CN109321556B - 脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制革生产中的脱毛酶，特别是指脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用。脱毛酶制剂的制备是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836接种于发酵培养基中发酵，当OD600值为0.5‑1时加入诱导剂IPTG，转速调至250‑300转/分钟的条件下培养40‑44小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；将制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。本发明解决了常规酶脱毛需与其它种类酶制剂或化学助剂协同脱毛，且脱毛时间长，控制不严仍旧容易损伤粒面的缺陷。具有脱毛效果与传统灰碱法脱毛效果相当，其成革的物理性能优于灰碱法，且成革的手感柔软等优点。

Description

脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用
技术领域
本发明涉及制革生产中的脱毛酶，特别是指脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用。
背景技术
长期以来灰碱法在制革脱毛工艺中因脱毛效果好、工艺简单而占主导地位，但毛被和表皮被硫化钠溶解，产生的废水、废渣、有毒气体对环境污染严重，污染物的排放量达制革总污染物的40％。市场需求促进制革业的发展，同时也要求其发展建立在节能减排、低碳环保的基础上。蛋白酶在清洁化脱毛工艺中有极大应用前景，与传统灰减法相比无毒、无害，不仅可减少硫化物污染，减少废水中的COD和BOD含量，而且还可回收完整的动物毛发，增加经济效益。现在环保问题已经成为世界性的重要问题，我国近些年对环保的力度也越来越大。
近年关于制革脱毛清洁工艺主要有酶法脱毛、在灰碱法基础上的保毛脱毛、有机胺脱毛、过氧化氢氧脱毛和其他脱毛方法。其中酶脱毛法是使用生物制剂—酶进行脱毛的方法，酶作用于皮面可以破坏表皮生发层和毛鞘细胞组织，削弱毛、表皮和真皮粒面层的联系。较其他清洁工艺而言，酶法脱毛条件温和，真皮中角蛋白水解少，毛与表皮容易分离、回收，是目前为止最有可能代替灰碱法实现工业化脱毛的方法。目前国内所使用的制革脱毛用的酶制剂成份复杂，如AS1.398枯草杆菌中性蛋白酶、166放线菌中性蛋白酶、209短小芽孢杆菌碱性蛋白酶等均是多种蛋白组成的粗酶混合物。在实际应用中对脱毛工艺的技术要求高，皮粒面容易造成伤害，甚至烂皮，还有小毛脱不净的情况。为了解酶系中各成分的作用，李志强等首先对AS1.398、166、209等酶制剂中酪蛋白水解酶和胶原纤维水解酶组分进行了分离，并就这两种组分对脱毛的作用进行了研究。结果发现，在现有脱毛温度条件下，脱毛蛋白酶的组分中酶脱毛具有主要贡献的是酪蛋白酶组分，而胶原酶不仅不会对脱毛产生贡献，反而是造成成革粒面松面、烂面的原因(李志强.酶法脱毛机理研究.四川大学博士学位论文，2000；李志强，等.枯草杆菌AS1.398蛋白酶中胶原水解酶的研究.皮革科学与工程，1991,1(3):16-20)。因此，去除或者抑制胶原蛋白酶是向安全高效的酶脱毛跨出最为关键的一步。程海明等的研究是在35℃-42℃下，先加入胶原酶抑制剂对浸水、去肉后的牛皮进行预处理，然后按常规加入脱毛酶制剂进行3-9小时脱毛处理即可按常规进行后续的机械去毛、浸灰、脱灰、软化、浸酸、鞣制工序(程海明，等.CN201510075480.2，一种用于消除牛皮皮革粒面伤害的酶脱毛方法)。虽然抑制了胶原酶的活性，皮粒面没有受到损伤，但制革工人操作比较粗放，此种脱毛方式在实际应用中不好掌握，且未见有推广应用。
现有的酶脱毛工艺是复合其它酶制剂增强综合脱毛效率，降低蛋白酶对皮子的损伤，如：公开号CN101235422A的专利文献中公开的动物皮复合酶脱毛剂及其应用及公开号CN106048104A的专利文献中公开的制革用碱性复合脱毛酶制剂及其应用工艺；或者在脱毛时添加化学助剂，抑制脱毛酶中胶原蛋白酶的活力，如：公开号为CN103060487A中公开的减小皮革损伤的脱毛酶制剂，未有使用单一酶制剂并不添加助剂进行脱毛工艺的技术。
申请人于申请号为201711335714.8中的专利文献中公开了利用中性蛋白酶基因转化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836，经申请人实验证实，将枯草芽孢杆菌工程菌接种于基础发酵培养基进行初步发酵，在未对培养基及发酵条件进行充分优化的条件下，酶活比对照提高了33％-53％。
目前酶脱毛工艺尚无官方的标准评价体系，评价其工艺优劣主要靠企业操作工人的经验判断脱毛是否干净、粒面是否有损伤、边缘是否松面等，但依靠经验判断有一定的局限性，研究工作中以脱毛后的粒面显微成像，及者成品革的感官评价和物理性能进行评价。
发明内容
本发明的目的在于提供脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用，所制备的脱毛酶制剂。
本发明的整体技术构思是：
脱毛酶制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、发酵：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按照质量比为2％-4％的接种量接种于含10μg/ml，装液量为2.5L-3.5L的2YT发酵培养基中，在温度为35-37℃、转速为180-200转/分钟的条件下发酵，当OD600值为0.5-1时加入0.5‰-1‰的诱导剂IPTG，转速调至250-300转/分钟的条件下培养40-44小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；
B、脱毛酶液体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用。
本发明的具体技术特征还有：
脱毛酶制剂可以支撑液体制剂，也可根据需要支撑固体制剂，制成固体酶制剂的优选技术方案是，还包括一步骤C，该步骤的工艺条件如下：
C、脱毛酶固体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，将离心收集的上清液添加0.5％-2％的元明粉后在出风温度50-60℃条件下真空喷雾干燥，制成脱毛酶固体制剂。
为便于适于工业化生产，优选的技术实施方式是，所述的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis CGMCC No.14836接入发酵培养基之前进行扩大培养。
所述的扩大培养包括菌种活化、摇瓶菌种的制备。
所述的菌种活化是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按2％-4％接种量接种于含10μg/ml Cm的5ml LB液体培养基中，在温度为35-37℃、转速为160-180转/分钟的条件下培养6-10小时。
摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于含10μg/ml Cm的50ml-100ml 2YT培养基中，在温度为35-37℃、转速为160-180转/分钟的条件下培养8-12小时。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，包括如下工艺步骤：
a、干皮浸水
将干皮洗净，除去毛皮中杂物，加0.2％-0.4％的浸水酶，pH＝8-10，室温浸泡至皮块成鲜皮状；
b、去肉
将步骤a所制备的浸水后的牛皮去除肉面脂肪；
c、除脂
将步骤b中去除肉面脂肪的皮块，加0.4％-0.6％的碱性脂肪酶和1％-2％的Tween-80，在pH＝7-9的条件下除脂；
d、有温有浴转鼓酶脱毛
将步骤c所制备的除脂后的皮块在固液比＝1:3-5、温度为33℃-35℃、脱毛酶制剂用量80U/ml-120U/ml、转速7-9转/分钟的条件下转鼓脱毛3-6小时。
为验证本发明制备的酶脱毛助剂的相应效果，申请人进行了如下实验：
一、酶法与灰碱法脱毛黄牛皮蓝湿革粒面比较
1、试验场所：河北省微生物研究所酶工程实验室；
2、实验人员：秦梦；
3、实验过程：
(1)选用灰碱法、1398酶脱毛以及本发明所制备的脱毛酶制剂对步骤(1)所制备蓝湿革的脱毛；
(2)蓝湿革的制备
按照常规工艺进行浸灰，片皮，去灰中和，浸酸和鞣制，其中去灰中和后的软化工艺采取皮重0.7％-0.8％的欧欧酶在34℃的条件下处理0.5-1小时。
4、效果观察
(1)观察方式：用体视镜进行观察并记录；
(2)试验结果：从脱毛效果来说，酶法脱毛可达到与灰碱法脱毛相当的效果，并且皮粒面并不像灰碱法那样呈现黄褐色，而是较鲜亮的皮肤色；肉面也不像灰碱法那样呈现浅蓝色，而是浅黄色。从脱毛后的皮张柔软度来说，酶法脱毛后的皮张更柔软，而灰碱法脱毛后的皮张硬度较大。而不同工艺处理的蓝湿革粒面情况见图1，其中灰碱法与本发明的脱毛酶制剂脱毛的毛孔边缘清晰，粒面光滑；而1398酶脱毛的毛孔边缘不清晰，粒面粘。
二、不同酶脱毛工艺脱毛废液中羟脯氨酸值比较
1、试验场所：河北省微生物研究所酶工程室；
2、试验人员：高沛汝；
3、试验内容及方法：酶解液中HYP用氯胺-T比色法测定；
3、试验结果
1398蛋白酶曾作为脱毛酶进行推广，但由于其酶系复杂，含有水解皮胶原的胶原蛋白酶，稍有操作不当就会造成松面、烂皮等情况，影响成革质量。选取本发明的脱毛酶制剂，1398蛋白酶，胶原蛋白酶Ⅱ型三种蛋白酶按照终浓度100-300U/mL的比例有温有浴处理黄牛皮，以空白作为对照，在30℃-35℃条件下处理5-10小时。取液体样本，经过水解后测定羟脯氨酸含量，由表1可知，胶原蛋白酶因对皮胶原的专一性水解，反应终止浴液中HYP含量最高，同时1398蛋白酶因酶系中含有胶原酶组分HYP含量也明显高于本发明的脱毛酶制剂。本发明的脱毛酶制剂的浴液中有少量HYP，可能是由于本发明的脱毛酶制剂的非专一性水解导致。
表1不同酶处理皮组织后浴液中羟脯氨酸(HYP)含量(μg/mL)
处理 HYP含量
水+皮 ＜0.1
本发明的脱毛酶制剂+皮 9.24
1398+皮 320.51
胶原蛋白酶+皮 1308.61
三、成品革理化性能检测
在国家皮革制品质量监督检验中心(北京)进行灰碱法、酶法脱毛制革的样品进行对比检测。
按照箱包革常规工艺对灰碱法与本发明的脱毛酶制剂脱毛的黄牛皮蓝湿革进行成革加工，并对加工后的成革进行理化性能检测，检测结果见表2，酶法脱毛和灰碱法脱毛制成的成品革物理性能也均达标，其中，撕裂力指标酶法脱毛要优于灰碱法脱毛。由此说明，酶法脱毛制成的成品革可以达到与灰碱法相当的效果，作为一种清洁化的制革工艺，可以取代灰碱法脱毛。
表2皮革理化性能检测结果
Figure GDA0001907220690000051
Figure GDA0001907220690000061
结论
1、本发明所制备的脱毛酶制剂解决了常规酶脱毛需与其它种类酶制剂或化学助剂协同脱毛，且脱毛时间长，控制不严仍旧容易损伤粒面的缺陷。本发明所制备的脱毛酶制剂属于中性蛋白酶，其对毛根鞘和毛根、毛乳头和毛袋之间的连接，对皮胶原的水解程度则相对较弱，因而不会造成成革粒面损伤以致烂皮的现象。
2、本发明所制备的脱毛酶制剂脱毛效果与传统灰碱法脱毛效果相当，其成革的物理性能优于灰碱法，且成革的手感柔软，可以作为潜在的清洁化手段替代灰碱法脱毛制革。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明所制备的脱毛酶制剂属于中性蛋白酶，解决了常规酶脱毛需与其它种类酶制剂或化学助剂协同脱毛，且脱毛时间长，控制不严仍旧容易损伤粒面的缺陷，对皮胶原的水解程度则相对较弱，因而不会造成成革粒面损伤以致烂皮的现象。
2、此酶制剂制革的脱毛液中胶原蛋白的指标物质羟脯氨酸值显著低于1398蛋白酶，且黄牛皮蓝湿革的粒面状态及其成革的物理性能优于灰碱法，且成革的手感柔软，可以作为潜在的清洁化手段替代灰碱法脱毛制革。
附图说明
图1是采用不同脱毛工艺处理后的蓝湿革粒面比较。
图1A是采用灰碱法脱毛处理后的蓝湿革粒面。
图1B是采用本发明所制备的脱毛酶制剂脱毛处理后的蓝湿革粒面。
图1C是采用1398酶法脱毛处理后的蓝湿革粒面。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
脱毛酶制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、发酵：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按照质量比为2％的接种量接种于含10μg/ml，装液量为2.5L的2YT发酵培养基中，在温度为35℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，当OD600值为0.5时加入0.5‰的诱导剂IPTG，转速调至250转/分钟的条件下培养40小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；
B、脱毛酶液体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用。
脱毛酶制剂可以支撑液体制剂，也可根据需要支撑固体制剂，制成固体酶制剂的技术方案是，还包括一步骤C，该步骤的工艺条件如下：
C、脱毛酶固体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，将离心收集的上清液添加0.5％的元明粉后在出风温度50℃条件下真空喷雾干燥，制成脱毛酶固体制剂。
所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836接入发酵培养基之前进行扩大培养。
所述的扩大培养包括菌种活化、摇瓶菌种的制备。
所述的菌种活化是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按2％接种量接种于含10μg/ml Cm的5ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160转/分钟的条件下培养6小时。
摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于含10μg/ml Cm的50ml2YT培养基中，在温度为35℃、转速为160转/分钟的条件下培养8小时。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，包括如下工艺步骤：
a、干皮浸水
将干皮洗净，除去毛皮中杂物，加0.2％的浸水酶，pH＝8，室温浸泡至皮块成鲜皮状；
b、去肉
将步骤a所制备的浸水后的牛皮去除肉面脂肪；
c、除脂
将步骤b中去除肉面脂肪的皮块，加0.4％的碱性脂肪酶和1％的Tween-80，在pH＝7的条件下除脂；
d、有温有浴转鼓酶脱毛
将步骤c所制备的除脂后的皮块在固液比＝1:3、温度为33℃、脱毛酶制剂用量80U/ml、转速7转/分钟的条件下转鼓脱毛3小时。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
脱毛酶制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、发酵：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按照质量比为4％的接种量接种于含10μg/ml，装液量为3.5L的2YT发酵培养基中，在温度为37℃、转速为200转/分钟的条件下发酵，当OD600值为1时加入1‰的诱导剂IPTG，转速调至300转/分钟的条件下培养44小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；
B、脱毛酶液体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。
脱毛酶制剂可以支撑液体制剂，也可根据需要支撑固体制剂，制成固体酶制剂的优选技术方案是，还包括一步骤C，该步骤的工艺条件如下：
C、脱毛酶固体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，将离心收集的上清液添加2％的元明粉后在出风温度-60℃条件下真空喷雾干燥，制成脱毛酶固体制剂。
菌种活化是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按2％-4％接种量接种于含10μg/ml Cm的5ml LB液体培养基中，在温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下培养10小时。
摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于含10μg/ml Cm的100ml 2YT培养基中，在温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下培养12小时。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，包括如下工艺步骤：
a、干皮浸水
将干皮洗净，除去毛皮中杂物，加-0.4％的浸水酶，pH＝10，室温浸泡至皮块成鲜皮状；
b、去肉
将步骤a所制备的浸水后的牛皮去除肉面脂肪；
c、除脂
将步骤b中去除肉面脂肪的皮块，加0.6％的碱性脂肪酶和2％的Tween-80，在pH＝9的条件下除脂；
d、有温有浴转鼓酶脱毛
将步骤c所制备的除脂后的皮块在固液比＝1:5、温度为35℃、脱毛酶制剂用量120U/ml、转速9转/分钟的条件下转鼓脱毛6小时。
实施例3
脱毛酶制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、发酵：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按照质量比为2％-4％的接种量接种于含10μg/ml，装液量为3L的2YT发酵培养基中，在温度为36℃、转速为190转/分钟的条件下发酵，当OD600值为0.8时加入0.8‰的诱导剂IPTG，转速调至280转/分钟的条件下培养42小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；
B、脱毛酶液体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用。
脱毛酶制剂可以支撑液体制剂，也可根据需要支撑固体制剂，制成固体酶制剂的优选技术方案是，还包括一步骤C，该步骤的工艺条件如下：
C、脱毛酶固体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，将离心收集的上清液添加1.42％的元明粉后在出风温度55℃条件下真空喷雾干燥，制成脱毛酶固体制剂。
菌种活化是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按3％接种量接种于含10μg/ml Cm的5ml LB液体培养基中，在温度为36℃、转速为170转/分钟的条件下培养8小时。
摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于含10μg/ml Cm的80ml 2YT培养基中，在温度为36℃、转速为170转/分钟的条件下培养10小时。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，包括如下工艺步骤：
a、干皮浸水
将干皮洗净，除去毛皮中杂物，加0.3％的浸水酶，pH＝9，室温浸泡至皮块成鲜皮状；
b、去肉
将步骤a所制备的浸水后的牛皮去除肉面脂肪；
c、除脂
将步骤b中去除肉面脂肪的皮块，加0.5％的碱性脂肪酶和1.5％的Tween-80，在pH＝8的条件下除脂；
d、有温有浴转鼓酶脱毛
将步骤c所制备的除脂后的皮块在固液比＝1:4、温度为34℃、脱毛酶制剂用量100U/ml、转速8转/分钟的条件下转鼓脱毛5小时。
实施例4
脱毛酶制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、发酵：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按照质量比为4％的接种量接种于含10μg/ml，装液量为2.5L的2YT发酵培养基中，在温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，当OD600值为0.5时加入0.5‰的诱导剂IPTG，转速调至300转/分钟的条件下培养43小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；
B、脱毛酶液体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。
菌种活化是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按4％接种量接种于含10μg/ml Cm的5ml LB液体培养基中，在温度为35-37℃、转速为160转/分钟的条件下培养6小时。
摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于含10μg/ml Cm的50ml 2YT培养基中，在温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下培养8小时。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，包括如下工艺步骤：
a、干皮浸水
将干皮洗净，除去毛皮中杂物，加0.2％的浸水酶，pH＝8，室温浸泡至皮块成鲜皮状；
b、去肉
将步骤a所制备的浸水后的牛皮去除肉面脂肪；
c、除脂
将步骤b中去除肉面脂肪的皮块，加0.4％的碱性脂肪酶和1％的Tween-80，在pH＝8的条件下除脂；
d、有温有浴转鼓酶脱毛
将步骤c所制备的除脂后的皮块在固液比＝1:5、温度为33℃、脱毛酶制剂用量80U/ml、转速9转/分钟的条件下转鼓脱毛6小时。
实施例5
脱毛酶制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、发酵：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按照质量比为4％的接种量接种于含10μg/ml，装液量为3.5L的2YT发酵培养基中，在温度为35℃、转速为200转/分钟的条件下发酵，当OD600值为1时加入1‰的诱导剂IPTG，转速调至300转/分钟的条件下培养40小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；
B、脱毛酶液体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用。
脱毛酶制剂可以支撑液体制剂，也可根据需要支撑固体制剂，制成固体酶制剂的优选技术方案是，还包括一步骤C，该步骤的工艺条件如下：
C、脱毛酶固体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，将离心收集的上清液添加0.5％的元明粉后在出风温度60℃条件下真空喷雾干燥，制成脱毛酶固体制剂。
所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836接入发酵培养基之前进行扩大培养。
所述的扩大培养包括菌种活化、摇瓶菌种的制备。
所述的菌种活化是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按2％接种量接种于含10μg/ml Cm的5ml LB液体培养基中，在温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下培养6小时。
摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于含10μg/ml Cm的100ml 2YT培养基中，在温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下培养8小时。
脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，包括如下工艺步骤：
a、干皮浸水
将干皮洗净，除去毛皮中杂物，加0.3％的浸水酶，pH＝8，室温浸泡至皮块成鲜皮状；
b、去肉
将步骤a所制备的浸水后的牛皮去除肉面脂肪；
c、除脂
将步骤b中去除肉面脂肪的皮块，加0.5％的碱性脂肪酶和2％的Tween-80，在pH＝9的条件下除脂；
d、有温有浴转鼓酶脱毛
将步骤c所制备的除脂后的皮块在固液比＝1:4、温度为35℃、脱毛酶制剂用量120U/ml、转速9转/分钟的条件下转鼓脱毛3小时。

Claims (7)

1.脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，其特征在于脱毛酶制剂的制备方法包括如下工艺步骤：
A、发酵：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按照质量比为2％-4％的接种量接种于含10μg/ml Cm，装液量为2.5L-3.5L的2YT发酵培养基中，在温度为35-37℃、转速为180-200转/分钟的条件下发酵，当OD600值为0.5-1时加入0.5‰-1‰的诱导剂IPTG，转速调至250-300转/分钟的条件下培养40-44小时后终止发酵制成含有脱毛酶的发酵液；
B、脱毛酶液体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，加入防腐剂制成脱毛酶液体制剂。
2.根据权利要求1所述的脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，其特征在于还包括一步骤C，该步骤的工艺条件如下：
C、脱毛酶固体制剂的制备：将步骤A中制成的含有脱毛酶的发酵液离心收集上清液，将离心收集的上清液添加0.5％-2％的元明粉后在出风温度50-60℃条件下真空喷雾干燥，制成脱毛酶固体制剂。
3.根据权利要求1或2所述的脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，其特征在于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836接入发酵培养基之前进行扩大培养。
4.根据权利要求3所述的脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，其特征在于所述的扩大培养包括菌种活化、摇瓶菌种的制备。
5.根据权利要求4所述的脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，其特征在于所述的菌种活化是将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14836按2％-4％接种量接种于含10μg/ml Cm的5ml LB液体培养基中，在温度为35-37℃、转速为160-180转/分钟的条件下培养6-10小时。
6.根据权利要求4所述的脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，其特征在于所述的摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于含10μg/ml Cm的50-100ml 2YT培养基中，在温度为35-37℃、转速为160-180转/分钟的条件下培养8-12小时。
7.根据权利要求1所述的脱毛酶制剂在黄牛皮脱毛中的应用，其特征在于包括如下工艺步骤：
a、干皮浸水
将干皮洗净，除去毛皮中杂物，加0.2％-0.4％的浸水酶，pH＝8-10，室温浸泡至皮块成鲜皮状；
b、去肉
将步骤a所制备的浸水后的牛皮去除肉面脂肪；
c、除脂
将步骤b中去除肉面脂肪的皮块，加0.4％-0.6％的碱性脂肪酶和1％-2％的Tween-80，在pH＝7-9的条件下除脂；
d、有温有浴转鼓酶脱毛
将步骤c所制备的除脂后的皮块在固液比＝1:3-5、温度为33℃-35℃、脱毛酶制剂用量80U/ml-120U/ml、转速7-9转/分钟的条件下转鼓脱毛3-6小时。
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