DE69434051T2

DE69434051T2 - Alpha-galactosidase

Info

Publication number: DE69434051T2
Application number: DE69434051T
Authority: DE
Inventors: Inge Helmer Knap; Carsten M. Hjort; Torben Halkier; Lene Venke Kofod
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: DK38893D0; CN1120351A; EP0692024A1; DE69434051D1; US5919690A; WO1994023022A1; JP3535162B2; US6197566B1; ATE278774T1; BR9406563A; EP0692024B1; JPH08508644A; AU682028B2; AU6375194A; CA2159314A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das ein α-Galactosidase-Enzym kodiert, und Varianten davon, die α-Galactosidase-Aktivität haben, einen rekombinanten Expressionsvektor und eine Zelle, die das DNA-Konstrukt enthält, und ein Verfahren zur Herstellung einer α-Galactosidase-Enzymzubereitung mittels rekombinanter DNA-Techniken. Das von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodierte α-Galactosidase-Enzym kann unter anderem für den Abbau von α-Galactosiden, die in verschiedenen Pflanzenprodukten vorhanden sind, oder als Verdauungshilfe verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
α-Galactosidase ist ein wohlbekanntes Enzym, das an der Hydrolyse von α-Galactosiden beteiligt ist, die zum Beispiel in verschiedenen wichtigen Pflanzen oder Pflanzenteilen vorhanden sind, die für Ernährungszwecke verwendet werden, wie z. B. Hülsenfrüchte, Gemüse, Getreidekörner, Zerealien und dergleichen. α-Galactosidase-Enzyme werden von verschiedenen Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren produziert. Bei Säugetieren fehlt jedoch die α-Galactosidase-Produktion im Darm, und sie sind folglich nicht fähig, mit der Nahrung aufgenommene α-Galactoside selbst abzubauen. Stattdessen werden mit der Nahrung aufgenommene α-Galactoside von im Darm anwesenden Mikroorganismen abgebaut. Dieser mikrobielle Abbau führt normalerweise zu Blähungen und zu einem verdauungsbedingten Unwohlsein des Säugetiers nach der Aufnahme von α-Galactosid-haltiger Nahrung oder Futter. Die physiologischen Wirkungen von α-Galactosiden sind im Einzelnen bei Rackis, J. J., 1975, diskutiert.
Um die mit dem α-Galactosidase-Mangel bei Säugetieren verbundenen Probleme zu überwinden, wurden in Nahrung oder Futter enthaltene α-Galactoside vor der Nahrungsaufnahme modifiziert, zum Beispiel enzymatisch durch die Wirkung von α-Galactosidase. Alternativ wurde α-Galactosidase als Verdauungshilfe vorgeschlagen, vgl. WO 90/14101.
Die Produktion von α-Galactosidase wurde bei Bakterien beschrieben, z. B. Bacillus stearothermophilus ( US 3,846,239 ), Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae ( US 4,431,737 ), Pilzen, z. B. Stämmen der Genera Neurospora und Rhizopus (Worthington und Beuchat, 1974), Aspergillus oryzae (Cruz und Park, 1982), A. ficuum (morphologisch ähnlich A. niger) (Zapater et al., 1990) und A. niger (Bahl und Agrawal (1969 und 1972), Christakopoulos et al. (1990), Chun und Lee (1988), Jung und Lee (1986), Lee und Wacek (1970), Adya und Elbein (1976), Kaneko et al. (1991)). All diese Literaturstellen beschreiben jedoch die Herstellung von α-Galactosidase durch herkömmliche Fermentation natürlich vorkommender oder mutierter mikrobieller Stämme.
Overbeeke et al., 1990, beschreibt die Herstellung von α-Galactosidase aus Guar in Bacillus subtilis, und Aslandis et al., 1989, beschreibt eine α-Galactosidase aus E. coli.
Eine A.-niger-α-Galactosidase-Enzymzubereitung (Alpha-Gal^TM), die durch herkömmliche Fermentation hergestellt wurde, ist von Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich. Ein mit der Herstellung von α-Galactosidase durch Fermentation von A. niger verbundener Nachteil ist, dass erhebliche Mengen von Oxalsäure, einem unerwünschten Nebenprodukt, von A. niger gleichzeitig mit der Produktion von α-Galactosidase hergestellt werden.
Es wäre wünschenswert, eine A.-niger-α-Galactosidase-Enzymzubereitung mit einer verringerten oder ohne eine gleichzeitige Produktion von Oxalsäure herstellen zu können und außerdem, die Ausbeute und die Reinheit der so hergestellten α-Galactosidase-Zubereitung zu erhöhen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren für die Herstellung von α-Galactosidase-Enzymen durch rekombinante DNA-Techniken. Es wird in Erwägung gezogen, dass es durch die Verwendung solcher Techniken möglich sein kann, α-Galactosidase in erheblich größeren Mengen und wirtschaftlicher herzustellen, als es durch die Verwendung der herkömmlichen Fermentationstechnologie möglich ist, und gleichzeitig die Bildung der Oxalsäure zu vermeiden oder ihre Menge zu verringern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß betrifft ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert das α-Galactosidase-Aktivität hat, worin die DNA-Sequenz a) ein Polypeptid kodiert, das die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; oder b) ein Analog der DNA-Sequenz von a) ist, das

i) mit der in der angehängten SEQ ID No. 1 oder 2 gezeigten DNA-Sequenz oder einer auf der Basis der besagten DNA-Sequenz oder auf der Basis der in SEQ ID No. 3 gezeigten Aminosäuresequenz hergestellten Oligonukleotid-Sonde unter den unten definierten Bedingungen hybridisiert, und/oder
ii) ein Polypeptid kodiert, das mit einem Antikörper reaktiv ist, der mit wenigstens einem Epitop eines Polypeptids reagiert, das die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, und/oder
iii) ein Polypeptid kodiert, das wenigstens zu 50% identisch mit dem Polypeptid ist, das die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz hat.

Die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz veranschaulicht ein vollständiges α-Galactosidasegen (einschließlich Introns), das aus einem Stamm von Aspergillus niger isoliert und charakterisiert wurde, und die in SEQ ID No. 2 gezeigte Nukleotidsequenz ist die entsprechende cDNA-Sequenz. Die Nukleotidsequenzen werden in den nachfolgenden Beispielen weiter beschrieben. Die in SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz ist von der in SEQ ID No. 2 gezeigten DNA-Sequenz abgeleitet und veranschaulicht die Aminosäuresequenz des A.-niger-α-Galactosidase-Enzyms, einschließlich seines Signalpeptids.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen rekombinanten Expressionsvektor, der das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt enthält, und eine Zelle, die entweder das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt oder den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthält.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das α-Galactosidase-Aktivität aufweist, wobei das Verfahren das Kultivieren einer wie oben beschriebenen Zelle, die ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthält, in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids erlauben, und das Gewinnen des resultierenden Polypeptids aus der Kultur umfasst.
Das α-Galactosidase-Aktivität aufweisende Polypeptid kann die in SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen oder eine Variante davon sein. Die Variante kann eine natürlich vorkommende, von einer beliebigen Quelle oder Organismus und insbesondere von einem natürlich vorkommenden Mikroorganismus oder einer Mutante oder einem Derivat davon abgeleitete Variante sein. Außerdem kann die „Variante" eine gentechnische veränderte Variante sein, z. B. hergestellt durch geeignetes Modifizieren einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, das zu der Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste an ein oder beide der N- und C-terminalen Enden des Polypeptids, das von der unmodifizierten DNA-Sequenz kodiert wird, der Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder verschiedenen Stellen in der Aminosäuresequenz, der Deletion einer oder mehrerer Aminosäurereste an einem oder beiden Enden des Polypeptids oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz oder der Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz führt.
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, Enzymzubereitungen herzustellen, die einen höheren Gehalt an α-Galactosidase haben, als es durch herkömmliche Fermentation von Eltern-Mikroorganismen möglich ist, wie z. B. A. niger, die von Natur aus die α-Galactosidase produzieren. Außerdem sind die resultierenden α-Galactosidase-Zubereitungen im Wesentlichen frei von anderen Bestandteilen, die von den Eltern-Mikroorganismen abgeleitet sind, insbesondere Bestandteilen, die zu unerwünschten enzymatischen Nebenaktivitäten führen. Demgemäß ist es durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, die Herstellung von α-Galactosidase-Enzym-Bestandteilen zu optimieren und dadurch eine Enzymzubereitung mit einer höheren spezifischen α-Galactosidase-Aktivität herzustellen, zu geringeren Kosten als es mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren möglich ist. Gleichzeitig kann die unerwünschte Produktion von Oxalsäure erheblich reduziert oder vermieden werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kann das Analog der DNA-Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, das α-Galactosidase-Aktivität hat, zum Beispiel eine Untersequenz der DNA-Sequenz, eine gentechnisch hergestellte Modifizierung der Sequenz, die durch wohlbekannte Verfahren hergestellt werden kann, z. B. durch ortsspezifische Mutagenese, und/oder eine aus einem anderen Organismus isolierte DNA-Sequenz sein, die ein α-Galactosidase-Enzym mit erheblicher Ähnlichkeit zu der α-Galactosidase kodiert, die die in SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz hat. Die tatsächliche Sequenz des Analogs ist nicht kritisch, solange das Analog wenigstens eine der oben aufgelisteten Eigenschaften i)–iii) hat. Diese Eigenschaften werden unten weiter erläutert.
Die Eigenschaft i), d. h. die Hybridisierung einer DNA-Sequenz mit der in SEQ ID No. 1 oder 2 gezeigten DNA-Sequenz oder mit einer auf der Basis der besagten DNA-Sequenzen oder auf der Basis des in SEQ ID No. 3 gezeigten Polypeptids hergestellten, geeigneten Oligonukleotid-Sonde, kann unter beliebigen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, die den DNA-Sequenzen erlauben, zu hybridisieren. Zum Beispiel wird 1 μg von Gesamt-DNA, von der erwartet wird, dass sie eine analoge DNA-Sequenz enthält, einer vollständigen Spaltung mit z. B. EcoRI, BamHI oder HindIII unterzogen und auf ein 1%-Agarosegel aufgetragen. Die DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt und dann nach den Anweisungen des Herstellers auf eine Immobilon^TM-N-Membran (Millipore Corporation) überführt. Die Membran wird nach den Anweisungen des Herstellers prähybridisiert, und dann wird die in SEQ ID No. 1 oder 2 gezeigte DNA-Sequenz oder ein repräsentatives Fragment davon, das mit ³²P durch Primer-Verlängerung markiert wurde (Sambrook et al., 1989), als Sonde hinzugefügt, und die Temperatur wird auf 45°C verringert. Nach 18 Stunden Hybridisierung wird die Membran wiederholt in 6 × SSC, 0,1% SDS, bei 45°C gewaschen. Die Membran wird dann der Autoradiographie unterzogen und ausgewertet.
Die Eigenschaft ii), d. h. die immunologische Kreuz-Reaktivität, kann getestet werden, indem ein Antikörper verwendet wird, der gegen wenigstens ein Epitop des α-Galactosidase-Enzyms gerichtet ist, das die in SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst oder reaktiv mit diesem ist. Der Antikörper, der entweder monoklonal oder polyklonal sein kann, kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, z. B. wie von Hudson et al., 1989, beschrieben wurde. Die immunologische Kreuz-Reaktivität kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Versuchen bestimmt werden, für die Western-Transfer (Western Blotting) oder radialer Immunodiffusionstest Beispiele sind, z. B. wie von Hudson et al., 1989, beschrieben.
Die Eigenschaft iii) kann bestimmt werden, indem die Aminosäuresequenzen des Polypeptids, die von dem Analog kodiert werden, und die in SEQ ID No. 3 gezeigte Polypeptidsequenz unter Verwendung wohlbekannter Algorithmen verglichen werden, wie z. B. dem von Lipman und Pearson (1985) beschriebenen. Im vorliegenden Zusammenhang wird „Identität" in seiner herkömmlichen Bedeutung verwendet, d. h. es soll die Anzahl identischer Aminosäurereste angeben, die ähnliche Positionen in den zwei (oder mehr) Aminosäuresequenzen, die miteinander verglichen werden sollen, besetzen.
Man glaubt, dass eine Identität von über 50%, wie z. B. über in etwa 70%, 75%, 80%, 90% und insbesondere über in etwa 95% mit der in SEQ ID No. 3 gezeigten Aminosäuresequenz auf eine Homologie mit der α-Galactosidase hindeutet, die von den in SEQ ID Nos. 1 und 2 gezeigten DNA-Sequenzen kodiert wird. Anhand einer Alinierungsstudie (alignment study) der in SEQ ID No. 3 gezeigten Aminosäuresequenz und der von Aslandis et al., 1989, offenbarten Aminosäuresequenz, die die E.-coli-α-Galactosidase kodiert, wurde eine Identität von in etwa 30% gefunden. Nach Kenntnis der Erfinder ist dies die einzige α-Galactosidase mit einer bekannten Aminosäuresequenz, die irgendeine vergleichbare Identität mit der α-Galactosidase aufweist, die von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodiert wird.
Es ist wohlbekannt, dass eine Homologie zwischen Polypeptiden verschiedener Ursprünge besteht, und es wurden α-Galactosidasen, die homolog zu α-Galactosidasen aus Hefe sind, in Pflanzen sowie in Säugetieren gefunden. Analog dazu wird in Erwägung gezogen, dass bei dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt die DNA-Sequenzen von einem Tier, einschließlich eines Säugetiers und eines Insekts, einer Pflanze oder eines Mikroorganismus abgeleitet werden können. In dem vorliegenden Zusammenhang sind Bakterien und Pilze besonders interessante Quellen. Der Ausdruck „Pilze" soll Hefen und filamentöse Pilze einschließen.
Wie oben angegeben, sind die in SEQ ID Nos. 1 und 2 gezeigten, eine α-Galactosidase kodierenden DNA-Sequenzen von einem Pilz, ausdrücklicher von A. niger, abgeleitet. Es wird in Erwägung gezogen, dass andere α-Galactosidasen aus Pilzen entweder auf der DNA- oder Aminosäure-Ebene eine erhebliche Homologie mit der hierin offenbarten A.-niger-α-Galactosidase aufweisen können, und folglich können DNA-Sequenzen des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts von einem Pilz, insbesondere von einem Stamm von Aspergillus, wie z. B. von einem Stamm von A. niger, abgeleitet sein. Ein Beispiel solch eines Stammes ist der bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 16882 hinterlegte Stamm von A. niger.
Wenn das α-Galactosidase-Enzym aus A. niger isoliert ist, kann es als eine Anzahl von Isoenzymen vorliegen, vermutlich aufgrund starker Glykosylierung. Es wird erwartet, dass die von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodierte α-Galactosidase in der Form verschiedener Isoenzyme vorliegen kann, in Abhängigkeit von den Umständen, unter denen sie produziert wird, und insbesondere von der jeweiligen Wirtszelle, die das Enzym produziert.
In Beispiel 1 unten werden charakteristische Eigenschaften eines A.-niger-α-Galactosidase-Enzyms (wie aus A. niger isoliert) beschrieben. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass einige Eigenschaften einer von einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt exprimierten α-Galactosidase von den entsprechenden Eigenschaften der aus A. niger isolierten α-Galactosidase abweichen.
Somit wurde gefunden, dass die von der in SEQ ID No. 2 gezeigten DNA-Sequenz in einer Aspergillus-oryzae-Wirtszelle exprimierte α-Galactosidase ein pH-Optimum in dem Bereich von 5,0–7,0 (vgl. Beispiel 5 nachfolgend) aufweist, wogegen die isolierte α-Galactosidase ein pH-Optimum in dem Bereich von 3,8–6,0 hat.
Auf der Basis der entsprechenden Eigenschaften der gereinigten A.-niger-α-Galactosidase wird angenommen, dass ein von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodiertes α-Galactosidase-Enzym einen pI in dem Bereich von 4,0–5,0 (abhängig von dem jeweiligen Isoenzym), wie z. B. in etwa 4,3, wie durch IEF, wie hierin beschrieben, bestimmt, ein Temperaturoptimum in dem Bereich von 50–70°C, ein Molekulargewicht von in etwa 170 kDa und/oder eine spezifische Aktivität von über in etwa 250 GALU/mg Protein hat. 1 GALU ist die Einheit der α-Galactosidase-Stärke, die in dem Abschnitt Material und Methoden unten näher definiert wird.
Es wird verstanden werden, dass das bevorzugte erfindungsgemäße DNA-Konstrukt eines ist, in dem die DNA-Sequenz so ist wie in der angehängten SEQ ID No. 1 oder 2 gezeigt.
Die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts kann durch wohlbekannte Verfahren isoliert werden. So kann die DNA-Sequenz zum Beispiel isoliert werden, indem eine cDNA- oder genomische Bibliothek eines Organismus hergestellt wird, von dem erwartet wird, dass er die Sequenz enthält, z. B. einer Zelle einer beliebigen oben genannten Quelle, und Screening nach positiven Klonen mittels herkömmlicher Verfahren. Beispiele solcher Verfahren sind Hybridisierung an Oligonukleotidsonden, die auf der Basis der gesamten oder teilweisen Aminosäuresequenz der A.-niger-α-Galactosidase hergestellt werden, die die in SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, nach Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989) und/oder Selektion auf Klone, die eine wie oben definierte, geeignete biologische Aktivität exprimieren, und/oder Selektion auf Klone, die ein Protein produzieren, das reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die A.-niger-α-Galactosidase gerichtet ist.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts aus einer cDNA- oder genomischen Bibliothek ist mittels Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung degenerierter, auf der Basis der in SEQ ID No. 3 gezeigten Aminosäuresequenz hergestellter Oligonukleotidsonden. Zum Beispiel kann die PCR unter Verwendung der in dem US-Patent Nr. 4,683,202 oder von R. K. Saiki et al. (1988) beschriebenen Techniken durchgeführt werden.
Alternativ kann die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts synthetisch durch etablierte Standardverfahren hergestellt werden, z. B. das von Beaucage und Caruthers (1981) beschriebene Phosphoamidit-Verfahren oder das von Matthes et al. (1984) beschriebene Verfahren. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide z. B. in einem automatischen DNA-Synthesizer synthetisiert, gereinigt, angelagert (annealed), ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Schließlich kann das DNA-Konstrukt von gemischt genomischem und synthetischem, gemischt synthetischem und cDNA- oder gemischt genomischem und cDNA-Ursprung sein, hergestellt durch Ligieren von Fragmenten von synthetischem, genomischem oder cDNA-Ursprung (wie geeignet), wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten rekombinanten DNA-Moleküls entsprechen, in Übereinstimmung mit Standard-Techniken.
Wie oben angegeben, kann das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt auch eine genetisch veränderte DNA-Sequenz umfassen. Solch eine Sequenz kann auf der Basis einer erfindungsgemäßen genomischen oder cDNA-Sequenz hergestellt werden, in geeigneter Weise an einer Stelle verändert ist, die der(den) Stelle(n) des Polypeptids entspricht, an der(den) Aminosäure-Substitutionen, z. B. durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, die die gewünschte Aminosäuresequenz kodieren, für eine homologe Rekombination in Übereinstimmung mit wohlbekannten Verfahren oder durch die Verwendung von Zufallsmutagenese, z. B. durch Bestrahlung oder chemische Behandlung, eingeführt werden sollen.
Beispiele geeigneter Modifikationen der DNA-Sequenz sind Nukleotid-Substitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des Polypeptids führen, sondern die dem Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus entsprechen, in den das rekombinante DNA-Molekül eingeführt wird (d. h. Modifikationen, die, wenn sie exprimiert werden, z. B. zu einer α-Galactosidase führen, die die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen), oder Nukleotidsubstitutionen, die sehr wohl zu einer anderen Aminosäuresequenz führen und deshalb möglicherweise zu einer anderen Polypeptidstruktur, ohne jedoch Eigenschaften des Polypeptids zu beeinträchtigen, wie z. B. dessen enzymatische Eigenschaften. Andere Beispiele möglicher Modifikationen sind Insertion eines oder mehrerer Nukleotide in die Sequenz, Addition eines oder mehrerer Nukleotide an einem oder beiden Enden der Sequenz und Deletion eines oder mehrerer Nukleotide an einem oder beiden Enden der Sequenz oder innerhalb davon.
Der rekombinante Expressionsvektor, der das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt trägt, kann ein beliebiger Vektor sein, der in geeigneter Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Auswahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid oder ein Bakteriophage. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszell-Genom integriert wird und gemeinsam mit dem/den Chromosom(en), in das/die er integriert wurde, repliziert.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz funktionsfähig mit einer geeigneten Promotorsequenz verbunden sein. Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die in einer Wirtszelle der Wahl eine transkriptionelle Aktivität zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Zum Beispiel sind Beispiele geeigneter Promotoren für die Steuerung der Transkription des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts in einer Pilz-Wirtszelle der TAKA-Promotor und der Triosephosphat-Isomerase-Promotor von Aspergillus oryzae, der Amyloglycosidase-Promotor und der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Promotor von Aspergillus niger und der Cellobiohydrolase-I-Promotor von Trichoderma reseei.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann auch einen geeigneten Terminator umfassen, der funktionsfähig mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt verbunden ist. Der Terminator wird geeigneter Weise von der gleichen Quelle abgeleitet wie der ausgewählte Promotor.
Der Vektor kann außerdem eine DNA-Sequenz umfassen, die dem Vektor ermöglicht, in der jeweiligen Wirtszelle zu replizieren. Beispiele solcher Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, wie z. B. die dal-Gene von B. subtilis oder B. licheniformis, oder der Antibiotikaresistenz verleiht, wie z. B. Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz.
Während eine intrazelluläre Expression unter einigen Gesichtspunkten vorteilhaft sein kann, z. B. wenn bestimmte Bakterien als Wirtszellen verwendet werden, ist es im Allgemeinen bevorzugt, dass die Expression extrazellulär erfolgt. Um eine extrazelluläre Expression zu erhalten, sollte der Expressionsvektor normalerweise außerdem eine DNA- Sequenz umfassen, die eine Präregion kodiert, d. h. ein Signalpeptid, das die Sekretion der exprimierten α-Galactosidase oder einer Variante davon in das Kulturmedium erlaubt.
Die Verfahren, die verwendet werden, um das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, den Promotor, den Terminator bzw. andere Elemente zu ligieren und um diese in geeignete Vektoren zu insertieren, die die erforderliche Information für die Replikation enthalten, sind dem Fachmann wohl bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al. (1989)).
Die erfindungsgemäße Zelle, die entweder ein wie oben definiertes erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen Expressionsvektor umfasst, wird vorteilhafterweise als Wirtszelle bei der rekombinanten Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet. Die Zelle kann mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt transformiert werden, vorteilhafter Weise mittels Integrierens des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom. Diese Integration wird im Allgemeinen als Vorteil angesehen, da es wahrscheinlicher ist, dass die DNA-Sequenz in der Zelle stabil bewahrt wird. Die Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, z. B. durch homologe Rekombination. Alternativ kann die Zelle mit einem wie unten in Zusammenhang mit den verschiedenen Typen von Wirtszellen beschriebenen Expressionsvektor transformiert werden.
Die erfindungsgemäße Zelle kann eine Zelle eines höheren Organismus sein, wie z. B. eines Säugetiers oder eines Insekts, aber sie ist vorzugsweise eine mikrobielle Zelle, z. B. eine bakterielle oder eine Pilzzelle (einschließlich Hefe), die bei der Kultivierung große Mengen des Polypeptids produziert.
Beispiele geeigneter Bakterien sind Gram-positive Bakterien, wie z. B. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans, Streptomyces murinus, oder Gram-negative Bakterien wie E. coli. Die Transformation der Bakterien kann zum Beispiel durch Protoplasten-Transformation oder durch Verwendung kompetenter Zellen in an sich bekannter Weise durchgeführt werden.
Der Hefeorganismus kann vorteilhafterweise aus einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces ausgewählt werden, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Der filamentöse Pilz kann vorteilhafterweise zu einer Spezies von Aspergillus gehören, z. B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Bildung von Protoplasten und die Transformation [von]der Protoplasten, gefolgt von der Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Weise, einschließt. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsorganismus ist z. B. in EP 238 023 beschrieben.
Bei einem noch weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, wie oben beschrieben, unter Bedingungen, die förderlich für die Produktion des Polypeptids sind, und Gewinnen des Polypeptids aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium, umfasst.
Das zur Kultivierung der Zellen verwendete Medium kann ein beliebiges herkömmliches Medium sein, das geeignet für das Wachstum der jeweiligen Wirtszellen ist. Geeignete Medien sind von gewerblichen Anbietern erhältlich oder können gemäß veröffentlichten Rezepten (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden.
Das Polypeptid kann aus dem Medium durch herkömmliche Verfahren gewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, falls nötig nach Aufbrechen der Zellen, Ausfällen der Proteinbestandteile des Überstands oder Filtrats mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von Reinigung durch eine Vielzahl chromatographischer Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, wobei das tatsächliche Gewinnungsverfahren von der Art des jeweiligen Polypeptids sowie dessen gewünschter endgültiger Reinheit abhängt.
Abhängig von dem Grad der Reinigung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Polypeptids kann die resultierende Polypeptidzubereitung geringe Mengen anderer enzymatischer Bestandteile enthalten, die natürlicherweise von der für die Herstellung verwendeten Wirtszelle produziert werden. Wenn zum Beispiel eine Pilzzelle, wie z. B. eine der Gattung Aspergillus, als Wirtszelle für die Herstellung eines rekombinanten Pilz-α-Galactosidase-Enzyms verwendet wird, können bestimmte der enzymatischen Nebenaktivitäten, die normalerweise in α-Galactosidase-Zubereitungen gefunden werden, die durch herkömmliche Fermentation eines Eltern-Pilzstamms hergestellt werden, auch produziert werden und gemeinsam mit dem rekombinanten Polypeptid gewonnen werden, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Ein Beispiel eines Enzyms, das normalerweise in α-Galactosidase-Zubereitungen gefunden wird, die durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, ist das Enzym Invertase. Dieses Enzym wird natürlicherweise von einer Anzahl von Aspergillus-Stämmen produziert und kann folglich auch in α-Galactosidase-Zubereitungen gefunden werden, die erfindungsgemäß von Aspergillus-Stämmen produziert werden, wenn auch in einer erheblich niedrigeren Menge, verglichen mit der α-Galactosidase, als bei herkömmlichen Fermentationen beobachtet wird. Somit kann im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung eine erhebliche Zunahme des Verhältnisses von α-Galactosidase zu anderen enzymatischen Aktivitäten erhalten werden, zusätzlich zu der Zunahme der Gesamtausbeute von α-Galactosidase.
Falls es gewünscht ist, im Wesentlichen reine α-Galactosidase oder alternativ eine α-Galactosidase-Zubereitung herzustellen, die frei von unerwünschten enzymatischen Nebenaktivitäten ist (wofür ein Beispiel – für einige Anwendungen der α-Galactosidase – Invertase ist), kann man entweder die Nebenaktivitäten) durch Reinigung entfernen, oder man kann einen Produktionsorganismus wählen, der nicht fähig ist, die fragliche(n) Nebenaktivitäten) zu produzieren.
Die von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodierte α-Galactosidase kann für eine Anzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich Hydrolyse von α-Galactosiden to Galactosen und Saccharosen.
Zum Beispiel kann die von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodierte und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte α-Galactosidase-Zubereitung für die Hydrolyse von α-Galactosiden verwendet werden, die z. B. in Pflanzen oder Pflanzenteilen vorhanden sind, die zum Beispiel für die Ernährung von Säugetieren oder für die Fermentation von Mikroorganismen bestimmt sind. Wie oben angegeben, umfassen solche Pflanzen und Pflanzenteile Hülsenfrüchte, wie z. B. Erbsen und Bohnen, Nüsse, Samen, Getreidekörner, Zerealien und Gemüse, einschließlich Kartoffeln, Rüben und Chicorée, sowie verarbeitete Produkte davon, einschließlich Mehl, Schrot, Kleie, Melasse, etc. Somit kann das erfindungsgemäß hergestellte α-Galactosidase-Enzym für die Vorbehandlung von Nahrung oder Futter, das α-Galactoside enthält, und zur Modifizierung von Sojabohnen- oder Zuckerrübenmelasse verwendet werden, die als ein Substrat bei der Fermentation von Mikroorganismen verwendet wird.
Eine wichtige Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten α-Galactosidase-Zubereitung ist das Modifizieren von Sojabohnen oder Sojaprodukten, wie z. B. Sojabohnenmelasse, Sojasoße, Sojamilch und Sojamolke.
Entsprechend bezieht sich ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Enzym-modifizierten Sojabohnenprodukts, umfassend Unterziehen einer Zusammensetzung, die das zu modifizierende Sojabohnenprodukt enthält, einer enzymatischen Behandlung in der Anwesenheit einer erfindungsgemäß hergestellten α-Galactosidasezubereitung. Die enzymatische Behandlung kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann Sojabohnenschrot modifiziert werden, indem das Sojabohnenprodukt in Wasser suspendiert wird, um einen Trockenmassen-Gehalt in der resultierenden Suspension von in etwa 15–20% zu erhalten, der pH auf in etwa 4,5–6 eingestellt wird und die resultierende Suspension mit 0,5% einer erfindungsgemäßen α-Galactosidase-Zubereitung, die in etwa 500 GALU/g umfasst, für 2–8 Stunden bei 50°C behandelt wird. Das resultierende modifizierte Produkt kann nachfolgend sprühgetrocknet werden. Außerdem können Sojabohnenprodukte wie bei Olsen et al., 1981, und Eriksen, 1983, beschrieben, hergestellt werden, und die α-Galactosidase-Zubereitung kann gegebenenfalls während der Herstellung zugesetzt werden. Bei der Herstellung von Sojamilch können die α-Galactosidase-Zubereitungen zu dem Extrakt, der nach der Trennung fester Partikel von dem Sojabohnenmaterial erhalten wird, oder während der Evaporierung oder in das endgültige konzentrierte Sojamilchprodukt zugegeben werden.
Alternativ kann ein Sojabohnenprodukt durch ein Verfahren behandelt werden, das umfasst

a) Insertieren eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts, das eine α-Galactosidase kodiert und gegebenfalls in einem geeigneten Expressionsvektor vorliegt, in einen geeigneten Wirtsorganismus,
b) Kultivieren des Wirtsorganismus in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des von dem DNA-Konstrukt kodierten Polypeptids erlauben, und Gewinnen des resultierenden Polypeptids aus der Kultur, und
c) Unterziehen einer das zu modifizierende Sojabohnenprodukt enthaltenden Zusammensetzung einer enzymatischen Behandlung in der Gegenwart des in Schritt b) gewonnenen Polypeptids.

Die Schritte a) und b) können wie hierin offenbart durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellte α-Galactosidase-Zubereitung kann außerdem für die Herstellung von Zucker aus Zuckerrüben nach wohlbekannten Verfahren verwendet werden, um die Zuckerausbeute durch Hydrolysieren von Raffinose und Stachyose zu Galactose oder Saccharose zu verbessern.
Eine weitere wichtige Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten α-Galactosidase ist für die In-vivo-Konversion von α-Galactosid-gekoppelten Zuckern in Säugetieren, z. B. wie in WO 90/14101 beschrieben.
Die α-Galactosidase-Zubereitung kann somit als Verdauungshilfe verwendet werden. Für diesen Zweck kann die α-Galactosidase-Zubereitung mit einem geeigneten Träger oder Arzneimittelträger kombiniert werden, um in der Form einer Tablette, einer Kapsel, eines Pulvers, einer Flüssigkeit oder in einer Weichgel-Kapselform vorzuliegen. Die Menge der in solchen Formulierungen vorhandenen α-Galactosidase ist in dem Bereich von 500–20000 GALU/g.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Nahrung oder ein Futter, umfassend eine erfindungsgemäß hergestellte α-Galactosidase-Zubereitung. Die α-Galactosidase-Zubereitung wird typischerweise in einer Menge entsprechend in etwa 1–20 GALU/g Nahrung oder Futter zugesetzt. Beispiele von Nahrung oder Futter, dem die α-Galactosidase-Zubereitung zugesetzt werden kann, sind oben angegeben.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden mit Bezug auf die angehängten Zeichnungen beschrieben, worin
1 die Konstruktion von pCaHj413, wie in Beispiel 4 beschrieben, veranschaulicht,
2 die Konstruktion von pCaHj414, wie in Beispiel 4 beschrieben, veranschaulicht,
3 die Konstruktion von pCaHj424, wie in Beispiel 4 beschrieben, veranschaulicht,
4 das pH-Optimum der α-Galactosidase veranschaulicht,
5 ein HPLC-Chromatogramm ist, das den Abbau von Raffinose durch α-Galactosidase veranschaulicht, und
6 ein HPLC-Chromatogramm ist, das den Abbau von Stachyose durch α-Galactosidase veranschaulicht.
Die vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen veranschaulicht, durch die in keiner Weise beabsichtigt ist, die hierin offenbarte Erfindung zu beschränken.
MATERIAL UND METHODEN
Ausgangsmaterial
Die in den folgenden Beispielen verwendete α-Galactosidase-Zubereitung ist eine kommerzielle A.-niger-α-Galactosidase-Zubereitung (Alpha-Gal^TM, Batch KAN 0001), die von Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich ist.
Bestimmung der α-Galactosidase-Aktivität (GALU)
1 GALU ist als die Menge an α-Galactosidase definiert, die für das Hydrolysieren von 1 μmol p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid (zu p-Nitrophenol + Galactose) in einer Minute unter den folgenden Bedingungen erforderlich ist:

Substrat: 0,80 mM p-NPGal

pH: 5,5 – Acetatpuffer 0,0333 M

Temperatur: 37°C

Reaktionszeit: 15 min.
Reagenzien

1. PUFFER: Acetatpuffer 0,05 M, pH 5,5
2. SUBSTRAT: 1,2 mM p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid
3. STOPPREAGENS: Borax-NaOH-Puffer 0,0625 M, pH 9,7
4. FARBSTANDARD: 4-Nitrophenol, 240 μM

Verfahren
Eine Standardkurve wird durch Mischen von 2 ml Substrat und 1 ml verschiedener Verdünnungen des Farbstandards (mit demineralisiertem Wasser hergestellt) und Zugeben von 5 ml Stoppreagens hergestellt. Bei der Herstellung der Farbleerprobe demineralisiertes Wasser anstelle von Farbstandard verwenden. OD₄₀₅ messen.
Die Enzymzubereitung wiegen und bis zu einer Konzentration, die einer Aktivität von in etwa 0,0015 GALU/ml entspricht, verdünnen.
Berechnung der Aktivität
Die Farb-Standardkurve herstellen (ΔOD gegen Konzentration). Die Aktivität wird gemäß der folgenden Formel berechnet:
worin
A_S = Der Messwert auf der Standardkurve in μM 4-NP, entsprechend der OD₄₀₅ der Probe.
A_B = Der Messwert auf der Standardkurve in μM 4-NP, entsprechend der OD₄₀₅ der Leerprobe.
F_S = Verdünnungsfaktor für die Probe.
T = Reaktionszeit in Minuten (= 15).
M = Menge der abgewogenen Probe.
10^–3 = Umwandlungsfaktor 1/ml.
Zulauffermentation
Die Zulauffermentation wurde in einem Medium durchgeführt, das Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt enthielt. Die Zulauffermentation wurde durchgeführt, indem eine Schüttelflaschenkultur der jeweiligen A.-oryzae-Wirtszellen in ein Medium inokuliert wurde, das 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle enthielt. Nach 24 Stunden Kultivierung bei pH 7,0 und 34°C wurde mit der kontinuierlichen Zufuhr zusätzlicher Kohlenstoff- und Stickstoffquellen begonnen. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierender Faktor gehalten, und es wurde sichergestellt, dass Sauerstoff im Überschuss vorhanden war. Die Zulaufkultur wurde für 4 Tage fortgesetzt, wonach das Enzym durch Zentrifugation, Ultrafiltration, Klarfiltration und Keimfiltration gewonnen werden konnte.
Charakterisierung eines erfindungsgemäßen Enzyms
Das pH-Optimum wird unter Verwendung von 2 mM PNP-α-Galactosidase in 0,1 M Citrat/Phosphatpuffern pH 2,5–10 als ein Substrat gemessen. Zu 0,5 ml Substrat werden 10 μl Enzymlösung (100 × in 3 mg/ml BSA verdünnt) zugegeben, die Mischung wird bei 30°C für 15 Minuten inkubiert und das Enzym wird bei 95°C Hitze-inaktiviert. Drei Proben und Leerwert werden hergestellt. 100 μl werden in eine Mikrotiterplatten-Vertiefung pipettiert, 100 μl 1 M Trispuffer pH 7,0 werden zugegeben, und die Extinktion wird in einem Mikrotiter-Leser bei 405 nm gemessen. Paranitrophenol wird als Standard verwendet. Die spezifische Aktivität bei dem optimalen pH wird berechnet.
Die Temperaturstabilität wird gemessen, indem die Enzymlösung (in BSA oder in 0,25% Raffinose) bei verschiedenen Temperaturen für 1 und 2 Stunden belassen wird, bevor Inkubationen bei optimalem pH in PNP-α-Galactosid durchgeführt werden. Die Messungen werden wie oben durchgeführt.
Die spezifische Aktivität gegenüber Raffinose wird gemessen, indem bei optimalem pH bei verschiedenen Raffinose-Konzentrationen (2–32 mM) Inkubationen durchgeführt werden. Die freigesetzte Galactose wird durch die Menge an reduzierenden Zuckern bestimmt.
Reduzierende Zucker werden durch Reaktion in Mikrotiterplatten mit einem PHBAH-Reagens durchgeführt, das 0,15 g Para-Hydroxy-Benzoesäurehydrazid (Sigma H-9882), 0,50 g Kalium-Natrium-Tartrat (Merck 8087) und eine 2%-ige NaOH-Lösung bis zu 10,0 ml umfasst. Die Ergebnisse von Leerwerten werden abgezogen.
Um die Aktivität gegenüber Raffinose und Stachyose in An- und Abwesenheit von Galactose und Saccharose zu testen, werden Lösungen gemäß der Tabelle unten gemischt. Der Puffer ist 0,1 M Acetatpuffer bei dem optimalen pH für jedes Enzym. 10 μl Enzymlösung (10-fach verdünnt) werden zugegeben, und Inkubationen werden bei 30°C für 0, 1, 2, 4 und 24 Stunden durchgeführt. 25 μl des Überstands werden auf dem Dionex-HPLC-System analysiert (PA1-Säule, 0,12 M NaOH-Eluent, 1 ml/min Fließgeschwindigkeit, gepulster amperometrischer Nachweis), das alle Saccharide trennt. Dieses Experiment sollte auch aufdecken, falls den α-Galactosidasen irgendeine Transferase-Aktivität zugeschrieben werden kann.
Experiment
BEISPIEL 1
Reinigung und Charakterisierung von α-Galactosidase aus Aspergillus niger
Salzfällung
Eine Probe der α-Galactosidase-Zubereitung wurde mit 5 Volumina Ionenwassser in einer Amicon-UF-Zelle (Membran GR 60PP, Rückhaltevermögen 25.000) gewaschen. Die Salzfällung wurde erreicht, indem (NHa)₂SO₄ bei 60%-iger Sättigung (385 g/l) verwendet wurde, bei welchem Sättigungsgrad eine Ausfallen der α-Galactosidase gezeigt worden war. Das (NHa)₂SO₄ wurde langsam (länger als eine Stunde) unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Der pH wurde bei pH 5,5 durch Zugabe einer Base konstant gehalten.
Das Präzipitat wurde in Wasser erneut gelöst und in einer Amicon-UF-Zelle (Membran GR 60PP) gewaschen, bis eine Leitfähigkeit von in etwa 0,9 mS erreicht wurde.
Ionenaustausch
Das erneut gelöste und gewaschene Präzipitat wurde einem Anionenaustausch auf einer DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule unterzogen, die mit einem Citrat/Phosphatpuffer, pH 5,5 (0,002 M Zitronensäure/0,006 M Na₂HPO₄) und einer Leitfähigkeit von in etwa 0,9 mS äquilibriert war. Die α-Galactosidase wurde mit 0–0,5 M NaCl eluiert, und Fraktionen, die α-Galactosidase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt.
Gelfiltration
Die vereinigten α-Galactosidase-Fraktionen wurden 10× konzentriert, um einen Proteingehalt von in etwa 16 mg/ml zu erhalten. Die Gelfiltration wurde auf einer Sephadex G100 (Mr 4.000–150.000) Gelfiltrationssäule durchgeführt, die mit dem oben beschriebenen Puffer äquilibriert war.
Die α-Galactosidase, die in der Frontfraktion anwesend war und 5,6 mg Protein enthielt, wurde anschließend unter Verwendung des IEF-Phast-Systems und des SDS-PAGE-Phast-Systems, wie unten beschrieben, auf ihre Reinheit analysiert.
Die spezifische Aktivität der Frontfraktion wurde, wie oben beschrieben, als 264 GALU/mg Protein bestimmt. Der Proteingehalt wurde spektralphotometrisch bei 280 nm bestimmt.
IEF
Die α-Galactosidase-Fraktion wurde auf ein IEF-PAA pH 4–6,5 (Pharmacia Phast-System File-Nrn. 100 und 200) aufgetragen. Eine starke Bindung konnte bei pH 4,3 beobachtet werden, und ein schwacher Schatten wurde bei pH 4,2 beobachtet. Es wurde geschlossen, dass der pI des gereinigten Enzyms 4,3 war.
SDS-PAGE
Die α-Galactosidase-Fraktion wurde auf einem SDS-Gradientengel PAA 10–15 (Pharmacia Phast-System, wie oben) laufen gelassen. Bevor die Probe aufgetragen wurde, wurde das Protein einer Denaturierung und Reduzierung durch Kochen und Zugabe von DTT (1,4-Dithio-DL-threitol) unterzogen. Eine starke Bindung wurde bei Mr 90.000 beobachtet und ein Schatten bei Mr 100.000. Wenn kein Kochen mit DTT durchgeführt wurde, führte die SDS-Analyse zu einer Bindung bei Mr 170.000, was das Molekulargewicht des intakten Proteins anzeigte. Die Tatsache, dass das Mr des intakten Proteins 170.000 ist, stimmt mit der Tatsache überein, dass die α-Galactosidase in der aus der Gelfiltrationsanalyse erhaltenen Frontfraktion enthalten war, insofern als das erwartet erwartet würde, dass das Mr der in der Frontfraktion enthaltenen Proteine höher als 150.000 ist.
Es kann somit geschlossen werden, dass das hierin beschriebene α-Galactosidase-Enzym aus A. niger ein Dimer von zwei Proteinketten ist, die beide ein Molekulargewicht von in etwa 90.000 haben.
BEISPIEL 2
Herstellung und Charakterisierung von α-Galactosidase-Peptiden
Ein chemischer Abbau einer gereinigten α-Galactosidase-Zubereitung mit einem Überschuss CNBr wurde in 70% HCOOH für 24 h bei 25°C durchgeführt. Ein enzymatischer Abbau unter Verwendung von Chymotrypsin wurde in 0,05 M NH₄HCO₃, 2 M Harnstoff für 5 h bei 37°C bei einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1 : 40 (w : w) durchgeführt. Peptide wurden unter Verwendung von Kapillar-Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei entweder C4- oder C18-Säulen eingesetzt wurden, die mit linearen Gradienten von 75% wässrigem 2-Propanol in 0,1% wässriger TFA (Trifluoressigsäure) eluiert wurden. Gereinigte Peptide wurden unter Verwendung eines Applied-Biosystems-473A-Proteinsequencers sequenziert.
Die folgenden zwei Peptide wurden durch chemischen Abbau mit CNBr erhalten:
CNBr-Peptid 1
CNBr-Peptid 2
Die folgenden Peptide wurden aus dem enzymatischen Abbau unter Verwendung von Chymotrypsin erhalten:
Chymotrypsin-Peptid 1
Chymotrypsin-Peptid 2
Chymotrypsin-Peptid 3
Chymotrypsin-Peptid 4
Chymotrypsin-Peptid 5
Es kann bemerkt werden, dass die Aminosäurereste 3–19 des Chymotrypsin-Peptids 5 in dem CNBr-Peptid 2 (Aminosäurereste 1–17) vorhanden sind.
BEISPIEL 3
Klonierung einer Aspergillus-niger-α-Galactosidase
Herstellung einer α-Galactosidase-Sonde
Wie in Beispiel 2 oben bemerkt, überlappen das Chymotrypsin-Peptid 5 und das CNBr-Peptid 2. Gemeinsam offenbaren sie das Peptid:
Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Primer wurden für eine Amplifizierung der dieses Peptid kodierenden DNA-Sequenz entworfen.
Am 5'-Ende (Sinnstrang) wurde der folgende degenerierte Primer verwendet:
Eine Spe-I-Stelle (ACTAGT) wurde in das 5'-Ende dieses Primers eingefügt.
Am 3'-Ende (Sinnstrang) wurden die folgenden degenerierten Primer verwendet:
5' # 1 wurde gemeinsam mit entweder 3' # 1, 3' # 2 oder 3' # 3 verwendet.
Genomische DNA von A. niger (ATCC 16882) wurde, wie bei Leach et al., 1986, beschrieben, hergestellt.
Diese DNA wurde als Template in den PCR-Reaktionen verwendet (0,05 μg genomische DNA, 100 pmol jedes degenerierten Primers, 200 μM vom dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,01% Gelatine, 10 mM Tris-HCl pH 8,3 in einem Gesamtvolumen von 100 μl), und das folgende PCR-Programm wurde durchgeführt:
94°C für 2 min, 1 Zyklus (0,5 μl von Amplitaq'-Taq-Polymerase (Perkin Elmer – Cetus) wurde während dieser Inkubation zugegeben).
94°C für 1 min, 50°C für 1 min, 72°C für 2 min, 30 Zyklen.
72°C für 5 min, 1 Zyklus.
Die Produkte der PCR-Amplifikationen wurden konzentriert und auf ein Agarosegel aufgetragen. Bei den Amplifikationen, bei denen 3' # 1 und 3' # 3 verwendet wurden, wurde kein Produkt, außer des „Primer-Dimers", beobachtet, aber bei der Amplifikation, bei der 3' # 2 verwendet wurde, wurde ein einzelnes Fragment von näherungsweise 80 bp beobachtet. Dieses Fragment wurde isoliert, mit den Restriktionsenzymen SpeI und SacI gespalten und mit dem Vektor pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985) ligiert, der mit XbaI und SacI gespalten war. Das Ligationsgemisch wurde in Escherichia coli MC 1000 (Casadaban et al., 1980) transformiert, der durch konventionelle Verfahren r^–m⁺ gemacht wurde.
Plasmid-DNA, die aus Transformanten isoliert wurde, wurde unter Verwendung des Sequenase-Kits (United States Biochemicals) nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die Sequenz zeigte, dass das klonierte PCR-Fragment tatsächlich das oben beschriebene Peptidfragment kodierte. Das Insert (86 bp) dieses Plasmids wurde als Sonde für die Klonierung des α-Galactosidasegens verwendet.
Markierung der Sonde
Eine radioaktiv markierte Sonde wurde in folgender Weise hergestellt: 5 μg des Plasmids wurden mit EcoRI und SalI gespalten, und das 86-bp-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und in 20 μl Wasser gelöst. Dieses wurde als ein Template in einer PCR-Reaktion verwendet, die 2 μl des Fragments, 50 pmol Primer 5' # 1, 50 pmol Primer 3' # 2, 10 pmol α³²PdATP (3000 Ci/mmol) (DuPont NEG-012H), 10 pmol dTTP, 10 pmol dCTP, 10 pmol dGTP, 1, 5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,01% Gelatine, 10 mM Tris-HCl pH 8,3 in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthielt.
Das folgende Temperaturzyklusprogramm wurde durchgeführt:
94°C für 2 min, 1 Zyklus (0,5 μl Amplitaq' Taq-Polymerase (Perkin Elmer – Cetus) wurde während dieser Inkubation zugegeben).
94°C für 1 min, 50°C für 1 min, 72°C für 2 min, 30 Zyklen.
72°C für 5 min, 1 Zyklus.
Das markierte Fragment wurde unter Verwendung einer Sephadex-G50-Spun-Säule, wie bei Maniatis et al. (Maniatis et al., 1982) beschrieben, isoliert. Die Sonde wurde für 5 min, 100°C, Hitze-denaturiert und dann zu dem Hybridisierungsgemisch zugegeben.
Genomklonierung der α-Galactosidase
Genomische DNA aus A. niger wurde wie oben beschrieben hergestellt und mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, und die Spaltungen wurden für Southerntransfer-Analysen unter Verwendung der beschriebenen α-Galactosidase-Sonde verwendet.
Ein 4,5-kb-BamHI-Fragment hybridisierte an die Sonde. Diese Fragment wurde in der folgenden Weise kloniert:
Genomische A. niger-DNA wurde mit BamHI gespalten, und Fragmente von 4–5 kb wurde aus einem Agarosegel isoliert. Die Fragmente wurden an pUC19 ligiert, das mit BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, wobei eine Ampicillin-Selektion verwendet wurde. 5000 Klone wurde mittels Koloniehybridisierung unter Verwendung der beschriebenen α-Galactosidase-Sonde auf das 4,5–kb-α-Galactosidase-Fragment gescreent, und die hybridisierenden Klone wurden ausgewählt.
Eine Sequenzanalyse von aus einem dieser Klone isolierter Plasmid-DNA unter Verwendung der Primer 3710 und 3711 bestätigte, dass das klonierte Fragment eine α-Galactosidase-kodierende Sequenz enthielt. Dieses Plasmid wurde pCaHj409 genannt. Eine Sequenz, die unter Verwendung des M13-Universal-Primers (United States Biochemicals) abgeleitet wurde, zeigte, dass das 3'-Ende des Gens fehlte.
2178 bp des Inserts, das den klonierten Teil des α-Galactosidasegens umfasste, wurden von beiden Strängen unter Verwendung verschiedener Primer sequenziert.
cDNA-Klonierung mittels PCR
mRNA wurde durch Guanidiniumthiocyanat-Extraktion, gefolgt von Zentrifugation in einer Cäsiumchlorid-Lösung, wie von Sambrook et al., 1989, beschrieben, unter Verwendung von frischem Mycel hergestellt.
Die Erststrang-cDNA wurde von einem Oligo-dT-Primer aus unter Verwendung des BRL-Superscript-cDNA-Kits nach den Anweisungen des Herstellers synthetisiert.
Das cDNA-Gen wurde als ein 5'-Fragment und als ein 3'-Fragment unter Verwendung des Rapid-Amplification-of-cDNA-Ends-(RACE)-Verfahrens wie von Frohman, 1990, beschrieben, kloniert.
Der Primer 3710 wurde als ein Sequenz-spezifischer Primer für die Amplifizierung des 5'-Endes verwendet, und 3711 wurde als ein Sequenz-spezifischer Primer für die Amplifizierung des 3'-Endes verwendet. In beiden Fällen wurden die Primer 2010 und 4433 als Hybrid-Oligo-dT-Primer bzw. Adapterprimer verwendet.
Die Zusammensetzung der PCR-Reaktionsgemische und die Zyklusprofile waren wie bei Frohman a. a. O. beschrieben.
Das erhaltene 430-bp-5'-Fragment wurde mit BamHI und XhoI gespalten und an pUC19 ligiert, der mit BamHI und SalI gespalten war. Das Ligationsgemisch wurde unter Verwendung einer Ampicillin-Selektion in E. coli transformiert. Ein Plasmid, das ein Insert enthielt, wurde von beiden Strängen unter Verwendung verschiedener Primer sequenziert. Die Sequenz bestätigte, dass das Fragment ein α-Galactosidase-cDNA-Fragment war.
Das erhaltene 1300-bp-3'-Fragment wurde mit XhoI und XbaI gespalten und an pUC19 ligiert, der mit SalI und XbaI gespalten war. Das Ligationsgemisch wurde unter Verwendung einer Ampicillin-Selektion in E. coli transformiert. Bei einem 1300-bp-Insert eines Plasmids wurde durch Sequenzanalyse von beiden Strängen unter Verwendung verschiedener Primer bestätigt, dass es ein α-Galactosidase-Fragment war. Dieses Plasmid wurde pCaHj410 genannt.
Die genomische Sequenz und die cDNA-Sequenz sind in SEQ ID Nos. 1 bzw. 2 gezeigt. Die Nukleotidfragmente 302–371, 628–716, 978–1032 der genomischen Sequenz stellen Intron-Sequenzen dar.
Die α-Galactosidase-Proteinsequenz zeigte in etwa 30% Homologie zu der E-coli-α-Galactosidase, die von dem Gen rafA (Aslandis et al., 1989) kodiert wird.
BEISPIEL 4
Expression der α-Galactosidase
Konstruktion von α-Galactosidase-Expressionsvektoren
Das Plasmid pCaHj409 wurde mit SalI und PstI gespalten, und ein 1,5-kb-Fragment wurde isoliert und an pUC19 ligiert, das mit SalI und PstI gespalten war. Nach Transformation in E. coli und Isolierung des Plasmids wurde das erhaltene Plasmid mit SalI und EcoRI gespalten, und das 4,2-kb-Fragment wurde isoliert. pCaHj410 wurde mit EcoRI und SalI gespalten, und das 0,8-kb-Fragment wurde isoliert und in das oben beschriebene 4,2-kb-Fragment insertiert. Das erhaltene Plasmid wurde pCaHj412 genannt. Dieses Plasmid wurde mit Apa LI gespalten, die zurückgesetzten 3'-Enden wurden unter Verwendung der Klenow-Polymerase aufgefüllt, und nach Phenol/Chloroform-Extraktion wurde das Gemisch mit HindIII gespalten. Das erhaltene 2,2-kb-Fragment wurde isoliert.
Das Aspergillus-Expressionsplasmid pToC68 (in WO 91/17243 beschrieben) wurde mit BglII gespalten, die zurückgesetzten 3'-Enden wurden unter Verwendung der Klenow-Polymerase aufgefüllt, und nach Phenol/Chloroform-Extraktion wurde das Gemisch mit HindIII gespalten. Das 4,6-kb-Fragment wurde isoliert und an das oben beschriebene 2,2-kb-Fragment ligiert. Das erhaltene Plasmid, pCaHj413 genannt, enthielt einen Teil des aglN-Gens, der an den Terminator des Amyloglycosidasegens von A. niger (Tamg) fusioniert war. Die Konstruktion von pCaHj413 ist in 1 zusammengefasst.
pCaHj413 wurde mit HindIII und XhoI gespalten, und das 4,1-kb-Fragment wurde isoliert. pCaHj409 wurde mit HindIII und XhoI gespalten, und das 4,0-kb-Fragment, das das 5'-Ende des aglN-Gens enthielt, wurde isoliert und an das pCaHj413-Fragment ligiert. Das erhaltene Expressionsplasmid, pCaHj414 genannt, enthielt den aglN-Promoter, gefolgt von dem aglN-Gen, das an den AMG-Terminator fusioniert war. Die Konstruktion von pCaHj414 ist in 2 zusammengefasst.
pMT1560 (4169 bp) wurde von pHD414 (beschrieben in WO 92/16634) durch Ersetzen des 617-bp-BamHI-EcoRI-Fragments von pHD414 durch das BamHI-EcoRI-gespaltene PCR-Fragment abgeleitet, das aus einer PCR-Reaktion unter Verwendung von pHD414 als Template und der Primer:
erhalten wurde.
pMT1560 wurde mit NcoI und HindIII gespalten, und das 3,9-kb-Fragment wurde isoliert. pCaHj414 wurde mit NcoI und HindIII gespalten, und das 5,2-kb-Fragment, das das aglN-Gen enthielt, wurde isoliert und in das 3,9-kb-pMT1560-Fragment insertiert. Das erhaltene Plasmid wurde pCaHj419 genannt. Dieses Plasmid wurde mit HindIII und XhoI gespalten, und das 5,2-kb-Fragment, das den TAKA-Promotor von A. oryzae und das 3'-Ende des an den AMG-Terminator fusionierten aglN-Gens enthielt, wurde isoliert.
pCaHj414 wurde als ein PCR-Template gemeinsam mit den Primern 3710 und 4982 (enthaltend eine HindIII-Stelle, gefolgt von dem ATG-Startkodon des aglN-Gens) verwendet:
Die PCR-Bedingungen waren wie in Beispiel 3 oben beschrieben (in „Herstellung einer α-Galactosidase-Sonde"). Das PCR-Fragment wurde mit HindIII und XhoI gespalten und in das 5,2-kb-pCaHj-419-Fragment insertiert. Das erhaltene Expressionsplasmid wurde pCaHj424 genannt und enthielt das aglN-Gen, das am 5'-Ende an den TAKA-Promotor und am 3'-Ende an den AMG-Terminator fusioniert war. Die Konstruktion von pCaHj424 ist in 3 zusammengefasst.
Transformation von A. oryzae
Das Plasmid pCaHj414 wurde unter Verwendung einer Selektion auf Acetammid und Co-Transformation mit pToC90, wie in WO 91/17243 beschrieben, in Aspergillus oryzae IFO 4177 transformiert.
Durch Kultivierung in Schüttelflaschen oder in Submers-Reaktor-Fermentation der Co-Transformanten wurde Aktivität in der Brühe angereichert.
pCaHj424 wurde unter Verwendung desselben Verfahrens in A. oryzae IFO 4177 transformiert. Co-Transformanten exprimierten signifikant höhere Mengen an α-Galactosidase als pCaHj414-Transformanten.
Reinigung von α-Galactosidase
Der Kulturüberstand der Fermentation von das rekombinante Enzym exprimierendem Aspergillus oryzae wird zentrifugiert und durch einen 0,2-μm-Filter filtriert, um die Mycelien zu entfernen. 35–50 ml des filtrierten Überstands (30–60 mg α-Galactosidase) werden in einer Filtron-Ultracette oder einer Amicon-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer 10 kDα-Membran ultrafiltriert, um eine 10-fache Konzentrierung zu erreichen. Dieses Konzentrat wird 100-fach in 25 mM Tris pH 8,0 in zwei aufeinander folgenden Runden einer Ultrafiltration in derselben Vorrichtung verdünnt. Diese ultrafiltrierte Probe wird mit 1,5 ml/min auf einen in 25 mM Tris pH 8,0 äquilibrierten Pharmacia-HR16/20-Fast-Flow-Q-Sepharose-Anionenaustauscher aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit zwei Säulenvolumina 25 mM Tris pH 8,0 gewaschen, und gebundene Proteine werden mit einem linear zunehmenden NaCl-Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl in 25 mM Tris pH 8,0 eluiert. Die α-Galactosidase eluiert bei näherungsweise 0,25–0,3 M NaCl, aber das Enzym in dieser Fraktion ist nicht vollkommen rein (näherungsweise 80% Reinheit). Folglich wurden die α-Galactosidase enthaltenden Fraktionen durch Ultrafiltration in einer Amicon-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer 10-kDa-Membran bis zu einem Volumen von 4,5 ml konzentriert und in 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,5 mit einem konstanten Fluss von 1 ml/min auf eine HR-26/60-Sephacryl-S200-Gelfiltrationssäule aufgetragen. Die α-Galactosidase wird als ein distinkter Peak mit einer Reinheit von näherungsweise 90% eluiert. Um ein bis zu elektrophoretischer Homogeneität gereinigtes Material zu erhalten, werden die α-Galactosidase enthaltenden Fraktionen vereinigt und in 10 mM Natriumphosphat pH 6,8 ultrafiltriert. Die Probe wird mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min auf eine 8-ml-BioRad-Htp-Hydroxylapatit-Säule (10 mm Innendurchmesser) aufgetragen. Gebundene Enzyme werden durch Erhöhen der Natriumphosphatkonzentration von 10 mM auf 0,2 M während 40 min eluiert. Die α-Galactosidase eluiert bei näherungsweise 0,1 M Natriumphosphat und ist in dieser Fraktion mehr als 95% rein.
BEISPIEL 5
Charakterisierung von α-Galactosidase
Die folgenden Eigenschaften der in A. oryzae exprimierten und daraus gereinigten α-Galactosidase wurden durch die in dem Abschnitt „Material und Methoden" oben beschriebenen Verfahren bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse können in der folgenden Tabelle zusammengefasst werden:

MG 95 kDa

pH-Optimum 6,0

Stabilität in Wasser sehr stabil

Temperaturstabilität in BSA für 1 Stunde < 60°C

Temperaturstabilität in Gegenwart von Raffinose < 70°C

Spezifische Aktivität gegenüber (μmol/mg Enzym/min)

a) PNP-α-Galactosidase 90

b) Raffinose 145 (100)

c) Stachyose (350)

d) Guar Gum (0)

Inhibierung durch Galactose keine

Transferaseaktivität keine
Die Ergebnisse in Klammern sind aufgrund der HPLC-Ergebnisse kalkuliert.
pH-Optimum
Das in 4 beobachtete pH-Optimum zeigt, dass das Enzym bei pH 6 am aktivsten ist, aber in dem gesamten Bereich von pH 4–8 einige Aktivität behält. Dies ist überraschend, weil das aus A. niger isolierte Enzym ein pH-Optimum in dem Bereich von 4–6 hat.
Abbau von Stachyose und Raffinose und HPLC-Analyse
Den HPLC-Chromatogrammen in 5 und 6 ist zu entnehmen, dass der Abbau von Raffinose (Peak 4) innerhalb von 24 Stunden beendet ist, wobei die Reaktionsprodukte Saccharose (Peak 39), Galactose (Peak 1) und geringe Mengen von Fructose (Peak 2) sind. Der Abbau von Stachyose führt zu der Bildung von Raffinose (Peak 4), Saccharose (Peak 39) und Galactose (Peak 1). Nach 24 Stunden wurde die gesamte Stachyose und Raffinose in Saccharose, Galactose und geringe Mengen von Fructose umgewandelt.
Es wurde überraschenderweise beobachtet, dass das Enzym nicht von Galactose gehemmt wurde.
IN DER BESCHREIBUNG ZITIERTE LITERATURSTELLEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das α-Galactosidase-Aktivität hat, worin die DNA-Sequenz a) ein Polypeptid kodiert, das die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; oder b) ein Analog der DNA-Sequenz von a) ist, die i) mit der in der angehängten SEQ ID No. 2 gezeigten DNA-Sequenz unter den Bedingungen von Hybridisieren bei 45°C und Waschen in 6 × SSC, 0,1% SDS bei 45°C hybridisiert und/oder ii) ein Polypeptid kodiert, das wenigstens zu 50% identisch mit dem Polypeptid ist, das die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz hat.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, das ein Polypeptid kodiert, das eine Identität von über 70%, 75%, 80%, 90% oder 95% mit der in der SEQ ID No. 3 gezeigten Aminosäuresequenz hat.
DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, worin die DNA-Sequenz von einem Stamm von Aspergillus abgeleitet ist, besonders von einem Stamm von A. niger.
DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, in welchem die DNA-Sequenz eine α-Galactosidase kodiert, die einen pI in dem Bereich von 4,0–5,5, wie mittels IEF bestimmt, ein pH-Optimum in dem Bereich von 5,0–7,0, ein Temperaturoptimum innerhalb des Bereichs von 50–70°C, ein Molekulargewicht von in etwa 170.000 Da und/oder eine spezifische Aktivität von über 250 GALU/mg Protein hat.
DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, worin die DNA-Sequenz wie in der angehängten SEQ ID No. 1 oder 2 gezeigt ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 1–5.
Zelle umfassend einen Vektor nach Anspruch 6.
Zelle nach Anspruch 7, die eine mikrobielle Zelle ist, vorzugsweise eine Bakterienzelle, eine Hefezelle oder eine Pilzzelle; worin die Bakterienzelle vorzugsweise eine Zelle von i) grampositiven Bakterien, vorzugsweise Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans, Streptomyces murinus, oder ii) gramnegativen Bakterien, vorzugsweise E. coli, ist; oder worin vorzugsweise die Hefezelle eine Zelle von iii) Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae, ist; oder worin vorzugsweise die Pilzzelle eine Zelle von iv) einem filamentösen Pilz gehörend zu Aspergillus, vorzugsweise Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, ist.
α-Galactosidase-Zubereitung, kodiert von einem DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 1–5.
Polypeptid, das α-Galactosidase-Aktivität zeigt und das a) die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst oder b) eine Variante davon ist, wobei die Variante i) von der DNA-Sequenz kodiert ist, die mit der in der angehängten SEQ ID No. 2 gezeigten DNA-Sequenz unter den Bedingungen von Hybridisieren bei 45°C und Waschen in 6 × SSC, 0,1% SDS bei 45°C hybridisiert und/oder ii) wenigstens zu 50% identisch mit dem Polypeptid ist, das die in der angehängten SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz hat.
Polypeptid nach Anspruch 10, das eine Identität von über 70%, 75%, 80%, 90% oder 95% mit der in SEQ ID No. 3 gezeigten Aminosäuresequenz hat.
Verfahren zur Herstellung eines α-Galactosidase-Enzyms oder einer Variante davon, die α-Galactosidase-Aktivität zeigt, umfassend Kultivieren einer Zelle nach einem beliebigen der Ansprüche 7–8 in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des α-Galactosidase-Enzyms oder der Variante erlauben, und Gewinnen des resultierenden Enzyms oder der Variante aus der Kultur.
Verwendung einer α-Galactosidase-Zubereitung wie in Anspruch 9 beansprucht oder des Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 10–11 zur Vorbehandlung von Essen oder Futter, das α-Galactoside enthält.
Verwendung einer α-Galactosidase-Zubereitung wie in Anspruch 9 beansprucht oder des Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 10–11 zur Herstellung von Zucker aus Zuckerrüben.
Die α-Galactosidase-Zubereitung nach Anspruch 9 oder das Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 10–11 zur Verwendung als Medikament.
Die α-Galactosidase-Zubereitung nach Anspruch 9 oder das Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 10–11 zur Verwendung bei der in-vivo-Konversion von α-Galactosid-verknüpften Zuckern in Säugetieren.
Die α-Galactosidase-Zubereitung nach Anspruch 9 oder das Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 10–11 zur Verwendung als Verdauungshilfe.
Essen oder Futter, umfassend eine α-Galactosidase-Zubereitung nach Anspruch 9 oder ein Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 10–11.
Verfahren zur Herstellung eines Enzym-modifizierten Sojabohnenprodukts, umfassend Unterziehen einer das zu modifizierende Sojabohnenprodukt enthaltenden Zusammensetzung einer enzymatischen Behandlung in der Gegenwart einer α-Galactosidase-Zubereitung nach Anspruch 9 oder eines Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 10–11.