CN103555634B - 一种嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株嗜酸乳杆菌，该菌株命名为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La-P6，已于2013年10月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013474。本发明的嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抑制能力，并且能够耐受一定浓度范围内的多种抗生素，可用作养殖动物的饮水添加剂或饲料添加剂。通过在饲料或饮水中添加嗜酸乳杆菌La-P6，能明显提高断奶仔猪的日增重，并且降低了料肉比，促进养殖动物的健康生长。
Description
技术领域
本发明属于微生物筛选应用技术领域，具体涉及一种嗜酸乳杆菌及其应用。
背景技术
在养殖技术领域中，抗生素的使用能够有效地预防动物疾病，降低动物死亡率，减少肉品污染的风险。但是，其在动物饲料中的滥用造成动物性食品抗生素残留超标，使动物和人体存在对抗生素产生耐药性的风险。因此，抗生素在饲料中的应用就成为一个有争议的话题。欧盟自2006年起将全面禁止食品动物食用抗生素促生长饲料添加剂，而且，抗生素对动物和人类的健康造成的风险也已引起我国农业部门的重视。加强管理养殖环节抗生素的合理使用和畜禽食品中抗生素残留超标，成为食品安全领域关注的热点。
为了避免抗生素使用存在的风险，实现对饲料中抗生素的部分或全部替代，益生菌制剂的研究成为当前畜禽养殖的热点。
益生菌是动物肠道内的正常菌群，对动物体没有毒副作用。其附着在动物肠道内，一方面产生一些抑制病原菌生长的物质，另外在生长代谢过程中，可以分泌多种酶类，促进动物对饲料的消化吸收，提高料肉比，促进动物健康生长。因此益生菌制剂成为国内外业界研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一株嗜酸乳杆菌及其在畜禽养殖中的应用，所述嗜酸乳杆菌筛选自健康仔猪的新鲜粪样，具有很强的抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的能力，并且能与绝大部分抗生素在其安全用药范围内一起添加到畜禽饲料或饮水中使用，从而减少抗生素的使用量。
本发明一方面提供了一株嗜酸乳杆菌，该菌株命名为嗜酸乳杆菌La-P6（Lactobacillus acidophilus La-P6），已于2013年10月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013474。
本发明的嗜酸乳杆菌用作饲料添加剂。
本发明另一个方面提供了包含上述嗜酸乳杆菌的微生物制剂。
上述微生物制剂为嗜酸乳杆菌发酵菌液，活菌量为108-109CFU/mL。
上述微生物制剂可用作饲料添加剂，优选用作饮水添加剂。
本发明的嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抑制能力，并且能够耐受一定浓度范围内的多种抗生素，可用作养殖动物的饮水添加剂或饲料添加剂。通过在饲料或饮水中添加嗜酸乳杆菌La-P6，能明显提高断奶仔猪的日增重，并且降低了料肉比，促进养殖动物的健康生长。
附图说明
图1：本发明的嗜酸乳杆菌La-P6体外对抗生素的敏感性实验。
具体实施方式
实施例1嗜酸乳杆菌La-P6分离筛选及鉴定：
1、乳酸菌初筛
收集青岛市平度养殖场健康仔猪新鲜粪样8份，分别称取5g加入45mL无菌水，制备成菌悬液，涂布于加0.5%碳酸钙的MRS平板上，37℃培养48h，分离培养有透明圈的菌株，获得56株乳酸菌。
2、抑菌型乳酸菌筛选
1）乳酸菌液制备：将初筛得到的56株乳酸菌接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养48h；
2）致病菌菌液制备：大肠杆菌（购自美国模式培养物集存库，菌株编号为ATCC25922）、沙门氏菌（购自美国模式培养物集存库，菌株编号为ATCC14028）和金黄色葡萄球菌（购自美国模式培养物集存库，菌株编号为ATCC6538），将菌种接种于营养肉汤，37℃摇床培养过夜；
3）抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5mL灭菌营养琼脂培养基（50℃左右）加100μL致病菌菌液（菌量106数量级），混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的乳酸菌菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径；
选择抑菌圈明显的菌株作为待选菌株，进行抗生素耐受筛选。经过两次筛选，最终筛选得到1株对大肠杆菌（ATCC25922）、沙门氏菌（ATCC14028），金黄色葡萄球菌（ATCC6538）生长抑制作用最明显的菌株。
3、菌株鉴定
采用分子生物学的方法对筛选得到的菌株进行鉴定，测得其16s rDNA序列，在GenBank核酸数据库中进行blast比对，通过比对确认其为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），命名为嗜酸乳杆菌La-P6（Lactobacillus acidophilusLa-P6），并于2013年10月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013474。
实施例2：嗜酸乳杆菌La-P6抑菌实验
1）乳酸菌液制备：将嗜酸乳杆菌La-P6接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养48h；
2）致病菌菌液制备：大肠杆菌（ATCC25922）、沙门氏菌（ATCC14028），金黄色葡萄球菌（ATCC6538），将菌种接种于营养肉汤，37℃摇床培养过夜；
3）抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5mL灭菌营养琼脂培养基（50℃左右）加100μL致病菌菌液（菌量106数量级），混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的嗜酸乳杆菌La-P6菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。
嗜酸乳杆菌La-P6对致病菌的抑制作用如下表所示：
由上表可以看出，嗜酸乳杆菌La-P6对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达到14mm。
实施例3：嗜酸乳杆菌La-P6体外对抗生素的敏感性实验
1）抗生素选择：兽用每大类抗生素选取常用且相对易得的1-2种。根据各种抗生素在全价料中的常规治疗用量，拟定治疗用量的2倍为重症用量，治疗用量的1/2为预防用量。
2）菌液制备：将嗜酸乳杆菌La-P6接种至液体MRS中37℃培养48h，用MRS培养基稀释至108数量级。
3）敏感性实验：取5mL稀释过的La-P6菌液，向其中加入1）中选定的抗生素使其浓度分别达到重症用量、治疗用量和预防用量，置于37℃培养4h后，用MRS琼脂计数。计算不同抗生素浓度下嗜酸乳杆菌La-P6的存活率，试验结果见图1。如图1所示，除庆大霉素外，嗜酸乳杆菌La-P6在与其它不同浓度的抗生素作用4h后，其存活率均超过70%，且多数超过80%。由此可以推测，嗜酸乳杆菌La-P6可以与除庆大霉素以外的大部分抗生素在其安全用药范围内同时使用而不会影响其效果。
实施例4：嗜酸乳杆菌La-P6作为饲料添加剂对仔猪生长性能的影响
选90头体重接近的健康断奶长白仔猪，断奶日龄为32日龄。随机分成两组，对照组饲喂基础日粮，实验组饲喂基础日粮中加入嗜酸乳杆菌La-P6发酵液（菌量约为108-109CFU/mL的发酵液，每公斤基础日粮添加80-100mL发酵液，发酵液稀释后拌料饲喂），每组分为3个重复共6栏，每栏15头猪。实验时间为30d，仔猪的免疫按常规程序进行。实验期间详细记录各组每天出现腹泻仔猪的头次和各组采食量。在实验结束后计算腹泻率、平均日增重和料肉比。腹泻率的计算公式为：腹泻率=试验期腹泻仔猪头次/（试验仔猪头次×试验天数）×100%
嗜酸乳杆菌La-P6作为饲料添加剂对仔猪生长性能的影响如下表所示：
由上表的数据可知，整个试验期间，实验组仔猪的腹泻率仅为15.6%，比对照组降低了50%左右，说明在饲料中添加本发明的嗜酸乳杆菌La-P6对于预防断奶仔猪的腹泻具有明显的效果；添加嗜酸乳杆菌La-P6还明显提高了断奶仔猪的日增重，比对照组提高了17%，料肉比降低了19.3%，说明在饲料中添加嗜酸乳杆菌La-P6能促进断奶仔猪的肠道健康，提高仔猪的生长性能。
另外，将本发明的嗜酸乳杆菌La-P6发酵液按800-1000倍比例加水稀释后给直接给养殖动物饮用，也能达到上述同等的效果。
Claims (6)
1.一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La-P6，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2013474。
2.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在制备饲料添加剂中的应用。
3.一种微生物制剂，所述微生物制剂包含有权利要求1所述的嗜酸乳杆菌。
4.如权利要求3所述的微生物制剂，为嗜酸乳杆菌发酵菌液，其活菌量为108-109CFU/mL。
5.权利要求3所述的微生物制剂在制备饲料添加剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的饲料添加剂为饮水添加剂。
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