CN101938909A - 具有改变的特性的大豆蛋白产品 - Google Patents

Abstract

本发明描述了获自高油酸大豆的大豆蛋白产品，其中此类产品具有改善的白度、减少的粘度和减少的凝胶强度。还公开了此类产品在食品、饮料和动物饲料中的用途。

Description

具有改变的特性的大豆蛋白产品

发明领域

本发明涉及获自高油酸大豆的大豆蛋白产品，其中所述蛋白产品具有改善的白度、减少的粘度和减少的凝胶强度。

背景技术

大豆在谷类食物和豆类中具有最高的蛋白含量。具体地讲，大豆具有约40％的蛋白，而其他豆类具有20-30％的蛋白，谷类食物具有约8-15％的蛋白。大豆还包含约20％的油，其余的干物质大多是碳水化合物(35％)。以湿基计(按原样)，大豆包含约35％的蛋白，17％的油，31％的碳水化合物和4.4％的灰分。大豆贮藏蛋白和脂质体包含在大豆可用的果肉部分(称为子叶)中。络合碳水化合物(或饮食纤维)也包含在子叶的细胞壁中。细胞的外层(称为种皮)占大豆总重量的约8％。未加工的带壳大豆取决于其品种包含大约18％的油，15％的不溶解碳水化合物，14％的水分和灰分，以及38％的蛋白质。

将植物蛋白材料用作功能性食物成分，并且在提高食物产品所期望的特性方面具有多种应用。大豆蛋白材料具体地讲已经被广泛用作功能性食物成分。在肉类产品中将大豆蛋白材料用作乳化剂以结合肉类并给予肉类产品良好的质地和结实的咬感。大豆蛋白材料作为功能性食物成分的另一个常见应用是作为增稠剂以向食物产品提供奶油状的粘度。

大豆蛋白材料通常包括大豆薄片、大豆粗磨粉、豆粕、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、和大豆分离蛋白，这些材料之间的主要差异是相对于完整大豆的精细化程度。

除了大豆蛋白含量之外，大豆蛋白材料的口味、凝胶强度、白度指数、和粘度也是大豆蛋白材料作为功能性食物成分的相关选择标准。常规的大豆蛋白材料可能具有强的豆腥味、苦味和气味(由于存在某些挥发性化合物而导致)和/或不可取的外观(这是由于在大豆蛋白材料中存在其他分子量相对较低的化合物而导致)。

本公开发明一般涉及包含大豆蛋白的组合物，该组合物具有减少的凝胶强度、减少的粘度、以及改善的白度。

在2003年7月29日授予Stark等人的美国专利6,599,556B2描述了糖果产品，该产品包括高蛋白含量的改性油料种子材料。

在2004年4月06日授予Stark等人的美国专利6,716,469B2描述了冷甜点产品，该产品包括高蛋白含量的改性油料种子材料。

在2004年4月13日授予Karleskind等人的美国专利6,720,020 B2描述了饮料组合物产品，该产品包括高蛋白含量的改性油料种子材料。

在1993年7月02日授予Takeshi等人的JP专利5,168,416 A1描述了获取浓缩大豆的方法，该浓缩大豆具有改善的味道、口味和色调，并且用作食物物料等，所述方法操作简单，成本低廉，并且不使蛋白变性，它通过用包含酒精的水在存在酸的弱酸条件下洗涤大豆等进行。

在1992年7月29日授予Hiroko等人的JP专利4,207,159 A1描述了具有亮白色调的原材料，它用于海产和揉捏吞食器-用碱金属氢氧化物控制pH的酸沉淀大豆蛋白的分散液体。

公布于2007年2月1日的WO2007013146A1描述了用于加工过的大豆蛋白食物的组合物。

发明概述

在第一实施方案中，本发明涉及获自高油酸大豆的大豆蛋白产品，其中所述产品在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时具有至少一种选自以下的特性：改善的白度、减少的凝胶强度和减少的粘度，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

在第二实施方案中，本发明涉及得自高油酸大豆的大豆蛋白产品，所述产品在与得自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时在白度指数上具有至少3％的增加，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

在第三实施方案中，本发明涉及得自高油酸大豆的未水解大豆蛋白产品，所述产品在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时在粘度上具有至少9％的减少，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

在第四实施方案中，本发明涉及得自高油酸大豆的大豆蛋白产品，所述产品在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时在凝胶强度上具有至少25％的减少，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

在第五实施方案中，本发明涉及选自以下产品的大豆蛋白产品：大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豆粕、全脂豆粉、脱脂豆粉、豆浆粉、豆浆、组织化蛋白、组织化豆粉、组织化浓缩物和组织化分离物。

在第六实施方案中，本发明涉及用于改善大豆蛋白产品干燥效率的方法，所述方法包括与获自商品大豆的至少一种大豆蛋白产品的给料相比，将获自高油酸大豆种子的至少一种大豆蛋白产品以更高的给料固体给料于巴氏灭菌器或烘干机。

在第七实施方案中，本发明涉及用于改善大豆蛋白产品干燥效率的方法，所述方法包括将获自高油酸大豆种子的至少一种大豆蛋白产品以不小于14％的给料固体给料于巴氏灭菌器或烘干机。

本发明的另一些实施方案包括按无水计具有至少40％、65％、或90％的蛋白(N×6.25)的大豆蛋白产品。

在其他方面，可将本发明的大豆蛋白产品用于包含本发明的大豆蛋白产品的食品、饮料、和动物饲料。

附图简述和序列表

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1示出质粒pKS210。

图2示出质粒PHP17731。

图3示出质粒PHP17064。

图4示出片段PHP19340A。

图5示出片段PHP17752A。

图6示出质粒PHP19340。

图7示出质粒PHP17752。

SEQ ID NO：1示出重组DNA片段PHP21676A的序列。

SEQ ID NO：2示出1533个多核苷酸片段的序列，该片段包含来自大豆FAD2-2基因的470个核苷酸，来自大豆FAD2-1基因的420个核苷酸，来自大豆FAD3基因的643个核苷酸。

SEQ ID NO：3示出寡核苷酸引物BM35的核苷酸序列，该引物用于扩增来自重组DNA片段KSFAD2-杂交体的大约0.9Kb的片段。

SEQ ID NO：4示出寡核苷酸引物BM39的核苷酸序列，该引物用于扩增来自重组DNA片段KSFAD2-杂交体的大约0.9Kb的片段。

SEQ ID NO：5示出寡核苷酸引物BM40的核苷酸序列，该引物用于扩增来自质粒XF1的大约0.65Kb的DNA片段。

SEQ ID NO：6示出寡核苷酸质粒BM41的核苷酸序列，该引物用于扩增来自质粒pXF1的大约0.65Kb的DNA片段。

SEQ ID NO：7示出重组DNA片段KSFAD2-杂交体的核苷酸序列，该片段包含来自大豆FAD2-2基因的约470个核苷酸和来自大豆FAD2-1基因的420核苷酸。

SEQ ID NO：8示出寡核苷酸引物KS 1的核苷酸序列，该引物用于扩增来自大豆FAD2-2基因的约470个核苷酸。

SEQ ID NO：9示出寡核苷酸引物KS2的核苷酸序列，该引物用于扩增大豆FAD2-2基因的约470个核苷酸。

SEQ ID NO：10示出寡核苷酸引物KS3的核苷酸序列，该引物用于扩增来自大豆FAD2-1基因的约420个核苷酸。

SEQ ID NO：11示出寡核苷酸引物KS4的核苷酸序列，该引物用于扩增来自大豆FAD2-1基因的约420个核苷酸。

SEQ ID NO：12示出来自pKS133的种子特异性基因表达-沉默盒的核苷酸序列，该盒包含Kti3启动子和终止子的核苷酸，它们邻接促进围绕唯一Not I限制性内切酶位点的茎结构形成的一串核苷酸。

SEQ ID NO：13示出质粒pKS210的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14示出质粒PHP17731的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15示出重组DNA片段PHP17731A的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16示出ALS选择性标记重组DNA片段的核苷酸序列。该重组DNA片段包含可操作地连接至编码大豆乙酰乳酸合酶的核苷酸片段的启动子，该核苷酸片段已经导入了突变以使其抗磺酰脲类除草剂处理。

SEQ ID NO：17示出包括在亚序列B和F中的突变的大豆除草剂抗性ALS的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是在美国专利5,013,659中公开的保守ALS“亚序列B”的野生型氨基酸序列。

SEQ ID NO：19示出在美国专利5,013,659中公开的保守ALS“亚序列F”的野生型氨基酸序列。

SEQ ID NO：20示出在克隆大豆ALS氨基-末端期间导入的五个附加氨基酸的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21示出质粒PHP17064的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22示出重组DNA片段PHP17064A的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23示出片段PHP19340A的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24示出片段PHP17752A的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25示出质粒PHP19340的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26示出质粒PHP17752的核苷酸序列。

序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中所列出的规定。

发明详述

本文引用的所有专利、专利申请、和公布全文以引用方式并入本文。

在本公开的上下文中将利用许多术语。

如本文所用，“大豆”指物种大豆(Glycine max)、野生大豆(Glycine soja)、或与大豆(Glycine max)性交相容的任何物种。“品系”是相似亲本的一组植物，它们个体之间的至少一个特性显示很小的或无基因变异。此类品系可通过一代或多代的自花授粉和选择形成，或者通过单一亲本的无性繁殖形成(包括组织或细胞培养技术)。“农学上的优良品系”或“优良品系”指具有所期望的农学性能的品系，这些农学性能可商业利用或不可商业利用。“品种”、“栽培变种”、“优良品种”、或“优良栽培变种”指农学上优异的优良品系，该品系已经进行了广泛的测试，并且用于或以前用于商业大豆生产。“突变”指可检测到的和可遗传的基因改变(自发的或诱发的)，该基因改变不是由分离或基因重组引起。“突变体”指具有突变的个体或个体的后代。

大豆蛋白产品的“白度指数”指包含大豆蛋白的组合物的颜色。许多包含大豆蛋白的饲料组合物将具有不同程度的微黄色或褐色。这些组合物的颜色通常能被“改善”，即，可通过本发明的方法提高产品的“白度指数”。白度指数通常使用色度计进行测定，色度计提供组合物的L、a、和b颜色值，由此可使用白度指数(WI)的标准表达式WI＝L-3b计算白度指数。L分量一般指示样本的白度或“明度”；L值近于0指示黑色样本，而L值近于100指示白色样本。b值指示样本中存在的黄色和蓝色；b正值指示存在黄色，而b负值指示存在蓝色。a值可用于其他颜色的测量，指示红色和绿色；正值指示存在红色，而负值指示存在绿色。就b值和a值而言，测量的绝对值随着相应的颜色增加的强度而提高。色度计通常使用与色度计一起提供的白度标准卡进行标准化。然后将样本放入玻璃单元，再将玻璃单元导入色度计。样本单元用不透明盖覆盖以最小化环境光透过样本到达检测器的可能性，并且在样本测量期间一直使用。因为通常测量相同材料的多个样本，在读数后将样本单元倒空并通常再充满，并且材料的白度指数用测量平均值表示。合适的色度计一般包括那些由HunterLab(Reston，VA)制造的色度计，包括例如配有光学传感器D 25的Model # DP-9000。

使用包括光学传感器D-25的HunterLab DP-9000色度计测量处理前和经处理后包含按重量计5％固体的悬浮液样本的白度指数，色度计和光学传感器均由Hunter Associates Laboratory(HunterLab)(Reston，VA)制造。就大规模生产平台中的白度指数测量而言，蛋白样本按5％w/w基分散：(5.25g)加到去离子水(100mL)中。就小规模生产平台中的白度指数测量而言，将1g蛋白样本按w/v基分散到19mL去离子水中。使用Hunter色度计获得的结果以L、a、和b单位报告。白度指数使用下式从L和b刻度值计算得到：白度指数＝L-3b。

除改善颜色之外，通过本公开的方法生产的大豆蛋白产品还能具有减少的粘度。

粘度、胶凝作用和其他结构形成的指示是大豆蛋白的重要特性，因为它们有助于产品应用的总体效用。蛋白通过形成含水的聚集蛋白分子的三维网状结构有助于产品的实心度和弹性。有时期望具有这些特性，例如类似肉的产品，或者可能期望具有较少的此类特性，例如饮料产品。就饮料应用而言，可能期望饮料的感官、口感和质地特性具有较低的粘度。粘度较低的包含大豆蛋白的组合物可旨在用于液体产品(即，饮料)；并且另外，在一些实施方案中，粘度较低的包含大豆蛋白的组合物可能期望用于肉类产品中。

如本文所用，术语“粘度”指含水浆液或溶液的表观粘度，它用旋转锭子粘度计，利用一个大的环面进行测量，其中尤其优选的旋转锭子粘度计是布氏粘度计。在另一个实施方案中，可使用Rapid Visco Analyzer(RVA)粘度计或AR-1000流变仪测量表观粘度。

术语粘度通常指浆液或溶液的表观粘度，它用旋转锭子粘度计，利用一个大的环面进行测量，其中尤其优选的旋转锭子粘度计是布氏粘度计。例如可通过以下方法测量大豆蛋白材料的表观粘度：称重大豆材料和水的样本以获得大豆材料对水的已知比率(按重量计优选1份大豆材料对9份水)，在环境温度和中性pH条件下，在共混机或搅拌器中合并，然后将大豆材料和水进行混合以形成大豆材料和水的均一化浆液，并且用旋转锭子粘度计，利用一个大的环面，以大约60的每分钟转数和从30至70％的扭矩测量浆液的表观粘度。

另一个重要的功能特性是蛋白的凝胶形成特性。蛋白胶凝作用对食物获得所期望的感官和组织结构是重要的。

蛋白凝胶的形成是一个两步过程，该过程起始于蛋白分子的部分变性。一旦蛋白变性，作为与去折叠蛋白相关联的分子改变增加的结果，浆液粘度增加。在该过程的第二部分期间，因为蛋白缔合和分子网络的发展，粘度有大的增加。

胶凝作用现象需要动力以打开天然蛋白结构，随后通过聚合使基质保持某种程度的顺序，所述基质通过蛋白链之间的缔合形成。蛋白胶凝传统上通过加热获得，但是一些物理和化学方法以与加热诱导类似的途径形成蛋白凝胶。除加热之外的物理方法是高压。化学方法是酸化、酶交联、以及使用盐和尿素引起蛋白-蛋白和蛋白-介质相互作用的变化。每种凝胶的特性是不同的，取决于以下因素：例如，蛋白浓度，由pH、温度、离子强度和/或压力引起的变性程度。

术语“凝胶强度”指蛋白形成凝胶的能力或量度。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C₁₂至C₂₂(尽管更长和更短链长的酸两者均是已知的)。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中C原子的总数，而Y表示双键的数目。

总的来说，脂肪酸被分为饱和的和不饱和的两类。术语“饱和脂肪酸”是指其碳主链不含“双键”的脂肪酸。相对的，“不饱和脂肪酸”的碳主链(通常为顺式构型)则含有“双键”。“单不饱和脂肪酸”的碳主链含有一个“双键”(例如，在棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)中通常位于第9号和第10号碳原子之间)，而“多不饱和脂肪酸”(或者叫“PUFA”)的碳主链则含有至少两个双键(例如，在亚油酸(18:2)中位于第9号和第10号以及第12号和第13号碳原子之间；在α-亚麻酸(18:3)中位于第9号和第10号、第12号和第13号以及第15号和第16号碳原子之间)。

术语“总脂肪酸含量”指存在于大豆中的五个主要脂肪酸组分的总量，即C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、和C18:3。术语“总多不饱和脂肪酸含量”指C18:2加上C18:3的总含量。

对于本公开内容而言，将使用ω-指代系统指示碳原子数、双键数和从ω碳原子开始计最靠近ω碳原子的双键的位置(它是脂链的末端原子并且为此编号为1)。该命名显示于下表1的名称为“简化符号(Shorthand Notation)”的栏中。

表1

多不饱和脂肪酸命名

俗名	缩写	化学名称	简化符号
				亚油酸	LA	顺式-9，12-十八碳二烯酸	18:2 ω-6
α-亚麻酸	αLIN	顺式-9，12，15-十八碳三烯酸	18:3 ω-3

术语“去饱和酶”指能够去饱和，即，导入双键到一个或多个脂肪酸中以制备单或多不饱和脂肪酸或受关注的前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。

术语“FAD”和脂肪酸去饱和酶互换使用，指膜结合微粒体油酰-和亚油酰-磷脂酰胆碱去饱和酶，它在将分子氧还原成水的反应中分别将油酸转化成亚油酸以及将亚油酸转化成亚麻酸，并且需要存在NADH。

术语“高油酸大豆”指具有按种子重量计至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、和95％油酸含量的大豆种子。优选的高油酸大豆油原料公开于世界专利公布WO94/11516中，其公开内容以引用方式并入本文。

术语酶“活性”指酶将底物转化成产物的能力。

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”、和“分离的核酸片段”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可为单链或双链RNA或DNA的聚合物，它任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。以DNA聚合物形式存在的多核苷酸可由一个或多个cDNA、基因组DNA、合成DNA、或它们的混合物的链段构成。核苷酸(通常以5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

术语“具有相当功能的亚片段”和“功能上相当的亚片段”在本文中可互换使用。这些术语是指分离的核酸片段的一个部分或亚序列，其中无论所述片段或亚片段是否编码有活性的酶，其都保留着改变基因表达或导致某种表型的能力。例如，所述片段或亚片段可以被用于设计嵌合基因，以在转化后的植物中产生所期望的表型。

可通过将核酸片段或亚片段以相对于植物启动子序列有义或反义的方向与所属启动子序列连接，从而设计出用于抑制的嵌合基因，其中所述核酸片段或亚片段无论是否编码有活性的酶均可。

术语“同源性”、“同源的”、“基本上类似的”和“基本上对应的”在本文中可互换使用。它们指其中一个或多个核苷酸碱基的变化不会影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应该理解的，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。

“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸片段，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。“等位基因”是染色体上占据给定位点的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当染色体上给定位点处存在的所有等位基因相同时，植物在该位点是纯合子。如果染色体上给定位点处存在的等位基因不同的话，植物在该位点是杂合子。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA区域。启动子序列由最接近的和较远的上游元件构成。这些上游元件常常指增强子。因此，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，它可为启动子的天然元件，或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；在Okamuro和Goldberg(1989)，Biochemistry of Plants 15：1-82的汇编中可找到许多实例。

任何种子特异性的启动子可根据本发明的方法使用。因此，只要能够从种子中期望的核酸片段中转录出足够的RNA完成本发明，选择的用于启动重组DNA片段表达的启动子起点是不重要的。

更多的启动子在公布于2000年4月6日的WO 00/18963中描述，其公开内容以引用方式并入本文。种子特异性启动子的实例包括但不限于大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子(Kti3，Jofuku and Goldberg(1989)Plant Cell 1：1079-1093)β-伴球蛋白启动子(Chen等人，(1989)Dev.Genet.10 112-122)、napin启动子、和菜豆蛋白启动子。

可用于表达本发明核酸片段的启动子的具体实例包括但不限于SAM合成酶启动子(PCT公开WO00/37662，公布于2000年6月29日)、CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)、和描述于公布于2002年12月12日的PCT公开WO02/099063的启动子。

“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner和Foster(1995)Mol.Biotechnol.3：225-236)。

“3′非编码序列”，“转录终止子/终止序列”是指位于编码序列下游并且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列和其他序列编码调节信号的DNA序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。不同3′非编码序列的用途例示于Ingelbrecht等人(1989)Plant Cell 1：671-680中。

“内含子”是基因中不编码蛋白序列部分的居间序列。因此，此类序列转录成RNA后被切除，不被翻译。该术语也用于切除的RNA序列。“外显子”是被转录的基因序列的一部分，并且存在于得自该基因的成熟信使RNA中，但是不是编码最终基因产物的序列的必需部分。

“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物。当RNA转录物是来源于转录后加工的初级转录物的RNA序列时，它指成熟的RNA。“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。“有义”RNA指包含mRNA并且能在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻止靶基因表达的RNA(美国专利5,107,065)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子、或编码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其他不能翻译但是对细胞过程有影响作用的RNA。术语“互补的”和“反向互补的”对mRNA转录来说可互换使用，并且用以定义信使反义RNA。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的调控。例如，当启动子能够调节编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。在另一个例子中，本发明的互补RNA区域，无论直接或间接连接、5′端与目标mRNA或3′端与目标mRNA连接、或者位于目标mRNA内、或者第一互补区域以5′端而其互补体以3′端与目标mRNA连接，均可构成可用的连接。

术语“内源RNA”指在用本发明的重组构建体转化之前由存在于宿主基因组中的任何核酸序列编码的任何RNA，它可为天然存在的或非天然存在的，即，通过重组方法、诱变等导入的。

术语“非天然存在的”指人工的，与通常天然存在的不一致。

本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且详细描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989。转化方法为本领域的技术人员所熟知，并描述于下文。

“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量的特定DNA片段的技术，其包括一系列重复的循环(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。典型地，双链DNA被热变性，两个与目标片段的3′端区域互补的引物在较低温度下与之退火，然后在中间温度下得到延伸。一组的上述三个连续的步骤被称为一个循环。

术语“重组”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。

术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可为源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多种核苷酸序列已连接或重组进入一个独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如嵌合构造可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞，遗传元件必须存在于载体上。技术人员也将认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和不同模式的表达(Jones等人，1985 EMBO J.4：2411-2418；De Almeida等人，(1989)Mol.Gen.Genetics 218：78-86)，因此，必须筛选多次事件以获得显示期望表达水平和模式的品系。这样的筛选可通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。

本文所用术语“表达”是指功能性终产物如mRNA或蛋白质(前体或成熟形式))的生产。

如本文所用，术语“表达盒”指可将核酸序列或片段导入其中的不连续的核酸片段。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和肽原可为(但不限于)细胞内定位信号。

“共抑制”指生产能够抑制相同或基本上类似的天然基因表达的有义RNA转录物(美国专利公开5,231,020，该专利在1999年7月27日授予Jorgensen等人)。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，1998，Plant J.，16：651-659；以及Gura，2000 Nature 404：804-808)。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。可将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。已经描述了“发夹”结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(于1999年10月21日公开的PCT专利公开WO99/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述，参见Wesley等人，2003，Methods in Molecular Biology，Plant Functional Genomics：Methods and Protocols 236：273-286。其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任意的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的WO 99/61632)。使用聚-T和聚-A序列产生茎-环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日公开的WO 02/00894)。然而另一种变型涉及使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的多核苷酸的水平降低，如于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00904中所述。已经描述了产生dsRNA构建体的用途。在这些构建体中，趋同启动子引导诱导基因抑制的基因特异性有义和反义RNA的转录(参见例如Shi等人(2000)RNA 6：1069-1076；Bastin等人(2000)J.Cell Sci.113：3321-3328；Giordano等人(2002)Genetics 160：637-648；LaCount，和Donelson.美国专利申请20020182223，公布于2002年12月5日；Tranet al.(2003)BMCBiotechnol.3：21；和申请人的美国临时申请60/578,404，提交于2004年6月9日)。

用于酶抑制的其他方法包括但不限于使用可形成催化RNA或可具有核酶活性的多核苷酸(美国专利公开4,987,071，公布于1991年1月22日)，以及小RNA(也称为miRNA)干涉(Javier等人(2003)Nature 425：257-263)。

微RNA(miRNA)是控制基因表达的小调控RNA。miRNA结合到靶RNA的区域上，并且抑制它们的翻译并因此干涉由靶RNA编码的多肽的生产。可将miRNA设计成与靶序列RNA的任何区域互补，包括3′非翻译区域、编码区域等。miRNA由高度结构化的RNA前体加工得到，该前体由核糖核酸酶III(称为DICER)进行加工。虽然miRNA作用的确切机制是未知的，但是似乎它们的功能是调节靶基因的表达。参见例如公布于2004年12月30日的美国专利公开2004/0268441 A1。

如本文所用，术语“表达”是指功能性终产物如mRNA或由mRNA翻译成的多肽的生产。

“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。-“共抑制”是指产生能抑制相同的或充分相似的外来或内源性基因表达的有义RNA转录本(美国专利5,231,020)。

“超表达”指在与正常的、野生型的或非转化的生物的功能性终产物的表达进行比较时，转基因生物的功能性终产物的生产水平超过前者的生产水平。

“稳定转化”指将核酸片段转入宿主生物的基因组以产生稳定的遗传特性，该基因组包括核基因组和细胞器基因组。相反，“瞬时转化”指将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物体。

本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)；Silhavy等人，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。一旦制备了重组构建体，然后可通过本领域普通技术人员熟知的方法将其导入选择的植物细胞或酵母细胞中，所述方法包括例如转染、转化和电穿孔(参见下文)。优选的植物细胞为油料种子植物细胞。然后在允许表达长链PUFA的合适条件下培养和再生转化过的植物细胞，所述重组构建体随后被回收并纯化。

可将重组构建体导入一个植物细胞中或者可将构建体导入分开的植物细胞中。

如前所述，在植物细胞中的表达方式可为暂时性的也可为稳定的。

植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于：根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织、多种形式的细胞和培养物如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可存在于植株或器官、组织或细胞培养物中。

术语“植物器官”是指构成植株的形态和功能不同部分的植物组织或组织群。术语“基因组”是指：1.存在于生物体的每一个细胞或者病毒或细胞器中的全套遗传物质(基因和非编码序列)；2.作为(单倍体)单位从一个亲本遗传的全套染色体。术语“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体或细胞的基因组中，导致基因稳定遗传。

用于转化双子叶植物(主要通过利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))以及获得转基因植物的方法已经被公布，它们用于棉花(美国专利5,004,863、美国专利5,159,135)；大豆(美国专利5,569,834、美国专利5,416,011)；芸苔属植物(美国专利5,463,174)；花生(Cheng等人(1996)Plant Cell Rep.15：653-657，McKently等人(1995)Plant Cell Rep.14：699-703)；木瓜(Ling等人(1991)Bio/technology 9：752-758)；以及豌豆(Grant等人，(1995)Plant Cell Rep.15：254-258)等等。对植物转化的其他常用方法的综述参见Newell(2000)Mol.Biotechnol.16：53-65。这些转化方法之一利用了发根农杆菌(Tepfler，和Casse-Delbart(1987)Microbiol.Sci.4：24-28)。已公布的利用直接输送DNA进行的大豆转化，有利用PEG融合(PCT专利公布WO 92/17598)、电穿孔(Chowrira等人，(1995)Mol.Biotechnol.3：17-23；Christou等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3962-3966)、显微注射、或粒子轰击(McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923；Christou等人，(1988)Plant Physiol 87：671-674)。

存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach，(1988)：Methods for Plant Molecular Biology，(编辑)，Academic：San Diego，CA)。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

除以上所讨论的程序以外，专业人员亦熟悉描述了用于大分子的构建、操作和分离(例如DNA分子、质粒等等)、重组DNA构建体和重组表达构建体的构建以及克隆的筛选和分离的特定条件和程序的标准源资料(例如参见Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor：NY；Maliga等人(1995)Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor：NY；Birren等人(1998)Genome Analysis：Detecting Genes，1，Cold Spring Harbor：NY；Birren等人(1998)Genome Analysis：Analyzing DNA，2，Cold Spring Harbor：NY；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，编辑，Clark，Springer：NY(1997))。

在一个方面，本发明包括来源于高油酸大豆的蛋白产品。

本发明包括获自高油酸大豆的蛋白产品，其中所述产品在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时具有至少一种选自以下的特性：改善的白度、减少的凝胶强度和减少的粘度，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

另一个实施方案涉及获自高油酸大豆的蛋白产品，其中所述白度指数在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时增加至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、或50％，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

另一个实施方案涉及获自高油酸大豆的蛋白产品，其中所述凝胶强度在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时减少至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、或60％，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

另一个实施方案涉及获自高油酸大豆的未水解的蛋白产品，其中在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时所述凝胶强度减少，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

另一个实施方案涉及获自高油酸大豆的未水解的蛋白产品，其中所述凝胶强度在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时减少至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、或60％，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

另一个实施方案涉及获自高油酸大豆的蛋白产品，其中所述粘度在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时减少至少9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、58％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、或87％，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

粘度减少的一个优点是改善干燥效率。因为受热导致的粘度和聚集并形成凝胶的倾向，当前商品大豆在能被给料于烘干机的给料固体浓度上存在限制。如果商品大豆必须以高固体进行干燥，则必须提高给料固体的温度以预防蛋白聚集形成胶凝；这增加了加热的成本并导致对蛋白溶解度的严重破坏。

减少的浓度和凝胶特性允许操作者显著提高给料固体的浓度，因为浆液能在正常温度下无胶凝地被轻易地泵入设备。

这意味着在干燥过程期间，必须从给料到烘干机中的每磅物料中除去的水较少。这种转化降低了使用的能量，并且每小时可干燥的固体较多，导致有较多的蛋白产物用于销售。

本发明的另一个实施方案涉及选自以下的大豆蛋白产品：大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豆粕、全脂豆粉、脱脂豆粉、豆浆、组织化蛋白、组织化豆粉、组织化浓缩物和组织化分离物。

如本文所用，“豆浆”指下列的任意一种或多种含水混合物：细磨大豆、大豆粉、大豆薄片、大豆浓缩液、大豆分离蛋白、大豆乳清蛋白、以及下列的任意一种或多种含水提取物：大豆、大豆薄片和大豆粉，其中已经除去了不溶解材料。豆浆可包含附加组分，包括但不限于脂肪、碳水化合物、甜味剂、着色剂、稳定剂、增稠剂、调味剂、酸、碱。

下文描述了一种制备豆浆的方法。

稳定剂(羧甲基纤维素和角叉菜胶)与一些糖干混，加入90％的水。用中到高的剪切力搅拌混合物一分钟或搅拌至观察不到块状物。加入多价螯合剂(柠檬酸钾、六偏磷酸钠和磷酸钾)并混合一分钟。加入蛋白并充分分散。将浆液加热至170℉并保持10分钟。将剩余的干燥成分加入蛋白浆液中并混合5分钟。在匀速搅拌下加入大豆油并混合三分钟。将维生素和矿物质共混物分散在10％水中，加到蛋白浆液中并混合5分钟。用NaOH按需将浆液pH调节至7.0-7.2。浆液在500psi(第二重)和2500psi(第一重)匀化。浆液通过超高温(UHT)处理在141℃(286℉)巴氏灭菌6秒钟。将混合物冷却至31℃(88℉)并包装在灭菌瓶中。产品在冷冻温度下贮存。

如本文所用，“豆浆粉”指脱水豆浆。豆浆可通过多种方法脱水，包括但不限于喷雾干燥、盘式干燥、洞道式干燥、和冷冻干燥。

本发明的另一个实施方案涉及用于改善大豆蛋白产品干燥效率的方法，所述方法包括与获自商品大豆的至少一种大豆蛋白产品的给料相比，将获自高油酸大豆种子的至少一种大豆蛋白产品以更高的给料固体给料于巴氏灭菌器或烘干机。

本发明的另一个实施方案涉及改善干燥效率的方法，与商品大豆蛋白产品的给料相比，该方法包括将高油酸大豆蛋白产品以不小于14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、或30％的给料固体给料于巴氏灭菌器或烘干机，从商品大豆获取大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取大豆蛋白产品的方法相同。

大豆蛋白产品分为三大类。这些分类按蛋白含量计，在40％至高于90％的范围内。所有三个基本大豆蛋白产品分类(除全脂豆粉之外)来源于脱脂薄片。它们是以下产品：大豆粉和粗磨粉、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白。这些产品在下文中详细讨论。

如本文所用，术语“未水解的蛋白产品”、“未水解的大豆蛋白产品”指尚未经过酶蛋白水解步骤的蛋白产品。

如本文所用，术语“酶水解”指通过加入特异性酶导致的蛋白或化学化合物的降解。

本发明的另一些实施方案包括按无水计具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％蛋白(N×6.25)的大豆蛋白产品。

可将本发明的大豆蛋白产品掺入食品、饮料、和动物饲料中。

术语“动物饲料”指提供给动物如牲畜和宠物的食物。一些饲料提供健康的和营养的饮食，而其他饲料可缺乏营养物质。向动物提供广泛不同的饲料，但是动物饲料的两种主要类型是加工过的动物饲料(配合饲料)和草料。

配合饲料是由多种原材料和添加剂混合成的饲料。用于商业制备的饲料的主要成分是饲料谷物，它们包括玉米、大豆、高粱、燕麦、和大麦。这些共混物根据目标动物的特定需要进行配制(包括不同类型的牲畜和宠物)。

它们通过饲料混合器被制造成粗粉型、小丸或胶粒。

配合饲料可为提供所有日常所需的营养物质的完全饲料、提供部分给养(蛋白、能量)的浓缩物或仅提供附加微量营养素如矿物质和维生素的补充剂。

氧化和由此导致的动物饲料成分的储存寿命是工业中的常见问题。氧化是不可逆的化学反应，其中氧与饲料组分反应并能导致动物健康和状态不佳。氧化的负效应可见于适口性降低、含油组分降解、产品不必要的降解增加、颜色变化、以及能量损失。与饲喂未发生显著氧化的饲料的动物相比，从饲喂氧化饲料的动物中获取的肉类具有显著较低的氧化状态。来自饲喂包含高油酸玉米产品的饮食的动物的肉类显示具有延长的储存寿命和更高的氧化稳定性(PCT公开WO/2006/002052，公布于2006年1月5日)，尤其是当与抗氧化剂如母育酚一起使用时更是如此。因此高度期望预防饲料和饲料成分的氧化以保护营养价值和感官质量。

使用合成抗氧化剂预防脂质氧化以保持饲料质量，这能够导致动物状态改善。

合成抗氧化剂一般可作为自由基清除剂使用，因此减少脂质氧化。合成抗氧化剂可延长动物饲料储存寿命并保护营养和感官质量

有多个测试包括豆粕和其他大豆蛋白产品在内的固体材料氧化状态的方法，所述方法包括预测材料储存寿命的加速老化方法。可使用的一项测试是在室温或高温下老化材料并在特定时间点测量材料的氧化状态。在这点上OSI仪是有用的，因为它反映开始氧化过程需要的时间长度(称为诱发时间)。更长的诱发时间意味着该材料具有更高的氧化稳定性并因此具有更长的储存寿命。其他方法包括测量挥发物和颜色的变化。

获取大豆蛋白产品的方法是本领域的技术人员熟知的。例如大豆蛋白产品可以多种方法获得。通常用于制备大豆分离蛋白的条件已经在(Cho等人，(1981)美国专利公开4,278,597；Goodnight等人，(1978)美国专利公开4,072,670)中进行了描述。大豆浓缩蛋白通过三种基本方法制备：酸浸(pH约为4.5)、酒精(约55％至80％)萃取、以及在水萃取之前用湿热处理令蛋白质变性。用于制备大豆蛋白浓缩物的典型条件描述于Pass((1975)美国专利公开897,574)和Campbell等人((1985)，New Protein Foods，编辑：Altschul和Wilcke，Academic Press，第5卷第10章Seed Storage Proteins，第302-338页)。

可将“包含大豆的产品”或“大豆产品”定义为那些包含/掺入大豆蛋白产品的产品。

例如，“大豆蛋白产品”能够包括但不限于表2列出的那些产品。

表2

a参见Soy Protein Products：Characteristics，Nutritional Aspects and Utilization(1987)。大豆蛋白委员会。

“加工”是指用以获得表2中所列产品的任何物理和化学方法，所述方法包括但不限于对完整种子或种子局部进行的热处理、去皮与碾磨、挤压、溶剂萃取或水浸萃取。此外，“加工”还包括用以从完整种子或种子局部浓缩和提取大豆蛋白质的方法，以及东方国家制作大豆发酵食物产品的各种传统方法。多种上述产品的贸易标准和规格已经确立(参见National Oilseed Processors Association Yearbook and Trading Rules 1991-1992)。

脱脂薄片指薄片状的去壳子叶，所述子叶已经脱脂并用受控的加热方法除去了剩余的己烷。该术语也可指已经经过碾磨的豆粉或粗磨粉。

“白色”薄片指薄片状的去壳子叶，所述子叶已经脱脂并用受控的加热方法除去了剩余的己烷。该术语也可指已经经过碾磨的豆粉。

“粗磨粉”是指在10号和80号美国标准筛尺寸之间的脱脂去壳的子叶。

“大豆浓缩蛋白”指那些从去壳的脱脂大豆中生产的产品，通常包含按无水计65重量％至90重量％的大豆蛋白。大豆浓缩蛋白通常通过三个基本过程制备：酸浸(pH约为4.5)、酒精(约55％至80％)萃取、以及在水萃取之前用湿热处理令蛋白质变性。用于制备大豆蛋白浓缩物的典型条件描述于Pass((1975)美国专利3,897,574和Campbell等人，(1985)，New Protein Foods，编辑：Altschul和Wilcke，Academic Press，第5卷第10章，Seed Storage Proteins，第302-338页)。

如本文所用，术语“大豆分离蛋白”或“分离大豆蛋白”指包含具有按无水基重量计至少90％大豆蛋白的材料的大豆蛋白。

“挤出”指其中材料(粗磨粉、豆粉或浓缩物)在高压高温条件下通过带夹套的螺旋输送机并由此改变材料质地的方法。“组织化”和“构造化”是指用以改变所述原料物理性状的挤压过程。包括热塑挤压在内的上述过程的特征此前已有描述(Atkinson(1970)美国专利3,488,770，Horan(1985)，New Protein Foods，编辑：Altschul和Wilcke，Academic Press，第1A卷第8章第367-414页)。此外，包含大豆蛋白产品的复合食品混合物的挤压过程所使用的条件此前也已有描述(Rokey(1983)Feed Manufacturing Technology III，第222-237页；McCulloch，美国专利4,454,804)。

残余脂肪酸分析。利用己烷使大豆薄片脱脂的商业方法留下残余的脂肪酸，该脂肪酸可作为底物生成异味化合物。取决于分析方法，己烷脱脂的大豆薄片的残余脂肪含量在0.6-1.0％(W:W)(可用醚提取的；AOCS Method 920.39(Official Methods of Analysis of the AOAC International(1995)，第16版，Method 920.39C，Locator #4.2.01(改进的))至2.5-3％(W:W)(可酸水解的；AOAC Method 922.06(Official Methods of Analysis of the AOAC International(1995)，第16版，Method 922.06，Locator 32.1.13(改进的))的范围内。这两个评估残余脂肪酸的方法之间存在差异的主要原因是在己烷提取后与蛋白基质相关联的脂肪类型的化学性质。小比例的残余脂肪酸以中性脂类的形式存在(即，甘油三酸酯)，而剩余的脂肪酸以极性脂质的形式存在(例如磷脂、a.k.a.、卵磷脂)。因为其极性性质，磷脂不能用醚萃取，并且假如进行酸水解或一些其他严苛提取规程时，它仅从蛋白基质中除去。因此，醚萃取技术给予中性脂类组分一个估计，然而酸水解方法给予总残余脂肪酸含量更好的估计(即，中性和极性组分)。

上述的AOAC方法依赖残余脂肪酸的重量分析测定法，并且虽然它们组合给出脂肪类别的指示(中性对极性)，此类评估是粗略的，并且常受到其他疏水材料(例如皂苷)的干扰。此外，未获取脂肪酸组合物以及它如何已经受到不同实验处理或原料遗传学影响的信息。测定残余脂肪酸的脂肪酸组合物的AOAC方法是可用的(Official Methods of Analysis of the AOAC International(2000)，第17版，Method 983.23 Locator 45.4.02，Method 969.33 Locator 41.1.28，Method 996.06 Locator 411.28A)。这些方法是按在气相色谱分析前通过酸水解提取的残余脂肪酸转化成的脂肪酸甲酯计。虽然此类技术用于为营养标签提供依据的脂肪酸评估，它们在商业环境中很少用于评估食物物料的残余脂肪酸含量。近来已经公布了一份报告，其中这些方法已经被用于测定商品大豆分离蛋白的残余脂肪酸组合物(Solina等人(2005)，Volatile aroma components of soy protein isolate and acid-hydrolysed vegetable protein Food Chemistry 90：861-873)。

用于测定大豆蛋白产品中残余脂肪的脂肪酸组合物的一种简便方法描述于实施例24中。该方法优于其他方法的优点是它不需要在衍生进行GC分析前从基质中提取残余脂肪。此外，该技术适于所有形式的脂肪酸，即，无论它们最初是以游离脂肪酸形式存在或以脂肪酸酯形式(例如甘油三酸酯或磷脂)存在(Chistie(1989)Gas Chromatography and Lipids；The Oily Press.Ayr，Scotland)。该技术也将从蛋白基质中除去脂肪酸，即使磷脂的极性头基与蛋白共价结合。

已经掺入本发明的大豆蛋白产品的食品、食品补充剂、压成块的(精)加工食品、和饮料以及动物饲料(例如宠物食品)也在本发明的范围内。饮料可为液体或干粉形式。

本发明的大豆蛋白产品可被掺入/加入的食品包括几乎所有食品、饮料和饲料(例如宠物饲料)。例如，可以是提到过的食品补充剂、压成块的(精)加工食品、肉类如肉替代品、肉糜、乳化肉、卤肉、以及注入本发明的大豆蛋白产品的肉。饮料可包括诸如营养饮料、运动饮料、蛋白强化饮料、果汁、牛奶、代乳品、以及瘦身饮料。提到的食品也可为干酪如硬干酪和软干酪、奶油干酪、和松软干酪。也可包括冷甜点如冰淇淋、冰牛奶、低脂冷甜点、和非乳品冷甜点。最后可包括酸奶、汤、布丁、焙烤食品、色拉味调料、涂料、和蘸料(例如蛋黄酱和薯片蘸料)。

可加入选择量的大豆蛋白产品以递送所需量到食品和/或饮料中。术语“大豆蛋白产品”和“大豆蛋白产物”在本文中可互换使用。

可使用任何高油酸大豆种子(转基因的或非转基因的)作大豆蛋白产品源。

已经描述了通过突变育种得到的具有减少含量的饱和脂肪酸的大豆(Erickson等人(1994)J.Hered.79：465-468；Schnebly等人(1994)Crop Sci.34：829-833；以及Fehr等人(1991)Crop Sci.31：88-89)，以及转基因变型(美国专利公开5,530,186)。

已经描述了通过突变育种和选择得到的具有减少含量的不饱和脂肪酸的大豆。相对于常量的亚油酸已经获得了减少含量的亚麻酸(美国专利公开5,710,369和美国专利公开5,986,118)。使用突变育种、遗传杂交和选择也已经获得了减少的亚油酸和亚麻酸组合(Rahman，S.M.等人(2001)Crop Sci.41：26-29)。这些方法生产具有含油特征的大豆种子，其含油特征具有占总脂肪酸1％至3％的亚麻酸含量和约30至35％的多不饱和脂肪酸总含量，与其相比商品大豆具有大于6％的亚麻酸和大于50％的总多不饱和脂肪酸。

发现了一种改变酶表达的方法，该酶负责以直接方法将第二(international patent publication WO 94/11516)和第三(international patent publication WO 93/11245)双键导入大豆种子贮藏脂质中，这已经允许生产此类大豆：它具有高单不饱和的、非常低的多不饱和脂肪酸含量，并且其亚麻酸含量尤其低。这两个转基因特征的基因组合描述于美国专利公开6,426,448中，导致大豆品系具有最少的多不饱和和高单不饱和以及极端环境稳定性的种子脂肪酸特征。

可使用微粒体Δ-12脂肪酸去饱和酶(描述于WO 94/11516)基因制备高油酸大豆品种。所得高油酸大豆品种是一种其中多不饱和脂肪酸从占总脂肪酸70％减少到小于5％的品种。

命名为FAD2-1和FAD2-2的两个大豆脂肪酸去饱和酶是Δ-12去饱和酶，它们将第二双键导入油酸以形成亚油酸，亚油酸是一种多不饱和脂肪酸。FAD2-1仅在发育种子中表达(Heppard等人(1996)Plant Physiol.110：311-319)。在油沉积期间该基因的表达增加，开始于开花后大约19天，并且其基因产物负责存在于大豆油中的多不饱和脂肪酸的合成。GmFad 2-1详述于Okuley，J.等人(1994)Plant Cell 6：147-158和WO94/11516中。它以质粒pSF2-169K(ATCC保藏号69092)的形式得自ATCC。FAD 2-2以恒定水平在大豆植物的种子、叶、根和茎中表达，并且是“持家”基因12-去饱和酶。Fad 2-2基因产物负责合成细胞膜的多不饱和脂肪酸。

因为FAD2-1是大豆种子中该类型的主要酶，FAD2-1表达减少导致油酸(18:1)积聚增加以及多不饱和脂肪酸含量的相应减少。

FAD2-2与FAD2-1组合表达的减少导致油酸积聚较多以及多不饱和脂肪酸含量的相应减少。

FAD3是Δ-15去饱和酶，它将第三双键导入亚油酸(18:2)以形成亚麻酸(18:3)。FAD3表达的减少与FAD2-1和FAD2-2的减少组合导致油酸积聚较多以及多不饱和脂肪酸含量尤其是亚麻酸含量的相应减少。

编码FAD2-1、FAD2-2、和FAD3核酸片段已经在WO 94/11516和WO 93/11245中进行了描述。能构建可操作地连接至至少一种合适的调控序列的、包含所有或部分这些核酸片段或它们的反向互补序列的嵌合重组构建体，其中该嵌合基因的表达导致脂肪酸表型的改变。可经由本领域技术人员熟知的转化技术将嵌合重组构建体导入大豆植物中。

用重组DNA转化得到的转基因大豆植物进行检测分析以选择具有改变脂肪酸特征的植物。重组构建体可包含所有或部分以下基因：1)FAD2-1基因或2)FAD2-2基因或3)FAD3基因或4)所有或部分FAD2-1、Fad2-2、或FAD3基因的组合。

重组构建体包含所有或部分以下基因：1)FAD2-1基因(具有或不具有)2)所有或部分Fad2-2基因(具有或不具有)，所有或部分FAD3基因，该重组构建体可用于制备具有高油酸表型的转基因大豆植物。脂肪酸特征的改变，具体地讲是油酸比例的增加和多不饱和脂肪酸比例的减少，指示一种或多种大豆种子FAD基因(FAD2-1、Fad2-2、FAD3)已经受到了抑制。可以对大豆体细胞胚芽培养物和种子进行检测分析以测定FAD2-1、Fad2-2、或FAD3的抑制。

本领域的技术人员完全理解可使用包含具有相似功能的、除那些具体例示的序列之外的序列的重组构建体。这些构建体可包括任何种子特异性的启动子。这些构建体也可包括或不包括任何促进茎-环结构形成的核苷酸。这些构建体可包含具有与基因的任何部分或上文提到的基因相同的核苷酸序列的多核苷酸，上文提到的基因相对于启动子以有义或反义方向插入。最后，这些构建体可包含或不包含任何转录终止信号。

一旦获得了具有所需表型的足够转基因种子，就可制备大豆蛋白产品如分离蛋白或完整大豆豆浆。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步限定，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。

高油酸大豆品系的生产在实施例3、5和8中详细描述，但不限于本文所述的方法。

实施例1

转化大豆(Glycine max)

胚芽培养物并再生大豆植株。

通过粒子枪轰击方法，使用本领域已知的程序转化大豆胚芽悬浮培养物(Klein等人，1987)Nature(London)327：70-73；美国专利4,945,050；Hazel等人(1998)Plant Cell.Rep.17：765-772；Samoylov等人(1998)In Vitro Cell Dev.Biol.-Plant 34：8-13)。在粒子枪轰击程序中，可能使用纯化的1)完整质粒DNA或，2)仅包含受关注的重组DNA表达盒的DNA片段。

转化实验的原液组织通过萌发大豆不成熟种子获得。在培养起始培养基上培养6至8周后，从外植体切除第二胚芽。起始培养基是琼脂-固化的改性MS(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473-497)培养基，补充有维生素、2，4-D和葡萄糖。将第二培养置于烧瓶中的液体培养物维持培养基中，并且在转动摇床上保持7-9天，培养在26+/-2℃，～80μEm-2s-1光照强度下进行。培养物维持培养基是改性MS培养基，补充有维生素、2，4-D、蔗糖和天冬酰胺。在轰击之前，从烧瓶中移除组织块并将其移动到空的60×15mm培养皿中进行轰击。组织在Whatman#2滤纸上吸水干燥。每个培养皿的受轰击组织为大约100-200mg，对应于10-20个组织块(每块尺寸为1-5mm)。

在轰击后，分开来自每个轰击培养皿的组织并将每个培养皿的轰击组织置于液体培养物维持培养基的两个烧瓶中。轰击后七天，每个烧瓶中的液体培养基用补充有100ng/mL选择剂(选择培养基)的新鲜培养物维持培养基置换。为了选择转化过的大豆细胞，使用的选择剂可为磺酰脲类(SU)化合物，其化学名为2-氯-N-((4-甲氧基-6甲基-1，3，5-三嗪-2-yl)氨基羰基)苯磺酰胺(俗名：DPX-W4189和氯磺隆)。氯磺隆是DuPont磺酰脲类除草剂GLEAN中的活性成分。每周更换包含SU的选择培养基，持续6-8周。在6-8周的选择期后，观察从未转化的坏死胚芽发生簇上生长的绿色转化组织的岛状物。分离这些推定的转基因事件并保存在具有100ng/mLSU的培养基中再培养2-6周，每隔1-2周改变培养基以生成新的无性繁殖的转化胚芽悬浮培养物。胚芽经总计大约8-12周接触SU。然后可将悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，也通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。

实施例2

大豆脂肪酸分析

为了测定由脂肪酸去饱和酶抑制导致改变的脂肪酸组合物，可如下测定脂肪酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的相对量。从单个成熟的体细胞大豆胚芽或大豆种子薄片中通过酯交换制备脂肪酸甲酯。将一个胚芽或来自种子的薄片置于包含50μL氢氧化三甲基锍的小瓶中并在室温下振荡培养30分钟。在30分钟后，加入0.5mL的己烷，与样本混合并静置15至30分钟，使得脂肪酸与己烷相分开。分离脂肪酸甲酯(从己烷层注入5μL)并进行定量，定量方法使用配有Omegawax 320熔融石英毛细柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(Supelco Inc.，Cat#24152)。设定炉温程序如下：220℃保持2.7分钟，然后以20℃每分钟的速度升温至240℃并再保持2.3分钟。载气通过Whatman氢气发生器供应。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.catalog #U-99-A)。

实施例3

通过抑制脂肪酸去饱和酶生产具有高含量油酸和/或高含量硬脂酸 和/或低含量多不饱和脂肪酸的大豆

制备重组DNA片段并用于转化大豆，同时抑制脂肪酸去饱和酶FAD2-1和FAD2-2以及脂肪酸去饱和酶FAD3。重组DNA片段构建体的描述如下。

A.重组DNA片段PHP21676A

重组DNA片段PHP21676A包含一个基因表达沉默盒，该盒设计用于沉默FAD2-1和FAD2-2基因以及FAD3基因的表达，它以头对头结构与下文实施例1D的ALS选择性标记重组DNA片段相连。重组DNA片段PHP21676A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。重组DNA片段PHP21676A以5′至3′取向包含：

a)下文实施例1D的ALS选择性标记重组DNA片段的互补链，

b)Kti3启动子的约2088个核苷酸，

c)74-核苷酸的合成序列，

d)大约1500个多核苷酸片段，该片段包含来自大豆FAD2-2基因的约470个核苷酸，来自大豆FAD2-1基因的420个核苷酸，和来自大豆FAD3基因的643个核苷酸，它在唯一的Not I限制性内切酶位点插入，

e)在c)中的74个核苷酸合成序列的反向重复序列，和

f))Kti3转录终止子的约202个核苷酸。

上文d)项的大约1500个多核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。大约1500个多核苷酸片段，该片段包含来自大豆FAD2-2基因的约470个核苷酸，来自大豆FAD2-1基因的约420个核苷酸，和来自大豆FAD3基因的约643个核苷酸，它通过如下所述的PCR扩增构建。

包含一部分大豆FAD2-2基因和一部分大豆FAD2-1基因的大约0.9kb DNA片段通过PCR扩增获取，该PCR扩增使用引物BM35(SEQ ID NO：3)和BM39(SEQ ID NO：4)并使用模板重组DNA片段KSFAD2-杂交体，如下文实施例1B所述。

包含一部分FAD3基因的大约0.65kb的DNA片段通过PCR扩增获取，该PCR扩增使用引物BM40(SEQ ID NO：5)和BM41(SEQ ID NO：6)并使用质粒pXF1作模板。质粒pXF1包含编码大豆Δ-15去饱和酶(FAD3)的多核苷酸，该质粒在公布于1999年9月14日的美国专利5,952,544中进行了描述。质粒pXF1在1991年12月3日由Budapest Treaty保藏于Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为ATCC 68874。

混合包含一部分大豆FAD2-2基因和一部分大豆FAD2-1基因的大约0.9kb的片段以及包含一部分FAD3基因的大约0.65kb的片段，将其作模板、BM35和BM41作引物进行PCR扩增以生成大约1533bp的片段，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将该片段克隆到可商购获得的质粒pCR2.1中。

在用NotI消化具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸片段的大约1500bp的片段后，将其连接到质粒pKS210的NotI位点中(下文实施例1C)。

B.重组DNA片段KSFAD2-杂交体

重组DNA片段KSFAD2-杂交体大约890个核苷酸的多核苷酸片段，该多核苷酸片段包含来自大豆FAD2-2基因的约470个核苷酸和来自大豆FAD2-1基因的420个核苷酸。重组DNA片段KSFAD2-杂交体的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。如下构建重组DNA片段KSFAD2-杂交体。

包含一部分大豆FAD2-2基因的大约0.47kb的DNA片段通过PCR扩增获取，该扩增使用引物KS1(SEQ ID NO：8)和KS2(SEQ ID NO：9)并使用从大豆cv.Jack叶片中纯化的基因组DNA作模板。

包含一部分大豆FAD2-1基因的大约0.42kb的DNA片段通过PCR扩增获取，该扩增使用引物KS3(SEQ ID NO：10)和KS4(SEQ ID NO：11)并使用从大豆cv.Jack叶片中纯化的基因组DNA作模板。

包含一部分大豆FAD2-2基因的0.47kb片段和包含一部分大豆FAD2-1基因的0.42kb片段使用GeneClean(Qbiogene，Irvine，CA)进行凝胶纯化，混合后以其作为模板，用KS 1和KS4作为引物进行PCR扩增以生成大约890bp的片段，将该片段克隆到可商购获得的质粒pGEM-T Easy(Promega，Madison，WI)中以制备包含重组DNA片段KSFAD2-杂交体的质粒。

C.制备质粒pKS210和质粒PHP17731

质粒pKS210来源于可商购获得的克隆载体pSP72(Promega)。β内酰胺编码区已经被潮霉素磷酸转移酶基因置换，该基因在大肠杆菌中用作选择性标记。此外，已经加上了一个以头对头结构与实施例1B的ALS选择性标记重组DNA片段相连的基因表达沉默盒。在质粒pKS210中的基因表达沉默盒包含KTi3启动子、74核苷酸合成序列、唯一的NotI限制性内切酶位点、74核苷酸合成序列的反向重复序列、和Kti3终止子区域。已经描述了编码Kti3的基因(Jofuku和Goldberg(1989)Plant Cell 1：1079-1093)。c)和e)的74核苷酸合成序列(上文)促进茎结构的形成。在唯一的Not I位点插入来自期望基因的核苷酸片段已经显示导致期望基因的抑制，该基因如公布于2002年1月03日的PCT公开WO 02/00904所述。该来自pKS133的种子特异性基因表达沉默盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。质粒pKS210的图谱如图1所示，其核苷酸序列公开于SEQ ID NO：13中。

制备重组质粒PHP17731，该质粒包含用于同时沉默其中一种大豆Δ-9去饱和酶基因和大豆Δ-12去饱和酶基因FAD2-1的基因序列。从质粒KS 133(WO 2002016565A2，A3)中获取与合成的反向重复序列一起的大豆KTI启动子、终止子区域。使用大豆基因组DNA和在US 6,372,965 B1的SEQ ID NO 5中的序列作模板，通过PCR扩增FAD2-1基因的片段，制备SEQ ID NO：14(PHP17731)的碱基对5423至6033的片段。置换邻近大豆Δ-9去饱和酶(WO 2002016565A2，A3的序列1)拷贝3的一部分编码序列的片段，该片段目前包含PHP17731的碱基6054至411。通过用限制性内切酶AscI消化并如下文E部分所述进行纯化，从克隆载体PHP17731中移除片段PHP17731A(SEQ ID NO：15)。质粒PHP17731的图谱如图2所示。

D.ALS选择性标记重组DNA片段

使用包含组成型启动子的重组DNA片段作为大豆转化的选择性标记，该组成型启动子引导后接大豆ALS 3′转录终止子的突变型大豆乙酰乳酸合酶(ALS)基因的表达。使用的组成型启动子是一个1.3-Kb的DNA片段，其功能是作为大豆S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAMS)基因的启动子，它在公布于2000年6月29日的PCT公开WO 00/37662中进行了描述。用作选择性标记的该重组DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。突变型大豆ALS基因编码对ALS抑制剂有抗性的酶，如磺酰脲类除草剂。存在于用作选择性标记的重组DNA片段中的突变型大豆ALS的推断氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。

编码对磺酰脲类除草剂有抗性的酶的突变型植物ALS基因在美国专利5,013,659中进行了描述。一种此类突变型是烟草属SURB-Hra基因，该基因编码在蛋白氨基酸序列中有两个取代的抗除草剂ALS。该烟草属抗除草剂ALS在保守“亚序列B”(SEQ ID NO：18)的位点191包含取代脯氨酸的丙氨酸，以及在保守“亚序列F”(SEQ ID NO：19)的位点568包含取代色氨酸的亮氨酸(美国专利5,013,659；Lee等人(1988)EMBO J 7：1241-1248)。

使用多核苷酸构建ALS选择性标记重组DNA片段用于大豆ALS，通过定点诱变将两个Hra样突变导入其中。因此，该重组DNA片段将翻译成一个在位点183用丙氨酸取代脯氨酸以及在位点560用亮氨酸取代色氨酸的大豆ALS。

此外，在构建SAMS启动子-突变型ALS表达盒期间，大豆ALS基因的编码区在5′-末端延伸五个附加密码子，导致五个氨基酸(M-P-H-N-T；SEQ ID NO：20)加到ALS蛋白的氨基末端。这些多余的氨基酸邻近转运肽并推测在将突变型大豆ALS蛋白导向质粒期间与转运肽一起移除。包含编码大豆ALS的多核苷酸的DNA片段用KpnI消化，用T4DNA聚合酶钝化末端，再用SalI消化，并且插入包含SAMS启动子的质粒中，所述质粒以前已经用NcoI消化过并用Klenow DNA聚合酶进行补齐以钝化末端。

通过用上述SAMS启动子取代可供选择的组成型表达的植物启动子来制备第二选择性标记质粒和随后的片段。合成启动子SCP1(US 6,072,050)被置于突变型大豆ALS编码序列之前以形成质粒PHP17064(SEQ ID NO 21和图3)。为了用于大豆转化，用限制性内切酶XbaI将片段PHP17064A(SEQ ID NO：22)从其克隆载体中切除并如下文E部分所述进行纯化。

E.制备重组DNA片段PHP21676A、PHP17731A和PHP17064A用 于大豆转化。

为了用于植物转化实验，用限制性内切酶AscI将7993bp的重组DNA片段PHP21676A从其克隆质粒中移除。通过琼脂糖凝胶电泳将重组DNA片段PHP21676A、PHP17731A和PHP17064A中的每一个片段从剩余的质粒DNA中分离。将重组DNA片段沉淀到金颗粒上并如实施例1所述进行大豆转化。每八个轰击转化，用3mg 0.6μm的金颗粒和1至90皮克(pg)的DNA片段每DNA片段碱基对制备30μL溶液。

作为另外一种选择，将片段PHP17064A和PHP17731A的混合物以等份或两份PHP17731A对一份PHP17064A的比例如上所述加到金颗粒上，每碱基对的重量相同，并且将其用于转化以沉默Δ-9和Δ-12去饱和酶基因。

实施例4

用重组DNA片段PHP21676A以及PHP17064A和PHP17731A组合 转化的大豆的脂肪酸分析。

在一个使用如上所述的重组DNA片段PHP21676A的大豆转化实验中，获取了67个独立的转化过的胚芽悬浮培养物，发现它们对磺酰脲类除草剂有抗性。五个主要脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸)中油酸百分比的增加指示FAD2基因的抑制。67个除草剂抗性胚芽悬浮培养物中有十三个(19％)生成具有大于25％的油酸的体细胞胚芽，与其相比未转化的胚芽生成约8％的油酸。

从13个事件中的9个事件中再生植物并生产T1种子。如实施例2所述，通过测量种子油的脂肪酸组合物测试脂肪酸去饱和酶的抑制。来源于5个转化事件的植物产生的种子表现出高油酸-低多不饱和脂肪酸表型。

在一个使用重组DNA片段PHP17064A和PHP17731A的混合物的大豆转化实验中，发现转化过的胚芽悬浮培养物抗磺酰脲类除草剂，获取它们，通过DNA印迹分析、然后通过体细胞胚芽的脂肪酸特征分析筛选存在的转基因片段的拷贝数。将硬脂酸和油酸含量的增加作为种子表达的Δ-9去饱和酶和Δ-12去饱和酶沉默的指示。再生三十三个转化过的候选品系，培养至成熟，并且分析来自初始转化体的种子的脂肪酸特征。对这些品系从自花授粉植物的附加两代获取的种子进行进一步选择。选择一个候选品系，其中亚油酸和亚麻酸总量小于总脂肪酸的14％，并且其中硬脂酸含量大于总脂肪酸的16％。

实施例5

用于生产高油酸特性的遗传物质(版本1)

通过重组操纵油酰12-去饱和酶的活性制备高油酸大豆。

将GmFad2-1置于种子特异性的强启动子控制下，该启动子来源于大豆(Glycine max)的α′-亚基β-伴球蛋白基因。该启动子允许特性基因高水平的、种子特异性的表达。它跨过大豆伴球蛋白贮藏蛋白α′亚基β-的起始密码子606bp的上游。β-伴球蛋白启动子序列提供公布的β-伴球蛋白基因的等位基因(Doyle等人，(1986)J.Biol.Chem.261：9228-9238)，该基因和其等位基因在27个核苷酸位置具有差异。它已经显示转基因植物保持种子特异表达模式(Barker等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：458-462以及Beachy等人，(1985)EMBO J.4：3047-3053)。阅读框用来自绿色菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白基因的3′片段封端。这是1174bp的延伸序列，它是菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白基因终止密码子的3′序列(来源于Doyle等人，1986所述的克隆)。

GmFad 2-1开放阅读框(ORF)针对启动子处于有义方向，以便生成基因沉默的有义GmFad 2-1 cDNA和内源GmFad 2-1基因。该现象称为“有义抑制”，它是一种有效的有意沉默植物基因的方法，描述于美国专利公开5,034,323中。

为了在大肠杆菌中维持并复制质粒，将上述的GmFad 2-1转录单位克隆进质粒pGEM-9z(-)(Promega Biotech，Madison WI，USA)中。

为了鉴定转化过的大豆植株，使用来自大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)。所用的盒由三部分构成；花椰菜花叶病毒35S启动子、来自大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)和包含基因终止子的0.77kb的DNA片段，该基因终止子来自根瘤农杆菌的Ti-质粒的胭脂碱合酶(NOS)基因。该35S启动子是来自CaMV的1.4kb启动子区，用于大多数植物组织的组成型基因表达(Odell等人，(1985)Nature 303：810-812)，GUS基因是1.85kb的片段，编码β-葡糖醛酸酶(Jefferson等人(1986)PNAS USA 83：8447-8451)，NOS终止子是胭脂碱合酶编码区3′末端的一部分(Fraley等人，(1983)PNAS US 80：4803-4807)。将GUS盒克隆进GmFad 2-1/pGEM-9z(-)构建体中并将其命名为pBS43。

通过如实施例1所述的粒子轰击方法将质粒pBS43转化到优良大豆品系A2396的分生组织中。使用本领域熟知的方法再生可繁殖的植物。

从转化过的植物的初始种群中选择表达GUS活性并且通过PCR评估时也是GmFad2-1基因(事件260-05)阳性的植物。从许多植物260-05的许多R1种子中获取小的薄片并筛选其脂肪酸组合物。然后种植切成薄片的种子并使其萌发。从所得植物的叶片中提取基因组DNA并用限制性酶Bam HI消化。用菜豆蛋白探针检测印迹。

从DNA杂交图中可以清楚地看出在初始转化事件中GmFad 2-1构建体已经在大豆基因组中的两个不同位点发生了整合。在一个位点(位点A)GmFad 2-1构建体引起内源GmFad 2-1基因的沉默，导致如图3所示的油酸含量。与之相比优良大豆品种具有约20％的油酸含量。在位点A有两拷贝的pBS43。在DNA杂交印迹上这可见为两条共分离的带。在另一个整合位点(位点B)GmFad 2-1过表达，因此将油酸含量减少至约4％。

使由初始转化体生成的第四代分离品系(R4植物)生长至成熟。在开花后20天收获的仅包含沉默位点A(例如G94-1)的R4种子在样本中不包含任何可检测到的GmFad 2-1 mRNA(当通过Northern印迹法进行测量时)。尽管GmFad 2-2 mRNA与对照相比有些许减少，但未被抑制。因此GmFad 2-1有义构建体具有期望的阻止GmFad 2-1基因表达的效果，并且因此提高种子的油酸含量。所有GmFad 2-1沉默位点的植物纯合子经历多代后具有相同的Southern印迹特征图。这指示经过至少四代，该插入序列是稳定的并且插入基因组的相同位点。

实施例6

脂肪酸分析高油酸特性(版本1)。

表7概述了存在于重组大豆植物和种子的不同代中的油酸含量。如实施例2所述测定脂肪酸组合物。

表3

a R0:1指示第一代转化体自花育种后的种子和种子长成的植物。R1:2指示第二代转化体自花育种后的种子和种子长成的植物。R2:3指示第三代转化体自花育种后的种子和种子长成的植物。R3:4指示第四代转化体自花育种后的种子和种子长成的植物。

实施例7

用于产生高油酸特性的遗传物质(版本2)

通过如实施例1所述的粒子共轰击，用片段PHP19340A(图4；SEQ ID NO：23)和PHP17752A(图5；SEQ ID NO：24)制备大豆(Glycine max)事件。这些片段通过用Asc I消化源质粒来获取。片段PHP19340A获自质粒PHP19340(图6；SEQ ID NO：25)，片段PHP17752A获自质粒PHP17752(图7；SEQ ID NO：26)。PHP19340A片段包含具有大豆微粒体ω-6去饱和酶基因1(gm-fad2-1)的597bp片段的盒(Heppard等人，1996，Plant Physiol.110：311-319)。

在表达盒中存在的gm-fad2-1片段作用在于抑制内源ω-6去饱和酶的表达，导致油酸含量提高而棕榈酸、亚油酸、和亚麻酸含量降低。gm-fad2-1片段的上游是来自Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因3(KTi3)的启动子区域(Jofuku和Goldberg，1989，Plant Cell1：1079-1093；Jofuku等人，1989，Plant Cell 1：427-435)，该区域调节转录物的表达。KTi3启动子在大豆胚芽中具有高度活性，而在叶片组织中活性降低1000倍(Jofuku和Goldberg，1989，Plant Cell1：1079-1093)。KTi3基因的3′非翻译区域(KTi3终止子)(Jofuku和Goldberg，1989，Plant Cell1：1079-1093)终止从该盒的表达。

PHP17752A片段包含具有改进版本的大豆乙酰乳酸合酶基因(gm-hra)的盒，所述大豆乙酰乳酸合酶基因编码GM-HRA蛋白，该蛋白有两个氨基酸残基与内源酶相比发生改变，并且在蛋白N-末端区域有五个附加氨基酸，这五个附加氨基酸来源于大豆乙酰乳酸合酶基因5′非翻译区域的翻译(Falco和Li，2003，美国专利申请：2003/0226166)。gm-hra基因编码乙酰乳酸合酶的一种形式，该乙酰乳酸合酶对磺酰脲类除草剂具有抗性。GM-HRA蛋白由656个氨基酸构成并具有大约71kDa的分子量。

gm-hra基因的表达受来自大豆的S-腺苷-L-甲硫氨酸合酶(SAMS)基因的5′启动子区域的控制(Falco和Li，2003，美国专利申请：2003/0226166)。该5′区域由组成型启动子和插入SAMS 5′非翻译区域的内含子构成(Falco和Li，2003)。gm-hra基因的终止子是内源大豆乙酰乳酸合酶终止子(als终止子)(Falco和Li，2003，美国专利申请：2003/0226166)。

实施例8

转化和选择大豆高油酸事件(版本2)

为了转化大豆组织，包含gm-fad2-1基因序列和表达必需的调控组件的DNA线性部分用限制性酶Asc I从质粒PHP19340中切除，并且使用琼脂糖凝胶电泳进行纯化。包含gm-hra基因序列和表达必需的调控组件的DNA线性部分用限制性酶Asc I从质粒PHP17752中切除，并且使用琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将包含gm-fad2-1基因的DNA线性部分命名为插入序列PHP19340A，其大小为2924bp。将包含gm-hra基因的DNA线性部分命名为插入序列PHP17752A，其大小为4511bp。导入转化事件DP-305423-1的唯一DNA是上述的DNA插入序列。

来自事件DP-305423-1的转基因植物通过如实施例1所述的粒子轰击方法获取。采集胚芽组织样本通过DNA印迹分析进行分子分析以确认gm-fad2-1和gm-hra转基因的存在。从来源于每个单独事件的组织再生植物并将其转移到温室中进行种子生产。

实施例9

包含高油酸事件版本2的植物的DNA印迹分析

材料和方法：使用标准尿素提取缓冲液方法，从T4和T5代DP-305423-1和对照植物(品种：Jack)的单个植株的冷冻大豆叶片组织中提取基因组DNA。在荧光分光光度计上用Pico Green

试剂(Molecular Probes，Invitrogen)定量基因组DNA。每个样本大约4μgDNA用Hind III或Nco I消化。就阳性对照样本而言，在消化前将大约3pg(2基因组拷贝等同物)质粒PHP19340或PHP17752加到对照大豆基因组DNA中。阴性对照样本由未改变的大豆基因组DNA组成(品种：Jack)。用琼脂糖凝胶电泳按大小分离DNA片段。

在琼脂糖凝胶电泳后，使用如TURBOBLOTTER^TM Rapid Downward Transfer System(Schleicher & Schuell)所述的方法，将分离的DNA片段去嘌呤化、变性、原位中和、并且在20x SSC缓冲液中将其转移到尼龙膜上。在转移到膜上后，通过UV交联使DNA与膜结合。

使用PCR DIG Probe Synthesis试剂盒(Roche)，通过PCR用地高辛(DIG)标记用于gm-fad2-1和gm-hra的DNA探针。

基本上如制造商所述，使用DIG Easy Hyb溶液(Roche)将标记探针杂交到在尼龙膜上的靶DNA上，用于检测特异片段。在高严格条件下进行杂交后洗涤。使用CDP-Star Chemiluminescent Nucleic Acid Detection System(Roche)检测与结合片段杂交的DIG-标记探针。将印迹在室温下曝光于X-射线薄膜一个或多个时间点以检测杂交片段。如实施例2所述测定该事件的脂肪酸组合物。在29个不同事件中测定的油酸含量(T1代)在61.5-84.6％的范围内。一个事件(T4-T5代)的油酸含量在72-82％的范围内。

实施例10

小规模大豆分离蛋白制备

大豆分离蛋白制备如下进行。

a)生产泛黄薄片：

全脂大豆薄片以下文方法制备。将一定体积的大豆置于密闭容器中，加入少量的水以防止大豆在随后的微波加热过程中干燥。微波加热大豆直至温度达到150℉，然后保持1分钟。在流化床冷却器中将大豆迅速冷却至室温约1分钟。然后将大豆给料通过破碎机以制备1/2和1/4的碎片。在吸气器中去壳，继续加工所得“果肉”以制备薄片。将果肉置于具有少量水的密封容器中并微波加热直至温度达到150℉，然后保持1分钟。然后将热果肉给料通过碾片机以制备大豆薄片，然后将其在流化床冷却器中迅速冷却至室温约1分钟。制备具有高蛋白分散指数(PDI)的薄片，它具有通过溶剂萃取去油的充分特征。具有较低PDI的薄片通过在生产期间增加水量、温度和暴露时间来制备。

b)生产白色薄片：

可通过使泛黄薄片与己烷接触以除去油来制备。除己烷之外，薄片还用具有某种程度油溶解度的其他溶剂体系单独或组合提取，例如乙醇、乙醇-水混合物、己烷-乙醇混合物、超临界CO2-乙醇-水混合物等。在足以除去油的一定溶剂/薄片比率、温度、和萃取时间下将泛黄薄片载入分批或半连续萃取器。在分批萃取器中，将加热至60℃的己烷以3∶1的溶剂/薄片比率加入，并且循环通过一层薄片45分钟。移除用过的溶剂油水混合物，并且重复上述的溶剂萃取程序。用新鲜溶剂最后一对一冲洗薄片。半连续萃取器使用大约相同的溶剂对薄片比率，但是通过使用固体/液体容器内过滤器，以及随后从油中蒸发溶剂并将缩合物再循环到萃取器中，连续再生新溶剂。这种半连续萃取器用于生成任何数量的溶剂周转。在任何一种设备中，所得加入己烷的白色薄片在通风橱中风干过夜。如果需要，通过加水到薄片中(通常按干薄片重量计5-10％)，并且将湿薄片置于密封容器中并在100℃下微波加热6分钟以模拟在除溶剂期间的商业蒸汽处理。然后将热薄片置于真空炉中并迅速冷却至约50℃以制备高PDI薄片。在这一步骤中增加水量、时间、或温度制备低PDI薄片。将薄片碾磨成粉以获得适合高效蛋白提取的粒度，或者可完全跳过这一步。

c)生产润湿凝乳：

在容器中用水(可为加热的水，通常加热到33℃)提取一定量的大豆粉，水对大豆粉的比率至少足以制备可流动的浆液(通常6∶1)，浆液使水充分接触薄片和/或赋予进一步的大豆粉碾磨能力(通常是胶体磨)。如果需要，可以用碱提高提取物的pH(通常是Ca(OH)₂，最高pH约9.7)，或者用酸降低提取物的pH至约2.0。这时可加入足量消泡剂(通常按薄片重量计小于1％)和亚硫酸盐(Na₂SO₃，通常小于按薄片重量计1％)以防止起泡并有助于提取。混合提取物(通常在胶体磨中)大约10-15分钟。将浆液给料于离心机(以分批方式或半连续方式)，离心机rpm和离心时间足以分离固体(通常高于Log 4.0 Gsec.，温度33℃)。滗析出液体并再提取固体，再提取时的水对固体的比率至少足以形成可流动的浆液(通常4对1)。混合浆液(通常33℃)(通常在胶体磨中)并如上所述在离心机中分离。如果需要，这时也可提高或降低第二提取物的pH。离心后滗析出液体并弃去消耗的大豆薄片。合并第一和第二液体提取物并进行后续处理。如果需要，可进行附加的提取。为了沉淀蛋白，用酸(通常1M HCl)调节pH，使得该pH足以分离受关注的蛋白(通常为4.5)，并且在上述条件下将其给料于半连续或分批离心机。滗析出液体并弃去，用新鲜水重悬固体(通常在匀化器中)。如果需要，可加热再次形成浆液的水(一般的洗涤水温度为约50-60℃)。如果需要，可重复上述洗涤。

d)生产大豆分离蛋白：

重悬湿凝乳，其固体含量适于蛋白浆液的巴氏灭菌。固体含量通常将为大约10-20％。混合浆液(通常在胶体磨或匀化器中)并用碱(通常用NaOH)调节pH至大约6.8-7.2。连续注入蒸汽对浆液进行巴氏灭菌，灭菌温度和时间足以减少微生物数和胰蛋白酶抑制剂活性以达到人摄取的安全水平。典型条件可为在大约120-160℃下进行4-60秒。冷却经巴氏灭菌的浆液(通常闪蒸冷却至50-60℃，使用100-150mm真空)。将浆液给料于喷雾干燥器，必需的干燥条件使得干燥产品具有小于约5％的水分。典型条件包括约250-300℃的入口温度和约90-100℃的出口温度。

在该实施例中示出的条件包括在小规模生成平台中用于生产Supro

 760、Supro

 670和Supro 500E-型分离蛋白的工艺参数。

实施例11

大规模生产脱脂薄片

按照以下方法从大豆形成大豆薄片材料。大豆除废物过程如下：使大豆通过磁选机以移除铁、钢、和其他磁性物体，随后在筛孔逐渐变小的筛网上摇动大豆以除去污垢残余、豆荚、杆、野草籽、较小豆粒、以及其他废物。然后使除去废物的大豆通过辊式破碎机进行破碎。辊式破碎机具有螺旋切口的波状滚筒，当大豆通过辊时它使大豆外壳变松并将大豆材料破碎成若干片。破碎后的大豆优选加水使其具有10％至11％的水分，在63至74℃下处理以改善大豆材料的贮藏质量保持率。然后将破碎后的大豆去壳，优选通过吸气去壳。可通过在筛孔足够小的筛网上摇动去壳大豆以除去远小于大豆子叶的大豆胚轴并保留大豆子叶。不需要除去胚轴，因为它们按重量计仅占大豆约2％，而子叶按重量计占大豆约90％，然而，优选除去胚轴，因为它们与大豆的豆腥味有关。然后使具有胚轴或不具有胚轴的去壳大豆通过辗片机变成薄片。辗片机安放有光滑的圆筒形轧辊，当大豆通过辊时，它们形成厚度为约0.01英寸至约0.015英寸的薄片。

然后将薄片脱脂。用合适的溶剂萃取薄片以从薄片中除去油，使薄片脱脂。薄片优选用正己烷或正庚烷进行逆流萃取。脱脂薄片将包含小于1.5％的脂肪或油，优选小于0.75％。然后使用常规除溶剂方法将溶剂萃取的脱脂薄片除溶剂以除去任何残余的溶剂，包括用闪蒸除溶剂器-脱臭剂汽提塔、蒸汽除溶剂器-真空脱臭剂、或倒风除溶剂法除溶剂。

脱脂薄片优选被粉碎成大豆粉或大豆粗磨粉以改善从薄片提取的蛋白产量。通过用常规研磨和碾磨设备如锤磨机或喷气流研磨机将薄片碾磨成期望的粒度以粉碎薄片。其中按重量计至少97％的大豆粉具有150微米或更小的粒度(能够通过No.100目美国标准筛)。与大豆粉相比碾磨得较粗的大豆粗磨粉具有大于大豆粉但是小于大豆薄片的粒度。大豆粗磨粉优选具有150微米至约1000微米的粒度(能够通过No.10-No.80美国标准筛)。

实施例12

大规模制备大豆分离蛋白

为了生产大豆蛋白凝乳材料，用pH6.5至10的水或水溶液萃取HO脱脂大豆粉以从不溶性材料如纤维中提取大豆粉中的蛋白。虽然其他碱性含水萃取剂如氢氧化铵也是有效的，优选用pH约8至约10的氢氧化钠水溶液提取大豆粉。优选萃取剂对大豆粉材料的重量比率为约8∶1至约16∶1。

在萃取后，使提取物与不溶性材料分离。优选通过过滤或离心有效分离提取物与不溶性材料。然后将分离后提取物的pH调节到约大豆蛋白的等电点以沉淀大豆蛋白凝乳，以便大豆蛋白能与大豆水溶物包括诱导胃肠气胀的低聚糖以及其他水溶性碳水化合物分离。用合适的酸调节分离后提取物的pH至大豆蛋白的等电点，优选的pH为约pH4至约pH5，最优选约pH4.4至约pH4.6。用于将提取物的pH调节至约大豆蛋白等电点的合适可食用酸包括盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、或乙酸。优选用盐酸或磷酸沉淀蛋白材料。将沉淀的蛋白材料(凝乳)与提取物(乳清)分离，优选通过离心或过滤生产大豆蛋白凝乳材料。分离的大豆蛋白凝乳材料优选用水洗涤以除去残余的可溶解物，优选的水对蛋白材料的重量比率为约4∶1至约10∶1。在实施例11和12中示出的条件基本上描述了在大规模生成平台中用于生产Supro

 760、Supro

 1610、Supro

 651、Supro

 500E和Supro

 670-型分离蛋白的工艺参数。在实施例13和14中描述了生产Supro

 760的细节。

Supro

 670的生产包括水解步骤，该步骤不被应用于生产其他分离物，它描述于实施例16-18中。

实施例13

为了生产Supro

 760型蛋白材料，如实施例12所述生产的大豆蛋白凝乳材料首先用含水碱性溶液或含水碱土溶液中和到pH6.8至7.2，优选氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。然后加热中和的大豆蛋白凝乳材料。优选加热中和大豆凝乳至温度约75℃至约160℃，保持约2秒至约2小时，其中将该凝乳在更低温度下加热更长时间并在更高温度下加热更短时间。更优选在高温及大于大气压的正压下处理大豆蛋白凝乳材料。

优选的大豆蛋白凝乳材料加热方法是通过将加压蒸汽注入凝乳中在高于室温的温度下处理大豆凝乳，此后称为“喷射蒸煮”。以下描述是优选的喷射蒸煮大豆蛋白凝乳材料的方法，然而，本发明不限于所述方法，而是包括可被本领域技术人员采用的任何显而易见的修改形式。

将大豆蛋白凝乳材料导入喷射蒸煮器给料槽，其中用搅拌大豆凝乳的搅拌器保持大豆凝乳悬浮。将凝乳从给料槽导入泵，该泵使得凝乳通过反应器管道。将蒸汽加压注入凝乳，一旦凝乳进入反应器管道，立即加热凝乳至期望温度。通过调节注入蒸汽的压力控制温度，温度优选为约75℃至约160℃，更优选约100℃至约155℃。在高温下处理凝乳，通过控制浆液通过管道的流速控制处理时间。优选的流速为约18.5lbs./分钟，并且蒸煮时间为在约150℃下约9秒。

为了生产本发明的蛋白材料，加热中和凝乳然后冷却并干燥。可用本领域已知的任何常规方法冷却并干燥凝乳。在本发明一个优选的实施方案中，通过闪蒸冷却凝乳。通过将热凝乳导入内部温度20℃至85℃的真空室中闪蒸热凝乳，这立即使凝乳压力从约25mm汞柱降至约100mm汞柱，更优选从约25mm汞柱降至约30mm汞柱。最优选地，将热凝乳从喷射蒸煮器的反应器管道中排入真空槽中，导致压力和温度立即大幅度下降，这从凝乳中蒸发大部分的水，立即冷却凝乳至所需温度。真空槽优选具有至多约85℃的高温以防止当把凝乳导入真空槽时大豆蛋白凝乳材料的胶凝作用。加压热处理并随后进行迅速降压和水分蒸发也引起大部分大豆材料的挥发性组分蒸发，从而改善大豆材料的味道。

闪蒸后的蛋白材料可然后进行干燥，优选喷雾干燥。喷雾烘干机优选是一种并流烘干机，其中输入的热空气和在压力下通过喷雾器进行了雾化的结构蛋白材料被注入烘干机，然后并流通过烘干机。

在一个优选的实施方案中，通过喷嘴喷雾器将蛋白材料注入烘干机。虽然喷嘴喷雾器是优选的，可利用其他喷雾干燥喷雾器如旋转喷雾器。在足够压力下将凝乳注入烘干机以雾化浆液。浆液优选在约3000磅/平方英寸至约5500磅/平方英寸的压力下雾化，最优选在约3500至5000磅/平方英寸的压力下雾化。通过热空气入口将热空气注入烘干机，该入口位置使得热空气与雾化的大豆凝乳从喷雾器并流进入烘干机。热空气温度为约285℃至约315℃，优选为约290℃至约300℃。

从喷雾烘干机中收集干燥大豆蛋白材料。可使用常规装置和方法收集大豆材料，包括旋风收集、袋式过滤器、静电沉淀、以及重力收集。

实施例14

SUPRO

 760-型高油酸大豆分离蛋白根据以下方法从高油酸大豆中生产。将100lbs脱脂高油酸大豆薄片置于萃取槽中并用1,000lbs加热至32℃的水萃取。这提供10∶1的水对薄片重量比率。分离薄片与提取物，并且用600lbs加热至32℃、并且加入足量氢氧化钙调节pH至9.7的水再萃取薄片。该第二萃取步骤提供6∶1的水对薄片的重量比率。离心移除薄片，组合使用第一和第二萃取并用盐酸调节至pH4.5以沉淀蛋白凝乳。离心分离酸沉淀的凝乳与提取物，留下含水乳清(弃去)，然后用起始薄片材料七倍重量的水洗涤以提供等电的分离蛋白。

为了生产SUPRO

 760-型高油酸蛋白材料，将水加入生物电大豆蛋白材料并用氢氧化钠水溶液调节pH至介于6.9和7.3之间以制备中和的大豆蛋白浆液，然后通过注入加压蒸汽到浆液中进行加热，此后称为“喷射蒸煮”。将中性大豆蛋白浆液导入喷射蒸煮器给料槽中，其中用搅拌浆液的搅拌器保持其悬浮。将浆液从给料槽导入泵，该泵使得浆液通过反应器管道。将蒸汽加压注入浆液，一旦浆液进入反应器管道，立即加热浆液至期望温度。通过调节注入蒸汽的压力控制温度。在150℃下热处理约9秒。加热后通过闪蒸冷却加热的中性浆液，闪蒸从热中性蛋白浆液中蒸发大部分水，立即冷却中性蛋白材料。

然后匀化冷却的中性蛋白浆液并将其转移到喷雾烘干机中，其中通过加热蒸发大部分水分以获得最终的SUPRO

 760-型大豆分离蛋白。

实施例15

为了制备本发明的Supro 760-型蛋白产品，用600lbs的32℃水以10∶1的水-大豆粉比率在搅拌器中萃取60lbs HO大豆粉，搅拌器搅拌大豆粉以使水-大豆薄片充分接触。加入足量消泡剂以防止起泡，这时加入54.48g亚硫酸盐(Na₂SO₃)。浆液pH为6.6。混合浆液10分钟。以12.2lb/分钟的速度，8.1％的固体含量将浆液给料于分批离心机以分离固体与液体。滗析出液体并将固体送回搅拌器中，在32℃下以5∶1的水-大豆薄片比率再次萃取。用NaOH将浆液pH提高至9.7，混合浆液10分钟并以12.2lb/分钟的速度，3.9％的给料固体在分批离心机中分离。离心后滗析出液体并弃去消耗的大豆薄片。合并第一和第二液体提取物并进行后续处理。为了沉淀蛋白，用HCl将pH调节至4.5并保持10分钟。以25lb/分钟，6.0％的固体含量将材料给料于分批离心机中，并且在55℃从凝乳中分离液体乳清。滗析出液体并将其弃去，用新鲜水以7∶1的水-大豆薄片比率使固体再次形成浆液，浆液通过Dispax碾磨机以确保有效洗涤。在25lb/分钟，59℃下将碾磨后的浆液给料于分批离心机以从凝乳中分离洗涤液体。湿凝乳用水重悬成11.3％的固体含量，它适于蛋白浆液的巴氏灭菌。用NaOH将浆液pH提高到pH7.1，并且在550磅/平方英寸下匀化浆液。将浆液导入喷射蒸煮器给料槽，其中用搅拌大豆凝乳的搅拌器保持大豆凝乳悬浮。将凝乳浆液从给料槽导入泵中，所述泵使得凝乳通过直径0.94英寸、长33英寸的反应器管道。将蒸汽加压注入凝乳，一旦凝乳进入反应器管道，立即加热凝乳至期望温度。通过调节注入蒸汽的压力控制温度为149℃。高温处理凝乳9秒。然后冷却并干燥热凝乳。通过闪蒸冷却凝乳。将热凝乳导入内部温度为63℃的闪蒸槽以闪蒸热凝乳，热凝乳压力立即降至26mm汞柱。压力和温度立即的大幅度下降从凝乳中蒸发大部分水分，立即冷却凝乳至68℃。

闪蒸蛋白材料使用并流烘干机进行喷雾干燥，其中将输入的热空气和蛋白材料通过喷雾器加压注入烘干机使它们雾化并且并流通过烘干机。

将凝乳浆液给料于匀化器并在57℃、1500磅/平方英寸下匀化。在4000磅/平方英寸的雾化压力下将匀化浆液通过喷嘴喷雾器注入烘干机。通过热空气入口将热空气注入烘干机，该入口位置使得热空气与雾化大豆凝乳从喷雾器并流进入烘干机。热空气温度为265℃。烘干机出口温度为89℃。

通过重力收集从喷雾烘干机的出口收集干燥的高油酸Supro

 760-型大豆分离蛋白。

实施例16

骤)

由大豆蛋白凝乳材料形成Supro

 670型蛋白材料的方式很大程度上与在实施例15中所述的Supro

670蛋白材料相同，然而，它包括一个酶蛋白水解步骤以水解蛋白。大豆蛋白凝乳材料首先被稀释至约12-15％的固体含量，并且用含水碱性溶液或含水碱土溶液中和到pH7.5至8.1，优选氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。加热并冷却中和的大豆蛋白凝乳，优选喷射蒸煮和闪蒸冷却，所述方法与如上所述的针对制备Supro

 760蛋白材料的方法相同。加热后优选将凝乳冷却到55℃至60℃。

在闪蒸冷却后，将活性为约2400TU/g的酶(菠萝蛋白酶)加入按凝乳固体含量计约0.02％的溶液。在连续混合状态下使得酶处理溶液反应约15分钟至65分钟，优选20-45分钟。加热水解大豆蛋白凝乳材料至有效灭活酶的温度以终止水解。使用如上所述的针对生产干燥Supro760蛋白材料的方法，最优选喷射蒸煮水解大豆蛋白凝乳材料以灭活酶，并且将其闪蒸冷却然后干燥。干燥的水解材料是干燥Supro

 670蛋白材料。

实施例17

基本上如实施例16所述制备SUPRO

 670-型高油酸大豆分离蛋白，但实验细节如下所述。用600lbs的41℃水以10∶1的水-大豆粉比率在搅拌器中萃取HO大豆粉(60lbs)，搅拌器搅拌大豆粉以使水-大豆薄片充分接触。加入足量消泡剂以防止起泡，这时加入54.48g亚硫酸盐(Na₂SO₃)。浆液pH为6.5。混合浆液10分钟。以10.0lb/分钟的速度，8.2％的固体含量将浆液给料于分批离心机以分离固体与液体。滗析出液体并将固体送回搅拌器中，在33℃下以5∶1的水-大豆薄片比率再次萃取。用NaOH将浆液pH提高至9.7，混合浆液10分钟并以12.0lb/分钟的速度，3.8％的给料固体在分批离心机中分离。离心后滗析出液体并弃去消耗的大豆薄片。合并第一和第二液体提取物并进行后续处理。为了沉淀蛋白，用HCl将pH调节至4.5并保持10分钟。以24lb/分钟，6.0.0％的固体含量将材料给料于分批离心机中，并且在57℃从凝乳中分离液体乳清。滗析出液体并将其弃去，用新鲜水以7∶1的水-大豆薄片比率使固体再次形成浆液，浆液通过Dispax碾磨机以确保有效洗涤。在14lb/分钟，56℃下将碾磨后的浆液给料于分批离心机以从凝乳中分离洗涤液体。湿凝乳用水重悬成11.3％的固体含量，它适于蛋白浆液的巴氏灭菌。用NaOH将浆液pH提高到pH7.7，并且在550磅/平方英寸下匀化浆液。将浆液导入喷射蒸煮器给料槽，其中用搅拌大豆凝乳的搅拌器保持大豆凝乳悬浮。将凝乳浆液从给料槽导入泵中，所述泵使得凝乳通过直径0.94英寸、长33英寸的反应器管道。将蒸汽加压注入凝乳，一旦凝乳进入反应器管道，立即加热凝乳至期望温度。通过调节注入蒸汽的压力控制温度为129℃。高温处理凝乳9秒。然后冷却并干燥热凝乳。通过闪蒸冷却凝乳。将热凝乳导入内部温度为63℃的闪蒸槽以闪蒸热凝乳，热凝乳压力立即降至23mm汞柱。压力和温度立即的大幅度下降从凝乳中蒸发大部分水分，立即冷却凝乳至70℃。

在闪蒸冷却后，将活性为约2400TU/g的酶(菠萝蛋白酶)加入按凝乳固体含量计0.03％的溶液。在连续混合条件下使酶反应溶液反应35分钟。加热水解大豆蛋白凝乳材料至有效灭活酶的温度以终止水解。将水解的大豆蛋白凝乳材料在142℃下喷射蒸煮9秒以灭活酶并闪蒸冷却。将热凝乳导入内部温度为61℃的闪蒸槽以闪蒸热凝乳，热凝乳压力立即降至25mm汞柱。压力和温度立即的大幅度下降从凝乳中蒸发大部分水分，立即冷却凝乳至61℃。

闪蒸蛋白材料使用并流烘干机进行匀化和喷雾干燥，其中将输入的热空气和蛋白材料通过喷雾器加压注入烘干机使它们雾化并且并流通过烘干机。

将凝乳浆液给料于匀化器并在54℃、2000磅/平方英寸下匀化。在4000磅/平方英寸的雾化压力下将匀化浆液通过喷嘴喷雾器注入烘干机。通过热空气入口将热空气注入烘干机，该入口位置使得热空气与雾化大豆凝乳从喷雾器并流进入烘干机。热空气温度为307℃。烘干机出口温度为93℃。

通过重力收集从喷雾烘干机的出口收集干燥的水解高油酸Supro

670-型大豆分离蛋白。

实施例18

SUPRO

 670-型高油酸大豆分离蛋白根据以下方法从高油酸大豆中生产。将100lbs脱脂高油酸大豆薄片置于萃取槽中并用1,000lbs加热至32℃的水萃取。这提供10∶1的水对薄片重量比率。分离薄片与提取物，并且用600lbs加热至32℃、并且加入足量氢氧化钙调节pH至9.7的水再萃取薄片。该第二萃取步骤提供6∶1的水对薄片的重量比率。离心移除薄片，组合使用第一和第二萃取并用盐酸调节至pH4.5以沉淀蛋白凝乳。离心分离酸沉淀的凝乳与提取物，留下含水乳清(弃去)，然后用起始薄片材料七倍重量的水洗涤以提供等电的分离蛋白。

为了生产SUPRO

 670-型高油酸蛋白材料，将水加入等电大豆蛋白材料并用氢氧化钠水溶液调节pH至介于7.3和7.7之间以制备中和的大豆蛋白浆液，然后通过注入加压蒸汽到浆液中进行加热，此后称为“喷射蒸煮”。将中性大豆蛋白浆液导入喷射蒸煮器给料槽中，其中用搅拌浆液的搅拌器保持其悬浮。将浆液从给料槽导入泵，该泵使得浆液通过反应器管道。将蒸汽加压注入浆液，一旦浆液进入反应器管道，立即加热浆液至期望温度。通过调节注入蒸汽的压力控制温度。在130℃下热处理约9秒。加热后通过闪蒸冷却加热的中性浆液，闪蒸从热中性蛋白浆液中蒸发大部分水，立即冷却中性蛋白材料至约61℃。将菠萝蛋白酶加到冷却蛋白浆液中并反应足够的时间以酶水解蛋白至TNBS值为约50。然后将酶处理的浆液用喷射蒸煮法进行热处理以灭活菠萝蛋白酶。在喷射蒸煮器中将酶处理的浆液在约152℃蒸煮约9秒。加热后通过闪蒸冷却加热的中性浆液，闪蒸从热中性蛋白浆液中蒸发大部分水，立即冷却中性蛋白材料至约82℃。

然后匀化冷却的中性蛋白浆液并将其转移到喷雾烘干机中，其中通过加热蒸发大部分水分以获得最终的SUPRO

 670-型大豆分离蛋白。

实施例19

高油酸蛋白大豆分离蛋白的凝胶强度测量(小规模生产平台)

分析与由商品大豆或低亚麻酸大豆制成的分离物相比，高油酸分离蛋白(基本上如实施例10所述进行制备)对冷藏和巴氏灭菌凝胶的凝胶强度的效应。本文所用的低亚麻酸大豆的脂肪酸组合物已经在公布于1999年11月9日的US 5,981,781的表2中公开。在低亚麻酸品系中的油酸含量类似于存在于商品大豆中的油酸含量，然而亚麻酸含量降低约3倍。

除了与来自商品大豆的分离物比较之外，低亚麻酸样本还与高油酸样本比较。通过在瓦林混碎机中以混合设置#2混合75mL ddH2O和15g分离蛋白30秒来制备凝胶(初始水合)。停止搅拌器并从其球面上刮除任何残余干蛋白。

在一些情况下，通过在这时加入0.84g NaCl，继续混合总计3分钟并且每隔30秒进行附加的刮除来制备凝胶。制备凝胶后，用一次性套筒微型枪式分配器将凝胶装入5mL玻璃小瓶中。小心操作以消除任何残余的气泡。用紧紧压褶的膜和顶盖密封小瓶。将密封小瓶立即置于冷藏机中并贮存16-24小时(冷藏凝胶)或在80℃温浴下培养30分钟，在冷藏16-24小时前在25℃水浴中冷却30分钟(巴氏灭菌的凝胶)。

在质构分析仪(TAXT.2i，Stable Micro Systems，UK)或AR-1000流变仪(TA Instruments)上测量凝胶强度。当在质构分析仪上测量凝胶强度时，从冷藏机中取出凝胶并升温至25℃。将开盖的样本小瓶置于载样平台的中央并使用直径3mm的不锈圆柱形打孔探头进行测量。凝胶在小瓶中央穿透两次，穿透深度为10mm，用仪器制造商的软件记录数据。积分计算曲线正向部分下的面积并记录数值(标记的面积)。在第二天重复进行凝胶制备和测量，数据取平均值并记录下来。

结果如图4所示。高油酸大豆分离物与非高油酸大豆分离物相比较的平均凝胶强度和标准偏差分别为168±45g*s和346±59g*s。高油酸大豆分离物与非高油酸大豆分离物相比较其凝胶强度减少了25％-70％(从平均值计算得到)。

表4

高油酸分离物与对照大豆分离物相比的凝胶强度

1高油酸、高油酸v.1(版本1)和高油酸v.2(版本2)大豆分离蛋白如实施例3、5、和8所述制备。对于本发明而言，将商品大豆和低亚麻酸(参见表8)大豆分离物用作对照物并称为“商品”品系。凝胶强度所得数字在小数点后四舍五入。

2商品名指制备分离物的具体工艺参数。

实施例20

高油酸大豆(蛋白产品)的Hunter颜色测定(小规模生产平台)

5％分离蛋白浆液(基本上如实施例10所述进行制备)在Hunter Colorflex 45/0 LAV仪器上进行颜色测量，仪器设置为D65/10。使用制造商为小体积测量提供的定制环，通过将其置于样本杯内，减少分析必需的样本量。用吸移管将14mL(10mm环)或8mL(5mm环)5％分离蛋白浆液分配到环中心，流体液面仅高于环顶部。当用仪器制造商提供的软件启动时，将样本杯置于仪器上并盖上白色或黑色盘。用该软件计算L值和与白色的差值数据并记录下来。将获得的样本L、a、和b刻度值报道为样本颜色。白度指数使用下式从L和b刻度值计算得到：白度指数＝L-3b

高油酸大豆、低亚麻酸大豆和商品大豆样本的颜色L值、与白色的色差以及白度指数在表5中列出。在5％蛋白浆液中测量上述值。高油酸样本具有较高的L值、较低的与白色的差值以及增加的白度指数。高油酸大豆样本的平均白度指数和标准偏差为45±4.4，而非高油酸大豆样本的平均白度指数和标准偏差为37±4.9。据观察，高油酸样本与非高油酸样本相比其白度指数增加3％-35％(从平均值计算得到)。

表5

实施例21

巴氏灭菌器给料粘度测量(小规模生产平台)

在调节固体浓度和pH后，在制备分离蛋白期间收集巴氏灭菌器给料的小量样本(基本上如实施例10所述进行制备)。为了制备样本进行粘度测量，用一次性吸移管将样本装载到AR-1000流变仪(TA Instruments)的平台上并将头部降低至1500mm。清除在凝胶边缘的过多样本并盖上盖以准备测量。在制备巴氏灭菌器给料后测量其粘度60分钟，测量使用40mm平板，间隙设置为1000μm。记录粘度(以厘泊为单位测量)数据并用仪器制造商提供的Rheology Advantage Data Analysis软件进行分析。

与低亚麻酸或商品样本相比，高油酸样本具有更低的巴氏灭菌器给料粘度(表6)。

高油酸大豆样本与非高油酸大豆分离物相比，它们的平均粘度和标准偏差分别是110±57.8cp和449±125cp，高油酸样本与非高油酸样本相比，粘度减少％(从平均值计算得到)为约9％至52％。

表6

高油酸大豆分离物的粘度测量

实施例22

使用高油酸大豆改善干燥效率

将高油酸大豆产品以比商品大豆蛋白产品更高的给料固体(约14％)给料于巴氏灭菌器或烘干机(在实施例23的表7&表8中)。这能用高油酸大豆蛋白产品的粘度减少来解释。当以提高的给料固体将蛋白产品给料于巴氏灭菌器或烘干机时，加入烘干机的每磅给料必须除去的水减少，导致能量成本减少，并且每小时可干燥更多的固体导致更好的资金利用以及更高的生产量。

表7

测量的加到喷雾干燥器中的高油酸对商品豆类浆液的固体含量

实施例23

高油酸大豆蛋白产品的凝胶强度测量

当以不小于14％的给料固体给料于干燥器时，高油酸大豆蛋白产品具有比得上商品大豆蛋白产品的凝胶强度。

凝胶强度在AR-1000流变仪上测量，用金属刮刀将凝胶样本置于流变仪平台上并将头部降低至1500μm。从凝胶边缘切除多余的凝胶并将上盖置于顶部。40mm交叉影线形状的1400um ta间隙用于在由仪器软件控制的振动模式下的测量。记录来自每个样本的2个平行测定的G′(标记的凝胶弹性，以单位Pascals[Pa]表示)(表8)。

表8

与商品大豆相比，在高油酸大豆终产品中测量出的浆液固体浓度和 ％蛋白

实施例24

通过酸甲醇分解进行的残余脂肪酸分析

称重三等份样本(大约100mg)，精确至0.1mg，将其置于13×100mm螺帽(PTFE衬里)管中。在加入C17:0三酰基甘油内部标准品(10μL，5％W:V甲苯中原液)后，每管中加入1mL新鲜甲醇分解溶液(5％硫酸无水甲醇)。管上加帽，涡旋混合并在80℃加热30分钟，每隔10分钟进行涡旋混合。样本冷却至室温，每管中加入1mL盐水溶液(25％氯化钠水溶液)，然后加入1mL庚烷。涡旋混合后，离心分离所述相(3000×g离心10分钟)，将上部有机相转移到GC样本小瓶中。在配有FID检测器的Agilent 6890上进行脂肪酸分析。GC配有OmegaWax-320，30m×0.32mm×0.25μm柱(Supelco，Bellefonte，PA)。载气为氢气(28cm/秒的线速度)并使用以下温度特征图；220℃2.6分钟，10℃升温至240℃，保持1.4分钟。积分计算单个脂肪酸的峰面积，相对于C17内部标准品定量单个脂肪酸，基于这些值估算脂肪酸组合物。假定检测器对每个脂肪酸响应相同(Morrison等人，(1980)Methods for the quantitative analysis of lipids in cereal grains and similar tissues.Journal of Science Food and Agriculture 31：329-340)。

使用上述技术，测定商品大豆和两个遗传学上改变的大豆品种：高油酸大豆和低亚麻酸大豆的与己烷提取的大豆白色薄片粉和用它们制造的大豆分离蛋白相关联的残余脂肪酸的脂肪酸特征。结果如图9所示。虽然公认大豆油中存在其他脂肪酸并且大豆产品中存在残余脂质，但是它们仅存在痕量(＜总量的3％)。为了在本专利中进行比较，我们已经将我们的分析限定于最丰富的脂肪酸即，棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)。

与己烷脱脂的白色薄片豆粉和大豆分离蛋白相关联的残余脂肪酸主要以磷脂形式存在，因此来源于膜脂，然而己烷提取的大豆油主要由贮藏的甘油三酯组成。在该工作之前，残余脂肪酸特征将与己烷提取的大豆油脂肪酸特征的相关密切程度是未知的。从表9中的数据能看出受试的三个遗传学上不同的大豆品种在大豆白色薄片粉和大豆分离蛋白中存在的残余脂肪酸中的棕榈酸含量与己烷提取的大豆油相比增加。与之相反，在商品大豆和低亚麻酸大豆中，与己烷提取的大豆油相比，残余脂肪酸中的油酸含量显著减少，但是在高油酸大豆中仅有部分减少。多不饱和脂肪酸(亚油酸和亚麻酸)在来自三个遗传学上不同的大豆品种的残余脂肪酸和己烷提取的大豆油中含量相似。

在来自低亚麻酸大豆的大豆白色薄片粉和大豆分离蛋白中的残余脂肪酸具有比商品大豆蛋白产品的残余脂肪酸更低的氧化不稳定亚麻酸含量，指示由低亚麻酸大豆制成的大豆蛋白产品更难以生成异味化合物。同样地，在来自高油酸大豆的大豆白色薄片粉和大豆分离蛋白中的残余脂肪酸具有比商品大豆蛋白产品的残余脂肪酸更低的多不饱和脂肪酸、亚油酸和亚麻酸含量，指示由高油酸大豆制成的大豆蛋白产品更难以生成异味化合物。

表9

大豆油、在由己烷脱脂的大豆白色薄片制成的粉末中的残余脂肪 酸、以及大豆分离蛋白的脂肪酸特征

就该表而言，脂肪酸％将单个脂肪酸与指出的五种主要脂肪酸的总量相关联。其他有时存在的并占小于3％总脂肪酸的脂肪酸类型不被考虑进行比较。

1商品大豆油中的五种脂肪酸的值范围得自“The Lipid Handbook”，第2版，(1994)Gunstone，F.D.，Harwood，J.L.，Padley，F.B.，Chapman & Hall。

2WFF＝来自己烷提取大豆的白色薄片粉

3SPI＝由白色薄片粉生产的大豆分离蛋白

4表X US 5710369

5表9 US 6426448

16:0＝棕榈酸，18:0＝硬脂酸，18:1＝油酸，18:2＝亚油酸，18:3＝亚麻酸

实施例25

高油酸和商品大豆分离物的脂肪酸分析

来自Supro

 760型高油酸、Supo

 760型ver.2和商品大豆的分离物如实施例13所述制备。

如下所述进行分离物的脂肪酸分析，结果如表10所示。

如下测定大豆分离蛋白的脂肪酸相对量。通过酸水解脂肪方法(AOAC 922.06)提取大豆分离蛋白。用氢氧化钠醇溶液皂化提取的脂质。以三氟化硼为催化剂，用甲醇酯化脂肪酸，摄入庚烷中并注入配有火焰离子化检测器和冷柱头进样器的Agilent 5890气相色谱仪中。脂肪酸甲酯在Supelco SP-2560柱(100m×0.25mm ID)上分离。设置柱温为140℃保持5分钟，然后以4℃每分钟加热至240℃的最高温度并保持该温度至检测结束。从一组包含已知浓度的由选择脂肪酸的甲酯制备的标准品中计算单个脂肪酸甲酯的百分比。

表10

实施例26

由使用大规模生产平台生产的分离物制备的大豆蛋白浆液的粘度 测量

用型号DV-II+的布氏粘度计测量粘度。

通过称出指定量的蛋白(±0.1g)到塑料杯中制备5％和10％蛋白浆液的样本。

用250mL带刻度的量筒量出指定量的26±1℃去离子水。将水注入玻璃品脱混合广口瓶中并小心地加入蛋白样本。用叶片组合件立即盖上广口瓶并剧烈振荡样本混合物20秒以分散蛋白并防止它粘附在广口瓶侧面上。随后用共混机的最低速度混合样本1分钟。然后将蛋白浆液加到600mL烧杯中并加入三滴消泡剂到浆液中，涡旋混合物。盖上烧杯并静置30分钟，然后涡旋以驱散并除去任何剩余泡沫。

开启布氏粘度计(按照制造商的说明书)并测量样本粘度。粘度的量度为厘泊(cps)。布氏锭子号为1，转速为100rpm，记录数据的温度为22℃。

从表11可以看出，高油酸蛋白样本的5％和10％分散体以cps为量度的粘度与商品大豆的相应样本相比大幅减少(5％浆液减少83％，10％浆液减少87％)。

表11

度测量

实施例27

由使用大规模生产平台生产的分离物制备的大豆蛋白浆液的粘度 测量

为了进行流变学评估，通过将90g去离子水加入8盎司塑料混合广口瓶中来对分离蛋白进行水合，随后加入10g分离蛋白粉末到水表面。该混合物用Oster共混机的“混合”设置混合90秒。在这段时间后，将混合物滗析到16盎司塑料杯中。该杯用塑料盖封盖，并且允许浆液在22℃静置约4小时，使得流体上方的大部分泡沫在进行流变学测量前消散。

通过Anton Paar MCR-300和MCR-301流变仪的组合重复进行流变学测量。每个流变仪配备有同心圆柱体(Anton Paar CC27)，其工作长度为119.2mm，位置长度为72.5mm，间隙长度为40mm。通过从温控槽到控制测量槽温度的Peltier样本加热器循环22℃水进行温度控制。所有测量在25±0.05℃下进行。经由以下4步骤程序获得每个样本的粘度曲线：(1)将19mL样本载入同心圆柱体杯中并在10l/s的剪切速率下预剪切30s以抹去样本加载历史。(2)在预剪切步骤后立即在25℃下平衡样本10分钟。(3)然后使样本经受一个1-100l/s的剪切速率变化过程，在此期间以30s每点的间隔记录20个对数间隔的数据点。(4)然后将样本立即暴露于剪切速率下降过程，它具有与上升过程相同的特性，但是施用于反方向(100-1l/s)。所得粘度对剪切速率的曲线适用于第2对数多项式模型：粘度＝A(剪切速率)^[b+c ln(剪切速率)]，其中A、b、和c是拟合常数。剪切应力对剪切速率的曲线也在这些测量期间被记录，并且适用于Herschel-Bulkley幂律模型：(剪切应力)＝K(剪切速率)^n，其中K和n分别是Herschel-Bulkley稠度和流动指数。在每个测量期间也记录由剪切速率上升和下降过程限定的剪切应力磁滞面积(HA)。

由这些测量产生的高油酸和商品SUPRO

ISP产品的流变学特性在表10-A中进行比较。表中报道了A、K、n(仅来自剪切速率上升过程)的平均值和磁滞面积。每个参数的变化平均系数分别为2.3、1.5、0.4、和7.4。在商品和SUPRO

760、SUPRO1610、和SUPRO

651 ISP产品的高油酸变体之间观察到了显著的流变学差异。高油酸样本对它们的商品类似物的A值、K值、和磁滞面积减少分别在67-90％、41-86％、以及45-90％的范围内。SUPRO

760和SUPRO

651高油酸ISP样本也对它们的商品变体表现出更大的流动指数-指示更大的Newtonian特性。与之相反，事实上在高油酸和SUPRO

670 ISP产品的商品变体之间未观察到流变学差异。

表12

的流变学比较

实施例28

高油酸大豆(蛋白)产品的Hunter颜色测定(大规模生产平台)

用Hunter色度计对高油酸蛋白和商品蛋白粉和5％含水浆液进行颜色测量。可检测出二单位的L值差异和一单位的白度指数差异。HO粉末的白度指数与商品粉末的白度指数相比增加了11％，HO浆液的白度指数与商品浆液的白度指数相比增加了34％。数据如表13和14所示。

使用Hunter Associates Laboratory(HunterLab，Reston，VA)制造的HunterLab Labscan XE色度计测量由HO和商品分离物制备的包含按重量计5％固体的悬浮液样本的白度指数。就白度指数测量而言，蛋白样本按5％w/w基分散：(5.25g)加到去离子水(100mL)中。使用Hunter色度计获得的结果以L、a、和b单位报告。白度指数使用下式从L和b刻度值计算得到：白度指数＝L-3b。

表13

高油酸和商品大豆样本的Hunter颜色测定

表14

高油酸和商品大豆样本的Hunter颜色测定

实施例29

制备原味豆浆

将约20磅干燥整大豆浸泡在过量(40磅或更多)冷自来水中，然后静置过夜。随后将多余的水排出。将40磅加水大豆用压榨机或研磨机碾碎。在碾磨期间不断加入足够量的水以保持浆液通过研磨机。然后加入足量水以使总浆液重量达到最多大约180磅。随后将浆液转移到高压锅中并通过注入蒸汽升温至116℃，保持温度恒定大约40秒。把浆液或豆浆排出高压锅并加压通过粗孔织物。将大豆残渣(okara)在袋中加压移除其中剩下的豆浆，然后弃去残渣。所得豆浆加压通过细孔织物，然后置于容器中。该过程产生大约200磅93.3℃的豆浆。加入卵磷脂(93g)、玉米油(533g)和酵母调味剂(180g)，用Tekmar高速剪切搅拌器搅拌混合物30秒。

实施例30

制备调味豆浆

包括如下表所示成分的豆浆饮料由上述产品(实施例原味豆浆)和大豆分离蛋白(Supro

760)制成。

将100％的水加热至65.6℃并保持在65.6℃，同时进行搅拌，直至加入所有成分。搅拌的同时加入蛋白产品，混合直至溶解。将蔗糖、羧甲基纤维素和角叉菜胶干混并加入蛋白浆液中，混合至溶解。加入碳酸钙和氯化钠并将它们分散。然后加入大豆油，随后加入调味剂和维生素预混物。按需用HCl或NaOH将体系的pH调节至介于6.8和7.0之间。然后在超高温短时处理器中在143℃下处理产品10秒钟。然后将产品在2重式匀化器中(2000和500psi)匀化，冷却并装入洁净瓶储存在冷藏机中。样本的白度指数和粘度在表15中显示。HO调味豆浆与由商品大豆制成的调味豆浆相比其白度指数和粘度分别增加了22％以及减少了40％。

表15

实施例31

原味豆浆的物理特性

如实施例30所述制备由高油酸大豆和商品大豆制成的原味豆浆。样本的白度指数和粘度在表16中显示。HO豆浆的粘度与商品豆浆的粘度相比减少了17％。HO豆浆的白度指数与由商品大豆制成的豆浆的白度指数相比增加了7.5％。

表16

实施例32

用于大豆挥发物分析的固相微萃取(SPME)GC MS方法

用SPME GC MS方法进行大豆挥发化合物分析的样本通过称出2.5±0.005g待分析样本到称量船中进行制备。然后将47.5±0.1g反向渗透(例如Mili-Q或Labcono)水称量到250mL瓦林混碎机杯中。该共混机开始以最低速度运行并将称出的样本经过大约10秒撒在水中。用使得产生最少泡沫的最低速度将样本和水共混成浆液。共混时间将足以使样本达到良好的分散度并应为约30秒，并且不超过60秒。这应对每一种样本基质保持一致。如果泡沫增加，将用勺子将泡沫舀去，并且将其手工拌回到样本混合物中。

为了悬浮浆液并使其尽可能均一化，用勺子或铲子将浆液短暂搅拌。然后将30g浆液从共混机杯中迅速转移到配衡SPME小瓶中(50mL血清瓶：Supelco p/n 33108-u)，该瓶中包含11.1g NaCl(Omnipur等级，EMD Chemicals)。

将100μL 4-庚酮的49.2ppm内部标准品原液吸移到SPME小瓶中混合以生成164ppb内部标准品浓度。将1″(1/16″直径)特氟隆搅拌棒放入小瓶中并用配有Natural Teflon/Blue Silicone垫(Microanalytical Supplies)的钳口带垫顶盖(Supelco)密封小瓶以确保良好的气密性。然后将瓶子放在搅拌盘的中心上，以300rpm搅拌5分钟以充分混合并平衡顶部空间。

如下进行样本萃取。如果是第一次使用，按照制造商手册(Supelco)推荐的方法在250℃下用最小载气流量预处理SPME纤维30分钟。在运行期间在280℃将该纤维插入后面的注射端口再处理最少30分钟。一旦顶部空间达到平衡，将加套的SPME纤维穿过瓶垫。必须确保套和纤维都不接触或浸入液体。

然后必须使SPME纤维伸出它的套并暴露于顶部空间30分钟。将调整纤维高度使得其末端大约1/4″高出液体表面。随后SPME纤维缩进其套中并从瓶垫中退回。包含挥发物的纤维将被尽可能快地注入进行分析。分析在Agilent 6890N GC上进行，该仪器配有7973 MSD检测器和Agilent ChemStation软件。用带套的SPME纤维通过进样器垫注入样本，然后迅速拔出纤维进入进样器主体。当GC开始时分离开始。SPME将被拔出套并留在进样器中1.5分钟，在此之后将其移除并进行再处理，并且缩回其套中。

用Agilent ChemStation Software分析数据，通过手动积分计算峰面积。通过下式将每个目标挥发物计算出的峰面积转化成ppb：浆液中挥发物浓度(μg/kg浆液)＝164×目标峰面积/int.std.峰面积

实施例33

大豆分离物的挥发物分析

如实施例32所述进行样本制备和分析，浆液¹中的挥发物浓度在表17中显示。

从表17中可看出(高油酸样本的己醛含量基本上低于由商品大豆制成的相应样本的己醛含量。据信较低的己醛含量对应于改善的大豆蛋白产品口味。

表17

1所有浓度用μg挥发物/kg 5％浆液相对于4-庚酮内标表示。内标的量为164μg/kg 5％浆液。

2ND＝未检出

Claims (11)

1.获自高油酸大豆的大豆蛋白产品，其中所述产品在与获自商品大豆的大豆蛋白产品进行比较时具有至少一种选自以下的特性：改善的白度、减少的凝胶强度和减少的粘度，从商品大豆获取所述大豆蛋白产品的方法与从高油酸大豆获取所述大豆蛋白产品的方法相同。

2.权利要求1的大豆蛋白产品，其中：

a)白度指数增加至少3％；或

b)凝胶强度减少至少25％；或

c)未水解大豆蛋白产品的粘度减少至少9％。

3.权利要求1或2中任一项的大豆蛋白产品，其中所述蛋白产品按无水计具有至少40％的蛋白(N×6.25)。

4.权利要求1或2中任一项的大豆蛋白产品，其中所述蛋白产品按无水计具有至少65％的蛋白(N×6.25)。

5.权利要求1或2中任一项的大豆蛋白产品，其中所述蛋白产品按无水计具有至少90％的蛋白(N×6.25)。

6.权利要求1或2中任一项的大豆蛋白产品，其中所述产品选自大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豆粕、全脂豆粉、豆浆粉、脱脂豆粉、豆浆、组织化蛋白、组织化豆粉、组织化浓缩物和组织化分离物。

7.掺入了权利要求1或2中任一项的大豆蛋白产品的食品。

8.掺入了权利要求1或2中任一项的大豆蛋白产品的饮料。

9.掺入了权利要求1或2中任一项的大豆蛋白产品的动物饲料。

10.用于改善大豆蛋白产品干燥效率的方法，所述方法包括：与获自商品大豆的至少一种大豆蛋白产品的给料相比，将获自高油酸大豆种子的至少一种大豆蛋白产品以更高的给料固体给料于巴氏灭菌器或烘干机。

11.用于改善大豆蛋白产品干燥效率的方法，所述方法包括：将获自高油酸大豆种子的至少一种大豆蛋白产品以不小于14％的给料固体给料于巴氏灭菌器或烘干机。

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