CN102578415B - 约氏乳杆菌在制备提高禽类产蛋性能和蛋品质饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了约氏乳杆菌在制备提高禽类产蛋性能和蛋品质饲料中的应用。将所述的约氏乳杆菌适当的剂量添加饲料中对提高产蛋鸡每枚蛋的蛋重，提高产蛋率，降低料蛋比，提高蛋黄颜色方面有显著的作用。

Description

约氏乳杆菌在制备提高禽类产蛋性能和蛋品质饲料中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌在制备提高禽类产蛋性能和蛋品质饲料中的应用。

背景技术

约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)，1980年首次被分离，然而在分类学上一直将其划分为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。1992年Fujisawa等通过生化实验和DNA杂交实验将其定名为约氏乳杆菌。约氏乳杆菌主要存在于动物和人的消化道中，且为优势菌群。

欧盟食品安全局(EFSA)会分别于2009年和2011年两次发布了针对约氏乳杆菌的健康申明，申明指出约氏乳杆菌具有减少肠道内病原菌的微生物，增强天然防御和免疫系统和保持皮肤健康。并且欧盟与2010年对约氏乳杆菌进行了安全资格认定(qualifiedpresumptionofsafety，QPS)批准其在饲料和食品中使用。综合目前关于约氏乳杆菌的文献报道，其对动物的益生功能主要体现在以下几方面：1.约氏乳杆菌对动物天然防御系统及免疫机能具有调节作用，其具体调控位点，如TGFβ，TLR9，NF-κB，IgA，往往是动物机体免疫应答反应的起始受体，因此其预防动物疾病的作用机理可能是在特定时期刺激动物免疫系统，早期激活下游免疫应答进而防止疾病发生；2.约氏乳杆菌表现出对动物皮炎的特异性预防作用。3.约氏乳杆菌对病原菌的排他性竞争作用。约氏乳杆菌对一些病原菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌在肠道上皮细胞上的定殖产生空间位阻，可防止病原菌对肠道上皮细胞的侵染，减少疾病发生。

2010年我国卫生部办公厅将约氏乳杆菌收录到《可用于食品的菌种名单》中，批准其作为具有益生功能的食品添加剂使用。目前在国内尚未见有将约氏乳杆菌作为添加剂添加食品和饲料添加剂的产品面世，其在动物畜禽养殖上的应用也鲜见报道，将约氏乳杆菌开发成动物微生态饲料添加剂，为填补国内空白，筛选益生性能优良的约氏乳杆菌，对促进我国畜禽养殖水平意义重大，可在畜禽养殖中发挥更大作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供约氏乳杆菌CGMCCNo.4926在制备提高禽类产蛋性能和蛋品质饲料中的应用。

本发明的约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，是通过体外耐酸和耐胆盐筛选得到的一株具有潜在益生功能的约氏乳杆菌，命名为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.4926。

其中，所述的约氏乳杆菌YS-12的筛选过程如下：

(1)收集菌种

截取健康猪结肠后半段，用生理盐水冲洗三次，用牙签多次刮取肠道上皮上的附着物，放入10mL的生理盐水中，作为样品原液，对原液进行10倍梯度稀释。

(2)菌种培养

将每个稀释度，取100微升涂布于MRS平板上，37℃倒置培养24小时。

(3)菌种鉴定

挑取平板上的单菌落进行对其16SrRNA进行菌落PCR鉴定，通过在数据库中进行序列比对，发现其16S序列(GenBank登录号：HQ641209)与数据库中已知的约氏乳杆菌的16S序列的相似度达99％，进一步通过理化实验证实其为约氏乳杆菌。

(4)菌种筛选

1)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10^-2，用移液器吸取10^-2稀释液100微升分别加入900微升0.3％的胆盐溶液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

2)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10^-2，用移液器吸取10^-2稀释液100微升分别加入900微升pH3.0的缓冲液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

3)将酸处理过的菌液继续稀释至10^-5，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度(对照组稀释至10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6)各0.1ml涂布MRS平板，37℃倒置培养48小时。挑取耐受性菌株进行反复筛选，得到耐酸和耐胆盐性能优良的约氏乳杆菌。

(5)菌种保藏

将筛选得到的约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，获得保藏号为CGMCCNo.4926。

将约氏乳杆菌CGMCCNo.4926单独或制备成制剂添加到不同类型的鸡的基础日粮中，饲喂后可显著免疫水平。

在本发明的一个实施方案中，在产蛋鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁴～10⁶cfu，优选达到1.0×10⁵cfu，显著提高了产蛋性能，提高每枚蛋的蛋重，提高产蛋率，降低料蛋比。

在本发明的另一个实施方案中，在产蛋鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁵、1.0×10⁷cfu或1.0×10⁸cfu，显著提高了鸡蛋蛋黄的颜色，提高了鸡蛋的品质。

在一个优选的实施方案中，所述的约氏乳杆菌制剂可为本领域常规制剂，优选为约氏乳杆菌冻干剂。

其中，所述约氏乳杆菌冻干剂还可含有冻干保护剂，优选的冻干保护剂为质量比为2∶2∶4∶1∶2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油。

其中，所述约氏乳杆菌冻干剂的制备方法如下：

1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCCNo.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mLMRS液体培养基，培养8～10小时后作为种子液；

2)以5％～10％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～6.5，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、KOH、NaOH中的任一种；在温度37～39℃、转速100rpm条件下发酵10～14小时，发酵过程不通气或通入N₂，维持溶氧小于1％；

4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹¹cfu/ml以上的发酵液；

5)4000-8000转/分钟离心5-10分钟，得到约氏乳杆菌菌泥；

6)得到的产物按照菌泥(g)∶保护剂(mL)质量体积比1∶5加入冻干保护剂，进行真空冷冻干燥，得到约氏乳杆菌冻干剂。

本发明的约氏乳杆菌CGMCCNo.4926以适当的剂量适当的剂量添加饲料中对提高产蛋鸡每枚蛋的蛋重，提高产蛋率，降低料蛋比，提高蛋黄颜色方面有显著的作用。其中，尤以在基础日粮中添加1.0×10⁵cfu/g的约氏乳杆菌CGMCCNo.4926效果最为显著。添加所述量的约氏乳杆菌CGMCCNo.4926，可同时提高产蛋鸡每枚蛋的蛋重，提高产蛋率，降低料蛋比，提高蛋黄颜色方面。

本发明中的约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)保藏，简称CGMCC，保藏日期为2011年6月8日，保藏号为CGMCCNo.4926。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1约氏乳杆菌CGMCCNo.4926冻干剂的制备

1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCCNo.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mLMRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；

2)以5％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入N₂，维持溶氧小于1％；

4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹¹cfu/ml以上的发酵液；

5)8000转/分钟离心10分钟，得到约氏乳杆菌菌泥；

6)得到的产物按照菌泥(g)∶保护剂(mL)质量体积比1∶5加入质量比为2∶2∶4∶1∶2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油，进行真空冷冻干燥，得到约氏乳杆菌冻干剂，其中，约氏乳杆菌的活菌数可达3.7×10¹¹cfu/g。

实施例2

(1)实验动物及实验设计

124日龄海兰褐商品代蛋鸡540只购自北京蛋鸡养殖场。基础日粮配方和营养成分，见表1。

表1基础日粮配方和营养成分

注：每千克饲料中含有：VA16mg，VD₃5mg，VE20mg，VK₃3mg，VB₁4.6mg，VB₂10.5mg，VB₆8.6mg，VB₁₂2mg，蛋白粉390mg，次粉5473.55mg，泛酸钙14.5mg，烟酰胺40.2mg，叶酸2.3mg，生物素10mg，硫酸锰251.57mg，硫酸锌202.9mg，硫酸铁199.33mg，硫酸铜31.92mg，碘化钾50mg，亚硒酸钠30mg，石粉1234.28mg，氯化胆碱1000mg，MET1000mg。

根据体重情况将540只健康蛋鸡，按单因素随机试验设计分成6个处理组，每个处理组6个重复，每个重复15只鸡。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2组为约氏乳杆菌试验组，分别在基础日粮的基础上添加10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸cfu/g的约氏乳杆菌。

(2)动物实验方法

试验鸡在相同条件的半开放鸡舍内饲养，采用3层阶梯式笼养，饲养密度为3只/笼，每天定时饲喂2次(8:00；15:00)。自由采食，饮水。采用16小时光照(早6:00至晚10:00)，用干湿球温度计记录鸡舍内温度和湿度，保持鸡舍内温度在22±3℃，相对湿度在50％-70％。随时记录和观察鸡只死亡情况，并进行剖检，对病情进行初步诊断。

(3)生产性能指标观测

每天15:30定时捡蛋一次，以每天每个重复为单位进行产蛋个数和蛋重的记录，统计产蛋量(率)和蛋重。每周清扫剩余料，试验结束时统计每5周的平均产蛋率、平均蛋重，采食量和料蛋比。

(5)蛋品质指标检测方法

每4周末采集所有鸡蛋测定蛋重，产蛋率，蛋黄颜色。

(6)统计方法

数据经Excel初步处理后，采用SAS软件进行单因素方差分析和多重比较，结果用“平均数±标准差”表示。

(7)结果分析

1)约氏乳杆菌对产蛋鸡平均蛋重的影响

表2约氏乳杆菌对蛋鸡平均每枚蛋重的影响(g)

从表2中可以看出，从饲喂开始直到25周，3组(添加1.0×10⁵cfu/g)与对照组相比，能持续地增加每枚蛋重。

2)约氏乳杆菌对蛋鸡产蛋率的影响

表3约氏乳杆菌对产蛋鸡产蛋率的影响(％)

从表3中可以看出，试验2～4组均能有效地提高产蛋率，在饲喂6周以后，效果就开始体现，16周以后，这种效果最明显。其中，试验3组(添加1.0×10⁵cfu/g)在16周以后，以对照组相比，能提高产蛋率3％以上，效果明显。

3)约氏乳杆菌对蛋鸡料蛋比的影响

表4约氏乳杆菌对产蛋鸡料蛋比的影响

从表4中可以看出，3组(添加1.0×10⁵cfu/g)从饲喂开始直到25周，都能有效地降低料蛋比。

4)约氏乳杆菌对鸡蛋蛋黄颜色的影响

第5周时试验3，4组蛋黄颜色显著高于对照组(P＜0.05)；第11周时试验2，3，6组蛋黄颜色显著高于对照组(P＜0.05)；第19周和23周时试验3，4，5和6组蛋黄颜色显著高于对照组(P＜0.05)。而蛋黄颜色是蛋品质的一项重要指标，因此，添加约氏乳杆菌对提高产蛋鸡产蛋品质具有积极效果。

表5约氏乳杆菌对鸡蛋蛋黄颜色的影响

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.约氏乳杆菌CGMCCNo.4926制剂在制备提高鸡产蛋性能饲料中的应用，所述的约氏乳杆菌制剂为约氏乳杆菌冻干剂，所述约氏乳杆菌冻干剂的冻干保护剂为质量比为2∶2∶4∶1∶2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油，在产蛋鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁴～10⁶cfu。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在产蛋鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁵cfu。

3.约氏乳杆菌CGMCCNo.4926制剂在制备提高鸡蛋品质饲料中的应用，所述的约氏乳杆菌制剂为约氏乳杆菌冻干剂，所述约氏乳杆菌冻干剂的冻干保护剂为质量比为2∶2∶4∶1∶2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油，在产蛋鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁵、1.0×10⁷cfu或1.0×10⁸cfu。