CN102154411B

CN102154411B - 一种寡糖Globotriose的制备方法

Info

Publication number: CN102154411B
Application number: CN 201110002979
Authority: CN
Inventors: 肖敏; 范树泉; 卢丽丽; 张丽丽
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2011-01-07
Filing date: 2011-01-07
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-01-07
Also published as: CN102154411A

Abstract

本发明涉及一种寡糖的制备方法，特别涉及一种利用α-半乳糖苷酶合成寡糖Globotriose的方法，属于寡糖合成技术领域。本发明利用α-半乳糖苷酶以对硝基苯-α-D-半乳糖苷为糖基供体，以乳糖为受体，一步转糖基反应合成寡糖Globotriose。该方法所需要的底物价格便宜，易于获得，且反应条件温和，操作简便，大大降低了Globotriose的生产成本，适合于Globotriose的大规模合成，具有潜在的应用前景。

Description

一种寡糖Globotriose的制备方法

技术领域

本发明涉及一种寡糖的制备方法，特别涉及一种利用α-半乳糖苷酶合成寡糖Globotriose的方法，属于寡糖合成技术领域。

技术背景

红细胞血型抗原p^k(Gb₃Cer)是一种广泛存在于人体细胞表面的重要糖脂，由Globotriose糖基配体和神经酰胺构成。一些肠道致病菌如志贺氏菌等可以合成志贺毒素，并通过毒素与Globotriose特异性结合来识别Gb₃Cer，入侵人体细胞。一旦毒素进入细胞内循环，将引发一系列临床综合症状，包括溶血尿毒症综合征，多器官功能衰竭等，严重则导致死亡。如果能阻止毒素和Gb₃Cer糖基配体的结合，则可以阻止志贺菌入侵细胞。研究发现，单个Globotriose分子对志贺毒素中和能力较弱，而Globotriose聚合分子对志贺毒素表现出了高度的亲和力，可以在毒素进入细胞前中和毒素，使得志贺菌无法与细胞表面Gb₃Cer的糖基配体接合，无法入侵细胞，从而有效防治该类病菌。Globotriose聚合分子已经在基础研究和临床治疗中得到广泛应用，其获得一般需要单个Globotriose分子作为前体物质。

Globotriose是一种中性三糖，化学结构为Gal α(1→4)Gal β(1→4)Glc，目前的合成方法主要有三种：化学合成、糖基转移酶合成和工程微生物代谢生产。化学合成方法需要反复的添加保护基团和脱保护基团，合成步骤繁琐，得率也较低，而且Gal-α-糖苷键的形成难以控制，该方法难以大规模应用。糖基转移酶可以催化一步转糖基反应特异性合成Globotriose，但它需要昂贵的UDP活化的糖苷作为底物，成本很高。工程微生物代谢生产是利用基因工程对细胞的糖合成和糖代谢途径进行改造，利用这种重组细胞来合成相应的糖苷化合物。通过将合成UDP糖苷的一系列酶和Gal α1，4糖基转移酶重组至细胞，使重组细胞可以利用低成本底物如乳清酸、果糖和乳糖等合成Globotriose，但细胞内多个酶的连续反应不容易控制，而且合成的产物Globotriose在转运出细胞方面的困难也难以解决，这些限制了它的大规模应用。由于现有的合成方法均存在局限性，使得Globotriose的商品价格一直非常昂贵，迫切需要寻找新的经济有效的合成方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种寡糖Globotriose的制备方法。

发明概述

本发明的技术要点是利用α-半乳糖苷酶以对硝基苯-α-D-半乳糖苷为糖基供体，以乳糖为受体，一步转糖基反应合成寡糖Globotriose。

发明详述

术语解释：

活力单位(U)：取酶液30μl，加2mM对硝基苯-α-半乳糖苷溶液150μl(pH 5.5、50mM醋酸缓冲液配制)，37℃反应10min，加入1.05ml、0.2M、pH 10.5硼酸缓冲液终止反应，测OD400。以每分钟水解对硝基苯-α-D-半乳糖苷底物释放1μM硝基苯酚的酶量为1个酶活单位(U)。

一种寡糖Globotriose的制备方法，步骤如下：

(1)分别用磷酸缓冲液配制浓度为0.1M的对硝基苯-α-D-半乳糖苷溶液、浓度为0.1M～0.5M的乳糖溶液和浓度为5～20U/ml的α-半乳糖苷酶溶液；

(2)将步骤(1)制得的对硝基苯-α-D-半乳糖苷溶液、乳糖溶液和α-半乳糖苷酶溶液按体积比1∶1∶8的比例混合，37℃水浴中反应1～5小时，100℃煮沸，得Globotriose反应液I；

(3)将步骤(2)制得的Globotriose反应液I用等体积的乙酸乙酯萃取1～2次，收集下层水溶液，在35℃～45℃的条件下旋转蒸发30分钟去除乙酸乙酯，得去除对硝基苯酚的Globotriose反应液II；

(4)将步骤(3)制得的Globotriose反应液II按照6～8％质量体积比的接种量加入酵母菌细胞，在28～30℃、150～180转/分培养24～36小时，离心，取上清，得去除对硝基苯酚、半乳糖和乳糖的Globotriose反应液III；

(5)将步骤(4)制得的Globotriose反应液III按每毫升反应液1-2毫克的用量加入活性炭，室温搅拌1小时，0.4μm的滤膜过滤，去上清，然后加入与Globotriose反应液III等体积的3％(质量百分比)乙醇重悬，室温搅拌1小时，0.4μm的滤膜过滤，去上清，再按反应液III二分之一体积加入20％(质量百分比)乙醇重悬，室温搅拌1小时，0.4μm的滤膜过滤，收集上清，冷冻干燥，即得寡糖Globotriose产品。

所述步骤(1)中的α-半乳糖苷酶溶液由具有α(1→4)糖苷键合成活性的α-半乳糖苷酶配制。

上述α-半乳糖苷酶选用专利ZL200510044898.3所述基因序列或GenBank登录号为AF406640的基因序列按照专利ZL200510044898.3所述方法制得。

所述步骤(1)中的磷酸缓冲液浓度为0.05M～0.5M，pH值为5.5～8.0；优选的，所述步骤(1)中的磷酸缓冲液是浓度为0.05M的磷酸钠缓冲液，pH值为8.0。所述步骤(1)中的乳糖溶液浓度为0.5M。

所述步骤(2)中100℃煮沸后，还包括12000转/分离心10分钟的离心步骤。

所述步骤(4)中的酵母菌细胞通过如下方法制得：采用YPD培养基培养乳酸克鲁维酵母细胞，该菌株在美国标准菌种收藏所编号为：ATCC NO.8563，在28℃培养30～40小时，12000转/分离心3～10分钟，即得。

上述YPD培养基组分如下，均为重量百分数：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，pH自然。

本发明提供了一种经济有效的利用糖苷酶合成Globotriose的方法，所采用的α-半乳糖苷酶催化合成Globotriose的反应避免了化学合成中基团保护和脱保护，条件温和，工艺简单，易于操作，更重要的是该酶所用到的底物便宜，来源广泛，容易获取，大大降低了酶法合成Globotriose的生产成本，适合于Globotriose的大规模合成，具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为本发明采用的糖苷酶法合成Globotriose的反应示意图；

其中，1、乳糖；2、对硝基苯-α-D-半乳糖苷；3、α-半乳糖苷酶；4、对硝基苯酚；5、Globotriose。

图2为α-半乳糖苷酶以乳糖为受体合成产物的质谱图。

图3为α-半乳糖苷酶以乳糖为受体合成产物的GC图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述乳酸克鲁维酵母购自美国标准菌种收藏所，菌种编号为：ATCC NO.8563。

实施例1

一种寡糖Globotriose的制备方法，步骤如下：

1.α-半乳糖苷酶的制备

按专利ZL200510044898.3所述方法制备α-半乳糖苷酶。

2.α-半乳糖苷酶催化合成寡糖Globotriose

测定上述α-半乳糖苷酶酶液以对硝基苯-α-D-半乳糖苷为底物的酶活，用pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液将其稀释到10U/ml。用pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液配制0.1M的对硝基苯-α-D-半乳糖苷溶液和0.5M的乳糖溶液。取10U/ml的酶液5ml，0.1M的对硝基苯-α-D-半乳糖苷溶液5ml，0.5M的乳糖40ml，在37℃反应3小时后，100℃煮沸10分钟，终止反应，得Globotriose反应液I。

3.寡糖Globotriose的纯化

用盐酸将获得的50mlGlobotriose反应液I调至pH5.5，然后转移至250ml的分液漏斗，加入50ml的乙酸乙酯，萃取后收取下层水溶液，在35℃下旋转蒸发30分钟，用NaOH调整反应液至pH7.0，然后加入100ml水将反应液的总糖含量稀释到6％(质量百分比)，得Globotriose反应液II。

将乳酸克鲁维酵母接种至900ml的YPD培养基28℃培养30h，12000转/分离心3分钟获得6g酵母细胞。将6g酵母细胞加入到上述150mlGlobotriose反应液II中，在37℃处理28小时，12000转/分离心10分钟去掉酵母细胞，收取上清，得Globotriose反应液III。

在酵母处理后的150mlGlobotriose反应液III中加入200毫克的活性炭颗粒，室温搅拌处理1个小时，用0.4μm的滤膜过滤，除去上清。然后向活性炭颗粒中加入150ml的3％乙醇，室温低速搅拌处理1个小时，用0.4μm的滤膜过滤，除去上清。然后向活性炭颗粒中加入75ml的20％乙醇，室温低速搅拌处理1个小时，用0.4μm的滤膜过滤，收集上清。冷冻干燥成白色粉末，即得寡糖Globotriose产品。

4.寡糖Globotriose的结构鉴定和含量分析：

取上述白色粉末用水稀释成质量体积百分比为1％的溶液，并取Globotriose的标准品配制成1％的水溶液，薄层层析板点样，在展层剂(正丁醇∶无水乙醇∶水＝5∶3∶2)中展开，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤5分钟，糖斑点显色后，目标产物的迁移率和Globotriose标准品迁移率一致。

取上述1％的水溶液进行质谱分析，目标产物的分子离子峰(m/z)[M-H]^-为503.4(如图2所示)，判断产物分子量为504，为三糖分子。

取1毫克获得的白色粉末，进行甲基化衍生，然后通过红外光谱检测甲基化程度。完全甲基化的样品用浓盐酸进行酸解，之后进行乙酰化。乙酰化完全的样品进行气质(GC-MS)分析，判断产物糖苷键型和含量。GC-MS中GC分析结果见图3，GC中保留时间为12.128分钟的质谱碎片峰，与文献报道的三糖非还原端1，4连接的半乳糖峰一致，据此判断主要产物为Globotriose。根据GC图谱的峰面积积分结果，Globotriose含量为51.3％。

上述质谱分析所用仪器为API 4000质谱仪，Applied Biosystems MDS Sciex(加拿大)；气质分析所用仪器为安捷伦气质联用仪Agilent 5975C(美国)。

实施例2

如实施例1所述寡糖Globotriose的制备方法，不同之处在于：

1)利用GenBank登录号为AF406640的基因，按照专利ZL200510044898.3所述方法制得α-半乳糖苷酶。

2)所述的磷酸缓冲液均含有5％(质量百分比)的甘油。

Claims

1.一种寡糖Globotriose的制备方法，步骤如下：

（1）分别用磷酸缓冲液配制浓度为0.1M的对硝基苯-α-D-半乳糖苷溶液、浓度为0.1M～0.5M的乳糖溶液和浓度为5～20U/ml的α-半乳糖苷酶溶液；

（2）将步骤（1）制得的对硝基苯-α-D-半乳糖苷溶液、乳糖溶液和α-半乳糖苷酶溶液按体积比1:1:8的比例混合，37℃水浴中反应1～5小时，100℃煮沸，得Globotriose反应液I；

（3）将步骤（2）制得的Globotriose反应液I用等体积的乙酸乙酯萃取1～2次，收集下层的水溶液，在35℃～45℃的条件下旋转蒸发30分钟去除乙酸乙酯，得Globotriose反应液II；

（4）将步骤（3）制得的Globotriose反应液II按照6～8%质量体积比的接种量加入酵母菌细胞，在28～30℃、150～180转/分培养24～36小时，离心，取上清，得Globotriose反应液III；

（5）将步骤（4）制得的Globotriose反应液III按每毫升1～2毫克的用量加入活性炭，室温搅拌1小时，0.4μm的滤膜过滤，去上清，然后加入与Globotriose反应液III等体积的质量百分比3%的乙醇重悬，室温搅拌1小时，0.4μm的滤膜过滤，去上清，再按Globotriose反应液III的二分之一体积加入质量百分比20%的乙醇重悬，室温搅拌1小时，0.4μm的滤膜过滤，收集上清，冷冻干燥，即得寡糖Globotriose产品；

所述步骤（1）中的α-半乳糖苷酶溶液由具有α(1→4)糖苷键合成活性的α-半乳糖苷酶配制；其中，α-半乳糖苷酶基因序列如下：

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所述步骤（4）中的酵母菌细胞通过如下方法制得：采用YPD培养基培养乳酸克鲁维酵母细胞，该菌株在美国标准菌种收藏所编号为：ATCC NO.8563，在28℃培养30～40小时，12000转/分离心3～10分钟，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液浓度为0.05M～0.5M，pH值为5.5～8.0。

3、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的磷酸缓冲液是浓度为0.05M的磷酸钠缓冲液，pH值为8.0。

4、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的乳糖溶液浓度为0.5M。

5、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中100℃煮沸后，还包括12000转/分离心10分钟的离心步骤。

6、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的YPD培养基组分如下，均为重量百分数：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉，pH自然。