KR20080052558A - 트립토판 고함유 대두 가루 - Google Patents

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KR20080052558A
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지홍 리앙
팡 치
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레네센 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 트립토판 고함유 대두 가루를 제공한다. 본 발명은 새로운 대두 가루를 제조하고, 사용하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 상기 대두 가루의 추가적 가공 공정으로부터의 생산물을 더 제공한다.
트립토판 함량, 대두 가루, 공정, 생산물

Description

트립토판 고함유 대두 가루{HIGH TRYPTOPHAN SOYBEAN MEAL}
본 발명은 유전공학, 작물육종학, 곡물가공, 및 동물영양학의 분야에 관련된 것이다. 본 발명은, 동물 급여 방법에 있어서 성분으로 사용되는 새로운 트립토판 고함유 대두 가루에 관한 것이다.
식용고기용으로 사육된 가축종들은 여러 아미노산을 생성하는 능력이 부족하여, 따라서 그들의 식사로부터 이러한 아미노산을 얻는 것을 필요로 한다. 식사로부터 얻어야 하는 상기 아미노산을 필수 아미노산이라 한다. 식물은 전체 20종의 필수 아미노산을 합성할 수 있으므로, 가축을 위한 이러한 아미노산들의 주요 공급원이 된다. 트립토판은 이러한 필수 아미노산 중의 하나이고, 동시에 수많은 사료 성분들의 아미노산 프로파일에 있어서 불충분하게 표시되어 있다.
옥수수 분쇄가공 및 동물 공급용 식물로부터의 부산물들과 같은 단백질의 경제적 공급원은 통상적으로 동물 사료로 사용된다. 이러한 종류의 부산물들의 예들로는 옥수수 글루텐 굵은 가루, 가용성 디스틸러 곡물(distiller's grain), 육골가루, 우모분(feather meal), 및 가금류 가루를 포함한다. 불행히도, 이러한 부산물내의 상기 트립토판의 함량은 여러 동물의 요구량에 불충분하므로, 특정한 사료 배합에서 사용될 수 있는 양에 한계가 있다.
대두 가루는, 단백질 및 필수 아미노산을 공급하는 동물 사료의 주요 성분 중의 하나이다. 대두 가루가 사료에 배합될 때, 그 함유율은, 일반적으로 가장 제한적인 필수 아미노산을 만족시키는 것을 기본으로 하여 계산된다. 상기 제한적인 필수 아미노산은 전형적으로 트립토판이고, 따라서 나머지 필수 아미노산들은 식이 요구량을 초과하여 배합되는 결과를 초래한다. 상기 과량의 아미노산들은 낭비되는 결과가 된다. 따라서, 고농도의 트립토판을 함유하는 대두 가루를 제공할 필요성이 있다.
발명의 요약
여기에서 서술하는 본 발명은, 전체 트립토판 함량을 고함량으로 포함하는 하나 또는 그 이상의 대두의 가공공정으로부터 유래된 트립토판 고함유 대두 가루에 관한 것이다. 본 발명은 동물 사료 산업에서 트립토판 함량이 높은 대두 가루의 사용을 포함한다.
따라서, 첫번째 관점에서, 본 발명은 건조물질기준(중량%)으로 트립토판의 전체 함량을 고함량으로 약 0.78중량% 이상 포함하는 대두 가루에 대한 것이고, 여기에서 외인성 트립토판은 추가되지 않는다. 본 발명의 하나의 구체예로서, 상기 대두 가루는, 적어도 약 0.10중량%의 유리 트립토판(free tryptophan)을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 대두 가루는 적어도 약 0.43중량%의 유리 트립토판을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 대두 가루는 적어도 약 44중량% 또는 그 이상의 단백질을 포함한다. 또한, 상기 대두 가루는, 유전적으로 변형된 단백질을 포함하는 단백질 결합 트립토판 함량을 더 포함할 수 있고, 여기에서, 상기 유전적으로 변형된 단백질은 적어도 8중량%의 트립토판 잔기를 포함한다.
본 발명은, 다음의 단계를 포함하는, 적어도 약 0.78중량%의 트립토판 총함량을 포함하는 대두 가루의 제조방법에 관한 것이다: 트립토판 생합성 경로의 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 형질전환유전자를 대두 식물의 재생가능한 세포내로 도입하는 단계(여기에서, 상기 분리된 핵산 분자는, 유전자 변형된 식물세포를 얻기 위하여, 식물세포내에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다); 상기 유전자 변형된 식물세포로부터 식물을 재생시키는 단계(여기에서, 상기 식물의 상기 세포는 유효량의 상기 분리된 핵산 분자에 의해 인코딩된 상기 효소를 발현하여 동일한 유전적 배경의 유전자 변형되지 않은 대두 식물의 곡물(grain)의 트립토판 함량에 비하여 상기 식물의 대두 곡물의 트립토판 함량을 증가시킨다); 및 상기 형질전환 식물의 상기 곡물로부터 대두 가루를 제조하는 단계.
본 발명의 하나의 관점에서, 상기 방법은 안트라닐레이트 합성효소 알파 도메인 및 안트라닐레이트 합성효소 베타 도메인을 포함하는 모노머성 안트라닐레이트 합성효소(monomeric anthranilate synthase)를 인코드하는 형질전환유전자를 포함한다. 또한 상기 방법은 피드백에 민감하지 않은 옥수수 안트라닐레이트 합성효소 알파-서브유닛을 인코드하는 형질전환유전자를 포함한다. 상기 방법은 포스포리보실안트라닐레이트 전이효소(phosphoribosylanthranilate transferase), 포스포리보실안트라닐레이트 이성질화효소(phosphoribosylanthranilate isomerase), 인돌-3-포스페이트 합성효소, 또는 트립토판 합성효소를 인코드하는 어떤 형질전환유전자를 더 포함한다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 트립토판 고함유 대두 가루의 제조 방법에 관한 것이다: a) 전체 트립토판 함량이 약 0.65중량% 이상인 대두 곡물을 선택하는 단계, 및 b) 대두 가루를 제조하기 위하여 상기 곡물로부터 오일을 추출하는 단계. 본 발명의 하나의 구체예로서, 상기 트립토판 고함유 대두 가루의 제조방법은, 또한, 유리 트립토판(free tryptophan)을 약 0.15중량% 이상 포함하는 대두 곡물을 사용할 수도 있다.
다른 관점에서, 본 발명은, 동물 생산자를 위한 사료, 애완 동물을 위한 사료, 및 양어 양식을 위한 사료를 포함하는 동물 사료에 상기 대두 가루를 도입하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 상기 대두 가루는 발효사료 공급원으로서 유용하다.
다른 관점에서, 상기 본 발명은, 동물 사료들의 사용에 있어서, 트립토판 고함유 전지(full fat) 대두 곡물에 관한 것이다. 상기 트립토판 고함유 전지 대두 가루는 선택적으로 압출될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 트립토판 고함유 대두 분리물 또는 대두 단백질 농축물에 관한 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 새로운 사료 성분인 트립토판 고함유 대두 가루를 개시한다. 본 발명의 상기 대두 가루는, 동물 사육에 있어서 양식 사료 공급원으로서, 그리고 발효매질(fermentation media)의 성분으로서 유용하다.
다음의 정의는 본 명세서에서 사용된다:
외인성 트립토판(Exogenous Tryptophan): 상기 대두 가루가 유래된 대두의 내재성 부분이 아닌 트립토판. 외인성 트립토판은, 상기 농도를 증가시키기 위하여 상기 가루에 또는 상기 사료에 추가될 수 있다.
유리 트립토판(Free tryptophan): 올리고펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 일부가 아닌 유리산 형태의 트립토판.
전지 대두 가루: 오일 추출 단계를 생략한 것을 제외하고는, 대두 가루와 유사하게 제조된 대두 생산물.
단백질 함량: 대두 종자 또는 대두 가루에 포함되어 있는 단백질의 중량 퍼센트(wt%).
대두 가루: 대두 곡물을 가공한 생산물인 사료 성분. 여기에서 언급된 상기 용어 "대두 가루"는 탈지(defatted)하고, 탈용매(desolventized)하고, 굽고(toasted), 그리고 빻은(ground) 대두 물질을 의미한다.
대두 단백질 분리물: 비-단백질 성분들의 대부분을 제거하여 제조되고, 수분제거상태(moisture-free basis)에서 90% 이상의 단백질을 포함하는 대두 곡물로부터의 조제물.
대두 단백질 농축물: 대부분의 오일 및 수용성 비-단백질 구성요소들을 제거하여 제조되고, 수분제거상태에서 약 65% 이상의 단백질을 포함하는 대두 곡물로부터의 조제물.
형질전환유전자: 유전자 스플라이싱(splicing) 기술을 통해 세포의 게놈내로 삽입된, 적어도 하나의 프로모터 서열, 코딩 영역, 및 전사 말단 서열을 포함하는 핵산 분자.
전체 트립토판 함량: 유리 트립토판 및 단백질 결합 트립토판(Protein bound tryptophan) 함량의 합계.
유리 트립토판 함량: 대두 곡물 또는 대두 가루의 유리 트립토판의 중량%.
단백질 결합 트립토판 함량: 상기 대두 종자 또는 대두 가루의 단백질들 또는 펩티드들내로 도입된 트립토판의 중량%. 상기 용어 "단백질 결합 트립토판" 및 "펩티드 결합 트립토판"은 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.
트립토판 고함유 대두 변종들( Soybean Varieties )
본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루는 트립토판 고함유 대두 변종 또는 변종들의 사용을 포함한다. 트립토판 고함유 대두 변종을 생산하는 여러가지 방법들이 있다.
대두 곡물의 트립토판은 두개의 다른 형태로 존재한다: 단백질 결합 형태 및 유리된 형태. 곡물중의 유리 트립토판의 농도를 증가시키기 위한 기술적 접근법들은 다음을 포함한다: 1) 합성의 증가, 2) 분해의 감소, 또는 3) 합성 위치에서 저장 위치로의 수송 증가. 또한, 상기 접근법의 일부 또는 전체의 조합이 최적의 결과에 도달하도록 사용될 수 있다.
대두 식물에서 트립토판의 합성을 증가시키는 방법은 1) 생합성 경로의 중요 효소 또는 효소들을 과발현시키거나, 또는 2) 상응하는 내생 효소와 비교하여 피드백 억제에 대해서 덜 민감하거나 또는 무감각한, 생합성 경로에 있어서의 적어도 하나의 중요 효소를 발현시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 방법들의 예들은 미국 특허 공보 제2003/0097677호 및 제2003/0213010호에 개시되어 있고, 이들은 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되어 있다.
트립토판의 분해를 감소시키는 방법은 1) 분해 능력이 있는 효소(들)의 양을 감소시키거나, 또는 2) 상기 효소의 억제제를 발현시킴으로써 분해 효소의 효과를 감소시키거나, 또는 3) 본래의 효소의 활성을 경쟁적으로 억제할 수 있는 분해 효소의 변종 형태(mutant form)를 발현시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 효소의 양은 안티센스 공동-억제, 센스 공동-억제, RNA 간섭과 같은 유전자 억제 기술, 또는 당 분야에 공지된 다른 기술들에 의하여 감소될 수 있다.
식물들은, 각각의 아미노산에 대한 그들의 특이성 또는 친화성에 따라 특징지워지는 다양한 형태의 아미노산 수송체들을 포함한다. 트립토판 수송체의 과발현 또는 더욱 유용한 트립토판 수송체의 발현은 색소체(plastids)로부터 세포질내 공간, 세포외 공간, 또는 액포와 같은 다른 구획들(compartments)로의 트립토판의 수송을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제2003/0188332호 참고.
단백질 결합 트립토판은 고함량의 트립토판을 함유하는 저장 단백질을 과발현함으로써 증가시킬 수 있다. 상기 트립토판 고함유 단백질은 본래의 단백질 또는 본래의 단백질의 변형된 형태일 수 있다. 이러한 방법들의 예는 PCT 출원 WO98/45458, WO98/20133, 및 WO99/29882에 개시되어 있다.
또한, 단백질 결합 트립토판은, 탄수화물 및 지질과 같은 다른 성분들에 비하여 대두 곡물의 단백질의 전체 농도를 증가시킴으로써 중량% 기준으로 증가될 수 있다. 단백질 고함유 대두는, 대두들의 본래의 생식세포 또는 대두들의 변종 개체군을 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다.
단백질 결합 트립토판을 증가시키는 다른 방법은, 트립토판이 본질적으로 낮은 본래의 저장 단백질의 발현을 억제하는 것이다. 상기 방법에 있어서, 상기 곡물의 아미노산 조성은, 비-억제된 원래의 곡물과 비교하여 보다 높은 농도의 트립토판을 갖도록 변화된다. 특별히 옥수수에 적용되지만 대두에도 적용가능한 상기 방법의 예는 미국 특허 제6,326,527호에 개시되어 있다.
대두의 단백질 결합 트립토판을 증가시키는 다른 방법은, 다른 아미노산들을 코딩하는 코돈들을 트립토판 코돈들로 치환함으로써 주요 저장 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 조작하는 것이다. 따라서, 상기 조작의 결과로서 발현된 단백질은 보다 높은 농도의 트립토판을 가지고, 이에 따라 식물의 전체 트립토판 농도가 증가한다. 상기 방법의 예는 미국 특허 공보 제2003/0200558호에 개시되어 있다.
또, 다른 방법에서, 유리 트립토판 수준은 표적 조직에서 증가될 수 있고, 동시에, 상보적인 단백질 싱크(complementary protein sink)가 만들어 질 수 있어, 이로 인하여 단백질 결합 트립토판이 증가되는 결과를 나타낸다. 상기 방법의 예는 미국특허 제6,080,913호에 개시되어 있다.
당 분야의 통상적인 기술자는 트립토판 고함유 대두 곡물을 제조하는 방법으로서, 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루를 재생시키는데 사용될 수 있는 다른 방법들을 인지할 것이다.
대두 가공 및 생산물
본 발명의 하나의 관점에 있어서, 트립토판 고함유 대두는 트립토판 고함유 대두 가루로 가공된다. 생대두들(raw soybeans)이 대두 가루가 되는 공정에 대해서 많은 방법들이 공지되어 있다. 본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루는 트립토판 고함유 대두 곡물을 가공하는 이러한 방법들을 사용하여 제조될 수 있다.
대두 가루의 제조를 위한 예시적인 공정들은 미국 특허 제4,992,294호; 제5,225,230호; 제5,773,051호; 및 제5,866,192호에 설명되어 있는 것들을 포함한다. 일반적으로, 상업적인 대두 가공은 어떤 통상적인 수송 수단에 의해 경작지로부터 대두를 받는 단계로 시작한다. 상기 대두는, 일반적으로 오염되고, 종종 젖은 상태로 공급되어, 진동체(vibrating screen)로 클리닝될 수 있다. 상기 단계에서, 상기 대두는 비-대두 물질, 예를 들면, 돌, 스틱, 나뭇잎, 가지, 먼지, 잡초 종자, 및 원치 않는 대두의 단편 조각들로부터 분리된다. 진동체에 의해 제거되지 않은 탈피된 외피와 섞여 있는 상기 클리닝된 대두들을 흡입기(aspirator)로 이송하고, 대부분의 남아있는 탈피된 외피들은 공기로 제거한다. 그런 다음, 상기 대두들을 저장소로 이송하고, 상기 제거된, 탈피된 외피들은 추가 가공을 위한 부산물로서 모아진다.
상기 가공 단계에서, 상기 대두는, 일반적으로 약 12%의 수분을 포함하나, 상기 대두의 실제 수분 함량은 많은 다른 요인들에 의해 변화될 수 있다. 상기 대두의 상기 수분 함량이 약 12%를 초과하면, 상기 대두는, 저장소에 저장하기 전에 약 12% 이하로 수분 함량을 감소시키기 위하여 건조 단계를 진행해야 한다. 상기 수분 함량의 조절은, 저장하는 동안에 곰팡이 및 세균에 의한 오염을 방지하기 위해 필수적이다.
전술한 상기 단계의 가공 공정은 원하는 최종 생산물에 따라 변경될 수 있다. 예를 들면, 상기 대두는, 첫번째로, 통상적인 흡입 시스템(aspiration system)과 함께 사용되는 크랙킹 롤(cracking roll) 또는 해머밀(hammer mill)과 같은 통상적인 장치를 사용하여 탈피될 수 있다. 선택적으로, 상기 외피들은 이후의 공정들에 앞서 제거되지 않을 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,225,230호 참고. 트립신 억제제와 같은 항영양인자들(antinutritional factors)을 불활성시키기 위하여, 상기 대두들은 크랭킹(craking)하거나, 제분(grinding)하거나, 또는, 분쇄(crushing)하기 전에 특정한 시간 동안 가열될 수 있다.
크래킹 공정에 있어서, 클리닝되고, 건조된 전체(whole) 대두들을 굵게 골이 파인 롤러밀들(roller mill) 또는 "파쇄기들(crackers)"에 넣는다. 이러한 파쇄기들은 하나 또는 둘 이상의 롤 세트들을 가질 수 있다. "분쇄물"이라 불리는 대두 조각들이 형성된다. 상기 파쇄하는 단계의 목적은 출발 대두의 1/4~1/8의 크기를 갖는 조각들을 최대로 형성시키고, 직경 1mm 미만의 조각들인 미세 조각들의 형성을 최소화하는 것이다.
크래킹 밀로부터, 전체 대두의 입자들(분쇄물들)이, 일반적으로 1~3단계를 적용하는 다단계 흡입 탈피 시스템으로 옮겨진다. 각 단계는 흡입기 및 크기 스크리닝 시스템(size screening system)으로 구성된다. 각각의 단계에서, 섬유소-풍부 외피는 우선 역류 에어 스트림(air stream) 및 사이클론(cyclone)에 의해 제거된다. 섬유소가 적은, 보다 무거운 알맹이(meat) 분획은 크기에 따라 적어도 하나의 추가의 분획을 제거하는 스크리닝 시스템에 옮겨져서, 추가의 흡입공정에 적용되기 위한 하나의 스트림이 얻어진다. 선택적으로, 흡입하기 전에 스크리닝이 적용될 수 있다. 상기 "외피들" 스트림은, 일반적으로 다른 대두 부산물과 함께 섞여 있고, 동물 사료 성분으로서 사용된다. 상기 한번 탈피(dehulled)된 알맹이는, 2단계 상업용 예비-추출 공정을 사용하여 약 3% 미만의 조섬유소(crude fiber)(탈지, 건조된 상태에서 4.28% 조섬유소)를 갖도록 두번째 탈피된다. 그러나, 단일 단계 시스템들도 또한 알맹이를 얻기 위하여 적용될 수 있다.
그런 다음, 상기 결과의 알맹이들은, 로터리 쿠커(rotary cooker) 또는 스택 쿠커(stack cooker)에서와 같이 열 컨디셔닝(heat conditioned) 된다. 상기 분쇄물의 체류시간은, 일반적으로 약 20~약 40분이다. 일반적으로, 토출 온도(discharge temperatures)는 약 120~180℉이다. 플레이커(flaker)에서 더욱 미세한 미세물들의 생산이 가능하다면, 보다 낮은 조건의 온도들이 적용될 수 있다.
상기와 같이 컨디셔닝된 알맹이들을 플레이커라 불리는 평면 롤러밀(smooth roller mill)에 넣는다. 일반적으로, 약 500kPa-게이지(72.5psig) 이상의 압력이 롤에 적용된다. 다음의 오일 추출 단계에서 최대로 오일을 회수하기 위하여, 바람직하게는 약 0.75mm(0.030인치) 미만의 플레이크 두께로 제조된다. 선택적으로, 분쇄 및 탈피 단계는 제외되거나, 또는 컨디셔닝 단계 다음에 진행된다. 추가의 선택은 오일 추출 전에 "수집물(collects)"을 형성하기 위해 플레이크된 대두들의 퍼센트비율을 늘리는 것일 수 있다. 다른 공정 변수들은 크래킹 단계전에 컨디셔닝하고, 오일 추출 전의 탈피 단계를 제외하는 것을 포함한다. 탈피 단계를 제외한 공정에서 생산된 본 발명의 대두 가루는 트립토판 고함유 및 섬유소 고함유 대두 가루일 것이다. 상기 생산물은 양돈 사육에 있어 특별한 사료 성분이 될 수 있다.
대두 가루의 생산공정의 다음 단계는 오일을 추출하는 것이다. 일반적으로 상기 추출단계는, 기계 추출에 의해 수행될 수 있는 것 이외에 지방 친화성 용매(lipophilic solvent)를 사용하여 진행된다. 상기 공정에서, 상기 대두 가루는 적당한 용매(예를 들면, 헥산)와 접촉시켜 오일함량이 약 1중량% 미만이 되도록 오일을 제거한다. 종래의 용매 추출 공정의 하나의 예는 미국 특허 제3,721,569호에 서술되어 있다.
그러나, "전지(full fat)" 대두 가루를 원하는 경우, 상기 오일 함유 가루를 오일(또한, 지방 또는 지질로 알려진) 추출에 적용하지 않는다. 본 발명의 이 구체예에서, 결과의 생산물은 트립토판 고함유 전지 대두 가루일 수 있다.
상기 용매 추출 단계에서, 일반적으로, 탈지된 대두 가루는, 약 30중량%의 용매를 포함한다. 일반적으로, 상기 대두 가루는, 동물 사료로 사용되기 전에 잔여 용매를 제거하고, 트립신 억제제들 및 다른 천연적으로 발생하는 독성물질(antifeedant)을 비활성화시키기 위하여 단백질 부분을 충분히 가열하기 위하여, 탈용매화 토스터(DT:desolventizer-toaster)를 통해 가공된다. 일반적으로, 스팀(steam)을 대두 가루에 쐬어주고, 농축된 스팀으로부터 방출된 기화열이 결과적으로 용매를 증발시키며, 상기 증발된 용매는 회수되어 재활용된다.
용매 추출의 대안으로서, 상기 대두 가루는, 예를 들면, 스크루 프레스(screw press)를 이용하여 기계적으로 탈지된다. 기계적으로 추출되거나, 또는 "착유기(expeller)"를 이용하여 얻어진 대두 가루는 약 4~약 8%의 잔여 오일을 포함한다. 상기 대두 가루의 의도된 사용이 반추동물을 위한 사료 보충제용이라면, 상기 대두 가루는, 오일을 기계적으로 추출하기 전에, 먼저 미국 특허 제5,225,230호에 설명되어 있는 것과 같은 특별한 방법으로 가열되어 건조될 수 있다. 상기 탈지된 대두 가루를 건조하고, 일반적으로 가루로 빻거나, 또는 펠렛(pellet)으로 만들고, 그런 다음, 식품 보조제로서 또는 동물 사료로서 사용하기에 적당한 물리적 상태로 분쇄한다.
상기 대두 또는 상기 대두 가루에 대한 추가 가공 공정은, 선택적으로 상기 결과의 사료가 동물의 입맛에 더욱 맞고, 이용가능하고, 그리고/또는 소화가능하게 제조되도록 진행될 수 있다. 이러한 공정들은 효소 또는 영양소들의 첨가, 및 대두 가루의 열 처리를 포함한다. 추가적으로 펠렛화와 같이, 대두 가루를 더욱 압축되고, 촘촘한 분포상태가 되도록 상기 가루를 추가 가공할 수 있다.
상기 대두 가루에 대한 추가 가공 공정에 의해 식품, 사료 및 산업적 사용에 적합한 대두 분말(flour), 대두 단백질 농축물, 및 대두 단백질 분리물을 제조할 수 있다. 본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루는 하기에 설명된 어떤 생산품으로 더 가공될 수 있다.
대두 분말은 탈지된 대두 가루를 빻고, 스크리닝함으로써 간단하게 제조된다. 적어도 약 65중량%의 단백질을 포함하는 대두 단백질 농축물은 탈지된 대두 가루로부터 용해 가능한 탄수화물 물질을 제거함으로써 제조된다. 수성 알코올 추출(물중의 60~80% 에탄올) 또는 상기 단백질의 등전(isoelectric) pH 4.5에서의 산 침출법(acid leaching)은 가용성의 탄수화물 부분을 제거하기 위한 가장 흔한 방법이다. 수많은 출원들이, 가공 식품들, 육류, 가금류, 어류, 곡류, 및 유제품 시스템에 있어서 대두 단백질 농축물 및 조직(texturized) 농축물에 대해서 개발되어 왔고, 이들은 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루에 적용될 수 있다.
대두 단백질 분리물은 가용화(solubilization)(pH 7~10에서의 알칼리 추출)와 분리 및 그 후의 등전 침전을 통하여 탈지 대두 플레이크로부터 단백질을 분리하는 표준적인 분리 화학을 통하여 바람직하게 제조된다. 결과적으로, 분리물들은 적어도 약 90중량%의 단백질을 갖는다. 분리물들은, 때때로 그들의 적용을 제한할 수 있는 특성인, 소듐 및 미네랄(회분 함량)이 높다. 그것들은 주로 유아용 조제분유(infant formulas) 및 우유 대체품과 같이, 유제품의 대체품에 적용되어 왔다.
대두 분말은, 육류 증량제(meat extenders) 및 육류 대체품들(meat analogs), 애완동물 사료, 제빵(baking) 재료, 및 다른 식품의 제조에 종종 사용된다. 대두 분말 및 대두 분리물로부터 제조된 식품들은 유아 식품, 사탕류, 곡류, 음료, 면류, 이스트, 맥주, 에일 등을 포함한다.
당 분야의 당업자는 본 발명의 정신을 벗어나지 않고서, 상기 서술된 공정에서 변형들이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루는 상기 서술된 어떤 생산물로 더 가공될 수 있다.
사료 배합
본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루는 다양한 식품 배합물에 사용된다. 바람직한 구체예로서, 본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루는, 양돈 및 가금류와 같은 위가 하나인 동물을 위한 사료 배합물에 사용된다. 본 발명의 대두 가루의 트립토판 함량이 보다 높기 때문에, 배합 비율은 일반 대두 가루에 비하여 일반적으로 감소된다. 사료 배합물에 있어서, 본 발명의 상기 대두 가루의 사용은 트립토판의 외인성 공급원(exogenous sources)을 추가할 필요성을 감소시키거나, 또는 제외시킬 것이다. 본 발명의 상기 대두 가루의 이러한 특성들은 동물 생산자 및 배합물 제조자에게 사료 배합에 있어서 더 많은 옵션을 가지는 이점을 제공한다.
본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루는, 사료 제조자들에게 있어서 동물 사료에 보다 저렴한 성분들을 사용가능하게 하여, 동물 생산자들에게 있어서 사료 비용을 낮추게 한다. 하기 표에는 본 발명의 상기 트립토판 고함유 대두 가루를 사용한 양계(broiler) 사육자 식이(C), 동물성 부산물을 포함하지 않는 배합물(A), 및 동물성 부산물을 포함하는 배합물(B)을 비교한 것을 나타낸다.
Figure 112008009590106-PCT00001
하기 표는, 선택된 사료 성분들과 사료 배합물 및 그들의 조생 단백질(CP)인 라이신(Lys) 및 트립토판(Trp) 함량을 나타낸 것이다. 트립토판 함량이 낮으나, 고단백질을 포함하는 특정한 성분들은 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루를 포함하는 배합물에 사용될 수 있음을 알 수 있다.
Figure 112008009590106-PCT00002
1DDGS는 용해가능한 디스틸러의 건조된 곡물(distiller's dried grains)를 의미한다.
NRC 가금류(1994) 및 NRC 양돈(1998)으로부터 추출된 데이타
본 발명은 다음의 실시예에서 더욱 상세히 설명되고, 이들은 예시적인 목적으로 제공될 뿐 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루를 제조하는데 사용된 유 전자변형된 트립토판 고함유 대두의 생산을 서술한다.
GM_A15238:0015로 지칭된 상기 트립토판 고함유 대두는 Weaver 등(이미 참고문헌으로 통합된 미국특허공보 제2003/0213010호)에 의해 설명된 바와 같이 생산되었다. 요약하면, 대두 식물을 피드백에 민감하지 않은 7S α'프로모터에 의해 유도된 옥수수 안트라닐레이트 합성효소(AS) α-서브유닛에 대한 코딩서열을 포함하는 벡터 pMON39325로 형질전환 시켰다.
고함량의 트립토판을 포함하는 계통(event)을 선택하였고, 이를 GM_A15238로 번호 매겼다. 상기 계통으로부터의 R1 종자들을 R1 식물을 생성하기 위해 온실 조건하에서 재배하였다. Invader® 분석기(WI, Madison, Third Wave Technologies, Inc.)를 사용하여 동형 접합체(homozygous) 및 이형접합체(heterozygous) 식물들을 동정확인하였다. 하나의 유전자 양성 동형 접합체 식물(GM_A15238:0015) 및 하나의 유전자 음성 동형 접합체 식물(GM_A15238:0017)을 선택하였고, 다음의 생성 단계를 진행시켰다. 트립토판 고함유 대두 가루를 제조하기 위한 대두 곡물의 생성은, 조절된 유전자 변형물에 대하여 USDA 조절 안내에 따라 실행되었다(실시예7 CFR §340 참고).
실시예 2
본 실시예는 대두 종자 및 대두 가루의 유리(free) 트립토판과 전체 트립토판 및 전체 단백질에 대한 분석방법을 설명한다.
유리 트립토판
대두 가루의 아미노산은 o-프탈알데히드(OPA)를 이용한 프리-컬럼 프라이머리 아민 유도체화(pre-column primary amine derivatization)를 사용하여 검출하였다. 상기 결과의 아미노산 부가물인 이소인돌은 소수성이고, 형광 검출기에서 검출될 수 있는, 우수한 형광특성을 갖는다. 역상(reverse-phase) 크로마토그래피를 사용하여, 각각의 아미노산에 위치하고 있는 R-그룹의 소수성을 통하여 분리를 수행하였다. 형광체를 안정화시키기 위하여, 2-멀캅토에탄올 또는 3-멀캅토프로피온산과 같은 티올(thiol)을 첨가하였다.
종자 및 가루 샘플을 1mm 스크린 섬도(screen fineness) 또는 미세도(finer)로 빻았다. 빻아진 샘플들을 분석 전에 5℃에서 저장하였다. 상기 샘플들을 실온으로 한 후, 무게를 재어 바로 코니칼 원심분리 튜브(2.0ml 용량)내에 넣었다. 추출 용매에 대한 상기 샘플의 비율은 30mg/ml 이하이다. 5% 트리클로로아세트산(TCA) 용액(PA, West Chester, part no. VW3372-1, VWR Scientific)을 각각의 샘플에 첨가한 후, 약 30분 동안 와류장치(vortex)로 혼합하였다.
상기 샘플들을, 추출완료를 확실하게 하기 위해 하룻밤(16시간) 동안 놓아두었다. 그런 다음 상기 샘플들을 약 30분 동안 와류장치로 혼합하였고, 3000rpm으로 약 30분 동안 원심분리하였고, 그 상등액을 분석전에 -80℃에서 저장하였다.
상기 아미노산들은 형광검출(FLD) 및 Zorbax Eclipse-AAA, XDB C-18컬럼, Zorbax Eclipse-AAA 가드 컬럼이 장착된 HPLC(CA, Palo Alto, 모델 1100, Agilent Technologies, Inc.)로 분석하였고, 다음은 파라미터들이다:
분석 방법에 대한 분석 시간: 14.0분
분석 당 전체 경과 시간: 약 17분
일반적 샘플 크기 및 최소 샘플 크기: 일반: 50mg
최소: 30mg
일반적 분석 범위: 7.8~800pmol/μL.
이동상(mobile phase)은 (A) 0.001%의 소듐 아자이드를 갖는 pH=7.8인 40mM NA2HPO4 버퍼 및 (B) 아세토니트릴:MeOH:H2O(45:45:10v/v)이다. 모든 시약들은 HPLC 등급이고, 모든 용매들은 Honeywell, Burdick 및 Jackson(Michigan, Muskegon)에서 제조된 고순도(High Purity) 등급이다. 하기는 사용된 이동상의 농도구배 및 HPLC 셋팅을 나타낸 챠트이다.
Figure 112008009590106-PCT00003
온도: 40℃
컬럼 유동 속도: 2.00mL/min
FLD 셋팅들: 추출: 340nm
방출: 450nm
피크너비: ＞0.2분
PMT 증가(Gain): 10
형광 스캔: 여기 범위: 220~380nm, 단계 5nm
방출 범위: 300~500nm, 단계 5nm
AOAC® 공식 방법 990.03, (2000)(MD, Gaithersburg, AOAC® International)에 따른 천연 단백질 분석; 및 AOAC® 공식 방법 982.30E(a,b,c), CHP. 45.3.05, (2000)에 따른 아미노산 프로파일.
실시예 3
다음 실시예는 시험 공장 스케일(pilot plant scale)에서의 대두 가루의 제조를 설명한다.
본 명세서에서 서술된 사양 실험(feeding trials)에 사용된 본 발명의 상기 대두 가루는, 용매 추출 공정에 의해 시험 공장 스케일로 제조하였다.
원료 작물 A4992(IA, Des Moines, Asgrow Seed Company)뿐만 아니라, 상기 트립토판 고함유 대두인 GM_A15238:0015(실시예 1에서 서술된), 및 상기 유전자변형 음성 동일 작물(trangenic isoline)인 GM_A15238:0017)을 세척하고, 그런 다음 10% 및 10.5% 수분을 함유하도록 Behlan Wicks drier(NE, Columbus, Behlen Manufacturing Company)로 건조하였다. 그런 다음, 상기 세척되고, 건조된 대두를, 외피로부터 알갱이들이 벗겨지도록 1~3일 동안 이동가능한 저장통내에 뚜껑을 덮어서 저장하였다. 그런 다음, 상기 대두들을 단일 스트랜드 Ferrell-Ross(IN, Bluffton, A. T. Ferrell Company Inc.) 크랙킹밀에 투입하였다. 상기 크랙킹 롤들을 주위온도(ambient temperature)에서, 1.9mm에 상응하도록 8 갭 셋팅(gap setting)에서 작동시켰다. 상기 롤들을 700ppm에서 보다 느린 롤 회전으로 1.5:1의 차동(differential) 속도 비율로 작동시켰다.
상기 크랙킹 밀로부터 제조된 분쇄물들을 상기 알갱이들로부터 외피들을 제거하기 위하여 다단계 공기역학적(aeromechanical) 탈피 시스템(KS, Wichita, Kice Industries, Kice Zigzag Aspirator)으로 이송시켰다. 상기 흡입기(aspirator)를 1~2.4인치 수두압의 절대압력에서 작동시켰다. 상기 결과의 외피들을 모았고, 해머밀에 투입하였다. 상기 해머밀로부터의 상기 생산물을 중력 테이블(gravity table)로 보내어, 알갱이 풍부 부분을 외피로부터 분리하여 수집하였다. 상기 방법으로 모아진 상기 알갱이들을 플레이킹하기 전에 흡입된 분쇄물 부분과 함께 혼합하였다(혼합된 알갱이 부분).
그런 다음, 상기 혼합된 알갱이 부분을 스캇 텐더블렌드 컨디셔너(MN, New Prague, 모델 번호 SJC2, Scott Equipment Company)로 66~188kg/시간의 속도로 이송시켰고, 55~67℃의 배출 온도(exit temperature) 및 9.5%의 수분 함량을 얻기 위해서 열을 가하였다. 상기 조절되고, 혼합된 알갱이 부분을, 0.010인치의 갭 세팅을 사용하여, 로스캠프 프레이킹 롤 모델 2862(Roskamp flaking roll model 2862)(IA, Waterloo, CPM Roskamp Champion, 28" 직경×62" 넓이)에 투입하여, 60℃에서 두께 0.23~0.36mm로 플레이킹하였다.
그런 다음, 상기 플레이크를, 오일 추출을 위하여 크라운 아이언 웍스 모델 2 침투 추출기(MN, Roseville, Crown Iron Works Co.)에 넣었다. 상기 추출기를, 약 37분의 체류시간, 가루 중량에 대한 헥산의 비율 1:1, 및 약 140kg/시간의 원료처리량을 적용하여 작동시켰다. 그런 다음, 상기 용매 추출된 가루를 크라운 슈넥켄 프리(pre)-탈용매화기를 경유하여 2-데크 크라운 탈용매화 토스터기(DT)로 옮겼 다. 상기 프리-탈용매화기를 50℃의 토출온도를 제공하기 위하여 0.2인치 수두압하에서 작동시켰다. 상기 DT를 다음의 조건하에서 작동시켰다: 91~104℃의 탑데크 온도(top deck temperature); 101~103℃의 바텀 데크 온도(bottom deck temperature); 75±5℃의 DT 증기 온도. 상기 결과의 가루는 16~19%의 배출 수분 레벨 및 0.15±0.5의 pH 상승에 상응하는 우레아제 레벨을 가졌다.
그런 다음, 상기 탈용매화된 가루를 8.5~9.5%의 수분 레벨로 건조하였고, 그런 다음, 12/64인치 스크린을 통하여 통과하기에 충분하게 작은 입자 사이즈로 해머 분쇄하였다.
상기 대두 가루를, 본 명세서에 하기와 같이 설명된, 안정성 테스트 및 식육용 영계(이하, 브로일러) 사양시험에 사용하였다.
실시예 4
본 실시예는, 상업적 대두 가루와, 트립토판 고함유 대두 가루, 및 상기 가루들을 생산하기 위해 사용된 상응하는 대두 곡물을 설명하고 비교한다. 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루(HT SBM), 대두 가루 상품, 대두 상품 및 대조군 가루의 분석 결과를 표 2에 나타낸다. 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 상기 대조군 및 상기 트립토판 고함유 대두 가루를 시험 공장 규모(pilot scale)에서 가공처리시켰다. 또한, 표 2에는 비교를 위해 대두 분리물 및 대두 농축물에 대한 값들도 포함한다.
표 2 . 대두 및 대두 가루의 비교 분석
Figure 112008009590106-PCT00004
표 2의 결과를 얻기 위해 사용된 분석방법들은 실시예 2에 설명되어 있다.
실시예 5
본 실시예는, 가공 및 저장 동안의 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루의 유리 트립토판의 안정성 측정을 서술한다.
상기 실시예 3 및 4에서 서술된 상기 트립토판 고함유 대두 가루를 본 명세서에서 서술된 안정성 측정에 사용하였다. 실시예2에 나타낸 바와 같이, 공정 샘플들을 다양한 단계들에서 취하여, 유리 트립토판에 대한 분석을 행하였다. 이러한 샘플들로부터의 상기 분석 결과를 하기 표 3에 요약하였다. 상기 결과들은 트립토판 고함유 대두 가루를 생산하는 동안에 유리 트립토판 농도의 손실이 없음을 증명하였다. 비탈지, 탈피, 및 수분 제거 상태로 표준화될 때, 상기 최종 대두 가루는 상기 대두 곡물에 포함된 초기 유리 트립토판을 약 98% 보존하였다. 비교해 보면, DT단계에서의 90분의 추가 가열 시간에 노출된 상기 대두 가루는, 매우 낮은 농도 의 트립토판을 가졌고, 이는 보다 강한 가열 조건하에서 분해될 수 있음을 나타내었다.
표 3 . 가공 중, 유리 트립토판의 안정성 및 보존성
Figure 112008009590106-PCT00005
* 비교 목적을 위하여 탈지되고, 탈피되고, 수분이 없는 상태로 표준화된 데이타
** 지나치게 구운 가루는 DT에서 90분 까지 시간을 증가시킴으로써 제조되었다.
상기 가루를 저장하는 동안 유리 및 전체 트립토판의 안정성을 측정하기 위해 안정성 시험을 수행하였다. 실시예 3 및 4에 개시된 상기 트립토판 고함유 대두 가루의 샘플을 4℃, 22℃, 및 38℃에서 6개월 동안, 실차고저온 챔버(environmental chamber)(캐나다, 마니토바, 위니피그, Enconair Ecological Chamber Inc., Enconair Model GC8-2H)에 저장하였다. 38℃에서 저장된 상기 샘플들을, 또한 습도 60%로 조절하였다. 트립토판 고함유 대두 가루 약 600 그램의 샘플을 날진 병(Nalgene jars)에 넣었다. 하기 표 4 및 5에서 특정된 시간에서 서브샘플들을 분석하였고, 이때 각각의 시간 포인트 분석은 2회씩 수행되었다.
그 결과들을 표 4 및 5에서 나타내었다. 상기 결과는, 유리 트립토판 및 단백질 결합 트립토판 모두 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루에서 6개월 이상, 심지어 상승된 온도(38℃)에서 안정하다는 것을 나타내었다.
표 4 . 저장하는 동안의 트립토판 고함유 대두 가루의 유리 트립토판의 안정성
Figure 112008009590106-PCT00006
표 5 . 저장하는 동안의 트립토판 고함유 대두 가루의 전체 트립토판의 안정성
Figure 112008009590106-PCT00007
표 4 및 표 5에서 각각의 데이타의 수치는 2회 반복실험한 것의 평균값을 나타낸다.
실시예 6
본 실시예는, 실시예 3에 서술된 바와 같이 제조된 트립토판 고함유 대두 가루를 사용한 브로일러 사료 연구를 설명한다.
사료 연구는, 7회의 식이 처리를 포함하고, 각 처리당 10회 반복하는 것을 포함하는 무작위적인 난괴법(Randomized Block Design)을 사용하여 수행하였다. 식 이처리와, 두개의 대두 가루의 분석 및 상기 연구에서 사용된 상기 사료 배합물은 표 6 내지 표 8에 설명하였다. 3개의 장치 기구들내의 세븐티 피터심 케이지들(Seventy Petersime(벨기에, Zulte) cages)을 10개의 블록들(반복물들)로 나누었다. 상기 블록들을, 각각의 기구 장치들내에서의 케이지들의 위치 및 레벨이 블록킹 요소(blocking factor)가 되도록 나누었다. 스트레인 로스 308(strain ross 308)(IA, Bancroft, Welp Hatchery)의 총 560마리의 수컷 브로일러(가금류들)를 상기 21일 시험에 사용하였다.
상기 가금류들이 7일령일 때, 그들의 무게를 재었고, 무작위적으로 우리에 배정하였으며, 상기 시험을 착수하였다. 상기 가금류들은, 성장기간 동안 내내 임의로 물과 사료에 접근하였다. 매쉬 식이(mash diet)가 모든 기간 동안 적용되었다.
표 6 . 사료 실험을 위한 처리법의 설명
처리방법 설명
1 기초 사료(Basal diet), Trp 57%, 100%의 기타 아미노산
2 처리방법 1에 보다 낮은 함량의 원료 대두 가루 추가
3 처리방법 1에 보다 높은 함량의 원료 대두 가루 추가
4 처리방법 2에 처리방법 6과 동일한 함량이 되도록 유리 트립토판 첨가
5 처리방법 3에 처리방법 7과 동일한 함량이 되도록 유리 트립토판 첨가
6 처리방법 1에 보다 낮은 함량의 양성 등치 대두 가루(HT) 추가
7 처리방법 1에 보다 높은 함량의 양성 등치 대두 가루(HT) 추가
표 7 . 시험 대두 가루(%)의 측정된 영양소 농도
Figure 112008009590106-PCT00008
7~14, 14~21, 21~28일 및 전체 기간동안에 평균 일당증체량, 사료 섭취량, 및 증체량에 대한 사료 비율을 계산하기 위해 시험 기간 중 대략 7, 14, 21 및 28일에 무게 및 사료섭취량 측정을 기록하였다. 또한, 상기 시험 동안 내내 치사율도 기록하였다.
실온을 첫날은 90±2oF로 조절하였고, 그런 다음, 매일 높은 온도와 낮은 온도를 기록하면서 시험이 끝날 때까지 매일 1oF 감소시켰다. 전체 실험에서 자정부터 1:00am까지 1시간 동안 암기를 유지하고, 그외 23시간 동안은 조명을 사용하였다. 각각의 우리에 시험 초기에 가금류 6마리를 넣었고, 성장 공간 밀도는 한마리당 0.58평방피트(square foot)이었다.
표 9에 처리법 2~7을 이용한 브로일러 실험 데이타의 요인 분석(factorial analysis)을 나타내었다. 또한, 비교 목적을 위하여, 대조군의 평균값도 개시하였 다. 실험기간 동안에 평균값 추세는 매우 유사하였다. 7~28일령의 결과는 대두 가루 함량에 따른 주요 효과들 사이에 사료:체증량 비율에 대한 주요 차이점이 있음을 나타내었다(P값＜0.0001). 상기 식이가 제1의 제한 영양소로서의 트립토판을 갖도록 배합되었기 때문에, SBM 함량의 증가로 인한 상기 실험의 양성 반응은 트립토판의 함량 증가에 기인한다. 트립토판 공급원에 따른 주요 효과로서의 시험 평균값들이 이러한 결론을 뒷받침한다. 원료 SBM+유리 트립토판(P+T, 처리법 4 및 5) 및 트립토판 양성 등치(isoline) SBM(HT, 처리법 6 및 7)의 처리법들은 동일한 양의 식이 트립토판을 가졌고, 그들의 실험결과는 매우 유사했다(0~28일 사료:체증량 비율이 P+T 및 HT에 대해 각각 1.611 및 1.624).
그러나, 보다 낮은 함량의 트립토판이 포함된 원료 SBM 식이가 급여된(처리법 2 및 3) 가금류들은 매우 열악한 결과를 나타냈다(0~28일 사료:체증량 비율이 1.801). 상기 실험의 결과는, 가금류 실험에 있어서, 유전자변형 트립토판 고함유 가루(HT)의 트립토판이 외인성으로 공급된(P+T) 합성 트립토판과 동등하다는 것을 또한 나타낸다.
표 8 . 생체이용률 실험의 성분 및 영양소 조성들. 주어진 값들은 중량% 기준이다.
Figure 112008009590106-PCT00009
표 9 . 브로일러 실험결과에 대한 트립토판 공급원 및 SBM 함량의 주요 효과들 및 상호작용.
Figure 112008009590106-PCT00010
실시예 7
본 실시예는, 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루를 제조하는데 유용한 트립토판 고함유, 단백질 고함유 대두 변종들의 생산을 서술한다.
옥수수 안트라닐레이트 합성효소 α 유전자(미국특허공보 제2003/0213010호에 서술됨)에 대한 동형 접합체인 R3 세대 대두를 단백질 고함유 대두 변종 EXP3103REN(PCT 출원 PCT/US05/002503에 개시됨)과 교배하여 F1 종자를 생산하였다. 상기 결과의 F1 종자를 심고, 완숙기까지 재배하여 F2 종자를 생산하였다. 상기 결과의 F2종자를 심었고, 결과의 식물을 글리포세이트 저항성 및 트립토판 함량에 대해 유전자 변이 시켰다. 상기 글리포세이트 저항성 및 트립토판 고함유 유전자에 대한 이형접합체로서 동정된 식물을 선발하였다. 상기 결과의 F2:3 종자를 단일 식물 수확물로 수집하였고, 당분야에서 공지된 방법을 사용하여 유리 트립토판(상기 실시예 2에 서술됨), 전체 단백질 및 전체 오일함량에 대해서 분석하였다. 상기 F2:3 선발물들의 분석 결과들은, 상기 트립토판 고함유 표현형이 대략의 예상 빈도로 단백질 고함유 생식질에서 발현하고, 허용가능한 오일 함량(표 10)은 유지된다는 것을 나타낸다.
표 10 . 유전자 변형된 대두의 트립토판 함량에 대한 고함량 단백질의 효과
Figure 112008009590106-PCT00011
표 10에 서술되어 있는 각각의 계통으로부터의 단일 라인에 대해 종자 조성, 글리포세이트 제초제에 대한 저항성 및 일반적 작물학을 평가하기 위해 경작지 실험(field trial)을 수행하였다. 상기 경작지 실험은, 다음의 3개의 글리포세이트 처리법을 2회 적용하는 무작위적 분할 플롯법(randomized split plot design)을 사용하였다; 글리포세이트 없음, V3 및 R1 단계에서 1.5lbs의 글리포세이트 산 당량(glyposate ae)/A, V3 단계에서 1.5lbs의 글리포세이트 산 당량/A, R1 단계에서 3.0lbs 글리포세이트 산 당량/A. 모든 플롯(plots)을 성숙기에 수확하여, 서브샘플들을 트립토판, 오일 단백질, 백화(chlorosis), 식물세포의 사멸(necrosis), 식물의 높이, 성숙도, 및 수확율에 대해서 분석하였다. F2:4 실험의 상기 결과들은, 트립토판 고함유 특성이 고단백질 생식질에서 발현된다는 초기 결과를 확인시켜 주었다. 게다가, 상기 결과는, 상기 트립토판 고함유 특성의 존재는 글리포세이트 저항성에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 본 실시예는 본 발명의 트립토판 고함유 대두 가루를 생산하는데에 사용하기 위한 추가의 대두 공급원을 제공한다. 이러한 대두들은 실시예 3에 서술된 바와 같은 트립토판 고함유 대두 가루로 가공된다.
본 발명은, 본 특허 출원에 본 발명의 바람직한 구체예의 상세한 설명에 따라 개시되어 있지만, 상기 개시는 제한적 의미가 아니라, 예시적인 의도로 설명된 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 정신 및 첨부된 청구범위내에서 당 분야의 당업자들은 용이하게 여러 변형들을 적용할 수 있을 것으로 고려된다.

Claims (34)

  1. 약 0.78중량% 이상의 전체 트립토판을 포함하고, 외인성 트립토판이 첨가되지 않은 대두 가루.
  2. 제 1항에 있어서, 약 0.8중량% 이상의 전체 트립토판을 포함하는 대두 가루.
  3. 제 1항에 있어서, 약 0.9중량% 이상의 전체 트립토판을 포함하는 대두 가루.
  4. 제 1항에 있어서, 약 1.0중량% 이상의 전체 트립토판을 포함하는 대두 가루.
  5. 제 1항에 있어서, 약 1.3중량% 이상의 전체 트립토판을 포함하는 대두 가루.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 대두는 유전자변형되지 않은 것인 대두 가루.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 대두는 유전자변형된 것인 대두 가루.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 전체 트립토판 함량은 적어도 0.10중량%의 유리 트립토판 농도를 더 포함하는 대두 가루.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 전체 트립토판 함량은 단백질 결합 트립토판 함량을 더 포함하는 대두 가루.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 단백질 결합 트립토판 함량은 유전자변형 단백질을 포함하는 대두 가루.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 유전자변형 단백질은 적어도 약 20%의 트립토판 잔기를 포함하는 대두 가루.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 대두는, 트립토판의 생합성 경로의 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 과발현하므로써 트립토판 고함량을 포함하는 것인 대두 가루.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 효소는 안트라닐레이트 합성효소, 포스포리보실안트라닐레이트 전이효소, 포스포리보실안트라닐레이트 이성질화효소, 인돌-3-포스페이트 합성효소, 및 트립토판 합성효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 대두 가루.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 효소는 안트라닐레이트 합성효소인 대두 가루.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 유전자는 형질전환유전자인 대두 가루.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 형질전환유전자는 피드백에 민감하지 않은 안트라닐레이트 합성효소를 인코드하는 것인 대두 가루.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 형질전환유전자는 모노머성 안트라닐레이트 합성효소를 인코드하는 것인 대두 가루.
  18. 제 12항에 있어서, 상기 유전자는 유전자변형 전사 요소의 결과로서 과발현되는 것인 대두 가루.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 대두는 트립토판 생합성 경로에서 반응을 촉매화하는 효소를 인코드하는 형질전환유전자를 발현하고, 상기 효소는, 상기 동일한 반응을 촉매화하는 외인성 효소와 비교하여 피드백 억제에 덜 민감하거나 또는 무감각한 것인 대두 가루.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 형질전환유전자는 안트라닐레이트 합성효소를 인코드하는 것인 대두 가루.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 안트라닐레이트 합성효소가 옥수수 C28변종인 대두 가루.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 트립토판의 분해 경로에서의 하나 또는 그 이상의 효소의 활성이 감소된 대두 가루.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 분해 경로에서의 상기 효소는 분지산 변위효소(chorismate mutase), 트립토판아제(tryptophanase), 및 트립토판 옥시다아제(tryptophan oxidase)를 포함하는 것인 대두 가루.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 활성이, 트립토판의 분해 경로에서의 적어도 하나의 효소를 인코딩하는 유전자의 유전자 억제로 인해 감소된 것인 대두 가루.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 억제는 안티센스 공동-억제 또는 센스 공동-억제를 사용하여 수행되는 것인 대두 가루.
  26. 제 1항에 기재된 대두 가루를 포함하는 동물 사료.
  27. 제 1항에 기재된 대두 가루를 포함하는 발효 사료 공급원.
  28. 제 1항에 기재된 대두 가루로부터 제조된 대두 단백질 농축물.
  29. 제 1항에 기재된 대두 가루를 포함하는 양어 양식 사료.
  30. 다음의 단계들을 포함하는, 적어도 약 0.78중량%의 전체 트립토판을 갖는 대두 가루의 제조 방법:
    a) 트립토판 생합성 경로에서의 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 형질전환유전자를 대두 식물의 재생가능한 세포에 도입하는 단계(여기에서, 상기 분리된 핵산 분자는 형질전환된 대두 식물 세포를 얻기 위해, 대두 세포에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다);
    b) 상기 형질전환된 대두 식물 세포로부터 대두 식물을 재생시키는 단계(여기에서, 상기 식물의 세포는 동일한 유전적 배경의 비형질전환된 대두 식물의 곡물내의 트립토판 함량과 비교하여 상기 식물의 곡물내의 트립토판 함량을 증가시키기 위한 유효량의 분리된 핵산 분자에 의해 인코드된 효소를 발현한다); 및
    c) 상기 형질전환된 식물의 상기 곡물로부터 대두 가루를 제조하는 단계.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 형질전환유전자는 안트라닐레이트 합성효소 α-도메인 및 안트라닐레이트 합성효소 β-도메인을 포함하는 모노머성 안트라닐레이트 합성효소를 인코드하는 것인 대두 가루의 제조방법.
  32. 제 30항에 있어서, 상기 형질전환유전자는 피드백에 민감하지 않은 옥수수 안트라닐레이트 합성효소 α-서브유닛을 인코드하는 것인 대두 가루의 제조방법.
  33. 다음의 단계들을 포함하는 대두 가루의 제조 방법:
    a) 약 0.65중량%~약 1.2중량%의 전체 트립토판 함량을 갖는 대두 곡물을 선택하는 단계; 및
    b) 대두 가루를 제조하기 위해서 상기 곡물로부터 오일을 추출하는 단계.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 곡물은 0.15중량% 이상의 유리 트립토판을 포함하는 것인 대두 가루의 제조방법.
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