ES2954455T3

ES2954455T3 - Cepas de Bacillus que mejoran la salud y el rendimiento de animales de producción

Info

Publication number: ES2954455T3
Application number: ES16707993T
Authority: ES
Inventors: Derrick Lewis; Marianne Thorup Cohn; Adam Nelson; Preben Nielsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2023-11-22
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: US11166989B2; WO2016118864A1; US20190091269A1; US20220143110A1; CN107567493A; FI3247788T3; EP3247788B1; BR112017015585A2; US11801272B2; AU2016209132B2; EP3247788A1; US20240075077A1; AU2016209132A1; CN107567493B

Abstract

La presente invención se refiere a cepas de Bacillus que mejoran la salud y el rendimiento de los animales de producción. La invención se refiere además a composiciones que comprenden las cepas de Bacillus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas de Bacillus que mejoran la salud y el rendimiento de animales de producción

Referencia a un depósito de material biológico

La presente solicitud contiene una referencia a un depósito de material biológico.

Referencia al listado de secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de secuencias en formato legible por ordenador.

Índice del listado de secuencias:

SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 13: cebadores de PCR y de secuenciación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a cepas de Bacillus que mejoran la salud y el rendimiento de animales de producción. La invención se refiere además a composiciones que comprenden las cepas de Bacillus.

Antecedentes de la invención

Clostridium perfringens (C. perfringens) es una bacteria gramnegativa, en forma de bacilo, anaerobia y formadora de esporas del género Clostridium. C. perfringens está ampliamente presente en la naturaleza y se puede encontrar como un componente de vegetación en descomposición, sedimentos marinos, tracto intestinal de humanos y otros vertebrados, insectos y tierra.

Las infecciones debidas a C. perfringens muestran evidencia de necrosis tisular, bacteremia, colecistitis enfisematosa y gangrena gaseosa, que también se conoce como mionecrosis clostridial. C. perfringens también puede producir infecciones anaerobias polimicrobianas.

La incidencia de la enteritis necrótica asociada a Clostridium perfringens en aves de corral ha aumentado en países que dejaron de usar promotores del crecimiento de antibiótico. La enteritis necrótica es una enfermedad enterotoxémica que produce pérdidas económicas significativas en la industria de las aves de corral.

Existe una necesidad de desarrollar herramientas y estrategias para la prevención y el control de C. perfringens en animales monogástricos, tales como las aves de corral. Aunque se ha sugerido la vacunación de los animales, plantea problemas asociados a la vacunación de miles de animales. Por lo tanto, sería ventajoso el descubrimiento de una disolución que pudiera ser administrada como un aditivo en un pienso para animales.

Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar disoluciones que prevengan y/o controlen C. perfringens en animales monogástricos, tales como las aves de corral, por uso de un pienso para animales que comprende una o más bacterias con actividad contra Clostridium perfringens.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar una solución que no plantee un riesgo para la salud del animal. La solución a este problema es el uso de cepas no hemolíticas de Bacillus con actividad contra Clostridium perfringens. Un problema de administrar Bacillus spp. en el pienso es el uso común de antibióticos como promotores del crecimiento en el pienso. Por lo tanto, es necesario determinar la compatibilidad de las cepas con los antibióticos comúnmente usados en los piensos, tales como la monensina, para identificar cualquier posible conflicto con el uso como microbiano de alimentación directa. La presente invención se refiere en una realización a cepas de Bacillus con elevada compatibilidad con la monensina.

Descripción de la técnica relacionada

Knap et al. (2010) describen que Bacillus licheniformis tiene un efecto sobre la enteritis necrótica en pollos de engorde (Knap, Lund, Kehlet, Hofacre y Mathis; Bacillus licheniformis Prevents Necrotic Enteritis in Broiler Chickens; Avian Diseases 54(2):931-935. 2010). Esta cepa de Bacillus licheniformis no tiene efecto sobre Clostridium perfringens in vitro como se demuestra en el Ejemplo 2.

Clostat (también conocido como Bacillus PB6) se describe en el documento de patente WO2007/064741. Bacillus PB6 tiene un efecto antagonista contra C. perfringens. Bacillus PB6 es hemolítico, como se describe en el Ejemplo 1. S. Jayaraman et al. (Bacillus subtilis PB6 improves intestinal health of broiler chickens challenged with Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis, Poultry Science, 92(2): 370-374, 2013) se refiere a la mejora por PB6 de Bacillus subtilis de la salud intestinal de pollos de engorde expuestos a la enteritis necrótica inducida por Clostridium perfringens. El efecto de PB6 de Bacillus subtilis sobre pollos de engorde infectados con una cepa patógena de Escherichia coli se desvela en A. Y.- L. Teo et al. (Effect of Bacillus subtilis PB6 (CloSTAT) on Broilers Infected with a Pathogenic Strain of Escherichia coli, J. Appl. Poultry Res., 15(2): 229-235, 2006). B. Essghaier et al. (Biological control of grey mould in strawberry fruits by halophilic bacteria, J Appl Microbiol, 106(3): 833-846, 2009) está relacionada con el control biológico del moho gris en fresas por bacterias halófilas y desvela una cepa B1-33 de B. subtillis con una secuencia determinada de ADN 16S (GenBank: EU435361). El documento CN 103 882 097 desvela un método de identificación de Bacillus subtillis con elevada producción de proteasas, pero no desvela una cepa que tenga actividad no hemolítica, sensibilidad a antibióticos, compatibilidad con monensina o actividad contra C. perfringens o E. coli.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a una cepa de Bacillus para su uso en la mejora de uno o más parámetros de rendimiento de un animal seleccionados del grupo que consiste en: mejorar la relación de conversión de pienso, mejorar el aumento de peso corporal, mejorar el factor de eficiencia europea de producción, mejorar la eficiencia del pienso y mejorar la salud, por ejemplo, de aves de corral, tales como pollos;

en donde la cepa de Bacillus es sensible a al menos siete, tal como ocho, de los antibióticos seleccionados del grupo que consiste en vancomicina, clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina y tetraciclina;

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

Fig. 1 Alineación de secuencias de ADNr 16S. Se han alineado SEQ ID NO: 1 (DSM 29869), SEQ ID NO: 2 (DSM 29870), SEQ ID NO: 3 (DSM 29871), SEQ ID NO: 4 (DSM 29872), SEQ ID NO: 5 (Bacillus vallismortis AB021198), SEQ iD NO: 6 (Bacillus subtilis de AJ276351) y SEQ ID NO: 7 (Bacillus amyloliquefaciens AB255669). No se muestra la región que cubre la posición 481-1200 en la Fig. 1 (en esta región todas las secuencias son idénticas).

DEFINICIONES

En general, los términos y expresiones usadas en el presente documento tienen su significado reconocido en la técnica, que se pueden encontrar por referencia a textos habituales, referencias de revistas y contexto conocido por los expertos en la técnica. Las siguientes definiciones se proporcionan para aclarar su uso específico en el contexto de la divulgación.

Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" también pretenden incluir las formas en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens: El término "actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens” significa que el crecimiento de Clostridium perfringens se inhibe y/o que algunos o todos los Clostridium perfringens son destruidos. Esto se puede determinar por el ensayo descrito en el Ejemplo 2.

Aumento de peso corporal: El aumento de peso corporal de un animal es el aumento de peso corporal del animal con respecto a un periodo de tiempo especificado. Un ejemplo de determinación del aumento de peso corporal se da en el Ejemplo 8.

Composición: El término "composición" se refiere a una composición que comprende un vehículo y al menos una cepa bacteriana como se describe en el presente documento. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden mezclar con un pienso(s) para animales y se denominan un "pienso en harina".

Control de infecciones y/o enteritis necrótica por C. perfringens: El término "control de infecciones y/o enteritis necrótica por C. perfringens" significa un método y/o composición que inhibe parcial o completamente infecciones y/o enteritis necrótica por C. perfringens en un animal. Por consiguiente, el término "control de infecciones y/o enteritis necrótica por C. perfringens" significa que las infecciones por C. perfringens y/o la enteritis necrótica se reducen o eliminan o previenen completamente.

Microbiano de alimentación directa: El término "microbiano de alimentación directa" significa microorganismos vivos que incluyen esporas que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio, tal como digestión o salud mejorada, en el hospedador.

Actividad enzimática en condiciones aerobias: El término "actividad enzimática en condiciones aerobias" significa actividad de enzimas producidas por una cepa de Bacillus durante el crecimiento en condiciones aerobias como se describe en el Ejemplo 6.

Actividad enzimática en condiciones anaerobias: El término "actividad enzimática en condiciones anaerobias" significa actividad de enzimas producida por una cepa de Bacillus durante el crecimiento en condiciones anaerobias como se describe en Ejemplo 6.

Factor de eficiencia europea de producción (EPEF): El Factor de eficiencia europea de producción es una forma de comparar el rendimiento de aves vivas de bandadas. Esta cifra única facilita la comparación del rendimiento dentro de y entre granjas y se puede usar para evaluar variables medioambientales, climáticas y de gestión. El EPEF se calcula como [(supervivencia (%) x peso vivo (kg)) / (edad al final (días) x FCR)] x 100, en donde la supervivencia es el porcentaje de aves vivas en la en el momento del sacrificio, peso vivo es el peso promedio de las aves en el momento del sacrificio, edad al final es la edad de las aves en el momento del sacrificio y FCR es la relación de conversión de pienso en el momento del sacrificio.

Alimentado: El término "alimentado" significa cualquier tipo de administración por vía oral, tal como administración por un pienso para animales o por agua de beber.

FCR (velocidad de conversión del pienso): La FCR es una medida de la eficiencia de un animal para convertir la masa de pienso en aumento de la producción deseada. En animales criados para carne -tales como cerdos, aves de corral y peces-, la producción es la masa ganada por el animal. Específicamente, la FCR es la masa del alimento digerido dividida entre la producción, todo durante un periodo especificado. La FCR se puede determinar como se describe en el Ejemplo 8. Una mejora en FCR significa la reducción del valor de FCR. Una mejora de FCR del 2 % significa que la FCR se redujo el 2 %.

Aislado: El término "aislado" significa que la una o más cepas bacterianas descritas en el presente documento están en una forma o entorno que no ocurre en la naturaleza, es decir, la una o más cepas bacterianas son sacadas al menos parcialmente de uno o más o todos los constituyentes que existen de forma natural con los que está asociado en la naturaleza.

No hemolítico: La hemólisis es la rotura de los glóbulos rojos. La capacidad de colonias bacterianas para inducir la hemólisis cuando crecen en agar con sangre se usa para clasificar las cepas bacterianas en cepas hemolíticas y no hemolíticas. En este contexto, la hemólisis se define como se describe en EFSA Journal 2011 ;9(11 ):2445, usando Bacillus subtilis 168 (BGSC-1A1, Bacillus Genetic Stock Center) como control negativo. Se puede clasificar una cepa de Bacillus como no hemolítica usando el ensayo descrito en el Ejemplo 1.

Aves de corral: El término "aves de corral" significa aves domesticadas criadas por el hombre por los huevos que producen y/o su carne y/o sus plumas. Las aves de corral incluyen pollos de engorde y ponedoras. Las aves de corral incluyen miembros del superorden Galloanserae (aves de caza), especialmente el orden Galliformes (que incluye pollos, gallinas de Guinea, codornices y pavos) y la familia Anatidae, del orden de las Anseriformes, comúnmente conocidas como "aves acuáticas" y que incluyen patos domésticos y gansos domésticos. Las aves de corral también incluyen otras aves que son sacrificadas por su carne, tales como las crías de las palomas. Los ejemplos de aves de corral incluyen pollos (incluyendo ponedoras, pollos de engorde y pollitos), patos, gansos, palomas, pavos y codornices.

Prevenir las infecciones y/o enteritis necrótica por C. perfringens: El término "prevenir las infecciones y/o la enteritis necrótica por C. perfringens" significa un método y/o composición que previene el desarrollo de una infección y/o enteritis necrótica por C. perfringens en un animal.

Sensible a antibióticos: El término "sensible a antibióticos" significa la propiedad fenotípica de una cepa bacteriana, cuyo crecimiento de dicha cepa bacteriana es inhibido en condiciones donde la cepa bacteriana crecería por lo demás. En este contexto, la sensibilidad a antibióticos se prueba según las directrices de CLSI (M07-A9 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; 2012). Se usa ATCC 29213 de S. aureus como cepa de referencia, que significa que se debe incluir en la prueba, y que los resultados solo son válidos si ATCC 29213 de S. aureus muestra resultados en cumplimiento de los valores críticos de la directriz de CLSI (véase Ejemplo 5 Tabla 5.5) (M100-S24 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; suplemento informativo, 2014). Una cepa de Bacillus se considera sensible si el crecimiento se detecta a una concentración igual o inferior al valor crítico del antibiótico apropiado especificado en EFSA Journal 2012; 10(6):2740.

Espora: Los términos "espora" y "endospora" son intercambiables y tienen su significado normal que se conoce bien y es entendido por los expertos en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término espora se refiere a un microorganismo en su estado protegido latente.

Estable: El término "estable" es un término que se conoce en la técnica y, en un aspecto preferido, estable pretende significar la capacidad del microorganismo para seguir en una forma de espora hasta que se administra a un animal para mejorar la salud del animal.

Porcino: El término "porcino" o "cerdos" significa cerdos domesticados por el hombre para comida, tal como su carne. Porcino incluye miembros del género Sus, tal como Sus scrofa domesticus o Sus domesticus, e incluye cochinillos, cerdos en crecimiento y cerdas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se ha descubierto sorprendentemente que la adición de microbios de alimentación directa (DFM) de especies de Bacillus a pienso para animales se puede usar para prevenir y/o controlar infecciones y/o enteritis necrótica por C. perfringens en animales monogástricos, tales como cerdos y/o aves de corral, y al mismo tiempo mejorar el aumento de peso corporal y/o la velocidad de conversión del pienso (en tanto pollos expuestos como sin exponer a Clostridium perfringens).

Cepas de Bacillus de la invención

en donde la cepa de Bacillus tiene una elevada compatibilidad con monensina;

en donde la cepa de Bacillus es no hemolítica; y

en donde la cepa de Bacillus se caracteriza por:

i) tener el número de acceso al depósito DSM 29870;

ii) tener el número de acceso al depósito DSM 29869;

iii) tener el número de acceso al depósito DSM 29871; o

iv) tener el número de acceso al depósito DSM 29872.

En una realización preferida, el Bacillus es compatible con al menos 2,3 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12. Es incluso más preferido que la cepa de Bacillus sea compatible con al menos 2,4 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12 (tal como al menos 2,5 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12, tal como al menos 2,6 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12, o tal como al menos 2,7 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12).

La sensibilidad a vancomicina, clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina y tetraciclina se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 5.

La actividad enzimática en condiciones aerobias y/o anaerobias que hidroliza uno o más de los sustratos seleccionados del grupo que consiste en amilosa, arabinano, arabinoxilano, caseína y xilano se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 6.

En una realización, la cepa de Bacillus tiene actividad enzimática en condiciones aerobias y/o anaerobias que hidroliza uno o más de los sustratos seleccionados del grupo que consiste en amilosa, arabinano, arabinoxilano, caseína y xilano.

En una realización, la cepa de Bacillus mejora uno o más parámetros de rendimiento en aves de corral seleccionados de la lista que consiste en aumento de peso corporal, factor de eficiencia europea de producción y velocidad de conversión del pienso en pollos alimentados con la cepa de Bacillus.

En una realización, la cepa de Bacillus tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens. La actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2.

En una realización, la mejora de la velocidad de conversión del pienso (FCR) da como resultado una FCR de -2,5 % o inferior a -2,5 %, tal como inferior a -2,6 %, tal como inferior a -2,7 %, tal como inferior a -2,8 %, tal como inferior a -2,9 %, tal como inferior a -3,0 %. En una realización preferida, la mejora de FCR da como resultado una FCR de -5 % a -2 %, tal como una FCR de -4 % a -2 %, tal como una FCR de -3,5 % a -2,5 %. En una realización específica, la mejora de FCR da como resultado una FCR dentro de un intervalo seleccionado del grupo que consiste en de -5 % a -4,5 %, de -4,5 % a -4 %, de -4 % a -3,8 %, de -3,8 % a -3,6 %, de -3,6 % a -3,4 %, de -3,4 % a -3,2 %, de -3,2 a -3.0 %, de -3,0 % a -2,8 % y de -2,8 a -2,5 %, o cualquier combinación de estos intervalos. La FCR se puede determinar como se describe en el Ejemplo 8.

En una realización, la mejora en el aumento de peso corporal da como resultado un aumento de peso corporal de al menos el 0,5 %, tal como al menos el 0,8 %, tal como al menos el 1,5 %, tal como al menos el 1,8 %, tal como al menos el 2,0 %, tal como al menos el 2,3 %, tal como al menos el 3,5 %, tal como al menos el 4,2 %, tal como al menos el 5,2 %, tal como al menos el 6,5 %, tal como al menos el 7,3 %. En una realización preferida, la mejora en el aumento de peso corporal da como resultado un aumento de peso corporal seleccionado del grupo que consiste en de 1,8 % a 2,0 %, de 2,0 % a 2,2 %, de 2,2 % a 2,4 %, de 2,4 % a 2,6 %, de 2,6 % a 2,8 %, de 2,8 % a 3,0 %, de 3.0 % a 3,2 %, de 3,2 % a 3,4 %, de 3,4 % a 3,6 %, de 3,6 % a 3,8 %, de 3,8 % a 4,0 %, de 4 % a 5 %, de 5 % a 7 %, de 7 % a 10 %, o cualquier combinación de los mismos. El aumento del peso corporal se puede determinar como se describe en el Ejemplo 8.

En una realización, la cepa de Bacillus es una cepa de Bacillus subtilis, una cepa de Bacillus amyloliquefaciens o una cepa de Bacillus licheniformis.

En una realización, la cepa de Bacillus tiene un efecto antimicrobiano contra E. coli. El efecto contra E. coli se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4.

En una realización, la cepa de Bacillus es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29869. En otra realización, la cepa de Bacillus es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870. En otra realización más, la cepa de Bacillus es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29871. En una realización adicional, la cepa de Bacillus es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29872.

La invención también se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus. En una realización adicional, la invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29869. En una realización adicional, la invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870. En una realización adicional, la invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29871. En una realización adicional, la invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29872.

En una realización adicional, la invención también se refiere a una cepa aislada de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29869. En una realización adicional, la invención también se refiere a una cepa aislada de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870. En una realización adicional, la invención también se refiere a una cepa aislada de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29871. En una realización adicional, la invención también se refiere a una cepa aislada de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29872.

Composiciones de la invención

La invención se refiere a una composición que comprende esporas de una o más cepas de Bacillus para su uso según invención.

Más específicamente, la invención se refiere a una cepa de Bacillus para su uso en la mejora de uno o más parámetros de rendimiento de un animal seleccionados del grupo que consiste en: mejorar la relación de conversión de pienso, mejorar el aumento de peso corporal, mejorar el factor de eficiencia europea de producción, mejorar la eficiencia del pienso y mejorar la salud, por ejemplo, de aves de corral, tales como pollos;

en donde la cepa de Bacillus tiene una elevada compatibilidad con monensina;

en donde la cepa de Bacillus es no hemolítica; y

en donde la cepa de Bacillus se caracteriza por:

i) tener el número de acceso al depósito DSM 29870;

ii) tener el número de acceso al depósito DSM 29869;

iii) tener el número de acceso al depósito DSM 29871; o

iv) tener el número de acceso al depósito DSM 29872;

en donde las esporas de Bacillus están presentes como esporas secadas en una composición.

En una realización preferida, la(s) cepa(s) de Bacillus de la composición es compatible con al menos 2,3 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12. Es incluso más preferido que la cepa de Bacillus sea compatible con al menos 2,4 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12 (tal como al menos 2,5 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12, tal como al menos 2,6 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12, o tal como al menos 2,7 μg/ml de monensina como se determina en el Ejemplo 12).

En una realización, la cepa de Bacillus de la composición tiene actividad enzimática en condiciones aerobias y/o anaerobias que hidroliza uno o más de los sustratos seleccionados del grupo que consiste en amilosa, arabinano, arabinoxilano, caseína y xilano.

En una realización, la cepa de Bacillus de la composición mejora uno o más parámetros de rendimiento en aves de corral seleccionados de la lista que consiste en aumento de peso corporal, factor de eficiencia europea de producción y velocidad de conversión del pienso en pollos alimentados con la cepa de Bacillus.

En una realización, la cepa de Bacillus de la composición tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens. La actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2.

En una realización, la mejora de la velocidad de conversión del pienso (FCR) da como resultado una FCR de -2,5 % o inferior a -2,5 %, tal como inferior a -2,6 %, tal como inferior a -2,7 %, tal como inferior a -2,8 %, tal como inferior a -2,9 %, tal como inferior a -3,0 %. En una realización preferida, la mejora de FCR da como resultado una FCR de -5 % a -2 %, tal como una FCR de -4 % a -2 %, tal como una FCR de -3,5 % a -2,5 %. En una realización específica, la mejora de FCR da como resultado una FCR dentro de un intervalo seleccionado del grupo que consiste en de -5 % a -4,5 %, de -4,5 % a -4 %, de -4 % a -3,8 %, de -3,8 % a -3,6 %, de -3,6 % a -3,4 %, de -3,4 % a -3,2 %, de -3,2 a -3,0 %, de -3,0 % a -2,8 % y de -2,8 a -2,5 %, o cualquier combinación de estos intervalos. La FCR se puede determinar como se describe en el Ejemplo 8.

En una realización, la mejora en el aumento de peso corporal da como resultado un aumento de peso corporal de al menos el 0,5 %, tal como al menos el 0,8 %, tal como al menos el 1,5 %, tal como al menos el 1,8 %, tal como al menos el 2,0 %, tal como al menos el 2,3 %, tal como al menos el 3,5 %, tal como al menos el 4,2 %, tal como al menos el 5,2 %, tal como al menos el 6,5 %, tal como al menos el 7,3 %. En una realización preferida, la mejora en el aumento de peso corporal da como resultado un aumento de peso corporal seleccionado del grupo que consiste en de 1,8 % a 2,0 %, de 2,0 % a 2,2 %, de 2,2 % a 2,4 %, de 2,4 % a 2,6 %, de 2,6 % a 2,8 %, de 2,8 % a 3,0 %, de 3,0 % a 3,2 %, de 3,2 % a 3,4 %, de 3,4 % a 3,6 %, de 3,6 % a 3,8 %, de 3,8 % a 4,0 %, de 4 % a 5 %, de 5 % a 7 %, de 7 % a 10 %, o cualquier combinación de los mismos. El aumento del peso corporal se puede determinar como se describe en el Ejemplo 8.

En una realización, la cepa de Bacillus de la composición es una cepa de Bacillus subtilis, o una cepa de Bacillus amyloliquefaciens.

En una realización, la cepa de Bacillus de la composición tiene un efecto antimicrobiano contra E. coli. El efecto contra E. coli se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4.

En una realización, la cepa de Bacillus de la composición es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29869. En otra realización, la cepa de Bacillus de la composición es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870. En otra realización más, la cepa de Bacillus de la composición es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29871. En una realización adicional, la cepa de Bacillus de la composición es la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso al depósito DSM 29872.

En una realización, las esporas de Bacillus de la composición están presentes como esporas secadas, tales como esporas secadas por pulverización. En una realización, las esporas de Bacillus de la composición están presentes como esporas estables. La composición también pueden ser una composición líquida y/o comprender sobrenadante de cultivo que comprende una o más cepa(s) de Bacillus de la invención.

En una realización, la composición comprende además un vehículo. El vehículo puede comprender uno o más de los siguientes compuestos: agua, glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol o 1,3-propilenglicol, cloruro sódico, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, tiosulfato de sodio, carbonato cálcico, citrato de sodio, dextrina, maltodextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, harina de trigo, salvado de trigo, harina de gluten de maíz, almidón, celulosa farigel, núcleos de yuca, silicato de sodio y aluminio, sílice amorfa coloidal, Sipernat 50S, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000 y carbopol.

En una realización preferida, la composición comprende además carbonato cálcico y silicato de sodio y aluminio.

En una realización preferida, la composición comprende además carbonato cálcico, silicato de sodio y aluminio y sacarosa.

En otra realización preferida, la composición comprende además uno o más vehículos, tales como uno o más vehículos seleccionados del grupo que consiste en carbonato cálcico, sulfato de sodio, almidón, farigel y núcleos de yuca.

En otra realización preferida, la composición comprende además uno o más agentes de fluidez, tales como silicato de sodio y aluminio y/o sílice amorfa coloidal (por ejemplo, Sipernat 50S).

En otra realización preferida, la composición comprende además uno o más aglutinantes, tales como uno o más aglutinantes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, glicerol, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, dextrina, maltodextrina y carbopol.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29869 de Bacillus, carbonato cálcico y silicato de sodio y aluminio.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29869 de Bacillus, carbonato cálcico, silicato de sodio y aluminio y sacarosa.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29869 de Bacillus y uno o más vehículos, tales como uno o más vehículos seleccionados del grupo que consiste en carbonato cálcico, sulfato de sodio, almidón, farigel y núcleos de yuca.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29869 de Bacillus y uno o más agentes de fluidez, tales como silicato de sodio y aluminio y/o sílice amorfa coloidal (por ejemplo, Sipernat 50S).

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29869 de Bacillus y uno o más aglutinantes, tales como uno o más aglutinantes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, glicerol, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, dextrina, maltodextrina y carbopol.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29870 de Bacillus, carbonato cálcico y silicato de sodio y aluminio.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29870 de Bacillus, carbonato cálcico, silicato de sodio y aluminio y sacarosa.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29870 de Bacillus y uno o más vehículos, tales como uno o más vehículos seleccionados del grupo que consiste en carbonato cálcico, sulfato de sodio, almidón, farigel y núcleos de yuca.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29870 de Bacillus y uno o más agentes de fluidez, tales como silicato de sodio y aluminio y/o sílice amorfa coloidal (por ejemplo, Sipernat 50S).

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29870 de Bacillus y uno o más aglutinantes, tales como uno o más aglutinantes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, glicerol, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, dextrina, maltodextrina y carbopol.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29871 de Bacillus, carbonato cálcico y silicato de sodio y aluminio.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29871 de Bacillus, carbonato cálcico, silicato de sodio y aluminio y sacarosa.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29871 de Bacillus y uno o más vehículos, tales como uno o más vehículos seleccionados del grupo que consiste en carbonato cálcico, sulfato de sodio, almidón, farigel y núcleos de yuca.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29871 de Bacillus y uno o más agentes de fluidez, tales como silicato de sodio y aluminio y/o sílice amorfa coloidal (por ejemplo, Sipernat 50S).

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29871 de Bacillus y uno o más aglutinantes, tales como uno o más aglutinantes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, glicerol, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, dextrina, maltodextrina y carbopol.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29872 de Bacillus, carbonato cálcico y silicato de sodio y aluminio.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29872 de Bacillus, carbonato cálcico, silicato de sodio y aluminio y sacarosa.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29872 de Bacillus y uno o más vehículos, tales como uno o más vehículos seleccionados del grupo que consiste en carbonato cálcico, sulfato de sodio, almidón, farigel y núcleos de yuca.

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29872 de Bacillus y uno o más agentes de fluidez, tales como silicato de sodio y aluminio y/o sílice amorfa coloidal (por ejemplo, Sipernat 50S).

En una realización preferida, la composición comprende DSM 29872 de Bacillus y uno o más aglutinantes, tales como uno o más aglutinantes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, glicerol, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, dextrina, maltodextrina y carbopol.

En una realización, la composición comprende uno o más coccidiostatos en donde la composición es, por ejemplo, una premezcla.

En una realización preferida, la composición la composición comprende de 105 a 1018 UFC/g de esporas aisladas de Bacillus.

En una realización adicional, la composición según la invención comprende una o más cepas bacterianas, tales como al menos dos de las cepas anteriores hasta y que incluyen todas las cepas en el grupo que consiste en DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872.

En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la espora de Bacillus destruye/inhibe al menos 40 % (tal como al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 % o al menos 80 %) de Clostridium perfringens después de, por ejemplo, 24 horas, por ejemplo, determinado como se describe en el Ejemplo 2.

En otra realización de la invención, la composición comprende además uno o más microbios adicionales. En otra realización de la invención, la composición comprende además una o más enzimas. En otra realización de la invención, la composición comprende además una o más vitaminas. En otra realización de la invención, la composición comprende además uno o más minerales. En otra realización de la invención, la composición comprende además uno o más aminoácidos. En otra realización de la invención, la composición comprende además uno o varios de otros ingredientes para pienso.

En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición también mejora la salud del animal monogástrico cuando se alimenta a dicho animal. En otra realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición también aumenta el rendimiento en huevos de aves de corral cuando se alimentan dichas aves de corral. En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición aumenta el rendimiento en carne del animal monogástrico cuando se alimenta a dicho animal.

En una realización preferida, la composición comprende una o más cepas bacterianas descritas en el presente documento, en donde la cifra bacteriana de cada una de las cepas bacterianas es entre 1x104 y 1x1018 UFC/kg de composición, preferentemente entre 1x107 y 1x1016 UFC/kg de composición, más preferentemente entre 1x1010 y 1x1015 UFC/kg de composición y lo más preferentemente entre 1x10” y 1x1014 UFC/kg de composición.

En una realización preferida, la cifra bacteriana de cada una de las cepas bacterianas en la composición es entre 1x104 y 1x1018 UFC/kg de materia seca, preferentemente entre 1x107 y 1x1016 UFC/kg de materia seca, más preferentemente entre 1x1010 y 1x1015 UFC/kg de materia seca y lo más preferentemente entre 1x10” y 1x1014 UFC/kg de materia seca. En una realización más preferida, la cifra bacteriana de cada una de las cepas bacterianas en el pienso para animales es entre 1x108 y 1x1010 UFC/kg de materia seca.

En una realización preferida, la composición tiene una cifra bacteriana de cada espora de Bacillus entre 1x103 y 1x1013 UFC/animal/día, preferentemente entre 1x105 y 1x10” UFC/animal/día, más preferentemente entre 1x106 y 1x1010 UFC/animal/día y lo más preferentemente entre 1x107 y 1x109 UFC/animal/día.

En todavía otra realización más de la invención, la una o más cepas bacterianas están presentes en la composición en forma de una espora, tal como una espora estable. En todavía una realización adicional de la invención, la espora estable germinará en el intestino y/o estómago del animal monogástrico.

En una realización, la una o más cepas bacterianas son estables cuando se someten a presiones aplicadas/logradas durante un proceso de extrusión para la peletización. En una realización particular, la una o más cepas bacterianas son estables a presiones que varían desde 1 bar hasta 40 bares, particularmente 10 bares a 40 bares, más particularmente 15 bares a 40 bares, incluso más particularmente 20 bares a 40 bares, todavía incluso más particularmente 35 bares a 37 bares, incluso todavía más particularmente 36 bares.

En una realización particular, la una o más cepas bacterianas son estables a altas temperaturas. En particular, las cepas bacterianas son estables cuando se someten a temperaturas logradas durante un proceso de extrusión para la peletización. En una realización incluso más particular, la una o más cepas bacterianas son estables a temperaturas que varían desde 80 °C hasta 120 °C, particularmente temperaturas que varían desde 90 °C hasta 120 °C, incluso más particularmente temperaturas que varían desde 95 °C hasta 120 °C.

En una realización, la composición comprende un vehículo y la cepa que tiene el número de acceso al depósito DSM 29869.

En una realización, la composición comprende un vehículo y la cepa que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870.

En una realización, la composición comprende un vehículo y la cepa que tiene el número de acceso al depósito DSM 29871.

En una realización, la composición comprende un vehículo y la cepa que tiene el número de acceso al depósito DSM 29872.

En una realización, la composición comprende además uno o más microbios adicionales. En una realización particular, la composición comprende además una bacteria de uno o más de los siguientes géneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Camobacterium, Propionibacterium, Bifidobacteríum, Clostridium y Megasphaera o cualquier combinación de los mismos

En una realización particular, la composición comprende además una bacteria de una o más de las siguientes cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización particular, la composición comprende además uno o más tipos de levadura. El uno o más tipos de levadura se pueden seleccionar del grupo que consiste en Saccharomycetaceae, Saccharomyces (tal como S. cerevisiae y/o S. boulardii), Kluyveromyces (tal como K. marxianus y K. lactis), Candida (tal como C. utilis, también llamada levadura de Torula), Pichia (tal como P. pastoris), Torulaspora (tal como T. delbrueckii), levaduras de Phaffia y Basidiomycota.

En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición comprende además un vehículo. El vehículo puede comprender uno o más de los siguientes compuestos: agua, glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol o 1,3-propilenglicol, cloruro sódico, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, tiosulfato de sodio, carbonato cálcico, citrato de sodio, dextrina, maltodextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, harina de trigo, salvado de trigo, harina de gluten de maíz, almidón, celulosa, farigel, núcleos de yuca, silicato de sodio y aluminio, sílice amorfa coloidal, Sipernat 50S, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000 y carbopol.

En otra realización, la composición descrita en el presente documento puede incluir opcionalmente una o más enzimas. Las enzimas se pueden clasificar basándose en el manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992), véase también el sitio de ENZYME en internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME es un repositorio de información con respecto a la nomenclatura de enzimas. Se basa principalmente en las recomendaciones del comité de nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología molecular (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, y describe cada tipo de enzima caracterizada para la que se ha proporcionado un número EC (Comisión de Enzimas) (Bairoch, The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res. 28:304-305). Esta nomenclatura de enzimas de IUB-MB se basa en su especificidad por sustrato y ocasionalmente en su mecanismo molecular; dicha clasificación no refleja las características estructurales de estas enzimas.

Hace algunos años se propuso otra clasificación de ciertas enzimas de glucósido hidrolasa, tales como endoglucanasa, xilanasa, galactanasa, mananoasa, dextranasa y alfa-galactosidasa, en familias basadas en similitudes de secuencias de aminoácidos. Actualmente se clasifican en 90 familias diferentes: véase el sitio de internet de CAZy(ModO) (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999), servidor de Carbohydrate-Active Enzymes en la URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html (artículos correspondientes: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita y T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23).

Por lo tanto, la composición de la invención también puede comprenden al menos otra enzima seleccionada del grupo que comprende fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4); fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa, tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); lisozima (EC 3.2.1.17); y beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6), o cualquier mezcla de las mismas.

En una realización particular, la composición de la invención comprende una fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26). Los ejemplos de fitasas comercialmente disponibles incluyen la fitasa Bio-Feed™ (Novozymes), Ronozyme® P y HiPhos™ (DSM Nutritional Products), Natuphos™ (BASF), Finase® y Quantum® Blue (AB Enzymes), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) y Axtra® PHY (DuPont). Otras fitasas preferidas incluyen las describas en, por ejemplo, los documentos de patente WO 98/28408, WO 00/43503 y WO 03/066847.

En una realización particular, la composición de la invención comprende una xilanasa (EC 3.2.1.8). Los ejemplos de xilanasas comercialmente disponibles incluyen Ronozyme® WX y G2 (DSM Nutritional Products), Econase® XT y Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium) y Axtra® XB (xilanasa/beta-glucanasa, DuPont)

En una realización particular, la composición de la invención comprende una proteasa (EC 3.4). Los ejemplos de proteasas comercialmente disponibles incluyen Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products).

Fabricación

La composición de la invención se puede fabricar, por ejemplo, como composición en harina (no peletizada) o composición peletizada. Los cultivos de bacterias y opcionalmente las enzimas se pueden añadir como formulaciones sólidas o líquidas. Por ejemplo, para la composición en harina, una formulación de cultivo sólido o líquido se puede añadir antes o durante la etapa de mezcla de los ingredientes. Normalmente, una preparación de cultivo líquido comprende el cultivo de la invención opcionalmente con un poliol, tal como glicerol, etilenglicol o propilenglicol, y se añade después de la etapa de peletización, tal como pulverizando la formulación líquida sobre las pellas.

La enzima se puede añadir a la composición como un gránulo, que opcionalmente se peletiza o extruye. El gránulo comprende normalmente una partícula de núcleo y uno o más recubrimientos, que normalmente son recubrimientos de sal y/o cera. La partícula de núcleo puede o ser una mezcla homogénea de un compuesto activo opcionalmente junto con sales (por ejemplo, sal de cinc o de calcio orgánica o inorgánica), o una partícula inerte con un compuesto activo aplicado sobre ella. El compuesto activo es el cultivo de la invención opcionalmente combinado con una o más enzimas. La partícula inerte puede ser soluble en agua o insoluble en agua, por ejemplo, almidón, un azúcar (tal como sacarosa o lactosa), o una sal (tal como NaCl, Na²SÜ⁴). El recubrimiento de sal es de normalmente al menos 1 gm de grosor y puede ser una sal particular o una mezcla de sales, tales como Na²SÜ⁴, K²SO⁴, MgSÜ⁴y/o citrato de sodio. Otros ejemplos son los descritos en, por ejemplo, los documentos de patente WO 2008/017659, WO 2006/034710, WO 97/05245, WO 98/54980, WO 98/55599, W o 00/70034 o recubrimiento de polímero, tal como se describe en el documento de patente WO 01/00042.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Cribado de cepas de Bacillus negativas para hemolisis

Se probó la hemólisis según Technical Guidance on the assessment of the toxigenic potential of Bacillus species used in animal nutrition, EFSA Journal 2011; 9(11):2445.

Se compraron placas de agar con sangre ovina listas para usar (Becton Dickenson, Art. 254053 o 254087). Alternativamente, las placas de agar se pueden preparar añadiendo 5 % de sangre ovina desfibrinada (obtenida del Statens Serum Institute, Dinamarca) a TS-agar (Oxoid CM 131). El agar debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 minutos y enfriado a aproximadamente 40 °C antes de añadir la sangre inmediatamente antes de verter las placas.

Se sacaron las cepas de Bacillus de la conservación a -80 °C y se extendieron sobre la placa de TS-agar, que se incubó a 30 °C durante la noche o hasta que apareció el crecimiento. A partir de una única colonia se usó tan poco como fuera posible del material para extender una línea sobre % de una placa de agar. La placa se incubó a 30 °C durante 72 horas. Se compararon las zonas de hemólisis/despejadas de las cepas de Bacillus a probar con el control positivo y negativo. Se usó Bacillus subtilis ATCC21332 como control positivo. Como control negativo se usó Bacillus subtilis 168 (BGSC-1A1, Bacillus Genetic Stock Center).

En un cribado de 599 cepas aisladas independientes de Bacillus, 223 cepas (37 %) dieron negativo para la hemólisis. En otro cribado, 21 de las 65 cepas aisladas independientes de Bacillus (32 %) dieron negativo para la hemólisis. Ambos cribados comprendieron exclusivamente cepas que, basándose en la identificación por secuenciación de ADNr 16S, pertenecen a Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus o Bacillus amyloliquefaciens o parientes cercanos de estas cuatro especies.

Por lo tanto, parece que las cepas de Bacillus no hemolíticas son comunes y bastante abundantes en la naturaleza, pero que solo comprenden una minoría de las cepas naturales. Las cepas no hemolíticas parecen ser más abundantes en Bacillus licheniformis, mientras que la mayoría de las cepas de Bacillus amyloliquefaciens parecen hemolíticas. Todas las cepas no hemolíticas se probaron para la inhibición del crecimiento de Clostridium perfringens. Las siguientes cepas del cribado dieron todas negativo para la hemólisis y entre ellas se seleccionaron para estudios adicionales: DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872. Se determinó que Clostat (Bacillus PB6) era hemolítica.

Ejemplo 2: Determinación de la inhibición del crecimiento de Clostridium perfringens

Se probaron todas las cepas no hemolíticas para la inhibición del crecimiento de las cepas 23 y 48 de Clostridium perfringens (ambas son netB positivas) [Gholamiandekhordi et al., 2006, Molecular and phenotypical characterization of Clostridium perfringens isolates from poultry flocks with different disease status, Vet. Microbiol. 113:143-152], se cultivaron durante la noche en caldo de soja tríptica (BD, pieza 211822) complementado con 0,6 % de extracto de levadura (BD, pieza 212750) a 35 °C en condiciones anaerobias estáticas. Se añadió 250 gl del cultivo durante la noche de Clostridium perfringens a 250 ml de agar de soja tríptico complementado con 0,6 % de extracto de levadura a 40 °C y se vertió en placas de Petri rectangulares (Nunc, pieza 267060). Se dejó enfriar el agar inoculado a temperatura ambiente después de que se hiciera un pocillo de 8 mm de diámetro en el agar. Las placas se almacenaron en ausencia de oxígeno hasta su uso.

La cepa de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 o DSM 29872 se cultivó durante la noche en caldo de soja tríptico a 35 °C en condiciones aerobias. Se recogieron 1000 gl de cultivo de Bacillus y se fraccionó en sobrenadante sin células y células por centrifugación. Se añadieron 20 gl de sobrenadante sin células o células 100x diluidas en solución salina tamponada con fosfato directamente a los pocillos en las placas de agar inoculadas con Clostridium perfringens. Un pocilio de control contuvo 20 μl de solución salina tamponada con tampón. Las placas se incubaron durante 18 horas a 35 °C en condiciones anaerobias.

La inhibición de la cepa de Clostridium perfringens se observó por una zona despejada circular alrededor del pocillo de interés. El pocillo de solución salina tamponada con fosfato se consideró un control negativo basándose en la ausencia de zona despejada alrededor del pocillo.

El sobrenadante sin células y las células 100x diluidas de las cepas de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 fueron capaces de inhibir coherentemente el crecimiento de las cepas 23 y 48 de C. perfringens in vitro. También se observó inhibición por la cepa competidora "CloSTAT", para tanto sobrenadante como células, pero no se observó con la cepa competidora GalliproTect. "CloSTAT" es una cepa de Bacillus amyloliquefaciens que se aisló del producto comercial de DFM CloSTAT, Kemin. "GalliproTect" es una cepa de Bacillus licheniformis que se aisló del producto comercial Gallipro Tect, Chr Hansen.

Ejemplo 3: Identificación, caracterización y depositó del material biológico

Los siguientes materiales biológicos se depositaron bajo los términos del Tratado de Budapest en el Leibniz-lnstitut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig Alemania, y se les dio los siguientes números de acceso:

Tabla 3,1: Depósito de material biológico

Las cepas se han depositado en condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la tramitación de la presente solicitud de patente para quien las leyes de patentes extranjeras determinen que tiene derecho al mismo. Los depósitos representan un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. Los depósitos están disponibles según lo exigido por las leyes de patentes extranjeras en los países en donde se presenten homólogos de la solicitud en cuestión o de su descendencia. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la invención en cuestión en derogación de los derechos de patente concedidos por acción gubernamental.

Secuenciación de genes de ARNr 16S

Se extrajo ADN de un cultivo de DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 usando el kit QiaAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Art. 51106). El kit se usó como se recomendó para la extracción de ADN de bacterias grampositivas.

Se amplificó el ARNr 16S en un volumen total de 50 μl mezclando: 10 pmol de cada cebador 16S F y 16S R, 0,2 mM de cada nucleótido, 2,5 unidades de Ampli taq, 1x tampón Ampli taq, 5 μl de molde de ADN y usando el siguiente programa de PCR: 94 °C 2 min (94 °C 30 s, 52 °C 30 s, 72 °C 1 min)x35, 72 °C 10 min en una máquina de PCR de Perkin Elmer. El producto de PCR se secuenció por la instalación de secuenciación de ADN de Novozymes usando el cebador 530R, 357F, 1390R y 1100F.

Tabla 3,2: Cebadores:

La degeneración del cebador 1390-R: R es A o G. Las secuencias de ADNr 16S de DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 se muestran como SEQ ID NO: 1-4 en el listado de secuencias, respectivamente. Las secuencias de ADNr 16S de DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 se analizaron por BLAST contra la base de datos de EMBL y mostraron identidad con secuencias de ADNr 16S de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3) y con respecto a Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4).

Para estudiar la afiliación filogenética de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, las secuencias se analizaron por una alineación ClustalW en MegAlign (DNASTAR) usando SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7 como referencia. Estas secuencias son secuencias de ADNr 16S de referencia del tipo cepas de Bacillus vallismortis tomadas de AB021198 (SEQ ID NO: 5), Bacillus subtilis tomadas de AJ276351 (SEQ ID NO: 6) y Bacillus amyloliquefaciens tomadas de AB255669 (SEQ ID NO: 7).

La alineación ClustalW de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 7 (Fig. 1) muestra posiciones de 7 nucleótidos donde 2 o más secuencias tienen un nucleótido que se desvía de la otra. Para la numeración, se usan las posiciones en SEQ ID NO: 6. En la posición 152, SEQ ID NO: 2 es idéntico a Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus vallismortis, pero diferente del resto que son idénticos entre sí. En la posición 174, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4 son idénticos a Bacillus amyloliquefaciens, pero diferentes del resto que son idénticos entre sí. En la posición 257, SEQ ID NO: 4 es idéntico a Bacillus amyloliquefaciens, pero diferente del resto que son idénticos entre sí. En la posición 437, 444 y 455, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 son idénticos a Bacillus subtilis, pero diferentes del resto que son idénticos entre sí. En la posición 1223, SEQ ID NO: 1 es idéntico a Bacillus amyloliquefaciens, pero diferente del resto que son idénticos entre sí. La variación en los genes de ADNr 16S soportan la afiliación de especies observada en el informe de BLAST.

Descripción del material biológico

Se aisló DSM 29869 de Bacillus amyloliquefaciens por Novozymes (Novo Nordisk) de una muestra medioambiental recogida en Jamaica en 1990. La cepa se identificó como Bacillus amyloliquefaciens basándose en la secuenciación de ADNr 16S.

Se aisló DSM 29870 de Bacillus subtilis por Novozymes (Novo Nordisk) de una muestra medioambiental recogida en Jamaica en 1990. La cepa se identificó como Bacillus subtilis basándose en la secuenciación de ADNr 16S.

Se aisló DSM 29871 de Bacillus subtilis para Novozymes por un estudiante danés de secundaria en Brcnderslev Gymnasium de una muestra de tierra de una propiedad privada en Dinamarca en 2008. La cepa se identificó como Bacillus subtilis basándose en la secuenciación de ADNr 16S.

Se aisló DSM 29872 de Bacillus amyloliquefaciens de una muestra medioambiental de los EE. UU. en 2008. La cepa se identificó como Bacillus amyloliquefaciens basándose en la secuenciación de ADNr 16S.

Ejemplo 4: Determinación de la inhibición del crecimiento de Escherichia coli

Se cultivaron cepas de Escherichia coli, ATCC10536 o ATCC25922, durante la noche en caldo de soja tríptico (BD, pieza 211822) complementado con 0,6 % de extracto de levadura (BD, pieza 212750) a 35 °C en condiciones anaerobias estáticas. Se añadió 100 μl del cultivo durante la noche de Escherichia coli a 250 ml de agar de soja tríptico complementado con 0,6 % de extracto de levadura a 40 °C y se vertió en placas de Petri rectangulares (Nunc, pieza 267060). Entonces se dejó enfriar el agar inoculado a temperatura ambiente después de que se hiciera un pocillo de 8 mm de diámetro en el agar.

La cepa de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 o DSM 29872 se cultivó durante la noche en caldo de soja tríptico a 35 °C en condiciones aerobias. Se recogieron 1000 μl de cultivo de Bacillus subtilis y se fraccionó en sobrenadante sin células y células por centrifugación. Se añadieron 20 μl de sobrenadante sin células o células 100x diluidas en solución salina tamponada con fosfato directamente a los pocillos en las placas de agar inoculadas con Escherichia coli. Un pocillo de control contuvo 20 μl de solución salina tamponada con tampón. Las placas se incubaron durante 18 horas a 30 °C en condiciones anaerobias.

La inhibición de la cepa de Escherichia coli se observó por una zona despejada circular alrededor del pocillo de interés. El pocillo de solución salina tamponada con fosfato se consideró un control negativo basándose en la ausencia de zona despejada alrededor del pocillo.

El sobrenadante sin células y las células 100x diluidas de las cepas de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871, y DSM 29872 fueron capaces de inhibir coherentemente el crecimiento de las cepas de E. coli ATCC10535 y ATCC25922 in vitro. También se observó inhibición por la cepa competidora CloSTAT, para tanto sobrenadante como células.

Ejemplo 5: Sensibilidad a antibióticos

Se determinaron las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de ocho antibióticos contra las cepas de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 usando microdilución en caldo esencialmente como se describe en las directrices de CLSI (M07-A9 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; 2012). La única modificación fue que los volúmenes se cambiaron; se añadieron 90 μl de caldo de Mueller Hinton 2 con bacterias a 10 μl de diluciones de antibióticos, las UFC de bacterias y la concentración de antibióticos se cambiaron de forma que las concentraciones finales y las UFC finales se correspondieran con la directriz. Las placas se incubaron durante 20-24 h en lugar de 16-20 h. Se usó la cepa de control recomendada en la norma de CLSI Staphylococcus aureus ATCC 29213 como cepa de control.

Cepas:

Bacillus amyloliquefaciens DSM 29869

Bacillus subtilis DSM 29870

Bacillus subtilis DSM 29871

Bacillus amyloliquefaciens DSM 29872

S. aureus ATCC 29213

Antibióticos:

Cloranfenicol (Sigma C1919, 10 mg/ml, solubilizado en 96 % de etanol)

Clindamicina (Sigma PHR1159, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Eritromicina (ABBOTICIN de Amdipharm 40501,50 mg/ml, solubilizada en 96 % de etanol) Gentamicina (Biomedicals inc., 190057, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Kanamicina (Sigma, CAS N.° 25389-94-0, 50 mg/ml, solubilizada en agua)

Estreptomicina (Sigma, S1277, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Tetraciclina (Sigma, T3383, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Vancomicina (Sigma, V-8138, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Caldo de Mueller Hinton 2 (Sigma/Fluka 90922)

0,9 % de NaCl (Sigma/RdH 31434/Merck 106404)

Placas de agar triptona-soja (Oxoid CM 131)

Placas de microtitulación: placa Costar, polipropileno, fondo redondo, Corning 3879

Preparación de bacterias:

Se inocularon algunas colonias de Bacillus spp. (<1 día de edad) en caldo de Mueller Hinton 2 (MHB) y se incubaron durante aproximadamente 4 horas a 37 °C. Se midió DO600 (BioPhotometer plus, Eppendorf) y se ajustó a 0,25 (equivalente a McFarland 0,5) en MHB. Para la cepa de control se usó suspensión de colonias directa. Se suspendieron algunas colonias de S. aureus ATCC 29213 (<1 día de edad) en MHB y se midió la DO600 (BioPhotometer plus, Eppendorf) y se ajustó a 0,10-0,12 (equivalente a McFarland 0,5) en MHB. Las suspensiones bacterianas se diluyeron 200x en MHB.

Preparación de placas de ensayo:

Se diluyeron los antibióticos hasta la concentración de 640 μg/ml en MHB. Se preparó una dilución doble en MHB hasta la concentración 0,625 μg/ml. Se pipetearon 10 μl de cada dilución y de cada antibiótico en una placa de microtitulación. Después, cuando los antibióticos se mezclaron con la suspensión de bacterias, las muestras se diluyeron 10x (muestra de 10 μl en un volumen total de 100 μl). Esto produjo el intervalo de prueba final de 0,06-64 μg/ml.

Si las placas no se usaron directamente, las placas se almacenaron en el congelador a -20 °C hasta su uso.

Se añadieron 90 μl de las suspensiones bacterianas a las placas de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron en una bolsa de plástico con una tela húmeda a 37 °C durante 20-24 h. La MIC se determinó como la concentración de antibiótico más baja que inhibió completamente el crecimiento de bacterias detectado a simple vista.

Estimación de UFC:

Se hizo una serie de diluciones al 10 % en 0,9 % de NaCl hasta 10-3 de los cultivos inoculados en la placa de microtitulación. Se sembraron 2 x 100 ul de la dilución de 10-3 en dos placas de TSA. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Se contó el número de UFC/ml.

Se realizaron tres duplicados biológicos del ensayo para Bacillus subtilis DSM 29871, Bacillus amyloliquefaciens DSM 29869 y Bacillus subtilis DSM 29870 (MIC 1-3), mientras que se realizaron cuatro duplicados biológicos para Bacillus amyloliquefaciens DSM 29872 (MIC 2-5).

Resultados:

Los valores de MIC obtenidos para DSM 29870 de B. subtilis mostraron que los valores críticos eran iguales o inferiores a los valores críticos dados en la directriz de EFSA (EFSA journal 2012; 10(6):2740). Para DSM 29869 de B. subtilis, los valores de MIC obtenidos en dos de los tres duplicados biológicos mostraron valores de MIC iguales o inferiores al punto crítico. En MIC 1 el valor para la tetraciclina era 16. Sin embargo, debido a la varianza analítica del método, los resultados de MIC de una dilución por encima del valor crítico son en general aceptados y la cepa se puede considerar que es sensible. Por lo tanto, según EFSA, estas dos cepas se consideran sensibles a los 8 antibióticos incluidos en la prueba (Tablas 5.2 y 5.3).

Para las cepas DSM 29871 de B. subtilis y DSM 29872 de B. amyloliquefaciens, los valores de MIC observaron que las dos cepas fueron sensibles a siete de los ocho antibióticos (Tablas 5.1 y 5.4). Se observó un aumento de la tolerancia hacia estreptomicina y según EFSA las cepas se clasifican como resistentes a estreptomicina.

Como control, se probó ATCC 29213 de S. aureus en paralelo y tuvo valores de MIC dentro de los intervalos dados por la norma de CLSI (M100-S24 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Suplemento informativo, 2014) (Tabla 5.5).

Se midió la cantidad de bacterias inoculadas en las placas de ensayo (UFC/ml). En general, las UFC/ml estuvieron muy próximas al valor objetivo de 5*105 UFC/ml. Sin embargo, las UFC/ml para las cepas de Bacillus se pueden asociar con cierta incertidumbre, puesto que las bacterias tienden a agregarse y una vez agregadas, solo darán como resultado una unidad formadora de colonias (Tablas 5.1 y 5.2).

Tabla 5.1: Resultados de MIC para DSM 29871 de B. subtilis

l

* EFSA Journal 2012; 10(6):2740

n.r. no registrado

Tabla 5.2: Resultados de MIC para DSM 29869 de B. amyloliquefaciens

Tabla 5.3: Resultados de MIC para DSM 29870 de B. subtilis

Tabla 5.4: Resultados de MIC para DSM 29872 de B. amyloliquefaciens

Tabla 5.5: Resultados de MIC para ATCC 29213 de S. aureus

Ejemplo 6: Actividad enzimática

Preparación de precultivos durante la noche

Se hizo el cultivo durante la noche es una placa profunda de 96 pocillos con 1,25 ml de caldo LB (Difco; BD N.° 244610) por pocillo. Cada cepa se probó por duplicado y se inoculó con una única colonia de una placa de Standard Methods Agar puro (placas SMA, Smith River Biologicals N.° 11-00450). Antes de la incubación, se puso una única junta transpirable estéril Aeraseal (Fisher N.° 50-212-463) encima de la placa, y la placa se incubó con agitación a 35 °C durante la noche en condiciones aerobias.

Determinación del crecimiento anaerobio

Se extendieron placas SMA de los cultivos durante la noche usando un bucle de inoculación de 10 μl. Se extendieron hasta cuatro cepas por placa, en cuadrantes separados.

Las placas se incubaron a 39 °C en un AnaeroJar (Thermo Scientific Oxoid, Fisher N.° OXAG0025A) junto con una bolsa AnaeroGen (Thermo Scientific Oxoid, Fisher N.° OXAN0025A) para mantener las condiciones anaerobias (~0,1 % de oxígeno). El trabajo se realizó en condiciones asépticas en una campana biológica, usando materiales estériles.

Determinación de la actividad enzimática usando placas de agar con sustrato AZCL

Preparación de medios con sustratos AZCL que pueden ser AZCL-celulosa esterilizado en autoclave (AZCL-HE-celulosa, I-AZCEL, Megazyme), arabinoxilano (AZCL-arabinoxilano, trigo, I-AZWAX, Megazyme), arabinano (AZCL-arabinano, desrramificada, I-AZDAR, Megazyme):

En dos (2) vasos de precipitados de 500 ml, se prepararon 300 ml de 0,1x y 1x agar LB para cada vaso de precipitados, añadiéndose una barra de agitación magnética a cada uno. Mientras se agitaba, se añadieron 100 ml de la condición LB de los vasos de precipitados a tres (3) botellas Wheaton de 250 ml, dando así 3 botellas con 0,1x LB y 3 botellas con 1x LB. Entonces se añadieron AZCL-celulosa, arabinano y arabinoxilano por separado a cada una de una botella de 1 x y a 0,1x con agitación. Se añadió un total de 0,05 gramos de sustrato por 100 ml de medio. Si se usan más de 100 ml de medio, la cantidad de sustrato añadida se ajusta usando la relación 0,05 g/100 ml. El medio se esterilizó en autoclave. Nota: Solo estos tres sustratos AZCL pueden ser esterilizados en autoclave sin liberación de colorante obvia, que indica la inestabilidad del sustrato. Después de la esterilización en autoclave, los medios se mantienes a >50 °C hasta que estén listos para verter las placas. Se comprobó el pH y, si fuera necesario, se ajustó a pH 7 usando 10 % de HCl o NaOH 2 N, manteniendo la esterilidad.

Preparación de medios con sustratos AZCL que no pueden ser esterilizados en autoclave

Estos sustratos fueron: AZCL-amilosa (I-AZAMY, Megazyme), AZCL-caseína (I-AZCAS, Megazyme), AZCL-xilano (xilano, madera de abedul (I-AZXBW, Megazyme)

En dos (2) botellas Wheaton de 1000 ml, se prepararon 400 ml de 0,1x LB y 1x LB y se añadió una barra de agitación magnética a cada una. Los medios se esterilizaron en autoclave, antes de añadir el reactivo AZCL. Después de la esterilización en autoclave, los medios se mantuvieron a 50-55 °C hasta que estuvieron listos para añadir el sustrato AZCL y verter las placas. Se comprobó el pH y, si fuera necesario, se ajustó a pH 7 usando 10 % de HCl o NaOH 2 N, manteniendo la esterilidad.

Vertido de placas medio de agar con sustrato AZCL

El trabajo se realizó en condiciones asépticas en una campana biológica, usando materiales estériles. Estas etapas se hicieron de forma relativamente rápida, de manera que el agar no solidificara antes de transferirlo a la placa de 96 pocillos.

Para sustratos que podrían ser esterilizados en autoclave (AZCL-celulosa, AZCL-arabinoxilano, AZCL-arabinano): el medio de agar líquido caliente (~50 °C) esterilizado en autoclave se agitó magnéticamente para suspender el sustrato AZCL insoluble. Se transfirió una alícuota a un recipiente de disolución estéril (fue necesaria la agitación periódica del material en el recipiente de disolución para mantener el sustrato suspendido). Se usó una pipeta multicanal de repetición (por ejemplo, pipeta Matrix de 1250 gl junto con las puntas de pipeta estériles correspondientes de 1250 gl) para dispensar 180 gl en cada pocillo de una placa de 96 pocillos estéril. Un conjunto de puntas duraría normalmente para hasta seis columnas por placa. Una vez se llenó placa, se añadió una tapa estéril, y se dejó solidificar. Se hizo una placa para cada sustrato (AZCL-celulosa, AZCL-arabinoxilano, AZCL-arabinano) y condición (0,1x y 1x LB). Para los sustratos que podrían no ser esterilizados en autoclave (AZCL-amilosa, AZCL-caseína, AZCL-xilano): a un vaso de precipitados estéril de 250 ml con barra de agitación magnética se añadió 100 ml de medio 0,1x o 1X LB estéril caliente (no se añadió sustrato AZCL). Con agitación, se añadió 0,05 mg de sustrato AZCL, y la agitación continuó hasta que se resuspendió. Puede ayudar añadir el sustrato lentamente al principio. Una vez el sustrato se resuspendió, se vertió en el recipiente de disolución y se añadió a las placas como se ha descrito anteriormente. Se hizo una placa para cada sustrato (AZCL-celulosa, AZCL-arabinoxilano, AZCL-arabinano) y condición (0,1x y 1x LB).

Inoculación de las placas de 96 pocilios, incubación y evaluación

El trabajo se realizó en condiciones asépticas en una campana biológica, usando materiales estériles. Las placas de agar con sustrato AZCL se inocularon aplicando 2 gl de cultivo durante la noche que se dispensó encima del agar. El líquido añadido debe ser visible encima del agar. Cuando se mueve a la siguiente placa, hay que estar seguro de que no quedan gotas en el extremo de las puntas de pipeta para garantizar que cada pocillo ha sido inoculado. Repetir para todas las placas de sustrato AZCL. Se prepararon diluciones de enzima de control, cada uno a 1/100, diluyendo en tampón de dilución de fosfato estéril: 10 gl de preparación de enzima 990 gl de tampón. Entonces se inocularon los pocillos de enzima de control con 10 gl de la dilución de enzima apropiada para cada sustrato

Tabla 6.1: Enzimas y sustratos respectivos

Tabla 6.2: Producción de enzima en condiciones aerobias

Tabla 6.3: Producción de enzima en condiciones anaerobias, 24 horas

Tabla 6.4: Producción de enzima en condiciones anaerobias, 48 horas

Ejemplo 7: Eficacia de la cepa DSM 29870 en condiciones de exposición de Clostridium perfringens Material y métodos

Se han realizado tres estudios en baterías independientes para evaluar la influencia de la cepa DSM 29870 sobre el desarrollo de una enteritis necrótica inducida.

En cada experimento, se asignó un total de 256 pollos de engorde macho de un día de edad Cobb x Cobb a jaulas en batería Petersime (8 aves/jaula). Las jaulas se usaron en un diseño factorial y completamente aleatorizado con 8 jaulas por tratamiento (es decir, 64 animales/tratamiento).

Se formuló una ración comercial de iniciación para pollos de engorde no medicada basada en maíz/harina de soja (Tabla 7.1). El pienso y el agua estuvieron disponibles a voluntad durante todos los ensayos.

Tabla 7.1: Composición de la dieta experimental basal4 (iniciación d1-d28)

Los 4 grupos experimentales consistieron en (Tabla 7.2): T1, animales no infectados y no tratados; T2, animales infectados por C. perfringens y no tratados; T3, animales infectados por C. perfringens alimentados con la dieta basal que contenía bacitracina (incluida a 50 ppm, de d1 a d28); T4, animales infectados por C. perfringens alimentados con la dieta basal que contenía la cepa DSM 29870 (incluida a 1.109 UFC/kg de pienso en el ensayo 1 y 5.108 UFC/kg de pienso en los ensayos 2 y 3, de d1 a d28).

Tabla 7.2: Tratamientos experimentales

En el día 14, todas las aves fueron inoculadas por vía oral con un inoculo de coccidio que contenía aproximadamente 5.000 ooquistes de Eimeria maxima por ave.

Una vez al día en d19, d20 y d21, todas las aves, excepto T1, se administraron (por sonda nasogástrica oral) con 1 ml de un caldo cultivo recién preparado de C. perfringens.

En d21, se seleccionaron tres aves de cada jaula, se sacrificaron, se pesaron y se examinaron para el grado de presencia de lesiones por enteritis necrótica. La puntuación se basó en una puntuación de 0 a 3, siendo 0 normal y siendo 3 la más grave.

Se registraron el peso corporal vivo y el pienso al principio (d1) y al final del experimento (d28), por corral, para calcular el rendimiento:

• Aumento de peso corporal (BWG) = (Peso corporal vivo)^d28-(Peso corporal vivo)^d1

• Relación de conversión de pienso (FCR) = relación entre el pienso consumido y el aumento de peso. La mortalidad se registró diariamente y la FCR se ajustó en consecuencia.

También se calcularon las puntuaciones de lesión por enteritis necrótica, la mortalidad total y el % de aves muertas con lesiones por enteritis necrótica

Los datos (n = 32) se sometieron a un ANOVA, con diseño de bloques aleatorizado completo usando el procedimiento de ANOVA de XLSTAT (Addinsoft 1995-2014) para establecer diferencias entre dietas. El corral se consideró la unidad experimental. El modelo incluyó dietas (n=4) y bloque como efecto fijo. Los resultados se informan como medias por mínimos cuadrados. Se supuso que las medias LS eran diferentes a P < 0,05.

Resultados experimentales

Los resultados obtenidos sobre el rendimiento, las puntuaciones de lesión por enteritis necrótica, la mortalidad y el % de aves muertas con los parámetros de lesiones por enteritis necrótica lesiones se muestran en las Tablas 7.3.

Tablas 7.3: Efecto de la suplementación dietética de la cepa DSM 29870 sobre el impacto negativo sobre los parámetros de producción debido a enteritis necrótica inducida en tres ensayos independientes.

Los datos obtenidos de los tres estudios de exposición mostraron que la cepa DSM 29870 puede contrarrestar el impacto negativo de una enteritis necrótica inducida sobre los parámetros de producción con un efecto significativo en todos los ensayos de exposición sobre la FCR y la mortalidad debido a enteritis necrótica, con respecto al grupo de control positivo (animales no infectados no tratados).

Además, no hubo diferencia significativa entre el grupo alimentado con DSM 29870 y el grupo alimentado con bacitracina con respecto a todos los parámetros medidos en estos ensayos.

Los estudios de exposición descritos anteriormente mostraron que la administración de la cepa DSM 29870 podría prevenir la enteritis necrótica en pollos de engorde.

Ejemplo 8: Primer ensayo de rendimiento con pollos de engorde (521)

Material y métodos

Se pesaron individualmente un total de 2000 pollos de engorde macho de un día de edad Cobb 500 (peso corporal 42 g ± 1 g) y se asignaron a corral de suelo (50 aves/corral). Los corrales se usaron en un diseño factorial y completamente aleatorizado con 8 corrales por tratamiento (es decir, 400 animales/tratamiento). Los 5 tratamientos experimentales consistieron en (Tabla 8.1): T1, dietas basales de control negativo; T2, dietas basales que contenían la cepa DSM 29870 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T3, dietas basales que contenían la cepa DSM 29871 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T4 dietas basales que contenían la cepa DSM 29872 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d i a d35); T5, dieta basal que contenía un probiótico comercializado, GalliPro Max (incluido a la dosis comercial, 8.108 UFC/kg de pienso, de d i a d35).

Las dietas basales consistieron en un programa de alimentación de 3 fases: fase de iniciación (desde el día 1 hasta 12), fase de engorde (desde el día 13 hasta 28) y fase de terminación (desde el día 29 hasta 35). Cada fase se formuló para cumplir o superar el requisito del animal y coincidir con las dietas comerciales habituales de los EE. UU. basadas en maíz-harina de soja para pollos de engorde. La composición dietética y de materiales de partida de estas dietas se facilita en la Tabla 8.2. Todas las dietas experimentales incluyeron fitasa (Ronozyme P, 250 FYT/kg) y no contuvieron ningún coccidiostato, NSPasa ni sustancia promotora del crecimiento. La comida y el agua estuvieron disponibles a voluntad durante todo el ensayo.

Tabla 8.1: Tratamientos experimentales

Tabla 8.2: Composición de las dietas basales experimentales

Se registraron el peso corporal vivo y el pienso al principio (d1) y al final del experimento (d35), por corral, para calcular el rendimiento:

Consumo de pienso (Fl) = (Pienso restante)d35 -(Pienso em itido)d1

Aum ento de peso corporal (BWG) = (Peso corporal vivo)d35 -(Peso corporal vivo)d1

Relación de conversión de pienso (FCR) = relación entre pienso consumido y aumento de peso

La mortalidad se registró diariamente y la FCR se ajustó en consecuencia.

Los datos (n = 40) se sometieron a un ANOVA, con diseño de bloques aleatorizado completo usando el procedimiento de ANOVA de XLSTAT (Addinsoft 1995-2014) para establecer diferencias entre dietas. El corral se consideró la unidad experimental. El modelo incluyó dietas (n=5) y bloque como efecto fijo. Los resultados se informan como medias por mínimos cuadrados. Se supuso que las medias LS eran diferentes a P < 0,05.

Se realizaron cálculos similares en el Ejemplo 9 y 10.

Se realizaron cálculos similares en el Ejemplo 3 y 4. Resultados experimentales

Los resultados obtenidos de parámetros de rendimiento para todo el periodo experimental se muestran en la Tabla 8.3.

Tabla 8.3: Efectos de la suplementación dietética de las cepas DSM 29870, DSM

29871 y DSM 29872 sobre el rendimiento de los pollos de engorde

1 Grupo alimentado con la dieta basa!.

2 Grupo suplementado con DSM 29870/29781/29872 alimentado con la dieta basal

que incluye la cepa DSM 29870/29781/29872 a 5.10e UFC/kg de pienso.

3 Grupo suplementado con GalliPro Max alimentado con la dieta basal que incluye

GalliPro Max a 8.108 UFC/kg de pienso.

4 Medias de 8 duplicados de 50 aves por corral para cada grupo. Los datos sin

procesar (n=24) se analizaron usando el análisis de la varianza con bloque (n=8) y

tratamientos (n=3) como efecto fijo.

ab-c Valores con diferentes superindices son significativamente (P<0,05) diferentes

entre sí.

Los aditivos para piensos no afectaron significativamente el consumo de pienso para animales con respecto al control. El peso corporal aumentó ligeramente usando las cepas NZB, mientras que GalliPro Max tendió a reducir este parámetro.

Las cepas DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 también mejoraron significativamente la relación de conversión de pienso en 1,6 %, 1,5 % y 1,9 %, respectivamente, sin diferencias significativas entre los grupos alimentados con las cepas NZB. GalliPro Max solo tuvo un ligero efecto y no significativo sobre la relación de conversión de pienso.

Ninguno de los probióticos probados aquí tuvo un efecto significativo sobre el nivel de mortalidad.

Ejemplo 9: Segundo ensayo de rendimiento con pollos de engorde (522)

Material y métodos

Se pesaron individualmente un total de 900 pollos de engorde macho de un día de edad Ross 708 (peso corporal 47,1 ± 1,1 g) y se asignaron a corral de suelo (15 aves/corral). Los corrales se usaron en un diseño factorial y completamente aleatorizado con 12 corrales por tratamiento (es decir, 180 animales/tratamiento). Los 5 tratamientos experimentales consistieron en (Tabla 9.1): T1, dietas basales de control negativo; T2, dietas basales que contenían la cepa DSM 29870 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T3, dietas basales que contenían la cepa DSM 29871 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T4 dietas basales que contenían la cepa DSM 29872 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T5, dieta basal que contenía un probiótico comercializado, GalliPro Max (incluido a la dosis comercial, 8.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35).

Las dietas basales consistieron en un programa de alimentación de 3 fases: fase de iniciación (desde el día 1 hasta 14), fase de engorde (desde el día 15 hasta 21) y fase de terminación (desde el día 22 hasta 35). Cada fase se formuló para cumplir o superar el requisito del animal y coincidir con las dietas comerciales habituales de los EE. UU. basadas en maíz-harina de soja para pollos de engorde. La composición dietética y de materiales de partida de estas dietas se facilita en la Tabla 9.2. Todas las dietas experimentales incluyeron premezclas de vitaminas y minerales, pero no contuvieron ningún coccidiostato, NSPasa, fitasa ni sustancia promotora del crecimiento. La comida y el agua estuvieron disponibles a voluntad durante todo el ensayo.

Tabla 9.1: Tratamientos experimentales

Tabla 9.2: Composición de las dietas basales experimentales

1La mezcla de vitaminas proporcionará lo siguiente (por kg de dieta): vitamina A, 13227513 UI; vitamina D3, 3968 254 UI; vitamina E, 66 138 UI; vitamina B12, 40 mg; biotina, 254 mg; menadiona, 3968 mg; tiamina, 3968 mg; riboflavina, 13228 mg; ácido d-pantoténico, 22046 mg; piridoxina, 7937 mg; niacina, 110229 mg; ácido fólico, 2 205 mg; premezcla de selenio: selenio, 600 ppm calcio, 36 %

2La mezcla de oligoelementos proporcionó lo siguiente (por kg de dieta): calcio, mín.: 15,7 % y máx.: 18,7%; manganeso (Mn), 6,0 %; cinc (Zn), 6,0 %; hierro (Fe), 4,0 %; cobre (Cu), 5000 ppm; yodo (I), 1250 ppm; cobalto (Co), 500 ppm

Resultados experimentales

Los resultados obtenidos de parámetros de rendimiento para todo el periodo experimental se muestran en la Tabla 9.3.

Tabla 9.3: Efectos de la suplementación dietética de las cepas DSM 29870, DSM

29871 y DSM 29872 sobre el rendimiento de los pollos de engorde

1 Grupo alimentado con la dieta basal.

2 Grupo suplementado con DSM 29870/29781/29872 alimentado con la dieta basal

que incluye la cepa DSM 29870/29781/29872 a 5.108 UFC/kg de pienso.

GalliPro Max a 8.10B UFC/kg de pienso.

4 Medias de 12 duplicados de 15 ai/es por corral para cada grupo. Los datos sin

procesar (n=36) se analizaron usando el análisis de la varianza con bloque (n=12) y

tratamientos (n=3) como efecto fijo.

a’bc Valores con diferentes superíndices son significativamente (P<0,05) diferentes

entre sí.

En este experimento también, la administración de las cepas DSM 29870, DSM 29871, DSM 29872 y GalliPro Max no redujo significativamente el consumo de pienso, pero mejoró el aumento de peso corporal en 2,3 %, 1,7 %, 2,6 % y 1,5 %, respectivamente. Por lo tanto, la diferencia con respecto al control fue significativa para DSM 29870 y DSM 29872.

Las cepas DSM 29870 y DSM 29872 mejoraron significativamente la relación de conversión de pienso en 3,6 % y 4,2 %, respectivamente. DSM 29871 y GalliPro Max también mejoraron (ligeramente para DSM 29871) la relación de conversión de pienso en este experimento, pero no significativamente.

La cepa DSM 29870 permitió una disminución del nivel de mortalidad en un modo numéricamente mayor que GalliPro Max.

Ejemplo 10: Tercer ensayo de rendimiento con pollos de engorde (051)

Material y métodos

Se pesaron individualmente un total de 1080 pollos de engorde macho de un día de edad Ross PM3 (peso corporal 42 ± 3,5 g) y se asignaron a corral de suelo (18 aves/ corral). Los corrales se usaron en un diseño factorial y completamente aleatorizado con 12 corrales por tratamiento (es decir, 216 animales/tratamiento). Los 3 tratamientos experimentales consistieron en (Tabla 10.1): T1, dietas basales de control negativo; T2, dietas basales que contenían la cepa DSM 29870 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T3, dietas basales que contenían la cepa DSM 29871 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T4 dietas basales que contenían la cepa DSM 29872 (incluida a 5.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35); T5, dieta basal que contenía un probiótico comercializado, GalliPro Max (incluido a la dosis comercial, 8.108 UFC/kg de pienso, de d1 a d35).

Las dietas basales consistieron en un programa de alimentación de 3 fases: fase de iniciación (desde el día 1 hasta 21) y fase de engorde (desde el día 22 hasta 35). Cada fase se formuló para cumplir o superar el requisito del animal y coincidir con las dietas comerciales habituales de los EE. UU. basadas en maíz-harina de soja para pollos de engorde. La composición dietética y de materiales de partida de estas dietas se facilita en la Tabla 10.2. Todas las dietas experimentales incluyeron premezclas de vitaminas y minerales, pero no contuvieron ningún coccidiostato, NSPasa, fitasa ni sustancia promotora del crecimiento. La comida y el agua estuvieron disponibles a voluntad durante todo el ensayo.

Tabla 10.1: Tratamientos experimentales

Tabla 10.2: Composición de las dietas basales experimentales

1La mezcla de vitaminas proporcionará lo siguiente (por kg de dieta): vitamina A, 12000 UI; vitamina D3, 3000 UI; vitamina E = 300 UI; vitamina K3, 3 mg; vitamina B, 2 mg; vitamina B2, 8 mg; vitamina B6, 3 mg; vitamina B12, 0,02 mg; ácido fólico, 1 mg; biotina, 0,2 mg; pantotenato de calcio, 15 mg; ácido nicotínico, 40 mg; manganeso (Mn), 80 mg; cinc (Zn), 60 mg; yodo (I), 1 mg, hierro (Fe), 80 mg; cobre (Cu), 15 mg; cobalto (Co), 0,4 mg; selenio (Se), 0,2 mg; magnesio (Mg), 5 mg; etoxiquina, 0,5 mg; BHA, 0,5 mg, ácido cítrico, 5 mg; ácido fosfórico, 5 mg.

Resultados experimentales

Los resultados obtenidos de parámetros de rendimiento para todo el periodo experimental se muestran en la Tabla 10.3.

Tabla 10.3: Efectos de ia suplementación dietética de las cepas DSM 29870, DSM

29871 y DSM 29872 sobre el rendimiento de los pollos de engorde

1 Grupo alimentado con la dieta basal.

2 Grupo suplementado con DSM 29870/29781/29872 alimentado con la dieta basal

que incluye la cepa DSM 29870/29781/29872 a 5.108 UFC/kg de pienso.

GalliPro Max a 8.108 UFC/kg de pienso.

4 Medias de 12 duplicados de 18 aves por corral para cada grupo. Los datos sin

tratamientos (n=3) como efecto fijo.

a-b-c Valores con diferentes superíndices son significativamente (P<0,05) diferentes

entre sí.

En este experimento, la administración de las cepas DSM 29870, DSM 29871, DSM 29872 (como GalliPro Max) no tuvo efecto significativo sobre el consumo de pienso, pero condujo a una mejora significativa del aumento de peso corporal en 6,5 %, 7,3 % y 5,2 %, respectivamente. GalliPro Max también mejoró el aumento de peso corporal (+4,2 %), pero no significativamente.

Todas las cepas de NZB mejoraron significativamente la relación de conversión de pienso en 4,0 %, 5,3 % y 4,8 % (DSM 29870, DSM 29871 y Ds M 29872, respectivamente) como GalliPro Max que alcanzó el 3,4 % de mejora. Con respecto al nivel de mortalidad, no hubo diferencias significativas entre los tratamientos.

EJEMPLO 11: Síntesis y metanálisis

Los resultados de los tres experimentos de rendimiento descritos anteriormente se resumen en la Tabla 11.1.

Tabla 11.1: Efectos de los estudios individuales

"A'; Valores con diferentes superíndices son significativamente (P<0,05) diferentes

entre sí.

En estos ensayos que tienen un diseño experimental similar, todos los datos obtenidos se reunieron y se combinaron en un metanálisis (después de haber sido probados para homogeneidad). Esta metanálisis implicó a 3.980 pollos de engorde en 160 duplicados (32 duplicados y 796 animales para cada grupo experimental). Los resultados se muestran en la Tabla 11.

Los datos (n = 160) se sometieron a un ANOVA de modelo mixto, usando el procedimiento GLlMMIX de SAS (SAS Institute, 2002-2012) para establecer diferencias entre dietas. El corral se consideró la unidad experimental. El modelo incluyó dietas (n=5) como efecto fijo y experimento (n=3) como efecto aleatorio. Los resultados se informan como medias por mínimos cuadrados. Se supuso que las medias LS eran diferentes a P < 0,05.

Tabla 11.2: Metanálisis de tres experimentos que muestran el efecto de la

suplementación dietética de la cepa DSM 29870. DSM 29871 v DSM 29872 sobre el

rendimiento de los pollos de engorde

1 Grupo alimentado con la dieta basal.

2 Grupo sup/ementado con DSM 29870/29781/29872 alimentado con la dieta basal

que incluye la cepa DSM 29870/29781/29872 a 5.108 UFC/kg de pienso.

GalliPro Max a 8.10B UFC/kg de pienso.

4 Medias de 32 observaciones para cada grupo experimental (796 animales/grupo).

abc Valores con diferentes superíndices son significativamente (P<0,05) diferentes

entre sí.

Este metanálisis mostró que el uso de la cepa DSM 29870, DSM 29871 o DSM 29872 en una dieta basada en maíz/harina de soja mejoró significativamente en promedio el aumento de peso corporal (+2,9 %, 2,6 % y 3,0 %, respectivamente) y la relación de conversión de pienso (-2,4 %, -2,2 % y -2,7 %, respectivamente) sin efecto sobre el consumo de pienso.

Conclusión

En los ejemplos de trabajo anteriores, se han demostrado efectos positivos de la cepa DSM 29870 sobre los rendimientos de los pollos de engorde (es decir, aumento de peso corporal y relación de conversión de pienso) alimentados con una dieta basada en maíz/harina de soja.

Todos los datos obtenidos de los experimentos descritos en los ejemplos anteriores también mostraron que el efecto de la cepa DSM 29870 sobre la relación de conversión de pienso es debido a su efecto sobre el peso corporal. Estos efectos se podrían asociar a un efecto sobre la salud o mejora del metabolismo.

La cepa DSM 29870 mostró efectos positivos y significativos sobre el aumento de peso corporal y la relación de conversión de pienso en el 66 % y 100 % de los ejemplos de trabajo anteriores, respectivamente.

GalliPro Max no mostró efecto significativo sobre el aumento de peso corporal en ninguno de los ejemplos de trabajo anteriores y mostró un efecto significativo y positivo sobre la relación de conversión de pienso en un tercio de los experimentos.

En los experimentos descritos en los ejemplos anteriores, se ha demostrado el mejor efecto de la cepa DSM 29870 en comparación con GalliPro Max sobre el rendimiento de pollos de engorde. El efecto observado usando DSM 29870 fue en promedio dos veces el observado para GalliPro Max.

Ejemplo 12: Determinación de la compatibilidad con monensina

Se determinó la compatibilidad con monensina de cepas de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 usando una microdilución de caldo modificado similar al método descrito en el Ejemplo 5. Brevemente, se inoculó una única colonia de Bacillus spp. (de placas de agar de soja tríptico durante la noche) en caldo de Mueller Hinton (MHB) y se cultivó durante la noche. Se inoculó medio estéril con el cultivo durante la noche y se dejó que creciera durante 4 horas para probar las bacterias en la fase de crecimiento logarítmico. Entonces se diluyeron los cultivos una vez más 1:200 en MHB recién preparado y se añadió 90 ql de este caldo inoculado a la monensina diluida a las concentraciones indicadas. Las cepas del estado de la técnica también se probaron para comparación: NN019785, NN062266 (NRRL B-50013), NN062267 (NRRL B-50104), NN062278 (PTA-6507), NN062319 (FERM BP-1096), NN062440, NN062441 (DSM 17236), NN062439.

Cepas:

Bacillus amyloliquefaciens DSM 29869

Bacillus subtilis DSM 29870

Bacillus subtilis DSM 29871

Bacillus amyloliquefaciens DSM 29872

Bacillus licheniformis NN019785

Bacillus amyloliquefaciens NN062266 (NRRL B-50013)

Bacillus subtilis NN062267 (NRRL B-50104)

Bacillus subtilis NN062278 (PTA-6507)

Bacillus amyloliquefaciens NN062319 (FERM BP-1096)

Bacillus subtilis NN062440

Bacillus licheniformis NN062441 (DSM 17236)

Bacillus amyloliquefaciens NN062439

Materiales:

Sal sódica de monensina (Sigma, CAS N.° 22373-78-0, solubilizada en 96 % de etanol)

Caldo de Mueller Hinton (Becton, Dickinson and Company, 275730)

Agar de soja tríptico (Becton, Dickinson and Company, 236920)

Placas de microtitulación: placa Costar, polipropileno, fondo plano, Corning, 3628

Tubos de vidrio de borosilicato: Kimbale, 16 x 125 mm, 73500-16125

Juntas adhesivas permeables a los gases: Thermo Scientific, AB-0718

Preparación de bacterias:

Se cultivó Bacillus spp. durante la noche en placa de agar de soja tríptica (40 g/l) a 37 °C. Se disolvió caldo de Mueller Hinton (21 g/l) en agua y se esterilizó en autoclave en tubos de vidrio que contenían 5 ml de caldo cada uno. Se inoculó una única colonia de Bacillus spp. (de placas durante la noche) en caldo de Mueller Hinton (MHB) y se incubó durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. Entonces se inoculó un tubo de vidrio de 5 ml de medio estéril recién preparado con 25 ml de cultivo durante la noche y se dejó que creciera durante 4 horas a 37 °C. Entonces se diluyeron los cultivos una vez más 1:200 en MHB recién preparado. Entonces se añadieron 90 ql de este caldo inoculado al antibiótico diluido a las concentraciones indicadas.

Preparación de placas de ensayo:

Se diluyó monensina en etanol al 96 % a una concentración de 800 qg/ml. Esta disolución se diluyó entonces 10 veces en tampón fosfato estéril hasta una concentración de 80 qg/ml. Se preparó una serie de dilución doble en MHB hasta la concentración 2,5 qg/ml. Se pipetearon 10 ql de cada dilución y de cada antibiótico en una placa de microtitulación. Después, cuando los antibióticos se mezclaron con la suspensión de bacterias, las muestras se diluyeron 10x (muestra de 10 ql en un volumen total de 100 ql). Esto produjo el intervalo de prueba final de 0,25-8 qg/ml.

Se añadieron 90 μl de las suspensiones bacterianas a las placas de ensayo. Las placas de ensayo se cubrieron entonces con una junta adhesiva permeable al vidrio y se incubaron durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. La concentración compatible máxima se determinó similar a un análisis de MIC como la concentración por encima de la cual se inhibió el 80 % de las bacterias que se detectaron a simple vista.

Resultados:

Un posible problema de administrar Bacillus spp. en el pienso es el uso común de antibióticos como promotores del crecimiento en el pienso. Por lo tanto, es necesario determinar la compatibilidad de las cepas con los antibióticos comúnmente usados en los piensos para identificar cualquier posible conflicto con el uso como microbiano de alimentación directa. Por lo tanto, se determinó la compatibilidad con la monensina de las cepas de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 junto con las cepas del estado de la técnica. Las cepas de Bacillus DSM 29869, DSM 29870, DSM 29871 y DSM 29872 indicaron un mayor nivel de compatibilidad con la monensina que la mayoría de las cepas del estado de la técnica incluidas en el presente documento: NN019785, NN062266 (NRRL B-50013), NN062267 (NRRL B-50104), NN062278 (PTA-6507), NN062319 (FERM BP-1096), NN062440, NN062441 (DSM 17236), NN062439.

Tabla 12.1: Resultados de compatibilidad con monensina

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de Bacillus para su uso en la mejora de uno o más parámetros de rendimiento de un animal seleccionados del grupo que consiste en: mejorar la relación de conversión de pienso, mejorar el aumento de peso corporal, mejorar el factor de eficiencia europea de producción, mejorar la eficiencia del pienso y mejorar la salud, por ejemplo, de aves de corral, tales como pollos;

en donde la cepa de Bacillus tiene una elevada compatibilidad con monensina;

en donde la cepa de Bacillus es no hemolítica; y

en donde la cepa de Bacillus se caracteriza por:

i) tener el número de acceso al depósito DSM 29870;

ii) tener el número de acceso al depósito DSM 29869;

iii) tener el número de acceso al depósito DSM 29871; o

iv) tener el número de acceso al depósito DSM 29872.

2. La cepa de Bacillus para su uso según la reivindicación 1, en donde la cepa de Bacillus tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens.

3. La cepa de Bacillus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la cepa de Bacillus mejora el aumento de peso corporal y/o la velocidad de conversión del pienso en pollos alimentados con la cepa de Bacillus.

4. La cepa de Bacillus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la cepa de Bacillus es una cepa de Bacillus subtilis o una cepa de Bacillus amyloliquefaciens.

5. La cepa de Bacillus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la cepa de Bacillus tiene efecto antimicrobiano contra E. coli.

6. La cepa de Bacillus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la cepa de Bacillus es una cepa aislada de Bacillus.

7. La cepa de Bacillus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la cepa de Bacillus está en forma de un cultivo biológicamente puro de dicha cepa de Bacillus.

8. La cepa de Bacillus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde las esporas de Bacillus están presentes como esporas secadas en una composición.

9. La cepa de Bacillus para su uso según la reivindicación 8, en donde la cifra bacteriana de cada espora de Bacillus de la composición es entre 1x104 y 1x1018 UFC/kg de composición, preferentemente entre 1x106 y 1x10145 UFC/kg de composición, y más preferentemente entre 1x107 y 1X1011 UFC/kg de la composición.

10. La cepa de Bacillus para su uso según las reivindicaciones 8 o 9, en donde la composición comprende además un vehículo.

11. La cepa de Bacillus para su uso según la reivindicación 10, en donde el vehículo comprende uno o más de los siguientes compuestos: agua, glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol o 1,3-propilenglicol, silicato de sodio y aluminio, cloruro sódico, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, tiosulfato de sodio, carbonato cálcico, citrato de sodio, dextrina, maltodextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, harina de trigo, salvado de trigo, harina de gluten de maíz, almidón, farigel, núcleos de yuca, silicato de sodio y aluminio, sílice amorfa coloidal, Sipernat 50S, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, carbopol y celulosa.

12. La cepa de Bacillus para su uso según la reivindicación 10 o 11, en donde el vehículo comprende carbonato cálcico.

13. La cepa de Bacillus para su uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la cepa de Bacillus se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Bacillus DSM 29869, DSM 29871 y DSM 29872.

14. Una cepa de Bacillus para su uso en un método de alimentación de un animal que comprende administrar una cepa de Bacillus o una composición que comprende esporas de una cepa de Bacillus a dicho animal, opcionalmente junto con otros ingredientes de pienso para animales,

en donde la cepa de Bacillus se caracteriza por:

i) tener el número de acceso al depósito DSM 29870;

ii) tener el número de acceso al depósito DSM 29869;

iii) tener el número de acceso al depósito DSM 29871; o

iv) tener el número de acceso al depósito DSM 29872.

15. La cepa de Bacillus para su uso según la reivindicación 14, en donde el animal se selecciona del grupo que consiste en aves de corral y cerdos.