CN107567493A - 改进生产动物的健康和性能的芽孢杆菌属菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改进生产动物的健康和性能的芽孢杆菌属菌株。本发明进一步涉及包含这些芽孢杆菌属菌株的组合物。

Description

改进生产动物的健康和性能的芽孢杆菌属菌株
对生物材料保藏的参考
本申请包含对生物材料保藏的参考，该保藏通过引用结合在此。
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
对序列表的索引：
SEQ ID NO:1是DSM 29869的16S rDNA。
SEQ ID NO:2是DSM 29870的16S rDNA。
SEQ ID NO:3是DSM 29871的16S rDNA。
SEQ ID NO:4是DSM 29872的16S rDNA。
SEQ ID NO:5是来自AB021198的死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)的16SrDNA。
SEQ ID NO:6是来自AJ276351的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的16S rDNA。
SEQ ID NO:7是来自AB255669的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的16S rDNA。
SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:13：PCR和测序引物。
发明背景
发明领域
本发明涉及改进生产动物的健康和性能的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。本发明进一步涉及包含芽孢杆菌属菌株的组合物。
发明背景
产气荚膜梭菌(C.perfringens)是革兰氏阳性的、杆状的、厌氧的、产孢子的梭菌属(Clostridium)细菌。产气荚膜梭菌在自然界中广泛存在，并可以作为腐烂的植被、海洋沉积物、人类和其他脊椎动物的肠道、昆虫和土壤的组分被发现。
由产气荚膜梭菌引起的感染显示组织坏死、菌血症、气肿性胆囊炎和气性坏疽(其也称为梭菌性坏死)的证据。产气荚膜梭菌也可以导致多种厌氧的微生物的感染。
在停止使用抗生素生长促进剂的国家，在家禽中产气荚膜梭菌相关的坏死性肠炎的发病率有所增加。坏死性肠炎是肠毒血症疾病，其在家禽产业中引起重大的经济损失。
需要开发用于预防和控制单胃动物(如家禽)中产气荚膜梭菌的工具和策略。虽然已经建议对动物进行疫苗接种，但是对数千只动物进行疫苗接种存在挑战。因此，发现可以在动物饲料中作为添加剂给予的溶液将是有利的。
因此，本发明的目标是通过使用包含一种或多种针对产气荚膜梭菌具有活性的细菌的动物饲料来提供在单胃动物(如家禽)中预防和/或控制产气荚膜梭菌的溶液。
本发明的另一个目标是提供对动物健康不存在风险的溶液。这个问题的解决办法是使用针对产气荚膜梭菌具有活性的非溶血的芽孢杆菌属菌株。
在饲料中投递芽孢杆菌属物种的挑战是在饲料中抗生素作为生长促进剂的普遍使用。因此，有必要确定菌株与常用的饲料抗生素(如莫能菌素)的相容性，以便鉴定与用作直接饲喂的微生物的任何潜在冲突。在一个实施例中，本发明涉及与莫能菌素具有高相容性的芽孢杆菌属菌株。
相关领域说明
Knap等人(2010)描述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)在肉鸡中对坏死性肠炎有作用(Knap,Lund,Kehlet,Hofacre,and Mathis；Bacillus licheniformisPrevents Necrotic Enteritis in Broiler Chickens；Avian Diseases 54(2):931-935.2010[Knap、Lund、Kehlet、Hofacre和Mathis，地衣芽孢杆菌预防肉鸡坏死性肠炎；禽类疾病，54(2):931-935，2010])。如在实例2中证明的这种地衣芽孢杆菌菌株在体外对产气荚膜梭菌没有作用。
Clostat(别名芽孢杆菌PB6)描述在WO 2007/064741中。芽孢杆菌PB6对产气荚膜梭菌具有拮抗作用。芽孢杆菌PB6如实例1中所述是溶血的。
发明内容
令人惊讶地发现，将来自芽孢杆菌属物种的直接饲喂的微生物(DFM)添加到动物饲料中可以用于预防和/或控制单胃动物(如猪)和/或家禽中产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎。这些芽孢杆菌属物种也可以改进体重增加和/或饲料转化率(例如，在产气荚膜梭菌激发和无激发的肉鸡中)。
在第一方面，本发明涉及芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的肉鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
在第二方面，本发明涉及芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素。
在第三方面，本发明涉及芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的肉鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
在第四方面，本发明涉及芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性，并且任选地
iii)该芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
本发明进一步涉及具有保藏登录号DSM 29869的菌株；具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
本发明进一步涉及具有保藏登录号DSM 29870的菌株；具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
本发明进一步涉及具有保藏登录号DSM 29871的菌株；具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
本发明进一步涉及具有保藏登录号DSM 29872的菌株；以及具有芽孢杆菌DSM29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
本发明也涉及组合物，这些组合物包含一种或多种根据本发明的改进生产动物的健康和性能的芽孢杆菌属菌株。
在优选的实施例中，本发明涉及例如包含载体和芽孢杆菌属菌株的组合物，其中：
i.该芽孢杆菌属菌株选自下组，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号DSM 29869的菌株；具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株，
具有保藏登录号DSM 29870的菌株；具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株，
具有保藏登录号DSM 29871的菌株；具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株，
具有保藏登录号DSM 29872的菌株；和具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株，以及
ii.该芽孢杆菌属菌株具有针对产气荚膜梭菌(如产气荚膜梭菌菌株23或48[Gholamiandekhordi AR,Ducatelle R,Heyndrickx M,Haesebrouck F,Van ImmerseelF.2006.Molecular and phenotypical characterization of Clostridium perfringensisolates from poultry flocks with different diseasestatus.Vet.Microbiol.113:143-152][Gholamiandekhordi AR、Ducatelle R、Heyndrickx M、Haesebrouck F、VanImmerseel F，2006，从具有不同疾病状态的家禽集群分离的产气荚膜梭菌的分子和表型特征，兽医微生物，113:143-152]和/或大肠杆菌(如ATCC10536或ATCC25922)的抗微生物活性。
在优选的实施例中，芽孢杆菌属菌株与莫能菌素具有高相容性，例如实例12中确定的与至少2.4μg/ml莫能菌素相容。
附图简要说明
图1 16S rDNA序列的比对。比对了SEQ ID NO:1(DSM 29869)、SEQ ID NO:2(DSM29870)、SEQ ID NO:3(DSM 29871)、SEQ ID NO:4(DSM 29872)、SEQ ID NO:5(死谷芽孢杆菌AB021198)、SEQ ID NO:6(来自AJ276351的枯草芽孢杆菌)和SEQ ID NO:7(解淀粉芽孢杆菌AB255669)。覆盖位置481-1200的区域在图1中未示出(在此区域中所有序列都相同)。
定义
通常，在此所用的术语和短语具有其本领域公认的含义，可以通过参考本领域技术人员已知的标准文本、期刊参考文献和上下文来发现。所提供的以下定义用来明确它们在披露背景下的特定用途。
如在此所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。
针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性：术语“针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性”意指产气荚膜梭菌的生长被抑制和/或一些或所有的产气荚膜梭菌被杀死。这可以通过在实例2中描述的测定确定。
体重增加：动物的体重增加是经特定的时间段动物体重的增加。确定体重增加的实例在实例8中给出。
组合物：术语“组合物”是指包含载体和至少一种如在此描述的细菌菌株的组合物。可以将在此所述的组合物与一种或多种动物饲料混合，并且可以将其称为“粉状饲料”。
控制产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎：术语“控制产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎”意指部分地或完全地抑制动物中产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎的方法和/或组合物。因此，术语“控制产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎”意指减少或者完全地消除或预防产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎。
直接饲喂的微生物：术语“直接饲喂的微生物”意指当以足够量给予时在宿主中赋予益处例如改进消化或健康的包括孢子的活的微生物。
在需氧条件下的酶活性：术语“在需氧条件下的酶活性”意指由芽孢杆菌属菌株在需氧条件下生长期间提供的酶活性，如在实例6中描述的。
在厌氧条件下的酶活性：术语“在厌氧条件下的酶活性”意指由芽孢杆菌属菌株在厌氧条件下生长期间提供的酶活性，如在实例6中描述的。
欧洲生产效率因子(EPEF)：欧洲生产效率因子是比较集群的活禽性能的方式。这个单一数字有助于比较农场内和农场之间的性能，并且可以用于评估环境、气候以及管理的变量。EPEF如以下进行计算：[(存活率(％)x活重(kg))/(放血时的年龄(天)x FCR)]x100，其中存活率是在屠宰时活的禽类的百分比，活重是在屠宰时禽类的平均重量，放血时的年龄是在屠宰时禽类的年龄，并且FCR是在屠宰时的饲料转化率。
饲喂：术语“饲喂”意指任何类型的口服给予如经由动物饲料或经由饮用水给予。
FCR(饲料转化率)：FCR是动物将饲料质量转化为所希望的产量增加的效率的量度。肉用动物-如猪、家禽和鱼类-产量是动物获得的质量。具体来说，FCR是在整个指定的时间内食用的食物的质量除以产量。可以如实例8中所述确定FCR。FCR的改进意指FCR值的减小。2％的FCR改进意指FCR减少了2％。
分离的：术语“分离的”意指如在此所述的一种或多种细菌菌株是处于自然界中不存在的形式或环境中，即该一种或多种细菌菌株至少部分地从与其自然相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除。
非溶血的：溶血反应是红细胞分解。将菌落在血液琼脂上生长时诱导溶血的能力用于将细菌菌株分类为溶血的和非溶血的菌株。在此背景下，如在EFSA杂志，2011；9(11):2445中描述的，使用枯草芽孢杆菌168(BGSC-1A1，芽孢杆菌属基因储存中心(BacillusGenetic Stock Center))作为阴性对照来定义溶血反应。使用在实例1中描述的测定可以将芽孢杆菌属菌株分类为非溶血的。
家禽：术语“家禽”意指针对它们所生产的蛋和/或它们的肉和/或它们的羽毛，由人类饲养的驯养禽类。家禽包括肉仔鸡和蛋鸡。家禽包括鸡雁小纲(Galloanserae)总目(禽)的成员，尤其是鸡形目(Galliformes)(其包括鸡、珍珠鸡、鹌鹑和火鸡)和雁鸭科(Anatidae)，在雁鸭目(Anseriformes)中，通常称为“水禽”并且包括家鸭和家鹅。家禽还包括为了它们的肉而被杀的其他禽类，如乳鸽。家禽的实例包括鸡(包括蛋鸡、肉仔鸡和雏鸡)、鸭、鹅、鸽子、火鸡和鹌鹑。
预防产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎：术语“预防产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎”意指预防动物中产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎的发展的方法和/或组合物。
对抗生素敏感：术语“对抗生素敏感”意指在细菌菌株原本生长的条件下所述细菌菌株的生长被抑制的细菌菌株的表型性质。在此背景下，对抗生素敏感在CLSI指导方针之下进行测定(M07-A9Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria That Grow Aerobically[M07-A9用于对需氧生长细菌的稀释抗微生物剂敏感性测试的方法]；2012)。将金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 29213用作参比菌株，其意指该菌株应该被包括在此测试中，并且结果仅在金黄色葡萄球菌ATCC 29213显示符合CLSI指导方针的分界点的情况下才有效(参见实例5表5.5)(M100-S24Performance Standards forAntimicrobial Susceptibility Testing[M100-S24抗微生物剂敏感性测试的性能标准]；补充信息，2014)。如果在EFSA杂志，2012；10(6):2740中规定的适当抗生素的分界点浓度或低于该浓度下检测到生长，则认为芽孢杆菌属的菌株是敏感的。
孢子：术语“孢子”和“内生孢子”是可互换的并且具有本领域的技术人员熟知和理解的其一般含义。如在此所使用的，术语孢子是指处于其休眠、受保护状态的微生物。
稳定的：“稳定的”是本领域已知的术语，并且在优选的方面，稳定的是旨在说明微生物直至其被给予动物以改善动物健康时保持其孢子形式的能力。
猪：术语“猪(swine或pig)”意指由人类因为食物(如其肉)饲养的驯养猪。猪包括猪属(Sus)的成员，如野猪(Sus scrofa domesticus)或家猪(Sus domesticus)，并包括小猪、生长猪和母猪。
发明详细说明
令人惊讶地发现，将来自芽孢杆菌属物种的直接饲喂的微生物(DFM)添加到动物饲料中可以用于预防和/或控制单胃动物(如猪)和/或家禽中产气荚膜梭菌感染和/或坏死性肠炎，并同时改进体重增加和/或饲料转化率(例如，在产气荚膜梭菌激发和无激发的肉鸡中)。
本发明的芽孢杆菌属菌株
本发明涉及关于芽孢杆菌属菌株的以下方面：
第1方面：一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的肉鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
第2方面：一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素。
第3方面：一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的肉鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
第4方面：一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性，并且任选地
iii)该芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
在优选的实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌与莫能菌素具有高相容性，与如实例12中确定的至少2.3μg/ml莫能菌素相容。甚至更优选的，芽孢杆菌属菌株与如实例12中确定的至少2.4μg/ml莫能菌素(如实例12中确定的至少2.5μg/ml莫能菌素、如实例12中确定的至少2.6μg/ml莫能菌素、或者如实例12中确定的至少2.7μg/ml莫能菌素)相容。
对万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素的敏感性例如可以如实例5中描述的确定。
在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性例如可以如实例6中描述的确定，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
在一个实施例中，根据第1、2或3方面的芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
在一个实施例中，根据第2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株改进家禽中选自下组的一种或多种性能参数，该组由以下各项组成：饲喂了芽孢杆菌属菌株的肉鸡中的体重增加、欧洲生产效率因子和饲料转化率。
在一个实施例中，根据第3方面的芽孢杆菌属菌株具有对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性例如可以如实例2中描述的确定。
在一个实施例中，根据第1或4方面的芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素。
在一个实施例中，对于第1、2、3或4方面的饲料转化率(FCR)的改进导致-2.5％或少于-2.5％，如少于-2.6％、如少于-2.7％、如少于-2.8％、如少于-2.9％、如少于-3.0％的FCR。在优选的实施例中，FCR的改进导致从-5％至-2％的FCR，如从-4％至-2％的FCR、如从-3.5％至-2.5％的FCR。在具体的实施例中，对于第1、2、3或4方面的FCR的改进导致在选自下组的区间内的FCR，该组由以下各项组成：从-5％至-4.5％、从-4.5％至-4％、从-4％至-3.8％、从-3.8％中-3.6％、从-3.6％至-3.4％、从-3.4％至-3.2％、从-3.2至-3.0％、从-3.0％至-2.8％以及从-2.8至-2.5％，或者这些区间的任何组合。FCR可以如实例8中描述的确定。
在一个实施例中，对于第1、2、3或4方面的体重增加的改进导致体重增加至少0.5％，如至少0.8％、如至少1.5％、如至少1.8％、如至少2.0％、如至少2.3％、如至少3.5％、如至少4.2％、如至少5.2％、如至少6.5％、如至少7.3％。在优选的实施例中，对于第1、2、3或4方面的体重增加的改进导致选自下组的体重增加，该组由以下各项组成：从1.8％至2.0％、从2.0％至2.2％、从2.2％至2.4％、从2.4％至2.6％、从2.6％至2.8％、从2.8％至3.0％、从3.0％至3.2％、从3.2％至3.4％、从3.4％至3.6％、从3.6％至3.8％、从3.8％至4.0％、从4％至5％、从5％至7％、从7％至10％，或其任何组合。体重增加可以如实例8中描述的确定。
在一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:1具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％、如超过99.5％)的序列同一性的16S rDNA。
在一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:2具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％)的序列同一性的16S rDNA。
在一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:3具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％)的序列同一性的16S rDNA。
在一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:4具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％)的序列同一性的16S rDNA。
在一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌菌株、解淀粉芽孢杆菌菌株或地衣芽孢杆菌菌株。
在一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株具有针对大肠杆菌的抗微生物作用。针对大肠杆菌的作用例如可以如实例4中描述的确定。
在一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM29869的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在另一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29870的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在又另一个实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM29871的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在另外的实施例中，根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29872的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。
在一个实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29869的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株。在另一个实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29870的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株。在另一个实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29871的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株。在另外的实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29872的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
本发明也涉及根据第1、2、3或4方面的芽孢杆菌属菌株的生物学纯的培养物。在另外的实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29869的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株的生物学纯的培养物。在另外的实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29870的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株的生物学纯的培养物。在另外的实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29871的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株的生物学纯的培养物。在另外的实施例中，本发明涉及具有保藏登录号DSM 29872的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株的生物学纯的培养物。
本发明也涉及根据第1、2、3或4方面的分离的芽孢杆菌属菌株。在另外的实施例中，本发明也涉及具有保藏登录号DSM 29869的分离的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的分离的菌株。在另外的实施例中，本发明也涉及具有保藏登录号DSM 29870的分离的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的分离的菌株。在另外的实施例中，本发明也涉及具有保藏登录号DSM29871的分离的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的分离的菌株。在另外的实施例中，本发明也涉及具有保藏登录号DSM 29872的分离的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的分离的菌株。
本发明的组合物
本发明涉及包含根据本发明的一种或多种芽孢杆菌属菌株的孢子的组合物。
更具体地，本发明涉及关于包含芽孢杆菌属菌株的组合物的以下方面：
第5方面：一种包含芽孢杆菌属菌株的孢子的组合物，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
第6方面：一种包含芽孢杆菌属菌株的孢子的组合物，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素。
第7方面：一种包含芽孢杆菌属菌株的孢子的组合物，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
第8方面：一种包含芽孢杆菌属菌株的孢子的组合物，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性，并且任选地
iii)该芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
在优选的实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的一种或多种芽孢杆菌属菌株与莫能菌素具有高相容性，与如实例12中确定的至少2.3μg/ml莫能菌素相容。甚至更优选的，芽孢杆菌属菌株与如实例12中确定的至少2.4μg/ml莫能菌素相容(如实例12中确定的至少2.5μg/ml莫能菌素、如实例12中确定的至少2.6μg/ml莫能菌素、或者如实例12中确定的至少2.7μg/ml莫能菌素)。
对万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素的敏感性例如可以如实例5中描述的确定。
在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性例如可以如实例6中描述的确定，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
在一个实施例中，根据第5、6、或7方面的组合物的芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧条件具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
在一个实施例中，根据第6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株改进家禽中选自下组的一种或多种性能参数，该组由以下各项组成：饲喂了芽孢杆菌属菌株的鸡中的体重增加、欧洲生产效率因子和饲料转化率。
在一个实施例中，根据第8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。对产气荚膜梭菌的抗微生物活性例如可以如实例2中描述的确定。
在一个实施例中，根据第5或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素。
在一个实施例中，对于第5、6、7或8方面的饲料转化率(FCR)的改进导致-2.5％或少于-2.5％，如少于-2.6％、如少于-2.7％、如少于-2.8％、如少于-2.9％、如少于-3.0％的FCR。在优选的实施例中，FCR的改进导致从-5％至-2％的FCR，如从-4％至-2％的FCR、如从-3.5％至-2.5％的FCR。在具体的实施例中，对于第1、2、3或4方面的FCR的改进导致在选自下组的区间内的FCR，该组由以下各项组成：从-5％至-4.5％、从-4.5％至-4％、从-4％至-3.8％、从-3.8％中-3.6％、从-3.6％至-3.4％、从-3.4％至-3.2％、从-3.2至-3.0％、从-3.0％至-2.8％以及从-2.8至-2.5％，或者这些区间的任何组合。FCR可以如实例8中描述的确定。
在一个实施例中，对于第5、6、7或8方面的体重增加的改进导致体重增加至少0.5％，如至少0.8％、如至少1.5％、如至少1.8％、如至少2.0％、如至少2.3％、如至少3.5％、如至少4.2％、如至少5.2％、如至少6.5％、如至少7.3％。在优选的实施例中，对于第1、2、3或4方面的体重增加的改进导致选自下组的体重增加，该组由以下各项组成：从1.8％至2.0％、从2.0％至2.2％、从2.2％至2.4％、从2.4％至2.6％、从2.6％至2.8％、从2.8％至3.0％、从3.0％至3.2％、从3.2％至3.4％、从3.4％至3.6％、从3.6％至3.8％、从3.8％至4.0％、从4％至5％、从5％至7％、从7％至10％，或其任何组合。体重增加可以如实例8中描述的确定。
在一个实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株包含与SEQ IDNO:1具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％)的序列同一性、和/或与SEQID NO:2具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％)的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:3具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％)的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:4具有超过98％(如超过98.5％、如超过99％、如超过99.5％)的序列同一性的16S rDNA。
在一个实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌菌株、或解淀粉芽孢杆菌菌株。
在一个实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株具有针对大肠杆菌的抗微生物作用。针对大肠杆菌的作用例如可以如实例4中描述的确定。
在一个实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29869的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在另一个实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29870的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在又另一个实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29871的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在另外的实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物的芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29872的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。
在一个实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含具有保藏登录号DSM29869的芽孢杆菌、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株。在另一个实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含具有保藏登录号DSM 29870的芽孢杆菌、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株。在另一个实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含具有保藏登录号DSM 29871的芽孢杆菌、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株。在另外的实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含具有保藏登录号DSM 29872的芽孢杆菌、或者具有芽孢杆菌DSM29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
在第5、6、7或8方面的一个实施例中，该组合物的芽孢杆菌孢子以干孢子(如喷雾干燥的孢子)存在。在第5、6、7或8方面的一个实施例中，该组合物的芽孢杆菌孢子以稳定的孢子存在。根据第5、6、7或8方面的组合物也可以是液体组合物和/或包含培养基上清液，该培养基上清液包含本发明的一种或多种芽孢杆菌属菌株。
在第5、6、7或8方面的一个实施例中，该组合物进一步包含载体。该载体可以包含以下化合物中的一种或多种：水、甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、麦芽糖糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、小麦粉、麦麸、玉米蛋白粉、淀粉、纤维素、farigel、木薯芯、硅酸铝钠、胶态无定形二氧化硅、Sipernat 50S、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000和卡波姆(carbopol)。
在第5、6、7或8方面的优选的实施例中，该组合物进一步包含碳酸钙和硅酸铝钠。
在第5、6、7或8方面的优选的实施例中，该组合物进一步包含碳酸钙、硅酸铝钠和蔗糖。
在第5、6、7或8方面的另一个优选的实施例中，该组合物进一步包含一种或多种载体，如一种或多种选自下组的载体，该组由以下各项组成：碳酸钙、硫酸钠、淀粉、farigel和木薯芯。
在第5、6、7或8方面的另一个优选的实施例中，该组合物进一步包含一种或多种流动性试剂如硅酸铝钠和/或胶态无定形二氧化硅(例如，Sipernat 50S)。
在第5、6、7或8方面的另一个优选的实施例中，该组合物进一步包含一种或多种粘合剂，如选自下组的一种或多种粘合剂，该组由以下各项组成：蔗糖、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、糊精、麦芽糖糊精和卡波姆。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29869、碳酸钙和硅酸铝钠。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29869、碳酸钙、硅酸铝钠和蔗糖。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29869和一种或多种载体，如选自下组的一种或多种载体，该组由以下各项组成：碳酸钙、硫酸钠、淀粉、farigel和木薯芯。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29869和一种或多种流动性试剂如硅酸铝钠和/或胶态无定形氧化硅(例如，Sipernat 50S)。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29869和一种或多种粘合剂，如选自下组的一种或多种粘合剂，该组由以下各项组成：蔗糖、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、糊精、麦芽糖糊精和卡波姆。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29870、碳酸钙和硅酸铝钠。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29870、碳酸钙、硅酸铝钠和蔗糖。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29870和一种或多种载体，如选自下组的一种或多种载体，该组由以下各项组成：碳酸钙、硫酸钠、淀粉、farigel和木薯芯。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29870和一种或多种流动性试剂如硅酸铝钠和/或胶态无定形氧化硅(例如，Sipernat 50S)。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29870和一种或多种粘合剂，如选自下组的一种或多种粘合剂，该组由以下各项组成：蔗糖、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、糊精、麦芽糖糊精和卡波姆。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29871、碳酸钙和硅酸铝钠。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29871、碳酸钙、硅酸铝钠和蔗糖。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29871和一种或多种载体，如选自下组的一种或多种载体，该组由以下各项组成：碳酸钙、硫酸钠、淀粉、farigel和木薯芯。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29871和一种或多种流动性试剂如硅酸铝钠和/或胶态无定形二氧化硅(例如，Sipernat 50S)。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29871和一种或多种粘合剂，如选自下组的一种或多种粘合剂，该组由以下各项组成：蔗糖、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、糊精、麦芽糖糊精和卡波姆。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29872、碳酸钙和硅酸铝钠。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29872、碳酸钙、硅酸铝钠和蔗糖。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌属DSM 29872和一种或多种载体，如选自下组的一种或多种载体，该组由以下各项组成：碳酸钙、硫酸钠、淀粉、farigel和木薯芯。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29872和一种或多种流动性试剂如硅酸铝钠和/或胶态无定形二氧化硅(例如，Sipernat 50S)。
在优选的实施例中，该组合物包含芽孢杆菌DSM 29872和一种或多种粘合剂，如选自下组的一种或多种粘合剂，该组由以下各项组成：蔗糖、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、糊精、麦芽糖糊精和卡波姆。
在一个实施例中，该组合物包含一种或多种抗球虫药，其中该组合物是例如预混合料。
在优选的实施例中，根据第5、6、7或8方面的组合物包含从105CFU/g至1018CFU/g的分离的芽孢杆菌孢子。
在另外的实施例中，根据本发明的组合物包含一种或多种细菌菌株，如以上菌株的至少两种以及多达包括下组的所有菌株，该组由以下各项组成：DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872。
在根据任何前述实施例所述的实施例中，芽孢杆菌孢子例如在24小时之后杀死/抑制至少40％(如至少45％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％)的产气荚膜梭菌，例如，如在实例2中描述的确定的。
在本发明的另一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种另外的微生物。在本发明的另一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种酶。在本发明的另一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种维生素。在本发明的另一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种矿物质。在本发明的另一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种氨基酸。在本发明的另一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种另外的饲料成分。
在根据任何前述实施例所述的实施例中，当饲喂所述动物时该组合物也改进单胃动物的健康。在根据任何前述实施例所述的另一个实施例中，当饲喂所述家禽时该组合物也增加家禽的产蛋量。在根据任何前述实施例所述的实施例中，当饲喂所述动物时该组合物增加单胃动物的产肉量。
在优选的实施例中，该组合物包含在此描述的一种或多种细菌菌株，其中每种细菌菌株的细菌计数是在1x 104CFU/kg和1x 1018CFU/kg的组合物之间，优选地在1x 107CFU/kg和1x 1016CFU/kg的组合物之间，更优选地在1x1010CFU/kg和1x 1015CFU/kg的组合物之间，并且最优选地在1x 1011CFU/kg和1x 1014CFU/kg的组合物之间。
在优选的实施例中，在组合物中每种细菌菌株的细菌计数是在1x 104CFU/kg的干物质和1x 1018CFU/kg的干物质之间，优选地在1x 107CFU/kg的干物质和1x 1016CFU/kg的干物质之间，更优选地在1x 1010CFU/kg的干物质和1x 1015CFU/kg的干物质之间，并且最优选地在1x 1011CFU/kg的干物质和1x 1014CFU/kg的干物质之间。在更优选的实施例中，在动物饲料中每种细菌菌株的细菌计数是在1x 108CFU/kg的干物质和1x 1010CFU/kg的干物质之间。
在优选的实施例中，该组合物具有的每种芽孢杆菌孢子的细菌计数是在1x103CFU/动物/天和1x 1013CFU/动物/天之间，优选地在1x 105CFU/动物/天和1x 1011CFU/动物/天之间，更优选地在1x 106CFU/动物/天和1x 1010CFU/动物/天之间，并且最优选地在1x107CFU/动物/天和1x 109CFU/动物/天之间。
在本发明的仍另一个实施例中，该一种或多种细菌菌株以孢子(如稳定的孢子)形式存在于组合物中。在本发明的仍另外的实施例中，该稳定的孢子将在单胃动物的肠和/或胃中萌发。
在一个实施例中，当使一种或多种细菌菌株经受在用于丸粒化的挤出过程期间所施加的/产生的压力时，该一种或多种细菌菌株是稳定的。在一个具体实施例中，该一种或多种细菌菌株在从1巴至40巴范围的压力下是稳定的，具体的是10巴至40巴，更具体的是15巴至40巴，甚至更具体的是20巴至40巴，仍甚至更具体的是35巴至37巴，甚至仍更具体的是36巴。
在一个具体实施例中，该一种或多种细菌菌株在高温下是稳定的。具体而言，当使细菌菌株经受在用于丸粒化的挤出过程期间所产生的温度时，这些细菌菌株是稳定的。在一个甚至更具体的实施例中，该一种或多种细菌菌株在从80℃至120℃范围的温度下是稳定的，具体的是从90℃至120℃范围的温度，甚至更具体的是从95℃至120℃范围的温度。
在另一个方面，本发明涉及包含载体和一种或多种细菌培养物的组合物，该细菌培养物具有与选自下组的菌株基本上相同的特征，该组由以下各项组成：
具有保藏登录号DSM 29869的菌株；
具有保藏登录号DSM 29870的菌株；
具有保藏登录号DSM 29871的菌株；以及
具有保藏登录号DSM 29872的菌株；或
其任何组合。
在一个实施例中，该组合物包含载体和具有保藏登录号DSM 29869的菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
在一个实施例中，该组合物包含载体和具有保藏登录号DSM 29870的菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
在一个实施例中，该组合物包含载体和具有保藏登录号DSM 29871的菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
在一个实施例中，该组合物包含载体和具有保藏登录号DSM 29872的菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
在一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种另外的微生物。在具体的实施例中，该组合物进一步包含来自以下属的一种或多种的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸菌属(Propionibacterium)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属和巨型球菌属(Megasphaera)或其任何组合。
在具体的实施例中，该组合物进一步包含来自以下菌株的一种或多种的细菌：解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)或其任何组合。
在具体的实施例中，该组合物进一步包含一种或多种类型的酵母菌。该一种或多种类型的酵母菌可以选自下组，该组由以下各项组成：酵母菌科(Saccharomycetaceae)、酵母菌属(Saccharomyces)(如酿酒酵母(S.cerevisiae)和/或布拉酵母菌(S.boulardii))、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)(如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、假丝酵母属(Candida)(如产朊假丝酵母(C.utilis)，也称为圆酵母属(Torula)酵母)、毕赤酵母属(毕赤酵母属)(如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))、有孢圆酵母属(Torulaspora)(如戴尔凯氏有孢圆酵母(T.delbrueckii))、法夫酵母属(Phaffia)酵母和担子菌门(Basidiomycota)。
在根据任何前述实施例所述的实施例中，该组合物进一步包含载体。该载体可以包含以下化合物中的一种或多种：水、甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、麦芽糖糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、小麦粉、麦麸、玉米蛋白粉、淀粉、纤维素、farigel、木薯芯、硅酸铝钠、胶态无定形二氧化硅、Sipernat 50S、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000和卡波姆。
在另一个实施例中，在此描述的组合物可以任选地包括一种或多种酶。酶可在来自NC-IUBMB，1992的手册酶命名法(Enzyme Nomenclature)的基础上分类，还可以在以下网址参见ENZYME网站：http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息仓库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committeeof the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，IUB-MB)，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为所述酶提供了EC(酶委员会)编号(Bairoch，The ENZYME database[ENZYME数据库]，2000，Nucleic Acids Res[核酸研究]28:304-305)。该IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性并且偶尔也会基于他们的分子机制；此种分类并不反映这些酶的结构特征。
在给予氨基酸序列相似性的家族中，某些糖苷水解酶的另一种分类，例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、右旋糖酐酶和α-半乳糖苷酶，在几年前已经提出了。它们目前分为90个不同的家族：参见CAZy(ModO)因特网网站(Coutinho,P.M.和Henrissat,B.(1999)碳水化合物活性酶服务器，在URL：http://afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html上(相应的论文：Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach[Coutinho、P.M.和Henrissat，B.(1999)碳水化合物活性酶：综合数据库方法]，在“Recent Advances inCarbohydrate Bioengineering”,H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat and B.Svenssoneds.,The Royal Society of Chemistry,Cambridge,pp.3-12[碳水化合物生物工程的最新进展，H.J.Gilbert、G.Davies、B.Henrissat和B.Svensson编辑，剑桥皇家化学学会，第3-12页]；Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)The modular structure of cellulases andother carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach[Coutinho,P.M.和Henrissat,B.(1999)纤维素酶和其他碳水化合物活性酶的模块结构：综合数据库方法]，在“Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation”.,K.Ohmiya,K.Hayashi,K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita and T.Kimura eds.,Uni Publishers Co.,Tokyo,pp.15-23[纤维素降解的遗传学、生物化学和生态学，K.Ohmiya、K.Hayashi、K.Sakka、Y.Kobayashi、S.Karita和T.Kimura编辑，东京大学出版有限公司，第15-23页])。
因此，本发明的组合物还可以包含选自下组的至少一种其他的酶，该组由以下各项组成： 植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26) ； 木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶如，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或其任何混合物。
在一个具体实施例中， 本发明的组合物包括植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26) 。可商购的植酸酶的实例包括Bio-FeedTM植酸酶(诺维信(Novozymes)) 、P和HiPhosTM(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))、NatuphosTM(巴斯夫公司(BASF))、和Blue(AB酶公司(AB Enzymes))、Xp(范恩尼姆/杜邦公司 (Verenium/DuPont))和PHY(杜邦公司 (DuPont)) 。其他优选的植酸酶包括描述于， 例如， WO 98/28408、 WO 00/43503、 和WO03/066847中的那些。
在一个具体实施例中， 本发明的组合物包括木聚糖酶(EC 3.2.1.8) 。可商购的木聚糖酶的实例包括WX和G2(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、XT和Barley(AB维斯塔公司(ABVista) ) 、(范恩尼姆公司 (Verenium) )和XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，杜邦公司(DuPont))。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包括蛋白酶(EC 3.4) 。可商购的蛋白酶的实例包括ProAct(帝斯曼营养产品公司 (DSM Nutritional Products))。
制造
可将本发明的组合物制成例如糊状组合物(非丸粒状)或丸粒状组合物。可以作为固体或液体配制品添加细菌培养物和可任选的酶。例如，对于糊状组合物，在成分混合步骤前或期间可添加固体或液体培养物配制品。典型地，一种液体培养物制剂包括本发明的培养物，任选地和多元醇，例如甘油、乙二醇或丙二醇，并且是在丸粒化步骤后添加，例如通过将该液体配制品喷洒至丸粒上。
该酶可以作为颗粒添加至组合物，该组合物被任选地丸粒化或挤出。该颗粒典型地包括核心颗粒和一种或多种包衣，该包衣典型地是盐和/或蜡质包衣。核心颗粒可以是任选地与盐(例如有机的或无机的锌盐或钙盐)一起的活性化合物的均匀共混物，或是具有施加至其上的活性化合物的惰性颗粒。活性化合物是任选地与一种或多种酶组合的本发明的培养物。惰性颗粒可以是水溶的或水不溶的，例如淀粉、糖(例如蔗糖或乳糖)、或盐(例如NaCl、Na2SO4)。盐包衣典型地是至少1μm厚并且可以是一种具体的盐或多种盐的混合物，例如Na2SO4、K2SO4、MgSO4和/或柠檬酸钠。其他实例是在例如WO 2008/017659、WO 2006/034710、WO 97/05245、WO 98/54980、WO 98/55599、WO 00/70034中描述的那些，或是例如在WO 01/00042中描述的聚合物包衣。
优选实施例
在下文的两组项目中描述了本发明的优选实施例。
项目组I：
1.一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
2.一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性并且
iii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素。
3.一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素并且
iii)该芽孢杆菌属菌株在饲喂了芽孢杆菌属菌株的鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
4.一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)该芽孢杆菌属菌株是非溶血的，
ii)该芽孢杆菌属菌株针对产气荚膜梭菌具有抗微生物活性，并且任选地
iii)该芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖。
5.根据项目1至3中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖(例如，如实例6中描述的确定)。
6.根据项目2至4中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株改进家禽中选自以下列表的一种或多种性能参数，该列表由以下各项组成：在饲喂芽孢杆菌属菌株的家禽中的体重增加、欧洲生产效率因子和饲料转化率。
7.根据项目3所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性(例如，如实例2中描述的确定)。
8.根据项目1至4中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素(例如，如实例5中描述的确定)。
9.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:1具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:2具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:3具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:4具有超过98％的序列同一性的16S rDNA。
10.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌菌株或解淀粉芽孢杆菌菌株。
11.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株具有针对大肠杆菌的抗微生物作用(例如，如实例4中描述的确定)。
12.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29869的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。
13.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29870的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。
14.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29871的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。
15.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是具有保藏登录号DSM 29872的芽孢杆菌属菌株、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株，该菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。
16.一种具有保藏登录号DSM 29869的芽孢杆菌、或者一种具有芽孢杆菌DSM29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
17.一种具有保藏登录号DSM 29870的芽孢杆菌、或者一种具有芽孢杆菌DSM29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
18.一种具有保藏登录号DSM 29871的芽孢杆菌、或者一种具有芽孢杆菌DSM29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
19.一种具有保藏登录号DSM 29872的芽孢杆菌、或者一种具有芽孢杆菌DSM29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
20.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株与莫能菌素具有高相容性，与如实例12中确定的至少2.3μg/ml莫能菌素(如实例12中确定的，如至少2.4μg/ml莫能菌素、如至少2.5μg/ml莫能菌素、如至少2.6μg/ml莫能菌素或如至少2.7μg/ml莫能菌素)相容。
21.一种组合物，该组合物包含根据项目1-20中任一项所述的芽孢杆菌属菌株的孢子。
22.根据项目21所述的组合物，其中该组合物的芽孢杆菌孢子以干孢子存在。
23.根据项目21至22中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含载体。
24.根据项目23所述的组合物，其中该载体包含以下化合物中的一种或多种：水、甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、硅酸铝钠、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、麦芽糖糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、小麦粉、麦麸、玉米蛋白粉、淀粉、farigel、木薯芯、硅酸铝钠、胶态无定形二氧化硅、Sipernat 50S、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、卡波姆和纤维素。
25.根据项目21至24中任一项所述的组合物，其中该组合物包含从105CFU/g至1018CFU/g的分离的芽孢杆菌孢子。
26.根据项目21至25中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下各项组成：
一种或多种酶；
一种或多种另外的微生物；
一种或多种维生素；
一种或多种矿物质；
一种或多种氨基酸；以及
一种或多种其他饲料成分。
27.根据项目21至26中任一项所述的组合物，其中每种芽孢杆菌孢子的细菌计数是在1x 104CFU/kg和1x 1018CFU/kg的组合物之间，优选地在1x 107CFU/kg和1x 1016CFU/kg的组合物之间，更优选地在1x 1010CFU/kg和1x 1015CFU/kg的组合物之间，并且最优选地在1x 1011CFU/kg和1x 1014CFU/kg的组合物之间。
28.根据项目21至26中任一项所述的组合物，其中每种芽孢杆菌孢子的细菌计数是在1x 104CFU/kg和1x 1018CFU/kg的组合物之间，优选地在1x 106CFU/kg和1x 1015CFU/kg的组合物之间，更优选地在1x 107CFU/kg和1x 1011CFU/kg的组合物之间。
29.根据项目1至20中任一项所述的芽孢杆菌属菌株的生物学纯的培养物。
30.根据项目1至20中任一项所述的分离的芽孢杆菌属菌株。
31.一种选自下组的分离的芽孢杆菌属菌株，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872，或者具有芽孢杆菌DSM 29869、DSM29870、DSM 29871和DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
32.根据项目31所述的分离的芽孢杆菌属菌株，其中该鉴别特征可以是选自下组的一种或多种(如所有)特征，该组由以下各项组成
i)非溶血的，例如如实例1确定的，
ii)针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性，例如如实例2确定的，
iii)针对大肠杆菌的抗微生物活性，例如如实例4确定的，
iv)对万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素敏感，以及
v)与莫能菌素具有高相容性，与如实例12描述的至少2.3μg/ml莫能菌素(如实例12确定的，如至少2.4μg/ml莫能菌素、如至少2.5μg/ml莫能菌素、如至少2.6μg/ml莫能菌素或如至少2.7μg/ml莫能菌素)相容。
项目组II：
1.一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)具有保藏登录号DSM 29870、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株；
ii)具有保藏登录号DSM 29869、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株；
iii)具有保藏登录号DSM 29871、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株；或者
iv)具有保藏登录号DSM 29872、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
2.根据项目1所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是非溶血的。
3.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性(例如，如实例2中描述的确定)。
4.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株在饲喂芽孢杆菌属菌株的鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
5.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:1具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:2具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:3具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:4具有超过98％的序列同一性的16S rDNA。
6.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:1具有超过99％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:2具有超过99％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:3具有超过99％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:4具有超过99％的序列同一性的16S rDNA。
7.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌菌株或解淀粉芽孢杆菌菌株。
8.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株具有针对大肠杆菌的抗微生物作用(例如，如实例4中描述的确定)。
9.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是分离的芽孢杆菌属菌株。
10.根据项目1至9中任一项所述的芽孢杆菌属菌株的生物学纯的培养物。
11.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株对至少七种，如选自下组的八种抗生素敏感，该组由以下各项组成：万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素(例如，如实例5中描述的确定)。
12.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株在需氧和/或厌氧的条件下具有水解一种或多种选自下组的底物的酶活性，该组由以下各项组成：直链淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、酪蛋白和木聚糖(例如，如实例6中描述的确定)。
13.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株改进家禽中选自以下列表的一种或多种性能参数，该列表由以下各项组成：饲喂芽孢杆菌属菌株的家禽中体重增加、欧洲生产效率因子和饲料转化率。
14.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株与莫能菌素具有高相容性，与如实例12中确定的至少2.3μg/ml莫能菌素(如实例12中确定的，如至少2.4μg/ml莫能菌素、如至少2.5μg/ml莫能菌素、如至少2.6μg/ml莫能菌素或如至少2.7μg/ml莫能菌素)相容。
15.一种组合物，该组合物包含根据项目1-14中任一项所述的芽孢杆菌属菌株的孢子。
16.根据项目15所述的组合物，其中该组合物的芽孢杆菌孢子以孢子(如干孢子(如喷雾干燥的孢子))存在。
17.根据项目16所述的组合物，其中每种芽孢杆菌孢子的细菌计数是在1x104CFU/kg和1x 1018CFU/kg的组合物之间，优选地在1x 106CFU/kg和1x1015CFU/kg的组合物之间，更优选地在1x 107CFU/kg和1x 1011CFU/kg的组合物之间。
18.根据项目15至17中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含载体。
19.根据项目18所述的组合物，其中该载体包含以下化合物中的一种或多种：水、甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、硅酸铝钠、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、麦芽糖糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、小麦粉、麦麸、玉米蛋白粉、淀粉、farigel、木薯芯、硅酸铝钠、胶态无定形二氧化硅、Sipernat 50S、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、卡波姆和纤维素。
20.根据项目18或19所述的组合物，其中该载体包含碳酸钙。
21.根据项目15至20中任一项所述的组合物，其中该组合物包含从105CFU/g至1018CFU/g的分离的芽孢杆菌孢子。
22.根据项目15至21中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下各项组成：
一种或多种酶；
一种或多种另外的微生物；
一种或多种维生素；
一种或多种矿物质；
一种或多种氨基酸；以及
一种或多种其他饲料成分。
23.根据项目15至22中任一项所述的组合物，其中每种芽孢杆菌孢子的细菌计数是在1x 104CFU/kg和1x 1018CFU/kg的组合物之间，优选地在1x 107CFU/kg和1x 1016CFU/kg的组合物之间，更优选地在1x 1010CFU/kg和1x 1015CFU/kg的组合物之间，并且最优选地在1x 1011CFU/kg和1x 1014CFU/kg的组合物之间。
24.根据项目15至23中任一项所述的组合物，其中每种芽孢杆菌孢子的细菌计数是在1x 104CFU/kg和1x 1018CFU/kg的组合物之间，优选地在1x 106CFU/kg和1x 1015CFU/kg的组合物之间，更优选地在1x 107CFU/kg和1x 1011CFU/kg的组合物之间。
25.一种选自下组的分离的芽孢杆菌属菌株，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872，或者具有芽孢杆菌DSM 29869、DSM29870、DSM 29871和DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
26.根据项目25所述的分离的芽孢杆菌属菌株，其中该鉴别特征可以是选自下组的一种或多种(如所有)特征，该组由以下各项组成
i)非溶血的，例如如实例1确定的，
ii)针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性，例如如实例2确定的，
iii)针对大肠杆菌的抗微生物活性，例如如实例4确定的，
iv)对万古霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素和四环素敏感，以及
v)与莫能菌素具有高相容性，与如实例12描述的至少2.3μg/ml莫能菌素(如实例12确定的，如至少2.4μg/ml莫能菌素、如至少2.5μg/ml莫能菌素、如至少2.6μg/ml莫能菌素或如至少2.7μg/ml莫能菌素)相容。
27.根据项目25或26所述的分离的芽孢杆菌属菌株，用于治疗坏死性肠炎和/或产气荚膜梭菌感染的用途。
28.一种选自下组的分离的芽孢杆菌属菌株，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29871和DSM 29872，或者具有芽孢杆菌DSM 29869、DSM 29871和DSM29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株，用于治疗坏死性肠炎和/或产气荚膜梭菌感染的用途。
29.根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株或组合物改进动物(例如家禽，如鸡)的选自下组的一种或多种性能参数的用途，该组由以下各项组成：改进饲料转化率、改进体重增加、改进欧洲生产效率因子、改进饲料效率和改进健康。
30.根据项目29所述的用途，其中该芽孢杆菌属菌株选自下组，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29871和DSM 29872，或者具有芽孢杆菌DSM 29869、DSM29871和DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
31.一种改进动物的选自下组的一种或多种性能参数的方法，该组由以下各项组成：改进饲料转化率、改进体重增加、改进欧洲生产效率因子、改进饲料效率和改进健康，该方法包括向动物给予如先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株或组合物。
32.根据项目31所述的方法，其中该芽孢杆菌属菌株选自下组，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29871和DSM 29872，或者具有芽孢杆菌DSM 29869、DSM29871和DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
33.一种饲养动物的方法，该方法包括向所述动物给予根据先前项目中任一项所述的芽孢杆菌属菌株或组合物，任选地结合其他动物饲料组分。
34.用于饲养根据项目33所述的动物的方法，其中该动物选自下组，该组由以下各项组成：家禽和猪。
实例
实例1：筛选溶血阴性芽孢杆菌属菌株
根据用于animal nutrition,EFSA Journal 2011；9(11):2445[动物营养，EFSA杂志，2011；9(11):2445]中对芽孢杆菌属物种的产毒素潜力评估的技术指导，测试溶血反应。
购买即可使用的羊血琼脂板(贝迪公司(Becton Dickinson)产品号254053或254087)。可替代地，通过添加5％去纤维蛋白的羊血(获得自丹麦国家血清研究所(StatensSerum Institute,Denmark))至TS-琼脂(Oxoid CM 131)上制备琼脂板。在倾倒进板前立即添加血液之前，应该将琼脂在121℃下高压蒸汽处理20分钟并冷却至约40℃。
将芽孢杆菌属菌株从在-80℃保存中取出并在TS-琼脂板上划线，将该TS-琼脂板在30℃下孵育过夜或直至生长出现。使用来自单菌落尽可能少的材料在1/4的琼脂板上划线。将该板在30℃下孵育72小时。将待测试的芽孢杆菌属菌株的溶血/清除区与阳性和阴性对照进行比较。使用枯草芽孢杆菌ATCC21332作为阳性对照。使用枯草芽孢杆菌168(BGSC-1A1、芽孢杆菌属基因储存中心(Bacillus Genetic Stock Center))作为阴性对照。
在筛选的599株中，223株芽孢杆菌菌株(37％)的独立的分离物是溶血阴性的。在另一个筛选中，65株芽孢杆菌中的21株(32％)的独立的分离物是溶血阴性的。两种筛选仅包括基于16S rDNA测序鉴定的菌株，这些菌株属于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌或这四种物种的近亲属。
因此，非溶血的芽孢杆菌菌株在自然界似乎是普遍和相当丰富的，但仅包含少数天然菌株。非溶血的菌株在地衣芽孢杆菌中似乎更丰富，而大多数解淀粉芽孢杆菌菌株出现溶血。测试所有非溶血菌株对产气荚膜梭菌的生长抑制。来自筛选的以下菌株均为溶血阴性，并且在这些中选择用于进一步研究：DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872。Clostat(芽孢杆菌PB6)被确定是溶血的。
实例2：确定对产气荚膜梭菌的生长抑制
在35℃、静态厌氧条件下，在补充有0.6％酵母提取物(BD公司型号212750)的大豆胰蛋白酶肉汤(BD公司型号211822)中生长过夜，测试所有非溶血的菌株抑制产气荚膜梭菌菌株23和48(都是netB阳性的)的生长[Gholamiandekhordi et al.,2006,Molecular andphenotypical characterization of Clostridium perfringens isolates frompoultry flocks with different diseasestatus,Vet.Microbiol.113:143-152][Gholamiandekhordi等人，2006，从具有不同疾病状态的家禽集群分离产气荚膜梭菌的分子和表型特征，兽医微生物，113:143-152]。在40℃下，将250μL的产气荚膜梭菌的过夜培养物添加至补充有0.6％酵母提取物的250mL的大豆胰蛋白酶琼脂中，并倾倒进矩形皮氏板(Nunc公司型号267060)中。允许接种的琼脂在室温下冷却，在冷却之后，在琼脂中制作8mm直径的孔。在没有氧气的情况下储存这些板直到使用。
在35℃、需氧条件下，芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871或DSM29872在大豆胰蛋白酶肉汤中生长过夜。收集1000μL的芽孢杆菌培养物，并通过离心分离成无细胞的上清液和细胞。将20μL无细胞上清液或在磷酸盐缓冲盐水中100x稀释的细胞直接添加至产气荚膜梭菌接种的琼脂板上的孔中。对照孔含有20μL的磷酸盐缓冲盐水。在35℃、厌氧条件下，将这些板孵育18小时。
通过感兴趣的孔周围的圆形清除区注意到对产气荚膜梭菌菌株的抑制。基于孔周围缺乏清除区，磷酸盐缓冲盐水孔被认为是阴性对照。
无细胞的上清液和芽孢杆菌菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的100x稀释的细胞能够在体外一致地抑制产气荚膜梭菌菌株23和48的生长。对于上清液和细胞，竞争菌株“CloSTAT”也观察到抑制，但是竞争菌株GalliproTect观察不到。“CloSTAT”是解淀粉芽孢杆菌的菌株，该菌株从商业DFM产品CloSTAT(凯明公司(Kemin))中分离。“GalliproTect”是地衣芽孢杆菌的菌株，该菌株从商业产品Gallipro Tect(科汉森公司(Chr Hansen))中分离。
实例3：生物材料的鉴定、表征和保藏
以下生物材料按布达佩斯条约的条款保藏于莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心，Inhoffenstraβe 7B，不伦瑞克38124，德国(Leibniz-Institut DSMZ-DeutscheSammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig Germany)，并给出以下登录号：
表3.1：生物材料保藏
鉴定 登录号 保藏日期
解淀粉芽孢杆菌 DSM 29869 2015年1月12日
枯草芽孢杆菌 DSM 29870 2015年1月12日
枯草芽孢杆菌 DSM 29871 2015年1月12日
解淀粉芽孢杆菌 DSM 29872 2015年1月12日
这些菌株于以下条件保藏：确保在本专利申请的未决期间，由国外专利法决定对其授权的人可获得该培养物。保藏物代表了被保藏菌株的基本上纯的培养物。按提交本申请的对应物或其子代的一些国家的国外专利法要求可获得保藏物。然而，应当理解的是，保藏物的获得并不构成对以侵犯由政府行为所授予的专利权的方式实施本发明的许可。
16S rDNA基因的测序
使用QiaAmp DNA Blood Mini Kit(凯杰公司(Qiagen)产品号51106)，从DSM29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的培养物中提取DNA。按照推荐使用该试剂盒用于从革兰氏阳性细菌中提取DNA。
通过混合：引物16S F和16S R各自10pmol、核苷酸各自0.2mM、2.5单位的Amplitaq、1x Ampli taq缓冲液、5μl DNA模板，并且通过使用以下PCR程序：在珀金埃尔默(Perkin Elmer)PCR机器上，94℃2min(94℃30s、52℃30S、72℃1min)x 35、72℃10min，在50μl的总体积中扩增16S rDNA。使用诺维信(Novozymes)DNA测序设备，使用引物530R、357F、1390R和1100F对PCR产物进行测序。
表3.2：引物：
引物 序列 SEQ ID NO
16S-F 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ SEQ ID NO:8
16S-R 5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ SEQ ID NO:9
794-R 5’-ATCTAATCCTGTTTGCTCCCC-3’ SEQ ID NO:10
357-F 5’-TACGGGAGGCAGCAG-3’ SEQ ID NO:11
1390-R 5’-CGGTGTGTRCAAGGCCC-3’ SEQ ID NO:12
1000-F 5’-CAACGAGCGCAACCCT’， SEQ ID NO:13
引物1390-R的变性：R是A或G。来自DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的16S rDNA序列在序列表中分别显示为SEQ ID NO:1-4。通过BLAST对EMBL数据库分析来自DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的16S rDNA序列，并显示与枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)和与解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4)的16SrDNA序列的同一性。
为了研究SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:4的系统发育的从属关系，使用SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:7作为基准通过在MegAlign(DNASTAR)中的ClustalW比对来分析这些序列。这些序列是来自AB021198(SEQ ID NO:5)的死谷芽孢杆菌、来自AJ276351(SEQ ID NO:6)的枯草芽孢杆菌和来自AB255669(SEQ ID NO:7)的解淀粉芽孢杆菌的模式菌株的参比16S rDNA序列。
SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7(图1)的ClustalW比对显示7个核苷酸位置，其中2个或更多个序列具有偏离其他的核苷酸。对于编号，使用SEQ ID NO:6中的位置。在位置152处，SEQ ID NO:2与解淀粉芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌相同，但不同于彼此相同的其余部分。在位置174处，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4与解淀粉芽孢杆菌相同，但不同于彼此相同的其余部分。在位置257处，SEQ ID NO:4与解淀粉芽孢杆菌相同，但不同于彼此相同的其余部分。在位置437、444和455处，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3与枯草芽孢杆菌相同，但不同于彼此相同的其余部分。在位置1223处，SEQ ID NO:1与解淀粉芽孢杆菌相同，但不同于彼此相同的其余部分。16S rDNA基因的变异支持BLAST报告中看到的物种从属关系。
生物材料的描述
由诺维信(Novozymes)(诺和诺德公司(Novo Nordisk))从1990年在牙买加收集的环境样品中分离解淀粉芽孢杆菌DSM 29869。基于16S rDNA序列，该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
由诺维信(诺和诺德公司)从1990年在牙买加收集的环境样品中分离枯草芽孢杆菌DSM 29870。基于16S rDNA序列，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。
由丹麦高中生在Gymnasium从2008年丹麦私人土地样品中为诺维信分离枯草芽孢杆菌DSM 29871。基于16S rDNA序列，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。
从2008年美国环境样品中分离解淀粉芽孢杆菌DSM 29872。基于16S rDNA序列，该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
实例4：确定对大肠杆菌的生长抑制
在35℃、静态厌氧条件下，大肠杆菌菌株ATCC10536或ATCC25922在补充有0.6％酵母提取物(BD公司型号212750)的大豆胰蛋白酶肉汤(BD公司型号211822)中生长过夜。在40℃下，将100μL的大肠杆菌的过夜培养物添加至补充有0.6％酵母提取物的250mL的大豆胰蛋白酶琼脂中，并倾倒进矩形皮氏板(Nunc公司型号267060)中。然后，允许接种的琼脂在室温下冷却，在冷却之后，在琼脂中制作8mm直径的孔。
在35℃、需氧条件下，芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871或DSM29872在大豆胰蛋白酶肉汤中生长过夜。收集1000μL的枯草芽孢杆菌培养物，并通过离心分离成无细胞的上清液和细胞。将20μL无细胞上清液或在磷酸盐缓冲盐水中的100x稀释的细胞直接添加至大肠杆菌接种的琼脂板上的孔中。对照孔含有20μL的磷酸盐缓冲盐水。在30℃、需氧条件下，将这些板孵育18小时。
通过感兴趣的孔周围的圆形清除区注意到对大肠杆菌菌株的抑制。基于孔周围缺乏清除区，磷酸盐缓冲盐水孔被认为是阴性对照。
无细胞的上清液和芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM29872的100x稀释的细胞能够在体外一致地抑制大肠杆菌菌株ATCC10535和ATCC25922的生长。对于上清液和细胞，竞争菌株CloSTAT也观察到抑制。
实例5：对抗生素的敏感性
基本上如在CLSI指南(M07-A9Methods for Dilution AntimicrobialSusceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically[M07-A9用于对需氧生长细菌的稀释抗微生物剂敏感性测试的方法]；2012)中描述的，使用肉汤微量稀释确定八种抗生素针对芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的最小抑制浓度(MIC)。仅有的修改是改变体积；将90μl具有细菌的Mueller Hinton肉汤2添加至10μl抗生素稀释液中，细菌的cfu和抗生素的浓度发生了变化，因此最终浓度和最终cfu符合该指南。将这些板孵育20-24h而不是16-20h。将CLSI标准中推荐的对照菌株金黄色葡萄球菌ATCC 29213用作对照菌株。
菌株：
解淀粉芽孢杆菌DSM 29869
枯草芽孢杆菌DSM 29870
枯草芽孢杆菌DSM 29871
解淀粉芽孢杆菌DSM 29872
金黄色葡萄球菌ATCC 29213
抗生素：
氯霉素(西格玛(Sigma)C1919，10mg/ml，溶解于96％乙醇中)
克林霉素(西格玛(Sigma)PHR1159，10mg/ml，溶解于水中)
红霉素(ABBOTICIN来自Amdipharm 40501，50mg/ml，溶解于96％乙醇中)
庆大霉素(Biomedicals公司，190057，10mg/ml，溶解于水中)
卡那霉素(西格玛(Sigma)，CAS号25389-94-0，50mg/ml，溶解于水中)
链霉素(西格玛(Sigma)，S1277，10mg/ml，溶解于水中)
四环素(西格玛(Sigma)，T3383，10mg/ml，溶解于水中)
万古霉素(西格玛(Sigma)，V-8138，10mg/ml，溶解于水中)
Mueller Hinton肉汤2(西格玛(Sigma)/Fluka 90922)
0.9％NaCl(西格玛(Sigma)/RdH 31434/默克(Merck)106404)
胰蛋白胨大豆琼脂板(Oxoid CM 131)
微量滴定板：Costar板、聚丙烯、圆底、康宁(Corning)3879
细菌的制备：
在37℃下，将少数芽孢杆菌的菌落(<1日龄)接种至Mueller Hinton肉汤2(MHB)上并孵育大约4小时。测量OD600(分光光度计(BioPhotometer plus)，艾本德公司(Eppendorf))并在MHB中调节至0.25(相当于McFarland 0.5)。对于对照菌株，使用直接菌落悬浮液。将少数金黄色葡萄球菌ATCC 29213的菌落(<1日龄)悬浮在MHB中，并测量OD600(分光光度计(BioPhotometer plus)，艾本德公司(Eppendorf))，并在MHB中调节至0.10-0.12(相当于McFarland 0.5)。将细菌悬浮液在MHB中稀释200x。
测定板的制备：
在MHB中将抗生素稀释至640μg/mL的浓度。在MHB中制备两倍稀释系列下降至浓度为0.625μg/ml。将10μl的每种稀释液和10μl的每种抗生素移液到微量滴定板中。之后，当将抗生素与细菌悬浮液混合时，将样品稀释10x(10μL样品在100μl总体积中)。这导致0.06-64μg/ml的最终测试范围。
如果这些板不是立即使用，将这些板在-20℃下在冷冻库中储存直至使用。
将90μl的细菌悬浮液添加至测定板中。将这些测定板在具有湿布的塑料袋中在37℃下孵育20-24h。MIC被确定为通过肉眼检测的完全抑制细菌生长的抗生素的最低浓度。
CFU估计：
将在0.9％NaCl中的10倍稀释系列制成10-3的接种至微量滴定板中的培养物。将来自该10-3稀释液中的2x 100ul涂板在两个TSA板上。将这些板在37℃下孵育过夜。计算CFU的数量/ml。
对枯草芽孢杆菌DSM 29871、解淀粉芽孢杆菌DSM 29869和枯草芽孢杆菌DSM29870(MIC 1-3)进行三次生物学重复的测定，同时对解淀粉芽孢杆菌DSM 29872(MIC 2-5)进行四次生物学重复的测定。
结果：
枯草芽孢杆菌DSM 29870获得的MIC值显示，分界点值等于或低于EFSA指南(EFSA杂志，2012；10(6):2740)中给出的分界点值。对于枯草芽孢杆菌DSM 29869，在三个生物学重复中的两个中获得的MIC值显示等于或低于分界点的MIC值。在MIC 1中，对于四环素的值是16。然而，由于方法的分析方差，高于分界点的一个稀释度的MIC结果通常被接受，并且该菌株可以被认为是敏感的。因此，根据EFSA，这两种菌株被认为对测试中包含的所有8种抗生素敏感(表5.2和5.3)。
对于枯草芽孢杆菌DSM 29871和解淀粉芽孢杆菌DSM 29872菌株，MIC值显示这两种菌株对八种抗生素中的七种敏感(表5.1和5.4)。对链霉素观察到增加的耐受性，并且根据EFSA，菌株被分类为耐链霉素。
金黄色葡萄球菌ATCC 29213作为对照进行平行测试，并且其MIC值在CLSI标准(M100-S24Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing[M100-S24抗微生物剂敏感性测试的性能标准]；补充信息，2014)中给出的范围内(表5.5)。
测量接种到测定板中的细菌的量(CFU/ml)。通常，该CFU/ml非常接近目标值5*105CFU/ml。然而，芽孢杆菌属菌株的CFU/ml可以与一些不确定性有关，因为细菌倾向于聚集并且一旦聚集将仅导致一个菌落形成单位(表5.1和5.2)。
表5.1：枯草芽孢杆菌DSM 29871的MIC结果
*EFSA杂志，2012；10(6):2740
n.r.未登记
表5.2：解淀粉芽孢杆菌DSM 29869的MIC结果
*EFSA杂志，2012；10(6):2740
表5.3：枯草芽孢杆菌DSM 29870的MIC结果
*EFSA杂志，2012；10(6):2740
表5.4：解淀粉芽孢杆菌DSM 29872的MIC结果
*EFSA杂志，2012；10(6):2740
表5.5：金黄色葡萄球菌ATCC 29213的MIC结果
*M100-S24Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting[M100-S24抗微生物剂敏感性测试的性能标准]；补充信息，2014
实例6：酶活性
过夜预培养物的制备
在96深孔板中进行过夜培养，每孔具有1.25mL的LB肉汤(Difco；BD#244610)。每种菌株一式两份进行测试，并用来自纯的标准方法琼脂板(SMA板，史密斯河生物制品公司(Smith River Biologicals)#11-00450)的单菌落接种。孵育前，将一个灭菌的透气密封(飞世尔公司(Fisher)#50-212-463)放置在板的顶部，并将该板在需氧条件下在35℃下振摇孵育过夜。
厌氧生长的确定
使用10μL接种环将SMA板从过夜培养物划线。每板最多四个菌株划分成单独的象限。
在39℃下，在AnaeroJar(赛默科技公司(Thermo Scientific)Oxoid，飞世尔(Fisher)#OXAG0025A)以及AnaeroGen小袋(赛默科技公司(Thermo Scientific)Oxoid，飞世尔(Fisher)#OXAN0025A)中孵育这些板以维持厌氧条件(约0.1％氧气)。使用灭菌材料在生物通风橱内的无菌条件下进行工作。
使用AZCL-底物琼脂板确定酶活性
用AZCL底物制备培养基，这些AZCL底物可以是高压蒸汽处理的AZCL-纤维素(AZCL-HE-纤维素、I-AZCEL，梅格泽姆公司(Megazyme))、阿拉伯木聚糖(AZCL-阿拉伯木聚糖、小麦、I-AZWAX，梅格泽姆公司)、阿拉伯聚糖(AZCL-阿拉伯聚糖、脱支的、I-AZDAR，梅格泽姆公司)：
在两个(2)500mL烧杯中，对每个烧杯制备300mL的0.1x和1x LB琼脂，向每个中添加磁力搅拌棒。在搅拌中，将来自这些烧杯的100mL的LB条件添加至三个(3)250mL惠顿(Wheaton)瓶中，因此给出3瓶具有0.1x LB和3瓶具有1x LB。然后伴随搅拌，将AZCL-纤维素、阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖分别添加至每个1x和0.1x瓶中。每100mL培养基中添加总共0.05克的底物。如果使用超过100mL的培养基，通过使用0.05g/100mL的比率调节添加的底物的量。将该培养基高压蒸汽处理灭菌。注释：仅这三种AZCL底物可以进行高压蒸汽处理，而不会发生明显的染料脱落，表明底物不稳定。在高压蒸汽处理之后，将培养基保持在≥50℃直至准备倾倒板。检查pH，并且如果需要，使用10％HCl或2N NaOH调节至pH 7，保持无菌。
用不能高压蒸汽处理AZCL底物制备培养基
这些底物是：AZCL-直链淀粉(I-AZAMY，梅格泽姆公司)、AZCL-酪蛋白(I-AZCAS，梅格泽姆公司)、AZCL-木聚糖(Xylan，桦木)(I-AZXBW，梅格泽姆公司)
在两个(2)1000mL惠顿(Wheaton)瓶中制备400mL的0.1x LB和1xLB，向每个中添加磁力搅拌棒。在添加AZCL试剂之前，将培养基高压蒸汽处理以灭菌。在高压蒸汽处理之后，将培养基保持在50℃-55℃直至准备添加AZCL底物以及倾倒板。检查pH，并且如果需要，使用10％HCl或2N NaOH调节至pH 7，保持无菌。
倾倒AZCL底物培养基琼脂板
使用灭菌材料在生物通风橱内的无菌条件下进行工作。这些步骤相对较快地进行，以便琼脂在转移到96孔板中之前不固化。
对于可以高压蒸汽处理的底物(AZCL-纤维素、AZCL-阿拉伯木聚糖、AZCL-阿拉伯聚糖)：将温热的(约50℃)、高压蒸汽处理的液体琼脂培养基磁力搅拌以便悬浮不溶性AZCL底物。将等分试样转移到灭菌溶液盆中(需要定期混合溶液盆中的物质以保持底物悬浮)。使用重复的多通道移液器(例如，Matrix 1250μL移液管以及相应的1250μL灭菌移液吸头)将180μL分配到灭菌96孔板的每个孔中。一组吸头通常可以持续每个板高达六列。一旦该板填满，添加无菌盖，并允许其固化。为每种底物(AZCL-纤维素、AZCL-阿拉伯木聚糖、AZCL-阿拉伯聚糖)和条件(0.1x LB和1x LB)制备一个板。
对于不可以高压蒸汽处理的底物(AZCL-直链淀粉、AZCL-酪蛋白、AZCL-木聚糖)：向具有磁力搅拌棒的灭菌250mL烧杯中添加100mL的温热的、灭菌的0.1x或1x LB培养基(没有添加AZCL底物)。伴随搅拌，添加0.05mg的AZCL底物，并持续搅拌直至再悬浮。首先这可以帮助缓慢添加底物。一旦底物再悬浮，将其倾倒进溶液盆中并如上所述的添加至板中。为每种底物(AZCL-纤维素、AZCL-阿拉伯木聚糖、AZCL-阿拉伯聚糖)和条件(0.1x LB和1x LB)制备一个板。
接种96孔板、孵育并评估
使用灭菌材料在生物通风橱内的无菌条件下进行工作。通过施用2μL分配在琼脂顶部的过夜培养物接种AZCL底物琼脂板。添加的液体应该在琼脂的顶部可见。当移动到下一个板时，确保移液吸头的末端没有滴液以确保已接种每个孔。重复所有AZCL底物板。制备对照酶稀释液，每个在1/100，在灭菌磷酸盐缓冲液中稀释：10μL酶制剂+990μL缓冲液。然后对每种底物用10μL的适当的酶稀释液对对照酶孔进行接种
表6.1：酶和各自的底物
酶 底物
淀粉酶 直链淀粉
阿拉伯糖酶 阿拉伯聚糖
纤维素酶 纤维素
蛋白酶 酪蛋白
木聚糖酶 阿拉伯木聚糖、木聚糖
表6.2：在需氧条件下的酶生产
表6.3：在厌氧条件下24小时的酶生产
表6.4：在厌氧条件下48小时的酶生产
实例7：DSM 29870菌株在产气荚膜梭菌激发条件下的功效
材料与方法
已经进行了三组独立的研究以评估菌株DSM 29870对诱导的坏死性肠炎的发展的影响。
在每个实验中，总共有256个一日龄的雄性肉鸡Cobb x Cobb分配至Petersime层架式鸡笼(8只鸡/笼)中。在析因且完全随机的设计中使用多个笼子，其中每次处理8个笼子(即，64只动物/处理)。
配制基于不含药物的玉米/大豆饼的商业肉鸡起始鸡口粮(表7.1)。贯穿整个实验可以使用任意量的饲料和水。
表7.1：基础实验日粮的组合物4(起始鸡d1-d28)
1维生素混合物提供了以下物质(每kg日粮)：硫胺素一硝酸盐，2.4mg；烟酸，44mg；核黄素，4.4mg；D-Ca泛酸盐，12mg；维生素B12(钴胺素)，12.0μg；吡哆醇HCL，4.7mg；D-生物素，0.11mg；叶酸，5.5mg；甲萘醌亚硫酸氢钠复合物，3.34mg；氯化胆碱，220mg；胆钙化醇，27.5ug；反式视黄醇乙酸酯，1,892ug；全消旋α-生育酚乙酸酯，11mg；乙氧基喹啉，125mg。
2痕量矿物质混合物提供了以下物质(每kg日粮)：锰(MnSO4·H2O)，60mg；铁(FeSO4·7H2O)、30mg；锌(ZnO)、50mg；铜(CuSO4·5H2O)，5mg；碘(乙二胺二氢碘化物)，0.15mg；硒(NaSe03)，0.3mg。
3Met＝甲硫氨酸；Cys＝半胱氨酸。
4基础饲料将不会含有任何益生菌/益生元饲料添加剂、NSPase、抗球虫药或抗生素生长促进剂。
该4个实验组由以下各项组成(表7.2)：T1，非感染和非治疗的动物；T2，产气荚膜梭菌感染的和非治疗的动物；T3，饲喂含有杆菌肽(包含50ppm，从d1至d28)的基础日粮的产气荚膜梭菌感染的动物；T4，饲喂含有DSM 29870菌株(在试验1和5中包含1.109CFU/kg饲料，在试验2和3中包含108CFU/kg饲料，从d1至d28)的基础日粮的产气荚膜梭菌感染的动物。
表7.2：实验处理
在第14天，所有的禽都用球虫接种物口服接种，该球虫接种物含有大约5,000个巨型艾美球虫(Eimeria maxima)的卵囊每只禽。
除T1以外的所有禽类，在d19、d20和d21每日一次给予(通过口服管饲法)1mL的产气荚膜梭菌的新鲜肉汤培养物。
在d21，选择来自每个笼子的三只禽、将其处死、称重并检查存在坏死性肠炎病变的程度。得分为0至3分，0为正常并且3为最严重。
在实验起始(d1)和实验结束(d28)时，以笼为基础记录活体重量和饲料，以便计算性能：
-体重增加(BWG)＝(活体重量)d28-(活体重量)d1
-饲料转化率(FCR)＝在饲料消耗和体重增加之间的比率
每天记录死亡率，并相应调整FCR。
还计算坏死性肠炎病变得分、总死亡率和患有坏死性肠炎病变的死禽的％。
使用XLSTAT(Addinsoft 1995-2014)的ANOVA程序，使用完全随机区组设计对数据(n＝32)进行ANOVA，来确立日粮之间的差异。围栏被认为是实验的单位。该模型包括日粮(n＝4)和区组作为固定效应。将结果报告为最小二乘均数。假设LS平均值在P≤0.05时不同。
实验结果
对参数性能、坏死性肠炎病变评分、死亡率和和患有坏死性肠炎病变的死禽的％的所得结果显示在表7.3。
表7.3：在三次独立试验中，菌株DSM 29870的饮食补充对由于诱导的性肠炎引起 生产参数方面的负面影响的作用。
1饲喂基础日粮的非感染的、非治疗的组。
2饲喂基础日粮的感染的、非治疗的组。
3饲喂补充有杆菌肽(50ppm)的基础日粮的感染的组。
4饲喂补充有DSM 29870(1.109CFU/kg饲料)的基础日粮的感染的组
5对于每个组来自每个笼子的8只禽的8个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝8)和处理(n＝4)作为固定效应分析原始数据(n＝32)。
6对于每个组来自每个笼子的3只禽的8个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝8)和处理(n＝4)作为固定效应分析原始数据(n＝32)。
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
1饲喂基础日粮的非感染的、非治疗的组。
2饲喂基础日粮的感染的、非治疗的组。
3饲喂补充有杆菌肽(50ppm)的基础日粮的感染的组。
4饲喂补充有DSM 29870(5.108CFU/kg饲料)的基础日粮的感染的组
5对于每个组来自每个笼子的8只禽的8个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝8)和处理(n＝4)作为固定效应分析原始数据(n＝32)。
6对于每个组来自每个笼子的3只禽的8个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝8)和处理(n＝4)作为固定效应分析原始数据(n＝32)。
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
1饲喂基础日粮的非感染的、非治疗的组。
2饲喂基础日粮的感染的、非治疗的组。
3饲喂补充有杆菌肽(50ppm)的基础日粮的感染的组。
4饲喂补充有DSM 29870(5.108CFU/kg饲料)的基础日粮的感染的组
5对于每个组来自每个笼子的8只禽的8个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝8)和处理(n＝4)作为固定效应分析原始数据(n＝32)。
6对于每个组来自每个笼子的3只禽的8个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝8)和处理(n＝4)作为固定效应分析原始数据(n＝32)。
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
从三项激发研究中获得的数据显示，相对于阳性对照组(非感染、非治疗的动物)，菌株DSM 29870可以抵消诱导的坏死性肠炎对生产参数的负面影响，在所有激发试验中对由于坏死性肠炎引起的FCR和死亡率具有显著的影响。
此外，关于在这些试验中测量的所有参数，在DSM 29870饲喂组和杆菌肽饲喂组之间没有显著差异。
上文描述的激发研究显示DSM 29870菌株的给予可以预防肉鸡中的坏死性肠炎。
实例8：肉鸡的第一性能试验(521)
材料与方法
对共计2000只一日龄的雄性肉鸡Cobb 500单独称重(体重42g±1g)，并分配在地面围栏(50只禽/围栏)中。在析因且完全随机的设计中使用多个围栏，其中每次处理8个围栏(即，400只动物/处理)。该5个实验处理由以下各项组成(表8.1)：T1，阴性对照基础日粮；T2，含有菌株DSM 29870(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T3，含有菌株DSM29871(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T4，含有菌株DSM 29872(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T5，含有市售的益生菌GalliPro Max(包含商业剂量，8.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮。
基础日粮存在于3阶段饲养方案中：起始阶段(从第1至12天)、生长阶段(从第13至28天)和完成阶段(从第29至35天)。每个阶段都配制成达到或超过动物需求，并且符合US商业标准的基于玉米-大豆粉的肉鸡日粮。这些日粮的饮食和原料组成在表8.2中给出。所有实验日粮包括植酸酶(Ronozyme P，250FYT/kg)，并不含任何球虫抑制药、NSPase或生长促进物质。贯穿整个实验可以使用任意量的饲料和水。
表8.1：实验处理
表8.2：基础实验日粮的组合物
1维生素混合物将提供以下物质(每kg日粮)：硫胺素一硝酸盐，2.4mg；烟酸，44mg；核黄素，4.4mg；D-Ca泛酸盐，12mg；维生素B12(钴胺素)，12.0μg；吡哆醇HCL，4.7mg；D-生物素，0.11mg；叶酸，5.5mg；甲萘醌亚硫酸氢钠复合物，3.34mg；氯化胆碱，220mg；胆钙化醇，27.5ug；反式视黄醇乙酸酯，1,892ug；全消旋α-生育酚乙酸酯，11mg；乙氧基喹啉，125mg。
2痕量矿物质混合物提供了以下物质(每kg日粮)：锰(MnSO4·H2O)，60mg；铁(FeSO4·7H2O)、30mg；锌(ZnO)、50mg；铜(CuSO4·5H2O)，5mg；碘(乙二胺二氢碘化物)，0.15mg；硒(NaSe03)，0.3mg。
在实验起始(d1)和实验结束(d35)，以围栏为基础记录活体重量和饲料，以便计算性能：
-饲料摄入量(FI)＝(剩余的饲料)d35-(发放的饲料)d1
-体重增加(BWG)＝(活体重量)d35-(活体重量)d1
-饲料转化率(FCR)＝在饲料消耗和体重增加之间的比率
每天记录死亡率，并相应调整FCR。
使用XLSTAT(Addinsoft 1995-2014)的ANOVA程序，使用完全随机区组设计对数据(n＝40)进行ANOVA，以确立日粮之间的差异。围栏被认为是实验的单位。该模型包括日粮(n＝5)和区组作为固定效应。将结果报告为最小二乘均数。假设LS平均值在P≤0.05时不同。
在实例9和10中也实现了类似的计算。
在实例3和4中也实现了类似的计算。实验结果
关于整个实验期间的性能参数所得到的结果显示在表8.3中。
表8.3：菌株DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的饮食补充对肉鸡性能的影响
1饲喂基础日粮的组。
2DSM 29870/29871/29872补充的组，饲喂包括菌株DSM29870/29871/29872(以5.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
3GalliPro Max补充的组，饲喂包括GalliPro Max(以8.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
4对于每个组来自每个围栏50只禽的8个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝8)和处理(n＝3)作为固定效应分析原始数据(n＝24)。
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
相对于对照，饲料添加剂对动物饲料摄入量没有显著影响。使用NZB菌株体重稍微增加，而GalliPro Max倾向于降低此参数。
DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872菌株的饲料转化率分别显著地改进了1.6％、1.5％和1.9％，而在饲喂NZB菌株的组之间无显著的差异。GalliPro Max对饲料转化率只有轻微且非显著的影响。
这里测试的益生菌中没有一种对死亡率水平有显著的影响。
实例9：肉鸡的第二性能试验(522)
材料与方法
对共计900只一日龄的雄性肉鸡Ross 708单独称重(体重47.1±1.1g)，并分配在地面围栏(15只禽/围栏)中。在析因且完全随机的设计中使用多个围栏，其中每次处理12个围栏(即，180只动物/处理)。该5个实验处理由以下各项组成(表9.1)：T1，阴性对照基础日粮；T2，含有菌株DSM 29870(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T3，含有菌株DSM 29871(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T4，含有菌株DSM 29872(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T5，含有市售的益生菌GalliPro Max(包含商业剂量，8.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮。
基础日粮存在于3阶段饲养方案中：起始阶段(从第1至14天)、生长阶段(从第15至21天)和完成阶段(从第22至35天)。每个阶段都配制成达到或超过动物需求，并且符合US商业标准的基于玉米-大豆粉的肉鸡日粮。这些日粮的饮食和原料组成在表9.2中给出。所有实验日粮包括维生素和矿物质预混合料，但不含任何球虫抑制药、NSPase、植酸酶或生长促进物质。贯穿整个实验可以使用任意量的饲料和水。
表9.1：实验处理
表9.2：基础实验日粮的组合物
1维生素混合物将提供以下物质(每kg日粮)：维生素A，13 227 513IU；维生素D3，3968 254IU；维生素E，66 138IU；维生素B12，40mg；生物素，254mg；甲萘醌，3 968mg；硫胺素，3968mg；核黄素，13 228mg；d-泛酸，22 046mg；吡哆醇，7 937mg；烟酸，110 229mg；叶酸，2205mg；硒预混合料：硒，600ppm+钙，36％
2痕量矿物质混合物将提供以下物质(每kg日粮)：钙，最小：15.7％和最大：18.7％；锰(Mn)，6.0％；锌(Zn)，6.0％；铁(Fe)，4.0％；铜(Cu)，5000ppm；碘(I)，1250ppm；钴(Co)，500ppm
实验结果
关于整个实验期间的性能参数所得到的结果显示在表9.3中。
表9.3：菌株DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的饮食补充对肉鸡性能的影响
1饲喂基础日粮的组
2DSM 29870/29871/29872补充的组，饲喂包括菌株DSM29870/29871/29872(以5.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
3GalliPro Max补充的组，饲喂包括GalliPro Max(以8.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
4对于每个组来自每个围栏15只禽的12个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝12)和处理(n＝3)作为固定效应分析原始数据(n＝36)。
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
而且，在本实验中，菌株DSM 29870、DSM 29871、DSM 29872和GalliPro Max的给予没有显著地减少饲料摄入量，但是分别改进了体重增加2.3％、1.7％、2.6％和1.5％。因此，DSM 29870和DSM 29872相对于对照的差异是显著的。
菌株DSM 29870和DSM 29872分别显著地改进了饲料转化率3.6％和4.2％。在本实验中，DSM 29871和GalliPro Max也改进(对于DSM 29871，轻微地)饲料转化率，但是不显著。
菌株DSM 29870允许以比GalliPro Max数值上更高的方式降低死亡率水平。
实例10：肉鸡的第三性能试验(051)
材料与方法
对共计1080只一日龄的雄性肉鸡Ross PM3单独称重(体重42±3.5g)，并分配在地面围栏(18只禽/围栏)中。在析因且完全随机的设计中使用多个围栏，其中每次处理12个围栏(即，216只动物/处理)。该3个实验处理由以下各项组成(表10.1)：T1，阴性对照基础日粮；T2，含有菌株DSM 29870(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T3，含有菌株DSM 29871(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T4，含有菌株DSM 29872(包含5.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮；T5，含有市售的益生菌GalliPro Max(包含商业剂量，8.108CFU/kg饲料，从d1至d35)的基础日粮。
基础日粮存在于3阶段饲养方案中：起始阶段(从第1至21天)、生长阶段(从第22至35天)。每个阶段都配制成达到或超过动物需求，并且符合EU商业标准的基于玉米-大豆粉的肉鸡日粮。这些日粮的饮食和原料组成在表10.2中给出。所有实验日粮包括维生素和矿物质预混合料，但不含任何球虫抑制药、NSPase、植酸酶或生长促进物质。贯穿整个实验可以使用任意量的饲料和水。
表10.1：实验处理
表10.2：基础实验日粮的组合物
1预混合料将提供以下物质(每kg日粮)：维生素A，12 000IU；维生素D3，3 000IU；维生素E＝300IU；维生素K3，3mg；维生素B，2mg；维生素B2，8mg；维生素B6，3mg；维生素B12，0.02mg；叶酸，1mg；生物素，0.2mg；泛酸钙，15mg；烟酸，40mg；锰(Mn)，80mg；锌(Zn)，60mg；碘(I)，1mg，铁(Fe)，80mg；铜(Cu)，15mg；钴(Co)，0.4mg；硒(Se)，0.2mg；镁(Mg)，5mg；乙氧基喹啉，0.5mg；BHA，0.5mg，柠檬酸，5mg；磷酸，5mg。
实验结果
关于整个实验期间的性能参数所得到的结果显示在表10.3中。
表10.3：菌株DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的饮食补充对肉鸡性能的影响
1饲喂基础日粮的组。
2DSM 29870/29871/29872补充的组，饲喂包括菌株DSM 29870/29871/29872(以5.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
3GalliPro Max补充的组，饲喂包括GalliPro Max(以8.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
4对于每个组来自每个围栏18只禽的12个重复的平均值。使用方差分析用区组(n＝12)和处理(n＝3)作为固定效应分析原始数据(n＝36)。
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
在本实验中，菌株DSM 29870、DSM 29871、DSM 29872(如GalliPro Max)的给予对饲料摄入量没有显著的影响，但是分别导致体重增加6.5％、7.3％和5.2％的显著改进。GalliPro Max也改进体重增加(+4.2％)，但不显著。
如改进达到3.4％的GalliPro Max，所有的NZB菌株的饲料转化率显著地改进了4.0％、5.3％和4.8％(分别地，DSM 29870、DSM 29871和DSM29872)。
关于死亡率水平，处理之间没有显著差异。
实例11：合成和元分析
以上描述的三种性能实验的结果总结在表11.1中。
表11.1：个体研究的结果
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
这些试验具有相似的实验设计，将获得的所有数据在元分析中合并和组合(经过同质性测试之后)。此元分析涉及在160个重复的3980只肉鸡(每个实验组32个重复和796只动物)。结果示于表11中。
使用SAS(SAS研究所(SAS Institute)，2002-2012)的GLIMMIX程序，对数据(n＝160)进行混合模型ANOVA，以便确立日粮之间的差异。围栏被认为是实验的单位。该模型包括作为固定效应的日粮(n＝5)和作为随机效应的实验(n＝3)。将结果报告为最小二乘均数。假设LS平均值在P≤0.05时不同。
表11.2：三个实验的元分析显示菌株DSM29870、DSM29871和DSM 29872的饮食补充 对肉鸡性能的影响
1饲喂基础日粮的组
2DSM 29870/29871/29872补充的组，饲喂包括菌株DSM29870/29871/29872(以5.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
3GalliPro Max补充的组，饲喂包括GalliPro Max(以8.108CFU/kg饲料)的基础日粮。
4来自每个实验组(796只动物/组)的32个观察的平均值。
a、b、c具有不同上标的值彼此之间差异显著(P<0.05)。
此元分析显示菌株DSM 29870、DSM 29871或DSM 29872在基于玉米/大豆粉的日粮中的使用显著地改进了平均体重增加(分别地，+2.9％、+2.6％和+3.0％)和饲料转化率(分别地，-2.4％、-2.2％和-2.7％)，对饲料摄入量没有影响。
结论
在以上操作实例中，已经证明了菌株DSM 29870对饲喂基于玉米/大豆粉的日粮的肉鸡性能(即体重增加和饲料转化率)的积极影响。
从以上实例中所述的实验得到的所有数据也显示，菌株DSM 29870对饲料转化率的影响是由于其对体重的影响。这些影响可以与健康效应或代谢改进有关。
在66％和100％的上述操作验实例中，菌株DSM 29870分别显示对体重增加和饲料转化率有积极和显著的影响。
GalliPro Max在任何上述操作实例中显示对体重增加没有显著的影响，并在三分之一的实验中显示对饲料转化率有显著和积极的影响。
在以上实例中描述的实验中，证明了与GalliPro Max相比，菌株DSM29870对肉鸡性能有更好的影响。使用DSM 29870观察到的影响是用GalliPro Max观察到的影响的平均两倍。
实例12：对莫能菌素相容性的确定
使用类似于实例5中描述的方法中的改良肉汤微量稀释液确定芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM 29872的莫能菌素相容性。简言之，将芽孢杆菌属物种的单菌落(来自过夜胰蛋白胨大豆琼脂板)接种至Mueller Hinton肉汤(MHB)中并培养过夜。用该过夜培养物接种灭菌的培养基并允许其生长4小时以便在对数生长期测试细菌。然后将培养物再一次稀释(1:200)至新鲜MHB中，并将90μL的该接种的肉汤添加至在指定浓度的稀释的莫能菌素中。还测试了以下现有技术菌株用于对照：NN019785、NN062266(NRRLB-50013)、NN062267(NRRL B-50104)、NN062278(PTA-6507)、NN062319(FERM BP-1096)、NN062440、NN062441(DSM 17236)、NN062439。
菌株：
解淀粉芽孢杆菌DSM 29869
枯草芽孢杆菌DSM 29870
枯草芽孢杆菌DSM 29871
解淀粉芽孢杆菌DSM 29872
地衣芽孢杆菌NN019785
解淀粉芽孢杆菌NN062266(NRRL B-50013)
枯草芽孢杆菌NN062267(NRRL B-50104)
枯草芽孢杆菌NN062278(PTA-6507)
解淀粉芽孢杆菌NN062319(FERM BP-1096)
枯草芽孢杆菌NN062440
地衣芽孢杆菌NN062441(DSM 17236)
解淀粉芽孢杆菌NN062439
材料：
莫能菌素钠盐(西格玛(Sigma)，CAS号22373-78-0，溶解于96％乙醇中)
Mueller Hinton肉汤(贝迪公司(Becton,Dickinson and Company)，275730)
胰蛋白胨大豆琼脂(贝迪公司(Becton,Dickinson and Company)，236920)
微量滴定板：Costar板、聚丙烯、平底、康宁(Corning)3628
硼硅酸盐玻璃管：Kimbale，16x 125mm，73500-16125
气体可渗透粘合剂密封：赛默科技公司(Thermo Scientific)，AB-0718
细菌的制备：
将芽孢杆菌属物种在胰蛋白胨大都琼脂板(40g/L)在37℃下生长过夜。将MuellerHinton肉汤(21g/L)溶解于水中并在各自含有5mL肉汤的玻璃管中进行高压蒸汽处理。将芽孢杆菌属物种的单菌落(来自过夜的板)接种至Mueller Hinton肉汤(MHB)中，并在37℃下在200rpm下振摇孵育过夜。然后将新鲜的、灭菌的培养基的5mL玻璃管用25mL过夜的培养物接种并允许其在37℃下生长4小时。然后，将培养物以1:200再一次稀释至新鲜的MHB中。然后，将90μL的该接种的肉汤添加至在指定浓度的稀释的抗生素中。
测定板的制备：
将莫能菌素稀释到96％乙醇中至800μg/mL的浓度。然后，将此溶液稀释10倍至灭菌的磷酸盐缓冲液中至80μg/mL的浓度。在MHB中制备两倍稀释系列下降至浓度为2.5μg/ml。将10μl的每种稀释液和10μl的每种抗生素移液到微量滴定板中。之后，当将抗生素与细菌悬浮液混合时，将样品稀释10x(10μL样品在100μl总体积中)。这导致0.25-8μg/ml的最终测试范围。
将90μl的细菌悬浮液添加至测定板中。然后将这些测定板用气体可渗透密封粘合剂覆盖，并在37℃、200rpm下振摇孵育过夜。与MIC分析相似，将最大相容浓度确定为上文如通过肉眼检测到的抑制80％细菌的浓度。
结果：
在饲料中投递芽孢杆菌属物种的潜在挑战是在饲料中抗生素作为生长促进剂的普遍使用。因此，有必要确定菌株与常用的饲料抗生素的相容性，以便鉴定与用作直接饲喂的微生物的任何潜在冲突。因此，芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM 29870、DSM 29871和DSM29872的莫能菌素相容性与现有技术菌株一起确定。芽孢杆菌属菌株DSM 29869、DSM29870、DSM 29871和DSM 29872显示出比本文中包括的大多数现有技术菌株与莫能菌素更高水平的相容性：NN019785、NN062266(NRRL B-50013)、NN062267(NRRL B-50104)、NN062278(PTA-6507)、NN062319(FERM BP-1096)、NN062440、NN062441(DSM 17236)、NN062439。
表12.1：莫能菌素相容性结果
序列表
<110> 诺维信公司
<120> 改进生产动物的健康和性能的芽孢杆菌属菌株
<130> 13132-WO-PCT
<160> 13
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1507
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260
tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1440
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa 1500
ggtgcgg 1507
<210> 2
<211> 1507
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 2
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcaaacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260
tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1440
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa 1500
ggtgcgg 1507
<210> 3
<211> 1507
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 3
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
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cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260
tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1440
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa 1500
ggtgcgg 1507
<210> 4
<211> 1507
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 4
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga accgcatggt tcagacataa 180
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aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
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tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
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<210> 5
<211> 1472
<212> DNA
<213> 死谷芽孢杆菌
<400> 5
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aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcagacataa 180
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ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
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cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
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ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260
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tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc 1440
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg 1472
<210> 6
<211> 1507
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 6
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140
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ggtgcgg 1507
<210> 7
<211> 1472
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 7
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcagacataa 180
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aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
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aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
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tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
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caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260
tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc 1440
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<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 8
gagtttgatc ctggctcag 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 9
agaaaggagg tgatccagcc 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 10
atctaatcct gtttgctccc c 21
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 11
tacgggaggc agcag 15
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 12
cggtgtgtrc aaggccc 17
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 13
caacgagcgc aaccct 16

Claims (15)

1.一种芽孢杆菌属菌株，其特征在于：
i)具有保藏登录号DSM 29870、或者具有芽孢杆菌DSM 29870或其突变体的所有鉴别特征的菌株；
ii)具有保藏登录号DSM 29869、或者具有芽孢杆菌DSM 29869或其突变体的所有鉴别特征的菌株；
iii)具有保藏登录号DSM 29871、或者具有芽孢杆菌DSM 29871或其突变体的所有鉴别特征的菌株；或者
iv)具有保藏登录号DSM 29872、或者具有芽孢杆菌DSM 29872或其突变体的所有鉴别特征的菌株。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是非溶血的。
3.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。
4.根据先前权利要求中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株在饲喂芽孢杆菌属菌株的鸡中改进体重增加和/或饲料转化率。
5.根据先前权利要求中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株包含16S rDNA，该16S rDNA与SEQ ID NO:1具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:2具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQ ID NO:3具有超过98％的序列同一性、和/或与SEQID NO:4具有超过98％的序列同一性。
6.根据先前权利要求中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌菌株或解淀粉芽孢杆菌菌株。
7.根据先前权利要求中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株具有针对大肠杆菌的抗微生物作用。
8.根据先前权利要求中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，其中该芽孢杆菌属菌株是分离的芽孢杆菌属菌株。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的芽孢杆菌属菌株的生物学纯的培养物。
10.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的芽孢杆菌属菌株的孢子。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中该组合物的芽孢杆菌孢子以孢子如干孢子存在。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中每种芽孢杆菌孢子的细菌计数是在1x104CFU/kg和1x1018CFU/kg的组合物之间，优选地在1x106CFU/kg和1x1015CFU/kg的组合物之间，以及更优选地在1x107CFU/kg和1x1011CFU/kg的组合物之间。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含载体。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中该载体包含以下化合物中的一种或多种：水、甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、硅酸铝钠、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、麦芽糖糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、小麦粉、麦麸、玉米蛋白粉、淀粉、farigel、木薯芯、硅酸铝钠、胶态无定形二氧化硅、Sipernat 50S、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、卡波姆和纤维素。
15.根据权利要求13或14所述的组合物，其中该载体包含碳酸钙。
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