tak też np. można wprowadzić takie zmiany aminokwasów, które ulepszą termostabilność polipeptydu, które zmienią specyficzność substratowa, która zmienia optimum pH itp.

Korzystnie liczba takich podstawień, delecji i/lub insercji w porównaniu z aminokwasami 1-40 w SEQ ID NO:2 wynosi najwyż ej 10, tak jak najwyż ej 9, np. najwyż ej 8, korzystniej najwyż ej 7, np. najwyżej 6, np. najwyżej 5, najkorzystniej najwyżej 4, np. najwyżej 3, np. najwyżej 2, w szczególności najwyżej 1.

Wyizolowano gen kodujący polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym z Pseudoplectania nigrella. Szczep Pseudoplectania nigrella niosący gen zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapesztańskim O Międzynarodowym Uznawaniu Depozytów Mikroorganizmów Do Celów Postępowania Patentowego z dnia 28 stycznia 1997 r. w Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Holandia (alternatywnie skrytka pocztowa 85167, 3508 AD Utrecht, Holandia), z przyznanym numerem dostę pu CBS 444.97.

W kolejnej postaci, wynalazek dotyczy polipeptydów o dział aniu przeciwdrobnoustrojowym, które są kodowane przez sekwencje nukleotydów, które hybrydyzują w warunkach umiarkowanej ostrości, korzystniej w warunkach umiarkowanie-wysokiej ostrości, jeszcze korzystniej w warunkach wysokiej ostrości, a najkorzystniej w warunkach bardzo wysokiej ostrości z sondą polinukleotydową wybraną z grupy obejmującej (i) nić komplementarną do nukleotydów 166 - 285 SEQ ID NO:1, (ii) nić komplementarną do sekwencji cDNA zawartej w nukleotydach 70-285 SEQ ID NO:1, oraz (iii) nić komplePL 209 403 B1 mentarną do nukleotydów 1-285 SEQ ID NO:1 (J. Sambrook, E. F. Fritsch i T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor, Nowy Jork).

Sekwencję nukleotydów SEQ ID NO:1 lub jej podsekwencję, jak również sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2 lub jej fragment, można stosować do zaprojektowania sondy polinukleotydowej do identyfikacji oraz klonowania DNA kodującego polipeptydy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym ze szczepów z różnych rodzajów lub gatunków metodami znanymi fachowcom. W szczególności takie sondy można stosować do hybrydyzacji z genomowym DNA lub cDNA interesującego rodzaju lub gatunku, zgodnie ze znanymi procedurami analizy metodą Southern biot, w celu identyfikacji i izolacji z niego odpowiadają cego genu. Takie sondy mogą być znacznie krótsze ni ż cał a sekwencja, ale powinny mieć długość co najmniej 15, korzystnie co najmniej 25, korzystniej co najmniej 35 nukleotydów, np. co najmniej 70 nukleotydów. Jednakże korzystne jest, aby sonda polinukleotydową miała długość co najmniej 100 nukleotydów. Tak też np. sonda polinukleotydową może mieć długość co najmniej 200 nukleotydów, co najmniej 300, co najmniej 400 nukleotydów lub co najmniej 500 nukleotydów. Można stosować nawet jeszcze dłuższe sondy np. sondy polinukleotydowe, które mają długość co najmniej 600 nukleotydów, co najmniej 700 nukleotydów, co najmniej 800 nukleotydów lub co najmniej 900 nukleotydów. Można stosować sondy zarówno DNA, jak i RNA. Sondy zazwyczaj znakuje się do wykrycia odpowiedniego genu (np. z użyciem 32P, 3H, 35S, biotyny lub awidyny).

Bibliotekę genomowego DNA lub cDNA otrzymaną z takich innych organizmów można przeszukać pod względem DNA, który hybrydyzuje z opisanymi powyżej sondami, oraz który koduje polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Genomowy lub inny DNA z takich innych organizmów można rozdzielić metodą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym lub innymi metodami rozdziału. DNA z bibliotek lub rozdzielony DNA można przenieść i unieruchomić na nitrocelulozie lub innych odpowiednich materiałach nośnikowych. W celu zidentyfikowania klonu lub DNA, homologicznego z SEQ ID NO:1, materiał nośnikowy z unieruchomionym DNA stosuje się w analizie metodą Southern blot.

Dla celów wynalazku, hybrydyzacja oznacza, że sekwencja nukleotydów hybrydyzuje ze znakowaną sondą polinukleotydową, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydów przedstawioną w SEQ ID NO:1 w warunkach o ostrości od bardzo niskiej do bardzo wysokiej. Cząsteczki, z którymi hybrydyzuje sonda polinukleotydową w tych warunkach, można wykrywać stosując kliszę rentgenowską lub inną znaną metodą. Gdy określenie „sonda polinukleotydową stosuje się w kontekście wynalazku, należy rozumieć, że taka sonda zawiera co najmniej 15 nukleotydów.

W interesują cej postaci, sondę polinukleotydową stanowi nić komplementarna do nukleotydów 166-285, nukleotydów 70-285 lub nukleotydów 1-285 SEQ ID NO:1.

W innej interesującej postaci, sondę polinukleotydową stanowi nić komplementarna do sekwencji nukleotydów, która koduje polipeptyd o SEQ ID NO:2. W kolejnej interesującej postaci sondę polinukleotydową stanowi nić komplementarna do SEQ ID NO:1. W kolejnej interesującej postaci sondę polinukleotydową stanowi nić komplementarna do regionu SEQ ID NO:1 kodującego dojrzały polipeptyd.

W przypadku długich sond o długości co najmniej 100 nukleotydów, warunki o ostrości od bardzo niskiej do bardzo wysokiej definiuje się jako prehybrydyzację i hybrydyzację w 42°C w 5X SSPE,

1,0% SDS, 5x roztworze Denhardta, 100 μg/ml pociętego i zdenaturowanego DNA z nasienia łososia, zgodnie ze znanymi procedurami analizy metodą Southern blot. Korzystnie długie sondy o długości co najmniej 100 nukleotydów nie zawierają więcej niż 1000 nukleotydów. W przypadku długich sond o długości co najmniej 100 nukleotydów, materiał nośnikowy ostatecznie przemywa się trzykrotnie za każdym razem przez 15 minut stosując 2x SSC, 0,1% SDS w 42°C (warunki bardzo niskiej ostrości), korzystnie przemywa się trzykrotnie za każdym razem przez 15 minut stosując 0,5x SSC, 0,1% SDS w 42°C (warunki niskiej ostrości), korzystniej przemywa się trzykrotnie za każdym razem przez 15 minut stosując 0,2x SSC, 0,1% SDS w 42°C (warunki umiarkowanej ostrości), jeszcze korzystniej przemywa się trzykrotnie za każdym razem przez 15 minut stosując 0,2x SSC, 0,1% SDS w 55°C (warunki umiarkowanie-wysokiej ostrości), najkorzystniej przemywa się trzykrotnie za każdym razem przez 15 minut stosując 0,1x SSC, 0,1% SDS w 60°C (warunki wysokiej ostrości), w szczególności przemywa się trzykrotnie za każdym razem przez 15 minut stosując 0,1x SSC, 0,1% SDS w 68°C (warunki bardzo wysokiej ostrości).

Pomimo tego, że nie jest to ogólnie korzystne, uważa się, że można także stosować krótsze sondy, np. sondy, które mają długość 15-99 nukleotydów, np. około 15-70 nukleotydów. W przypadku takich krótkich sond warunki ostrości definiuje się jako prehybrydyzację, hybrydyzację i przemywanie

PL 209 403 B1 po hybrydyzacji w temperaturze o 5-10°C niższej od obliczonej Tm według Bolton i McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) w 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1x roztworze Denhardta, 1 mM pirofosforanie sodu, 1 mM jednozasadowy fosforan sodu, 0,1 mM ATP i 0,2 mg drożdżowego RNA na ml, zgodnie ze znanymi procedurami analizy metodą Southern biot.

W przypadku krótkich sond, które mają długość około 15-99 nukleotydów, materiał nośnikowy przemywa się raz w 6X SCC plus 0,1% SDS przez 15 minut, a następnie dwukrotnie po 15 minut stosując 6X SSC w temperaturze o 5-10°C niższej niż obliczona Tm.

Wydłużenie na N-końcu

Wydłużenie na N-końcu może dogodnie zawierać 1-50 aminokwasów, korzystnie 2-20 aminokwasów, w szczególności 3-15 aminokwasów. W jednej postaci N-końcowe wydłużenie peptydowe nie zawiera Arg (R). W innej postaci N-końcowe wydłużenie zawiera miejsce cięcia kex2 lub kex2-podobne, co zostanie dalej przedyskutowane poniżej. W korzystnej postaci N-końcowe wydłużenie jest peptydem zawierającym co najmniej dwie reszty aminokwasowe Glu (E) i/lub Asp (D), tak że N-końcowe wydłużenie zawiera jedną z poniższych sekwencji: EAE, EE, DE, DD.

Miejsca kex2

Miejsca kex2 (patrz np. Methods in Enzymology tom 185, red. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, „Gene Expression Technology) i miejsca kex2-podobne są dwuzasadowymi miejscami rozpoznawanymi (tj. miejscami trawienia) występującymi pomiędzy regionem kodującym propeptyd i dojrzałym regionem pewnych białek.

Wykazano, że wstawienie miejsca kex2 lub miejsca kex2-podobnego w pewnych przypadkach zwiększa prawidłową obróbkę przez endopeptydazę w miejscu cięcia pro-peptydu wywołując zwiększenie poziomu wydzielania białka.

W kontekś cie wynalazku wstawienie miejsca kex2 lub kex2-podobnego stwarza moż liwość osiągnięcia trawienia w pewnej pozycji w N-końcowym wydłużeniu, co prowadzi do wydłużonego polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego w porównaniu z dojrzałym polipeptydem przedstawionym jako aminokwasy 1 do 40 SEQ ID NO:2.

Źródła polipeptydów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym

Polipeptyd według wynalazku można uzyskać z mikroorganizmów dowolnego rodzaju. Dla celów wynalazku, określenie „uzyskać z w użytym znaczeniu oznacza, że polipeptyd kodowany przez sekwencję nukleotydów wytwarzany jest przez komórkę w której sekwencja nukleotydów jest naturalnie obecna, lub do której sekwencja nukleotydów została wstawiona. W korzystnej postaci, polipeptyd jest wydzielany na zewnątrz komórki.

Polipeptyd według wynalazku może być polipeptydem bakteryjnym. Tak też np. polipeptyd może być polipeptydem bakterii Gram dodatnich, np. polipeptydem Bacillus np. polipeptydem Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, lub Bacillus thuringiensis; lub Streptomyces np. polipeptydem Streptomyces lividans lub Streptomyces murinus; lub polipeptydem bakterii Gram ujemnych np. polipeptydem E. coli lub Pseudomonas sp.

Polipeptyd według wynalazku może być polipeptydem pochodzącym z grzybów, a korzystniej drożdżowym polipeptydem, np. polipeptydem Candida, Kluyveromyces, Pichia, polipeptydem Saccharomyces, Schizosaccharomyces lub Yarrowia; lub korzystniej polipeptydem z grzybów strzępkowych, np. polipeptydem Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium lub Trichoderma.

W interesują cej postaci, polipeptyd jest polipeptydem Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis lub Saccharomyces oviformis.

W innej korzystnej postaci, polipeptyd jest polipeptydem z Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides,

PL 209 403 B1

Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei lub Trichoderma viride.

W korzystnej postaci, polipeptyd jest polipeptydem Pseudoplectania nigrella, a korzystniej polipeptydem Pseudoplectania nigrella CBS 444.97, np. polipeptydem składającym się z sekwencji aminokwasów 1-40 SEQ ID NO:2.

Należy zdawać sobie sprawę, że w przypadku wspomnianych powyżej gatunków wynalazek obejmuje zarówno stan idealny, jak i niedoskonały, oraz inne odpowiedniki taksonomiczne np. anamorfy, niezależnie od nazwy gatunku, pod którą są one znane. Fachowcy łatwo rozpoznają tożsamość stosownych odpowiedników.

Szczepy tych gatunków są łatwo dostępne publicznie z kilku kolekcji szczepów, takich jak American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) oraz Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Takie polipeptydy można ponadto zidentyfikować i uzyskać z innych źródeł, włącznie z mikroorganizmami izolowanymi z natury (np. gleby, kompostu, wody itd.) stosując wspomniane powyżej sondy. Metody izolacji mikroorganizmów z naturalnych siedlisk są dobrze znane. Następnie sekwencję nukleotydów można znaleźć przez podobne przeszukanie biblioteki DNA genomowego lub DNA innego mikroorganizmu. Gdy sekwencja nukleotydów kodująca polipeptyd zostanie wykryta za pomocą sondy (sond), sekwencję tą można wyizolować lub sklonować stosując metody znane fachowcom (patrz np. Sambrook i inni, 1989, supra).

Polipeptydy kodowane przez sekwencje nukleotydów według wynalazku obejmują także zfuzowane polipeptydy lub rozszczepialne polipeptydy fuzyjne, w których inny polipeptyd jest zfuzowany z N-koń cem lub C-koń cem polipeptydu lub jego fragmentu. Zfuzowany polipeptyd wytwarza się przez zfuzowanie sekwencji nukleotydów (lub jej części) kodującej inny polipeptyd z sekwencją nukleotydów (lub jej częścią) według wynalazku. Sposoby wytwarzania polipeptydów fuzyjnych są znane i obejmują ligację sekwencji kodujących polipeptydy tak, że znajdują się one w ramce odczytu, a ekspresja zfuzowanego polipeptydu jest pod kontrolą tego samego promotora(ów) i terminatora.

Polinukleotydy i sekwencje nukleotydów

Wynalazek dotyczy także polinukleotydów mających sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd według wynalazku. W szczególności wynalazek dotyczy polinukleotydów składających się z sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd według wynalazku. W korzystnej postaci, sekwencją nukleotydów jest sekwencja przedstawiona w SEQ ID NO1. W korzystniejszej postaci, sekwencją nukleotydów jest region SEQ ID NO1 kodujący dojrzały polipeptyd. Wynalazek także obejmuje polinukleotydy zawierające, korzystnie składające się z sekwencji nukleotydów kodujących polipeptyd składający się z sekwencji aminokwasów SEQ ID NO:2 lub jego dojrzał y polipeptyd, które róż nią się od SEQ ID NO1 ze względu na degenerację kodu genetycznego.

Wynalazek dotyczy także polinukleotydów mających, korzystnie składających się z podsekwencji SEQ ID NO:1, która koduje fragmenty SEQ ID NO: 2 o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Podsekwencją SEQ ID NO:1 jest sekwencja nukleotydów objęta przez SEQ ID NO:1, z takim wyjątkiem, że została wydeletowana jeden lub większa liczba nukleotydów z 5' i/lub 3' końca.

Wynalazek dotyczy także polinukleotydów mających, korzystnie składających się ze zmodyfikowanej sekwencji nukleotydów, która zawiera co najmniej jedną modyfikację w sekwencji SEQ ID NO:1 kodującej dojrzały polipeptyd, oraz w których zmodyfikowana sekwencja nukleotydów koduje polipeptyd zawierający aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2.

Sposoby stosowane do wyizolowania lub sklonowania sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd są znane i obejmują izolację z genomowego DNA, wypreparowanie z cDNA lub ich połączenie. Klonowanie sekwencji nukleotydów według wynalazku z takiego DNA genomowego można wykonać np. stosując dobrze znaną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) lub przeszukiwanie za pomocą przeciwciał bibliotek ekspresyjnych w celu wykrycia sklonowanych fragmentów DNA o wspólnych cechach strukturalnych. Patrz np. Innis i inni, 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nowy Jork. Można także zastosować inne procedury amplifikacji, takie jak reakcję łańcuchową ligazy (LCR), transkrypcję aktywowaną ligacją (LAT) oraz amplifikację opartą na sekwencji nukleotydów (NASBA). Sekwencja nukleotydów może być sklonowana ze szczepu sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy obecnej w Pseudoplectania, lub

PL 209 403 B1 innym lub pokrewnym organizmie i tak np. może być wariantem allelicznym lub gatunkowym regionu sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd.

Sekwencję nukleotydów można otrzymać znanymi metodami klonowania, stosowanymi w inżynierii genetycznej do przeniesienia sekwencji nukleotydów z jej naturalnej lokalizacji do innego miejsca, gdzie zostanie ona odtworzona. Procedury klonowania mogą obejmować wycięcie i wyizolowanie wymaganego fragmentu zawierającego sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd, wstawienie tego fragmentu do cząsteczki wektora i wprowadzenie zrekombinowanego wektora do komórki gospodarza, gdzie zreplikuje się wiele kopii lub klonów tej sekwencji nukleotydów. Sekwencja nukleotydów może być genomowa, cDNA, RNA, półsyntetyczna, syntetyczna lub może być ich połączeniem.

Wynalazek dotyczy także polinukleotydu zawierającego, korzystnie składającego się z sekwencji nukleotydów, która wykazuje co najmniej 70% identyczności z nukleotydami 166-285 SEQ ID NO:1. Korzystnie sekwencja nukleotydów wykazuje co najmniej 80% identyczności, np. co najmniej 90% identyczności, korzystniej co najmniej 95% identyczności, np. co najmniej 96% identyczności, np. co najmniej 97% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 98% identyczności, np. co najmniej 99% z nukleotydami 166-285 SEQ ID NO:1. Korzystnie sekwencja nukleotydów koduje polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Stopień identyczności pomię dzy sekwencjami nukleotydów wyznacza się jak wcześniej opisano (patrz część zatytułowana „Definicje). Korzystnie sekwencja nukleotydów zawiera nukleotydy 166-285 SEQ ID NO:1. W jeszcze korzystniejszej postaci, sekwencja nukleotydów składa się z nukleotydów 166-285 SEQ ID NO:1.

Modyfikacja sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd według wynalazku może być potrzebna do syntezy polipeptydu, który zawiera sekwencję aminokwasów, która ma co najmniej jedno podstawienie, delecję i/lub insercję w porównaniu z aminokwasami 1-40 SEQ ID NO:2. Te sztuczne warianty mogą różnić się w pewien zrealizowany metodami inżynierii genetycznej sposób od polipeptydu wyizolowanego z jego natywnego źródła np. warianty, które różnią się aktywnością właściwą, termostabilnością, optimum pH itp.

Dla fachowców będzie zrozumiałe, że takie modyfikacje można wprowadzić poza regionami krytycznymi dla działania cząsteczki, otrzymując nadal aktywny polipeptyd. Reszty aminokwasowe niezbędne dla aktywności polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydów według wynalazku, a zatem korzystnie nie podlegaj ą ce modyfikacji, takiej jak podstawienie, moż na zidentyfikowa ć za pomocą procedur znanych fachowcom, takich jak ukierunkowana mutageneza lub alaninowa mutageneza przeszukująca (patrz np. Cunningham i Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). W drugiej z tych metod, mutacje wprowadza się w każdej dodatnio naładowanej reszcie w cząsteczce i powstałe zmutowane cząsteczki bada pod względem działania przeciwdrobnoustrojowego w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych krytycznych dla aktywności cząsteczki. Miejsca oddziaływania enzymsubstrat można także wyznaczyć na podstawie analizy struktury trójwymiarowej wyznaczonej takimi metodami, jak analiza metodą rezonansu magnetycznego, krystalografia i znakowanie fotopowinowactwem (patrz np. de Vos i inni, 1992, Science 255: 306-312; Smith i inni, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver i inni, 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

Ponadto, sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd według wynalazku można zmodyfikować przez wprowadzenie podstawień nukleotydów, które nie powodują powstania innej sekwencji aminokwasów polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydów, ale które odpowiadają wykorzystaniu kodonów organizmu gospodarza, w którym ma być wytwarzany enzym.

Wprowadzenie mutacji do sekwencji nukleotydów w celu zmiany jednego nukleotydu na inny nukleotyd można wykonać przez ukierunkowaną mutagenezę stosując metody znane w dziedzinie wynalazku. Szczególnie przydatna jest procedura, która wykorzystuje superhelikalny, dwuniciowy wektor DNA z interesującą wstawką oraz dwa syntetyczne startery zawierające wymaganą mutację. Startery oligonukleotydowe, każdy komplementarny do przeciwległych nici wektora, wydłużają się podczas cykli temperaturowych dzięki polimerazie DNA Pfu. W wyniku wprowadzenia starterów powstaje zmutowany plazmid zawierający zaburzone przerwy. Po zakończeniu cykli temperaturowych produkt traktuje się DpnI, która jest specyficzna dla zmetylowanego i hemizmetylowanego DNA, w celu strawienia wyjś ciowej matrycy DNA oraz wyselekcjonowania zawierają cego mutację zsyntetyzowanego DNA. Można także zastosować inne procedury znane w dziedzinie wynalazku. Ogólny opis podstawień nukleotydowych, patrz np. Ford i inni, 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Wynalazek dotyczy także polinukleotydu zawierającego, korzystnie składającego się z sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, oraz hybrydyzującego

PL 209 403 B1 w warunkach umiarkowanej ostroś ci, korzystniej w warunkach umiarkowanie-wysokiej ostrości, jeszcze korzystniej w warunkach wysokiej ostrości, a najkorzystniej w warunkach bardzo wysokiej ostrości, z sondą polinukleotydową wybraną z grupy obejmującej (i) nić komplementarną do nukleotydów 166-285 SEQ ID NO:1, (ii) nić komplementarną do sekwencji cDNA zawartej w nukleotydach 70-285 SEQ ID NO:1, (iii) nić komplementarną do nukleotydów 1-285 SEQ ID NO:1.

Jak to zostanie zrozumiane, szczegóły i konkrety dotyczące hybrydyzacji sekwencji nukleotydów będą takie same lub analogiczne z aspektami hybrydyzacji przedstawionymi w opisie w części zatytułowanej „Polipeptydy mające działanie przeciwdrobnoustrojowe.

Konstrukty kwasu nukleinowego

Wynalazek dotyczy także konstruktów kwasu nukleinowego zawierających sekwencję nukleotydów według wynalazku funkcjonalnie połączoną z jedną lub większą liczbą sekwencji kontrolnych, które kierują ekspresją sekwencji kodującej w odpowiedniej komórce gospodarzu w warunkach odpowiadających sekwencjom kontrolnym.

Sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd według wynalazku można poddać manipulacji na wiele sposobów, tak by zapewnić ekspresję polipeptydu. Manipulacja sekwencją nukleotydów przed jej wstawieniem do wektora może być wymagana lub konieczna zależnie od wektora ekspresyjnego. Metody modyfikacji sekwencji nukleotydów z wykorzystaniem metody rekombinacji DNA są dobrze znane.

Sekwencją kontrolną może być sekwencja odpowiedniego promotora, sekwencja nukleotydów, która jest rozpoznawana przez komórkę gospodarza do ekspresji sekwencji nukleotydów. Sekwencja promotora zawiera transkrypcyjne sekwencje kontrolne, które kierują ekspresją polipeptydu. Promotorem może być dowolna sekwencja nukleotydów, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarzu, włącznie ze zmutowanymi, skróconymi i hybrydowymi promotorami, przy czym można ją otrzymać z genów kodujących polipeptydy zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe, homologiczne lub heterologiczne względem komórki gospodarza.

Przykładami odpowiednich promotorów do kierowania transkrypcją konstruktów kwasu nukleinowego według wynalazku, w szczególności w bakteryjnej komórce gospodarzu, są promotory uzyskane z operonu lac E. coli, genu agarazy (dagA) Streptomyces coelicolor, genu e-2,6-fruktozylotransferazy (sacB) Bacillus subtilis, genu α-amylazy (amyL) Bacillus licheniformis, genu maltogennej amylazy (amyM) Bacillus stearothermophilus, genu α-amylazy (amyQ) Bacillus amyloliguefaciens, genu penicylinazy (penP) Bacillus licheniformis, genów xylA i xylB Bacillus subtilis oraz prokariotycznego genu β-laktamazy (Villa-Kamaroff i inni, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), a także promotora tac (DeBoer i inni, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21- 25). Dalsze promotory opisano w „Useful proteins from recombinant bacteria Scientific American, 1980, 242: 74-94; oraz w Sambrook i inni, 1989, supra.

Przykłady odpowiednich promotorów do kierowania transkrypcją konstruktów kwasu nukleinowego według wynalazku w komórkach gospodarzach grzybów strzępkowych obejmują promotory uzyskane z genów amylazy TAKA Aspergillus oryzae, proteinazy asparaginianowej Rhizomucor miehei, obojętnej α-amylazy Aspergillus niger, kwasostabilnej α-amylazy Aspergillus niger, glukoamylazy (glaA) Aspergillus niger lub Aspergillus awamori, lipazy Rhizomucor miehei, zasadowej proteazy Aspergillus oryzae, izomerazy fosforanów trioz Aspergillus oryzae, acetamidazy Aspergillus nidulans oraz trypsynopodobnej proteazy Fusarium oxysporum (WO 96/00787), a także promotor NA2-tpi (hybryda promotorów z genów obojętnej α-amylazy Aspergillus niger i izomerazy fosforanów trioz Aspergillus oryzae), oraz te promotory zmutowane, skrócone oraz hybrydowe.

W drożdżowych komórkach gospodarzach promotory uzyskuje się z genów enolazy (ENO-1) Saccharomyces cerevisiae, galaktokinazy (GALI) Saccharomyces cerevisiae, dehydrogenazy alkoholowej/dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicerynowego (ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae oraz kinazy 3-fosfoglicerynianu Saccharomyces cerevisiae. Inne użyteczne promotory dla drożdżowych komórek gospodarzy opisano w Romanos i inni, 1992, Yeast 8: 423-488.

Sekwencją kontrolną może być także odpowiednia sekwencja terminatora transkrypcji, sekwencja rozpoznawana przez komórkę gospodarza jako sygnał do zakończenia transkrypcji. Sekwencja terminatora jest funkcjonalnie połączona z 3'-końcem sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd. Dowolny terminator działający w wybranej komórce gospodarzu można stosować według wynalazku.

Korzystne terminatory dla komórek gospodarzy grzybów strzępkowych uzyskuje się z genów amylazy TAKA Aspergillus oryzae, glukoamylazy Aspergillus niger, syntazy antranilanu Aspergillus nidulans, α-glukozydazy Aspergillus niger oraz trypsyno-podobnej proteazy Fusarium oxysporum.

PL 209 403 B1

Korzystne terminatory z drożdżowych komórek gospodarzy uzyskuje się z genów enolazy Saccharomyces cerevisiae, cytochromu C (CYC1) Saccharomyces cerevisiae oraz dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicerynowego Saccharomyces cerevisiae. Inne użyteczne terminatory z drożdżowych komórek gospodarzy opisano w Romanos i inni, 1992, supra.

Sekwencją kontrolną może być także odpowiednia sekwencja liderowa, nie ulegający translacji region mRNA, który jest ważny dla translacji przez komórkę gospodarza. Sekwencja liderowa jest funkcjonalnie połączona z 5'-końcem sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd. W wynalazku można stosować dowolną sekwencję liderową, działającą w wybranej komórce gospodarzu.

Korzystne sekwencje liderowe z komórek gospodarzy grzybów strzępkowych uzyskuje się z genów amylazy TAKA Aspergillus oryzae oraz izomerazy fosforanów trioz Aspergillus nidulans.

Odpowiednie sekwencje liderowe dla drożdżowych komórek gospodarzy uzyskuje się z genów enolazy (ENO-1) Saccharomyces cerevisiae, kinazy 3-fosfoglicerynianu Saccharomyces cerevisiae, czynnika a Saccharomyces cerevisiae oraz dehydrogenazy alkoholowej/dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicerynowego (ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae.

Sekwencją kontrolną może także być sekwencja poliadenylacji, sekwencja funkcjonalnie połączona z 3'-końcem sekwencji nukleotydów, która przy transkrypcji jest rozpoznawana przez komórkę gospodarza jako sygnał do dodania reszt poliadenozyny do transkrybowanego mRNA. Jakakolwiek sekwencja poliadenylacji, która działa w wybranej komórce gospodarzu może być stosowana według wynalazku.

Korzystne sekwencje poliadenylacji dla komórek gospodarzy grzybów strzępkowych uzyskuje się z genów amylazy TAKA Aspergillus oryzae, glukoamylazy Aspergillus niger, syntazy antranilanu

Aspergillus nidulans, trypsyno-podobnej proteazy Fusarium oxysporum oraz α-glukozydazy Aspergillus niger.

Użyteczne sekwencje poliadenylacji dla drożdżowych komórek gospodarzy opisano w Guo i Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

Sekwencją kontrolną może być także region kodujący peptyd sygnałowy kodujący sekwencję aminokwasów przyłączoną na N-końcu polipeptydu, która kieruje kodowany polipeptyd na szlak wydzielniczy komórki. Koniec 5' sekwencji kodującej w sekwencji nukleotydów może z natury zawierać region kodujący peptyd sygnałowy połączony w ramce odczytu translacji z segmentem regionu kodującego, który koduje wydzielany polipeptyd. Alternatywnie, 5'-koniec sekwencji kodującej może zawierać region kodujący peptyd sygnałowy, który jest obcy dla sekwencji kodującej. Obcy region kodujący peptyd sygnałowy może być niezbędny, gdy sekwencja kodująca naturalnie nie zawiera regionu kodującego peptyd sygnałowy. Alternatywnie, obcy region kodujący peptyd sygnałowy może łatwo zastąpić naturalny region kodujący peptyd sygnałowy w celu zwiększenia wydzielania polipeptydu. Jednakże dowolny region kodujący peptyd sygnałowy, który kieruje eksprymowany polipeptyd na szlak wydzielniczy w wybranej komórce gospodarzu, może być stosowany według wynalazku.

Region kodujący peptyd sygnałowy obejmuje nukleotydy 1-69 SEQ ID NO:1, które kodują aminokwasy od -55 do -33 SEQ ID NO:2 (lub aminokwasy 1-23 SEQ ID NO:3).

Skuteczne regiony kodujące peptyd sygnałowy dla bakteryjnych komórek gospodarzy są regionami kodującymi peptydy sygnałowe uzyskanymi z genów maltogennej amylazy Bacillus NCIB 11837, α-amylazy Bacillus stearothermophilus, subtylizyny Bacillus licheniformis, β-laktamazy Bacillus licheniformis, obojętnych proteaz (nprT, nprS, nprM) Bacillus stearothermophilus oraz prsA Bacillus subtilis. Kolejne peptydy sygnałowe opisano w Simonen i Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Skutecznymi regionami kodującymi peptydy sygnałowe komórek gospodarzy grzybów strzępkowych są regiony kodujące peptydy sygnałowe uzyskane z genów amylazy TAKA Aspergillus oryzae, obojętnej amylazy Aspergillus niger, glukoamylazy Aspergillus niger, proteinazy asparaginianowej Rhizomucor miehei, celulazy Humicola insolens oraz lipazy Humicola lanuginosa.

Użyteczne peptydy sygnałowe dla drożdżowych komórek gospodarzy uzyskuje się z genów czynnika a Saccharomyces cerevisiae oraz inwertazy Saccharomyces cerevisiae. Inne użyteczne regiony kodujące peptydy sygnałowe opisano w Romanos i inni, 1992, supra.

Sekwencją kontrolną może być także region kodujący propeptyd, który koduje sekwencję aminokwasów umiejscowioną na N-końcu polipeptydu. Powstały polipeptyd jest znany jako proenzym lub propolipeptyd (lub w niektórych przypadkach zymogen). Propolipeptyd jest ogólnie nieaktywny i może ulec przemianie do dojrzałego aktywnego polipeptydu na drodze katalitycznego lub autokatalitycznego odszczepienia propeptydu od propolipeptydu. Region kodujący propeptyd można otrzymać z genów kodujących zasadową proteazę (aprE) Bacillus subtilis, obojętną proteazę (nprT) Bacillus subtilis,

PL 209 403 B1 czynnik α Saccharomyces cerevisiae, proteinazę asparaginianową Rhizomucor miehei oraz lakazy Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Region kodujący propeptyd obejmuje nukleotydy 70-165 SEQ ID NO:1, które kodują aminokwasy od -32 do -1 SEQ ID NO:2 (lub aminokwasy 24 - 55 SEQ ID NO:3).

Gdy na N-końcu polipeptydu obecne są regiony zarówno peptydu sygnałowego, jak i propeptydu, region propeptydu jest umiejscowiony zaraz za N-końcem polipeptydu, a region peptydu sygnałowego jest umiejscowiony zaraz za N-końcem regionu propeptydu.

Wymagane może być także dodanie sekwencji regulatorowych, które umożliwiają regulację ekspresji polipeptydu względem wzrostu komórki gospodarza. Do przykładowych systemów regulatorowych należą te, które powodują włączenie lub wyłączenie ekspresji genu w odpowiedzi na chemiczny lub fizyczny bodziec, włącznie z obecnością związku regulatorowego. Systemy regulatorowe w układach prokariotycznych obejmują systemy operatorów lac, tac i trp. W droż dż ach można zastosować system ADH2 lub system GAL1. W grzybach strzępkowych jako sekwencje regulatorowe można zastosować promotor α-amylazy TAKA, promotor glukoamylazy Aspergillus niger oraz promotor glukoamylazy Aspergillus oryzae. Innymi przykładami sekwencji regulatorowych są takie, które pozwalają na amplifikacje genu. W układach eukariotycznych obejmują one gen reduktazy dihydrofolanu, który jest amplifikowany w obecności metotreksatu oraz geny metalotionein, które są amplifikowane w obecności metali ciężkich. W tych przypadkach sekwencja nukleotydów kodująca polipeptyd będzie funkcjonalnie połączona z sekwencją regulatorową.

Wektory ekspresyjne

Wynalazek dotyczy także rekombinowanych wektorów ekspresyjnych zawierających konstrukt kwasu nukleinowego według wynalazku. Różne sekwencje nukleotydów i kontrolne opisane powyżej można łączyć ze sobą z wytworzeniem rekombinowanego wektora ekspresyjnego, który może zawierać jedno lub większą liczbę dogodnych miejsc restrykcyjnych, aby umożliwić wstawienie lub podstawienie w takich miejscach sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd. Alternatywnie, sekwencja nukleotydów według wynalazku może być eksprymowana przez wstawienie sekwencji nukleotydów lub konstruktu kwasu nukleinowego zawierającego tę sekwencję do odpowiedniego wektora do ekspresji. Przy tworzeniu wektora ekspresyjnego sekwencję kodującą umiejscawia się w wektorze tak, że sekwencja kodująca jest funkcjonalnie połączona z odpowiednimi do ekspresji sekwencjami kontrolnymi.

Rekombinowanym wektorem ekspresyjnym może być dowolny wektor (np. plazmid lub wirus), który można dogodnie poddać procedurom rekombinacji DNA i można doprowadzić do ekspresji sekwencji nukleotydów. Wybór wektora zazwyczaj zależy od zgodności wektora z komórką gospodarzem, do której wektor ma być wprowadzony. Wektory mogą być liniowe lub mogą być zamkniętymi kolistymi plazmidami.

Wektor może być wektorem replikującym się autonomicznie, tj. wektorem, który występuje jako jednostka zewnątrzchromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomu, np. plazmidem, elementem zewnątrzchromosomalnym, minichromosomem lub sztucznym chromosomem.

Wektor może zawierać dowolne środki do zapewnienia autoreplikacji. Alternatywnie, wektor może być takim, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza integruje się do genomu i replikuje razem z chromosomem(ami) do którego wintegrował. Można ponadto zastosować pojedynczy wektor lub plazmid albo dwa lub większą liczbę wektorów lub plazmidów, które razem zawierają całkowity DNA, który ma być wprowadzony do genomu komórki gospodarza, albo transpozon.

Wektory według wynalazku korzystnie zawierają jeden lub większą liczbę markerów selekcyjnych, które pozwalają na łatwą selekcję transformowanych komórek. Marker selekcyjny jest genem, którego produkt dostarcza oporność na biocyd lub wirusa, oporność na metale ciężkie, prototrofię dla auksotrofów itp.

Przykładami bakteryjnych markerów selekcyjnych są geny dal z Bacillus subtilis lub Bacillus licheniformis, lub markery nadające oporność antybiotykową, taką jak oporność na ampicylinę, kanamycynę, chloramfenikol lub tetracyklinę. Odpowiednimi markerami dla drożdżowych komórek gospodarzy są ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 i URA3. Markery selekcyjne do zastosowania w komórkach gospodarzach grzybów strzępkowych obejmują, lecz nie wyłącznie, amdS (acetamidazę), argB (karbamoilotransferazę ornitynową), bar (acetylotransferazę fosfinotrycyny), hygB (fosfotransferazę higromycyny), niaD (reduktazę azotanu), pyrG (dekarboksylazę 5'-fosforanu orotydyny), sC (adenylotransferazę siarczanową), trpC (syntazę antranilanową) a także ich odpowiedniki.

PL 209 403 B1

Do zastosowania w komórce Aspergillus korzystne są geny amdS i pyrG Aspergillus nidulans lub Aspergillus oryzae oraz gen bar Streptomyces hygroscopicus.

Wektory według wynalazku korzystnie zawierają element(y), który umożliwia stabilną integrację wektora do genomu komórki gospodarza lub autonomiczną replikację wektora w komórce niezależnie od genomu.

Do integracji do genomu komórki gospodarza, wektor może być oparty na sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd lub jakikolwiek inny element wektora dla stabilnej integracji wektora do genomu przez rekombinację homologiczną lub niehomologiczną. Alternatywnie, wektor może zawierać dodatkowe sekwencje nukleotydów do kierowania integracją przez rekombinację homologiczną do genomu komórki gospodarza. Dodatkowe sekwencje nukleotydów umożliwiają integrację wektora do genomu komórki gospodarza precyzyjnie w konkretnym miejscu(ach) w chromosomie(ach). Aby zwiększyć prawdopodobieństwo integracji precyzyjnie w konkretnym miejscu, elementy integracyjne powinny korzystnie zawierać wystarczającą liczbę nukleotydów, np. 100 - 1500 par zasad (pz), korzystnie 400 - 1500 pz, a najkorzystniej 800 - 1500 pz, które są wysoce homologiczne do odpowiadającej im sekwencji docelowej, co zwiększa prawdopodobieństwo rekombinacji homologicznej. Elementem integracyjnym może być jakakolwiek sekwencja, która jest homologiczna do docelowej sekwencji w genomie komórki gospodarza. Ponadto, elementy integracyjne mog ą być niekodują cymi lub kodują cymi sekwencjami nukleotydów. Z drugiej strony, wektor może zostać wintegrowany do genomu komórki gospodarza przez rekombinację niehomologiczną.

Do autonomicznej replikacji, wektor może ponadto zawierać miejsce startu replikacji umożliwiające autonomiczną replikację wektora w danej komórce gospodarzu. Przykładami bakteryjnych miejsc startu replikacji są miejsca startu replikacji plazmidów pBR322, pUC19, pACYC177 i pACYC184, umożliwiające replikację w E. coli, oraz pUBUO, pE194, pTA1060 i pAMpi umożliwiające replikację w Bacillus. Przykł ady miejsc startu replikacji do zastosowania w droż d ż owych komórkach gospodarzach są miejsce startu replikacji 2μ, ARS1, ARS4, połączenie ARS1 i CEN3, oraz połączenie ARS4 i CEN6. Miejscem startu replikacji moż e być miejsce zawierają ce mutację , która sprawia, ż e jego funkcjonowanie jest wrażliwe na temperaturę w komórce gospodarzu (patrz np. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).

Więcej niż jedną kopię sekwencji nukleotydów według wynalazku można wstawić do komórki gospodarza, aby zwiększyć wytwarzanie produktu genowego. Zwiększenie liczby kopii sekwencji nukleotydów można osiągnąć przez integrację co najmniej jednej dodatkowej kopii sekwencji do genomu komórki gospodarza lub przez włączenie namnażalnego genu markera selekcyjnego z sekwencją nukleotydów, gdzie komórki zawierające namnożone kopie genu markera selekcyjnego, a tym samym dodatkowe kopie sekwencji nukleotydów, mogą zostać wyselekcjonowane przez hodowanie komórek w obecnoś ci odpowiedniego czynnika selekcyjnego.

Procedury stosowane do ligowania opisanych powyżej elementów do skonstruowania rekombinowanych wektorów ekspresyjnych według wynalazku są dobrze znane fachowcom (patrz np. Sambrook i inni, 1989, supra).

Komórki gospodarze

Wynalazek dotyczy także rekombinowanych komórek gospodarzy zawierających konstrukt kwasu nukleinowego według wynalazku, które są korzystnie stosowane do rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydów. Wektor zawierający sekwencję nukleotydów według wynalazku wprowadza się do komórki gospodarza, tak, że wektor utrzymuje się jako element wintegrowany do chromosomu lub jako autoreplikujący się pozachromosomowy wektor, jak wcześniej opisano.

Komórka gospodarz może być drobnoustrojem jednokomórkowym, np. prokariotycznym lub drobnoustrojem niejednokomórkowym, np. eukariotycznym.

Użytecznymi komórkami jednokomórkowymi są komórki bakteryjne, takie jak bakterie Gram dodatnie, w tym, lecz nie wyłącznie, komórką Bacillus np. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis i Bacillus thuringiensis; lub komórką Streptomyces np. Streptomyces lividans lub Streptomyces murinus, lub bakterie Gram ujemne, takie jak E. coli i Pseudomonas sp. W korzystnej postaci bakteryjną komórką gospodarzem jest komórka Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus lub Bacillus subtilis. W innej korzystnej postaci, komórką Bacillus jest zasado-chłonna Bacillus.

Wprowadzenie wektora do bakteryjnej komórki gospodarza można np. przeprowadzić przez transformację protoplastu (patrz np. Chang i Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115),

PL 209 403 B1 stosując komórki kompetentne (patrz np. Young i Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, lub Dubnau i Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), elektroporację (patrz np. Shigekawa i Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) lub koniugację (patrz np. Koehler i Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

Komórką gospodarzem może być komórka eukariotyczna, taka jak komórka ssacza, owadzia, roślinna lub grzybowa.

W korzystnej postaci, komórka gospodarz jest komórką grzyba. Określenie „grzyby w stosowanym tu znaczeniu obejmuje gromady Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota i Zygomycota (jak zdefiniowano w Hawksworth i inni, w Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, wyd. 8, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), a także Oomycota (jak zacytowano w Hawksworth i inni, 1995, supra, str. 171) oraz wszystkie grzyby niedoskonałe (Hawksworth i inni, 1995, supra).

W jednej korzystnej postaci, grzybową komórką gospodarzem jest komórka drożdżowa. Określenie „drożdże w stosowanym tu znaczeniu obejmuje drożdże wytwarzające askospory (Endomycetales), drożdże wytwarzające bazydiospory oraz drożdże należące do Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ze względu na to, że klasyfikacja drożdży może się zmienić w przyszłości, dla celów wynalazku, drożdże definiuje się jak opisano w Biology and Activities of Yeast (Skinner F.A., Passmore S. M., oraz Davenport R. R., red., Soc. App. Bacteriol. Symposium Series nr 9, 1980).

W jeszcze korzystniejszej postaci, komórką drożdżową jest komórka Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces lub Yarrowia.

W najkorzystniejszej postaci, drożdżową komórką gospodarzem jest komórka Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis lub Saccharomyces oviformis. W innej korzystnej postaci, drożdżowa komórka gospodarz jest komórką Kluyveromyces lactis. W innej korzystnej postaci, drożdżową komórką gospodarzem jest komórka Yarrowia lipolytica.

W innej korzystniejszej postaci, grzybowa komórka gospodarz jest komórką grzyba strzępkowego. „Grzyby strzępkowe tworzą podgromady Eumycota i Oomycota (jak zdefiniowano w Hawksworth i inni, 1995, supra). Grzyby strzępkowe charakteryzują się ścianą grzybni złożoną z chityny, celulozy, glukanu, chitozanu, mannanu i innych złożonych polisacharydów. Wzrost wegetatywny zachodzi przez wydłużanie strzępka i katabolizm węgla jest obligatoryjnie tlenowy. W odróżnieniu od tego, wzrost wegetatywny przez drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae, polega na pączkowaniu jednokomórkowej plechy i katabolizm węgla może być fermentacyjny.

W jeszcze korzystniejszej postaci, komórka gospodarz grzyba strzępkowego jest komórką z gatunku, ale nie wyłącznie, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium lub Trichoderma.

W najkorzystniejszej postaci, komórka gospodarz grzyba strzępkowego jest komórką Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger lub Aspergillus oryzae. W innej najkorzystniejszej postaci, komórka gospodarz grzyba strzępkowego jest komórką Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides lub Fusarium venenatum. W jeszcze korzystniejszej postaci, komórka wyjściowa grzyba strzępkowego jest komórką Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). W innej najkorzystniejszej postaci komórka gospodarz grzyba strzępkowego jest komórką Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei lub Trichoderma viride.

Komórki grzybów mogą być transformowane sposobem obejmującym tworzenie protoplastu, transformację protoplastów i odtworzenie ściany komórkowej w znany sposób. Odpowiednie procedury transformacji komórek gospodarzy Aspergillus opisano w EP 238023 oraz Yelton i inni, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470- 1474. Odpowiednie sposoby transformacji gatunków Fusarium opisano w Malardier i inni, 1989, Gene 78: 147-156, oraz WO 96/00787. Drożdże można transformować stosując procedury opisane w Becker i Guarente, w Abelson J.N. i Simon M.I., red., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, tom 194, strony 182-187, Academic Press, Inc., Nowy Jork; Ito i inni, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; oraz Hinnen i inni, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

PL 209 403 B1

Sposoby wytwarzania

Wynalazek dotyczy także sposobów wytwarzania polipeptydu według wynalazku, obejmujących (a) hodowanie szczepu, który w swojej postaci typu dzikiego jest zdolny do wytwarzania polipeptydu; oraz (b) odzyskiwanie polipeptydu. Korzystnie szczep jest z rodzaju Pseudoplectania, a korzystniej

Pseudoplectania nigrella.

Wynalazek dotyczy także sposobów wytwarzania polipeptydu według wynalazku, obejmujących (a) hodowanie komórki gospodarza w warunkach sprzyjających wytwarzaniu polipeptydu; oraz (b) odzyskiwanie polipeptydu.

W sposobach wytwarzania według wynalazku, komórki hoduje się w pożywce odżywczej odpowiedniej do wytwarzania polipeptydu, sposobami znanymi fachowcom. Przykładowo, komórkę może hodować w kolbie do hodowli z wytrząsaniem, na drodze fermentacji w małej skali lub w dużej skali (w tym fermentacji ciągłych, periodycznych, periodycznych z zasilaniem lub w stanie stałym) w laboratoryjnych lub przemysłowych fermentorach, w odpowiedniej pożywce i w warunkach pozwalających na ekspresję i/lub wyizolowanie polipeptydu. Hodowlę prowadzi się w odpowiedniej pożywce odżywczej zawierającej źródła węgla i azotu oraz sole nieorganiczne, zgodnie z procedurami znanymi fachowcom. Odpowiednie pożywki są dostępne od handlowych dostawców lub mogą zostać otrzymane w oparciu o opublikowane składy (np. w katalogach American Type Culture Collection). Gdy polipeptyd jest wydzielany do pożywki odżywczej, polipeptyd może być odzyskiwany bezpośrednio z pożywki. Gdy polipeptyd nie jest wydzielany, może zostać odzyskany z lizatów komórkowych.

Polipeptydy można wykrywać znanymi metodami, specyficznymi dla polipeptydów. Te metody wykrywania obejmują zastosowanie swoistych przeciwciał, tworzenie produktu enzymu lub zanikanie substratu enzymu. Przykładowo, test enzymatyczny można zastosować do określenia aktywności polipeptydu, w opisany sposób.

Powstały polipeptyd można odzyskać znanymi sposobami. Tak też np. polipeptyd można odzyskać z pożywki odżywczej znanymi metodami obejmującymi, lecz nie wyłącznie, odwirowanie, filtrację, ekstrakcję, suszenie rozpryskowe, odparowanie lub wytrącenie.

Polipeptydy według wynalazku można oczyszczać różnymi znanymi procedurami, obejmującymi, lecz nie wyłącznie, chromatografię (np. jonowymienną, powinowactwa, hydrofobową, chromatoogniskowanie i chromatografię z wykluczeniem wielkości), procedury elektroforetyczne (np. preparatywne izoelektroogniskowanie), na podstawie różnic w rozpuszczalności (np. wytrącenie siarczanem amonu), SDS-PAGE lub ekstrakcję (patrz np. Protein Purification, J.-C. Janson i Lars Ryden, red., VCH Publishers, Nowy Jork, 1989).

Rośliny

Wynalazek znajduje również zastosowanie w konstruowaniu transgenicznej rośliny, części rośliny lub komórki roślinnej, która została transformowana sekwencją nukleotydów kodującą polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym według wynalazku, tak aby eksprymowała i wytwarzała polipeptyd w możliwych do odzyskania ilościach. Polipeptyd można odzyskiwać z rośliny lub części rośliny. Alternatywnie, roślinę lub komórkę roślinną zawierającą rekombinowany polipeptyd można stosować jako taką do poprawienia jakości żywności lub karmy np. poprawienia wartości odżywczych, smakowych i właściwości reologicznych lub zniszczenia czynnika przeciwodżywczego. Odzyskany polipeptyd, roślinę lub cześć rośliny można także stosować do poprawienia lub zmiany flory trawiennej u zwierząt i inwentarza żywego.

Rośliną transgeniczną może być roślina dwuliścienna lub jednoliścienna. Przykładami roślin jednoliściennych są trawy, takie jak wiechlina (wiechlina łąkowa, Poa), trawy paszowe, takie jak Festuca, Lolium, trawy klimatu umiarkowanego, takie jak Agrostis, oraz zboża np. pszenica, owies, żyto, jęczmień, ryż, sorgo i kukurydza.

Przykładami roślin dwuliściennych są tytoń, ziemniak, burak cukrowy, rośliny strączkowe, takie jak łubin, groch, fasola i soja oraz rośliny krzyżowe (rodzina Brassicaceae), takie jak kalafior, nasiona rzepaku oraz blisko spokrewniony organizm modelowy Arabidopsis thaliana.

Przykładami części roślin są łodyga, kallus, liście, korzeń, owoce, nasiona i bulwy. Także specyficzne składniki tkanki roślinnej, takie jak chloroplast, apoplast, mitochondria, wakuole, peroksysomy i cytoplazma, uważa się za część rośliny. Ponadto dowolna komórka roślinna, pochodząca z dowolnej tkanki, uważana jest za część rośliny.

Pojęcie rośliny transgeniczne obejmuje także rośliny potomne tych roślin, części roślin oraz komórek roślinnych.

PL 209 403 B1

Transgeniczną roślinę lub komórkę roślinną eksprymującą polipeptyd według wynalazku można skonstruować metodami znanymi fachowcom. W skrócie, roślinę lub komórkę roślinną konstruuje się przez wprowadzenie jednego lub większej liczby konstruktów kodujących polipeptyd według wynalazku do genomu komórki gospodarza oraz rozmnożenie powstałej zmodyfikowanej rośliny lub komórki roślinnej do transgenicznej rośliny lub komórki roślinnej.

Dogodnie, konstrukt ekspresyjny jest konstruktem kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd według wynalazku funkcjonalnie połączoną z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi wymaganymi do ekspresji sekwencji nukleotydów w wybranej roślinie lub części rośliny. Ponadto, konstrukt ekspresyjny może zawierać marker selekcyjny użyteczny do identyfikacji komórek gospodarzy do których wintegrowany został konstrukt ekspresyjny oraz sekwencje DNA potrzebne do wprowadzenia konstruktu do danej rośliny (ostatnia możliwość zależy od stosowanej metody wprowadzania DNA).

Wybór sekwencji regulatorowych, takich jak sekwencje promotora i terminatora, oraz ewentualnie sekwencje sygnałową lub tranzytową, ustala się na podstawie tego kiedy, gdzie i w jaki sposób ma być eksprymowany polipeptyd. Tak więc np. ekspresja genu kodującego polipeptyd według wynalazku może być konstytutywna lub indukowana, lub może być zależna od rozwoju, stadium lub tkankowospecyficzna, a produkt genu może być skierowany do specyficznej tkanki lub części rośliny, takiej jak nasiona lub liście. Sekwencje regulatorowe opisano np. w Tague i inni, 1988, Plant Physiology 86: 506.

Do konstytutywnej ekspresji można zastosować promotor 35S-CaMV (Franek i inni, 1980, Cell 21: 285-294). Promotorami specyficznymi dla narządów mogą być np. promotory z tkanek gromadzących zapasy, takich jak nasiona, bulwy ziemniaka oraz owoce (Edwards i Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-3 03), lub tkanek metabolicznych, takich jak merystemy (Ito i inni, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), promotor specyficzny dla nasienia, taki jak promotor gluteliny, prolaminy, globuliny lub albuminy ryżu (Wu i inni, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), promotor Vicia faba leguminy B4 oraz genu nieznanego białka nasienia Vicia faba (Conrad i inni, 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), promotor białka ciał olejowych nasion (Chen i inni, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), promotor zapasowego białka napA z Brassica napus, lub jakikolwiek inny znany promotor specyficzny dla nasienia, np. opisany w WO 91/14772. Ponadto promotor może być promotorem specyficznym dla liści, takim jak promotor rbes z ryżu i pomidora (Kyozuka i inni, 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), promotor genu metylotransferazy adeninowej wirusa Chlorella (Mitra i Higgins, 1995, Plant Molecular Biology 26: 85-93), promotor genu aldP z ryż u (Kagaya i inni, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) oraz promotor indukowany zranieniem, taki jak promotor pin2 ziemniaka (Xu i inni, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).

Można także zastosować element wzmacniacza promotora aby osiągnąć wyższą ekspresję enzymu w roślinie. Tak też np. elementem wzmacniacza promotora może być intron, który jest umiejscowiony pomiędzy promotorem a sekwencją nukleotydów kodującą polipeptyd według wynalazku. Przykładowo, Xu i inni, 1993, supra, ujawniają zastosowanie pierwszego intronu genu aktyny 1 z ryżu do wzmocnienia ekspresji.

Gen markera selekcyjnego oraz jakiekolwiek inne części konstruktu ekspresyjnego można wybrać spośród znanych składników.

Konstrukt kwasu nukleinowego wprowadza się do genomu rośliny znanymi metodami, włącznie z transformacją pośredniczoną przez Agrobacterium, transformacją pośredniczoną przez wirusa, mikroiniekcją, bombardowaniem cząstkami, transformacją biolistyczną, oraz elektroporacją (Gasser i inni, 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto i inni, 1989, Nature 338: 274).

Obecnie, transfer genów kierowany Agrobacterium tumefaciens jest metodą wybieraną do tworzenia transgenicznych roślin dwuliściennych (praca przeglądowa, patrz Hooykas i Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38). Jakkolwiek można ją także stosować do transformacji roślin jednoliściennych, jednakże inne metody transformacji są ogólnie korzystne dla tych roślin. Obecnie, wybieraną metodą do wytworzenia transgenicznych roślin jednoliściennych jest bombardowanie cząstkami (mikroskopijnymi cząstkami złota lub wolframu powlekanymi transformującym DNA) embrionalnego kallusa lub rozwijających się embrionów (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil i inni, 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Alternatywna metoda transformacji roślin jednoliściennych jest oparta na transformacji protoplastu, jak opisano w Omirulleh i inni, 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

PL 209 403 B1

Po transformacji, transformanty z włączonym konstruktem ekspresyjnym selekcjonuje się i regeneruje do całych roślin dobrze znanymi sposobami.

Preparaty

Polipeptyd według wynalazku można formułować w postać preparatów, takich jak preparaty farmaceutyczne zawierające przeciwdrobnoustrojowy polipeptyd według wynalazku.

Preparat może zawierać polipeptyd według wynalazku jako główny składnik polipeptydowy np. w preparacie jednoskładnikowym. Alternatywnie, preparat może zawierać wiele składników o aktywności enzymatycznej, takich jak aminopeptydaza, amyla-za, karbohydraza, karboksypeptydaza, katalaza, celulaza, chitynaza, kutynaza, glikozylotransferaza cyklodekstryny, deoksyrybonukleaza, esteraza, α-galaktozydaza, β-galaktozydaza, glukoamylaza, α-glukozydaza, β-glukozydaza, haloperoksydaza, inwertaza, lakaza, lipaza, mannozydaza, oksydaza, enzym pektynolityczny, peptydoglutaminaza, peroksydaza, fitaza, oksydaza polifenolowa, enzym proteolityczny, rybonukleaza, transglutaminaza lub ksylanaza.

Preparaty mogą ponadto zawierać inną substancję farmaceutycznie czynną, taką jak dodatkowy środek biobójczy, taki jak inny polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, jak zdefiniowano powyżej. Środkiem biobójczym może być antybiotyk, znany fachowcom. Klasy antybiotyków obejmują penicyliny, np. penicylinę G, penicylinę V, metycylinę, oksacylinę, karbenicylinę, nafcylinę, ampicylinę itd.; penicyliny w połączeniu z inhibitorami β-laktamazy, cefalosporynami, np. cefaklor, cefazolinę, cefuroksym, moksalaktam itd.; karbapenemy; monobaktamy; aminoglikozydy; tetracykliny; makrolidy; linkomycyny; polirayksyny; sulfonoamidy; chinolony; chloramfenikol; metronidazol; spektynomycyna; trimetoprym; wankomycyna itd. Środkiem biobójczym może być także środek przeciwgrzybiczy, w tym polieny, np. amfoterycyna B, nystatyna; 5-flukozyna; oraz azole, np. mikonazol, ketokonazol, itrakonazol i flukonazol.

W jednej postaci środek biobójczy jest nieenzymatycznym środkiem chemicznym. W innej postaci środek biobójczy jest niepolipeptydowym środkiem chemicznym.

Środek biobójczy może być zdolny do zmniejszenia liczby żywych komórek Escherichia coli (DSM 1576) do 1/100 po 30 minutach inkubacji w 20°C w 25% (wag.) wodnym roztworze; korzystnie w 10% (wag.) wodnym roztworze; korzystniej w 5% (wag.) wodnym roztworze; jeszcze korzystniej w 1% (wag.) wodnym roztworze; najkorzystniej w 0,5% (wag.) wodnym roztworze; oraz, w szczególności w 0,1% (wag.) wodnym roztworze środka biobójczego.

Środek biobójczy może być także zdolny do zahamowania wzrostu bakterii Escherichia coli (DSM 1576) przez 24 godziny w 25°C w drobnoustrojowym substracie wzrostowym, przy dodaniu w stężeniu 1000 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 500 ppm; korzystniej przy dodaniu w stężeniu 250 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 100 ppm; najkorzystniej przy dodaniu w stężeniu 50 ppm; a zwłaszcza przy dodaniu w stężeniu 25 ppm.

Środek biobójczy może być także zdolny do zmniejszenia liczby żywych komórek Bacillus subtilis (ATCC 6633) do 1/100 po 30 minutach inkubacji w 20°C w 25% (wag.) wodnym roztworze; korzystnie w 10% (wag.) wodnym roztworze; korzystniej w 5% (wag.) wodnym roztworze; jeszcze korzystniej w 1% (wag.) wodnym roztworze; najkorzystniej w 0,5% (wag.) wodnym roztworze; a zwłaszcza w 0,1% (wag.) wodnym roztworze środka biobójczego.

Środek biobójczy może być także zdolny do zahamowania wzrostu Bacillus subtilis (ATCC 6633) przez 24 godziny w 25°C w drobnoustrojowym substracie wzrostowym, przy dodaniu w stężeniu 1000 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 500 ppm; korzystniej przy dodaniu w stężeniu 250 ppm; korzystnie przy dodaniu w stężeniu 100 ppm; najkorzystniej przy dodaniu w stężeniu 50 ppm; a zwłaszcza przy dodaniu w stężeniu 25 ppm.

Polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy według wynalazku oraz środek biobójczy preparatu można wybrać tak, aby osiągnąć synergistyczne działanie przeciwdrobnoustrojowe.

Polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy oraz środek biobójczy preparatu mogą być wybrane tak, aby liczba żywych komórek Escherichia coli (DSM 1576) po 10 minutach inkubacji w 20°C w wodnym roztworze zawierającym 50% (wag.) (korzystnie 25% (wag.), korzystniej 10% (wag.), najkorzystniej 5% (wag.)) środka biobójczego oraz 0,5 ppm (korzystnie 0,1 ppm) polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego, była zmniejszona co najmniej o 5% (korzystnie co najmniej o 10%) więcej w porównaniu z wynikiem osiągniętym przez dodanie wyników osobnych inkubacji z samym środkiem biobójczym i polipeptydem przeciwdrobnoustrojowym, tj. prostym efektem addycyjnym.

PL 209 403 B1

Składnik enzymatyczny i środek biobójczy preparatu można także wybrać tak aby wzrost E. coli (DSM 1576) w 25°C w drobnoustrojowym substracie wzrostowym zawierającym 500 ppm (korzystnie 250 ppm, korzystniej 100 ppm, najkorzystniej 50 ppm) środka biobójczego oraz 0,5 ppm (korzystnie 0,1 ppm) polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego, był zahamowany przez czas co najmniej o 5% (korzystnie co najmniej 10%) dłuższy w porównaniu z tym, który uzyskuje się przy dodaniu wyników osobnych inkubacji z samym środkiem biobójczym i polipeptydem przeciwdrobnoustrojowym, tj. prostym efektem addycyjnym.

Polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy i środek biobójczy preparatu można także wybrać tak, aby liczba żywych komórek Bacillus subtilis (ATCC 6633), po 10 minutach inkubacji w 20°C w wodnym roztworze zawierającym 50% (wag.), (korzystnie 25% (wag.), korzystniej 10% (wag.), najkorzystniej 5% (wag.)) środka biobójczego oraz 0,5 ppm (korzystnie 0,1 ppm) polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego, była zmniejszona o co najmniej 5% (korzystnie co najmniej 10%) więcej w porównaniu z wynikiem osiągniętym przez dodanie wyników osobnych inkubacji z samym środkiem biobójczym i polipeptydem przeciwdrobnoustrojowym, tj. prostym efektem addycyjnym.

Składnik enzymatyczny i środek biobójczy preparatu można także wybrać tak aby wzrost Bacillus subtilis (ATCC 6633) w 25°C w drobnoustrojowym substracie wzrostowym zawierającym 500 ppm (korzystnie 250 ppm, korzystniej 100 ppm, najkorzystniej 50 ppm) środka biobójczego oraz 0,5 ppm (korzystnie 0,1 ppm) polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego, był zahamowany przez czas co najmniej o 5% (korzystnie co najmniej 10%) dłuższy w porównaniu z wynikiem osiągniętym przez dodanie wyników osobnych inkubacji z samym środkiem biobójczym i polipeptydem przeciwdrobnoustrojowym, tj. prostym efektem addycyjnym.

Preparaty mogą także zawierać odpowiedni nośnik. Preparaty mogą także zawierać odpowiednie podłoże nośnikowe zdolne do dostarczenia polipeptydów przeciwdrobnoustrojowych według wynalazku do wymaganego miejsca, gdy preparaty stosuje się jako leki.

Preparaty można wytwarzać znanymi sposobami i mogą być one w postaci preparatu ciekłego lub w stanie stałym. Przykładowo preparat polipeptydu może być w postaci granulatu lub mikrogranulatu. Polipeptyd do wprowadzania do preparatu może być stabilizowany znanymi sposobami.

Poniżej zamieszczono przykłady korzystnych zastosowań preparatów polipeptydu według wynalazku. Dawkę preparatu polipeptydu według wynalazku oraz inne warunki w których stosuje się preparat można wyznaczyć na podstawie metod znanych fachowcom.

Sposoby i zastosowania

Wynalazek także obejmuje różne zastosowania polipeptydów przeciwdrobnoustrojowych.

Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe zazwyczaj są użyteczne w jakimkolwiek miejscu zarażonym bakteriami, grzybami, drożdżami lub glonami. Zazwyczaj miejsca te znajdują się w systemach wodnych, takich jak systemy wody chłodzącej, woda do płukania prania, systemy olejowe, takie jak ciecze chłodząco-smarujące, środki smarujące, pola naftowe itp., gdzie mikroorganizmy muszą zostać uśmiercone lub gdzie ich wzrost musi być kontrolowany. Jednakże wynalazek można także stosować we wszystkich wskazaniach, w których użyteczne są znane preparaty przeciwdrobnoustrojowe, np. do ochrony drewna, lateksu, lepiszcza, kleju, papieru, tektury, materiałów włókienniczych, skóry, tworzyw sztucznych, materiałów uszczelniających oraz paszy.

Inne zastosowania obejmują konserwację pożywienia, napojów, kosmetyków, takich jak lotony, kremy, żele, maści, mydła, szampony, odżywki, środki przeciwpotne, dezodoranty, płyny do płukania jamy ustnej, produkty do soczewek kontaktowych, preparaty enzymatyczne oraz składniki żywności.

Tak też, polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku mogą być użyteczne jako środki dezynfekujące np. w leczeniu trądziku, zakażeń oka lub jamy ustnej, zakażeń skóry; w środkach przeciwpotnych lub dezodorantach; solach do moczenia stóp; do czyszczenia i dezynfekcji szkieł kontaktowych, twardych powierzchni, zębów (pielęgnacja jamy ustnej), ran, siniaków itp.

Ogólnie uważa się, że polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku są użyteczne do czyszczenia, dezynfekcji lub hamowania wzrostu drobnoustrojów na jakiejkolwiek twardej powierzchni. Przykłady takich twardych powierzchni, które można korzystnie poddać działaniu polipeptydów przeciwdrobnoustrojowych według wynalazku są powierzchniami urządzeń stosowanych np. w mleczarniach, chemicznych lub farmaceutycznych zakładach przemysłowych, systemach oczyszczania wody, zakładach przetwarzających ropę naftową, zakładach przemysłowych przetwarzających masę papierniczą, zakładach uzdatniania wody oraz chłodniach kominowych. Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku powinny być stosowane w ilości, która jest skuteczna do czyszczenia, dezynfekcji lub hamowania wzrostu drobnoustrojów na danej powierzchni.

PL 209 403 B1

Ponadto, uważa się, że polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku korzystnie można stosować w systemie zautomatyzowanego czyszczenia typu cleaning-in-place (CIP), do czyszczenia wyposażenia urządzeń technologicznych dowolnego typu.

Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku można ponadto stosować do czyszczenia powierzchni oraz przyborów kuchennych w zakładach przetwórstwa spożywczego oraz jakichkolwiek obszarów, w których przygotowuje się lub podaje pożywienie, takich jak szpitale, domy opieki, restauracje, w szczególności restauracje typu fast food, bary itp. Mogą one także być stosowane jako środki przeciwdrobnoustrojowe w produktach spożywczych i będą szczególnie przydatne jako środki przeciwdrobnoustrojowe na powierzchniach serów, owoców i warzyw oraz w żywności z barów sałatkowych.

Mogą być także stosowane jako środki konserwujące lub środki dezynfekujące w farbach emulsyjnych.

Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku są także użyteczne do kontrolowania drobnoustrojów w liniach wodnych, oraz do dezynfekcji wody, w szczególności wody przemysłowej.

Wynalazek dotyczy także zastosowania polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego według wynalazku jako leku. Ponadto, polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy według wynalazku lub preparat można także stosować do wytwarzania leku do kontrolowania lub zwalczania mikroorganizmów, takich jak organizmy grzybów lub bakterie, korzystnie bakterie Gram dodatnie.

Preparat oraz polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy według wynalazku można stosować jako przeciwdrobnoustrojowy środek terapeutyczny lub profilaktyczny w weterynarii lub do leczenia ludzi. I tak preparat i polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy według wynalazku można stosować do wytwarzania weterynaryjnych lub stosowanych do leczenia ludzi środków terapeutycznych lub profilaktycznych, do leczenia zakażeń drobnoustrojowych, takich jak zakażenia bakteriami lub grzybami, korzystnie zakażenia bakteriami Gram dodatnimi. W szczególności, zakażenia drobnoustrojami mogą być związane z chorobami płuc, obejmującymi, lecz nie wyłącznie, gruźlicę i mukowiscydozę; oraz chorobami przenoszonymi drogą płciową, włącznie z, lecz nie wyłącznie, rzeżączką i Chlamydia.

Preparat według wynalazku zawiera skuteczną ilość polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego według wynalazku.

Określenie „skuteczna ilość w użytym tu znaczeniu oznacza ilość polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego zawierającego sekwencję aminokwasów przedstawioną jako aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2, lub jego fragmentu lub wariantu, która jest wystarczająca do zahamowania wzrostu danych mikroorganizmów.

Wynalazek znajduje także zastosowanie do preparatów do gojenia się ran lub produktów, takich jak bandaże, urządzenia medyczne, takie jak cewniki, a ponadto środków przeciwłupieżowych do włosów, takich jak szampony.

Synteza in vitro

Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku można wytwarzać na drodze syntezy in vitro, stosując znane sposoby. W handlu dostępne są różne aparaty do syntezy, np. zautomatyzowane syntezatory Applied Biosystems Inc., Beckman itd. Przez zastosowanie syntezatorów, naturalnie występujące aminokwasy można podstawiać nienaturalnymi aminokwasami, w szczególności izomerami D (lub formami D), np. D-alaniną i D-izoleucyną, diastereoizomerami, aminokwasami, których łańcuchy boczne mają inną długość lub funkcyjność, itp. Konkretna sekwencja oraz sposób jej wytwarzania są uzależnione od praktyczności, ekonomiki, wymaganej czystości, itd.

Sprzęganie na drodze chemicznej można zastosować w stosunku do różnych peptydów lub białek zawierających dogodne grupy funkcyjne do tworzenia wiązań, takie jak grupy aminowe do tworzenia amidu lub podstawionej aminy, np. drogą redukcyjnego aminowania, grupy tiolowe do tworzenia tioeterów lub disulfidów, grupy karboksylowe do tworzenia amidów, itp.

Jeżeli jest to wymagane różne grupy można wprowadzać do peptydu podczas syntezy lub podczas ekspresji, co umożliwia sprzęganie z innymi cząsteczkami lub z powierzchnią. Cysteiny można np. zastosować do tworzenia tioeterów, histydyny do sprzęgania z kompleksami jonów metali, grupy karboksylowe do tworzenia amidów lub estrów, grupy aminowe do tworzenia amidów itp.

Polipeptydy można także wydzielać i oczyszczać znanymi sposobami stosowanymi w syntezie rekombinacyjnej. Lizat można otrzymać z gospodarza ekspresji, a następnie lizat ten oczyścić metodą

HPLC, chromatografii z wykluczeniem wielkości, elektroforezy w żelu, chromatografii powinowactwa lub innej metody oczyszczania. Najczęściej preparaty do stosowania będą zawierać co najmniej 20% wag. wymaganego produktu, częściej co najmniej około 75% wag., korzystnie co najmniej około 95%

PL 209 403 B1 wag., oraz do celów terapeutycznych, zazwyczaj co najmniej około 99,5% wag., w stosunku do zanieczyszczeń związanych z metodą wytwarzania produktu oraz jego oczyszczania. Zazwyczaj procenty będą odnosić się do całkowitego białka.

Karma dla zwierząt

Wynalazek dotyczy także sposobów stosowania polipeptydów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym w karmie dla zwierząt, a także kompozycji karmy oraz dodatków do karmy zawierających polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku.

Określenie zwierzę obejmuje wszystkie istoty żywe, w tym ludzi. Przykładami zwierząt są zwierzęta nie przeżuwające oraz przeżuwacze, takie jak krowy, owce i konie. W szczególnej postaci, zwierzę jest zwierzęciem nie przeżuwającym. Zwierzęta nie przeżuwające obejmują zwierzęta jednożołądkowe, np. świnie (w tym lecz nie wyłącznie, prosięta, rosnące świnie i maciory); drób, taki jak indyki i kurczaki (w tym lecz nie wyłącznie pisklęta broilery, nioski); mł ode cielęta; oraz ryby (w tym lecz nie wyłącznie łosoś).

Określenie karma lub kompozycja karmy oznacza jakikolwiek związek, preparat, mieszaninę lub kompozycję, odpowiednie lub przeznaczone do spożywania przez zwierzę.

W zastosowaniu według wynalazku polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy można podawać zwierzęciu przed, po lub równocześnie z pożywieniem. Korzystna jest ostatnia możliwość.

W szczególnej postaci, polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy, w postaci w której jest dodawany do karmy, lub gdy jest zawarty w dodatku do karmy, jest dokładnie określony. Dokładnie określony oznacza, że preparat polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego jest w co najmniej w 50% czysty, przy oznaczaniu metodą chromatografii z wykluczeniem wielkości (patrz, przykład 12, WO 01/58275). W innych szczególnych postaciach preparat polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego jest co najmniej w 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 lub co najmniej w 95% czysty, przy oznaczaniu tą metodą.

Dokładnie określony preparat polipeptydu przeciwdrobnoustroj owego jest korzystny. Tak też np. dużo łatwiej jest prawidłowo dawkować do karmy polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy, który jest zasadniczo wolny od przeszkadzających lub zanieczyszczających innych polipeptydów przeciwdrobnoustrojowych. Określenie prawidłowo dawkować dotyczy, w szczególności, celu uzyskania zgodnych i stałych wyników oraz moż liwości optymalizacji dawki w oparciu o zamierzony efekt.

Jednakże do zastosowania w karmie dla zwierząt, polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy nie musi być tak czysty; może on, np. zawierać inne enzymy, w którym to przypadku będzie on nazywany preparatem polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego.

Preparat polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego może być (a) dodany bezpośrednio do karmy (lub stosowany bezpośrednio w procesie obróbki białek roślinnych), lub (b) może być stosowany do wytwarzania jednego lub większej liczby preparatów pośrednich, takich jak dodatki do karmy lub przedmieszki, które następnie dodaje się do karmy (lub stosuje w procesie obróbki). Opisany powyżej stopień czystości dotyczy czystości oryginalnego preparatu polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego, stosowanego zgodnie z (a) lub (b) powyżej.

Preparaty polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego o czystości tego rzędu otrzymuje się w szczególności stosując rekombinacyjne metody wytwarzania, podczas gdy nie są one tak łatwo uzyskiwalne, a wahania pomiędzy partiami są znacznie większe, gdy polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarza się tradycyjnymi metodami fermentacji.

Taki preparat polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego oczywiście można mieszać z innymi enzymami.

Określenie białka roślinne w użytym tu znaczeniu dotyczy dowolnego związku, kompozycji, preparatu lub mieszaniny, zawierających co najmniej jedno białko wyprowadzone z lub pochodzące z rośliny, włącznie z modyfikowanymi białkami oraz pochodnymi białek. W szczególnych postaciach, zawartość białka w białkach roślinnych wynosi co najmniej 10, 20, 30, 40, 50 lub 60% (wag.).

Białka roślinne mogą pochodzić od źródeł białek roślinnych, takich jak rośliny strączkowe i zboża, np. materiałów z roślin z rodzin Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae oraz Poaceae, takich jak mączka sojowa, mączka łubinowa i mączka z nasion rzepaku.

W szczególnej postaci, źródłem białka roś linnego jest materiał z jednej lub większej liczby roślin z rodziny Fabaceae, np. soi, ł ubinu, grochu lub fasoli.

W innej szczególnej postaci, ź ródł em biał ka roś linnego jest materiał z jednej lub wię kszej liczby roślin z rodziny Chenopodiaceae, np. buraka, buraka cukrowego, szpinaku lub komosy ryżowej.

Innymi przykładami źródeł białek roślinnych są nasiona rzepaku i kapusta.

PL 209 403 B1

Soja jest korzystnym źródłem białek roślinnych.

Innymi przykładami źródeł białek roślinnych są zboża, takie jak jęczmień, pszenica, żyto, kukurydza, ryż i sorgo.

Polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy można dodawać do karmy w dowolnej postaci, takiej jak względnie czysty polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy, lub w domieszce z innymi składnikami, które mają być dodane do karmy dla zwierząt, np. w postaci dodatków do karmy dla zwierząt, takich jak, tzw. przedmieszki do karmy dla zwierząt.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy preparatów do zastosowania w karmie dla zwierząt, takich jak karma dla zwierząt oraz dodatki do karmy dla zwierząt, np. przedmieszki.

Oprócz polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego według wynalazku, dodatki do karmy dla zwierząt według wynalazku zawierają co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w tłuszczach, i/lub co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w wodzie, i/lub co najmniej jeden minerał śladowy, i/lub co najmniej jeden składnik makromineralny.

Ponadto ewentualnymi składnikami dodatku do karmy dla zwierząt są środki barwiące, związki zapachowe, stabilizatory, i/lub co najmniej jeden inny enzym wybrany spośród fitaz EC 3.1.3.8 lub 3.1.3.26; ksylanaz EC 3.2.1.8; galaktanaz EC 3.2.1.89; i/lub β-glukanaz EC 3.2.1.4.

W szczególnej postaci te i inne enzymy są dobrze określone (jak zdefiniowano powyżej dla preparatów polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego).

Przykładami innych polipeptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) są CAP18, Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Thanatin, Defensin, Ovispirin, taki jak Novispirin (Robert Lehrer, 2000), oraz ich warianty lub fragmenty, które zachowują działanie przeciwdrobnoustrojowe.

Przykładami innych polipeptydów przeciwgrzybicznych (AFP) są peptydy Aspergillus giganteus i Aspergillus niger, a także ich warianty i fragmenty, które zachowują działanie przeciwgrzybiczne, jak ujawniono w WO 94/01459 i PCT/DK02/00289 [zastąpione numerem WO po opublikowaniu].

Zazwyczaj witaminy rozpuszczalne w tłuszczach oraz wodzie, a także minerały śladowe stanową część, tzw. przedmieszki, która ma być dodawana do karmy, podczas gdy składniki makromineralne są zazwyczaj osobno dodawane do karmy. Dowolny z tych typów preparatów, po wzbogaceniu polipeptydem przeciwdrobnoustrojowym według wynalazku, jest dodatkiem do karmy dla zwierząt według wynalazku.

W konkretnej postaci dodatek do karmy dla zwierząt według wynalazku w zamierzeniu ma być obecny (lub zalecany jako obecny) w dietach zwierząt lub karmach w ilości 0,01-10,0%; w szczególności 0,05-5,0%; lub 0,2-1,0% (procent oznacza gramy dodatku na 100 g karmy). Dotyczy to w szczególności przedmieszek.

Poniżej zamieszczono nie wyłączającą listę tych składników:

Przykładowymi witaminami rozpuszczalnymi w tłuszczach są witamina A, witamina D3, witamina E i witamina K, np. witamina K3.

Przykładowymi witaminami rozpuszczalnymi w wodzie są witamina B12, biotyna i cholina, witamina B1, witamina B2, witamina B6, niacyna, kwas foliowy i pantotenian, np. Ca-D-pantotenian.

Przykładami minerałów śladowych są mangan, cynk, żelazo, miedź, jod, selen i kobalt.

Przykładami składników makromineralnych są wapń, fosfor i sód.

Wymagania odżywcze dla tych składników (na przykładzie drobiu i prosiąt/świń) zamieszczono w tabeli A, WO 01/58275. Wymaganie odżywcze oznacza, że składniki te powinny być dostarczone w diecie we wskazanych stężeniach.

Alternatywnie, dodatek do karmy dla zwierząt według wynalazku zawiera co najmniej jeden z pojedynczych składników wyszczególnionych w tabeli A, WO 01/58275. Przynajmniej jeden oznacza którąkolwiek z możliwości, jeden lub większą liczbę, jeden, lub dwa, lub trzy lub cztery itd. aż do trzynastu, lub aż do piętnastu pojedynczych składników. W szczególności, ten co najmniej jeden pojedynczy składnik jest zawarty w dodatku według wynalazku w takiej ilości, aby jego stężenie w karmie pozostawało w zakresie wskazanym w kolumnie czwartej, lub kolumnie piątej lub kolumnie szóstej tabeli A.

Wynalazek znajduje także zastosowanie w kompozycji karmy dla zwierząt. Kompozycje karmy dla zwierząt lub diety mają względnie wysoką zawartość białka. Diety dla drobiu i świń można scharakteryzować w sposób podany w tabeli B, WO 01/58275, kolumny 2-3. Diety dla ryb można scharakteryzować w sposób podany w kolumnie 4 tej tabeli B. Ponadto takie diety dla ryb zazwyczaj zawierają surowy tłuszcz w ilości 200-310 g/kg.

Karma dla zwierząt według wynalazku zawiera surowe białko w ilości 50-800 g/kg, a ponadto zawiera co najmniej jeden polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy, jak tutaj zastrzeżono.

PL 209 403 B1

Dodatkowo lub wariantowo (w stosunku do podanej powyżej zawartości surowego białka), preparat karmy dla zwierząt według wynalazku zawiera metabolizowalną energię w ilości 10-30 MJ/kg; i/lub zawiera wapń w ilości 0,1-200 g/kg; i/lub zawiera dostępny fosfor w ilości 0,1-200 g/kg; i/lub zawiera metioninę w ilości 0,1-100 g/kg; i/lub zawiera metioninę plus cysteinę w ilości 0,1-150 g/kg; i/lub zawiera lizynę w ilości 0,5-50 g/kg.

W konkretnych postaciach zawartość metabolizowalnej energii, surowego bia łka, wapnia, fosforu, metioniny, metio-niny plus cysteiny i/lub lizyny mieści się w dowolnym z zakresów 2, 3, 4 lub 5 z tabeli B WO 01/58275 (R. 2-5).

Surowe białko oblicza się jako azot (N) pomnożony przez czynnik 6,25, tj. surowe białko (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. Zawartość azotu oznacza się metodą Kjeldahla (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis wyd. 14, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Metabolizowalną energię można obliczyć na podstawie publikacji NRC Nutrient requirements in swine, wyd. 9 poprawione z 1988 r., subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., str. 2-6, oraz European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centrę for poultry research and extension, 73 61 DA Beekbergen, Holandia. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

Zawartość w pożywieniu wapnia, dostępnego fosforu oraz aminokwasów w kompletnych dietach dla zwierząt obliczono na podstawie tabel karmy, takich jak Veevoedertabe2 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

W szczególnej postaci, kompozycja karmy dla zwierząt według wynalazku zawiera co najmniej jedno białko roślinne lub źródło białka, jak zdefiniowano powyżej.

W kolejnych konkretnych postaciach, kompozycja karmy dla zwierząt według wynalazku zawiera 0-80% kukurydzy; i/lub 0-80% sorgo; i/lub 0-70% pszenicy; i/lub 0-70% jęczmienia; i/lub 0-30% owsa; i/lub 0-40% mączki sojowej; i/lub 0-10% mączki rybnej; i/lub 0-20% serwatki. Diety dla zwierząt mogą być np. wytwarzane jako miazga karmy (nie granulowana) lub jako granulowana karma. Zazwyczaj zmielone składniki karmy miesza się i dodaje wystarczającą ilość niezbędnych witamin i minerałów, zgodnie z wymaganiami dla danego gatunku. Enzymy można dodawać w postaci stałych lub ciekłych preparatów enzymów. Przykładowo, stały preparat enzymu zazwyczaj dodaje się przed lub podczas etapu mieszania; a ciekły preparat enzymu zazwyczaj dodaje się po etapie granulowania. Enzym można także wprowadzić do dodatku do karmy lub przedmieszki.

Ostateczne stężenie enzymu w diecie wynosi 0,01-200 mg białka enzymu na kg diety, np. 5-30 mg białka enzymu na kg diety dla zwierząt.

Polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy można dodawać w jednej lub większej liczbie poniższych ilości (zakresy dawek): 0,01-200; lub 0,01-100; lub 0,05-100; lub 0,05-50; lub 0,10-10 - wszystkie te zakresy są w mg białka polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego na kg karmy (ppm).

W celu okreś lenia zawartoś ci w mg biał ka polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego na kg karmy, polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy oczyszcza się z kompozycji karmy, oraz aktywność właściwą oczyszczonego polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego określa się stosując odpowiedni test (patrz - działanie przeciwdrobnoustrojowe, substraty i testy). Działanie przeciwdrobnoustrojowe kompozycji karmy jako takie także wyznacza się stosując ten sam test, oraz na podstawie tych dwóch oznaczeń, oblicza się dawkę w mg białka polipeptydu przeciwdrobnoustroj owego na kg karmy.

Takie same zasady stosują się do określenia mg białka polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego w dodatkach do karmy. Oczywiście, jeżeli dostępna jest próbka polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego stosowanego do przygotowania dodatku do karmy lub do karmy, aktywność właściwą wyznacza się dla tej próbki (nie ma potrzeby oczyszczania polipeptydu przeciwdrobnoustroj owego z preparatu karmy lub dodatku).

Kompozycja detergentowa

Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku można stosować tak, że stają się składnikiem kompozycji detergentowej.

Kompozycję detergentową według wynalazku można np. formułować jako kompozycję detergentową do prania ręcznego lub w pralce, zawierającą kompozycję dodatku do prania, odpowiednią do wstępnego traktowania zabrudzonych materiałów oraz kompozycję zmiękczającą tkaniny dodawaną do

PL 209 403 B1 płukania, lub formułować jako kompozycję detergentową do stosowania ogólnie w gospodarstwie domowym do czyszczenia twardych powierzchni lub formułować do ręcznego lub maszynowego zmywania naczyń .

W konkretnej postaci, wynalazek dostarcza dodatek detergentowy, zawierający polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku oraz środek powierzchniowo czynny. Dodatek detergentowy, a także kompozycja detergentowa może zawierać jeden lub większą liczbę enzymów, takich jak proteaza, lipaza, kutynaza, amylaza, karbohydraza, celulaza, pektynaza, mannanaza, arabinaza, galaktanaza, ksylanaza, oksydaza (taka jak lakaza) i/lub peroksydaza (taka jak haloperoksydaza).

Ogólnie, właściwości wybranego(-ych) enzymu(ów) powinny być zgodne z wybranym detergentem, (tj. optimum pH, zgodność z innymi enzymatycznymi i nieenzymatycznymi składnikami itd.), a enzym(y) powinny być obecne w skutecznej ilości.

Proteazy: odpowiednie proteazy obejmują proteazy pochodzenia zwierzęcego, roślinnego lub drobnoustrojowego. Pochodzenie drobnoustrojowe jest korzystne. Dotyczy to również mutantów białek chemicznie modyfikowanych oraz zmienionych metodami inżynierii genetycznej. Proteazą może być proteaza serynowa lub metaloproteaza, korzystnie zasadowa proteaza drobnoustrojowa lub proteaza trypsynopodobna. Przykładami proteaz zasadowych są subtylizyny, w szczególności te pochodzące z Bacillus np. subtylizyna Novo, subtylizyna Carlsberg, subtylizyna 309, subtylizyna 147 oraz subtylizyna 168 (opisane w WO 89/06279). Przykładami proteaz trypsynopodobnych są trypsyna (np. pochodzenia świńskiego lub bydlęcego) oraz proteaza Fusarium opisana w WO 89/06270 i WO 94/25583.

Przykładami użytecznych proteaz są warianty opisane w WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 i WO 98/34946, w szczególności warianty z podstawieniami w jednej lub większej liczbie z następujących pozycji: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 i 274.

Lipazy: odpowiednie lipazy obejmują enzymy pochodzenia bakteryjnego lub grzybowego. Dotyczy to również mutantów białek chemicznie modyfikowanych oraz zmienionych metodami inżynierii genetycznej. Przykłady użytecznych lipaz obejmują lipazy z Humicola (synonim Thermomyces), np. z H. lanuginosa (T. lanuginosus), jak opisano w EP 258068 i EP 305216 lub z H. insolens, jak opisano w WO 96/13580, lipaza z Pseudomonas, np. z P. alcaligenes lub P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1372034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. szczep SD 705 (WO 95/06720 i WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), lipaza Bacillus, np. z B. subtilis (Dartois i inni (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) lub B. pumilus (WO 91/16422).

Innymi przykładami są warianty lipazy, takie jak te opisane w WO 92/05249, WO 94/01541, EP

407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 i WO 97/07202.

Amylazy: odpowiednie amylazy (α i/lub β) obejmują enzymy pochodzenia bakteryjnego lub grzybowego. Dotyczy to również mutantów białek chemicznie modyfikowanych oraz zmienionych metodami inżynierii genetycznej. Amylazy obejmują np. α-amylazy z Bacillus, np. ze specjalnego szczepu B. licheniformis, opisane bardziej szczegółowo w GB 1296839.

Przykładami użytecznych amylaz są warianty opisane w WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 i WO 97/43424, w szczególności warianty z podstawieniami w jednej lub większej liczbie następujących pozycji: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 i 444.

Celulazy: odpowiednie celulazy obejmują enzymy pochodzenia bakteryjnego lub grzybowego. Dotyczy to również mutantów białek chemicznie modyfikowanych oraz zmienionych metodami inżynierii genetycznej. Odpowiednie celulazy obejmują celulazy z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, np. celulazy grzybowe wytwarzane z Humicola insolens, Myceliophthora thermophila i Fusarium oxysporum ujawnione w US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 i WO 89/09259.

Szczególnie korzystnymi celulazami są celulazy zasadowe lub obojętne mające korzystne cechy zachowywania barwy. Przykładami takich celulaz są celulazy opisane w EP 0495257, EP

0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Innymi przykładami są warianty celulaz, takie jak te opisane w WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471,

WO 98/12307 i PCT/DK98/00299.

PL 209 403 B1

Peroksydazy/Oksydazy: odpowiednie peroksydazy/oksydazy obejmują enzymy, które są pochodzenia roślinnego, bakteryjnego lub grzybowego. Dotyczy to również mutantów białek chemicznie modyfikowanych oraz zmienionych metodami inżynierii genetycznej. Przykłady użytecznych peroksydaz obejmują peroksydazy z Coprinus, np. z C. cinereus, oraz ich warianty ujawnione w WO 93/24618,

WO 95/10602 i WO 98/15257.

Enzym(-y) detergentowy(-e) można włączyć do kompozycji detergentowej przez dodanie osobnych dodatków zawierających jeden lub większą liczbę enzymów lub przez dodanie połączonego dodatku zawierającego wszystkie te enzymy. Dodatek detergentowy według wynalazku, tj. osobny dodatek lub połączony dodatek, może być formułowany jako np. granulat, ciecz, zawiesina itd. Korzystnymi kompozycjami dodatków detergentowych są granulaty, w szczególności nie pylące granulaty, ciecze, w szczególności stabilizowane ciecze lub zawiesiny.

Nie pylące granulaty można wytwarzać np. w sposób ujawniony w US 4106991 oraz 4661452 oraz dodatkowo mogą one być powlekane metodami znanymi fachowcom. Do przykładowych woskowatych materiałów powlekających należą produkty typu poli(tlenku etylenu) (glikolu polietylenowego, PEG) o średniej masie molowej 1000-20000; oksyetylenowane nonylofenole mające 16-50 jednostek tlenku etylenu; oksyetylenowane alkohole tłuszczowe, w których alkohol zawiera 12-20 atomów węgla oraz w których jest 15-80 jednostek tlenku etylenu; alkohole tłuszczowe; kwasy tłuszczowe; a także mono-, di- i triglicerydy kwasów tłuszczowych. Przykłady błonotwórczych materiałów powlekających odpowiednich do nanoszenia technikami w złożu fluidalnym podano w GB 1483591. Ciekłe preparaty enzymatyczne mogą być np. stabilizowane przez dodanie poliolu, takiego jak glikol polipropylenowy, cukier lub alkohol cukrowy, kwasu mlekowego lub kwasu borowego, zgodnie z opracowanymi metodami. Zabezpieczone enzymy można wytwarzać sposobem ujawnionym w EP 238216.

Kompozycja detergentowa może być w dowolnej dogodnej postaci np. kostki, tabletki, proszku, granulatu, pasty lub cieczy. Ciekły detergent może być wodny, zazwyczaj zawierający do 70% wody oraz 0-30% rozpuszczalnika organicznego, lub niewodny.

Kompozycja detergentowa zawiera jeden lub większą liczbę środków powierzchniowo czynnych, które mogą być niejonowe, włącznie z półpolarnymi i/lub anionowe i/lub kationowe i/lub amfoteryczne. Środki powierzchniowo czynne zazwyczaj są obecne w ilości 0,1%-60% wag.

W przypadku użycia danego środka, detergent zazwyczaj będzie zawierać około 1-40% anionowego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak liniowy alkilobenzenosulfonian, α-olefinosulfonian, alkilosiarczan (siarczan alkoholu tłuszczowego), etoksysiarczan alkoholu, drugorzędowy alkanosulfonian, ester metylowy kwasu α-sulfotłuszczowego, kwas alkilo-lub alkenylobursztynowy lub mydło.

W przypadku użycia danego środka, detergent zazwyczaj będzie zawierać około 0,2-40% niejonowego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak oksyetylenowany alkohol, oksyetylenowany nonylofenol, alkilopoliglikozyd, tlenek alkilodimetyloaminy, oksyetylanowany monoetanoloamid kwasu tłuszczowego, monoetanoloamid kwasu tłuszczowego, polihydroksyalkiloamid kwasu tłuszczowego oraz pochodne N-acylowo N-alkilowe glukozaminy („glukamidy).

Detergent może zawierać 0-65% aktywnego wypełniacza detergentowego lub środka kompleksującego, takiego jak zeolit, difosforan, trifosforan, fosfonian, węglan, cytrynian, kwas nitrylotrioctowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, kwas alkilo- lub alkenylobursztynowy, rozpuszczalne krzemiany lub warstwowe krzemiany (np. SKS-6 z Hoechst).

Detergent może zawierać jeden lub większą liczbę polimerów. Przykładami są karboksymetyloceluloza, poliwinylopirolidon, glikol polietylenowy, poli(alkohol winylowy), poli(N-tlenek winylopirydyny), poliwinyloimidazol, polikarboksylany, takie jak poliakrylany, kopolimery kwas maleinowy/akryIowy oraz kopolimery metakrylan laurylu/kwas akrylowy.

Detergent może zawierać układ wybielający, który może zawierać źródło H2O2, takie jak nadboran lub nadwęglan, które może być połączone z aktywatorem wybielacza tworzącym nadkwas, takim jak tetraacetyloetylenodiamina lub nonanoiloksybenzenosulfonian. Alternatywnie, układ wybielający może zawierać peroksykwasy, np. typu amidu, imidu lub sulfonu.

Enzym(y) kompozycji detergentowej mogą być stabilizowane z użyciem zwykłych środków stabilizujących, np. poliolu, takiego jak glikol propylenowy lub gliceryna, cukier lub alkohol cukrowy, kwasu mlekowego, kwasu borowego, pochodnej kwasu borowego np. aromatycznego estru boranowego lub fenylowej pochodnej kwasu boronowego, takiej jak kwas 4-formylofenylo-boronowy, a kompozycję można formułować jak opisano w np. WO 92/19709 i WO 92/19708.

PL 209 403 B1

Detergent może także zawierać inne znane składniki detergentu, takie jak np. środek kondycjonujacy do płukania tkanin, takie jak glinki, środki wzmacniające pienienie, środki gaszące pianę, środki przeciwkorozyjne, środki dyspergujące brud, środki przeciwdziałające powtórnemu osadzaniu się brudu, barwniki, środki bakteriobójcze, rozjaśniacze optyczne, środki solubilizujące, środki hamujące matowienie oraz środki zapachowe.

Obecnie uważa się, że w kompozycjach detergentowych jakikolwiek enzym, oraz polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku, można dodać w ilości odpowiadającej 0,01-100 mg białka enzymu na litr płynu do mycia, korzystnie 0,05-10 mg, korzystniej 0,1-5 mg, a najkorzystniej 0,1-1 mg białka enzymu na litr płynu do mycia.

Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku można dodatkowo wprowadzać do preparatów detergentów ujawnionych w WO 97/07202.

Wynalazek jest dodatkowo opisany w poniższych przykładach, których nie należy uważać za ograniczające zakres wynalazku.

Środki chemiczne stosowane jako bufory oraz substraty były produktami dostępnymi w handlu co najmniej o jakości odczynnika.

P r z y k ł a d 1

Identyfikacja polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego z Pseudoplectania nigrella

Materiały i metody

Bibliotekę cDNA przygotowano z hodowli P. nigrella indukowanych przez 5 dni na pożywce Mex-1 (protokół podany w przykładach międzynarodowego zgłoszenia patentowego opublikowanego jako WO 98/38288). RNA wzbogacony w poliA oczyszczono, zsyntetyzowano cDNA i stworzono bibliotekę zgodnie ze zwykłymi procedurami biologii molekularnej. Szczegółowy protokół ogólnego procesu można znaleźć w przykładach międzynarodowego zgłoszenia patentowego opublikowanego jako WO 01/12794. Wektorem zastosowanym do klonowania był pMhas5, który przedstawiono w SEQ ID NO:4 i ma on następujące cechy:

T a b e l a 1 Cechy wektora pMhas5.

Cecha	Miejsce	Opis
CDS	365-1156	Oporność na kanamycynę
CDS	2232-2387	Peptyd α β-galaktozydazy
sygnał-10	2189-2192	Shine Dalgarno
promotor	2101-2189	promotor Lac
cecha misc	626-650	starter KanP1 dla systemu BACE

Godnymi uwagi cechami tego plazmidu są miejsca restrykcyjne EcoRI-Notl leżące proksymalnie względem regionu Shine Dalgarno promotora Lac. Umożliwia to wklonowanie dostosowanych EcoRI-Notl cDNA do wektora, a powstałe konstrukty mogą być aktywnie transkrybowane i ulegają translacji w gospodarzu E. coli.

Konstrukcja biblioteki Pseudoplectania nigrella i wychwytywanie sygnału z powstałej puli plazmidów cDNA

Pule plazmidów cDNA wytworzono z całkowitej liczby 20000 transformantów z oryginalnej ligacji wektora cDNA-pMHas5. Plazmidowy DNA otrzymano bezpośrednio z puli kolonii odzyskanych z selekcyjnej stałej pożywki LB zgodnie z protokołem Qiagen izolacji DNA plazmidowego (Qiagen Inc.). Pulę plazmidów potraktowano transpozonem SigA2 i transpozazą MuA zgodnie z instrukcjami producenta transpozazy (Finnizyme, Finlandia). Ogólną informację na temat wychwytywania sygnału wspomaganego transpozonem można znaleźć w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym opublikowanym jako WO 01/77315. Powstałą mieszaninę wytrącono etanolem w celu usunięcia nadmiaru soli i 1,5 μl wtransformowano drogą elektroporacji do 20 μl ultrakompetentnych komórek DH10B zgodnie z typowym protokołem dostarczonym razem z komórkami (Gibco-BRL). Komórki po elektorporacji inkubowano w pożywce SOC z wytrząsaniem (28°C, 2 godziny, 250 obrotów/minutę) przed wysianiem na pożywkę selekcyjną. Zastosowano trzy pożywki agarowe:

LB + 50 μg/ml kanamycyny,

LB + kanamycyna + 15 μg/ml chloramfenikolu, lub

LB + kanamycyna + chloramfenikol + 12,5 μg/ml ampicyliny.

PL 209 403 B1

Z wysiewania rozcieńczeń po elektroporacji na pożywce LB+kanamycyna+chloramfenikol, ustalono, że obecnych było około 119000 kolonii zawierających plazmidy biblioteki cDNA z transpozycją SigA2. Ogólnie 363 kolonii odzyskano z doświadczenia przy potrójnej selekcji. Wszystkie 363 wysiano tworząc replikę na pożywkę z potrójną selekcją zawierające 50 μg/ml ampicyliny aby wyselekcjonować składniki prawidłowo wychwytujące sygnały. Całkowita liczba 336 kolonii była w stanie rosnąć przy zwiększonym stężeniu ampicyliny i z nich przygotowano minipreparaty według protokołu Qiagen Qiaturbo96 (Qiagen Inc.). Plazmidy zsekwencjonowano z transpozonowymi starterami do przodu i do tyłu (startery A i B) zgodnie z procedurą ujawnioną w przykładach międzynarodowego zgłoszenia patentowego opublikowanego jako WO 01/77315.

Starter A: agcgt ttgcg gccgc gatcc (SEQ ID NO:16)

Satrter B: ttatt cggtc gaaaa ggatc c (SEQ ID NO:17)

Sekwencję DNA uzyskano z reakcji w kapilarnym sekwenatorze AB3700. Sekwencje przycięto w celu usunięcia sekwencji wektora i transpozonu oraz odczytów startera A i B dla każdego złożonego plazmidu. Otrzymano 225 złożonych sekwencji, które pogrupowano pod względem homologii sekwencji w 145 kontigów. Wszystkie 145 kontigów niezależnie poddano analizie BLAST i wyniki przeanalizowano. Jeden plazmid (Plecta-sin_6_B12) dzielił pewną homologię aminokwasów ze znanymi polipeptydami przeciwdrobnoustrojowymi (polipeptydami defensyno-podobnymi).

W poniższych przykładach polipeptyd przeciwdrobnoustro-jowy według wynalazku jest nazywany „Plektazyna.

P r z y k ł a d 2

Konstrukcja wektora ekspresyjnego Aspergillus dla Plektazyny

Sekwencję kodującą Plektazynę zamplifikowano z powyższej biblioteki cDNA (patrz przykład 1 powyżej) w następujący sposób: 1 μl cDNA (około 10 ng DNA) zastosowano jako matrycę w reakcji PCR z dwoma starterami 178 i 179.

Starter 178: tctgg atcca ccatg caatt tacca ccatc ctctc (SEQ ID NO:7)

Starter 179: tctct cgagc tagta acact tgcaa acaaa gc (SEQ ID NO:8) pmoli każdego startera zastosowano w 100 μl objętości reakcji. Temperatura hybrydyzacji wynosiła 55°C, temperatura wydłużania 72°C przez 1 minutę. Przeprowadzono łącznie ilość 35 cykli. Zastosowano system Expand High Fidelity PCR System (Roche).

Próbki z reakcji PCR rozdzielono na 4% żelu agarozowym. Zaobserwowano dwa osobne prążki: najbardziej widoczny prążek wielkości około 300 pz, a nieco słabszy prążek o wielkości około 350 pz.

Obydwa fragmenty strawiono BamH1 i Xho1, które odcinały wystające końce wprowadzone przez startery PCR. Stawione fragmenty wyizolowano i wklonowano do pMT2188, plazmidu ekspresyjnego Aspergillus opartego na plazmidzie pCaHj527 (patrz przykłady w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym opublikowanym jako WO 00/70064) skonstruowanym jak opisano w przykładzie 7 duńskiego zgłoszenia patentowego PA 200100088. Stwierdzono, że krótszy fragment zawierał sekwencję kodującą Plektazynę, co określono z doświadczenia wychwytywania sygnałów (patrz przykład 1 powyżej). Sekwencję tego krótszego fragmentu z PCR przedstawiono jako SEQ ID NO:5.

Podobnie ustalono, że sekwencja dłuższego fragmentu z PCR zawierała sekwencję kodującą Plektazynę i dodatkową wstawkę o wielkości 58 pz. Zauważono, że wstawka o wielkości 58 pz zawierała konsensusowe cechy intronu grzybowego, oraz amplifikacja tego produktu była dowodem na niecałkowite usunięcie intronów z puli mRNA i wyprowadzanej z niej biblioteki cDNA. Sekwencję dłuższego fragmentu z PCR przedstawiono jako SEQ ID NO:6. Plazmid ekspresyjny Aspergillus dla krótszego fragmentu z PCR (SEQ ID NO:5) nazwano pMT2548.

P r z y k ł a d 3

Eksprymowanie Plektazyny w Aspergillus pMT2548 transformowano do szczepu Aspergillus oryzae BECh2 (ujawnionego w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym opublikowanym jako WO 00/39322) oraz do Aspergillus niger MBin118. Po 30 transformantów z każdego szczepu ponownie izolowano dwukrotnie w warunkach selekcyjnych i nie indukujących na minimalnych płytkach Cove z sacharozą i acetamidem. Aby zbadać ekspresję Plektazyny, transformanty hodowano przez 6 dni w 30°C w probówkach z 10 ml YPM (2% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 2% maltozy). Supernatanty rozdzielono na żelach NuPage 10% Bis-Tris SDS (Invitrogen), jak zalecał producent w buforze MES, co pozwala na rozdzielenie w zakresie niskich Mw. Obydwa szczepy Aspergillus rosły dobrze nawet po indukcji do eksprymowania Plektazyny. Wyraźny prążek o wielkości przewidywanej dla Plektazyny zaobserwowano w większości transformantów, podczas gdy prążek ten nie był widoczny w nietransformowanych szczepach gospo28

PL 209 403 B1 darzach A. oryzae BECh2 i A. Niger MBin118. Okazało się, że prążek Plektazyny był silniejszy w transformantach BECh2, niż w transformantach MBin118. Oszacowano, bardzo z grubsza oraz tylko na podstawie intensywności wybarwienia, że wydajność w tych warunkach wzrostowych była rzędu 10-50 mg na litr pożywki hodowlanej.

P r z y k ł a d 4

Klonowanie Plektazyny do systemu Suicide Expression System (SES)

Fragment Plektazyny amplifikowano metodą PCR z użyciem pełnej długości cDNA Plektazyny jako matrycy (Plektazyn_6_B12) oraz startery z łącznikami rozpoznawanymi przez Ncol i Xbal, DR34F i DR34R.

DR34F: ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg (SEQ ID NO: 9)

DR34R: gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc (SEQ ID NO:10)

Amplifikację metodą PCR przeprowadzono z użyciem polimerazy DNA PWO zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Bioscience, CA). Produkt PCR strawiono Ncol i Xbal i w sposób ukierunkowany wstawiono do plazmidów pHHA i pHH (ujawnionych w przykładach międzynarodowego zgłoszenia patentowego opublikowanego jako WO 00/73433). Powstałe plazmidy nazwano pDR-18-plektazyna do cytoplazmatycznej ekspresji peptydu i pDRS-18-plektazyna do ekspresji periplazmatycznej.

Obydwa plazmidy zawierały następującą sekwencję aminokwasów fragmentu Plektazyny: mGFG CNG PWD EDD MQC HNH CKS IKG YKG GYC AKG GFV CKCY (SEQ ID NO:11) gdzie m (metionina) nie jest obecna w natywnej Plektazynie, ale jest wprowadzona w wyniku strategii klonowania.

Zahamowanie wzrostu E. coli przez ekspresję Plektazyny

Aby stwierdzić, czy wzrost E. coli był hamowany w ciekłej pożywce po indukcji endogennej ekspresji Plektazyny, przeprowadzono następujące doświadczenie, jak opisano w przykładach międzynarodowego zgłoszenia patentowego opublikowanego jako WO 00/73433. W skrócie, świeże nocne hodowle komórek zawierających plazmid pDRS-18-plektazyna, pDR-18-plektazyna, pHH lub pHHA, rozcieńczono 300-krotnie w 150 μl LB lub LB zawierającego 0,1% arabinozy na płytce do mikromianowania i inkubowano w 37°C z intensywnym wytrząsaniem. Krzywą wzrostu monitorowano mierząc OD450 w równych odstępach czasu przy użyciu czytnika ELISA. Wyniki pokazały, że Plektazyna hamowała o 41% wzrost komórek przy skierowaniu do periplazmy, jednakże nie wpływała na wzrost komórek przy skierowaniu do cytoplazmy (patrz tabela poniżej).

T a b e l a 2

Hamowanie wzrostu komórek.

Konstrukt	Hamowanie %
pHH	16%
pHH-plektazyna (pDRS-18-plektazyna)	41%
pHHA	12%
pHHA-plektazyna (pDR- 18-plektazyna)	13%

P r z y k ł a d 5

Klonowanie, ekspresja i ocena aktywności Plektazyny z P. nigrella w E. coli

Klonowanie Plektazyny z P. nigrella w pET31b+

Aby wytworzyć Plektazynę do testów działania przeciwdrobnoustroj owego cDNA kodujący Plektazynę wstawiono do wektora ekspresyjnego pET31b+ (Novagen Inc., WI). Za pomocą specyficznie zaprojektowanych oligonukleotydów (Starter1 i Starter2) gen Plektazyny zamplifikowano drogą reakcji łańcuchowej polimerazy, z użyciem polimerazy DNA PWO zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Bioscience, CA).

Starter1: attattcagatgctggatcc gaaaaacctgcgtcgcatta tccgcaaaggcatccatatc (SEQ ID NO:12)

Starter2: aataatctcgagttattagc catattttttaatgatatgg atgcctttgcggataatgcg ac (SEQ ID NO:13)

Enzymatyczne strawienie flankujących miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne (AlwNl/AvaI) umożliwiło wklonowanie tego genu jako konstruktu fuzyjnego do pET31b+ (typowe procedury opisane przez producenta (New England Biolabs Inc., MA)). Wszystkie typowe protokoły opisano w literaturze (Sambrook, Fritsch i Maniatis, 1989).

PL 209 403 B1

Transformacja i ekspresja Plektazyny z P. nigrella w E. coli

Zrekombinowany pET31b+ wtransformowano do E. coli Nova-blue według instrukcji producenta (Novagen). Plazmid przygotowano na kolumnach QIAprep Mini Columns (QIAGEN Inc., CA) i zsekwencjonowano z użyciem automatycznego sekwenatora, stosując startery specyficzne dla plazmidu (Starter3 i Starter4).

Starter3: tgctagttat tgctcagcgg (SEQ ID NO:14)

Starter4: accgtagttg cgcccatcg (SEQ ID NO:15)

Plazmid wtransformowano do E. coli BLR-DE3 według wskazań producenta (Novagen).

Bakterie hodowano w pożywce LB do OD600 ~0,8, a syntezę rekombinowanego białka zainicjowano 1 mM IPTG (Izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozyd). Po 3 godzinach indukcji, bakterie zebrano, ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 1/10 objętości buforu A (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8) i zlizowano przez rozbijanie ciśnieniowe (1500 mbarów). Powstały osad przemyto dwukrotnie buforem B (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0,5% Tritonu X-100, 100 mM NaCl, pH 8). Wszystkie typowe protokoły opisano w literaturze (Sambrook, Fritsch i Maniatis, 1989).

Oczyszczanie Plektazyny z P. nigrella z ciałek inkluzyjnych E. coli

Osad powstały z powyższego oczyszczania zawierał oczyszczone ciałka inkluzyjne. Aby uwolnić peptyd od partnera fuzyjnego KSI, przeprowadzono kwasową hydrolizę w miejscu Asp-Pro wprowadzonym na drodze inżynierii genetycznej, wprowadzonym N-końcowo względem genu kodującego Plektazynę.

Ciałka inkluzyjne ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 100 mM fosforanie sodu (pH 2,3) i inkubowano przez noc w 85°C. Powstały supernatant zawierał Prolino-Plektazynę i próbkę zneutralizowano 100 mM fosforanem sodu (pH 12,3). Tożsamość Prolino-Plektazyny potwierdzono metodą spektrometrii masowej. Wszystkie typowe protokoły opisano w literaturze (Sambrook, Fritsch i Maniatis, 1989).

Test działania przeciwdrobnoustrojowego z zastosowaniem radialnej dyfuzji

Zmodyfikowaną wersję wcześniej opublikowanego protokołu zastosowano do wykrycia działania przeciwdrobnoustrojowego (Lehrer i inni, (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides, J Immunol Methods, 137: 167-173). Docelowe bakterie (10⁶ jednostek tworzących kolonie (CFU)) dodano do 10 ml spodniej warstwy agarozy (1% agarozy o niskiej elektroendoosmotyczności, 0,03% bulionu tryptozowo-sojowego, 10 mM fosforan sodu, pH 7,4, 37°C). Zawiesinę zestalono na płytkach Petriego INTEGRID (Becton Dickinson Labware, NJ). 3 mm dziurkacz do żelu zastosowano do wykonania otworów w spodniej warstwie agarozy (Amersham Pharmacia Biotech, Szwecja). Próbki dodano do otworów i inkubowano w 37°C, 3 godziny. Warstwę nawierzchniową wylano na wierzch i płytkę inkubowano przez noc (pożywka LB, 7,5% Agar). Działanie przeciwdrobnoustrojowe było widoczne jako strefy wolne od bakterii wokół studzienek. Żywe komórki wybarwiono kontrastowo przez dodanie 10 ml, 0,2 mM MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, błękit tiazolilowy). Wszystkie typowe protokoły opisano w literaturze (Sambrook, Fritsch i Maniatis, 1989).

Działanie przeciwdrobnoustrojowe Plektazyny względem Bacillus subtilis

Aby ocenić działanie przeciwdrobnoustrojowe Plektazyny, pożywkę fermentacyjną dwóch rekombinowanych Aspergillus oryzae zbadano w 2-krotnych kolejnych rozcieńczeniach w teście radialnej dyfuzji (opisanym powyżej). Zaobserwowano duże strefy wolne od bakterii, gdy badano próbki na Bacillus subtilis zgodnie z powyższym protokołem. Największą strefę wolną od bakterii zaobserwowano dla nie rozcieńczonej pożywki hodowlanej (15 mm), podczas gdy próbki z nie rekombinowanych Aspergillus oryzae nie wykazywały działania przeciwdrobnoustrojowego względem Bacillus subtilis.

Plektazyna eksprymowana w ciałkach inkluzyjnych innego gospodarza E. coli

Aby zwiększyć ilość odzyskiwanej Plektazyny o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, Plektazynę eksprymowano w E. coli Origami-DE3 (Novagen Inc.). Szczep ten niesie mutację w genach kodujących reduktazę tioredoksyny (trxB) i reduktazę glutationu (gor). Rekombinowany plazmid pET31b+ kodujący Plektazynę wtransformowano do E. coli Origami-DE3 zgodnie z instrukcjami producenta (Novagen). Hodowanie, eksprymowanie i izolację ciałek inkluzyjnych zawierających Plektazynę przeprowadzono w sposób opisany powyżej (Transformacja i ekspresja Plektazyny z P. nigrella w E. coli). Odzyskiwanie Plektazyny przeprowadzono w sposób opisany powyżej (Oczyszczanie Plektazyny z P. nigrella z ciałek inkluzyjnych E. coli). Następnie, test dyfuzji radialnej zastosowano do oceny działania przeciwdrobnoustrojowego (patrz powyżej: Test działania przeciwdrobnoustrojowego z zastosowaniem radialnej dyfuzji).

PL 209 403 B1

Wyniki pokazały, że w wyniku wytwarzania peptydów Plektazyny w E. coli Origami-DE3 następuje 5-10-krotny wzrost działania przeciwdrobnoustrojowego peptydu. Zwiększenie aktywności biologicznej Plektazyny potwierdził ponadto fakt, że podobne wyniki uzyskano przy wytwarzaniu innej defensyny, ludzkiej β-defensyny 3. Wywnioskowano, że szczepy E. coli, które umożliwiają tworzenie mostków disulfidowych w cytoplazmie mają ogólnie zastosowanie do biosyntezy biologicznie aktywnych defensyn oraz innych polipeptydów przeciwdrobnoustro-jowych zawierających mostki disulfidowe.

P r z y k ł a d 6

Konstrukcja wektora ekspresyjnego Saccharomyces cerevisiae dla Plektazyny

Aby ocenić ekspresję Plektazyny w S. cerevisiae przygotowano dwa różne konstrukty plazmidowe, pHH3875 i pHH3876. pHH3875 kodował α-lider S. cerevisiae zfuzowany z dojrzałą Plektazyną. Plektazyna mogła być uwolniona od α-lidera i tym samym dojrzeć przez rozszczepienie sekwencji KEX2. pHH3 876 kodował α-lider zfuzowany z pro-regionem Plektazyny, po którym występowała dojrzała Plektazyna. W tym konstrukcie jedno miejsce KEX2 było obecne pomiędzy α-liderem a proregionem Plektazyny, a drugie miejsce KEX2 rozdzielało pro-region Plektazyny od samej Plektazyny.

Konstrukcja pHH3875-a-lider/KEX2/Plektazyna

Gen Plektazyny zamplifikowano w znanej reakcji PCR stosując startery pHH3875-Forw i pHH3875-Rev opisane poniżej. Plazmid Aspergillus pMT2548 z przykładu 2 zastosowano jako matrycę DNA w reakcji PCR. Powstały fragment DNA oczyszczono za pomocą zestawu do oczyszczania Qiaquick PCR (Qiagen) i strawiono restrykcyjnie Xbal i Cla, które odcinają wiszące końce wprowadzone przez startery. Fragment dalej oczyszczono z 2% żelu agarozowego i wligowano do wektora ekspresyjnego S. cerevisiae także strawionego restrykcyjnie Xbal i Cla. Ten oparty na 2μ wektor wahadłowy E. coli/drożdżowy wykorzystuje konstytutywny promotor tpi do kierowania ekspresją fuzji α-lider/Plektazyna, wykorzystuje β-laktamazę do selekcji fenotypowej w E. coli, oraz niesie gen POT do selekcji plazmidu w drożdżach Δtpi (MT663; a/a, Δtpi/Δtpi, pep4-3/pep4-3).

Starter pHH3875-Forw:

gaagg ggtat cgatg gctaa gagag gattt ggatg caatg gtcct tggga tgagg (SEQ ID NO:18)

Starter pHH3875-Rev:

cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c (SEQ ID NO:19)

Konstrukcja pHH3876-a-lider/KEX2/proreqion/KEX2/Plektazyna

Protokół konstrukcji pHH3876 był identyczny do zastosowanego dla pHH3875, z wyjątkiem zastosowanych starterów DNA. W przypadku pHH3876 zastosowano startery opisane poniżej:

Starter pHH3876-Forw:

gaagg ggtat cgatg gctaa gagag caccc cagcc tgttc ccgag getta ege (SEQ ID NO:20)

Starter pHH3876-Rev (identyczny jak pHH3875-Rev):

cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c (SEQ ID NO: 21)

Ekspresja Plektazyny w S. cerevisiae

Plazmidy pHH3902 (kontrolny), pHH3875 i pHH3876 wtransformowano do szczepu MT633

S. cerevisiae stosując protokół z octanem litu. Wybrano kilka transformantów pHH3902, pHH3875 i pHH3876, wysiano na płytki z podłożem SC/agarem (zawierające podłoże SC agar, 2% D-glukozy, 0,02% treoniny) i inkubowano w 30°C do czasu rozwoju kolonii.

Aby zbadać ekspresję, poszczególne kolonie zaszczepiono do 10 ml ciekłego podłoża SC (zawierającego podłoże SC, 2% D-glukozy, 0,02% treoniny), inkubowano z intensywnym wytrząsaniem w 30°C przez 3 dni. Supernatanty rozdzielono na 16% żelach Tricine (Novex) tak by uzyskać optymalny rozdział w regionie białek niskocząsteczkowych. Równolegle, supernatanty zatężono z 500 μl do 20 μl stosując kolumny do wirowania microcon o odcięciu MW 3 kDa. Wszystkie próbki z pHH3875 i pHH3876 wykazały prążki peptydów o oczekiwanej wielkości. W zatężonych próbkach stwierdzono najbardziej widoczne prążki.

Aby uzyskać dokładniejszą informację, supernatanty analizowano za pomocą spektrometru masowego typu MALDI (Voyager DE-Pro z Perseptive Biosystems).

Dla pHH3875, główny pik zaobserwowano przy masie 4410-4411. Był on bardzo blisko oczekiwanej masy 4402 dla prawidłowo wytworzonej i poddanej prawidłowej obróbce Plektazyny.

Dla pHH3876 zaobserwowano kilka pików. Dwa najwyraźniejsze piki znaleziono przy masie

4411-4413 i 7870-7871. Pik 4411 ponownie zgadzał się z poddaną prawidłowej obróbce Plektazyna.

Pik 7870 najlepiej odpowiadał pół-przetworzonej Plektazynie, gdy Pro-region nie został odcięty z Plektazyny. Zaobserwowano kilka produktów rozpadu, prawdopodobnie piku 7870.

PL 209 403 B1

Aktywność Plektazyny z pHH3875 i pHH3876

Supernatanty opisane powyżej analizowano w teście dyfuzji radialnej, jak opisano w przykładzie 5.

T a b e l a 3

Przybliżona strefa zahamowania wzrostu bakterii (mm).

Plazmid	Normalny	Zatężony
pHH3902	0	0
pHH3875	5	12
pHH3876	8	14

Co ciekawe, pHH3876 wywołał największą strefę zahamowania wzrostu bakterii, co wskazuje, że zawierał on większą ilość produktu lub produkt o wyższej aktywności w porównaniu z pHH3875.

Przeszukiwanie HTP wariantów Plektazyny

Aby dalej zoptymalizować działanie przeciwdrobnoustrojowe Plektazyny, wymagany jest test o dużej rozdzielczości (HTP). Aby opracować taki system, komórki drożdżowe zawierające plazmid kontrolny, pHH3902 lub dwa plazmidy ekspresyjne Plektazyny, pHH3875 i pHH3876, hodowano w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania. Przy rozsądnej gęstości komórek, usunięto 5 lub 20 μl hodowli drożdży z płytki do mikromianowania i zastosowano je w testach dyfuzji radialnej, jak opisano w przykładzie 5. Również w tym przypadku strefy wolne od bakterii na testowej płytce dyfuzji radialnej były dobrze widoczne dla supernatantów pochodzących z dwóch szczepów wytwarzających Plektazyn, pHH3875 i pHH3876. Jak obserwowano powyżej, strefy wolne od bakterii były większe dla supernatantów pochodzących z pHH3876. Nie obserwowano stref wolnych od bakterii dla plazmidu kontrolnego. Oznacza to, że ten prosty test HTP może rozróżnić komórki drożdży wykazujące różne poziomy działania przeciwdrobnoustrojowego i jest stosowny do przeszukiwania wariantów Plektazyny o wymaganych aktywności.

P r z y k ł a d 7

Konstrukcja systemu do indukowalnego wytwarzania w drożdżach oraz przeszukiwania HTP dla Plektazyny - Konstrukcja pYES2-3902, pHH3886 (Plektazyny) i pHH3887 (Pro-plektazyny)

Aby ocenić indukowalne systemy ekspresyjne oraz możliwość opracowania systemu przeszukującego HTP do identyfikacji wariantów Plektazyny o zwiększonej bioaktywności skonstruowano indukowalne wektory ekspresyjne kodujące Plektazynę i pro-plektazynę przy zastosowaniu pYES2.

pYES2 (Invitrogen) jest wektorem o wielkości 5,9 kb zaprojektowanym do indukowalnej ekspresji rekombinowanych białek i peptydów w Saccharomyces cerevisiae. Wektor zawiera elementy, takie jak drożdżowy promotor GAL1 do ekspresji indukowalnej na wysokim poziomie przez galaktozę i represji przez glukozę. Prototrofię uracylową i oporność na ampicylinę stosuje się do selekcji transformantów, odpowiednio w komórkach drożdżowych i E. coli.

Skonstruowano trzy plazmidy; plazmid kontrolny, pYES-3902, oraz dwa plazmidy kodujące Plektazynę, pHH3886 i pHH3887.

Z uwagi na to, że pYES2 jest nie fuzyjnym wektorem, całe regiony α-lidera z pHH3902, pHH3875 i pHH3876 amplifikowano metodą PCR w znanej reakcji PCR. Fragmenty rozdzielono na 2% żelu agarozowym, oczyszczono za pomocą zestawu do oczyszczania Qiagen i strawiono restrykcyjnie Hindlll i Xbal oraz wligowano w odpowiednie miejsca w plazmidzie pYES2. Umiejscawiało to α-lidera przed promotorem GAL1. Mieszaninę ligacyjną wtransformowano do kompetentnych E. coli. Transformanty rozdzielono ponownie i kilka poszczególnych klonów analizowano pod względem obecności w plazmidach wstawki o prawidłowej wielkości. Ostateczne potwierdzenie przeprowadzono przez sekwencjonowanie DNA przy zastosowaniu starterów AOP107 i AOP446. Plazmidy nazwano pYES2-3902 (kontrolny), pHH3886 (Plektazyna) i pHH3887 (Pro-Plektazyna).

Starter AOP107: caata taaaa aagct agctt tccg (SEQ ID NO:22)

Starter AOP446: ccggc tgaag ctgct atcgg (SEQ ID NO:23)

Trzy plazmidy, pYES-3902, pHH3886 i pHH3887 wtransformowano do drożdży szczepu JG169 i wysiano na płytki zawierające glukozę (0,5%)/galaktozę (1,5%). Glukoza umożliwiała tworzenie kolonii o prawidłowej wielkości, a po wyczerpaniu glukozy, galaktoza zapewniała dalszy wzrost, indukcję transkrypcji i odpowiadające jej wytwarzanie Plektazyny. Po wytworzeniu kolonii, na kolonie wysiano warstewkę (około 10⁶ cfu) szczepu wskaźnikowego B. subtilis i płytki dalej inkubowano przez noc.

PL 209 403 B1

Tak jak obserwowano dla innych plazmidów drożdżowych opisanych powyżej, szczep drożdży niosący plazmid kontrolny nie tworzył strefy pozbawionej bakterii, podczas gdy pHH3886 i pHH3887 tworzyły strefy wolne od bakterii. Największe strefy wolne od bakterii obserwowano dla pHH3887 kodującego Pro-plektazynę.

P r z y k ł a d 8

Konstrukcja systemu do indukowalnego wytwarzania w drożdżach oraz przeszukiwania HTP dla Plektazyny - Konstrukcja bibliotek zmutowanej Plektazyny

Biblioteki zmutowanej Plektazyny skonstruowano stosując podatną na błędy PCR. Losowo zmutowane fragmenty DNA wytworzono stosując startery pYES-mut i pHH3 885-Rev oraz matrycę pHH3875 (Pro-plektazyna) albo pHH3876 (Plektazyna) w reakcji PCR zawierającej 0,5 mM MnCl2.

Starter pYES-mut:

taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgatg gccaagaga (SEQ ID NO:24)

Starter pHH3885-Rev:

tgtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga (SEQ ID NO:25)

Fragmenty rozdzielono na 2% żelu agarozowym, oczyszczono stosując zestaw do oczyszczania Qiagen i wstawiono do plazmidu pYES2-3902. Plazmidy wstawiono drogą elekoroporacji do kompetentnych komórek JG169.

Dwie różne biblioteki wysiano na duże płytki agarowe (23 cm x 23 cm) zawierające 0,5% glukozy i 1,5% galaktozy. Po inkubacji w 30°C przez 2 dni, na płytki bibliotek wylano cienką warstwę agarozy zawierającą około 10⁷ cfu B. subtilis. Płytki inkubowano przez kolejne 24 godziny w 30°C. Przebadano około 10000 kolonii. Kolonie drożdżowe, które wywoływały duże strefy pozbawione bakterii wyizolowano do dalszej charakteryzacji.

Zdeponowanie materiału biologicznego

Następujący materiał biologiczny zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapesztańskim w Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Holandia (alternatywnie skrytka pocztowa 85167, 3508 AD Utrecht, Holandia) i nadano mu następujący numer dostępu:

Depozyt Numer dostępu Data depozytu

Pseudoplectania nigrella CBS 444.97 28 stycznia 1997

Depozyt został złożony przez Novo Nordisk A/S, a później przepisany na Novozymes A/S.

Klasyfikacja Pseudoplectania nigrella

Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Pezizomycetes; Pezizales; Sarcosomataceae; Pseudoplectania.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Polipeptyd o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, wybrany z grupy obejmującej:

   (a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów, która wykazuje co najmniej 70% identyczności z aminokwasami 1-40 SEQ ID NO:2 (b) polipeptyd kodowany przez sekwencję nukleotydów, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanej ostrości, z użyciem 0,2 x SSC w 42°C do przemywania, z sondą polinukleotydową wybraną z grupy obejmującej:

   (i) nić komplementarną do nukleotydów 166-285 SEQ ID NO: 1, (ii) nić komplementarną do nukleotydów 70-2 85 SEQ ID NO:1, oraz (iii) nić komplementarną do nukleotydów 1-285 SEQ ID NO:1.
2. 2. Polipeptyd według zastrz. 1, zawierający sekwencję aminokwasów, która wykazuje co najmniej 80% identyczności, co najmniej 85% identyczności, co najmniej 90% identyczności, co najmniej 95% identyczności lub co najmniej 99% identyczności z aminokwasami 1-40 SEQ ID NO:2.
3. 3. Polipeptyd według zastrz. 2, zawierający aminokwasy 1-40 SEQ ID NO:2.
4. 4. Polipeptyd według zastrz. 1-3, składający się z aminokwasów 1-40 SEQ ID NO:2.
5. 5. Polipeptyd według zastrz. 1, kodowany przez sekwencję nukleotydów, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie-wysokiej ostrości, z użyciem 0,2 x SSC w 55°C do przemywania, korzystnie w warunkach wysokiej ostrości, z użyciem 0,1 x SSC w 60°C do przemywania, z sondą polinukleotydową wybraną z grupy obejmującej:

   (i) nić komplementarną do nukleotydów 166-285 SEQ ID NO:1,

   PL 209 403 B1 (ii) nić komplementarną do nukleotydów 70-285 SEQ ID NO:1, oraz (iii) nić komplementarną do nukleotydów 1-285 SEQ ID NO:1
6. 6. Polipeptyd według zastrz. 5, kodowany przez sekwencję nukleotydów, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie-wysokiej ostrości, z użyciem 0,2 x SSC w 55°C do przemywania, korzystnie w warunkach wysokiej ostrości z użyciem 0,1 x SSC w 60°C do przemywania, z sondą polinukleotydową, która jest nicią komplementarną do nukleotydów 166-285 SEQ ID NO:1.
7. 7. Polinukleotyd mający sekwencję nukleotydów, która koduje polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1-6.
8. 8. Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję nukleotydów zdefiniowaną w zastrz. 7, funkcjonalnie połączoną z jedną lub większą liczbą sekwencji kontrolnych, które kierują wytwarzaniem polipeptydu w odpowiednim gospodarzu.
9. 9. Rekombinowany wektor ekspresyjny zawierający konstrukt kwasu nukleinowego zdefiniowany w zastrz. 8.
10. 10. Rekombinowana komórka gospodarz zawierająca konstrukt kwasu nukleinowego zdefiniowany w zastrz. 8.
11. 11. Sposób wytwarzania polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1-6, znamienny tym, że:

    (a) hoduje się szczep, który w swojej postaci typu dzikiego jest zdolny do wytwarzania polipeptydu, z wytworzeniem polipeptydu; oraz (b) odzyskuje się polipeptyd.
12. 12. Sposób wytwarzania polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1-6, znamienny tym, że:

    (a) hoduje się rekombinowaną komórkę gospodarza zdefiniowaną w zastrz. 10, w warunkach sprzyjających wytwarzaniu polipeptydu; oraz (b) odzysuje się polipeptyd.
13. 13. Sposób uśmiercania lub hamowania wzrostu komórek drobnoustrojów, który nie jest sposobem terapeutycznego traktowania organizmu człowieka lub zwierzęcia, znamienny tym, że komórki drobnoustrojów kontaktuje się z polipeptydem przeciwdrobnoustrojowym zdefiniowanym w zastrz. 1-6.
14. 14. Polipeptyd przeciwdrobnoustrojowy zdefiniowany w zastrz. 1-6 do stosowania jako lek.
15. 15. Zastosowanie polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego zdefiniowanego w zastrz. 1-6 do wytwarzania weterynaryjnego lub stosowanego do leczenia ludzi terapeutycznego środka do leczenia zakażenia drobnoustrojami lub do stosowania profilaktycznego.
16. 16. Zastosowanie co najmniej jednego polipeptydu przeciwdrobnoustrojowego zdefiniowanego w zastrz. 1-6 w karmie dla zwierząt.