KR20190137136A - 박테리아 만나나아제 - Google Patents

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크리스티나 자르비넨
다니엘라 돌락
패트릭 로렌츠
자리 베흐만페라
펜티 오자팔로
테르히 푸라넨
다니엘라 허브스트
수잔 위엘란드
니나 무스만
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에이비 엔자임스 오와이
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Abstract

본 발명은 신규한 만나나아제, 만나나아제를 포함하는 조성물, 만나나아제의 생산방법 및 만나나아제를 사용한 만난 함유 물질의 분해 및 변형 방법에 관한 것이다.

Description

박테리아 만나나아제
본 발명은 박테리아 만나나아제 효소에 관한 것이다. 상기 만나나아제는 사료, 식품, 펄프 및 석유 산업의 세탁 및 세정 분야와 같은 만난의 분해 또는 변형이 요구되는 산업 분야에서의 응용에 유용하다. 본 발명은 또한 유용한 만나나아제 효소, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 효소 조성물 및 이의 생산 및 사용 방법을 제공한다.
만난은 다양한 식물에서 발견되는 만노스 함유 다당체이다. 만난은 수성 환경에서 잘 녹지 않으며, 이의 물리화학적 특성은 점성 분산(viscous dispersions)을 일으키도록 한다. 또한 만난은 높은 물 결합력을 가지고 있다. 이러한 모든 특성은 양조, 제빵, 동물 영양, 세탁 및 세정 분야를 포함한여러 산업에서 문제를 야기한다.
식물 기반의 식이요법은 다양한 β-만난이 존재하며, 그 양과 특성에 따라 영양소 소화, 미생물 군집화 및 성장 성능을 손상시킬 수 있다. 만난의 효소적 분해는 고 수용성 만난의 점성을 감소시키고, 콩과(leguminoseae)에 존재하는 불수용성 선형 만난을 형성할 수 있는 만노-올리고당의 생성을 초래한다. 만나나아제는 모든 단일 위 동물에서 평균 일일 증체량, 사료효율, 체중 균일성 및 생존성을 증가시킨다.
곡류 식이요법을 포함하는 단일 위 동물용 사료와 같은 동물 먹이 분야에 있어서, 만난은 장 내용물의 점성에 기여하는 요인이므로 사료 소화율과 동물 성장 속도에 악영향을 미친다. 반추 동물의 경우, 만난은 섬유질 섭취의 실질적인 성분을 나타내며, 만난의 완전한 소화는 보다 높은 사료 전환 효율을 촉진할 수 있다.
세탁 및 세정 분야에서, 만나나아제를 포함하는 효소 조성물은 만난을 분해하는데 사용될 수 있다. 그러나 사료와 같은 동물 먹이 분야의 경우, 다양한 저장 및 사용 조건에서 우수한 만난 분해 활성을 나타내는 안정한 만나나아제를 제공하는 것은 어렵다.
본 발명의 목적은 상이한 산업 공정에 적용될 때, 만나나아제 활성을 나타내는 신규한 효소와 만난 분해 또는 변형을 위한 효소 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 제1관점에서, 서열번호 16 (Man7)과 적어도 70%의 서열상동성, 서열번호 12 (Man6)와 적어도 93%의 서열 상동성 및/또는 서열번호 20 (Man14)과 적어도 79%의 서열상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 만나나아제를 포함하는 효소 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 관점에서, 하기를 갖는 아미노산 서열을 갖는 코어 영영을 갖는 적어도 하나의 만나아제 효소를 포함하는 효소 조성물을 제공한다:
Man7 서열번호 16의 아미노산 27 내지 331과 적어도 79%의 서열 상동성;
Man6 서열번호 12의 아미노산 35 내지 324와 적어도 95%의 서열 상동성; 및/또는
Man14 서열번호 20의 아미노산 17 내지 314와 적어도 85%의 서열 상동성.
본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 만나나아제 효소는 상기 정의된 것과 같은 코어 영역을 갖는다.
본 발명의 효소 조성물은 계면활성 및 형성에서 우수한 안정성 및 만나나아제 활성을 가지는데 유리하다. 또한, 만난 분해 또는 변형이 요구되는 다양한 산업에서의 응용에 적합하다. 본 발명의 효소 조성물의 만나나아제는 다양한 화학 환경에서 만난 함유 물질을 분해 및 변형 시키기에 적합하다.
실시예에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 효소 조성물에 포함된 만나나아제는 재조합 숙주세포에서 생산될 수 있으며, 산업 분야에 적용하기 위한 효소 조성물에 유용한 구조 및 특성을 갖는다. Man6, Man7 및 Man14가 공유하는 공통 구조 요소는 GH5 도메인이다. 다른 공통 구조 요소는 Man6와 Man7 사이의 60%의 서열 상동성, Man6와 Man14 사이의 57%의 서열 상동성 및 Man7과 Man14사이의 69%의 서열 상동성이다. 또 다른 공통 구조적 특성은 코어 영역이다. 이러한 구조적 요소는 본명의 만나나아제의 특징이다.
본 발명의 제2 관점에서,
만나나아제 활성 및
서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 상동성,
서열번호 12의 아미노산 서열과 적어도 93%의 서열 상동성, 및/또는
서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 79%의 서열상동성을 갖는 적어도 하나의 제조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 유전 요소를 포함하는 재조합 숙주세포를 제공하며,
상기 숙주세포는 하기의 그룹으로부터 선택된다:
곰팡이 세포(fungal cells)
아스코마이코타 문(Division Ascomycota), 페지조마이코티나 아문(Subdivision Pezizomycotina) 유래의 사상성 진균 세포(filamentous fungal cells); 바람직하게는 소르다리오미이세트 강(Class Sordariomycete), 하이포크레오마이세트 아강(Subclass Hypocreomycetidae), 하이포크릴레스(Hypocreales) 및 마이크로아스칼레스(Microascales) 및 아스퍼질러스(Aspergillus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 마이셀리오프토라(Myceliophthora) 및 휴미콜라(Humicola) 목(order)으로 구성된 군 유래;
더욱 바람직하게는, 하이포크리세(Hypocreacea), 넥트리아세(Nectriaceae), 클라비치피타세(Clavicipitaceae), 마이크로아스카세(Microascaceae) 과(family) 및 Genera 트리코더마(Trichoderma; 하이포크리아의 아나모프(anamorph of Hypocrea)), 푸사리움(Fusarium), 지버렐라(Gibberella), 넥트리아(Nectria), 스타치보트리(Stachybotrys), 클라비셉(Claviceps), 메타히지움(Metarhizium), 빌로시클라바(Villosiclava), 오피오코르다이셉(Ophiocordyceps), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 및 셰도스포리움(Scedosporium) 종으로 구성된 군 유래;
더욱 바람직하게는, 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei; Hypocrea jecorina), T. 시트리노비리데(T. citrinoviridae), T. 롱기브라키아툼(T. longibrachiatum), T. 바이렌(T. virens), T. 하지아눔(T. harzianum), T. 아스페렐럼(T. asperellum), T. 아트로비리데(T. atroviridae), T. 파라리세이(T. parareesei), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), F. 그라미내눔(F. gramineanum), F. 슈도그람이니어룸(F. pseudograminearum), F. 베네나툼(F. venenatum), 지버렐라 후지코로이(Gibberella fujikuroi), G. 모닐리포르미스(G. moniliformis), G. 제에(G. zeaea), 넥트리아(Nectria; Haematonectria) 헤마토코카(haematococca), 스타키보트리스 차타룸(Stachybotrys chartarum), S. 클로로할로나타(S. chlorohalonata), 클라비셉스 푸르푸리아(Claviceps purpurea), 메타히지움 아크리둠(Metarhizium acridum), M. 아니소플리에(M. anisopliae), 빌로시클라바 바이렌(Villosiclava virens), 오피오코르다이셉스 시넨시스(Ophiocordyceps sinensis), 아크레모니움(Acremonium; Cephalosporium) 크리소제넘 (chrysogenum), 및 셰도스포리움 아피오스퍼멈(Scedosporium apiospermum), 및 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 크리스포리움(Chrysosporium) 럭코벤스(lucknowense), 마이셀리오 프토라 테르모필(Myceliophthora thermophile), 휴미콜라 인솔렌(Humicola insolens), 및 휴미콜라 그리시아(Humicola grisea)로 구성된 군 유래;
박테리아 세포, 바람직하게는 B. 서브틸리스(B.subtilis), B.린체니포미스(B. licheniformis), B. 메가테리움(B. megaterium), B.아밀로리퀴파시엔(B. amyloliquefaciens), B. 푸밀리스(B. pumilus) 와 같은 그람 양성 바실리, 에스커리치아 콜리(Escherichia coli)와 같은 그람 음성 박테리아, 스트렙토 마이셉스 종(Streptomyces sp.)과 같은 악티노마이세탈레스(actinomycetales), 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)와 같은 효모, 가장 바람직하게는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 또는 바실러스(Bacillus).
재조합 숙주세포는 만나나아제를 생산하고 만나나아제를 암호화 하는 폴리뉴클레오 타이드를 운반하는 데 사용될 수 있다. 상기 재조합 숙주세포는 상이한 특성을 갖는 만나나아제의 제조에 유용하다. 예를 들어, 안정성 또는 활성에 유리한 번역 후 변형 또는 숙주세포에서 생성된 만나나아제의 후 과정 및 형성을 용이하게 하는 숙주세포가 선택될 수 있다.
본 발명의 제3관점에서, 만나나아제 활성을 가지고, 제2관점의 숙주세포를 사용하여 수득 가능한 재조합 폴리펩타이드가 제공된다. 사익 재조합 폴리펩타이드는 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 갖는 천연 폴리펩타이드와 구별되는 구조적 또는 기능적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전사 후 변형된 재조합 폴리펩타이드의 제공, 이의 결손, 또는 재조합 폴리펩펩타이드의 생산 및/또는 형성을 촉진하는 지역화를 제공하는 숙주세포가 선택될 수 있다.
본 발명의 제4관점에서, 다음을 포함하는 만나나아제의 제조방법을 제공한다:
a. 제2관점의 재조합 숙주세포를 배양하는 단계,
i. 상기 유전 요소는 폴리펩타이드를 생산하도록 하는 조건에서 재조합 숙주세포에서 재조합 폴리펩타이드의 생산을 조절하는 적어도 하나의 조절 서열을 포함;
ii. 상기 유전 요소는 상기 폴리펩타이드를 상기 숙주세포의 외부로 수송하기 위한 신호 서열을 암호화 하는 적어도 하나의 서열을 선택적으로 포함; 및
iii. 배양은 상기 폴리펩타이드의 생산을 허용하는 조건에서 수행됨; 및
b. 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
상기 방법은 만나나아제를 생산하는 효율적인 방법을 제공한다. 상기 만나나아제는 재조합 숙주세포에서 생산되기 때문에, 원하는 방식으로 최적화, 조정 및 제어될 수 있는 만나나아제 생산 시스템을 제공한다. 상기 방법에 의해 생산된 만나나아제는 구조적 수준에서 천연 만나나아제와 상이할 수 있다. 상기 방법에 의해 생산된 만나나아제는 예를 들어 글리코실화 패턴, 또는 상이한 전사 후 변형을 가지며, 이는 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 갖는 만나나아제와 같은 천연 만나나아제와 비교할 때, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖지만 다른 숙주세포에서 생산된 만나나아제와 비교할 때, 구조 및 또는 기능에서 차이를 야기하도록 한다. 상기 방법에 의해 생성된 만나나아제는 그대로 사용되거나 선택된 제형으로 제형화될 수 있다.
또 다른 관점에서, 만나나아제 활성을 가지고 제2관점의 숙주세포를 사용하여 얻을 수 있는 재조합 포릴펩타이드를 포함하는 효소 제제(enzyme preparation)가 제공된다.
상기 효소 제제 또는 조성물은 안정화제(stabilizers), 완충제(buffers), 계면활성제(surfactants), 표백제(bleaching agents), 매개제(mediators), 항-부식제(anti-corrosion agents), 빌더(builders), 재침착 방지제(anti-redeposition agents), 형광 발광제(optical brighteners), 염료(dyes), 색소(pigments), 향료(perfumes), 부식제(caustics), 연마제(abrasives) 및 방부제(preservative)로 구성되는 군에서 선택되는 적합한 첨가제뿐 아니라 매개체(mediator)와 같이 또는 없이 프로테아제(proteases), 아밀라아제(amylases), 셀룰라아제(cellulases), 리파아제(lipases), 자일라나아제(xylanases), 만나나아제(mannanases), 큐티나아제(cutinases), 에스터라아제(esterases), 파이타아제(phytases), DNAses, 펙티나아제(pectinases), 펙티놀리틱 효소(pectinolytic enzymes), 잔타나아제(xanthanases), 지일로글루카나아제(xyloglucanases), 락카아제(laccases), 페록시다아제(peroxidases) 및 옥시다아제(oxidases)로 구성된 군에서 선택되는 다른 효소를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제5관점에서, 상기 만난 함유 물질을 본 발명의 효소 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로 처리하는 것을 포함하는 만난 함유 물질의 분해 또는 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제6관점에서, 본 발명의 효소 조성물 또는 재조합 숙주세포 및 적어도 하나의 식물 유래 단백질 공급원 또는 만난 함유 생성물 또는 부산물; 및
a. 선택적으로 프로테아제, 아밀라아제, 파이타아제(phytase), 자일라나아제, 엔도글루카나아제, 베타글루카나아제 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 효소; 및
b. 선택적으로 말토덱스트린(maltodextrin), 곡물가루(flour), 염(salt), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 설페이트(sulphate), 소듐 설페이트(sodium sulphate) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나이상의 충전제를 포함하는 동물 사료가 제공된다.
본 발명의 제7관점에서, 본 발명의 효소 조성물 또는 숙주세포로부터 얻을 수 있는 효소; 및
a. 선택적으로 프로테아제, 아밀라아제, 파이타아제(phytase), 자일라나아제, 엔도글루카나아제, 베타글루카나아제 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 효소; 및
b. 선택적으로 말토덱스트린(maltodextrin), 곡물가루(flour), 염(salt), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 설페이트(sulphate), 소듐 설페이트(sodium sulphate) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나이상의 충전제를 포함하는 사료 보충제가 제공된다.
상기 사료 및 사료 보충제는 만나나아제가 없는 사료와 비교하여 사료의 영양성분을 향상시킨다. 본 발명의 효소 조성물은 사료에 존재하는 만난을 분해하여 동물이 보다 쉽게 소화할 수 있도록 한다. 특히, 효소 소화로부터 생성된 결과인 사료 만난 올리고사크라이드를 함유하는 콩 먹이는 장내 미생물 및 결과적으로 동물의 퍼포먼스에 유익한 영향을 미친다. 옥수수 콩 기반의 먹이에 존재하는 아라비녹실란(arabinoxylan)을 소화하기 위해 자일라나아제를 포함시킴으로써 만나나아제의 효과를 향상시킬 수 있다.
만나나아제는 또한 습식 사료의 유동학적(rheological) 특성을 변형하는데 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 사료는 고기 사료 또는 뼈 사료 같은 동물성 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제 8관점에서, 제6관점의 동물 사료 또는 제7관점의 사료 보충물은 다음과 같은 용도 및 사용방법을 제공한다.
a. 동물, 바람직하게는, 단일 위 동물 및 반추 동물에게의 급여;
b. 동물의 체중증가의 개선.
본 발명의 제9관점에서, 본 발명의 효소 조성물 또는 숙주세포로부터 얻을 수 있는 효소의 세제에 대한 사용 및 사용방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 세제 조성물은 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 큐티나아제(cutinase), 아밀라아제(amylase), 카보하이드로나아제(carbohydrase), 셀룰라아제(cellulose), 펙티나아제(pectinases), 펙티놀리틱 효소(pectinolytic enzymes), 에스터라아제(esterase), 만나나아제(mannanase), 아라비나아제(arabinose), 갈락타나아제(galactanase), 자일라나아제(xylanase), 옥시다아제(oxidase), 잔타나아제(xanthanase), 자일로글루카나아제(xyloglucanase), 라카아제(laccase), DNAse 및/또는 퍼옥시다아제(peroxidase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함하고, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 및 리파아제로부터 선택되는 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 세제 조성물은 바(bar), 균질 정제(homogenous tablet), 2개 이상의 층을 갖는 정제, 하나이상의 구획을 갖는 파우치, 일반 또는 소형 분말, 과립(granule), 페이스트(paste), 젤 또는 일반, 소형 또는 농축액의 제형일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 세제 조성물은 세탁 세제 조성물, 바람직하게는 액체 또는 고체 세탁 세제 조성물일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한, 만난을 분해하기 위한 본 발명의 효소 조성물 또는 세제 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명은 세탁 과정에서 본 발명의 효소 조성물 또는 세제 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 효소 조성물 또는 세제 조성물로 표면을 접촉하는 단계를 포함하는 표면으로부터 얼룩을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 효소 조성물 또는 세제 조성물을 만난에 적용하는 것을 포함하는 만난 분해방법에 관한 것으로, 바람직하게는 만난은 직물의 표면에 있거나, 적어도 일부는 직물에 파묻혀있다.
제10관점에서, 제1관점의 본 발명의 효소 조성물 또는 제3관점의 숙주세포로부터 얻을 수 있는 효소의 용도 및 오일 드릴링에서의 사용 방법을 제공한다.
본 발명의 효소 조성물은 오일 드릴링액의 유동학적 특성을 변형하고 오일의 회수를 개선시키는데 유용하다.
제11관점에서, 커피 추출물, 과일 주스, 파인애플 주스 또는 두유를 가공할 때 제1관점의 본 발명의 효소 조성물 또는 제3관점의 숙주세포에서 얻을 수 있는 효소의 용도 및 사용방법을 제공한다.
본 발명의 효소 조성물 또는 숙주세포로부터 얻을 수 있는 효소를 사용하는 것은 커피 추출물의 점도를 감소시키기 때문에 커피 추출물을 가공하는데 유리하다.
본 발명의 효소 조성물 또는 숙주세포로부터 얻을 수 있는 효소를 사용하는 것은 과일 주스를 가공 및 제조하는데 유리하며, 이는 과일주스의 점성을 낮추고, 여과속도 및 안정성을 개선시키며, 과일 성분을 추출하는 것을 돕기 때문이다.
본 발명의 효소 조성물 또는 숙주세포로부터 얻을 수 있는 효소를 사용하는 것은 두유의 가공 및 제조에 유리하며, 이는 두유의 수율, 색상 단백질 함량, 및 두유의 맛을 향상시키기 때문이다.
다른 관점에서, 본 발명의 만나나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 본 명세서에 개시된 서열 정보는 다른 상동성 만나나아제를 동정하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 다양한 생물학적 공급원으로부터 다른 상동성 만나나아제를 암호화하는 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 또한 게놈 채굴 접근법은 게놈 데이터베이스로부터 다른 상동성 만나나아제를 인코딩하는 서열을 동정할 수 있다.
도 1은 Bacillus.에서의 복제를 위한 벡터 pEV1의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 만나나아제 단백질(Man6, Man7 및 Man14)을 과생산하기 위한 Trichoderma reesei 원형질체의 형질전환에 사용한 발현 카세트를 개략적으로 나타낸 것이다. 만나나아제 유전자는 T.reesei cel7A/cbh1 프로모터(pcbh1)로 제어되었으며, 전사의 종결은 T. reesei cel7A/cbh1 종결 서열(tcbh1)을 사용하여 수행되었다. amdS유전자는 형질전환 마커로 포함되었다.
도 3은 pH 4 내지 pH 11의 40mM 브리튼-로빈슨 버퍼에서 재조합 Man6, Man7 및 Man14(바실러스 생산) 만나나아제 단백질의 활성에 대한 pH의 효과를 나타내는 것이다. 반응온도는 50℃ 였으며, 반응시간은 10분이다. 아주린-크로스링크된 캐롭 갈락토만난(Azurine-crosslinked carob galactomannan)은 기질로 사용되었다. 모든 측정은 적어도 2번 수행되었다. 상기 데이터 포인트는 개별 측정 값의 평균을 나타낸 것이다.
도 4는 10분의 반응 시간을 사용하여 40mM 브리튼-로빈슨 버퍼 pH7에서 분석한 재조합 Man6, Man7 및 Man14(바실러스 생산) 만나나아제의 온도 프로파일을 나타내며, 아주린-크로스링크된 캐롭 갈락토만난(Azurine-crosslinked carob galactomannan)은 기질로 사용되었다. 모든 측정은 적어도 2번 수행되었다. 상기 데이터 포인트는 개별 측정 값의 평균을 나타낸 것이다.
도 5는 박테리아 만나나아제의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 약 8.3 및 효소가 활성 단위로 투여되는 조건에서 4.4g/l의 시판 중질(heavy duty) 액체 세제 A의 존재아래, 밝기의 증가(4얼룩의 ΔL*의 합)로서 Man6 및 Man7 (Bacillus 및 Trichoderma 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 7은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 약 8.3 및 효소가 활성 효소 단백질(active enzyme protein; AEP)로 투여되는 조건에서 4.4g/l의 시판 중질(heavy duty) 액체 세제 A의 존재 아래, 밝기의 증가(4얼룩의 ΔL*의 합)로서 Man6 및 Man7 (Bacillus 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 8은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 약 10 및 효소가 활성 단위로 투여되는 조건에서 3.8g/l의 시판 색상 세제 분말의 존재 아래, 밝기의 증가(4얼룩의 ΔL*의 합)로서 Man6 및 Man7 (Bacillus 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 9은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 약 10 및 효소가 활성 효소 단백질(active enzyme protein; AEP)로 투여되는 조건에서 3.8g/l의 시판 색상 세제 분말의 존재 아래, 밝기의 증가(4얼룩의 ΔL*의 합)로서 Man6 및 Man7 (Bacillus 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 10은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 약 9.5 및 효소가 활성 효소 단백질(active enzyme protein; AEP)로 투여되는 조건에서 4.2g/l의 시판 표백 세제 분말의 존재 아래, 밝기의 증가(3얼룩의 ΔL*의 합)로서 Man6 및 Man7 (Bacillus 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 11은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 약 8.3 및 효소가 활성 단위로 투여되는 조건에서 5g/l의 시판 중질(heavy duty) 액체 세제 B의 존재 아래, 밝기의 증가(2얼룩의 ΔL*의 합)로서 Man14 (Bacillus 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 12은 40℃, 16˚dH, 60분, pH 약 8.3 및 효소가 활성 효소 단백질(active enzyme protein; AEP)로 투여되는 조건에서 5g/l의 시판 중질(heavy duty) 액체 세제 B의 존재 아래, 밝기의 증가(2얼룩의 ΔL*의 합)로서 Man14 (Bacillus 생산)의 얼룩 제거 성능을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 13은 37℃의 액체 세제(OMO color)에서 Man6 및 Man7(Bacillus 생산)의 안정성을 나타낸 것이다. 상업 제조된 Mannaway ® 4.0L가 비교를 위해 사용되었다.
도 14는 시판 중질(heavy duty) 액체 세제 A에서 Man7(Bacillus 및 Trichoderma 모두에서 생산) 및 Man6(Bacillus 생산)의 안정성을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 만나나제의 사용을 포함하는 인스턴트 커피 생산의 흐름도를 나타낸 것이다.
서열목록
SEQ ID NO: 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Man6_1의 서열
SEQ ID NO: 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Man6_2의 서열
SEQ ID NO: 3 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Man7_1의 서열
SEQ ID NO: 4 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Man7_2의 서열
SEQ ID NO: 5 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Man14_1의 서열
SEQ ID NO: 6 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Man14_2의 서열
SEQ ID NO: 7 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Vec_1의 서열
SEQ ID NO: 8 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Vec_2의 서열
SEQ ID NO: 9 Bacillus clausii man6의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 10 신호 펩타이드를 코딩하는 서열이 없고 Trichoderma reesei에 최적화된 코돈을 가지는 Bacillus clausii man6의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 11 Bacillus clausii Man6의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 12 신호 펩타이드가 없는 Bacillus clausii Man6의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 13 Bacillus hemicellulosilyticus man7의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 14 신호 펩타이드를 코딩하는 서열이 없고 Trichoderma reesei에 최적화된 코돈을 가지는 Bacillus hemicellulosilyticus man7의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 15 Bacillus hemicellulosilyticus Man7의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 16 신호 펩타이드가 없는 Bacillus hemicellulosilyticus Man7의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 17 Virgibacillus soli man14의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 18 신호 펩타이드를 코딩하는 서열이 없고 Trichoderma reesei에 최적화된 코돈을 가지는 Virgibacillus soli man14의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 19 Virgibacillus soli man14의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 20 신호 펩타이드가 없는 Virgibacillus soli man14의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 21 Sequence of the 올리고뉴클레오타이드 프라이머 BMAN1
SEQ ID NO: 22 Sequence of the 올리고뉴클레오타이드 프라이머 BMAN2
SEQ ID NO: 23 Sequence of the 올리고뉴클레오타이드 프라이머 BMAN3
SEQ ID NO: 24 Sequence of the 올리고뉴클레오타이드 프라이머 BMAN4
SEQ ID NO: 25 Bacillus pumilus man31의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 26 Bacillus pumilus man31의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 27 Bacillus amyloliquefaciens man32의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 28 Bacillus amyloliquefaciens man32의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 29 Amphibacillus xylanus man33의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 30 Amphibacillus xylanus man33의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 31 Paenibacillus polymyxa man34의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 32 Paenibacillus polymyxa man34의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 33 Bacillus hemicellulosilyticus man35의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 34 Bacillus hemicellulosilyticus man35의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 35 Bacillus alcalophilus man36의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 36 Bacillus alcalophilus man36의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 37 Bacillus sp. man37의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 38 Bacillus sp. man37의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 39 Bacillus circulans man38의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 40 Bacillus circulans man38의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 41 Paenibacillus sp. man39의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 42 Paenibacillus sp. man39의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 43 Bacillus circulans man40의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 44 Bacillus circulans man40의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 45 Bacillus nealsonii man41의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 46 Bacillus nealsonii man41의 추론된 아미노산 서열
SEQ ID NO: 47 Bacillus circulans man42의 뉴클레오타이드 서열
SEQ ID NO: 48 Bacillus circulans man42의 추론된 아미노산 서열
구체적인 내용
만난은 α-1,6-결합에 의해 골격에 부착된 갈락토오즈 사이드체인과 β-1,4-결합에 의해 함께 연결된 만노스 골격으로 구성된 다당류를 의미한다. 만난은 구아 검(guar gum) 및 로커스트 빈 검(locust bean gum)과 같은 식물-기반 물질을 포함한다. 글루코만난은 더욱 또는 적게 규칙적으로 교대하는 β-1,4 결합된 만노스 및 글루코스의 골격을 갖는 다당류이며, 갈락토만난 및 갈락토글루코만난은 α-1,6-결합된 갈락토스 곁가지를 갖는 만난 및 글루코만난이다.
본 발명에서 사용된 용어 “만나나아제” 또는 ”갈락토만나나아제”는 통상의 기술자에게 만난 엔도-1,4-베타-만노시다아제로 정의되고, 베타-만나나아제 및 엔도-1,4-만나나아제로도 명명되며, 만난, 갈락토만난, 글루코만난 및 갈락토글루코만난의 1,4-만노시딕 결합의 가수분해를 촉매하는 만나나아제효소를 의미한다. 만나나아제는 효소 명명법에따라 EC 3.2.1.78로 분류된다.
본 발명에서 사용된 용어, “분리된(isolated)”은 자연적으로 발생하지 않는 환경 또는 형태의 물질을 의미한다. 분리된 물질의 비제한적인 예는 (1) 임의의 비자연적으로 발생하는 물질, (2) 자연적으로 관련된 자연 발생 성분의 하나 이상 또는 전부로부터 적어도 부분적으로 제거된 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 공동인자를 포함하는 임의의 물질; (3) 자연에서 발견된 물질과 관련된 사람의 손에 의해 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연적으로 관련된 다른 성분에 비해 물질의 양을 늘리거나 줄여서 변형시킨 임의의 물질 (예, 수주세포에서의 재조합 생산; 물질을 코딩하는 유전자의 단일 또는 다중 복제; 및 물질을 코딩하는 유전자에 자연적으로 관련된 프로모터의 대체 프로모터). 일 실시예에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 효소, 폴리뉴클레오타이드, 숙주세포 또는 조성물이 분리되었다.
본 발명에서 사용된 용어 “포함하는(comprising)”은 “포함하는(including)”, “함유하는(containing)” 및 “이해되는(comprehending)”의 넓은 의미뿐만 아니라 “~로 구성된(consisting of)” 및 “~로만 구성된(consisting only of)”의 좁은 표현을 포함한다.
본 발명에서 사용된, “단편(fragment)”은 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드가 결실된 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. DNA와 관련하여, 단편은 임의의 길이의 단일가닥 및 이중가닥 모두를 포함한다. 단편은 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 효소 활성 또는 조절 활성을 가지는 활성 단편을 의미할 수 있다. 단편은 또한 천연 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 생물학적 효과를 갖지 않는 비활성 단편일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “펩타이드” 및 “폴리펩타이드”는 복수의 연속적으로 중합된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. 본 발명에 있어서, 펩타이드는 최대 20개의 펩타이드는 최대 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자이고, 폴리펩타이드는 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 변형된 아미노산 잔기, 코돈에 의해 암호화되지 않는 천연 아미노산 잔기 및 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 “단백질”은 임의의 크기의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 단백질은 효소, 단백질, 항체, 막 단백질, 펩타이드 호르몬, 조절자 또는 임의의 다른 단백질 일 수 있다.
용어 “폴리뉴클레오타이드는” 5`에서 3` 말단으로 읽히는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 단일 또는 이중가닥 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA을 포함하고, 천연 공급원으로부터 분리되거나, in vitro에서 합성되거나, 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 폴리뉴클레오타이드와 관련한 “변형(modification)”, “변형된(modified)”, 및 유사한 용어는 조절 서열, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 상향 조절 유전 요소, 하향 조절 유전 요소, 인핸서, 억제자, 프로모터, 엑손 또는 인트론 지역과 같은 폴리뉴클레오타이드의 암호화 또는 비-암호화 영역에서의 변형을 의미한다. 일부 실시예에서, 변형은 생물학적 효과, 작용 또는 기능에 영향을 미치지 않는 오직 구조적인 것 일수 있다. 다른 실시예에서, 변형은 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 효과, 작용, 기능의 변화를 제공하는 구조적 변형이다. 이러한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능을 향상, 억제 또는 변화시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된 “상동성(identity)”은 두 서열의 잔기가 존재하는 위치의 수에 대한 2개의 정렬된 서열 사이의 정확하게 일치되는 아미노산 잔기의 백분율을 의미한다. 하나의 서열이 다른 서열에서 상응하는 잔기가 없는 경우, 정렬 프로그램은 정렬시에 갭을 허용하고, 그 위치는 동일성 계산의 분모에서 계수되지 않는다. 동일성은 EMBL-EBI 웹사이트 (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)의 Pairwise Sequence Alignment tool EMBOSS Needle로 결정된 값이다.
본 발명에서 사용된 “숙주세포(host cell)”는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물 또는 발현 벡터에 의한 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 형질도입(transduction), 교배(mating), 교차(crossing) 또는 이와 유사한 것에 의해 영향을 받기 쉬운 임의의 세포 유형을 의미한다. 용어 “숙주세포”는 복제동안 발생하는 돌연변이로 인해 동일하지 않은 임의의 자손을 포함한다. 숙주세포의 비제한적인 예로서, 곰팡이 세포(fungal cells), 아스코마이코타 문(Division Ascomycota) 유래의 사상곰팡이 세포, Subdivision 페지조마이코티나 아문(Subdivision Pezizomycotina); 바람직하게는 preferably from the group consisting of members of the 소르다리오마이세트 강(Class Sordariomycetes), 하이포크레오마이세티다 아강(Subclass Hypocreomycetidae), 하이포크레알레스 및 마이크로스칼레스 및 아스퍼질러스 목(Orders Hypocreales and Microascales and Aspergillus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 마이셀리오프토라 및 휴미콜라(Myceliophthora and Humicola)의 구성원으로 구성된 그룹 유래이고; 더욱 바람직하게는 히포크리아세(Hypocreacea), 넥트리아세(Nectriaceae), 클라비시피타세(Clavicipitaceae), 마이크로아스카세(Microascaceae) 과, 및 트리코더마(Trichoderma (히포크레아의 아나모프(anamorph)), 푸사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 넥트리아(Nectria), 스타키보트리스(Stachybotrys_, 클라비셉(Claviceps), 메타히지움(Metarhizium), 빌로시클라바(Villosiclava), 오피오코르다이셉스(Ophiocordyceps), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 및 세도스포리움(Scedosporium) 종으로 구성된 그룹 유래이며; 더욱 바람직하게는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei; Hypocrea jecorina), T.시트리노비리다(T. citrinoviridae), T.롱지브라키아툼(T. longibrachiatum), T.바이렌스(T. virens), T.하지아눔(T. harzianum), T.아스페렐룸(T. asperellum), T.아트로비리다(T. atroviridae), T.파라리세이(T. parareesei), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), F.그라미네아눔(F. gramineanum), F.슈도그라미네아룸(F. pseudograminearum), F.베네나툼(F. venenatum), 지베렐라 후지쿠로이(Gibberella fujikuroi), G.모닐리포르미스(G. moniliformis), G.제아에(G. zeaea), 넥트리아 헤마토코카(Nectria (Haematonectria) haematococca), 스타키보트리스 차르타룸(Stachybotrys chartarum), S.클로하로나타(S. chlorohalonata), 클라비셉스 푸르푸르에(Claviceps purpurea), 메타히지움 아크리둠(Metarhizium acridum), M.아니소플리에(M. anisopliae), 빌로시클라바 바이렌스(Villosiclava virens), 오피오코르다이셉스 시넨시스(Ophiocordyceps sinensis), 아크레모니움 크리소제넘(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum), 및 세도스포리움 아피오퍼뭄 (Scedosporium apiospermum), 및 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 룩노웬스(Chrysosporium lucknowense), 마이셀리오프토라 테르모필(Myceliophthora thermophile), 휴미콜라 인솔렌(Humicola insolens), 및 휴미콜라 그리세(Humicola grisea)로 구성된 그룹 유래이며,가장 바람직하게는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)이다. 숙주세포의 비제한적인 예로서 박테리아세포, 바람직하게는 그람 양성 바실리(gram positive Bacilli (예, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), B.리체니포르미스(B. licheniformis), B.메가테리움(B. megaterium), B.아밀로리큐파시엔스(B. amyloliquefaciens), B.푸밀러스(B. pumilus)), 그람 음성 박테리아(gram-negative bacteria (예, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), 엑티노마이세탈레스(actinomycetales (예, 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.)) 및 효모 (yeasts (예, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica))이다.
일 실시예에서, 숙주세포는 곰팡이 세포, 바람직하게는 트리코더마(Trichoderma) 또는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)와 같은 사상 곰팡이 세포이다. 일 실시예에서, 숙주세포는 박테리아세포, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), B.리체니포르미스(B. licheniformis), B.메가테리움(B. megaterium), B.아밀로리큐파시엔스(B. amyloliquefaciens), B.푸밀러스(B. pumilus)와 같은 그람 양성 바실러스 세포이다.\
“재조합 세포” 또는 “재조합 숙주세포”는 상기 세포 또는 숙주세포에 고유하지 않은 핵산서열을 포함하도록 유전자 변형되거나(modified), 변조한(altered) 세포 또는 숙주세포를 지칭한다. 일 실시예에서, 유전자 변형은 폴리 뉴클레오타이드를 숙주세포의 게놈에 통합시키는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 외인성이다.
본 발명에서 사용된 ”발현”은 전사, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 숙주세포에서 폴리펩타이드의 생산에 관련된 임의의 단계를 포함한다. 발현 후에는 숙주세포 또는 발현 생성물을 수확, 회수할 수 있다.
용어 “발현 벡터”는 그의 전사를 위해 제공되는 추가적인 세그먼트에 작동가능하게 연결된 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 세그먼트를 포함하는 선형 또는 원형의 DNA 분자를 나타낸다. 이러한 추가적인 세그먼트는 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 원점, 하나 이상의 선택 가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 담체 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 둘 모두의 요소를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 일반적으로 적용되는 임의의 발현 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 주로 벡터가 도입될 숙주세포에 의존적일 수 있다. 따라서, 벡터는 자율복제 벡터, 즉, 염색체 외 공간에 존재하는 복제 벡터일 수 있으며, 이의 복제는 염색체의 복제와 무관하다. 예, 플라스미드. 선택적으로 벡터는 숙주세포 내로 도입될 때, 숙주세포의 게놈 내로 통합되고, 통합된 염색체와 함께 복제될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 단백질의 생산과 관련하여 본 발명에서 사용된 용어 "재조합 생산된" 또는 "재조합적으로 생산된"은 본 기술분야의 일반적인 정의에 따라 정의된다.
특정 미생물 공급원과 관련하여 본 발명에서 사용된 용어 "~로부터 수득된" 및 "수득 가능한"은 폴리뉴클레오타이드가 특정 공급원(동종 발현)에 의해 또는 공급원으로부터 유전자가 삽입된 세포에 의해 발현되는 것을 의미한다(이종 발현).
용어 “효소 조성물(enzyme composition)”은 다수의 상이한 효소 활성을 포함하는 제제; 또는 단일성분 효소, 바람직하게는 박테리아 또는 곰팡이 종으로부터 일반적인 재조합 기술을 사용하여 유래된 개별적으로 발효되고 단리 및 정제가능하며 상이한 종 바람직하게는 곰팡이 또는 박테리아 종으로 유래될 수 있는 효소의 혼합물 또는 재조합 만나나아제의 생산을 위한 숙주세포로서 작용하면서도, 동시에 다른 효소를 생산하는 미생물의 발효 생산물과 같은 단일 종의 미생물로부터 분리 및 정제 가능한 통상적인 효소 발효 생성물을 의미한다.
DNA 세그먼트에서, “작동가능하게 연결된”이라는 용어는 세그먼트가 의도된 목적을 위해 함께 작동하도록 배열되는 것을 의미하며, 예를 들어, 전사는 프로모터에서 개시되고 코딩 세그먼트를 통해 종결자로 진행된다.
용어 “프로모터”는 RNA 중합 효소의 결합 및 전사의 개시를 위해 제공되는 DNA 서열을 함유하는 유전자의 일부를 의미한다. 프로모터 서열은 일반적으로 5` 비-암호화 부위에서 발견되지만 항상 그런 것은 아니다.
용어 “분비 신호 서열”은 더욱 큰 폴리펩타이드의 일부로서, 생산되는 숙주세포의 분비 경로를 통해 더욱 큰 폴리펩타이드를 지시하는 폴리펩타이드(“분비 펩타이드”)를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 분비 신호 서열은 고유한 것일 수 있으며, 다른 공급원 유래의 분비 신호 서열 또는 캐리어 서열로 대체될 수도 있다. 숙주세포에 따라, 더 큰 펩타이드는 분비 경로를 통해 통과하는 동안 분비 펩타이드를 제거하기 위해 절단될 수 있다.
용어 “코어 영역(core region)”이라는 용어는 변형 또는 변경 되거나 되지 않을 수 있지만, 본래의 활성의 적어도 일부를 보유하는 효소의 도메인을 의미한다; 본 기술 분야에 알려진 촉매 도메인은 기능적으로 남아있다. 본 발명의 만나나아제의 코어 영역은 Man7, 서열번호 16의 27-331 아미노산, Man6, 서열번호 12의 35-224 아미노산 또는 Man14, 서열번호 20의 17-314 아미노산과 정렬된 아미노산에 상응한다.
용어 “링커” 또는 “스페이서”는 예를 들어, 효소 코어 및 탄수화물 결합 모듈(carbohydrate binding module (CBM)) 또는 임의의 다른 효소 하이브리드와 같은 결합 도메인을 포함하는 효소와 같은 다중 도메인 단백질의 도메인 사이 또는 융합 폴리펩타이드로서 생성된 2개의 단백질 또는 폴리펩타이드 사이에 존재할 수 있는 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를들어, 효소 코어를 코딩하는 DNA 서열, 링커를 코딩하는 DNA 서열 및CBM을 코딩하는 DNA 서열을 하나의 오픈 리딩 프레임에 순차적으로 융합시키고 이 구조물을 발현시킴으로써, CBM과 효소 코어의 융합단백질이 제공된다.
효과적인 양은 선택된 분야에서 만노스를 분해하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 “세제 조성물” 및 “세제”는 달리 명시되지 않는 한 고체, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 중질 세제, 특히 세정 세제; 액체, 젤 또는 페이스트 형태의 다목적 세정제, 특히 중질 액상형(heavy-duty liquid (HDL) types); 액체 미세-직물 세제; 수식 식기세척제 또는 경질 식기세척제, 특히 고-발포형의 식기세척제; 다양한 정제, 과립, 액체 및 행굼 보조제 형태를 포함하는 가정용 및 시설용 기계 식기세척제; 액체 세정 및 소독제, 차 또는 카펫 샴푸, 욕실 세정제; 금속 세척제; 뿐만 아니라, 표백 첨가제 및 “얼룩-스틱” 또는 전 처리 타입과 같은 세척 보조제를 포함한다. “세제”, “세제 조성물” 및 “세제 제형”은 오염된 물체의 세척을 위해 세척 매체에 사용하기 위한 혼합물과 관련하여 사용된다. 일 실시예에서, 상기 용어는 직물 및/또는 의복을 세탁하는 것과 관련하여 사용된다(예를 들어, “세탁 세제”). 다른 실시예에서, 상기 용어는 식기, 식기류 등을 세척하는데 사용되는 것과 같은 다른 세제를 의미한다(예를 들어 “식기세척 세제”). 본 발명은 임의의 특정한 세제 또는 조성물로 제한되지 않는다. 본 발명의 만나나아제 외에도, 상기 용어는 예를 들어, 계면활성제, 빌더, 킬레이터, 또는 킬레이트제, 표백 시스템 또는 표백 성분, 폴리머, 직물 컨디셔너, 폼 부스터, 비누 거품 억제제, 염료, 향료, 탈지 억제제, 형광 발광제(optical brightener), 살세균제(bactericides), 살곰팡이제(fungicides), 소일 서스펜딩제(soil suspending agents), 부식방지제(anticorrosion agents), 향수성 물질(hydrotropes), 섬유 발색제(fabric hueing agents), 분산제(dispersants), 이염 억제제(dye transfer inhibiting agents), 형광 표백제(fluorescent whitening agents), 소일 릴리즈 폴리머(soil release polymers), 재침착 방지제(anti-redepositions agents), 수축 방지제(anti-shrink agents), 주름 방지제(anti-wrinkling agents), 살세균제(bactericides), 결합제(binders), 담체(carriers), 염료(dyes), 효소 안정화제(enzyme stabilizers), 섬유 유연제(fabric softeners), 충전제(fillers), 거품 조절제(foam regulators), 향수(perfumes), 색소(pigments), sod 억제제(sod suppressors), 솔벤트(solvents), 및 액체 세제를 위한 구조결정제, 구조 탄성화제(structure elasticizing agents), 효소 억제제 또는 안정화제(enzyme inhibitors or stabilizers), 효소 활성화제(enzyme activators), 전이효소(transferase(s)), 가수분해 효소(hydrolytic enzymes), 산화 환원효소(oxido reductases), 청분작용제(bluing agents) 및 형광 염료(fluorescent dyes), 항산화제(antioxidants), 및 용해보조제(solubilizers)를 함유할 수 있는 세제를 포함하는 것을 의미한다.
용어 “직물”은 실(yarns), 실 중간체(yarn intermediates), 섬유(fibers), 부직포 물질(non-woven materials), 천연 물질(natural materials), 합성 물질(synthetic materials), 및 임의의 다른 직물 물질, 이들 물질로 만들어진 직물 및 섬유로 만들어진 제품을 의미한다(예를 들어, 의복, 린넨 및 기타 물품). 상기 직물 및 섬유는 편직물, 직포, 데님, 편직물, 펠트, 실 및 타월 형태일 수 있다. 상기 직물은 면, 아마/린넨(flax/linen), 황마(jute), 모시(ramie), 사이잘(sisal) 또는 코이어를 포함하는 천연 셀룰로오스 화합물 또는 비스코스/레이온(viscose/rayon), 모시(ramie), 셀룰로오스 아세트산 섬유(cellulose acetate fibers (tricell)), 라이오셀(lyocell) 또는 이의 혼합과 같은 인공 셀룰로오스 화합물(예를 들어, 나무 펄프 유래의)과 같은 셀룰로오스 계일 수 있다. 또한, 상기 직물 또는 섬유는 울, 카멜, 캐시미어, 모헤어, 토끼 및 비단을 포함하는 천연 폴리아마이드 또는 나일론, 아라미드, 폴리에스테르, 아크릴릭, 폴리프로필렌 및 스판덱스/엘라스테인, 또는 이의 혼합과 같은 합성 폴리머와 같은 비셀룰로오스 계일 수 있을 뿐만 아니라, 셀룰로오스계 및 비셀룰로오스계의 혼합 섬유일 수 있다. 혼합의 예로, 면 및/또는 레이온/비스코스와 울, 합성 섬유(예, 폴리아마이드 섬유, 아크릴 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리비닐 알코올 섬유, 폴리 염화 비닐 섬유, 폴리우레탄 섬유, 폴리우레아 섬유, 아라미드 섬유) 및 셀룰로오스 함유 섬유(예, 레이온/비스코스, 모시, 아마/린넨, 황마, 셀룰로오스 아세테이트 섬유, 라이오셀)와 같은 하나 이상의 동반 물질의 혼합이다. 섬유는 통상적인 세척가능한 세탁물, 예를들어, 염색된 가정용 세탁물일수 있다. 섬유 또는 의류라는 용어가 사용되는 경우, 더욱 광범위한 직물을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 “안정성”은 저장 안정성 및 사용 중 안정성(예, 세척 과정 중(세척 안정성))을 포함하며, 시간 함수로 본 발명의 만나나아제의 안정성을 반영한다. 예를 들어, 특히 세제 용액에서 만나나아제를 용액에 보관했을 때 얼마나 많은 활성이 유지되는지를 의미한다. 상기 안정성은 예를 들어, pH, 온도, 세제 조성물(예 프로테아제, 안정제, 빌더, 계면활성제 등의 많은 요소에 의해 영향을 받는다. 상기 만나나아제 안정성은 실시예에 기재된 바와 같이 '활성 분석'을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 “만나나아제 활성”은 폴리펩타이드의 만난 분해 활성을 의미한다. 본 발명에서 사용된 분해 또는 변형은 만노스 단위가 만나나아제에 의해 만난 다당체에서 가수분해되는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 만난 분해 활성은 해당 기술 분야에 공지된 표준 시험 절차에 따라 시험될 수 있다. 실시예 7은 만나나아제 활성을 측정하기 위한 표준 방법의 예를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 적어도 하나의 효소가 만나나아제 활성을 갖는다. 본 발명의 상기 효소 조성물에 포함된 만나나아제는 다양한 화학 환경, 바람직하게는 세제 조성물에서 만난 함유 물질을 분해 및 변형하는데 적합하다.
본 발명의 일 실시예에서, 효소 조성물은 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 큐티나아제(cutinase), 아밀라아제(amylase), 탄수화물 분해효소(carbohydrase), 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase), 펙테이트릴라아제(pectatelyase), 펙티놀 분해효소(pectinolytic enzyme), 에스터라아제(esterase), 파이타아제(phytase), 만나나아제(mannanase), 아라비나아제(arabinose), 갈락타나아제(galactanase), 자일라나아제(xylanase), 옥시다아제(oxidase), 잔타나아제(xanthanase), 자일로글루카나아제(xyloglucanase0, DNAse, 락카아제(laccase), 및/또는 퍼옥시다아제(peroxidase)로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 프로테아제 아밀라아제 셀룰라아제 및 리파아제로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소를 더 포함할 수 있다.
만나나아제 및 추가적인 효소를 포함하는 본 발명의 효소 조성물은 상승 효과를 제공하기에 유리하다. 이러한 추가 효소는 만나나아제를 포함하는 본 발명의 효소 조성물이, 세제에, 예를 들어 얼룩 세척 시에 사용되는 것이 바람직하다. 특히 만나나아제와 함께 작용하여 유리한 시너지를 일으키는 효소는 아밀라아제, 프로테아제 및 셀룰라아제 또는 만나나아제, 아밀라아제 및 프로테아제를 포함하는 조성물과 같은 이의 조합이다.
선택된 효소(들)의 일반적인 특성은 선택된 세제와 호환 가능하여야 하며(즉, pH 최적화, 다른 효소 및 비 효소 성분과의 호환성 등), 상기 효소(들)는 유효한 양으로 존재하여야 한다.
고형 세탁 세제에 사용하기 위한 조성물은 예를 들어, 조성물의 중량을 기준으로 0.000001%-5%, 예를들어, 0.000005%-2%, 예를들어, 0.000005%-1%, 예를들어, 0.000005%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.
세탁 액체에 사용하기 위한 조성물은 예를들어, 조성물의 중량을 기준으로 0.000005%-3%, 예를들어, 0.000005%-1%, 예를들어, 0.000005%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.
자동 식기세척에 사용하기 위한 조성물은 예를들어, 조성물의 중량을 기준으로 0.000001%-5%, 예를들어, 0.000005%-2%, 예를들어, 0.000005%-1%, 예를들어, 0.000005%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 세제 조성물은 바(bar), 균질 정제(homogenous tablet), 2개 이상의 층을 갖는 정제, 하나 이상의 구획을 갖는 파우치, 일반 또는 소형 분말, 과립(granule), 페이스트(paste), 젤 또는 일반, 소형 또는 농축액의 제형이다. 일 실시예에서, 상기 세제 조성물은 세탁 세제 조성물, 바람직하게는 액체 또는 고체 세탁 세제 조성물일 수 있다. 층(layer, 동일 또는 다른 상의), 파우치뿐만 아니라 기계 투여 유닛을 위한 제형과 같은 다양한 세제 형태가 존재한다.
일 실시예에서, 상기 효소 조성물은 추가적으로 다음을 포함한다.
a. 벤조산(benzoic acid), 벤조산 나트륨(sodium benzoate), 히드록시벤조에이트(hydroxybenzoate), 시트르산(citric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 보존제;
b. 선택적으로, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol), 당(a sugar), 당 알코올(sugar alcohol), 젖산(lactic acid), 붕산(boric acid), 붕산 유도체(boric acid derivative), 방향족 붕산염 에스테르(aromatic borate ester), 페닐 보론산 유도체(phenyl boronic acid derivative), 펩타이드, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 폴리올;
c. 선택적으로, 매개체(mediator)와 같이 또는 없이, 프로테아제(proteases), 아밀라아제(amylases), 셀룰라아제(cellulases), 리파아제(lipases), 자일라나아제(xylanases), 만나나아제(mannanases), 큐티나아제(cutinases), 에스터라아제(esterases), 파이타아제(phytases), DNAses, 펙티나아제(pectinases), 펙티놀 분해효소(pectinolytic enzymes), 잔타나아제(xanthanases), 지일로글루카나아제(xyloglucanases), 락카아제(laccases), 페록시다아제(peroxidases) 및 옥시다아제(oxidases), 또는 이의 조합 로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
d. 선택적으로 말토덱스트린(maltodextrin), 곡물가루(flour), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 설페이트(sulphate), 소듐 설페이트(sodium sulphate) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제. 상기 효소 조성물은 추가 성분과 호환가능하고, 다양한 용도에서 효소 조성물의 적용성을 향상시킨다.
염화 나트륨 및 황산 나트륨과 같은 염은 건조 보조제로서 기능한다.
제1관점의 실시예에서, 본 발명의 효소 조성물은 용액, 분산액, 페이스트, 분말, 과립(granule), 그래뉼레이트(glanulate), 코팅 그래뉼레이트, 정제, 케이크, 결정, 결정 슬러리, 젤 또는 펠렛과 같은 액체 조성물 또는 고체조성물의 제형이다.
또한, 본 발명은 만난을 분해 및 세탁 공정에서의 용도와 같은 본 명세서에 개시된 것과 같은 효소 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다. 효소 조성물은 또한, 세척 동안 또는 세척 이전에 세제 위에 첨가되고, 예를 들어, 액체, 젤, 분말, 과립 또는 정제의 제형인 세정제 또는 부스터에 사용될 수 있다. 또한, 효소 조성물 및 세제 성분은 직물과 같은 담체에 담길 수 있다.
일 실시예에서, 만나나아제는 pH 5.5 내지 8.5에서 적어도 50%의 상대 활성을 갖는다. 상대 활성은 실시예 7에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 만나나아제는 45℃ 내지 65℃의 온도 범위에서 적어도 30%의 상대 활성을 갖는다.
주변 온도보다 높은 온도에서 활성을 유지하는 만나나아제를 제공하는 것은 그러한 환경에서 만난 분해가 요구되는 분야에 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 만나나아제는 알칼리성 조건에서 우수한 안정성 및 활성을 가질 수 있으며, 이는 세제 용도 및 바이오 매스의 가공에 유용하다.
일 실시예에서, 상기 만나나아제 효소는 서열번호 12와 적어도 또는 약 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 상기 만나나아제 효소는 서열번호 16과 적어도 또는 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 상기 만나나아제 효소는 서열번호 20과 적어도 또는 약 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 상기 만나나아제 효소는 서열번호 12[Man6], 서열번호 16[Man7], 서열번호 20[Man14]와 100% 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 본 발명의 효소 조성물은 제2관점의 재조합 숙주세포를 포함한다.
제2관점의 일 실시예에서, 재조합 폴리펩타이드는 만나나아제 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것 외에 다음 중 적어도 하나를 포함하는 융합 단백질이다:
바실러스 아밀로리퀘파시엔(Bacillus amyloliquefaciens) 자일라나아제 신호 서열과 같은 분비 신호 서열을 제공하는 아미노산 서열;
친화성 태그, His-tag와 같은 정제를 용이하게 하는 아미노산 서열;
CBM과 같은 담체인 아미노산 서열과 같은 생산을 향상시키는 아미노산 서열;
효소 활성을 갖는 아미노산 서열; 및
탄수화물 결합 부분과 같은 결합 친화도를 가지는 융합 단백질을 위해 제공되는 아미노산 서열.
탐체로서의 CBM, 탄수화물 결합 부분은 예를들어, Trichoderma에서의 생산에서 유리하다.
일 실시예에서, 숙주세포는 비병원성이다. 이는 사료 및 가정용 세탁 세제와 같은 세제 분야에서 숙주세포의 사용에 특히 유리하다.
제5관점의 실시예에서, 만난 함유 물질은 식물 기반의 물질, 직물, 폐수, 오물, 오일 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 만난 함유 물질은 재활용 폐지; 기계식 펄프, 화학 펄프, 반 화학 펄프, 크래프트(kraft) 또는 다른 제지 펄프; 침수처리(retting) 공정을 거친 섬유; 또는 구아검(guar gum) 또는 로커스트 빈 검(locust bean gum)함유 물질이다.
또 다른 실시예에서, 분해 또는 변형은 만나나아제가 활성을 나타내는 수성 환경에서 수행된다.
바람직한 실시예에서, 상기 방법으로 분해되거나 변형된 만난 함유 물질은 선택적으로 만난 얼룩을 가지는 직물 또는 섬유상에 있다. 직물 또는 섬유에 부착된 만난의 분해에 의해, 먼지 또는 소일(soil)은 방출되어, 만난 또는 만난 얼룩과 다시 결합할 수 없다. 직물 또는 섬유는 예를들어, 플렉스/린넨(flax/linen), 황마(jute), 라미(ramie), 사이잘(sisal) 또는 코이어 또는, 비스코스/레이온(viscose/rayon), 모달(modal), 셀룰로오스 아세테이트 섬유(cellulose acetate fibers (tricell)), 라이오셀(lyocell), 큐프로(cupro) 또는 이의 혼합을 포함하는 인공 셀룰로오스섬유(예, 목재 펄프로부터 유래)와 같은 임의의 물질일 수 있다.
제6관점의 일 실시예에서, 상기 동물은 단일 위 동물 또는 반추 동물이다. 다른 실시예에서, 동물은 육계(broiler chicken), 산란용 닭(egg-laying chicken), 돼지(swine), 칠면조(turkey), 또는 어류와 같은 양식 유기체이다. 또 다른 실시예에서, 동물은 반추동물(ruminant)이다.
일 실시예에서, 사료는 옥수수(maize) 및 콩(soybean)를 포함하거나 이로 구성된다.
일 실시예에서, 식물 유래의 단백질 공급원은 콩(soy), 보리(barley), 밀(wheat), 호밀(rye), 귀리(oats)와 같은 곡류, 또는 옥수수를 포함하거나 이로 구성된다
일 실시예에서, 만난 함유 생성물 또는 부산물은 팜 커넬(palm kernel), 구아박(guar meal) 또는 야자박(copra meal)을 포함하거나 이로 구성된다.
제6관점 또는 제7관점의 실시예에서, 동물 사료 또는 사료 보충제는 습윤 조성물 또는 건조 조성물의 형태로 제형화 된다.
일 실시예 또는 제9관점에서, 세제는 바람직하게는 분말, 바, 정제, 파우치, 페이스트, 젤, 액체, 과립(granule) 또는 그래뉼레이트(granulate)의 액체 세제 또는 고체 세제이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 만나나아제 효소를 포함하는 조성물은 펄프 및 제지 산업, 바이오표백, 섬유 변형, 배수 개선 및 오일 산업, 즉 오일 드릴링 또는 수압파쇄 또는 드릴링 플루이드(drilling fluids)의 점성을 조절하기 위한 오일 서비스 산업에 사용된다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 만나나아제 효소를 포함하는 조성물은 직물 및 세제 산업, 바이오매스 가공 및 바이오매스 가수분해, 바람직하게는, 바이오연료, 전분, 펄프 및 제지, 식품, 제빵, 사료 및 음료산업에서 사용된다.
일 실시예에서, 상기 만나나아제는 엔도-베타-1,4-만노시딕 결합을 무작위적으로 가수분해한다.
일 실시예에서, 만나나아제는 박테리아 공급원으로부터 수득되거나 유도될 수 있다.
일 실시예에서, 만나나아제는 적어도 하나의 추가적인 폴리펩타이드와 융합되어 융합 폴리펩타이드를 형성할 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드 또는 추가적인 폴리펩타이드는 만나나아제의 촉매 또는 결합 활성 이외의 다른 촉매 또는 결합 활성을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 추가적인 폴리펩타이드는 탄수화물 결합 모듈을 포함하거나 이로 구성되며, 이는 선택적으로 만나나아제와 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래된 다른 단백질 또는 효소의 단편이다
일 실시예에서, 만나나아제는 링커를 사용하여 추가적인 폴리펩타이드에 연결된다.
일 실시예에서, 제1관점의 효소 조성물, 제2관점의 재조합 숙주로부터 수득되는 효소 또는 제3관점의 재조합 폴리펩타이드를 함유하는 세척 용액으로 기계 세척 공정의 세척 사이클 동안 섬유를 처리하는 단계를 포함하는 섬유의 기계처리 방법이 제공한다.
일 실시예에서, 제1관점의 효소 조성물, 제2관점의 재조합 숙주로부터 수득되는 효소 또는 매개체가 있거나 없는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulose), 리파아제(lipase), 자일라나아제(xylanase), 만나나아제(mannanase), 큐티나아제(cutinases), 에스터라아제(esterases), 파이타아제(phytases), DNAses, 펙티나아제(pectinases), 펙티놀리틱 효소(pectinolytic enzymes), 펙테이트 라이아제(pectate lyase), 카르보하이드라아제(carbohydrase), 아라비나아제(arabinose), 갈락타나아제(galactanase), 잔타나아제(xanthanases), 지일로글루카나아제(xyloglucanases), 락카아제(laccases), 페록시다아제(peroxidases) 및 옥시다아제(oxidases)로부터 선택되는 효소와 제3관점의 폴리펩타이드의 섬유 세정 및/또는 섬유 얼룩 제거를 위한 세정 조성물에서의 용도를 제공한다.
일 실시예에서, 제1관점의 효소 조성물, 제2관점의 재조합 숙주로부터 수득되는 효소 또는 매개체가 있거나 없는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulose), 리파아제(lipase), 자일라나아제(xylanase), 만나나아제(mannanase), 큐티나아제(cutinases), 에스터라아제(esterases), 파이타아제(phytases), DNAses, 펙티나아제(pectinases), 펙티놀리틱 효소(pectinolytic enzymes), 펙테이트 라이아제(pectate lyase), 카르보하이드라아제(carbohydrase), 아라비나아제(arabinose), 갈락타나아제(galactanase), 잔타나아제(xanthanases), 지일로글루카나아제(xyloglucanases), 락카아제(laccases), 페록시다아제(peroxidases) 및 옥시다아제(oxidases)로부터 선택되는 효소와 제3관점의 폴리펩타이드의 바닥, 벽, 욕실 타일과 같은 단단한 표면을 세정하기 위한 세정 조성물에서의 용도를 제공한다.
일 실시예에서, 제1관점의 효소 조성물, 제2관점의 재조합 숙주로부터 수득되는 효소 또는 매개체가 있거나 없는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulose), 리파아제(lipase), 자일라나아제(xylanase), 만나나아제(mannanase), 큐티나아제(cutinases), 에스터라아제(esterases), 파이타아제(phytases), DNAses, 펙티나아제(pectinases), 펙티놀리틱 효소(pectinolytic enzymes), 펙테이트 라이아제(pectate lyase), 카르보하이드라아제(carbohydrase), 아라비나아제(arabinose), 갈락타나아제(galactanase), 잔타나아제(xanthanases), 지일로글루카나아제(xyloglucanases), 락카아제(laccases), 페록시다아제(peroxidases) 및 옥시다아제(oxidases)로부터 선택되는 효소와 제3관점의 폴리펩타이드의 손 또는 기계 설거지용 세정 조성물에서의 용도를 제공한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 관점을 설명하기 위해 제공된다. 이들은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명은 제한하지 않는다.
실시예 1. 스크리닝
신규한 베타-1,4-만나나아제를 동정하기 위해, 공개 데이터베이스(NCBI, EBI) 및 선택된 독점 및 공개 게놈을 스크리닝하였다. 이 작업에 사용된 모든 독점 및 공개 게놈은 표 1에 도시하였다. 모든 히트를 그룹화하고 바실러스에 클로닝하기 위해, 최종적으로 각자 사이의 계통 발생 거리(phylogenetic distance)에 기반하여 박테리아 기원의 유전자 15개를 선택하였다(표 2).
베타-1,4-만나나아제의 스크리닝에 사용된 독점 및 공개 게놈의 목록
종 균주 소스
Bacillus pumilus MS8 ABE
Amphibacillus xylanus NBRC 15112 NCBI
Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 NCBI
Bacillus clausii KSM-K16 NCBI
Bacillus amyloliquefaciens RH1330 ABE
Virigibacillus soli PL205 NCBI
바실러스에 클로닝된 선택된 유전자의 목록. 단백질의 예측된 PFAM 도메인 및 아미노산 길이가 도시됨
서열 이름 종 GH family 길이
orf2511 Bacillus amyloliquefaciens 26 360 aa
AXY_08250 Amphibacillus xylanus 5 497 aa
man7 Bacillus hemicellulosilyticus 5 490 aa
T1Z249.2 Bacillus nealsonii 5 369 aa
man6 Bacillus clausii 5 324 aa
Q9EYQ3 Clostridium cellulolyticum 5 424 aa
YdhT Bacillus cellulosilyticus 26 1183 aa
V5X1N9 Paenibacillus polymyxa 5 588 aa
Q9ZI87 Geobacillus stearothermophilus 5 694 aa
Q49HI4 Bacillus circulans 5 327 aa
orf0659 Bacillus pumilus 5 376 aa
JCM9152_1090 Bacillus hemicellulosilyticus 26 489 aa
D3HC62 Streptococcus gallolyticus 5 487 aa
A0LSH9 Acidothermus cellulolyticus 5 763 aa
man14 Virgibacillus soli 5 482 aa
실시예 2. 박테리아 만나나아제의 바실러스로의 클로닝
달리 언급되지 않는 한, DNA 조작 및 형질전환을 포함하는 분자생물학적 방법은 Sambrook 및 Russell (2001) 및 Harwood 및 Cutting (1990)에 기술된 것과 같은 방법으로 수행되었다. 유전자 man6, man7및 man14는 Pfx Accu Prime Polymerase (Invitrogen)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다.
PCR은 제조사의 지시에 따라 수행되었다. 하기의 PCR 조건은 발현 플라스미드의 구축에 사용되었다: 94℃에서 120초 초기 변성, 이어서 94℃에서 15초의 35사이클, 다음 50/55℃ 중 하나에서 30초의 어닐링, 68℃에서 110/290초의 신장(extension)및 68℃에서 10분간 최종 신장(extension). man7의 증폭을 위해 바실러스 헤미셀룰로오실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) JCM 915의 게놈 DNA가 사용되었다. man6 및 man14는 코돈 최적화없이 합성 유전자로서 주문되었다 (Eurofins MWG, Germany). 클로닝에 사용된 프라이머의 서열은 표 3에 개시되어 있다. 혼성화(hybridization)를 위한 오버행은 밑줄로 표시하였다.
man6, man7 및 man14의 증폭에 사용된 프라이머 목록
주형 프라이머 bp 서열 서열번호
syn. gene man6 Man6_1 39 CAACCGCCTCTGCAGCTTATGCACAAAACGGATTTCACG 　1
syn. gene man6 Man6_2 39 CGGTATATCTCTGTCTTAATCACTCTTAAGCCCATTTTC 　2
gDNA B. hemicellulosilyticus Man7_1 37 CAACCGCCTCTGCAGCTTCTGATGGTCATAGCCAAAC 　3
gDNA B. hemicellulosilyticus Man7_2 36 CGGTATATCTCTGTCTTATTGGATTGTTACATGATC 　4
syn. Gene man14 Man14_1 40 CAACCGCCTCTGCAGCTGCAAGCGGGTTTTATGTAAACGG 　5
syn. Gene man14 Man14_2 39 CGGTATATCTCTGTCTTATTTAATGGTAACGTTATCAAC 　6
pUB110 derivate Vec_1 17 AGCTGCAGAGGCGGTTG 　7
pUB110 derivate Vec_2 21 GACAGAGATATACCGACAGTG 　8
유전자는 NEBuilder®Hifi DNA Assembly Master Mix (NEB, Frankfurt)를 사용하여, 바실러스 린체니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래의 프로모터 PaprE 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 유래의 자일라나아제 신호 펩타이드를 포함하는 pUB110 유도체인 표준 벡터 pEV1 pEV1(도 1)에서 클로닝 되었다. 1:3의 삽입율을 가지는 벡터를 클로닝에 적용하였다. 단편의 총량은 총 부피 20μl에서 0.2 pmol이었다. 샘플을 50℃에서 40분동안 인큐베이션했다. 개발을 목적으로 발현 플라스미드는 Zhang & Zhang 2011에 기술된 바실러스 서브틸리스 SCK6에서 유도된 능력에 의해 형질전환되었다. 형질전환된 세포를 10 mg/l 카나마이신이 보충된 LB(Luria-Bertani) 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 20시간동안 인큐베이션 하였다. 발생한 콜로니를 채취하고, QiaPrep MiniPrep Kit (Qiagen, Hilden)을 사용하여 플라스미드를 분리하였다. 그람 양성 플라스미드 제제에 대한 제조사 권장사항에 따라 분리를 수행하였다. 생어 시퀀싱((GATC, Germany)을 통해 삽입물을 서열분석하고, 만나나아제 Man6, Man7 및 Man14의 성숙 부분에 해당하는 DNA 서열을 밝혀냈다. ClustalW 서열 정렬을 사용하여 서열 비교를 수행하였다(Thompson et al 1994). 최종적으로, 발현 플라스미드를 전기천공법을 통해 적절한 바실러스 생산 균주에 형질전환하였다. 바실러스 생산 균주를 20g/l 트립톤, 10g/l 효모 추출물, 10g NaCl 및 2M 사카로오스를 함유하는 전기천공 배지에서 성장시키고, 10ml를 0.4 OD(600nm)에서 수확하였다. 세포를 0,272M 사카로오스, 1mM MgCl2 및 7mM KH2PO4를 함유하는 전기천공 버퍼로 세척하고, 최종적으로 250μl 전기천공 버퍼에 재현탁하였다. 1.2kV, 150Ω, 50μF 조건에서 전기천공을 수행하였다. 이어서 1ml 전기 천공 배지를 첨가하고 세포를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. 20mg/l의 카나마이신이 보충된 LB 플레이트에 세포를 도말하고 37℃에서 18시간동안 배양하였다. 클론을 상기한 것과 같이 검증하고, 분석 시험을 위한 물질의 생성에 사용하였다. 따라서, 단백질 유도 조건 아래에서, 균주를 표준 발현으로 접종하고 37℃에서 30시간 배양하였다. 상등액을 수거하여 분석 및 적용 테스트에 사용하였다. 유전자 및 효소 특성이 표 4 및 표 5에 제시되어 있다.
바실러스 클라우시( Bacillus clausii ) KSM-K16, 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스( Bacillus hemicellulosilyticus ) JCM 9152 및 비르기바실러스 솔라이( Virgibacillus soli ) PL205 유래의 GH5 패밀리 만나나아제 암호화 유전자의 정리.
유전자 SP 포함 길이 (bp) 서열 번호
man6 975 9
man7 1473 13
man14 1449 17
바실러스 클라우시( Bacillus clausii ) KSM-K16, 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스( Bacillus hemicellulosilyticus ) JCM 9152 및 비르기바실러스 솔라이( Virgibacillus soli ) PL205 유래의 GH5 패밀리 만나나아제 암호화 유전자로부터 추론된 아미노산 서열의 정리.
인간 단백질 No of AAs Length of SS CBM Predicted MW (Da), ss not included Predicted pI, ss not included 서열 번호
Man6 324 35 31.84 4.56 11
Man7 490 21 Yes 51.36 4.81 15
Man14 482 16 Yes 50.68 4.35 19
실시예 3: 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)에서 박테리아 만나나아제 man6 및 man7의 PCR-클로닝
대장균 형질전환, 시퀀싱 등에서 E.coli DNA의 분리 및 효소처리(예, 플라스미드 DNA의 분리 DNA 단편을 생성하기 위한 DNA의 분해)에 표준 분자 생물학 방법이 사용되었다. 기본적인 사용 방법은 효소, 시약 꼬는 키트 제조업체가 설명하거나 표준 분자 생물학 핸드북에 기재된 것과 같이 수행되었다(예, Sambrook and Russell (2001)).
바실러스 클라우시(Bacillus clausii) 및 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) 유래의 Man6 및 Man7는 각각 트리코더마 리세이에서 발현을 위해 클로닝되었다. 유전자는 트리코더마 리세이에 대한 코돈 최적화를 갖는 합성 유전자를 사용하여 PCR 클로닝되었다. man6 및 man7의 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 PCR 및 새로운 클로닝 부위를 사용하여 제거하였다. 프라이머의 서열은 표 6에 제시되어있다(서열번호 21 내지 24).
바실러스 클라우시( Bacillus clausii ) 및 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스( Bacillus hemicellulosilyticus ) 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머로 사용된 올리고 뉴클레오타이드.
주형,
(합성) DNA 기원 		올리고 뉴클레오타이드 길이 (bp) 서열 서열 번호
Bacillus hemicellulosilyticus BMAN1 60 5'-AGTCAATCGCG ACAAGCGCCAGACCCACTCGGGCTTCTACATCGAGGGCTCGACGCTCTA-3' (s) 21
Bacillus hemicellulosilyticus BMAN2 46 5'-CGCGCCGGATC CTTACTGGATCGTGACGTGGTCCAGGTAGATGGCG-3' (as) 22
Bacillus clausii BMAN3 60 5'-AGTCAATCGCG ACAAGCGCCAGAACGGCTTCCACGTCTCCGGCACGGAGCTCCTGGACAA-3' (s) 23
Bacillus clausii BMAN4 50 5'-CGCGCCGGATC CTTAGTCGCTCTTCAGGCCGTTCTCGCCGTAGACGATGCG-3' (as) 24
괄호안의 “s”는 센스 가닥(sense strand)이며, “as”는 안티센스 가닥(antisense strand)이다.
유전자를 표 6에 기재된 프라이머를 사용하고 반응에서 주형으로서 합성 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 바실러스 클라우시(Bacillus clausii) man6 및 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) man7의 PCR 혼합물은 각각 Phusion HF Polymerase (NEB/BioNordika, Finland)를 위한 1x HF 버퍼, 1μM의 각각의 프라이머, 3% DMSO (Thermo Fisher Scientific), Phusion High-Fidelity Polymerase의 1유닛 (NEB/BioNordika, Finland) 및 50 ng의 상응하는 플라스미드 DNA를 함유한다. PCR 반응의 조건은 다음과 같았다: 98℃에서 30 초의 초기 변성, 이어서 98℃ 에서 10초의 28사이클, 다음 45/50/55/60℃ 중 하나에서 30 초 어닐링, 72 ℃에서 45초간 신장 및 72 ℃에서 7 분 동안 최종 연장.
표 6에 기재된 프라이머 조합은 예상 크기를 갖는 DNA 생성물을 생성하였다. PCR 생성물은 아가로즈 젤로부터 GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 분리하고, Nrul 및 BamHI 제한 효소(Thermo Fisher Scientific)으로 절단하고, Nrul 및 BamHI로 절단된 발현 벡터로 클로닝 하였다. 라이게이션 혼합물을 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) XL1-Blue(AH Diagnostics)에 형질전환시키고 50 내지 100μg/ml 앰피실린을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 플레이트에 도말하였다. 몇몇 E.coli 콜로니를 플레이트로부터 수집하고 GenJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific)로 DNA를 분리하였다. 제한효소 절단을 사용하여 양성 클론을 스크리닝하였다. 자체 신호 펩타이드 암호화 유전자가 없는 바실러스 클라우시(Bacillus clausii) man6 및 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) man7 GH5 만나나아제를 시퀀싱하고 플라스미드를 각각 pALK4274 및 pALK4273으로 명명하였다(실시예 6 참조).
실시예 4. 합성 박테리아 만나나아제 man14의 클로닝
대장균 형질전환, 시퀀싱 등에서 DNA의 분리 및 효소 처리(예, 플라스미드 DNA의 분리, DNA 단편 제작을 위한 DNA 소화)에 표준적인 분자 생물학 방법이 사용되었다. 사용된 기본 방법은 효소, 시약 또는 키트의 제조사에 의해 개시되거나 예를들어 Sambrook and Russell (2001)와 같은 표준 분자 생물학 핸드북에 기재된 것과 같다. 게놈 DNA의 분리는 Raeder and Broda (1985)에 상세히 기술된 것과 같이 수행되었다.
버지바실러스 솔리(Virgibacillus soli) 유래의 만나나아제 유전자 man14또한 트리코더마 발현을 위해 클로닝되었다. 버지바실러스 솔리 유래의 GH5 패밀리 만나나아제 Man14를 암호화하는 유전자는 트리코더마 리세이에 대한 코돈 최적화를 가진 합성 구조물로 Genscript에 주문되었다.
man14 유전자를 포함하는 GenScript에서 얻은 플라스미드 DNA를 멸균수에 재현탁하고, 제조업자의 지시에 따라 Nrul 및 BamHI 제한 효소(Thermo Fisher Scientific)로 분해하고, Nrul 및 BamHI로 절단된 발현 벡터로 클로닝 하였다. 라이게이션 혼합물은 Escherichia Coli XL1-Blue(AH Diagnostics)에 형질전환되었으며, 50-100μg/ml 앰피실린을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 플레이트에 도말하였다. 몇몇 E.coli 콜로니를 플레이트로부터 수집하고, GenJet 플라스미드 미니프렙 키트(Thermo Fisher Scientific)로 분리하였다. 양성 클론은 제한 소화(restriction digestion)를 사용하여 스크리닝되었으며, 예상된 크기의 삽입을 포함하는 것으로 나타났다. 발현 플라스미드에 대한 버지바실러스 솔리 man 14의 융합 부위를 시퀀싱하고, 상기 플라스미드를 pALK4414로 명명하였다(구체적인 내용은 실시예 6 참조).
실시예 5. 바실러스에서 재조합 박테리아 GH5 만나나아제 단백질의 생산
바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) 및 버지바실러스 솔리(Virgibacillus soli)로부터 재조합 GH5 만나나아제(Man6, Man7 및 Man14) 단백질을 생산하기 위해 발현 플라스미드를 제작하였다. 구축된 발현 플라스미드는 표 7에 열거되어있다. 재조합 GH5 유전자(man6, man7 및 man14)는 그들 자신의 신호서열 없이 바실러스 린체니포르미스 PaparE 프로모터 및 B.amyloliquefaciens 자일라나아제 신호 펩타이드에 융합되었전사 종결은 강한 종결자에 의해 보장되었으며, 카나마이신 내성 마커는 형질전환체의 선택을 위해 사용되었다. 실시예2에 기재된 바와 같이 형질전환을 수행하였다.
적절한 바실러스 발현 균주 중 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) 및 버지바실러스 솔리(Virgibacillus soli)로부터 Man6, Man7 및 Man14를 생산하기 위해 구축된 발현플라스미드.
만나나아제 (GH5) 단백질 발현 플라스미드
Man6 pEV1 Man6
Man7 pEV1 Man7
Man14 pEV1 Man14
형질전환체의 GH5 생산을 진탕 플라스크 배양액의 배양 상등액으로부터 분석하였다. LB 플레이트로부터 2% 글루코스, 6% 옥수수 스팁 분말(steep powder), 1,3 % (NH4)2HPO4, 0,05 % MgSO4 x 7H2O 및 0,5 % CaCl2를 함유하는 진탕플라스크로 형질전환체를 접종하였다. pH는 pH7.5로 조정하였다. 37℃에서 30시간동안 180rpm에서 성장시킨 후 배양 상등액으로부터, 형질전환체의 GH5 단백질 생산을 분석하였다. 재조합 단백질의 이종 생산은 SDS-PAGE 이후의 쿠마시 염색으로 분석되었다.
실험실 규모의 생물 반응기에서 배양하기 위해 최고의 생산 형질 전환체를 선택했다. 형질전환체를 단백질 유도 조건 및 적합 수율에 도달할때까지 추가 공급하면서, 37℃의 생물반응기에서 배양하였다. 적용 시험을 위해 상등액을 원심분리 또는 여과를 사용하여 상등액을 회수하였다.
실시예 6. 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)에서 재조합 박테리아 GH5 만나나 CBHI, CBHII, EGI, EGII). 아제 단백질의 생산
트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)에서 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) 및 버지바실러스 솔리(Virgibacillus soli)(실시예3 및 4) 유래의 재조합 GH5 만나나아제를 생산하기 위해 발현 플라스미드가 구축되었다. 구축된 발현 플라스미드는 표 8에 나열하였다. 스스로의 신호 서열이 없는 재조합 GH5 유전자(man6, man7 및 man14)는 T.reesei cel6A/cbh2 운반체 및 링커 뒤의 Kex2 프로테아제 인식부위를 가지는 T.reesei cel7A/cbh1 프로모터에 융합시켰다. 전사 종결은 T.ressei cel7A/cbh1 종결자에 의해 보장되었으며, A.nidulans amdS 마커 유전자가 Paloheimo et al. (2003)에 개시된 것과 같이 형질전환체의 선택을 위해 사용되었다.선형 발현 카세트(도 2)는 NotI 소화 이후에 벡터 골격으로부터 분리되었으며, T.reesei 원형질체(protoplast)로 형질전환되었다. 숙주균주는 4개의 주요 T.reesei 셀룰라아제(CBHI, CBHII, EGI, EGII)를 생성하지 않는 것을 사용하였다.형질전환은 아세트아미다아제(acetamidase)를 유일한 질소원(amdS 마커 유전자)으로 선택하여, Karhunen et al. (1993)에서 변형된 Penttila et al.(1987)에서의 방법으로 수행되었다. 형질전환체를 PD상에 포자형성시키기 전에 단분생자(single conidia)를 통해 선별 플레이트에서 정제하였다.
트리코더마 리세이에서 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 헤미셀룰로실리티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus) 및 버지바실러스 솔리(Virgibacillus soli)유래의 Man6, Man7 및 Man14 재조합 단백질을 생산하도록 구축된 발현 카세트. 발현 카세트의 전체 구조는 도 2에 도시된 것과 같다.
만나나아제 (GH5) 단백질 발현 플라스미드 발현 카세트
Man6 pALK4274 7.0 kb NotI
Man7 pALK4273 7.5 kb NotI
Man14 pALK4414 7.6 kb NotI
T. reesei 형질전환을 위한 발현 카세트는 NotI 소화를 통해 벡터 골격으로부터 분리되었다.형질 전환체의 만나나아제 생산을 진탕 플라스크 배양액의 배양 상등액으로부터 분석하였다. PD 슬랜트(slant)로부터 5% KH2PO4로 완충된 50ml의 복합 락토오즈 기반 셀룰라아제 유도 배지(Joutsjoki at al. 1993)를 함유하는 진탕플라스크에 형질전환체를 접종하였다. 형질전환체의 GH5 단백질 생성을 30℃, 250rpm에서 7일간 성장시킨 후 배양 상등액으로부터 분석하였다. 재조합 단백질의 이종생산은 SDS-PAGE와 함께 후속적인 쿠마시 염색으로 분석되었다.
실험실 규모의 생물반응기에서 배양하기 위해 최고의 생산 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체는 전형적인 중온성 곰팡이 배양 온도 및 약 산성 조건 아래에서 1회분(batch) 또는 추가적인 먹이 타입 유형의 공정으로 생물반응기에서 배양되었다. 배지 당이 고갈되거나 적절한 수율에 도달할 때까지 배양을 계속하였다. 적용시험을 위해 원심분리 또는 여과로 상등액을 회수하였다.
실시예 7. DNS-방법에 의한 갈락토만나나아제 활성 분석
50℃ 및 pH7.0에서 5분동안에 갈락토만난(0.3w/w-%) 유래의 환원당의 방출로서 만나나아제 활성(MNU)을 측정하였다. 방출된 환원 탄수화물의 양은 디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid)을 사용하여 분광 광도법으로 측정 하였다.
분석에 사용된 기질 (0,3w/w-%)은 다음과 같이 제조되었다: 0.6g의 로커스트 콩 검 (Sigma G-0753)은 가열 자석 교반기를 사용하여 약 80℃에서 50mM 시트르산 나트륨 버퍼 pH7 (또는 시트르산 인산염 완충액 pH7)에 있었으며, 끓는점까지 가열하였다. 용액을 냉각시키고 연속 교반하면서 차가운 방 (2 내지 8℃)에서 밤새 용해시키고 불용성 잔류물을 원심분리에 의해 제거 하였다. 그 후, 용액을 완충액으로 200 ml까지 채웠다. 기질을 동결된 상태로 저장하고 끓는 수조에서 약 80℃로 가열하여 녹여 실온으로 냉각시키고 사용 전에 조심스럽게 혼합하였다.
분석에 사용된 DNS 시약은 약 4리터의 물에 50g의 3.5-디니트로살리실산(Sigma D-550)을 용해하여 제조하였다. 연속 자기 교반과 함께, 80.0g의 NaOH를 점진적으로 첨가하고 용해시켰다. 1500g의 로쉘 염(Rochelle Salt, K-Na-tartrate, Merck 8087)을 연속적인 교반과 함께 소량씩 첨가하였다. 최대온도 45℃로 조심스럽게 가온한 용액을 실온으로 냉각시키고 5000ml까지 채웠다. 그 후, Whatman 1 필터 종이를 통해 여과하고 실온에서 어두운 병에 저장하였다.
두 개의 시험관 각각에 1.8ml의 기질 용액을 첨가하여 반응을 시작하고, 50℃에서 5 분 동안 평형화시킨 후, 200μL의 적합하게 희석된 효소 용액을 튜브 중 하나에 첨가한 뒤, 볼텍스 혼합기를 사용하여 혼합하고 50℃에서 5분 동안 정확하게 인큐베이션 하였다. 효소 블랭크는 평형화 또는 인큐베이션할 필요가 없었다. 두 튜브에 3.0ml의 DNS 시약을 첨가하여 반응을 중지시키고 혼합하였다. 200μ:의 샘플 용액을 효소 블랭크 튜브에 첨가 하였다. 두 튜브를 끓는 수조에 넣었다. 정확히 5 분 동안 끓인 후, 튜브를 냉각 수조에 넣고 실온으로 냉각시켰다. 540 nm에서 효소 블랭크에 대해 샘플의 흡광도를 측정하고 활성을 교정 곡선으로부터 판독하고 희석 계수를 곱 하였다. 적절한 희석된 샘플은 0.15-0.4의 흡광도 차이를 나타냈다.
360mg의 만노스(SigmaM-6020, 데시케이터(desiccator)에 저장)를 분석 버퍼에 용해시키고, 3, 6, 10 및 14μmol/ml의 만노스를 희석시켜 만노스 스톡 용액으로부터 20mM의 표준 곡선을 제조하였다. 표준은 50℃에서 배양하는 것을 제외하고 샘플과 같이 취급되었다. 540nm에서 시약 블랭크(만노스의 표준 희석액 대신 버퍼 함유)에 대해 흡광도를 측정하였다. 모든 일련의 분석에 대해 보정 곡선을 구성 하였다.
하나의 만나나아제 단위(MNU)는 분석조건 아래에서 1초동안 갈락토만난 유래의 만노스의 1nm에 상응하는 환원력을 갖는 환원성 탄수화물을 생성하는 효소의 양으로 정의되었다(1MNU = 1nkat).
실시예 8. Man6 만나나아제의 정제
세포 및 고체를 4℃에서 10분동안 4000g로 원심 분리하여 발효 배양 배지로부터 제거하였다. 단백질 정제에는 10ml의 상등액을 사용하였다. 샘플을 0.44μm PVDF 막(Millex-HV, Merck Millipore Ltd,Carrigtwohill, IRL)으로 여과하였다. 여과액을 20mM HEPES pH7에 평형화된 HiPrep 26/10 탈염 칼럼(Desalting column) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 로딩하였다. 이어서, 탈염된 샘플을 20mM HEPES pH7로 사전 평형화된 5 ml HiTrap Q HP column (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 로딩하였다. 샘플의 로딩 후, 컬럼을 동일한 버퍼 20ml로 세척하였다. 15 CV에서 선형 염 농도구배 20mM HEPES, 500mM NaCl pH7로 용출하였다. 5ml의 분획을 수집하고 SDS-PAGE에서 분석하였다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 합하고 Vivaspin 20, 10 kDa MWCO 초여과 장치(GE Healthcare)를 사용하여 2ml로 농축시켰다. 농축된 샘플을 20mM MES, 200mM NaCl pH6,5로 평형화된 Superdex 75 26/60 젤-여과 컬럼을 사용하여 추가로 분획하였다. 2ml의 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다. 순수한 만나나아제를 함유하는 분획을 합쳤다. 다른 만나나아제는 동일한 프로토콜이나 탈염 및 이온교환 단계에서 버퍼 조성물을 변경하여 정제하였다. 버퍼 조성물은 표 9에 나타내었다.
이온교환 크로마토그래피에 사용된 버퍼
Mannanase Buffers used in ion exchange chromatography
Man6 20 mM HEPES pH 7
Man7 20 mM HEPES pH 7
Man14 20 mM MES pH 6
정제된 샘플은 순도 95% 이상이었다.
정제된 샘플의 효소 함량을 UV 흡광도 280nm 측정법으로 측정하였다. ExPASy (Server http://web.expasy.org/protparam/). (Gasteiger et al. 2005)를 사용하여 효소의 아미노산 서열의 염기에 대해 각 만나나아제에 대한 활성화 계수를 계산하였다.
정제된 샘플의 효소 활성(MNU)을 실시예 7 에 기재된 것과같이 환원당의 방출로서 측정하였다.
정제된 샘플의 MNU 활성을 정제된효소의 양으로 나누어서 만나나아제의 특이적 활성(MNU/mg)을 계산하였다. 얻어진 값을 실시예 10 및 11에 사용된 효소 용량을 계산하는데 사용하였다.
만나나아제의 pH 프로파일
정제된 만나나아제의 pH 프로파일은 제공된 프로토콜에 대해 약간의 수정을 가하여 Megazyme의 베타-만나자입 정제 분석 아주린-크로스링크된 캐롭 갈락토만난(beta-mannazyme tablet assay Azurine-crosslinked carob galactomannan (T-MNZ 11/14))을 사용하여 결정되었다. 분석의 선형성은 각각의 정제된 효소로 확인되었다. 4 내지 11 사이의 pH 값으로 조정된 40mM 브리튼-로빈슨 버퍼(Britton-Robinson buffer)에서 분석을 수행하였다. 효소 용액을 분석버퍼에 희석하고 500μL의 효소 용액을 50℃의 수조에서 5분동안 평형화한 후, 하나의 기질 정제를 첨가하였다. 10분 후, 10ml의 2% Tris pH12를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응 튜브를 실온에 5분동안 방치한 후, 교반하고 액체를 Whatman No.1 종이 필터로 여과하였다. 기질로부터 청색 염료의 방출을 595nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다. 각 pH에서의 효소 활성은 최적 pH에서의 활성을 100%로 설정한 상대적 활성으로 기재하였다. pH 프로파일은 도 3에 도시하였다.
만나나아제의 상대 활성(%)은 샘플의 만나나아제 활성을 기준 샘플의 만나나아제 활성으로 나누어서 계산된다. pH 프로파일의 경우, 기준 샘플은 최적 pH의 샘플이다. 온도 프로파일의 경우 기준 샘플은 최적 온도의 샘플이다.
만나나아제의 온도 프로파일
정제된 만나나아제의 최적 온도는 제공된 프로토콜에 대해 약간의 수정을 가하여 Megazyme의 베타-만나자입 정제 분석 아주린-크로스링크된 캐롭 갈락토만난(beta-mannazyme tablet assay Azurine-crosslinked carob galactomannan (T-MNZ 11/14))을 사용하여 결정되었다. 40mM 브리튼-로빈슨 버퍼(Britton-Robinson buffer)pH7에서 10분동안 30℃ 내지 90℃의 변온조건에서 분석을 수행하였다. 효소 활성은 최적 온도에서의 활성을 100%로 설정한 상대 활성으로 기재하였다. 온도 프로파일은 도 4에 도시하였다.
만나나아제의 온도 및 pH 특성
Man6은 30 내지 35kDa의 분자량을 갖는다. pH7에서 효소의 최적온도는 50℃ 내지 70℃이다. 상기 효소는 50℃에서 적어도 pH6 내지 pH9의 pH 범위에서 최적 pH를 갖는다. 10분의 반응 시간 및 기질로서 아주린-크로스링크된 캐롭 갈락토만난을 사용하여 최적온도 및 최적 pH를 측정하였다.
Man7은 50 내지 55kDa의 분자량을 갖는다. pH7에서 효소의 최적온도는 40℃ 내지 60℃이다. 상기 효소는 50℃에서 적어도 pH7 내지 pH10의 pH 범위에서 최적 pH를 갖는다. 10분의 반응 시간 및 기질로서 아주린-크로스링크된 캐롭 갈락토만난을 사용하여 최적온도 및 최적 pH를 측정하였다.
Man14은 30 내지 40kDa의 분자량을 갖는다. pH7에서 효소의 최적온도는 50℃ 내지 60℃이다. 상기 효소는 50℃에서 적어도 pH7 내지 pH8의 pH 범위에서 최적 pH를 갖는다. 10분의 반응 시간 및 기질로서 아주린-크로스링크된 캐롭 갈락토만난을 사용하여 최적온도 및 최적 pH를 측정하였다.
실시예 9. 표백제 없는 상업용 세제와 함께 Man6 및 Man7 만나나아제의 얼룩 제거 성능
바실러스(실시예 5) 및 트리코더마(실시예6) 에서 생산된 Man6 및 Man7 만나나아제는 시판 만나나아제 제제 Mannaway ® 4,0 L (Novozymes)와 비교하여 표백제가 없는 상용 세제와 함께 40℃ 및 물경도 16˚dH에서 만나아제 민감성 표준 얼룩의 제거 능력을 테스트 하였다. 하기 Center for test material B.V.(the Netherlands)의 인공적으로 오염된 다음의 테스트 천이 사용되었다: 면 위의 만나나아제 민감 초콜렛 푸딩(E-165), 면 및 폴리에스터/면 위의 색소를 포함하는 로커스트 콩 검 (C-S-73 및 PC-S-73) 및 면 위의 탄소 검정을 가진 구아 검(C-S-43). 직물을 6 cm x 6 cm 견본으로 절단하고 각각 2 조각을 시험에 사용 하였다.
만나나아제를 제외한 다른 모든 효소를 함유하는 시판 중질 액체 세제 A를 세척액 1리터당 4.4g의 농도로 사용하였으며, 효소가 없는 시판 색상 세제 분말을 3.8g/l로 사용하였다. 경도 16˚dH의 합성 수돗물에 세제 함유 세척액을 준비하였다. Protease Savinase® 16L(0.5 w/w%) 및 amylase Stainzyme®(0.4 w/w%)이 시판용 색상 세제 분말을 함유한 사용 경수에 첨가되었고, 액체 세제는 이미 아밀라아제 및 프로테아제를 함유하고 있다. 색상 세제 분말의 세척액의 pH는 약 10이었으며, 액체세제의 pH는 약 8.3 이었다.
만나나아제 투여량은 세제 중량의 0-0.2/0.25% 범위였지만, 평가를 위해, 투여량은 ml 세척액 당 효소 활성 단위 (MNU) 또는 세척액 1L 당 활성 효소 단백질(AEP)의 mg으로 계산되었다. 활성은 실시예 7에 기재된 바와 같이 측정하였다. 각 제제의 AEP 함량은 실시예 8에 정의된 효소 활성을 특정 활성으로 나누어 계산하였다. 대조 샘플은 세제 용액을 함유하지만 만나나아제는 포함하지 않았다.
16˚dH의 경도를 가진 합성 수돗물의 경우, 다음의 스톡 용액을 탈이온수(Milli-Q 또는 동등물)에서 준비하였다.
1000˚d 칼슘-경도를 갖는 스톡 용액: CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, Germany) 26.22 g/l
200˚d 마그네슘-경도를 갖는 스톡 용액: MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, Germany) 8.79g/l H2O
NaHCO3 스톡 용액: NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, Germany) 29.6g/l
13.3ml의 CaCl2 용액, 13.3ml의 MgSO4 용액 및 10.0ml의 새로 제조 된 NaHCO3 용액을 주어진 순서로 부피 플라스크에 첨가하고, 탈 이온수로 1L까지 만들어 혼합 하였다. 물의 경도는 착물형성 적정(complexometric titration)에 의해 측정되었고 정확한 것으로 확인되었다.
얼룩 제거 처리는 다음과 같이 Atlas LP-2 Launder-Ometer에서 수행되었다. 세탁물 온도계는 우선 40℃로 예열되었다. 이어서, 세제, 경도 16 ° dH의 250 ml 합성 수돗물 및 희석 된 효소 (<1.0 ml)를 1.2 리터 용기에 첨가 하였다. 얼룩을 첨가하고 Launder-Ometer를 42rpm의 회전 속도로 40 ℃에서 60 분 동안 작동시켰다. 그 후, 견본을 흐르는 물로 조심스럽게 헹구고 일광으로부터 보호되는 그리드에서 밤새 실내 공기에서 건조시켰다.
얼룩 제거 효과는 L * a * b * 색 공간 좌표 (illuminant D65/10°, 420nm cut)를 사용하여 Konica Minolta CM-3610A 분광 광도계로 반사율 값으로 색을 측정하여 평가되었다. 만나나아제 성능(얼룩 제거 효율)을 나타내는 얼룩의 퇴색은 △L* (delta L*)로 계산되었으며, 이는 효소 처리된 직물의 명도값 L*- 만나나아제 없이 세척액으로 처리된 직물의 명도값 L*을 의미한다(대조군). 최종 결과(총 얼룩 제거 효과)는 각 얼룩의 △L*의 합으로 나타났다. 각 얼룩의 색상 값은 2개의 견본의 평균이다.
시판 액체 세제로 얻은 결과는 도 6-7에 도시되어 있다. 본 발명에 따른 만나나아제는 시판 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L와 비교하여 활성 단위 또는 활성 효소 단백질로서 투여될 때 액체세제와 유사하거나(Man6), 상당히 더 우수한(Man7) 얼룩제거 성능을 갖는다. 발현 숙주, 바실러스 또는 트리코더마에 관계없이 Man6 및 Man7에 대해 유사한 성능이 확인되었다(도 6). 시판 색상 세제 분말 (도 8-9)로 얻어진 결과는 본 발명에 따른 만나나아제가 시판 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L와 비교하여 활성 단위 또는 활성 효소 단백질로서 투여될 때 색상 세제 분말에 비하여 얼룩 제거 성능이 더욱 우수한 것을 보여준다.
실시예 10. 표백제 함유 세제와 함께 Man6 및 Man7 만나나아제의 얼룩 제거 성능
바실러스(실시예 5)에서 생산된 Man6 및 Man7 만나나아제는 40℃ 및 시판 표백제 세제 분말을 사용한 16˚dH의 물경도에서 만나나아제 민감성 표준 얼룩을 제거하는 능력을 시판 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L (Novozymes)와 비교하여 테스트했다. Center for testmaterial B.V.(the Netherlands)의 인공 오염된 3개의 테스트 천이 사용되었다는 점을 제외하고는 실시예 9에 설명된 것과 유사하다: 면 위의 만나나아제 민감 초콜렛 푸딩(E-165), 면 위의 색소를 포함하는 로커스트 콩 검 (C-S-73) 및 면 위의 탄소 검정을 가진 구아 검(C-S-43). 시판 색상 세제 분말을 세척액 1L 당 4.2g의 농도로 사용하였고, 세척액의 pH는 약 9.5였다. 세제에 효소가 포함되지 않았기 때문에, Protease Savinase® 16L(0.5 w/w%) 및 amylase Stainzyme®(0.4 w/w%)이 테스트에 사용된 경수에 첨가되었다.
처리 후 견본의 색상을 측정하고, 실시예 9에 기재한 바와 같이 각각의 3 개의 얼룩의 △L*의 합으로서 결과를 계산하였다.
시판 표백제 함유 세제로 얻은 결과(도 10)는 본 발명에 따른 만나나아제(Man7)가 활성 효소 단백질로서 투여될 때 시판되는 만나나아제 Mannaway® 4,0 L에 비해 상당히 우수한 얼룩 제거 성능을 가짐을 나타낸다. Man6의 결과는 시판 만나나아제와 비교하여 적어도 유사한 성능을 갖는다.
실시예 11. 상업용 액체 세제와 함께 Man14 만나나아제의 얼룩 제거 성능
바실러스에서 생산된 Man14 만나나아제(실시예 5)는 40˚ 및 16˚dH 물 경도에서 시판 중질 액체 세제 B와 함께 만나나아제 감응성 표준 얼룩의 제거 능력을 테스트 하고 시판 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L (Novozymes)와 비교하였다. 테스트 시스템은 Center for testmaterial B.V.(the Netherlands)의 인공 오염된 2개의 테스트 천이 사용되었다는 점을 제외하고는 실시예 9에 설명된 것과 유사하다: 면 위의 만나나아제 민감 초콜렛 푸딩(E-165), 면 위의 색소를 포함하는 로커스트 콩 검 (C-S-73). 시판 중질 액체 세제 B는 세척액 1L 당 5g의 농도로 사용되었고 세척액의 pH는 약 8.3이었다. 세제에 효소가 포함되지 않았기 때문에, Protease Savinase® 16L(0.5 w/w%) 및 amylase Stainzyme®(0.4 w/w%)이 테스트에 사용된 경수에 첨가되었다. 처리 후 견본의 색상을 측정하고, 실시예 9에 기재한 바와 같이 각각의 2 개의 얼룩의 △L*의 합으로서 결과를 계산하였다. 세제 함유 시판 액체로 얻은 결과(도 11 내지 12)는 Man14가 활성 단위 또는 활성 효소 단백질로 투여될 때 시판 제품과 비슷한 액체 세제에서 우수한 성능을 가지는 것을 나타낸다.
실시예 12. 시판 액체 세제에서 Man6 및 Man7 만나나아제의 안정성
바실러스에서 생산된 Man6 및 Man7 만나나아제 제제의 안정성은 현지 슈퍼마켓에서 얻은 OMO 색상 액체에서 테스트 되었으며, 시판 만나나아제 제제 Mannaway® 4,0 L와 비교되었다. 만나나아제 제제는 세제에서 0.5% w/w-%로 첨가되었으며, 뚜껑있는 플라스틱 튜브에서 37℃에서 5주동안 인큐베이션되었다. 30분 인큐베이션 시간을 사용한 것을 제외하고는 실시예 7에 기재된 활성 분석에 의해 특정 간격으로 활성을 측정하였다. 결과는 잔류 활성(%)으로 계산되었으며, 이는 특정 시점에서 취한 샘플의 활성을 샘플의 초기활성으로 나누어서 얻었다.
바실러스 및 트리코더마에서 생산된 Man7 및 트리코더마에서 생산된 Man6의 안정성은 프로테아제를 함유하나 만나나아제는 함유하지 않는 시판 액체 중질 세제 A에서 Mannaway® 4,0 L에 대해 테스트 되었다. 상기 테스트에서, 1%-(w/w)의 만나나아제가 사용되었으며, 샘플을 12주동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
Omo Color에서의 결과(도 13)는 Mannaway® 4,0 L와 비교하여 Man6가 상당히 우수하고 Man7이 유사한 안정성을 가지는 것을 나타낸다. 도 14와 같이, Man7 및 특히 Man6는 다른 시판 액체 세제 A를 사용할 때 Mannaway® 4,0 L보다 더 안정적이었다. 동일한 조건의 다른 테스트에서 얻어진 결과는 Man6가 발현숙주, 바실러스 또는 트리코더마에 관계없이 유사한 안정성을 가지는 것을 보여준다(데이터 나타내지 않음).
안정성 실험 결과는 본 발명에 따른 만나나아제가 37℃와 같은 높은 온도에서 저장될 때에도 몇 주 동안 세제에서 안정하다는 것을 나타낸다. 액체 세제에서의 본 발명에 따른 만나나아제(Man6 및 Man7)의 안정성은 시판 박테리아 만나나아제에 비해 향상되었다.
실시예 13. 육계에서 만나나아제 단독 및 비-전분 다당류 분해 효소와의 조합에 의한 효울 연구
본 발명의 재조합 만나나아제의 효과는 육계의 성장에 대한 연구이다. 재조합 만나나아제를 포함하는 발효 브로스의 초여과액을 건조하고 표적 레벨을 펠렛된 육계의 식단에 단독 또는 시판 자일라나아제 기반 제품과 함께 적용하였다.
옥수수 및 탈피 용매 추출 콩을 기반으로하는 조절 식단은 효소없이 공급되거나 본 발명의 재조합 만나나아제의 다양한 수준으로 단독 또는 표준 용량의 시판 자일라나아제와 조합하여 첨가되었다. 육계의 초기 무게는 30g에서 50g 사이다. 테스트는 3주에서 5주 사이에서 지속된다. 각각의 처리는 각각 10마리의 육계로 최소 6개의 반복으로 구성된다. 각각의 케이스에서 식단은 수분, 조단백질, 조섬유, 지방, 애쉬 및 효소 단백질에 대해 분석되었다.
5개의 식단이 준비되었다:
1) 비보충된 대조군(BD)
2) BD + 만나나아제 1 - 500mg/kg
3) BD + 만나나아제 1 - 1000mg/kg
4) BD + 만나나아제 1 - 500mg/kg + 자일라나아제 1 내지 10mg/kg
5) BD + 자일라나아제 1 내지 10mg/kg
동물의 건강 상태 및 사망률은 육안으로 매일 점검하였다. 0, 14 및 35일에 체중 증가(BW), 사료 섭취(FI) 및 사료 전환율(FCR)을 측정하였다. FCR은 총 소비량을 동일한 기간동안의 체중 증가로 나눈 값으로 계산된다. 재조합 만나나아제의 효과 결정은 동일한 식단 또는 동일한 식단에 자일라나아제를 첨가한 동물의 비교에 기반한다.
실시예 14. 인스턴트 커피 생산
순수한 만난은 커피 배젖의 주요 저장 다당류 성분이며 높은 점도의 원인으로 인스턴트 커피의 기술적 처리에 부정적인 영향을 미치고 건조 중에 에너지 소비를 증가시킨다. 이러한 효과는 단단하고 불용성의 결정구조를 형성하는 결정 구조를 형성하는 만난에 기인한다. β-만나나아제는 종종 펙티나아제 및 셀룰라아제와 같은 다른 효소와 함께 커피 추출물의 점도를 감소시키기 위해 인스턴트 커피 생산 농축 단계에서 첨가된다. 또한, 만나나아제는 인스턴트 커피의 동결 건조 동안 젤 형성을 억제하기 위해 액체 커피 추출물에 존재하는 갈락토만난을 가수분해하는데 사용된다. 또한, 효소 처리의 사용으로 커피 콩 추출물은 증발과 같은 저렴한 기법으로 농축될 수 있다.
테스트는 10℃의 온도 및 0.15% d.s의 효소 용량에서 도 15의 플로우 차트에 따라 수행된다.
본 발명의 만나나아제는 펙티나아제 및 셀룰라아제와 같은 다른 효소로 구성된 혼합물로 테스트되었다.
커피 추출물의 점도는 표준 공정 조건에서 시간이 지남에 따라 크게 증가한다. 그러나 본 발명의 만나나아제를 함유하는 효소 혼합물을 사용하여 점도를 현저히 감소시켜 스프레이-또는 동결 건조와 같은 다운스트림 처리를 개선한다.
실시예 15. 파인애플 가공
파인애플은 글루코만난과 갈락토만난을 포함하는 많은 양의 만난을 함유하기 때문에, 특히 만나나아제는 파인애플 즙(mill juice) 추출 및 정화에 유용하다.
만나나아제는 가치있는 과일 성분의 추출을 개선하고, 농축 전 과일 즙의 점도를 낮추며 최종 제품의 여과 속도와 안정성을 향상시킨다.
파인애플을 고기 분쇄기에서 분쇄하고 1000ml 비커에 500g의 매쉬(mash)를 채웠다. 효소는 21℃에서 60분의 반응시간으로 적용되었다. 그 뒤 압력 프로토콜에 따라 작은 Hafico 프레스로 매쉬를 압착햇다: 0 bar 2 분 - 50 bar 2 분 - 100 bar 2 분 - 150 bar 2 분 - 200 bar 1 분 - 300 bar 1 분 - 400 bar 1분. 얻어진 즙을 4500rpm에서 5분 동안 원심분리하고 탁도 및 점도를 분석하였다.
본 발명의 만나나아제는 효소 혼합물 A, B 및 C에서 테스트 되었다(표 10).
파인애플 매쉬에 첨가하기전에 효소를 먼저 수돗물로 희석하였다.
효소 혼합물
효소 활성 용량 [ppm] 5 ml of
[% 효소 용액]
blank 5 ml H2O
혼합물 A Pectinase 50 0.50%
혼합물 B Pectinase + Arabanase 50 0.50%
혼합물 C Pectinase + Mannanase 50 0.50%
본 발명의 만나나아제를 적용하면 파인애플 가공에서 즙의 수율이 증가하고 탁도가 낮아진다.
실시예 16. 두유 생산을 위한 두유 콩의 만나나아제 처리
두유를 얻기 위한 콩의 효소처리를 위해 “열 공정”이 일반적으로 사용된다. 열 두유 공정을 위해, 건조된 콩을 1:7 (끓인 콩: 물)비율의 끓인 수돗물로 혼합기에서 혼합하고 분쇄하였다. 전체 콩 슬러리는 효소 첨가 전에 50 내지 55℃로 냉각된다. 콩 슬러리의 pH 수준은 pH6.5정도여야 하며, NaHCO3로 조정할 수 있다. 만나나아제 효소를 건조 콩의 1kg/t의 용량으로 슬러리에 첨가하고, 30분간 저어주었다. 반응 시간이 지난후, 실험 프레스를 사용하여 슬러리를 가압하여 최종 생성물인 두유를 수득하였다. 동일한 가압 프로파일을 보장하기 위해 압력 및 이에 상응하는 프레싱 시간이 표 11에 나타낸 바와 같이 지정되었다. 효소 반응을 위한 샘플 외에도 효소가 없는 대조군 샘플이 준비되었으며, 여기서는 효소 용액이 물로 교체되었다.
가압 계획
압력 [bar] 0 50 100 300
시간 [min] 2 2 2 1
두유를 가압한 후, 끓을 때까지 전자레인지에서 가열하여 효소반응을 중지시켰다.
두유의 분석:
그램/시간 의 수율
두유의 당량과 직접적인 상관관계를 나타내는 Brix는 굴절률측정기로 결정하였다(refractometer).
즙의 탁도는 NTU-광도계로 측정하였으며, nephelometric 탁도를 측정하였다.
밝기는 LAB-측정법으로 측정하였다.
단백질 함량은 CN-분석기(연소 방법)로 결정하였다.
맛
본 발명의 만나나아제로 처리된 두유는 증가된 수율, 더 밝은 색, 증가된 브릭스, 더 낮은 탁도, 더 높은 단백질 함량 및 더 나은 맛(향료 제거)을 나타낸다.
실시예 17. 본 발명에 따른 액체 세제 조성물의 세척 성능
본 발명에 따른 액체 세제 조성물의 세척 성능은 CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands (”CFT”), Eidgenossische Material- und Pr
Figure pct00001
fanstalt Testmaterialien AG [Federal materials and testing agency, Testmaterials], St. Gallen, Switzerland (“EMPA”) 및 Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham (“Equest”)로부터 얻을 수 있는 표준 오염을 사용하여 결정되었다.
하기 조성을 갖는 액체 세척제가 기본 제제로 사용되었다(모든 값은 중량 %):
Chemical name 활성 물질
원재료[%] 		활성 물질
세제 제형 [%]
Water demin. 100 Rest
Alkyl benzene sulfonic acid 96 2-7
Anionic surfactants 70 6-10
C12-C18 Fatty acid sodium salt 30 1-4
Nonionic surfactants 100 4-7
Phosphonates 40 0.1-2
Citric acid 100 1-3
NaOH 50 1-4
Boronic acid 100 0.1-2
Antifoaming agent 100 0.01-1
Glycerol 100 1-3
Enzymes 100 0.1-2
Preserving agent 100 0.05-1
Ethanol 93 0.5-2
Optical brightener 90 0.01-1
Perfume 100 0.1-1
Dye 100 0.001-0.1
세제 조성물의 pH는 8.2-8.6 이었다.
상기 기본 제형에 기초하여, 액체 세제 조성물 1 및 2는 하기에 개시하는 바와 같이 각각의 효소를 첨가함으로써 제조되었다.
조성물 1: 서열번호 12에 따른 효소 (Man6)
조성물 2: 서열번호 16에 따른 효소 (Man7)
세척은 AISE 방법에 따라 다음과 같이 수행되었다: 3.5kg 깨끗한 벨라스트 천, 4개의 SBL 천, 밀레 세탁기, 20℃ 및 40℃ 짧은 프로그램.
모든 만나나아제는 총 단백질 함량에 기초하여 동일한 양으로 첨가되었다.
액체 세척제의 투여 비율은 세척액 1리터당 4.0g 이었다. 세척 절차는 20℃ 내지 40℃, 물의 경도가 15.5 내지 16.5(독일 경도 단위)인 물에서 60분동안 수행되었다.
얻어진 결과는 세제를 사용하여 얻은 제거 단위(remession unit)와 시판되는 기준 만나나아제(Mannaway 4.0L, Novozymes에서 구입)를 함유한 세제를 사용하여 얻은 제거 단위(remession unit) 사이의 차이 값이다. 따라서, 양의 값은 기준 만나나아제를 포함하는 동일한 세제 조성물과 비교하여, 본 발명의 만나나아제를 포함하는 세제 조성물의 개선된 세척성능을 나타낸다. 세척 시험에서 광범위한 얼룩이 테스트되었다.
백색도, 즉, 얼룩의 밝음은 세척 성능의 지표로서 광도계로 측정되었다. Minolta CM508d 분광계 장치를 사용하였고, 장치와 함께 제공된 백색 표준을 사용하여 사전에 보정하였다.
얻어진 결과는 세제로 얻은 제거 단위와 효소 조합을 함유한 세제로 얻은 제거 단위의 차이 값이다. 따라서, 양의 값은 세제에 존재하는 효소 조합으로 인한 세척성능의 개선을 나타낸다. 세제 조성물에서 본 발명의 만나나아제는 다양한 만난 포함 얼룩에서 개선된 성능을 나타내었다.
얼룩 20°C 40°C
조성물 1 조성물
2 		조성물
1 		조성물
2
Chocolate Ice Cream (Equest) 1.3 4.2 n.d. n.d.
Carte Dor Chocolate Ice Cream (Equest) n.d. 3.3 n.d. 0.7
Cocoa [CO] (Equest) n.d. 2.3 n.d. n.d.
Mayonnaise/Carbon black color (CFT CS05S [CO]) 1.3 4.3 1.1 2.2
Salad dressing, with natural black (CFT CS06 [CO]) 1.2 3.5 1.2 2.6
Lipstick, diluted, Red (CFT CS216 [CO]) n.d. 1.5 n.d. 0.7
실시예 18. 본 발명에 따른 분말 세제 조성물의 세척 성능
본 발명에 따른 분말 세제 조성물의 세척 성능은 CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands (”CFT”), Eidgenossische Material- und Prufanstalt Testmaterialien AG [Federal materials and testing agency, Testmaterials], St. Gallen, Switzerland (“EMPA”) 및 Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham (“Equest”)로부터 얻을 수 있는 표준 얼룩을 사용하여 결정되었다.
하기 조성을 갖는 고형 세척제가 기본 제형으로 사용되었다(모든 값은 중량%):
Chemical name 활성 물질
원재료 [%]		 활성 물질
세제 제형 [%]
Water demin. 100 1-4
Alkyl benzene sulfonic acid 97 9-13
Nonionic surfactants 100 4-7
Percarbonates 88 9-13
TAED 92 1-5
Phosphonates 60 0.1-3
Polyacrylates 45 1-4
Sodium silicate 40 5-10
Sodium carbonate 100 18-22
Carboxymethylcellulose 69 1-4
Soil release polymer 100 0.1-1
Optical brightener 70 0.1-1
Antifoaming agent t.q. 0.01-1
Sodium sulfate 100 22-30
Enzymes 100 0.1-1
Perfume 100 0.1-1
NaOH 100 0.1-1
Rest - 1-4
상기 기본 제형에 기초하여, 액체 세제 조성물 3 및 4는 하기에 개시하는 바와 같이 각각의 효소를 첨가함으로써 제조되었다.
조성물 3: 서열번호 12에 따른 효소 (Man6)
조성물 4: 서열번호 16에 따른 효소 (Man7)
세척은 AISE 방법에 따라 다음과 같이 수행되었다: 3.5kg 깨끗한 벨라스트 천, 4개의 SBL 천, 밀레 세탁기, 20℃ 및 40℃ 짧은 프로그램. 모든 만나나아제는 총 단백질 함량에 기초하여 동일한 양으로 첨가되었다.
분말 세척제의 투여 비율은 세척액 1리터당 3.8g 이었다. 세제의 조성은 표 14에 나열하였다. 세척 절차는 20℃ 내지 40℃, 물의 경도가 15.5 내지 16.5(독일 경도 단위)인 물에서 60분동안 수행되었다.
백색도, 즉, 얼룩의 밝음은 세척 성능의 지표로서 광도계로 측정되었다. Minolta CM508d 분광계 장치를 사용하였고, 장치와 함께 제공된 백색 표준을 사용하여 사전에 보정하였다.
얻어진 결과는 세제를 사용하여 얻은 제거 단위(remession unit)와 기준 만나나아제(Mannaway 4.0L, Novozymes에서 구입)를 함유한 세제를 사용하여 얻은 제거 단위(remession unit) 사이의 차이 값이다. 따라서, 양의 값은 기준 만나나아제를 포함하는 동일한 세제 조성물과 비교하여, 본 발명의 만나나아제를 포함하는 세제의 개선된 세척성능을 나타낸다. 본 발명의 만나나아제는 표 15에서 몇몇 얼룩에 대해 개선된 성능을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 만나나아제는 Mannaway와 비교하여 개선된 세척 성능을 나타내는 것이 명백하다.
20/40°C 분말
20°C 40°C
얼룩 조성물 3 조성물 4 조성물 3 조성물 4
Carte Dor Chocolate Ice Cream (Equest) 1.4 2.8 2.1 0.5
Vienetta (Equest) 0.5 0.8 0.5 n.d.
Chocolate Icecream L [CO] (Equest) 0.9 0.9 1.1 n.d.
Porridge (EMPA 163 [CO]) n.d. n.d. 1.3 5.1
Cocoa (CFT CS02 [CO]) 1.8 3.1 n.d. n.d.
Mayonnaise/Carbon black color (CFT CS05S [CO]) n.d. 1.0 n.d. 2.7
Salad dressing, with natural black (CFT CS06 [CO]) 2.0 4.8 1.3 5.1
Sebum BEY with carbon black (CFT CS32 [CO]) 0.7 1.4 0.5 0.7
Chocolate drink, pure (CFT CS44 [CO]) n.d. 1.4 n.d. 0.8
본 명세서에 개시된 하나 이상의 관점 또는 실시예의 특정한 기술적 효과는 하기에 나열하나, 특허 청구범위의 권리 범위 및 해석을 제한하지 않는다: 기술적 효과는 만난의 분해 및 변형이다. 다른 기술적 효과는 우수한 저장 안정성을 갖는 만나나아제의 제공이다.
상기 설명은 본 발명의 특정한 구현 및 실시의 비제한적인 예를 통해 본 발명을 실시하기 위해 본 발명자들에 의해 현제 고려되는 최상에 모드에 대한 완전하고 유익한 설명을 제공한다. 그러나, 본 발명은 상기 기술한 실시예의 세부 내용으로 제한되지 않으며, 본 발명의 특성을 벗어나지 않는 한 동등한 수단을 사용하여 다른 실시예로 구현될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다 할 것이다.
또한, 본 발명의 상기 관점 및 실시예의 특징 중 일부는 다른 특징의 상응하는 용도 없이도 유리하게 사용될 수 있다. 이와 같이, 상기 발명의 설명은 단지 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 간주되어야 하며, 이를 제한하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 특허 청구범위에 의해서만 제한된다.
일 실시예에서, 본 발명의 조성물의 적어도 하나의 성분은 적어도 하나의 성분이 유래된 상응하는 천연 성분과 비교하여 상이한 화학적, 구조적 또는 물리적 특성을 갖는다. 일 실시예에서, 상기 특성은 균일한 크기, 균질 분산, 상이한 이소형태, 상이한 코돈 변성, 상이한 번역 후 변형, 상이한 메틸화 상이한 3차 또는 4차 구조, 상이한 효소활성, 상이한 친화성, 상이한 결합 활성 및 상이한 면역원성 중 적어도 하나이다.
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Sequence <220> <223> primer <400> 8 gacagagata taccgacagt g 21 <210> 9 <211> 975 <212> DNA <213> Bacillus clausii <400> 9 atgaagaggg aggacatgga tcaaatgaaa agaaagcggt tacaattgtt tggaacacta 60 gtggtattgg ttttgttcgt gtacggtagc ggttcggcat atgcacaaaa cggatttcac 120 gtatccggta cagagttgtt ggacaaaaat ggcgatcctt atgttatgcg tggcgtcaac 180 catggacact cttggtttaa gcaagatctg gaggaagcaa tccctgccat agcagaaaca 240 ggggcgaaca cggtgagaat ggtcttatcc aatggacagc aatgggaaaa agatgatgcc 300 tctgagcttg cccgtgtgct ggctgccaca gaaacatatg gattgacaac tgtgctggaa 360 gtccatgacg ctacaggaag tgacgatcct gctgatttag agaaagcagt cgattattgg 420 atcgaaatgg ctgatgttct caaggggaca gaagaccgag taatcattaa cgttgccaat 480 gaatggtatg ggtcgtggag gagcgacgtt tgggcagaag catacgcaca agcgatcccg 540 cgcttgcgca gcgctggcct ctcccataca ttaatggttg atgcggcagg ttggggccag 600 taccctgcct ccatccacga gcggggagcc gatgtgtttg cgtccgatcc attaaaaaac 660 acgatgtttt cgatccatat gtacgaatat gcaggagctg atagggcgac aattgcctat 720 aacattgatc gtgtgcttgc tgaaaatctt 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120 125 Asp Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ala Val Asp Tyr Trp Ile Glu Met Ala 130 135 140 Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu Asp Arg Val Ile Ile Asn Val Ala Asn 145 150 155 160 Glu Trp Tyr Gly Ser Trp Arg Ser Asp Val Trp Ala Glu Ala Tyr Ala 165 170 175 Gln Ala Ile Pro Arg Leu Arg Ser Ala Gly Leu Ser His Thr Leu Met 180 185 190 Val Asp Ala Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Ile His Glu Arg 195 200 205 Gly Ala Asp Val Phe Ala Ser Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser 210 215 220 Ile His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Ala Asp Arg Ala Thr Ile Ala Tyr 225 230 235 240 Asn Ile Asp Arg Val Leu Ala Glu Asn Leu Ala Val Val Ile Gly Glu 245 250 255 Phe Gly His Arg His His Asp Gly Asp Val Asp Glu Asp Ala Ile Leu 260 265 270 Ala Tyr Thr Ala Glu Arg Gln Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr 275 280 285 Gly Asn Ser Gly Gly Val Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Glu Gly Pro Ser 290 295 300 Gly Pro Leu Thr Ser Trp Gly Lys Arg Ile Val Tyr Gly Glu Asn Gly 305 310 315 320 Leu Lys Ser Asp <210> 12 <211> 289 <212> PRT <213> Bacillus clausii <400> 12 Gln Asn Gly Phe His Val Ser Gly Thr Glu Leu Leu Asp Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Pro Tyr Val Met Arg Gly Val Asn His Gly His Ser Trp Phe Lys 20 25 30 Gln Asp Leu Glu Glu Ala Ile Pro Ala Ile Ala Glu Thr Gly Ala Asn 35 40 45 Thr Val Arg Met Val Leu Ser Asn Gly Gln Gln Trp Glu Lys Asp Asp 50 55 60 Ala Ser Glu Leu Ala Arg Val Leu Ala Ala Thr Glu Thr Tyr Gly Leu 65 70 75 80 Thr Thr Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Ser Asp Asp Pro Ala 85 90 95 Asp Leu Glu Lys Ala Val Asp Tyr Trp Ile Glu Met Ala Asp Val Leu 100 105 110 Lys Gly Thr Glu Asp Arg Val Ile Ile Asn Val Ala Asn Glu Trp Tyr 115 120 125 Gly Ser Trp Arg Ser Asp Val Trp Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Ile 130 135 140 Pro Arg Leu Arg Ser Ala Gly Leu Ser His Thr Leu Met Val Asp Ala 145 150 155 160 Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Ile His Glu Arg Gly Ala Asp 165 170 175 Val Phe Ala Ser Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met 180 185 190 Tyr Glu Tyr Ala Gly Ala Asp Arg Ala Thr Ile Ala Tyr Asn Ile Asp 195 200 205 Arg Val Leu 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agcatgggac 480 ggacaaggct gggcaaatgg ctataaggag gttattccac gtttacgaaa tgctggcttc 540 actcatacat taatggtaga tgcagctggt tggggacaat accctcaatc gattcatgat 600 tatggtcaag aggtatttaa tgctgatcct ttagcaaata cgatgttttc catccatatg 660 tatgaatatg ctggcggaaa tgcttcaatg gtacaatcta atatcgatgg tgtcgtcgat 720 caagggttag ctcttgtaat aggagaattt gggcatatgc atacggacgg agatgttgat 780 gaagcaacga tattgagcta ctcgcaacaa agaggagtcg gttggctagc ttggtcttgg 840 aaaggcaatg ggactcaatg ggaatatcta gatttatctt atgattggca aggaacaaac 900 ttaacttctt ggggaaatac cattgtccac gggcctaatg gattactcga aacatccatt 960 ccaagctcga ttttccatac cgctccaaac aatggagatc cccctcctca taacggtaat 1020 gaaacgatct tatatgattt cgaacatggc actcaaggct ggtcaggttc ttcacttctt 1080 ggaggacctt ggacgacgaa tgaatggagt acaaatggta accattcatt aaaggccgat 1140 attttcttat cagctaactc caaacatgaa ttagcaaaag ttgaaaatcg aaatttatca 1200 ggctactcta ctttacaagc cactgtccgc catgcacatt ggggaaatgt tggtaattta 1260 acggcgagaa tgtatgtaaa aacgggctca aactatagct ggtttaatgg tgatcctatc 1320 ccagtaaact cagcaaatgg tacgactgtc actttgcctc tttcatctat tccaaaccta 1380 aatgacgtaa aagaaattgg cgttgaattt attggagctt caaatagcaa tggacaaacc 1440 gccatttatt tagatcatgt aacaatccaa taa 1473 <210> 14 <211> 1395 <212> DNA <213> Bacillus hemicellulosilyticus <400> 14 cagacccact cgggcttcta catcgagggc tcgacgctct acgacgctaa cggcgagcct 60 tttgtcatgc gcggcatcaa ccacggccac gcctggtaca agcacgactc caacgtcgct 120 atccctgcta tcgctaacca gggcgctaac accatccgca tcgtcctcag cgacggtggc 180 cagtgggcca aggacgacat caacacgctg aaccaggtcc tcgacctggc cgaggagcac 240 gagatgatcg ctgtcgtcga ggtccacgac gctaccggct ccaacagcat ggccgacctc 300 aaccgcgccg tcgactactg gatcgagatg aaggacgccc tgatcggcaa ggaagaccgc 360 gtcatcatca acatcgctaa cgagtggtac ggcgcttggg acggccaggg ctgggccaac 420 ggctacaagg aagtcatccc tcgcctgcgc aacgctggct tcacccacac cctcatggtc 480 gacgctgccg gctggggcca gtaccctcag agcatccacg actacggcca agaggtcttc 540 aacgccgacc ctctggccaa caccatgttc tccatccaca tgtacgagta cgctggcggc 600 aacgcctcca tggtccagag caacatcgac ggcgtcgtcg accagggcct cgctctggtc 660 atcggcgagt tcggccacat gcacacggac ggcgacgtcg acgaggctac catcctgagc 720 tactcgcagc agcgcggcgt cggctggctg gcctggtcgt ggaagggcaa cggcacccag 780 tgggagtacc tcgacctgag ctacgactgg cagggcacca acctcacgtc gtggggcaac 840 acgatcgtcc acggccctaa cggcctcctg gagacgtcca tcccttccag catctttcac 900 accgctccta acaacggcga ccctcctccc cacaacggca acgagacgat cctgtacgac 960 ttcgagcacg gcacgcaggg ctggtcgggc tcgtccctgc tgggcggccc ttggaccacc 1020 aacgagtggt cgaccaacgg caaccactcc ctcaaggccg acatcttcct gtccgccaac 1080 agcaagcacg agctcgccaa ggtcgagaac cgcaacctca gcggctactc gacgctgcag 1140 gctaccgtcc gccacgctca ctggggcaac gtcggcaacc tgacggctcg catgtacgtc 1200 aagacgggca gcaactactc gtggttcaac ggcgacccca tccctgtcaa ctcggctaac 1260 ggcaccaccg tcaccctccc tctgagctcg atccccaacc tcaacgacgt caaggagatc 1320 ggcgtcgagt tcatcggcgc tagcaacagc aacggccaga ccgccatcta cctggaccac 1380 gtcacgatcc agtaa 1395 <210> 15 <211> 490 <212> PRT <213> Bacillus hemicellulosilyticus <400> 15 Met Arg Asn Phe Gly 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tatctatacc taactcaaaa cctaaatttt agcggaaagt cacaactcac agcgactgta 1200 aagcatgctg attggggaaa cttcggggat gaaataaatg caaagttata tgtaaaaaca 1260 gaatcagatt ggcaatggtt tgatggagga attgaaaaga tcaattcttc aattggaact 1320 attataacct tagatttatc atcgctctca aacccaagtg atattaaaga agttggtgtt 1380 cagtttacgg gttcttcaaa tagttatggc ctaacagctt tatatgttga taacgttacc 1440 attaaataa 1449 <210> 18 <211> 1401 <212> DNA <213> Virgibacillus soli <400> 18 gcctcgggct tctacgtcaa cggcaacact ctctacgacg ccacgggcac cccatttgtc 60 atccgcggca tcaaccacgc tcactcgtgg ttcaaggacg acactgccac cgctatccct 120 gctatcgctg ctacgggcgc caacacgatc cgcatcgtcc tcagcgacgg ctcgcagtac 180 tcccgcgacg acatcgacgg cgtccgcaac ctcatctccc tggccgagga gaacaacctc 240 atcgccatgc tggaggtcca cgacgctacc ggcaaggacg acatcagctc gctggacagc 300 gccgccgact actggatctc gatcaaggaa gccctcatcg gcaaggaaga caaggtcctg 360 atcaacatcg ccaacgagtg gtacggcacc tgggacggcg ctagctgggc tgacggctac 420 aagcaggtca tccctaagct ccgcaacgcc ggcctcaacc acacgctcat cgtcgactcg 480 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ctcaggtgtt 540 caatataaag atgaccctgc tattatgaca tgggagctcg ccaatgagcc gcgcgctcag 600 tcagaccctt cgggagatat actagtaaac tgggcagatg aaatgagtgc atggatcaaa 660 tcaattgact cgaatcatct tgttgctgta ggagacgaag ggttctttcg catgacaggt 720 catgatgatt ggttttacag tggaggagaa ggtgttgatt gggatcgttt gactgctctc 780 cctcatattg attatggaac ctatcattta tacccggatc actggaatca gtctgctgca 840 tggggagtga aatggatcaa agatcatatc acccgaggaa acgcaatcgg aaaacctgtt 900 gtattagaag agtttggcta tcaaaatcaa gcagcccgtc ctgatgtata tgatagctgg 960 ctgaagacaa ttgaacagct cggaggcgca ggtagccaat tttggatttt aacaagcatt 1020 caagacgatg attccctcta cccggattat gatggttttc gagttttaaa ggagagccgg 1080 gaggcaggaa ttattcgtga acacgccaaa agaatgaatg aaaagaactg atgaagaatg 1140 cctgtttata aggaacttca tttgcataaa aaaattggat atggtatagt ttttatggaa 1200 atgctaacga ttaccgagac aagagtgggg aaacccgctc ttttgtattg aacaggcaat 1260 ttttgtctcg acattattca tccgttttct gctccccctg ctcacaataa agcagggttt 1320 ttatgcagaa tgattgataa gagcgtttat cgaaagcaca aggaggaaga gaatgagcaa 1380 aaaagtagtg gatatcgtaa gcgacatggt gcagccaatt ttagatggct tacagcttga 1440 actcgttgat gttgaatttg tcaaagaggg tcaaaactgg ttccttcgcg tatttattga 1500 ctctgataaa ggcgtcgata tcgaggagtg tgccaaagtg agcgaagcct tgagcgaaaa 1560 gcttgatgag gcagatccaa ttagccaaaa ctactttctt gaagtgtcct ctcctggagc 1620 ggagcgccca ttaaagaaaa aagctgattt tgaaaaagca cttggaaaaa atgttttcat 1680 gaaaacatac gaaccaattg atggtgaaaa ggcatttgaa ggtgagctta caagctttga 1740 tggtgagatt gcaacagtga cagtgaagat caagacaaga aagaaagaga tcaatattcc 1800 atacgaaaaa attgctaacg caagattagc agtttcgttc aattaa 1846 <210> 26 <211> 376 <212> PRT <213> Bacillus pumilus <400> 26 Met Lys Lys Trp Val Gln Arg Val Ala Cys Phe Met Leu Leu Ile Thr 1 5 10 15 Leu Trp Ala Gly Trp Phe Thr Leu Thr Val Lys Ala Ser Ser Tyr Val 20 25 30 Gln Thr Ser Gly Thr His Phe Val Leu Asn Asn His Pro Phe Tyr Phe 35 40 45 Ala Gly Thr Asn Asn Tyr Tyr Phe His Tyr Lys Ser Lys Lys Met Val 50 55 60 Asp Ala Val Phe Asp Asp Met Lys Ala Met Asp Leu Lys Val Ile Arg 65 70 75 80 Ile Trp Gly 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Asp Gly Asn Gly Trp Ala Gln Gly Tyr Lys Ser Val Ile Pro Lys 420 425 430 Leu Arg Asn Ala Gly Ile Lys Asn Thr Ile Met Val Asp Ala Ala Gly 435 440 445 Trp Gly Gln Tyr Pro Lys Ser Ile Phe Asp Tyr Gly Thr Gln Val Phe 450 455 460 Asp Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu 465 470 475 480 Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Glu Thr Val Lys Ser Asn Ile Asp Asn Val 485 490 495 Leu Asn Lys Asn Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Ile Lys His 500 505 510 Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser Tyr Ala Gln Gln 515 520 525 Lys Gly Val Gly Tyr Leu Gly Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly Ser Gly 530 535 540 Leu Glu Tyr Leu Asp Met Ser Asn Asp Trp Ala Gly Ser Ser Tyr Thr 545 550 555 560 Glu Gln Gly His Ala Ile Ile Glu Gly Pro Asn Gly Ile Arg Ala Thr 565 570 575 Ser Lys Leu Ser Thr Ile Tyr Ser Asn Gly Lys Gln 580 585 <210> 33 <211> 1470 <212> DNA <213> Bacillus hemicellulosilyticus <400> 33 atggatatat taagaaagtg tgtacttgta ctattggcct tactattgtt gttacctacg 60 acatcaacgg cattttctga aagcgcttct actaatgaga gagtgctaaa tttatctgat 120 ccgaatgcga cacgctatac gaaggaattg tttgcgtttc ttcaagacgt gagtggtgag 180 caagtgttgt tcgggcaaca gcatgcaaca gatgaagggt tgactctgac aggtgaagga 240 aatcgaattg gttcaactga gtcggaggtg aagaatgcag taggtgatta tccagctgtt 300 tttgggtggg atacgaacag cttggatggt cgtgaaaagc caggtacaga tgtggaaagt 360 caagagcaac gaattttaaa tacagcagaa tcgatgaaag tggcacatga attaggaggg 420 atcatcacat taagtatgca tccggataac tttgttaccg gtcattacta tggcgatacg 480 gatggtaacg tcgttcaaga aatattgcca ggtggctcca agcacaatga atttaacgct 540 tggctagata atattgctgc cctagcacat gaattagttg atgataatgg agagcctatt 600 ccggttatct tccgtccatt ccatgagcaa acaggttcgt ggttttggtg gggtgcgagc 660 acaacaactc ctgagcaata caaagcgatt tttcgatata cagtcgaata cttaagagat 720 gcaaagggtg ttcataactt tttatatgga ttctcccctg gtgcgggtcc tgctggcgat 780 ctagatcgat atttagaaac gtacccaggt gataattatg tcgatatctt aggtattgat 840 aattatgata gtaagtcaaa tgcggggtca gacgcttggt tatctggaat ggtaaaagat 900 ttagcgatga tctcgaaatt agcagaggaa agagggaagg tatcagcctt tactgaattt 960 ggatacagcg ctgaagggat gagtcaaacg ggtgatgcgt tagattggta tacacgtgtg 1020 ttaaatgcga taaaagcaga tgaagatgcg cgaaacatat cctacatgct aacgtgggct 1080 aactttgggt ggcctaataa tatatttgtt ccgtatcgtg atgtgaatgg ggatttaggt 1140 ggagatcatg agttattacc tgactttgta cagttttatg aagatgaata ctcagcattt 1200 cgtgaagata taaatgaaag tgtttacaat cgtaatgaga gttatattgt tgcggatcat 1260 gagccattta tgtatgttgt ttcccctacg acaggtacat atataacagg ctcgtctgtt 1320 gtcttacgag cgaaagtagt taacgatgag gatccgtccg ttacgtatca agtggcgggt 1380 tctgaagaag tctatgagat gactttagat gaaaatgggt attactctgc tgattatatt 1440 cctactgctc ctaagaatgg agctctgtag 1470 <210> 34 <211> 489 <212> PRT <213> Bacillus hemicellulosilyticus <400> 34 Met Asp Ile Leu Arg Lys Cys Val Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Thr Thr Ser Thr Ala Phe Ser Glu Ser Ala Ser Thr Asn 20 25 30 Glu Arg Val Leu Asn Leu Ser Asp Pro Asn Ala Thr Arg Tyr Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Phe Ala Phe Leu Gln Asp Val Ser Gly Glu Gln Val Leu Phe 50 55 60 Gly Gln Gln His Ala Thr Asp Glu Gly Leu Thr Leu Thr Gly Glu Gly 65 70 75 80 Asn Arg Ile Gly Ser Thr Glu Ser Glu Val Lys Asn Ala Val Gly Asp 85 90 95 Tyr Pro Ala Val Phe Gly Trp Asp Thr Asn Ser Leu Asp Gly Arg Glu 100 105 110 Lys Pro Gly Thr Asp Val Glu Ser Gln Glu Gln Arg Ile Leu Asn Thr 115 120 125 Ala Glu Ser Met Lys Val Ala His Glu Leu Gly Gly Ile Ile Thr Leu 130 135 140 Ser Met His Pro Asp Asn Phe Val Thr Gly His Tyr Tyr Gly Asp Thr 145 150 155 160 Asp Gly Asn Val Val Gln Glu Ile Leu Pro Gly Gly Ser Lys His Asn 165 170 175 Glu Phe Asn Ala Trp Leu Asp Asn Ile Ala Ala Leu Ala His Glu Leu 180 185 190 Val Asp Asp Asn Gly Glu Pro Ile Pro Val Ile Phe Arg Pro Phe His 195 200 205 Glu Gln Thr Gly Ser Trp Phe Trp Trp Gly Ala Ser Thr Thr Thr Pro 210 215 220 Glu Gln Tyr Lys Ala Ile Phe Arg Tyr Thr Val Glu Tyr Leu Arg Asp 225 230 235 240 Ala Lys Gly Val His Asn Phe Leu Tyr Gly Phe Ser Pro Gly Ala Gly 245 250 255 Pro Ala Gly Asp Leu Asp Arg Tyr Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Asp Asn 260 265 270 Tyr Val 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Ala Pro Lys Asn Gly Ala Leu 485 <210> 35 <211> 1110 <212> DNA <213> Bacillus alcalophilus <400> 35 atgagaagta tgaagctttt atttgctatg tttattttag ttttttcctc ttttactttt 60 aacttagtag ttgcgcaagc tagtggacat ggacaaatgc ataaagtacc ttgggcaccc 120 caagctgaag cacctggaaa aacggctgag aatggagtct gggataaagt tagaaataat 180 cctggaaaag ccaatcctcc agcaggaaaa gtcaatggtt tttatataga tggaacaacc 240 ttatatgatg caaatggtaa gccatttgtg atgcgcggaa ttaaccacgc tcattcctgg 300 tacaagcctc acatagaaac cgcgatggag gcaattgctg atactggagc aaactccatt 360 cgtgtagttc tctcagatgg acaacagtgg accaaagatg atgttgacga agtagcaaaa 420 attatatctt tagcagaaaa acattcttta gttgctgttc ttgaggtaca tgatgcactc 480 ggaacagatg atattgaacc attacttaaa acagtcgatt actggattga gatcaaagat 540 gctttaatcg gaaaagagga caaagtaatt attaacattt ctaatgaatg gtttggttct 600 tggagcagtg aaggttgggc agaaggatat aaaaaagcaa ttcctttact aagagaggcg 660 ggtctaaaac atacacttat ggttgacgca gctgggtggg gacaatttcc tagatctatt 720 catgaaaaag gattagacgt ttttaactca gacccattaa agaatacaat gttttccatt 780 catatgtatg aatgggcagc gggtaatcct caacaagtaa aagacaatat tgacggtgtt 840 cttgaaaaga atttagctgt agtaattggt gagttcggtc atcatcacta cggaagagat 900 gttgctgttg atacgatctt aagtcattca gagaagtatg atgtaggttg gcttgcctgg 960 tcttggcacg gaaatagtgg tggtgtagag tatcttgact tagcaacaga tttttcaggg 1020 acgcaactaa ctgaatgggg agaaagaatt gtgtacggtc cgaatggttt aaaagaaact 1080 tctgaaatcg ttagtgtata caaaaaataa 1110 <210> 36 <211> 369 <212> PRT <213> Bacillus alcalophilus <400> 36 Met Arg Ser Met Lys Leu Leu Phe Ala Met Phe Ile Leu Val Phe Ser 1 5 10 15 Ser Phe Thr Phe Asn Leu Val Val Ala Gln Ala Ser Gly His Gly Gln 20 25 30 Met His Lys Val Pro Trp Ala Pro Gln Ala Glu Ala Pro Gly Lys Thr 35 40 45 Ala Glu Asn Gly Val Trp Asp Lys Val Arg Asn Asn Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Asn Pro Pro Ala Gly Lys Val Asn Gly Phe Tyr Ile Asp Gly Thr Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Asp Ala Asn Gly Lys Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn His 85 90 95 Ala His Ser Trp Tyr Lys Pro His Ile Glu Thr Ala Met Glu Ala Ile 100 105 110 Ala Asp Thr Gly Ala Asn Ser Ile Arg Val Val Leu Ser Asp Gly Gln 115 120 125 Gln Trp Thr Lys Asp Asp Val Asp Glu Val Ala Lys Ile Ile Ser Leu 130 135 140 Ala Glu Lys His Ser Leu Val Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Leu 145 150 155 160 Gly Thr Asp Asp Ile Glu Pro Leu Leu Lys Thr Val Asp Tyr Trp Ile 165 170 175 Glu Ile Lys Asp Ala Leu Ile Gly Lys Glu Asp Lys Val Ile Ile Asn 180 185 190 Ile Ser Asn Glu Trp Phe Gly Ser Trp Ser Ser Glu Gly Trp Ala Glu 195 200 205 Gly Tyr Lys Lys Ala Ile Pro Leu Leu Arg Glu Ala Gly Leu Lys His 210 215 220 Thr Leu Met Val Asp Ala Ala Gly Trp Gly Gln Phe Pro Arg Ser Ile 225 230 235 240 His Glu Lys Gly Leu Asp Val Phe Asn Ser Asp Pro Leu Lys Asn Thr 245 250 255 Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Trp Ala Ala Gly Asn Pro Gln Gln 260 265 270 Val Lys Asp Asn Ile Asp Gly Val Leu Glu Lys Asn Leu Ala Val Val 275 280 285 Ile Gly Glu Phe Gly His His His Tyr Gly Arg Asp Val Ala Val Asp 290 295 300 Thr Ile Leu Ser His Ser Glu Lys Tyr Asp Val Gly Trp Leu Ala Trp 305 310 315 320 Ser Trp His 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agatgtgttt aatgcagatc cgttaaaaaa tacgatattc 660 tccatccata tgtatgagta tgctggtggt gatgctaaca ctgttagatc aaatattgat 720 agagtcatag atcaagacct tgctctcgta ataggtgagt tcggtcatag acacactgat 780 ggcgatgttg atgaagatac aatccttagt tattctgaag aaactggcac aggatggctc 840 gcttggtctt ggaaaggcaa cagtgccgaa tgggattatt tagacctttc agaagattgg 900 gctggtaacc atttaactga ttggggaaat aggattgtcc acggggcaaa tggcttgcag 960 gaaacctcca aaccatccac cgtatttaca gatgataacg gtggtgcccc tgaaccgcca 1020 actactacta ccttgtatga ctttgaagga agcacacaag ggtggcatgg aagcaacgtg 1080 atgggtggcc cttggtccgt aacagaatgg ggtgcgtcag gcaactactc tttaaagggc 1140 gatgtcaatt taagctcaaa ttcttcacat gaactgtata gtgaacaaag tcgtaatcta 1200 cacggatact ctcagctaaa tgcaaccgtt cgccatgcca attggggaaa tcccggtaat 1260 ggcatgaatg caagacttta cgtgaaaacg ggctctgatt atacatggta tagcggtcct 1320 tttacacgta tcaatagctc caactcaggt acaacgttat cttttgattt aaacaacatc 1380 gaaaatagtc atcatgttag ggaaataggt gtgcaatttt cagctgcaga taatagcagc 1440 ggtcaaactg ctctatacgt tgataatgtt actttaagat aa 1482 <210> 38 <211> 493 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 38 Met Lys Lys Lys Leu Ser Gln Ile Tyr His Leu Ile Ile Cys Thr Leu 1 5 10 15 Ile Ile Ser Val Gly Ile Met Gly Ile Thr Thr Ser Pro Ser Glu Ala 20 25 30 Ser Ser Gly Phe Tyr Val Asp Gly Asn Thr Leu Tyr Asp Ala Asn Gly 35 40 45 Gln Pro Phe Val Met Lys Gly Ile Asn His Gly His Ala Trp Tyr Lys 50 55 60 Asp Thr Ala Ser Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Glu Gln Gly Ala Asn 65 70 75 80 Thr Ile Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly Gly Gln Trp Glu Lys Asp Asp 85 90 95 Ile Asp Thr Val Arg Glu Val Ile Glu Leu Ala Glu Gln Asn Lys Met 100 105 110 Val Ala Val Val Glu Val His Asp Ala Thr Gly Arg Asp Ser Arg Ser 115 120 125 Asp Leu Asp Arg Ala Val Asp Tyr Trp Ile Glu Met Lys Asp Ala Leu 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Asp Thr Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr 145 150 155 160 Gly Ser Trp Asp Gly Ala Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Ile Asp Val Ile 165 170 175 Pro Lys Leu Arg Asp Ala Gly Leu Thr His Thr Leu Met Val Asp Ala 180 185 190 Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile His Asp Tyr Gly Gln Asp 195 200 205 Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Ile Phe Ser Ile His Met 210 215 220 Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asp Ala Asn Thr Val Arg Ser Asn Ile Asp 225 230 235 240 Arg Val Ile Asp Gln Asp Leu Ala Leu Val Ile Gly Glu Phe Gly His 245 250 255 Arg His Thr Asp Gly Asp Val Asp Glu Asp Thr Ile Leu Ser Tyr Ser 260 265 270 Glu Glu Thr Gly Thr Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Ser 275 280 285 Ala Glu Trp Asp Tyr Leu Asp Leu Ser Glu Asp Trp Ala Gly Asn His 290 295 300 Leu Thr Asp Trp Gly Asn Arg Ile Val His Gly Ala Asn Gly Leu Gln 305 310 315 320 Glu Thr Ser Lys Pro Ser Thr Val Phe Thr Asp Asp Asn Gly Gly Ala 325 330 335 Pro Glu Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Tyr Asp Phe Glu Gly Ser Thr 340 345 350 Gln Gly Trp His Gly Ser Asn Val Met Gly Gly Pro Trp Ser Val Thr 355 360 365 Glu Trp Gly Ala Ser Gly Asn Tyr Ser Leu Lys Gly Asp Val Asn Leu 370 375 380 Ser Ser Asn Ser Ser His Glu Leu Tyr Ser Glu Gln Ser Arg Asn Leu 385 390 395 400 His Gly Tyr Ser Gln Leu Asn Ala Thr Val Arg His Ala Asn Trp Gly 405 410 415 Asn Pro Gly Asn Gly Met Asn Ala Arg Leu Tyr Val Lys Thr Gly Ser 420 425 430 Asp Tyr Thr Trp Tyr Ser Gly Pro Phe Thr Arg Ile Asn Ser Ser Asn 435 440 445 Ser Gly Thr Thr Leu Ser Phe Asp Leu Asn Asn Ile Glu Asn Ser His 450 455 460 His Val Arg Glu Ile Gly Val Gln Phe Ser Ala Ala Asp Asn Ser Ser 465 470 475 480 Gly Gln Thr Ala Leu Tyr Val Asp Asn Val Thr Leu Arg 485 490 <210> 39 <211> 1551 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 39 atggggtggt ttttagtgat tttacgcaag tggttgattg cttttgtcgc atttttactg 60 atgttctcgt ggactggaca acttacgaac aaagcacatg ctgcaagcgg attttatgta 120 agcggtacca aattattgga tgctacagga caaccatttg tgatgcgagg agtcaatcat 180 gcgcacacat ggtataaaga tcaactatcc accgcaatac cagccattgc taaaacaggt 240 gccaacacga tacgtattgt actggcgaat ggacacaaat ggacgcttga tgatgtaaac 300 accgtcaaca atattctcac cctctgtgaa caaaacaaac taattgccgt tttggaagta 360 catgacgcta caggaagcga tagtctttcc gatttagaca acgccgttaa ttactggatt 420 ggtattaaaa gcgcgttgat cggcaaggaa gaccgtgtaa tcattaatat agctaacgag 480 tggtacggaa catgggatgg agtcgcctgg gctaatggtt ataagcaagc catacccaaa 540 ctgcgtaatg ctggtctaac tcatacgctg attgttgact ccgctggatg gggacaatat 600 ccagattcgg tcaaaaatta tgggacagaa gtactgaatg cagacccgtt aaaaaacaca 660 gtattctcta tccatatgta tgaatatgct gggggcaatg caagtaccgt caaatccaat 720 attgacggtg tgctgaacaa gaatcttgca ctgattatcg gcgaatttgg tggacaacat 780 acaaacggtg atgtggatga agccaccatt atgagttatt cccaagagaa gggagtcggc 840 tggttggctt ggtcctggaa gggaaatagc agtgatttgg cttatctcga tatgacaaat 900 gattgggctg gtaactccct cacctcgttc ggtaataccg tagtgaatgg cagtaacggc 960 attaaagcaa cttctgtgtt atccggcatt tttggaggtg ttacgccaac ctcaagccct 1020 acttctacac ctacatctac gccaacctca actcctactc ctacgccaag tccgaccccg 1080 agtccaggta ataacgggac gatcttatat gatttcgaaa caggaactca aggctggtcg 1140 ggaaacaata tttcgggagg cccatgggtc accaatgaat ggaaagcaac gggagcgcaa 1200 actctcaaag ccgatgtctc cttacaatcc aattccacgc atagtctata tataacctct 1260 aatcaaaatc tgtctggaaa aagcagtctg aaagcaacgg ttaagcatgc gaactggggc 1320 aatatcggca acgggattta tgcaaaacta tacgtaaaga ccgggtccgg gtggacatgg 1380 tacgattccg gagagaatct gattcagtca aacgacggta ccattttgac actatccctc 1440 agcggcattt cgaatttgtc ctcagtcaaa gaaattgggg tagaattccg cgcctcctca 1500 aacagtagtg gccaatcagc tatttatgta gatagtgtta gtctgcaata a 1551 <210> 40 <211> 516 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 40 Met Gly Trp Phe Leu Val Ile Leu Arg Lys Trp Leu Ile Ala Phe Val 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Met Phe Ser Trp Thr Gly Gln Leu Thr Asn Lys Ala 20 25 30 His Ala Ala Ser Gly Phe Tyr Val Ser Gly Thr Lys Leu Leu Asp Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Pro Phe Val Met Arg Gly Val Asn His Ala His Thr Trp 50 55 60 Tyr Lys Asp Gln Leu Ser Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly 65 70 75 80 Ala Asn Thr Ile Arg Ile Val Leu Ala Asn Gly His Lys Trp Thr Leu 85 90 95 Asp Asp Val Asn Thr Val Asn Asn Ile Leu Thr Leu Cys Glu Gln Asn 100 105 110 Lys Leu Ile Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Ser Asp Ser 115 120 125 Leu Ser Asp Leu Asp Asn Ala Val Asn Tyr Trp Ile Gly Ile Lys Ser 130 135 140 Ala Leu Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu 145 150 155 160 Trp Tyr Gly Thr Trp Asp Gly Val Ala Trp Ala Asn Gly Tyr Lys Gln 165 170 175 Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asn Ala Gly Leu Thr His Thr Leu Ile Val 180 185 190 Asp Ser Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Asp Ser Val Lys Asn Tyr Gly 195 200 205 Thr Glu Val Leu Asn Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Val Phe Ser Ile 210 215 220 His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Ser Thr Val Lys Ser Asn 225 230 235 240 Ile Asp Gly Val Leu Asn Lys Asn Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe 245 250 255 Gly Gly Gln His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser 260 265 270 Tyr Ser Gln Glu Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly 275 280 285 Asn Ser Ser Asp Leu Ala Tyr Leu Asp Met Thr Asn Asp Trp Ala Gly 290 295 300 Asn Ser Leu Thr Ser Phe Gly Asn Thr Val Val Asn Gly Ser Asn Gly 305 310 315 320 Ile Lys Ala Thr Ser Val Leu Ser Gly Ile Phe Gly Gly Val Thr Pro 325 330 335 Thr Ser Ser Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ser Thr Pro 340 345 350 Thr Pro Thr Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Gly Asn Asn Gly Thr Ile 355 360 365 Leu Tyr Asp Phe Glu Thr Gly Thr Gln Gly Trp Ser Gly Asn Asn Ile 370 375 380 Ser Gly Gly Pro Trp Val Thr Asn Glu Trp Lys Ala Thr Gly Ala Gln 385 390 395 400 Thr Leu Lys Ala Asp Val Ser Leu Gln Ser Asn Ser Thr His Ser Leu 405 410 415 Tyr Ile Thr Ser Asn Gln Asn Leu Ser Gly Lys Ser Ser Leu Lys Ala 420 425 430 Thr Val Lys His Ala Asn Trp Gly Asn Ile Gly Asn Gly Ile Tyr Ala 435 440 445 Lys Leu Tyr Val Lys Thr Gly Ser Gly Trp Thr Trp Tyr Asp Ser Gly 450 455 460 Glu Asn Leu Ile Gln Ser Asn Asp Gly Thr Ile Leu Thr Leu Ser Leu 465 470 475 480 Ser Gly Ile Ser Asn Leu Ser Ser Val Lys Glu Ile Gly Val Glu Phe 485 490 495 Arg Ala Ser Ser Asn Ser Ser Gly Gln Ser Ala Ile Tyr Val Asp Ser 500 505 510 Val Ser Leu Gln 515 <210> 41 <211> 984 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 41 atgagacaac ttttagcaaa aggtatttta gctgcactgg tcatgatgtt agcgatgtat 60 ggattgggga atctctcttc taaagcttcg gctgcaacag gtttttatgt aagcggtacc 120 actctatatg attctactgg taaacctttt gtaatgcgcg gtgtcaatca ttcgcatacc 180 tggttcaaaa atgatctaaa tgcagccatc cctgctattg ccaaaacagg tgcaaataca 240 gtacgtatcg ttttatctaa tggtgttcag tatactagag atgatgtaaa ctcagtcaaa 300 aatattattt ccctggttaa ccaaaacaaa atgattgctg ttcttgaggt gcatgatgct 360 accggtaaag acgattacgc ttctcttgat gccgctgtaa actactggat cagcatcaaa 420 gatgccttga ttggcaagga agatcgagtc attgttaata ttgccaatga atggtacggt 480 acatggaatg gcagtgcttg ggcagatggt tataagcagg ctattcccaa actaagaaat 540 gcaggcatca aaaacacttt aatcgttgat gccgccggct ggggacaatg tcctcaatcg 600 atcgttgatt acgggcaaag tgtatttgca gcagattcgc ttaaaaatac aattttctct 660 attcacatgt atgaatatgc aggcggtaca gatgcgatcg tcaaaagcaa tatggaaaat 720 gtactgaaca aaggacttcc tttgatcatc ggtgaatttg gcgggcagca tacaaacggc 780 gatgtagatg aacatgcaat tatgcgttat ggtcagcaaa aaggtgtagg ttggctggca 840 tggtcgtggt atggcaacaa tagtgaactc agttatctgg atttggctac aggtcccgcc 900 ggtagtctga caagtatcgg caatacgatt gtaaatgatc catatggtat caaagctacc 960 tcgaaaaaag cgggtatctt ctaa 984 <210> 42 <211> 327 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 42 Met Arg Gln Leu Leu Ala Lys Gly Ile Leu Ala Ala Leu Val Met Met 1 5 10 15 Leu Ala Met Tyr Gly Leu Gly Asn Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Val Ser Gly Thr Thr Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys 35 40 45 Pro Phe Val Met Arg Gly Val Asn His Ser His Thr Trp Phe Lys Asn 50 55 60 Asp Leu Asn Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn Thr 65 70 75 80 Val Arg Ile Val Leu Ser Asn Gly Val Gln Tyr Thr Arg Asp Asp Val 85 90 95 Asn Ser Val Lys Asn Ile Ile Ser Leu Val Asn Gln Asn Lys Met Ile 100 105 110 Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Asp Tyr Ala Ser 115 120 125 Leu Asp Ala Ala Val Asn Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Asp Ala Leu Ile 130 135 140 Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Trp Asn Gly Ser Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro 165 170 175 Lys Leu Arg Asn Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala 180 185 190 Gly Trp Gly Gln Cys Pro Gln Ser Ile Val Asp Tyr Gly Gln Ser Val 195 200 205 Phe Ala Ala Asp Ser Leu Lys Asn Thr Ile Phe Ser Ile His Met Tyr 210 215 220 Glu Tyr Ala Gly Gly Thr Asp Ala Ile Val Lys Ser Asn Met Glu Asn 225 230 235 240 Val Leu Asn Lys Gly Leu Pro Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Gln 245 250 255 His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu His Ala Ile Met Arg Tyr Gly Gln 260 265 270 Gln Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Asn Ser 275 280 285 Glu Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Leu Thr 290 295 300 Ser Ile Gly Asn Thr Ile Val Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Lys Ala Thr 305 310 315 320 Ser Lys Lys Ala Gly Ile Phe 325 <210> 43 <211> 981 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 43 atggccaagt tgcaaaaggg tacaatctta acagtcattg cagcactgat gtttgtcatt 60 ttggggagcg cggcgcccaa agccgcagca gctacaggtt tttacgtgaa tggaggcaaa 120 ttgtacgatt ctacgggtaa accattttac atgaggggta tcaatcatgg gcactcctgg 180 tttaaaaatg atttgaacac ggctatccct gcgatcgcaa aaacgggtgc caatacggta 240 cgaattgttt tatcaaacgg tacacaatac accaaggatg atctgaattc cgtaaaaaac 300 atcattaatg tcgtaaatgc aaacaagatg attgctgtgc ttgaagtaca cgatgccact 360 gggaaagatg acttcaactc gttggatgca gcggtcaact actggataag catcaaagaa 420 gcactgatcg ggaaggaaga tcgggttatt gtaaacattg caaacgagtg gtacggaaca 480 tggaacggaa gcgcgtgggc tgacgggtac aaaaaagcta ttccgaaatt aagagatgcg 540 ggtattaaaa ataccttgat tgtagatgca gcaggctggg gtcagtaccc tcaatcgatc 600 gtcgattacg gacaaagcgt attcgccgcg gattcacaga aaaatacggc gttttccatt 660 cacatgtatg agtatgcagg caaggatgcg gccaccgtca aatccaatat ggaaaatgtg 720 ctgaataagg ggctggcctt aatcattggt gagttcggag gatatcacac caatggagat 780 gtcgatgaat atgcaatcat gaaatatggt ctggaaaaag gggtaggatg gcttgcatgg 840 tcttggtacg gtaatagctc tggattaaac tatcttgatt tggcaacagg acctaacggc 900 agtttgacga gctatggtaa tacggttgtc aatgatactt acggaattaa aaatacgtcc 960 caaaaagcgg gaatctttta a 981 <210> 44 <211> 326 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 44 Met Ala Lys Leu Gln Lys Gly Thr Ile Leu Thr Val Ile Ala Ala Leu 1 5 10 15 Met Phe Val Ile Leu Gly Ser Ala Ala Pro Lys Ala Ala Ala Ala Thr 20 25 30 Gly Phe Tyr Val Asn Gly Gly Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys Pro 35 40 45 Phe Tyr Met Arg Gly Ile Asn His Gly His Ser Trp Phe Lys Asn Asp 50 55 60 Leu Asn Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn Thr Val 65 70 75 80 Arg Ile Val Leu Ser Asn Gly Thr Gln Tyr Thr Lys Asp Asp Leu Asn 85 90 95 Ser Val Lys Asn Ile Ile Asn Val Val Asn Ala Asn Lys Met Ile Ala 100 105 110 Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Asp Phe Asn Ser Leu 115 120 125 Asp Ala Ala Val Asn Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Glu Ala Leu Ile Gly 130 135 140 Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Thr 145 150 155 160 Trp Asn Gly Ser Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Lys Ala Ile Pro Lys 165 170 175 Leu Arg Asp Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala Gly 180 185 190 Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Tyr Gly Gln Ser Val Phe 195 200 205 Ala Ala Asp Ser Gln Lys Asn Thr Ala Phe Ser Ile His Met Tyr Glu 210 215 220 Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Ser Asn Met Glu Asn Val 225 230 235 240 Leu Asn Lys Gly Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Tyr His 245 250 255 Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Tyr Ala Ile Met Lys Tyr Gly Leu Glu 260 265 270 Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Ser Ser Gly 275 280 285 Leu Asn Tyr Leu Asp Leu Ala Thr Gly Pro Asn Gly Ser Leu Thr Ser 290 295 300 Tyr Gly Asn Thr Val Val Asn Asp Thr Tyr Gly Ile Lys Asn Thr Ser 305 310 315 320 Gln Lys Ala Gly Ile Phe 325 <210> 45 <211> 1110 <212> DNA <213> Bacillus nealsonii <400> 45 atggttgtga aaaaattatc aagttttatt ctaattttac tgttagttac ttctgctttg 60 tttattactg attcaaaagc aagtgctgct tcgggatttt atgtaagcgg taccacttta 120 tatgatgcaa cgggtaaacc gtttactatg agaggtgtaa atcatgctca ttcttggttt 180 aaagaagatt cagcagctgc tattccagca atagcagcaa ctggagcaaa cacagtaaga 240 attgttttat ctgatggtgg acaatacacc aaagatgata ttaatactgt taaaagcctt 300 ttgtcattgg cagaaaaaat aaacttgcat tctggagtca tgacgcacag aaaagacgat 360 gtggaatctt taaatcgtgc agtcgattat tggatcagct taaaagacac attgataggc 420 aaagaagata aagtgataat aaacattgcg aatgaatggt atggtacttg ggatggtgcg 480 gcatgggcag ctggttataa acaagctatt ccaaagttac ggaatgcagg cttaaatcat 540 actctaataa ttgattctgc tggatgggga caatacccag cttccattca taattatgga 600 aaagaggtat ttaatgcgga tccattgaaa aatacaatgt tctccataca tatgtatgag 660 tacgctggtg gggatgcagc aactgttaag tcaaatattg atggtgtctt aaaccaagga 720 ttagctttaa taataggaga gtttggacaa aaacatacaa atggagatgt agatgaagca 780 accatcatga gttattcaca gcaaaaaaat atcggttggc ttgcatggtc ttggaaagga 840 aatagcacag attggagcta tctggattta agcaacgatt ggtctggtaa cagtttaact 900 gattggggta atacggttgt taatggggca aatgggttaa aagccacttc aaaactaagc 960 ggagtattcg gtagctcagc aggaacaaat aatatattgt atgattttga aagcggtaat 1020 caaaactgga ctggatcaaa tatcgcgggt ggaccttgga acgaattcaa gcttgatatc 1080 attcaggacg agcctcagac tccagcgtaa 1110 <210> 46 <211> 369 <212> PRT <213> Bacillus nealsonii <400> 46 Met Val Val Lys Lys Leu Ser Ser Phe Ile Leu Ile Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Thr Ser Ala Leu Phe Ile Thr Asp Ser Lys Ala Ser Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Tyr Val Ser Gly Thr Thr Leu Tyr Asp Ala Thr Gly Lys Pro Phe 35 40 45 Thr Met Arg Gly Val Asn His Ala His Ser Trp Phe Lys Glu Asp Ser 50 55 60 Ala Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Ala Thr Gly Ala Asn Thr Val Arg 65 70 75 80 Ile Val Leu Ser Asp Gly Gly Gln Tyr Thr Lys Asp Asp Ile Asn Thr 85 90 95 Val Lys Ser Leu Leu Ser Leu Ala Glu Lys Ile Asn Leu His Ser Gly 100 105 110 Val Met Thr His Arg Lys Asp Asp Val Glu Ser Leu Asn Arg Ala Val 115 120 125 Asp Tyr Trp Ile Ser Leu Lys Asp Thr Leu Ile Gly Lys Glu Asp Lys 130 135 140 Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Thr Trp Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Trp Ala Ala Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asn Ala 165 170 175 Gly Leu Asn His Thr Leu Ile Ile Asp Ser Ala Gly Trp Gly Gln Tyr 180 185 190 Pro Ala Ser Ile His Asn Tyr Gly Lys Glu Val Phe Asn Ala Asp Pro 195 200 205 Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly 210 215 220 Asp Ala Ala Thr Val Lys Ser Asn Ile Asp Gly Val Leu Asn Gln Gly 225 230 235 240 Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gln Lys His Thr Asn Gly Asp 245 250 255 Val Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser Tyr Ser Gln Gln Lys Asn Ile Gly 260 265 270 Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Ser Thr Asp Trp Ser Tyr Leu 275 280 285 Asp Leu Ser Asn Asp Trp Ser Gly Asn Ser Leu Thr Asp Trp Gly Asn 290 295 300 Thr Val Val Asn Gly Ala Asn Gly Leu Lys Ala Thr Ser Lys Leu Ser 305 310 315 320 Gly Val Phe Gly Ser Ser Ala Gly Thr Asn Asn Ile Leu Tyr Asp Phe 325 330 335 Glu Ser Gly Asn Gln Asn Trp Thr Gly Ser Asn Ile Ala Gly Gly Pro 340 345 350 Trp Asn Glu Phe Lys Leu Asp Ile Ile Gln Asp Glu Pro Gln Thr Pro 355 360 365 Ala <210> 47 <211> 984 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 47 atgatgttga tatggatgca gggatggaag tctattctag tcgcgatctt ggcgtgtgtg 60 tcagtaggcg gtgggcttcc tagtccagaa gcagccacag gattttatgt aaacggtacc 120 aagctgtatg attcaacggg caaggccttt gtgatgaggg gtgtaaatca tccccacacc 180 tggtacaaga atgatctgaa cgcggctatt ccggctatcg cgcaaacggg agccaatacc 240 gtacgagtcg tcttgtcgaa cgggtcgcaa tggaccaagg atgacctgaa ctccgtcaac 300 agtatcatct cgctggtgtc gcagcatcaa atgatagccg ttctggaggt gcatgatgcg 360 acaggcaaag atgagtatgc ttcccttgaa gcggccgtcg actattggat cagcatcaaa 420 ggggcattga tcggaaaaga agaccgcgtc atcgtcaata ttgctaatga atggtatgga 480 aattggaaca gcagcggatg ggccgatggt tataagcagg ccattcccaa attaagaaac 540 gcgggcatta agaatacgtt gatcgttgat gcagcgggat gggggcaata cccgcaatcc 600 atcgtggatg agggggccgc ggtatttgct tccgatcaac tgaagaatac ggtattctcc 660 atccatatgt atgagtatgc cggtaaggat gccgctacgg tgaaaacgaa tatggacgat 720 gttttaaaca aaggattgcc tttaatcatt ggggagttcg gcggctatca tcaaggtgcc 780 gatgtcgatg agattgctat tatgaagtac ggacagcaga aggaagtggg ctggctggct 840 tggtcctggt acggaaacag cccggagctg aacgatttgg atctggctgc agggccaagc 900 ggaaacctga ccggctgggg aaacacggtg gttcatggaa ccgacgggat tcagcaaacc 960 tccaagaaag cgggcattta ttaa 984 <210> 48 <211> 327 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 48 Met Met Leu Ile Trp Met Gln Gly Trp Lys Ser Ile Leu Val Ala Ile 1 5 10 15 Leu Ala Cys Val Ser Val Gly Gly Gly Leu Pro Ser Pro Glu Ala Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys 35 40 45 Ala Phe Val Met Arg Gly Val Asn His Pro His Thr Trp Tyr Lys Asn 50 55 60 Asp Leu Asn Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Gln Thr Gly Ala Asn Thr 65 70 75 80 Val Arg Val Val Leu Ser Asn Gly Ser Gln Trp Thr Lys Asp Asp Leu 85 90 95 Asn Ser Val Asn Ser Ile Ile Ser Leu Val Ser Gln His Gln Met Ile 100 105 110 Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Glu Tyr Ala Ser 115 120 125 Leu Glu Ala Ala Val Asp Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Gly Ala Leu Ile 130 135 140 Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly 145 150 155 160 Asn Trp Asn Ser Ser Gly Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro 165 170 175 Lys Leu Arg Asn Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala 180 185 190 Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Glu Gly Ala Ala Val 195 200 205 Phe Ala Ser Asp Gln Leu Lys Asn Thr Val Phe Ser Ile His Met Tyr 210 215 220 Glu Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Thr Asn Met Asp Asp 225 230 235 240 Val Leu Asn Lys Gly Leu Pro Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Tyr 245 250 255 His Gln Gly Ala Asp Val Asp Glu Ile Ala Ile Met Lys Tyr Gly Gln 260 265 270 Gln Lys Glu Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Ser Pro 275 280 285 Glu Leu Asn Asp Leu Asp Leu Ala Ala Gly Pro Ser Gly Asn Leu Thr 290 295 300 Gly Trp Gly Asn Thr Val Val His Gly Thr Asp Gly Ile Gln Gln Thr 305 310 315 320 Ser Lys Lys Ala Gly Ile Tyr 325

Claims (16)

  1. 서열번호 16(Man7)과 적어도 70%의 서열 상동성, 서열번호 12(Man6)과 적어도 93%의 서열 상동성 및/또는 서열번호 20(Man14)과 적어도 79%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 만나나아제 효소를 포함하는 효소 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 벤조산(benzoic acid), 벤조산 나트륨(sodium benzoate), 하이드록시벤조산(hydroxybenzoate), 시트르산(citric acid), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 보존제;
    b. 선택적으로, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol), 당(sugar), 당 알코올(sugar alcohol), 젖산(lactic acid), 붕산(boric acid), 붕산 유도체(boric acid derivative), 방향족 붕산염 에스터(aromatic borate ester), 페닐 보로닉 산 유도체(phenyl boronic acid derivative), 펩타이드(peptide) 또는 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리올.
    c. 선택적으로, 매개체가 있거나 없는 프로테아제(proteases), 아밀라아제(amylases), 셀룰라아제(cellulases), 리파아제(lipases), 자일라나아제(xylanases), 만나나아제(mannanases), 큐티나아제(cutinases), 에스터라아제(esterases), 파이타아제(phytases), DNA분해효소(DNAses), 펙티나아제(pectinases), 펙티놀리틱 효소(pectinolytic enzymes), 펙테이트 리아제(pectate lyases), 탄수화물 분해효소(carbohydrases), 아라비나아제(arabinases), 갈락타나아제(galactanases), 잔타나아제(xanthanases), 자일로글루카나아제(xyloglucanases), 라카아제(laccases), 과산화효소(peroxidases) 및 산화효소, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어노 하나의 효소;
    d. 선택적으로, 말토덱스트린(maltodextrin), 곡물가루(flour), 염화나트륨(sodium chloride), 황산염(sulfate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전재를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 용액(solution), 분산액(dispersion), 페이스트(paste), 분말(powder), 과립(granule), 그래뉼레이트(granulate), 코팅 그래뉼레이트(coated granulate), 정제(tablet), 케이크(cake), 결정(crystal), 결정 슬러리(crystal slurry), 겔(gel) 또는 펠렛(pellet)과 같은 액제 조성물 또는 고체 조성물 형태인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  4. 만나나아제 활성 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 상동성, 서열번호 12의 아미노산 서열과 적어도 93%의 서열 상동성 및/또는 서열번호 20의 아미노산서열과 적어도 79%의 서열 상동성을 갖는 적어도 하나의 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 유전 요소(genetic element)를 포함하는 재조합 숙주세포로서,
    상기 숙주세포는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주세포:
    진균 세포, 아스코마이코타 문(Division Ascomycota), 페지조마이코티나 아문(Subdivision Pezizomycotina)에서 유래;
    바람직하게는 소르다리오미이세트 강(Class Sordariomycete), 하이포크레오마이세트 아강(Subclass Hypocreomycetidae), 하이포크릴레스(Hypocreales) 및 마이크로아스칼레스(Microascales) 및 아스퍼질러스(Aspergillus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 마이셀리오프토라(Myceliophthora) 및 휴미콜라(Humicola) 목(order)으로 구성된 군에서 유래;
    더욱 바람직하게는, 하이포크리세(Hypocreacea), 넥트리아세(Nectriaceae), 클라비치피타세(Clavicipitaceae), 마이크로아스카세(Microascaceae) 과(family) 및 Genera 트리코더마(Trichoderma; 하이포크리아의 아나모프(anamorph of Hypocrea)), 푸사리움(Fusarium), 지버렐라(Gibberella), 넥트리아(Nectria), 스타치보트리(Stachybotrys), 클라비셉(Claviceps), 메타히지움(Metarhizium), 빌로시클라바(Villosiclava), 오피오코르다이셉(Ophiocordyceps), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 및 셰도스포리움(Scedosporium) 종으로 구성된 군에서 유래;
    더욱 바람직하게는, 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei; Hypocrea jecorina), T. 시트리노비리데(T. citrinoviridae), T. 롱기브라키아툼(T. longibrachiatum), T. 바이렌(T. virens), T. 하지아눔(T. harzianum), T. 아스페렐럼(T. asperellum), T. 아트로비리데(T. atroviridae), T. 파라리세이(T. parareesei), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), F. 그라미내눔(F. gramineanum), F. 슈도그람이니어룸(F. pseudograminearum), F. 베네나툼(F. venenatum), 지버렐라 후지코로이(Gibberella fujikuroi), G. 모닐리포르미스(G. moniliformis), G. 제에(G. zeaea), 넥트리아(Nectria; Haematonectria) 헤마토코카(haematococca), 스타키보트리스 차타룸(Stachybotrys chartarum), S. 클로로할로나타(S. chlorohalonata), 클라비셉스 푸르푸리아(Claviceps purpurea), 메타히지움 아크리둠(Metarhizium acridum), M. 아니소플리에(M. anisopliae), 빌로시클라바 바이렌(Villosiclava virens), 오피오코르다이셉스 시넨시스(Ophiocordyceps sinensis), 아크레모니움(Acremonium; Cephalosporium) 크리소제넘 (chrysogenum), 및 셰도스포리움 아피오스퍼멈(Scedosporium apiospermum), 및 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 크리스포리움(Chrysosporium) 럭코벤스(lucknowense), 마이셀리오 프토라 테르모필라(Myceliophthora thermophila), 휴미콜라 인솔렌(Humicola insolens), 및 휴미콜라 그리시아(Humicola grisea)로 구성된 군에서 유래한 사상성 진균 세포(filamentous fungal cells);
    박테리아 세포, 바람직하게는 B. 서브틸리스(B.subtilis), B.린체니르포미스(B. licheniformis), B. 메가테리움(B. megaterium), B.아밀로리퀴파시엔(B. amyloliquefaciens), B. 푸밀리스(B. pumilus) 와 같은 그람 양성 바실리(gram positive Bacilli), 에스커리치아 콜리(Escherichia coli)와 같은 그람 음성 박테리아, 스트렙토 마이셉스 종(Streptomyces sp.)과 같은 악티노마이세탈레스(actinomycetales), 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)와 같은 효모,
    가장 바람직하게는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 또는 바실러스(Bacillus).
  5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 만나나아제 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것 외에 다음 중 적어도 하나를 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 숙주세포:
    바실러스 아밀로리파퀴시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 자일라나아제 신호 펩타이드와 같은 분비 신호 서열을 제공하는 아미노산 서열;
    친화성 태그, His-태그와 같은 정제를 용이하게 하는 아미노산 서열;
    CBM과 같은 담체인 아미소산 서열과 같은 생산을 향상시키는 아미노산 서열;
    효소 활성을 갖는 아미노산 서열; 및
    융합 단백질에 탄수화물 결합 부분과 같은 결합 친화성을 제공하는 아미노산 서열.
  6. 만나나아제 활성을 가지며, 제4항 내지 제5항의 숙주세포를 사용하여 수득 가능한 재조합 폴리펩타이드.
  7. 만나나아제 생산방법으로서,
    a. 제4항 내지 제5항의 재조합 숙주세포를 배양하는 단계;
    i. 상기 유전 요소는 폴리펩타이드의 생산 조건에서 재조합 숙주세포에서 재조합 폴리펩타이드의 생산을 조절하는 적어도 하나의 조절 서열(control sequence)을 포함하고;
    ii. 상기 유전 요소는 선택적으로 폴리펩타이드를 숙주세포의 외부로 수송하기 위한 신호 서열을 암호화하는 적어도 하나의 서열을 포함하고;
    iii. 상기 배양은 폴리펩타이드의 생산 조건에서 수행됨; 및
    b. 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 만나나아제 생산방법.
  8. 만난 함유 물질의 분해 또는 변형방법으로서,
    상기 만난 함유 물질을 제1항 내지 제3항의 효소 조성물 또는 제6항의 재조합 폴리펩타이드의 유효한 양으로 처리하는 단계를 포함하는 만난 함유 물질의 분해 또는 변형방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 만난 함유 물질은 식물 기반의 물질, 직물, 폐수, 하수, 오일 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3항의 효소 조성물 또는 제4항 내지 제5항의 재조합 숙주세포로부터 수득 가능한 효소, 및 식물 기원의 하나 이상의 단백질 공급원 또는 만난 함유 물질 또는 부산물, 및
    a. 선택적으로 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 파이타아제(phytase), 자일라나아제(xylanase), 엔도글루카나아제(endoglucanase), 베타-글루카나아제(beta-glucanase) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
    b. 선택적으로 말토덱스트린(maltodextrin), 곡물가루(flour), 염(salt), 염화나트륨(sodium chloride), 황산염(sulfate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전재를 포함하는 동물사료.
  11. 제1항 내지 제3항의 효소 조성물 또는 제4항 내지 제5항의 재조합 숙주세포로부터 수득 가능한 효소; 및
    a. 선택적으로 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 파이타아제(phytase), 자일라나아제(xylanase), 엔도글루카나아제(endoglucanase), 베타-글루카나아제(beta-glucanase) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
    b. 선택적으로 말토덱스트린(maltodextrin), 곡물가루(flour), 염(salt), 염화나트륨(sodium chloride), 황산염(sulfate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전재를 포함하는 사료 보충제.
  12. 제10항의 동물 사료 또는 제11항의 사료 보충제의
    a. 동물 급여, 바람직하게는 단일 위 동물 또는 반추동물; 및/또는
    b. 동물의 체중 증가 개선을 위한 용도.
  13. 제1항 내지 제3항의 효소 조성물 또는 제4항 내지 제5항의 재조합 숙주세포로부터 수득 가능한 효소의 세제에서의 용도.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세제는 액체 세제 또는 건조 세제이며, 바람직하게는 분말, 바, 정제, 파우치, 페이스트, 젤, 액체, 과립 또는 그래뉼레이트인 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 제1항 내지 제3항의 효소 조성물 또는 제4항 내지 제5항의 재조합 숙주세포로부터 수득 가능한 효소의 오일-드릴링(oil drilling)에서의 용도.
  16. 제1항 내지 제3항의 효소 조성물 또는 제4항 내지 제5항의 재조합 숙주세포로부터 수득 가능한 효소의 커피 추출물, 과즙, 파인애플 즙 또는 두유의 가공에서의 용도.
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