CN101646761B - 皮脱脂的酶促处理 - Google Patents
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Abstract
本发明涉及用疏棉状腐质霉脂肪酶的某些变体为皮脱脂的方法。更具体来说，本发明涉及在没有表面活性剂、pH 6-13的条件下用脂肪酶为皮酶促脱脂的方法。
Description
发明领域
本发明涉及在皮(hides and skins)制革过程中使用脂肪酶为皮脱脂。更具体来说，所述脂肪酶可用于在浸灰车间加工过程中的pH 6-13、含或不含其它化学品或表面活性剂的多个步骤。
发明背景
皮具有天然脂肪区域。但是在制革处理过程中，需要减少过量的脂肪以获得皮革终产品令人满意的光洁度(finish)。
目前皮的脱脂通过使用有机溶剂和表面活性剂完成。
最近已建议使用脂肪分解酶来改进皮的脱脂，从而减少或者甚至避免使用表面活性剂，或作为有机溶剂的替代品，特别是来自疏棉状腐质霉(Humicola lanuginose)的脂肪酶(EP 258068和EP 305216)，其以商标
出售(Novozymes A/S产品)。WO 00/60063描述了这一疏棉状腐质霉脂肪酶的多个变体及其在洗涤剂中的用途，但却未提到其在皮革工业中的脱脂用途。
与传统方法相比，酶促脱脂处理通常提高最终皮革的品质、减少化学品的使用和替代对环境具有不利影响的化学品。
脂肪分解酶将脂肪水解为甘油一酯和甘油二酯、游离脂肪酸和甘油。脂肪酶脱脂已经在酸性至碱性pH条件下被提到。但是由于脂肪酶在乳化体系发挥作用但是在含水超50％的单相溶液中效果较差，因而在未添加任何表面活性剂的水体系中发挥很好效果或者将表面活性剂的使用保持在最低程度的特定脂肪酶的使用是挑战性的难题，而解决这一难题将带来许多益处。另外，如果脂肪酶可以在碱性条件和中性至酸性条件(pH 6-13)下的多个步骤中使用，其将在减少化学品和表面活性剂以及以最佳方式选择化学品和表面活性剂上带来另外的益处。
在多种制革方法中，一直存在对提供具有改良脱脂性质的新脂肪酶的需要。
发明简述
本发明人发现野生型疏棉状腐质霉脂肪酶的某些变体(这些变体已在WO 00/60063中公开)在制革中具有特别好的脱脂表现。这些脂肪酶变体可以在无表面活性剂的情况下用于脱脂。
因此，本发明提供为皮酶促脱脂的方法，包括在pH 6-13的水溶液中使用野生型疏棉状腐质霉脂肪酶的某些变体进行酶促处理。
本发明的方法改进了脱脂性质并最大限度地减少了其它化学品和表面活性剂的使用。
附图简述
参考附图本发明得到了进一步的阐释，其中：
图1表示用
OD 4％处理的脱脂步骤之后，脂肪酸和甘油三酯的HPLC分析。
图2表示用脂肪酶200LU/kg湿皮处理的脱脂步骤之后，脂肪酸和甘油三酯的HPLC分析。
图3表示用脂肪酶100LU/kg湿皮处理的脱脂步骤之后，脂肪酸和甘油三酯的HPLC分析。
图4表示用空白处理的脱脂步骤之后，脂肪酸和甘油三酯的HPLC分析。
图1-4中峰的解释：
5.780分钟的峰指示棕榈酸；14-20分钟的峰指示多种甘油三酯，其中17.7-18分钟是三油酸酯(trioleate)峰；20.71-21.4分钟的峰是溶剂峰。
图5：实施例3中皮提取物的HPLC层析图。
图6：实施例4中皮提取物的HPLC层析图。
发明详述
本发明提供将皮制革的方法，包括用某种脂肪酶对所述皮的酶促处理。
将皮制革
制革厂接收的皮通常是盐化或干燥的生皮(raw hides or skins)形式。将皮制革包括几个不同的处理步骤，包括浸水(soaking)、脱毛(unhairing)、浸灰(liming)、脱灰(deliming)、软化(bating)、浸酸(pickling)和鞣制(tanning)步骤。这些步骤组成湿处理，在浸灰间进行。根据本发明，酶促处理可以在制革过程中pH 6-11的步骤中进行。但是本发明的脂肪酶脱脂通常在湿处理过程中，即在浸水、脱毛、软化和/或浸酸过程中使用。
制革方法是本领域技术人员公知的，并已在如WO 94/06942、WO90/12118、美国专利号3,840,433、EP 505920、GB-A 2233665和美国专利号3,986,926中描述。
酶促脱脂
本发明的方法可用于任何常规用于制革的皮。具体而言，本发明的方法可用于绵羊皮、用于猪皮、用于牛皮或用于山羊皮。
依据本发明的酶促脱脂可在制革过程中pH 6-11的步骤中进行，或者作为独立的步骤或作为已有的皮革处理步骤的一部分。但是，所述方法优选地在pH 6-13进行的处理步骤中或之间进行以避免不必要且费时的pH调节。
本发明的方法在pH 6-13进行。所述方法优选地在大约pH 7-11的范围内进行。在其最优选的实施方式中，本发明的方法在约pH 8-11范围内的pH下进行。
本发明的酶促脱脂方法在一个或多个以下的步骤中进行：浸水、脱毛、浸灰、脱灰、软化和浸酸。在制革方法中，浸水步骤通常在pH 8-9范围内进行，脱毛在pH 9-13，脱灰在pH 8-13而软化在约pH 8。在浸酸步骤中，该步骤的初始pH约为8，而在该步骤的最后pH降至约为2。在优选的实施方式中，酶促脱脂在软化步骤或浸酸步骤的初始阶段进行。
在另一个优选的实施方式中，本发明的酶促脱脂方法作为独立步骤实施，其在浸水、脱毛、浸灰、脱灰、软化或浸酸已完成后的任何时间段进行。在浸酸步骤的最后，反应混合物的pH通常在pH 1-3范围内(pH 2左右)。当在浸酸步骤中实施本发明的方法时，在pH 6-8(如7)将会有1-1.5小时的时间段供酶发挥作用。在浸酸步骤中进行酶脱脂会有一些益处，原因是在前面的步骤中皮结构已经被其它化学品或酶处理打开，这使脂肪酶透入皮并发挥作用更加容易。另一方面，如果在前面的步骤将脂肪酶加入，益处是使脂肪酶发挥作用的时间更长且pH最佳，尽管脂肪酶的透入比在浸酸步骤加入要差。
本发明的方法可以在通常在制革方法中使用的温度下实施，即在约15℃至约65℃的范围内，或者甚至高至约75℃。根据需要处理的皮(还有其它事项)，温度优选地保持在约20℃至约40C的范围内(特别适用于绵羊皮)，或者在约30℃至40℃的范围内(特别适用于牛皮)。
皮的酶促处理
在依据本发明对皮酶促脱脂的方法中，为了水解皮中存在的脂肪，用脂肪酶在含水反应介质中处理皮。
用本发明的脂肪酶脱脂在没有表面活性剂时工作良好。当使用表面活性剂时，所述表面活性剂优选地为阴离子、非离子或两性类表面活性剂或者其混合物。而且，在脂肪分解处理的过程中可以存在有机溶剂，但是本发明的方法不需要有机溶剂。因此，出于对环境的考虑，反应混合物应当不使用有机溶剂。
反应时间很大程度上取决于所述方法的需要，脂肪酶在浸灰间的多数处理条件下基本上工作良好。出于操作的原因，反应时间预计在30分钟至24小时的范围内。反应时间优选地在0.5-16小时范围内，更优选地在0.5-4小时，最优选地在0.5-2小时。
当水解发生时，水解产物形成。这些反应产物应当从皮上除去。
可以通过从含水反应介质中分离皮来除去水解产物。优选地随后用水反复洗涤皮。在所述方法具有较高pH(如pH＞11)的情况下，通过脂肪酶形成的脂肪酸会自动发生皂化作用并因此产生皂质，不必加入更多外来表面活性剂即可帮助乳化脂肪和脂肪酸。因此此类脂肪酶的使用将最大限度地减少表面活性剂的使用。
在含水混合物中使用的除去水解产物的表面活性物质可以是任何常规的表面活性剂。但是无论作为单独的表面活性剂或者在混合物中，阴离子、非离子和两性类表面活性剂都是优选的。
脂肪酶
本发明使用的参考脂肪酶是来自疏棉状腐质霉菌株DSM 4109的野生型疏棉状腐质霉脂肪酶。它在EP 258068和EP 305216中描述并具有美国专利号5,869,438中SEQ ID NO：2的位置1-269所示的氨基酸序列。在本文中，所述参考脂肪酶为本发明SEQ ID NO：1的氨基酸1-269所示。
此疏棉状腐质霉脂肪酶的变体及其在洗涤剂中的使用已在WO00/60063中提到。
本发明的变体脂肪酶当然具有脂肪酶活性，并在制革脱脂中显示良好效果。与SEQ ID NO：1的1-269氨基酸序列相比，包含保守取代、插入、缺失、N-末端延伸和/或C-末端延伸的脂肪酶，以及脂肪酶片段能够从此分子用任何本领域公知的方法，例如位点定向诱变、随机诱变、共有衍生方法(consensus derivation processes)(EP 897985)和基因改组(WO 95/22625、WO96/00343)等制备。
本发明的变体脂肪酶所允许的氨基酸改变是性质不重要的(of a minornature)，其为不严重影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入，优选地为少量此类的取代或插入；小的缺失；小的氨基或羧基末端延伸等。在以上的语境中，术语“小的”独立地表示多至25个的氨基酸残基数。在优选的实施方式中，术语“小的”独立地表示多至24、23、22、21或多至20个氨基酸残基。在另一个优选的实施方式中，术语“小的”独立地表示多至19、18、17、16、15、14、13、12、11或多至10个氨基酸残基。在另外的优选实施方式中，术语“小的”独立地表示多至9、8、7、6、5、4、3、2或多至1个氨基酸残基。
在优选的实施方式中，变体脂肪酶通过在一个或多个以下位置的取代、插入和/或缺失从SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的亲本脂肪酶衍生而来：1、24、33、60、62、83、84、87、91、94、96、99、101、102、189、209、225、228、231、233、244、249、251、255、263、264、265、266、267、269、270、271、272。更优选地，所述脂肪酶变体包含一个或多个下列取代、插入和/或缺失：E1A；K24C；N33Q；V60G；D62A，E；S83T；R84W；E87K；G91A，D；N94K；D96L，S，W；E99K，N；N101S；D102G；T189G；R209P；G225P；V228I；T231R；N233R；T244R；Q249R；N251D；G255R；G263Q；L264A；I265T；G266S；T267A；L269N；270PCL，AGVF，PGLPFKRV，CP，RE，SPG，VVVP，LLASSGRGGHR，VTT，VLQ，TST，LRI，AGGFS；271G；272L。更优选地，所述脂肪酶变体包含在位置231和233的双取代；甚至更优选地，T231R和N233R的双取代。
最优选地，所述变体脂肪酶是下列变体之一(括号中的取代是任选的)：
| T231R+N233R |
| N94K+D96L+T231R+N233R+Q249R+270P+271G+272L |
| D96L+T231R+N233R |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R |
| (N33Q)+D96L+T231R+N233R+Q249R+270PGL |
| R209P+T231R+N233R |
| (N33Q)+E99N+N101S+T231R+N233R+Q249R+270PGL |
| K24C+(N33Q)+D96S+T231R+N233R+Q249R+270PCL |
| (N33Q)+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270PGL |
| E1A+(N33Q)+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270PGL |
| (N33Q)+G91A+E99K+G255R+T231R+N233R+Q249R+270PGL |
| (N33Q)+G91A+E99K+T231R+N233R+T244R+Q249R+270PGL |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R |
| E87K+G91D+D96L+G225P+T231R+N233R+Q249R+N251D |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270AGVF |
| G91A+E99K+T189G+T231R+N233R+Q249R |
| D102G+T231R+N233R+Q249R |
| T231R+N233R+Q249R+270AGVF |
| R209P+T231R+N233R |
| N33Q+N94K+D96L+T231R+N233R+Q249R+270PGLPFKRV |
| N33Q+N94K+D96L+T231R+N233R+Q249R |
| N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R |
| N33Q+D96S+V228I+T231R+N233R+Q249R |
| E1A+N33Q+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270PGLPFKRV |
| N33Q+S83T+E87K+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270PGLPFKRV |
| N33Q+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270PGLPFKRV |
| T231R+N233R+270CP |
| T231R+N233R+270RE |
| N33Q+E99N+N101S+T231R+N233R+Q249R+270PGLPFKRV |
| D62A+S83T+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R |
| E99N+N101S+T231R+N233R+Q249R |
| R84W+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270SPG |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270VVVP |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270LLASSGRGGHR |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270VTT |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270VLQ |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270TST |
| G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270LRI |
| V60G+D62E+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R |
| G91A+D96W+E99K+T231R+N233R+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270AGGFS |
本文使用的定义突变的命名法基本上如WO 92/05249所述。因此，T231R表示在位置231T被R取代。PGL或270P+271G+272L表示在C末端附加PGL的加入肽(L269)。
本发明的脂肪酶可以按在脱脂方法中通常使用的浓度使用。所述脂肪酶可以以每千克皮10到600KLU的量加入，优选地每千克皮50到400KLU，更优选地每千克皮100到300KLU。
皮革脱脂组合物
在脱脂中本发明的脂肪酶可与表面活性剂共同使用。另外，所述组合物可包含另一种酶和其它在皮革工业中常规使用的组分。
依据本发明的皮革脱脂组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或颗粒状形式。
加入皮革脱脂组合物中的本发明的脂肪酶，或者任选地其它酶，通常以酶蛋白占组合物重量的0.00001％至3％的水平加入，优选地以酶蛋白占组合物重量的0.001％至2％的水平加入，更优选地以酶蛋白占组合物重量的0.01％至1％的水平加入，甚至更优选地以酶蛋白占组合物重量的0.1％至1％的水平加入。
表面活性剂体系
表面活性剂体系可包含非离子、阴离子、阳离子、两性和/或兼性离子表面活性剂。如上所述，本发明的脂肪酶变体特别适用于包含阴离子和非离子表面活性剂组合的皮革脱脂，其阴离子表面活性剂在重量上占0-40％而非离子在重量上占60-100％，特别是0-30％的阴离子表面活性剂和70-100％的非离子。如进一步描述的，一些本发明优选的脂肪酶也适用于包含20-30％阴离子和70-80％非离子表面活性剂的皮革脱脂。
表面活性剂通常以组合物重量的0.1％至60％的水平存在，如按重量计1％至40％，特别是3％至30％，优选地10-30％，更优选地约12％至约25％。下面描述一些表面活性剂的实例。
阴离子表面活性剂
优选的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐、烷基乙氧基硫酸盐、直链烷基苯磺酸盐和这些的混合物。
所述烷基硫酸盐表面活性剂是分子式为ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选地为C10-C24烃基，优选地为具有C10-C20烷基组分的烷基或羟烷基，更优选地为C12-C18烷基或羟烷基，而M为H或阳离子，如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)或铵或取代的铵。
烷基苯磺酸盐是合适的，特别是线性(直链)烷基苯磺酸盐(linear(straight-chain)alkyl benzene sulfonate，LAS)，其中烷基基团优选地包含10至18个碳原子。
合适的阴离子表面活性剂包括为水溶性盐或酸的烷基烷氧化硫酸盐，分子式为RO(A)mSO3M，其中R为未取代的C10-C-24烷基或具有C10-C-24烷基组分的羟烷基基团，优选地为C12-C20烷基或羟烷基，更优选地为C12-C18烷基或羟烷基，A为乙氧基或丙氧基单元，m大于0，通常介于约0.5至约6之间，更优选地介于约0.5至约3之间，而M为H或阳离子，例如可以是金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代的铵阳离子。烷基乙氧基硫酸盐以及烷基丙氧基硫酸盐是本文预期的。取代的铵阳离子的特定实例包括甲基-、二甲基-、三甲基-铵阳离子和季铵阳离子例如四甲基铵和二甲基哌啶阳离子和那些从烷基胺衍生而来的阳离子，例如乙基胺、二乙基胺、三乙基胺及它们的混合物等。
其它阴离子表面活性剂包括脂肪酸的盐(salts of soap)(包括，例如钠、钾、铵和取代的铵盐，例如单、二和三乙醇胺盐)、C8-C22伯或仲烷基磺酸盐、C8-C24烯烃磺酸盐、通过磺化碱土金属柠檬酸盐的热解产物制备的磺化聚羧酸。
非离子表面活性剂
表面活性剂可包含烷基酚的聚环氧烷烃(如聚环氧乙烷)缩合物。所述烷基基团可包括直链或支链形式的约6至约14个碳原子。所述环氧乙烷可以以相当于每摩尔烷基酚约2至约25摩尔的量存在。
所述表面活性剂也可以包含伯和仲脂族醇与约1至约25摩尔的环氧乙烷的缩合产物。所述脂族醇的烷基链可以是直链或支链，且通常包含约8至约22个碳原子。
另外，所述非离子表面活性剂可包含烷基酚的聚环氧乙烷缩合物、伯和仲脂族醇与约1至约25摩尔的环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖及其混合物。最优选的是具有3至15个乙氧基基团的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2至10个乙氧基基团的C8-C18醇乙氧基化物(优选地平均C10)及其混合物。
优选的非离子表面活性剂为醇乙氧基化物、醇酚乙氧基化物、多羟基脂肪酸酰胺、烷基多聚葡萄糖苷和这些的混合物。非离子表面活性剂的可以通过商业方法获得的实例为OD、
ON60或
25-7。
脂肪分解活性
脂肪分解活性可以用三丁酸甘油酯(tributyrine)作为底物来测定。此方法基于酶对丁酸甘油酯的水解，碱消耗显示为时间的函数。
一个脂肪酶单位(Lipase Unit，LU)定义为在标准条件下(即30℃；pH 7.0；阿拉伯树胶作为乳化剂而三丁酸甘油酯作为底物)每分钟释放1微摩尔可滴定的丁酸的酶量。
实施例
本发明参考下列实施例进一步阐释，其并非意在以任何形式限制本发明主张权利的范围。
实施例1：绵羊皮的酶促脱脂
此实施例示范了应用于浸酸的英格兰驯养绵羊皮(England domesticsheep skin)的本发明的方法。用脂肪酶变体对所述皮进行脂肪酶处理，该变体在SEQ ID NO：1中有两个取代T231R+N233R(根据WO 00/60063获得)。
脂肪提取和脂肪含量测试：在完成脱脂试验后，收集皮块并用水清洗2分钟，然后于烘箱内40℃干燥过夜。将干燥的皮称重并在SOXTECHTM设备(可从FOSS公司获得)中用CHCl3提取，浸泡50分钟，在120℃提取180分钟，溶剂回收时间为50分钟。计脂肪含量为提取之后的重量损失。
脂肪酸和甘油三酯的HPLC分析：使用包括四溶剂梯度体系和LiChrospher 100RP-8封端(5um)柱(Merck)的Waters 2690分离组件。使用包括HCN、0.1％AcOH水溶液和CH2Cl2/HCN的三梯度溶剂洗脱来分离FA(脂肪酸，fatty acids)和TG(甘油三酯，Triglycerides)。使用0.2-1.0mg/ml的油酸、棕榈酸、硬脂酸和三油酸酯标准品计算脂肪酸的形成和CHCl3提取物中的TG残留。图1-4给出了HPLC图。
三油酸酯残留：三油酸酯是在每个酯键含有三个相同油酸的甘油三酯。由于它是动物皮中最广泛存在的TG，因此它可用作检查脱脂程度的指标。
棕榈酸：它是存在于动物皮中的常见(popular)脂肪酸之一，由于油酸具有更低的熔点，它可以在脱脂和后续处理过程中溶入洗液，因此留在绵羊皮中的多数残留脂肪酸是高熔点脂肪酸，而棕榈酸是其中之一。测定它以指示绵羊皮中脂肪酸的形成。
脱脂步骤：将经过浸酸的原料英格兰驯养绵羊皮(Raw material-pickledNew Zealand sheep skin)从低脂肪位置切1*1cm，从高脂肪位置(肩部、颈部和臀部)切0.5*0.5cm的小块，每LOM烧杯中共40g混合物，向LOM烧杯中加入四个钢球增加机械强度。表1显示了脱脂条件。
表1
| 处理 | 皮革(g) | 缓冲液(ml) | pH | 温度(℃) | 时间(min) |
| 脱脂 | 40g | 50ml | 7 | 30 | 60 |
| 皂化 | 12 | 30 | 60 | ||
| 排水 | |||||
| 流水洗涤 | 2 |
| 皮块 |
缓冲液包含8wt％NaCl和4wt％NaHCO3。
该实施例进行五组平行试验(参见表2的组1-5)。为每个对比试验在脱脂步骤中根据表2将表面活性剂或脂肪酶加入缓冲液。图1-4相应地显示了组1、2、3和5的HPLC实验图。
其中，
OD 4％用于工业标准脱脂方法。空白仅是缓冲液。未处理样品是作为对比的没有任何脱脂处理的原始浸酸皮。
表2
脂肪％根据CHCl3提取的重量损失计算，它可以是FA或TG或DG(diglycerides，甘油二酯)或MG(monoglycerides，单甘油酯)或它们的组合。脂肪酶处理之后皮中残留的脂肪％为6.7％(组2)或8.2％(组3)，而表面活性剂Eusapon OD 4％处理之后残留的脂肪％为大于14％。其显示本发明脂肪酶的脱脂效果比表面活性剂的效果好很多。
提取物中的残留三油酸酯和棕榈酸含量根据HPLC测定的标准曲线计算。在脂肪酶处理样品中没有显示TG和三油酸酯的HPLC峰(图2和3)而由Eusapon处理的提取物中残留三油酸酯高达15.2mg/ml(表2)。这些结果意味着100-200KLU/kg脂肪酶在测试条件下完全降解了绵羊皮中的所有TG，因此脂肪酶处理的样品中测得的脂肪％可能是脂肪酸混合物或蛋白质水解物或皂质。
从HPLC图还可以看出，200KLU脂肪酶/kg皮的处理没有脂肪酸峰，这意味着脂肪酸可能经皂化作用转化为了皂质，其可以留在皮内或已转移出皮。当使用100KLU脂肪酶/kg皮时，由于形成脂肪酸的速率比使用200KLU脂肪酶时低，皂化作用不完全，只检测到一个脂肪酸峰，峰的位置与棕榈酸和油酸保留时间相同，由于油酸具有更低熔点，它比棕榈酸更容易转化为液体并被洗脱。因此怀疑此峰检测到的大多数脂肪酸是棕榈酸，其为16.4mg/ml(表2)。
实施例2.脂肪酶对浸酸的新西兰绵羊皮的作用的对比
用与实施例1相同的方法准备绵羊皮。在以下条件下进行试验。
脱脂步骤：如实施例1，准备经过浸酸的原料新西兰绵羊皮。脱脂条件为如下表3所示。
表3
| 处理 | 皮革(g) | 缓冲液(ml) | pH | 温度(℃) | 时间(min) |
| 脱脂 | 40g | 50ml | 7 | 30 | 60 |
| 排水 | |||||
| 流水洗涤皮块 | 2 |
缓冲液包含8wt％NaCl和4wt％NaHCO3。
本实施例以四组试验进行。在每个对比试验的脱脂步骤中向缓冲液中根据表3加入两种脂肪酶。空白只是缓冲液。未处理的是作为对照使用的、没有任何脱脂处理的原始浸酸皮。
表4
组2中使用的参考脂肪酶：如本申请SEQ ID NO：1的亲本疏棉状腐质霉脂肪酶。
组3中使用的脂肪酶：在SEQ ID NO：1中有两个取代T231R+N233R的脂肪酶变体。
从表4的结果可以观察到，当体系中没有表面活性剂时，脂肪酶在脱脂时表现不一。组3中变体脂肪酶的脂肪残留是13.6％，比参考脂肪酶的脂肪残留(其与空白几乎相同，17.4对17.9)低很多。
实施例3：浸灰条件下表面活性剂和脂肪酶的协同作用
此实施例示范了用于经浸灰的绵羊皮(可从Shanghai Oujiayu Trading Co.，Ltd.PRC获得)的脱脂方法。此实施例和实施例4使用的脂肪酶是SEQ ID NO：1中具有两个取代T231R+N233R的脂肪酶变体(根据WO 00/60063获得)。
脱脂步骤：如实施例1准备经过浸灰的原料绵羊皮。脱脂条件为下表5所示。此实施例使用的缓冲液是水以模拟浸灰条件。
表5
| 处理 | 皮革(g) | 缓冲液(ml) | pH | 温度(℃) | 时间(min) |
| 脱脂 | 50g | 100ml | 12 | 30 | 60 |
| 排水 | |||||
| 流水洗涤皮块 | 2 |
本实施例以八组试验进行。根据表6按照每个对比试验脱脂步骤中的皮重量在缓冲溶液中加入脂肪酶和/或表面活性剂
OD。空白只是缓冲液。
表6
T1代表表面活性剂
OD，L代表脂肪酶。
*脂肪酶浓度为25mg/ml。
**Eusapon OD浓度为250mg/ml。
根据实施例1中的方法进行脂肪提取测试，除了在此实施例中使用己烷而非CHCl3之外。
使用HPLC分析来分析残留脂肪组成，但仅用代表性的峰为甘油三酯或游离脂肪酸含量定量。
结果
图5清晰地显示，仅用分别为0.5％和1％剂量的T1没有显著量的脂肪从皮中除去。当与0.1％脂肪酶共同使用时，用
OD可得到剂量依赖的脂肪减少和FA释放(在图5中FA代表脂肪酸)，当使用2％
OD剂量时，减少变得明显，在HPLC层析仪上仅观察到少量残留FA。该结果指示脂肪酶与表面活性剂之间明显的协同脱脂作用，特别是在较高剂量时。
实施例4：脱灰条件下表面活性剂和脂肪酶的协同作用
脱脂步骤：如实施例1准备经浸灰的原料绵羊皮。脱脂条件为下表7所示。此实施例使用的缓冲液是1.5％(NH4)2SO4以模拟脱灰条件。
表7
| 处理 | 皮革(g) | 缓冲液(ml) | pH | 温度(℃) | 时间(min) |
| 脱脂 | 50g | 100ml | 8 | 30 | 120 |
| 排水 | |||||
| 流水洗涤皮块 | 2 |
本实施例以八组试验进行。根据表8按照每个对比试验脱脂步骤中的皮重量在缓冲液中加入脂肪酶和/或表面活性剂。空白只是缓冲液。
非离子表面活性剂是
ON60和
25-7，而阴离子表面活性剂是平均烃链长度11的短链LAS，其中25％为LAS，25％为
25-7而50％为ON60。
表8
| 组号 | 处理 | 皮 | 1.5％(NH4)2SO4 | 脂肪酶* | T2** |
| 1 | 空白 | 50g | 100ml | - | - |
| 2 | 5％T2 | 50g | 99ml | - | 10ml |
| 3 | 10％T2 | 50g | 90ml | - | 20ml |
| 4 | 0.1％L | 50g | 80ml | 1ml | - |
| 5 | 0.1％L+0.5％T2 | 50g | 98ml | 1ml | 1ml |
| 6 | 0.1％L+1％T2 | 50g | 97ml | 1ml | 2ml |
| 7 | 0.1％L+2％T2 | 50g | 95ml | 1ml | 4ml |
| 8 | 0.1％L+5％T2 | 50g | 89ml | 1ml | 10ml |
T2代表表面活性剂，其为25％LAS、25％
25-7和50％ON60的混合物；L代表脂肪酶。
*脂肪酶浓度为50mg/ml。
**T2浓度为250mg/ml。
如实施例3进行脂肪提取测试和HPLC分析。
结果
图6显示，T2和脂肪酶在脂肪水解上具有协同效果，因为T2和脂肪酶共同产生比它们任何一个单独使用更多的FA和更少的TG。在更高的T2提供下，更好的FA去除变得明显。T2可能具有非常好的FA去除能力。如图6所示，0.1％脂肪酶与5％T2组合比单独使用10％T2产生了更低的脂肪含量和稍高的FA，其阐释了它们之间的协同脱脂效果。
Claims (12)
1.用于皮的酶促脱脂的方法，该方法包括用脂肪酶变体处理皮，所述脂肪酶变体是对应脂肪酶SEQ ID NO：1的氨基酸1-269的T231R和N233R的取代。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法用于绵羊皮、猪皮、牛皮或山羊皮。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述脂肪酶处理在水介质中进行，任选地有表面活性剂存在。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法在一个或多个以下后续步骤中进行：浸水、脱毛、浸灰、脱灰、软化和浸酸。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法在浸水、脱毛、浸灰、脱灰、软化和浸酸之后作为单独步骤进行。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法在pH 6至13的范围内进行。
7.根据权利要求6的方法，其中所述方法在pH 7至11的范围内进行。
8.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法在温度15至65℃的范围内进行。
9.根据权利要求8的方法，其中所述方法在温度20至40℃的范围内进行。
10.根据权利要求1或2的方法，其中所述脂肪酶以10至600KLU每千克皮的量加入。
11.根据权利要求10的方法，其中所述脂肪酶以50至400KLU每千克皮的量加入。
12.根据权利要求11的方法，其中所述脂肪酶以100至300KLU每千克皮的量加入。
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