KR102198787B1 - 변이된 comt 유전자를 포함하는 사료용 작물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 변이된 COMT 단백질, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 벡터, 상기 형질전환 벡터가 도입되어 형질전환된 사료용 작물, 상기 형질전환된 사료용 작물을 포함하는 사료용 조성물, 상기 사료용 조성물을 포함하는 사료, 상기 사료를 이용한 가축의 사육방법 및 상기 형질전환된 사료용 작물의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 형질전환된 사료용 작물은 일반적인 사료용 작물에 비하여 총 리그닌 함량이 감소되어 이로부터 얻어진 바이오매스의 소화율이 증가될 뿐만 아니라, 헤미셀룰로오스의 일종인 자일로스의 함량이 증가되는 특징을 나타내므로, 상기 형질전환된 사료용 작물은 다양한 가축 비육용 사료의 유효성분으로서 활용될 수 있을 것이다.

Description

변이된 COMT 유전자를 포함하는 사료용 작물 및 이의 용도{Novel feed crop comprising mutated COMT gene and uses thereof}

본 발명은 변이된 COMT 유전자를 포함하는 사료용 작물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 변이된 COMT 단백질, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 벡터, 상기 형질전환 벡터가 도입되어 형질전환된 사료용 작물, 상기 형질전환된 사료용 작물을 포함하는 사료용 조성물, 상기 사료용 조성물을 포함하는 사료, 상기 사료를 이용한 가축의 사육방법 및 상기 형질전환된 사료용 작물의 생산방법에 관한 것이다.

리그닌 (lignin)은 중합체 거대분자이며, 식물 세포벽의 주된 구성성분이다. 상기 리그닌은 또한 조직에서 구조적인 지지에 필수적이며, 식물 맥관구조의 소수성에 기여하고, 병원체 공격으로부터 식물을 보호하는 역할을 수행한다. 식물 리그닌은 속씨식물에서 주로 구아이아실 (G) 및 시린길 (S) 모노리그놀 서브유닛으로 이루어진다. p-히드록시페닐 (H) 서브유닛은 p-쿠마릴 코어 모노리그놀로부터 유도된다. 높은 S/G-함량 비율을 보유한 목재 물질에서는 펄프 형성 동안 리그닌의 화학적 분해가 더욱더 효율적으로 일어난다. 페닐프로파노이드 경로는 또한 다양한 환경에 대한 식물 적응에 필수적인 페놀계 생성물을 생성한다고 알려져 있다.

상술한 바와 같이, 상기 리그닌은 식물을 보호하는 역할을 수행하지만, 식물체를 이용하는 사용자의 관점에서 볼 때는 식물의 이용율을 저하시키는 주된 원인으로 여겨지고 있다. 이에 따라, 상기 리그닌의 합성을 억제하여 식물의 이용율을 향상시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제10-1300509호에 억새 식물체에서 COMT 유전자의 발현을 억제하여 리그닌의 함량을 감소시키는 기술이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2013-0108088호에 리그닌 함량이 감소된 옥수수를 소의 비육사료로 사용하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 상기 리그닌의 발현을 억제하거나 함량을 감소시키면 해당 식물체가 정상적으로 생육하지 못한다는 단점이 대두됨에 따라, 이러한 단점을 해결하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 배경하에서 본 발명자들은 식물체의 생육에 별다른 영향을 미치지 않으면서도 식물체의 이용율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, COMT 유전자의 점 돌연변이를 유발시킬 경우, 식물체의 총 리그닌 함량이 다소 감소되어, 이로부터 수득한 바이오매스의 소화율을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 변이된 COMT(caffeic acid O-methyltransferase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는, 변이된 COMT(caffeic acid O-methyltransferase) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 벡터가 도입되어 형질전환된 사료용 작물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 사료용 작물을 포함하는 사료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 사료용 조성물을 포함하는 사료를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 사료를 가축에게 급이하는 단계를 포함하는 가축의 사육방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 사료용 작물의 생산방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 사료용 작물에 도입되어, 리그닌의 합성을 억제하고, 헤미셀룰로오스의 합성을 촉진할 수 있는, 변이된 COMT(caffeic acid O-methyltransferase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는, 변이된 COMT(caffeic acid O-methyltransferase) 단백질을 제공한다.

본 발명의 용어 "사료용 작물"이란, 가축의 사료를 얻기 위하여 재배하는 식물류를 통칭하는 용어이다. 사료를 공급하는 가축에 따라, 화본과 작물, 콩과 작물, 기타 작물 등으로 구분되는데, 상기 화본과 작물로는 벼, 조, 수수, 옥수수, 귀리, 보리, 기장, 티머디, 오챠드그라스, 라이그라스 등을 들 수 있고, 상기 콩과 작물로는 알팔파, 화이트클로버, 레드클로버, 스위트클로버, 동부 등을 들 수 있으며, 기탁 작물로는 순무, 비이트, 해바라기, 뚱딴지 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 사료용 작물은 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있는 벼, 조, 수수, 옥수수, 귀리, 보리, 기장, 티머디, 오챠드그라스, 라이그라스 등의 화본과 작물인 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "리그닌"이란, 관속식물(vascular plant)과 일부 조류(algae)에서 조직을 지지하는 중요한 구조물질을 형성하는 유기폴리머(organic polymer) 화합물의 일종을 의미한다. 상기 리그닌은 식물에서 2차 세포벽의 구성성분으로 사용되는데, 셀룰로오스 및 다른 다당류와 함께 공유결합을 형성하여 식물에서 기계적인 지지체를 형성하므로, 사료용 작물을 가축이 섭취할 때, 사료의 소화를 억제하는 주요 성분으로서 인식되고 있다.

본 발명의 용어 "헤미셀룰로오스"란, 식물체 중에 셀룰로오스에 수반하여 널리 존재하는 다당류의 총칭으로서, 알라반, 만난, 갈락탄, 아라비노갈락톤, 자일란, 자일로글루칸 등의 글리칸복합체의 형태로 존재하여 셀룰로오스와 함께 식물 세포막을 구성하는 것으로 알려져 있다. 식물에 알칼리성 용액을 처리하여 추출할 수 있는데, 산 처리에 의해 단당류로 가수분해될 수 있다. 이처럼 가수분해된 단당류로는 글루코스, 자일로스, 아라비노스 등이 알려져 있다.

본 발명의 용어 "COMT(caffeic acid O-methyltransferase)"란, 모노리그놀의 C5 히드록실 잔기의 O-메틸화를 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 COMT는 대부분의 모든 식물 계열에서 발현되는데, 대체로 광범위한 기질 허용성을 갖고, 모노리그놀 생합성의 다양한 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 COMT는 상시 활성화되어 있지 않고, 외부의 자극에 의하여 활성화되는데, 예를 들어, 5-히드록시코니페르알데히드 및 카페오일 알데히드의 처리에 의해 활성화된다고 알려져 있다. 상기 COMT의 구체적인 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 정보는 NCBI 등의 데이터베이스에 공지되어 있다. 예를 들어, GenBank No. AHN09802.1, BAA08559.1, AAD50440.1 등에 공지되어 있다. 본 발명에서는 보리로부터 유래되고 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 COMT 유전자를 사용하였다.

본 발명에서 제공하는 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 야생형 COMT 유전자를 구성하는 염기서열 중 하나의 염기가 점 돌연변이된 형태로서, 서열번호 3의 염기서열의 334번 염기가 결실되거나 또는 상기 334번 위치에 A 또는 T가 삽입된 형태의 변이된 염기서열을 포함할 수 있고, 이로 인하여, 서열번호 5, 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 발현시킬 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 사료용 작물에서 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하여 발현시킬 수 있는 형질전환 벡터 및 상기 형질전환 벡터가 도입되어, 소화율이 향상되도록 형질전환된, 사료용 작물을 제공한다.

상기 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "사료용 작물"은 앞서 설명한 바와 동일하다.

본 발명의 용어 “벡터”란, 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 구체적으로, 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열과 발현 조절 서열은 선발마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어, "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터는, 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 식물의 형질전환에 사용될 수 있도록 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 “형질전환”이란, 일반적으로 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다. 상기 형질전환은 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 일 예로서, 식물 병원균 아그로박테리움을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 아그로박테리움은 그들의 Ti(종양 유도성, tumor-inducing) 또는 Ri(뿌리 유도성, root-inducing) 플라스미드 DNA 중 일부(T-DNA)를 감염된 식물 세포 내로 전이 이식시키는 능력을 지니고 있다. 따라서 목적 유전자를 T-DNA 내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다.

본 발명에 있어서, 형질전환된 사료용 작물은 상기 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 이미 발현되거나 또는 발현될 가능성이 있는 상태로 세포 내에 존재하는 사료용 작물의 형질전환 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 형질전환된 사료용 작물은 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환세포를 포함한 사료용 작물의 식물체 전체 또는 일부 기관 등을 모두 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 식물체의 유성생식 또는 무성생식에 의해 얻어질 수 있는 종자, 식물체 및 이의 조직이나 기관의 일부도 포함될 수 있다. 이러한 본 발명의 형질전환된 사료용 작물은 변이된 COMT가 발현되어 리그닌의 함량이 감소되고 헤미셀룰로오스의 일종인 자일로스의 함량이 증가되어 결과적으로는 소화율이 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 형질전환된 사료용 작물을 포함하는 사료용 조성물 및 상기 사료용 조성물을 포함하는 사료를 제공한다.

상기 용어 "형질전환된 사료용 작물"에 대한 설명은 전술한 바와 동일하다.

상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명의 용어 "사료"란, 개체가 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 사료는 본 발명에서 제공하는 형질전환된 사료용 작물 또는 상기 사료용 작물을 포함하는 사료용 조성물과 함께 반추동물에 급이되어 반추동물의 소화율을 증가시키는 매개체인 것으로서 해석될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 사료를 반추동물에게 급이하는 단계를 포함하는, 가축의 사육방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 가축은 본 발명에서 제공하는 사료를 급이할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 사료용 작물에 포함된 리그닌을 소화시킬 수 있는 반추동물이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "반추동물"이란, 포유류 중에서 4 내지 5개의 방으로 구분된 반추위가 구비된 동물을 의미하는데, 주로 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과 및 소과에 속하는 동물에서 발견할 수 있다. 상기 반추위는 먹은 음식물을 저장하는 혹위(rumen), 벌집모양의 벽이 있는 벌집위(reticulum), 점막이 주름모양으로 된 겹주름위(omasum) 및 위선이 분포된 주름위(abomasum)로 구분된다.

본 발명에서 제공하는 사료용 조성물은 리그닌의 함량이 감소되고 헤미셀룰로오스의 일종인 자일로스의 함량이 증가된 형질전환된 사료용 작물을 유효성분으로 포함하므로, 상기 조성물을 포함하는 사료를 반추동물 등의 가축에 급이하면, 보다 효율적으로 소화되어 가축의 사육을 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 형질전환된 사료용 작물의 종자를 파종, 재배 및 수확하는 단계를 포함하는, 사료용 작물의 생산방법을 제공한다.

상기 형질전환된 사료용 작물은 변이된 COMT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어, 유전자 수준에서 변이되었으므로, 이의 후대에서도 동일한 형질이 발현될 수 있다. 따라서, 상기 형질전환된 사료용 작물의 종자를 파종, 재배 및 수확하면, 리그닌의 함량이 감소되고 헤미셀룰로오스의 일종인 자일로스의 함량이 증가되어 결과적으로는 소화율이 향상되는 동일한 특성을 갖는 사료용 작물을 생산할 수 있다.

이때, 형질전환된 사료용 작물의 종자를 파종, 재배 및 수확하는 과정은 통상의 사료용 작물을 대상으로 하는 방법과 동일하거나 유사한 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 형질전환된 사료용 작물은 일반적인 사료용 작물에 비하여 총 리그닌 함량이 감소되어 이로부터 얻어진 바이오매스의 소화율이 증가될 뿐만 아니라, 헤미셀룰로오스의 일종인 자일로스의 함량이 증가되는 특징을 나타내므로, 상기 형질전환된 사료용 작물은 다양한 가축 비육용 사료의 유효성분으로서 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 서열번호 3으로 표시되는 HvCOMT 유전자의 염기서열을 나타내는 개략도로서, 적색표시부는 프라이머 HvCOMT_5UF의 결합부위를 나타내고, 노란색 형광부위는 첫 번째 엑손부위를 나타내며, 회색 부위는 두 번째 엑손부위를 나타내고, 청색표시부는 프라이머 HvCOMT_CR의 결합부위를 나타낸다.
도 2는 HvCOMT 유전자의 첫 번째 엑손부위의 1 내지 354번의 염기서열에 해당하는 gRNA의 서열을 나타내는 개략도로서, CRISPR/Cas9 표적 부위인 Target 1(시작 코돈으로부터 +33~ +14; antisense 방향), Target 2(+228~+209; antisense 방향) 및 Target 3(+336~+317; antisense 방향)을 나타낸다.
도 3은 pKCRISPR_HvCOMT 매개 HvCOMT 특이적 돌연변이체의 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 수행하여, pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 분리된 개체를 선발한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4는 HvCOMT내 CRISPR/Cas9 표적부위(blue box)와 이중나선 절단부위 및 잠재적 돌연변이 유도 부위(적색 번개표시)를 나타내는 개략도로서, 밑줄친 부위는 돌연변이 개체 선발에 활용한 EciI 제한효소 인식 부위를 나타낸다.
도 5는 HvCOMT내 CRISPR/Cas9 표적부위에서 HvCOMT 돌연변이의 zygosity를 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 6은 pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 없는 동형접합 HvCOMT 돌연변이 개체중에서 각기 다른 돌연변이를 나타내는 변이주의 변이부위를 나타내는 개략도이다.
도 7은 야생형 HvCOMT 단백질과 3개 변이주의 HvCOMT 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타내는 개략도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 보리 COMT(HvCOMT) 유전자 탐색 및 동정

공지된 문헌과 공공 DB 검색을 기반으로 타 화본과 식물 종에서 돌연변이 및 RNAi를 활용한 유전자발현 억제 연구를 통해 기능적으로 확인된 리그닌 생합성에 관여하는 COMT 유전자 정보를 확보하고자 하였다. 그 결과,5개 품종에서 유래된 Brachypodium distachyon COMT (mutant, Phytozome accession No. Bradi3g16530), Sorghum bicolor COMT (Bmr12 mutant, Genbank accession No. AY217766), Zea Mays COMT (bm3 mutant, Genbank accession No. M73235), Panicum virgatum COMT (RNAi study, GenBank accession No. HQ645965) 및 Sugarcane COMT (RNAi study, GenBank accession No. AJ231133) 유전자의 정보를 확보하였다.

International Barley Sequencing Consortium(IBSC)의 IPK Barley BLAST Server (http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/index.php)로 부터 총 11개의 보리 COMT family 유전자를 탐색한 다음, 상기 확보된 5개 유전자 정보를 기반으로 phylogenetic analysis를 수행한 결과, 보리 COMT 유전자일 것으로 예상되는 CAJW010050098를 최종 선발하고, 이를 'HvCOMT'라고 명명하였다.

한편, 보리 형질전환 donor 품종인 Golden Promise에서 상기 HvCOMT 유전자를 동정하기 위하여, 공지된 HvCOMT(CAJW010050098) 염기서열을 바탕으로 하기 프라이머(서열번호 1 및 2)를 제작한 후, 이를 이용한 PCR 분석을 수행하여 Golden Promise 품종에서 유래된 HvCOMT 유전자의 염기서열(서열번호 3)을 결정하였다(도 1).

HvCOMT_5UF: 5'-GTGAAGCCAGAAAGCCCATA-3'(서열번호 1)

HvCOMT_CR: 5'-CGGTTGCCATGGATCTACTT-3'(서열번호 2)

도 1은 서열번호 3으로 표시되는 HvCOMT 유전자의 염기서열을 나타내는 개략도로서, 적색표시부는 프라이머 HvCOMT_5UF의 결합부위를 나타내고, 노란색 형광부위는 첫 번째 엑손부위를 나타내며, 회색 부위는 두 번째 엑손부위를 나타내고, 청색표시부는 프라이머 HvCOMT_CR의 결합부위를 나타낸다.

실시예 2: CRISPR/Cas9 표적 염기서열 및 guide RNA(gRNA) 염기서열 분석

상기 실시예 1에서 결정된 HvCOMT의 염기서열과 공지된 보리 COMT family 유전자의 염기서열을 비교분석한 결과, 두 개의 엑손 중 첫 번째 엑손은 낮은 상동성을 나타냄을 확인하였다.

또한, CRISPR/Cas9에 의한 넉아웃(knock-out) 효과를 최대화시키기 위해 첫 번째 엑손 부위에서 CRISPR/Cas9 표적 염기서열을 결정하고자 하였다.

대략적으로, Broad Institute에서 제공하는 Design sgRNAs web tool (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)에 HvCOMT의 첫 번째 엑손의 염기서열을 입력하고, guide RNA design rule에 따라 5개의 후보 gRNA 염기서열을 선발하였다.

아울러, CRISPR/Cas9에 의한 off-target 가능성을 최소화시키기 위해 IBSC IPK Barley BLAST Server에서 상기 선발된 5개의 후보 gRNA 염기서열을 대상으로 한 blast 검색을 수행한 후, 보리 유전체상 염기서열과 3개 이상의 mismatch를 가지는 3개의 guide RNA 염기서열을 선별하였다(도 2).

도 2는 HvCOMT 유전자의 첫 번째 엑손부위의 1 내지 354번의 염기서열에 해당하는 gRNA의 서열을 나타내는 개략도로서, CRISPR/Cas9 표적 부위인 Target 1(시작 코돈으로부터 +33~ +14; antisense 방향), Target 2(+228~+209; antisense 방향) 및 Target 3(+336~+317; antisense 방향)을 나타낸다.

실시예 3: CRISPR/Cas9 벡터의 제작

Plasmid 저장 및 보급 비영리 기관인 Addgene과 영국의 John Innes Center로부터 CRISPR/Cas9 백본 벡터 2종(pRGEB31 및 pBRACT)을 분양받았다.

먼저, 상기 분양받은 pRGEB31 백본 벡터를 활용하여, 실시예 2에서 선별된 Target 1을 표적으로 하는 pRGEB31_HvCOMT 벡터를 제작하였다.

대략적으로, 선별마커로 사용된 하이그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 고발현시키기 위해 상기 pRGEB31 백본 벡터에서 35s 프로모터를 35s HSP 인트론 프로모터로 교체하고; gRNA의 고발현과 전사 시작 서열(transcription start sequence)의 다양성을 확보하기 위해, G로 시작하는 표적 염기서열을 선택 가능하도록 rice U3 프로모터를 wheat U6 프로모터로 교체하였으며; Cas9의 고발현을 위해 2x35s 프로모터를 rice 유비퀴틴 프로모터로 교체하여, 최종적으로 pKCRISPR 백본 벡터를 제작하였다.

다음으로, 상기 분양받은 pKCRISPR 백본 벡터를 활용하여, 실시예 2에서 선별된 Target 2 및 3을 동시에 표적하는 pKCRISPR_HvCOMT 벡터를 제작하였다.

대략적으로, 상기 하이그로마이신 저항성 유전자 고발현 시스템 (hygromycin 저항성 유전자내 CAT1 intron 포함); 두 개의 gRNA 발현 cassette; wheat U6 프로모터에 의한 gRNA 발현; 및 Maize 유비퀴틴 프로모터에 의한 Cas9 발현이 가능한 pBRACT 벡터 백본을 활용하여, HvCOMT내 Target 2 및 3을 동시에 표적하는 pBRACT_HvCOMT 벡터를 제작하였다(표 1).

실시예 4: 보리 조직배양 및 아그로박테리아 매개 형질전환

먼저, 보리 형질전환 donor 품종인 Golden Promise 종자를 대상으로 춘화처리(4℃, 4주)한 다음, 파종하였다. 온실 조건(18℃/16℃, 16 시간 광조건)에서 재배하여, 개화된 시점에서 14일 후, 지름 약 2.0 mm의 미성숙 배아(immature embryo)를 분리하였다.

다음으로, 아그로박테리아 AGL1 균주에 상기 실시예 3에서 제작된 pRGEB31_HvCOMT, pKCRISPR_HvCOMT 및 pBRACT_HvCOMT 벡터를 각각 삽입하여 형질전환 균주를 수득하고, 이를 MG/L 배지(250 mg/ℓ KH₂PO₄ , 100 mg/ℓ NaCl, 100 mg/ℓ MgSO₄-7H₂O, 1 g/ℓ L-glutamic acid, 5 g/ℓ mannitol, 5 g/ℓ tryptone, 2.5 g/ℓ yeast extract, 1 ㎍/ℓ biotin, pH 7.0)에 접종한 후, OD600 약 0.8 수준이 될 때까지 배양하였다.

한편, Golden Promise에서 미성숙 배아를 분리하고, 이로부터 embryo axis를 제거한 scutellum을 수득한 다음, 이를 2.5 ㎖ co-cultivation 배지(CCM: phytagel 무첨가 CIM + 800 mg/ℓ L-cysteine +　500 ㎕/ℓ 1M acetosyringone)에 접종하였다. 이어, 상기 배지를 제거하고, 상기 scutellum에 상기 배양된 형질전환 균주를 가한 다음, 600 ㎕의 배양액을 가하고, 10분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 배지를 제거하고, 상기 scutellum을 CCM 배지로 세척한 다음, CCM 배지를 흡수시킨 여과지에 치상하고, 암조건, 21℃에서 72시간 동안 1차 배양을 수행하였다.

상기 1 차 배양이 종료된 후, 상기 scutellum을 캘러스 유도 배지(CIM: 4.3 g/ℓ MS basal salt, 30 g/ℓ maltose, 1.0 g/ℓ casein hydrolysate, 250 mg/ℓ myo-inositol, 690 mg/ℓ proline, 1.25mg/ℓ CuSO₄-5H₂O, 1.0 mg/ℓ thiamine HCl, 2.5 mg/ℓ Dicamba, 3.5 g/ℓ Phytagel, pH 5.8)에 치상하고, 암조건, 21℃에서 2주일 동안 2차 배양을 수행하였다.

상기 2차 배양이 종료된 후, 상기 scutellum을 CIM 선택 배지 (CIM + 50 mg/ℓ hygromycin +150mg/ℓ timentin)에 접종하고, 암조건, 21℃에서 8주 동안 캘러스 분화를 유도하였다(2주 간격 계대배양). 분화된 캘러스 중에서, 하이그로마이신에 저항성을 나타내는 캘러스를 선발하고, 선발된 캘러스를 재분화 선택 배지(RMS: 50 ㎖/ℓ K4N macro mineral stock, 1 ㎖/ℓ NaFeEDTA stock, 1 ㎖/ℓ K micro stock, 1 ㎖/ℓ vitamin B5 stock, 1 ㎖/ℓ 6-BAP stocks, 4 ㎖/ℓ L-glutamine stock, 100 ㎖/ℓ maltose stock, 196 ㎕/ℓ CuSO₄-5H₂O stock, 3.5 g/ℓ Phytagel, pH 5.8 + 50 mg/ℓ hygromycin + 150mg/ℓ timentin)에 접종하고, 16시간 광조건, 21℃에서 8주 동안 캘러스 재분화를 유도하여(2주 간격 계대배양), 재분화된 형질전환 캘러스를 수득하였다.

끝으로, 상기 수득한 재분화된 형질전환 캘러스를 대상으로 CRISPR/Cas9 벡터의 삽입 여부를 확인하고, 형질전환 개체를 최종 선발하였다.

대략적으로, 상기 재분화된 형질전환 캘러스에서 게놈 DNA를 수득하고, 이를 증폭시켜서 CRISPR/Cas9 표적 부위를 포함한 DNA 단편을 수득하였다. 상기 수득한 DNA 단편의 크기는 야생형인 경우 678 bp의 크기가 될 것으로 예상되었다.

상기 수득한 DNA 단편의 염기서열을 분석하여 CRISPR/Cas9에 의해 매개된 HvCOMT 특이적 돌연변이체 선발하였다(표 2).

실시예 5: HvCOMT 특이적 돌연변이체의 특성분석

상기 실시예 4에서 선발된 pKCRISPR_HvCOMT 매개 HvCOMT 특이적 돌연변이체 11종(T0 개체)을 파종하여, 각각의 종자(T1 종자)를 확보하였다.

상기 확보된 각 종자를 파종하여 15개체의 식물체(T1 식물체)를 수득하고, 상기 수득한 각 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 대상으로 PCR을 수행하여 pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 분리된 개체를 선발하였다(도 3).

도 3은 pKCRISPR_HvCOMT 매개 HvCOMT 특이적 돌연변이체의 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 수행하여, pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 분리된 개체를 선발한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

도 3에서 보듯이, PCR 산물이 검출되는 개체와 검출되지 않는 개체가 존재하는데, 이 중에서 PCR 산물이 검출되지 않는 개체가 pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 분리된 개체인 것으로 확인되었다.

한편, HvCOMT내 CRISPR/Cas9 표적부위를 포함한 DNA 단편을 증폭하고, HvCOMT 표적 부위내 CRISPR/Cas9 절단 부위를 특이적으로 인식하는 EciI 제한효소를 처리한 다음, DNA 단편 분석을 통해 HvCOMT 돌연변이의 zygosity를 분석하였다. 이때, EciI 제한효소에 잘리지 않은 경우 동형접합 HvCOMT 돌연변이로 판정하고, 제한효소에 잘리는 경우 야생형 HvCOMT인 것으로 판정하며, 이 둘이 혼재하는 경우 이형접합 HvCOMT 돌연변이로 판정하였다.(도 4 및 5).

도 4는 HvCOMT내 CRISPR/Cas9 표적부위(blue box)와 이중나선 절단부위 및 잠재적 돌연변이 유도 부위(적색 번개표시)를 나타내는 개략도로서, 밑줄친 부위는 돌연변이 개체 선발에 활용한 EciI 제한효소 인식 부위를 나타낸다.

도 5는 HvCOMT내 CRISPR/Cas9 표적부위에서 HvCOMT 돌연변이의 zygosity를 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 5에서 보듯이, EciI 제한효소에 잘리지 않는 동형접합 HvCOMT 돌연변이체, 제한효소에 잘리는 야생형 HvCOMT 및 이형접합 HvCOMT 돌연변이체가 모두 존재함을 확인하였다.

이에 따라, CRISPR/Cas9 표적 부위를 포함한 DNA 단편에 대한 염기서열분석을 통해 CRISPR/Cas9 매개 HvCOMT 특이적 돌연변이 및 zygosity를 재확인하여, pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 없는(transgene free) 동형접합 HvCOMT 돌연변이 개체를 선발하였으며, 이 중 각기 다른 돌연변이 양상을 가진 3개 변이주를 최종 선발하였다(도 6).

도 6은 pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 없는 동형접합 HvCOMT 돌연변이 개체중에서 각기 다른 돌연변이를 나타내는 변이주의 변이부위를 나타내는 개략도이다.

상기 최종 선발된 3개 변이주의 특성을 분석한 결과, pKCRISPR_HvCOMT 벡터가 없는 동형접합 HvCOMT 돌연변이 개체는 동일한 부위에 염기가 결실되거나(C deletion), A 염기가 삽입되거나(A insertion) 또는 T 염기가 삽입된(T insertion) 점 돌연변이의 형태를 나타냄을 확인하였다.

이러한 점 돌연변이로 인하여 아미노산 서열수준에서 frame shift 돌연변이가 발생될 것으로 분석되었다(도 7).

도 7은 야생형 HvCOMT 단백질과 3개 변이주의 HvCOMT 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타내는 개략도이다.

도 7에서 보듯이, 야생형 HvCOMT(360 aa) 대비 상기 3개 변이주는 모두 71째 아미노산부터 frame shift가 일어나서, 각 변이주 별로 126, 145 및 145aa에서 early termination 발생될 것으로 예상되었는 바, 이러한 돌연변이에 의해 HvCOMT 단백질이 정상적인 기능을 수행하지 못할 것으로 분석되었다.

실시예 6: 변이체 보리품종의 특성 분석

상기 실시예 5에서 선발된 3개 변이체 보리품종의 특성을 분석하였다.

실시예 6-1: 바이오매스 수득

상기 실시예 5에서 선발된 3개 변이체 보리품종의 개체를 각각 3개체씩 확보하고, 이들이 출수하기 직전에 지상부를 수확하였다. 수확한 지상부를 45℃에서 건조한 다음 분쇄기(Wiley mill)로 분쇄하고, 1mm 체로 여과하여 각각의 분말형태의 바이오매스를 수득하였다. 수득한 각 바이오매스를 50% (v/v) 에탄올로 3회 및 3차 증류수로 1회 세척하고, 45℃에서 다시 건조하여, ECW(extract-free cell wall) 바이오매스를 수득하였다.

실시예 6-2: 총 리그닌 함량 및 세포벽 구성성분의 함량 분석

먼저, 총 리그닌 함량을 분석하였다.

대략적으로, 상기 실시예 6-1에서 수득한 ECW 바이오매스 2mg을 아세트산으로 희석한 1ml 25% (w/w) acetyl에 가하고, 50℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 원심분리하여 반응물의 상등액을 수득하고, 수득한 상등액 100 ㎕를 분취한 다음, 이에 2 M NaOH 용액 200 ㎕와 1.7 ㎖의 아세트산을 가하고, 280nm에서 흡광도를 측정하여, Beer-Lambert law와 리그닌 Molar extinction coefficient (21.5 ℓ/g cm)에 따라 총 리그닌 함량을 분석하였다(표 3).

다음으로, 세포벽의 주요 구성성분인 글루코스(glucose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)의 함량을 분석하였다.

대략적으로, 상기 실시예 6-1에서 수득한 ECW 바이오매스 100 mg에 1 ㎖의 72% 황산을 가하고, 30℃에서 한 시간 동안 가수분해하였다. 이어, 상기 반응물에 증류수를 가하여 황산의 농도를 4%가 되도록 희석하고, 121℃에서 한 시간 동안 추가로 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 반응물을 HPLC에 적용하여 상기 반응물에 포함된 글루코스, 자일로스 및 아라비노스의 함량을 정량분석하였다(표 3).

상기 표 3에서 보듯이, 총 리그닌 함량은 HvCOMT_D1C, HvCOMT_I1A 및 HvCOMT_I1T 변이체 보리품종의 총 리그닌 함량이 야생형 보리품종의 총 리그닌 함량에 비하여, 각각 24%, 8% 및 19%가 감소됨을 확인하였다.

또한, 세포벽을 구성하는 주요성분인 글루코스, 자일로스 및 아라비노스 중에서 글루코스와 아라비노스의 함량은 야생형 보리품종과 변이체 보리품종에서 별다른 차이를 나타내지 않았으나, 헤미셀룰로오스의 일종인 자일로스의 함량은 야생형 보리품종의 함량에 비하여, 변이체 보리품종에서 약 9%가 증가됨을 확인하였다.

실시예 6-3: 소화율 분석

상기 실시예 6-1에서 수득한 ECW 바이오매스 250 mg에 0.1 N 염산으로 희석한 50 ㎖의 2% 펩신용액을 가하고, 39℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 반응물을 여과지로 여과한 다음, 여과지에 잔류된 반응물을 증류수로 세척하였다. 여과지에 잔류된 반응물을 회수하고, 이에 25 ㎖의 셀룰라제 완충액(cellulase buffer: 10.5 g/ℓ citric acid, 14.15 g/ℓ phosphate, pH4.8, Onozuka R-10 cellulase 6.25g/ℓ)를 가한 다음, 39℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 도자기를 이용하여 반응물을 여과하고, 도자기에 잔류된 반응물을 증류수와 아세톤으로 세척하였다. 상기 잔류물을 포함하는 도자기를 105℃에서 12시간 동안 건조하고, 잔류물의 중량을 측정하였다. 상기 측정된 잔류물의 중량을 사용하여 소화율을 분석하였다. 이때, 소화율(%)은 ((반응전 바이오매스 무게- 소화되지 않은 바이오매스 무게)/ 반응전 바이오매스 무게) * 100의 수식으로 산출되었다.

상기 소화율을 분석한 결과, 야생형 보리품종 유래 바이오매스의 소화율은 약 38%를 나타내었고, HvCOMT_D1C 변이체 보리품종 유래 바이오매스의 소화율은 50%를 나타내었으며, HvCOMT_I1A 변이체 보리품종 유래 바이오매스의 소화율은 43%를 나타내었고, HvCOMT_I1T 변이체 보리품종 유래 바이오매스의 소화율은 49%를 나타냄을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 변이체 보리품종은 야생형 보리품종 보다 우수한 소화율을 나타냄을 알 수 있었는데, 이는 앞서 확인한 변이체 보리품종의 총 리그닌 함량이 야생형 보리품종의 총 리그닌 함량에 비하여 감소되었다는 결과와 일치됨을 알 수 있었다.

즉, 본 발명에서 제공하는 변이체 보리품종은 야생형 보리품종에 비하여 총 리그닌의 함량이 감소되고, 이로 인하여 소화율이 증가되는 것으로 분석되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Korea University Research and Business Foundation <120> Novel feed crop comprising mutated COMT gene and uses thereof <130> KPA181610-KR <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtgaagccag aaagcccata 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cggttgccat ggatctactt 20 <210> 3 <211> 1872 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombimamt HvCOMT <400> 3 gtgaagccag aaagcccata taaccctttt cccgtcctcc ctccaaagca ttcctcatcg 60 ctcacaccaa aatcaaccac caccaccagc agcagctcgg ctccggagag gcagaggcag 120 agatgggctc caccgcagcg gacatggccg cctcctccga cgaggaggcg tgcatgtacg 180 ccctccagct cgtctcgtcg tcgatcctcc cgatgacgct caagaacgcc atcgagctgg 240 gcctcctcga caccctggtg gccgccggcg gcaagctgct gacccccgcc gaggtggccg 300 ccaagctccc gtccacggcg aaccccgccg cggcggacat ggtggaccgc atgctccggc 360 tgctggcctc gtacaacgtg gtgtcgtgca ccatggagga gggcaaggac gggcggctgt 420 cccggcggta cggcgccgcg cccgtgtgca agttcctcac ccccaacgag gacggcgtct 480 ccatggcggc gctcgcgctc atgaaccagg acaaggtcct catggagagc tggtgagcta 540 gatcgatcac tccatcatcc cctgtttctt ccatgttttg cccgtttgct gtggctggct 600 atcatgcggg ggcacccact cggcagccgg cagccggcag catagctctt tctctttaac 660 aaattgagct ccagcagcag gtaataaata ctaggagtag tagtaagtag gagtactaaa 720 gttagcacga gatagagaag ctccaagagt ccatctagaa gccgagagat tacgtatcaa 780 atacggcaat cagcttcaga agcagtcaag cagaaccgaa ccgcatggcg atggattcct 840 tgtagtaata gtcaaccacc aatggacaat ttttgttttc gaaacggaca atggacgaat 900 tttggttttt catgtttaaa aaaagaggac ttttcaagtt aaaaacaagg acttttaagc 960 cgatgatata gcaactcttt tgtctctttt cagacagaag catctccatg tgtcaaaaga 1020 tgtggcaggc attgatttaa acactccctg gtccctgaca tctactgtat attaatggtc 1080 gctgacttag tataaacttg gatcaaaggg agttgcaatg atatgctctc atggaaatga 1140 gctgttgtaa taaaatgtgt gtgtgaatgt tgttttcaat ttcaggtact atctgaagga 1200 cgctgtcctt gacggcggca tcccgttcaa caaggcgtac gggatgtccg cgttcgaata 1260 ccacggcacg gacccgcgct tcaaccgcgt gttcaacgaa gggatgaaga accactccat 1320 catcatcacc aagaagctcc tcgaggtgta caagggcttc gagggcctcg gcaccatcgt 1380 cgacgtgggc ggcggcgtgg gcgccaccgt gggcgccatc accgccgcct acccggccat 1440 caagggcatc aacttcgacc tcccccacgt catctccgag gcgccgccgt tcccgggcgt 1500 cacccacgtc ggcggcgaca tgttccagaa ggtgccctcg ggcgacgcca tcctcatgaa 1560 gtggatcctc cacgactgga gcgacgagca ctgcgcgacg ctgctcaaga actgctacga 1620 cgcgctgccg gcgcacggca aggtggtgct cgtggagtgc atcctgccgg tgaacccgga 1680 ggccacgccc aaggcgcagg gggtgttcca cgtcgacatg atcatgctcg cgcacaaccc 1740 cggcggcagg gagaggtacg agagggagtt cgaggccctg gccaagggcg ccggcttcgc 1800 agccatgaag accacctaca tctacgccaa cgcatttgcc atcgagttca ccaagtagat 1860 ccatggcaac cg 1872 <210> 4 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombimamt HvCOMT <400> 4 Met Gly Ser Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Ser Ser Asp Glu Glu Ala 1 5 10 15 Cys Met Tyr Ala Leu Gln Leu Val Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met Thr 20 25 30 Leu Lys Asn Ala Ile Glu Leu Gly Leu Leu Asp Thr Leu Val Ala Ala 35 40 45 Gly Gly Lys Leu Leu Thr Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser 50 55 60 Thr Ala Asn Pro Ala Ala Ala Asp Met Val Asp Arg Met Leu Arg Leu 65 70 75 80 Leu Ala Ser Tyr Asn Val Val Ser Cys Thr Met Glu Glu Gly Lys Asp 85 90 95 Gly Arg Leu Ser Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Pro Val Cys Lys Phe Leu 100 105 110 Thr Pro Asn Glu Asp Gly Val Ser Met Ala Ala Leu Ala Leu Met Asn 115 120 125 Gln Asp Lys Val Leu Met Glu Ser Trp Tyr Tyr Leu Lys Asp Ala Val 130 135 140 Leu Asp Gly Gly Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met Ser Ala Phe 145 150 155 160 Glu Tyr His Gly Thr Asp Pro Arg Phe Asn Arg Val Phe Asn Glu Gly 165 170 175 Met Lys Asn His Ser Ile Ile Ile Thr Lys Lys Leu Leu Glu Val Tyr 180 185 190 Lys Gly Phe Glu Gly Leu Gly Thr Ile Val Asp Val Gly Gly Gly Val 195 200 205 Gly Ala Thr Val Gly Ala Ile Thr Ala Ala Tyr Pro Ala Ile Lys Gly 210 215 220 Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val Ile Ser Glu Ala Pro Pro Phe Pro 225 230 235 240 Gly Val Thr His Val Gly Gly Asp Met Phe Gln Lys Val Pro Ser Gly 245 250 255 Asp Ala Ile Leu Met Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His 260 265 270 Cys Ala Thr Leu Leu Lys Asn Cys Tyr Asp Ala Leu Pro Ala His Gly 275 280 285 Lys Val Val Leu Val Glu Cys Ile Leu Pro Val Asn Pro Glu Ala Thr 290 295 300 Pro Lys Ala Gln Gly Val Phe His Val Asp Met Ile Met Leu Ala His 305 310 315 320 Asn Pro Gly Gly Arg Glu Arg Tyr Glu Arg Glu Phe Glu Ala Leu Ala 325 330 335 Lys Gly Ala Gly Phe Ala Ala Met Lys Thr Thr Tyr Ile Tyr Ala Asn 340 345 350 Ala Phe Ala Ile Glu Phe Thr Lys 355 360 <210> 5 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HvCOMT_D1C <400> 5 Met Gly Ser Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Ser Ser Asp Glu Glu Ala 1 5 10 15 Cys Met Tyr Ala Leu Gln Leu Val Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met Thr 20 25 30 Leu Lys Asn Ala Ile Glu Leu Gly Leu Leu Asp Thr Leu Val Ala Ala 35 40 45 Gly Gly Lys Leu Leu Thr Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser 50 55 60 Thr Ala Asn Pro Ala Ala Gly Thr Trp Trp Thr Ala Cys Ser Gly Cys 65 70 75 80 Trp Pro Arg 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Claims (14)

1. 사료용 작물에 도입되어, 리그닌의 합성을 억제하고, 헤미셀룰로오스의 합성을 촉진할 수 있는, 변이된 COMT(caffeic acid O-methyltransferase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 COMT 유전자의 334번 염기가 결실되거나 또는 상기 334번 위치에 A 또는 T가 삽입된 것인, 폴리뉴클레오티드.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 사료용 작물은 벼, 조, 수수, 옥수수, 귀리, 보리, 기장, 티머디, 오챠드그라스, 라이그라스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 작물인 것인, 폴리뉴클레오티드.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 헤미셀룰로오스는 자일로스인 것인, 폴리뉴클레오티드.
   
4. 삭제
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는, 변이된 COMT(caffeic acid O-methyltransferase) 단백질.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 변이된 COMT 단백질은 서열번호 5, 6 또는 7의 아미노산 서열을 가지는 것인, 단백질.
   
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 사료용 작물에서 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하여 발현시킬 수 있는 형질전환 벡터.
   
8. 제7항의 형질전환 벡터가 도입되어, 소화율이 향상되도록 형질전환된, 사료용 작물.
   
9. 제8항의 사료용 작물을 포함하는 사료용 조성물.
   
10. 제9항의 사료용 조성물을 포함하는 사료.
    
11. 제10항의 사료를 가축에게 급이하는 단계를 포함하는, 가축의 사육방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 가축은 반추동물인 것인, 사육방법.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 반추동물은 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과 또는 소과에 속하는 동물인 것인, 사육방법.
    
14. 제8항의 사료용 작물의 종자를 파종, 재배 및 수확하는 단계를 포함하는, 사료용 작물의 생산방법.
    

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