BR112019020799A2 - mananases bacterianas - Google Patents

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HERBST Daniela
Vehmaanperä Jari
Juntunen Kari
Järvinen Kristiina
Valtakari Leena
Seefried Michael
Mussmann Nina
Lorenz Patrick
Ojapalo Pentti
Wieland Susanne
Leinonen Taija
Puranen Terhi
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Abstract

a presente descrição está relacionada a novas mananases, composições compreendendo mananase, a métodos para produzir mananases e a métodos para usar mananases para degradar e modificar material que contém manano.

Description

MANANASES BACTERIANAS
CAMPO DA INVENÇÃO [001] Esta invenção se refere a enzimas de mananase bacteriana. As mananases são úteis em aplicações industriais em que degradação ou modificação de manano é desejada, como em aplicações de lavanderia e limpeza, na indústria de ração, alimento, polpa e petróleo. A invenção também fornece enzimas de mananases úteis, polinucleotídeos que codificam essas enzimas, composições enzimáticas e métodos para sua produção e seu uso.
ANTECEDENTES [002] Mananos são polissacarídeos que contêm manose encontrados em diversas plantas. Mananos são fracamente solúveis em um ambiente aquoso e suas propriedades físico-químicas dão origem a dispersões viscosas. Adicionalmente, mananos têm alta capacidade de ligação a água. Todas essas características causam problemas em diversas indústrias que incluem fabricação de cerveja, cozimento, nutrição animal e aplicações de lavanderia e limpeza.
[003] Em dietas baseadas em planta, β-mananos diferentes estão presentes e, dependendo de suas quantidades e propriedades, os mesmos podem compreender digestão de nutriente, colonização microbiana e desempenho de crescimento. A degradação enzimática de mananos reduz a viscosidade digestiva de mananos altamente solúveis em água e leva à produção de manooligossacarídeos que pode formar mananos lineares insolúveis em água presentes em leguminosas. A mananase aumenta o ganho médio diário, eficiência de ração, uniformidade de peso e habitabilidade em todos os animais monogástricos.
[004] Para aplicações de ração animal, como ração para animais monogástricos com dietas de cereais, manano é um fator contribuinte à viscosidade de teores de intestino e o mesmo, desse modo, afeta de modo
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2/68 adverso a digestibilidade de ração e a taxa de crescimento animal. Para ruminantes, manano representa um componente substancial de ingestão de fibras e uma digestão mais completa de manano facilitaria maiores eficiências de conversão de ração.
[005] Para aplicações de lavanderia e limpeza, composições enzimáticas que compreendem mananase podem ser usadas para degradar manano. Entretanto, fornecer mananases que são estáveis em condições de armazenamento e uso variantes enquanto ainda mostram boa atividade de degradação de manano é difícil.
[006] É um objetivo da presente invenção fornecer enzimas inovadoras que exibem atividade de mananase quando aplicadas em processos industriais diferentes, assim como composições enzimáticas para degradação ou modificação de manano.
SUMÁRIO [007] De acordo com o primeiro aspecto da invenção, é fornecida uma composição enzimática que compreende pelo menos uma enzima mananase que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 16 (Man7), pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12 (Man6) e/ou pelo menos 79% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20 (Manl4).
[008] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição enzimática que compreende pelo menos uma enzima mananase com um sítio ativo que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 79% de identidade de sequência com os aminoácidos 27-331 de Man7SEQID NO: 16;
pelo menos 95% de identidade de sequência com os aminoácidos 35-324 de Man6SEQID NO: 12; e/ou
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3/68 pelo menos 85% de identidade de sequência com os aminoácidos 17-314 de Manl4SEQID NO: 20.
[009] Em uma modalidade, a pelo menos uma enzima mananase tem um sítio ativo, conforme definido acima.
[010] A presente composição enzimática é vantajosa em ter boa estabilidade e atividade de mananase em detergentes e em formulações. A mesma também é adequada para diversas aplicações industriais em que a degradação ou modificação de manano é desejada. As mananases da composição enzimática da invenção são adequadas para degradar e modificar material que contém manano em diversos ambientes químicos.
[011] Conforme evidenciado pelos Exemplos, as mananases compreendidas na composição enzimática de acordo com a invenção têm uma estrutura e propriedades que permitem a produção em células hospedeiras recombinantes e tornam as mesmas úteis em composições enzimáticas para aplicações industriais. Um elemento estrutural comum compartilhado por Man6, Man7 e Manl4 é o domínio GH5. Outro elemento estrutural comum é uma identidade de sequência de 60% entre Man6 e Man7, uma identidade de sequência de 57% entre Man6 e Manl4 e identidade de sequência de 69% entre Man7 e Manl4. Outra característica estrutural comum é o sítio ativo. Esses elementos estruturais são característicos para as mananases da invenção.
[012] De acordo com o segundo aspecto, é fornecida uma célula hospedeira recombinante que compreende elementos genéticos que permitem a produção de pelo menos um polipeptídeo recombinante que tem atividade de mananase e pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, pelo menos 93% de identidade de sequência com a sequência de
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4/68 aminoácidos de SEQ ID NO: 12, e/ou pelo menos 79% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em:
células fúngicas, células fúngicas filamentosas de Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotincr, preferencialmente a partir do grupo que consiste em membros da Classe Sordariomycetes, Subclasse Hypocreomycetidae, Ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicolcr, mais preferencialmente a partir do grupo que consiste em Famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae e Gêneros Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium, e Scedosporium;
mais preferencialmente a partir do grupo que consiste em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, e Scedosporium apiospermum, e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophile, Humicola insolens e Humicola grisea, células bacterianas, preferencialmente Bacilli gram positivas, como B. subtilis, B. Hcheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus,
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5/68 bactérias gram-negativas, como Escherichia coli, actinomicetos, como Streptomyces sp. e leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, ainda mais preferencialmente Trichoderma reesei ou Bacillus.
[013] A célula hospedeira recombinante pode ser usada para produzir mananase e portar a mananase de codificação de polinucleotídeo. A célula hospedeira recombinante também é útil na preparação de mananases com propriedades diferentes. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser selecionada, que fornece modificações pós-translacionais benéficas para estabilidade ou atividade, ou que facilita pós-processamento e formulação de mananase produzida na célula hospedeira.
[014] De acordo com o terceiro aspecto, é fornecido um polipeptideo recombinante que tem atividade de mananase e é obtenível usando-se a célula hospedeira do segundo aspecto.
[015] O polipeptideo recombinante pode ter propriedades estruturais ou funcionais que diferenciam o mesmo de um polipeptideo nativo que tem a mesma sequência de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos semelhante. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser selecionada a qual fornece o polipeptideo recombinante produzido com modificações póstranslacionais, uma falta do mesmo ou localização para facilitar produção e/ou formulação do polipeptideo recombinante.
[016] De acordo com o quarto aspecto, é fornecido um método para produzir mananase que compreende:
a. cultivar uma célula hospedeira recombinante do segundo aspecto, em que
i. os elementos genéticos compreendem pelo menos uma sequência
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6/68 de controle que controla a produção do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira recombinante sob condições que permitem a produção do polipeptídeo;
ii. os elementos genéticos compreendem opcionalmente pelo menos uma sequência que codifica uma sequência-sinal para transportar o polipeptídeo fora da célula hospedeira; e iii. cultivo é realizado em condições que permitem a produção do polipeptídeo; e
b. recuperar o polipeptídeo.
[017] O método fornece uma forma eficiente para produzir mananase. Devido ao fato de que a mananase é produzida em uma célula hospedeira recombinante, um sistema de produção de mananase é fornecido, o qual pode ser otimizado, personalizado e controlado de uma forma desejada. A mananase produzida por meio do método pode ser diferente de mananases naturais em um nível estrutural. A mananase produzida por meio do método pode, por exemplo, ter um padrão de glicosilação ou outra modificação pós-translacional, que causa diferenças na estrutura e/ou função em comparação com uma mananase natural, como uma mananase que tem a sequência de aminoácidos semelhante ou a mesma sequência de aminoácidos, ou em comparação com uma mananase que tem a mesma sequência de aminoácidos, mas é produzida em outra célula hospedeira. A mananase produzida por meio do método pode ser usada como tal ou formulada em uma formulação selecionada.
[018] De acordo com outro aspecto, é fornecida uma preparação enzimática que compreende um polipeptídeo recombinante que tem atividade de mananase e é obtenível usando-se a célula hospedeira do segundo aspecto.
[019] A preparação ou composição enzimática pode compreender adicionalmente outra enzima (ou enzimas) selecionada a partir do grupo que
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7/68 consiste em proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, enzimas pectinolíticas, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases com ou sem um mediador, assim como aditivos adequados selecionados a partir do grupo que consiste em estabilizadores, tampões, tensoativos, agentes de clareamento, mediadores, agentes anticorrosão, construtores, agentes antirredeposição, branqueadores ópticos, tintas, pigmentos, perfumes, cáusticas, abrasivos e conservantes.
[020] De acordo com um quinto aspecto, é fornecido um método para degradar ou modificar material que contém manano que compreende tratar o dito material que contém manano com uma quantidade eficaz da presente composição enzimática ou do polipeptideo recombinante.
[021] De acordo com um sexto aspecto, é fornecida uma ração animal que compreende a presente composição enzimática ou a célula hospedeira recombinante e pelo menos uma fonte proteica de origem vegetal ou um subproduto ou produto que contém manano, e
a. Opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase ou uma combinação destas; e
b. Opcionalmente pelo menos uma carga selecionada a partir de maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou uma combinação destes.
[022] De acordo com um sétimo aspecto, é fornecido um suplemento alimentar que compreende a presente composição enzimática ou a enzima obtenível a partir da célula hospedeira; e
a. Opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase ou uma combinação
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8/68 destas; e
b. Opcionalmente pelo menos uma carga selecionada a partir de maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou uma combinação destes.
[023] A ração e o suplemento alimentar aperfeiçoam valor nutricional de ração em comparação com uma ração sem mananase. A presente composição enzimática degrada manano presente na ração e, desse modo, torna o mesmo mais facilmente digestível para o animal. Em particular para refeição de soja que contém alimentações de oligossacarídeos de manano que resultam de digestão enzimática têm efeitos benéficos nos micróbios intestinais e, consequentemente, no desempenho dos animais. O efeito de mananases pode ser aprimorado incluindo-se xilanase para digerir arabinoxilanos presentem em dietas baseadas em soja e milho. Mananase também pode ser usada para modificar propriedades reológicas de rações úmidas.
[024] Em uma modalidade, a ração pode compreender proteína animal, como refeição de carne ou refeição de ossos.
[025] De acordo com um oitavo aspecto, é fornecido um use e um método para usar a ração animal do sexto aspecto ou o suplemento alimentar do sétimo aspecto na:
a. ração de animais, preferencialmente animais monogástricos e ruminantes;
b. aperfeiçoamento de ganho de peso de animais.
[026] De acordo com um nono aspecto, é fornecido um uso de e um método para usar a presente composição enzimática ou a enzima obtenível a partir da célula hospedeira em um detergente.
[027] Em uma modalidade da presente invenção, a composição de detergente compreende adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais
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9/68 selecionadas a partir do grupo que consiste em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, pectateliase, enzima pectinolítica, esterase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, lacase, DNAse e/ou peroxidase, preferencialmente selecionadas a partir do grupo que consiste em proteases, amilases, celulases e lipases.
[028] Em uma modalidade adicional da presente invenção, a composição de detergente está em uma forma de uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido que tem duas ou mais camadas, uma bolsa que tem um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel ou um líquido regular, compacto ou concentrado. Em uma modalidade, a composição de detergente pode ser uma composição de detergente de lavanderia, preferencialmente, uma composição líquida ou sólida de detergente de lavanderia.
[029] A presente invenção é adicionalmente relacionada ao uso da composição enzimática ou da composição de detergente como revelado na presente invenção para degradar manano.
[030] Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere ao uso da composição enzimática ou da composição de detergente como revelado na presente invenção em um processo de lavanderia.
[031] A presente invenção é adicionalmente relacionada a um método para remover uma mancha de uma superfície, que compreende colocar a superfície em contato com a composição enzimática ou a composição de detergente como revelado na presente invenção.
[032] A presente invenção também se refere a um método para degradar manano que compreende aplicar a composição enzimática ou a composição de detergente como revelado na presente invenção a manano, preferencialmente em que o manano está em uma superfície de um têxtil, ou pelo menos
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10/68 parcialmente embutido em um têxtil.
[033] De acordo com um décimo aspecto, é fornecido um uso, e um método para usar, da presente composição enzimática do primeiro aspecto ou da enzima obtenível a partir da célula hospedeira do terceiro aspecto na extração de petróleo.
[034] A presente composição enzimática é vantajosa na modificação de propriedades reológicas de fluidos de extração de petróleo e para aperfeiçoar a recuperação de petróleo.
[035] De acordo com um décimo primeiro aspecto, fornece-se um uso de, e um método para usar, a presente composição enzimática do primeiro aspecto ou a enzima obtenível a partir da célula hospedeira do terceiro aspecto no processamento de extrato de café, suco de frutas, suco de abacaxi ou leite de soja.
[036] O uso da presente composição enzimática ou da enzima obtenível a partir da célula hospedeira é vantajoso no processamento de extrato de café devido ao fato de que a mesma reduz viscosidade do extrato de café.
[037] O uso da presente composição enzimática ou da enzima obtenível a partir da célula hospedeira é vantajoso no processamento e na fabricação de suco de frutas devido ao fato de que a mesma abaixa a viscosidade e aperfeiçoa a taxa de filtração, estabilidade e ajuda a extrair componentes de fruta.
[038] O uso da presente composição enzimática ou da enzima obtenível a partir da célula hospedeira é vantajosa no processamento e na fabricação de leite de soja devido ao fato de que a mesma aperfeiçoa rendimento, cor, teor de proteína e gosto do leite de soja.
[039] Em outro aspecto, as informações de sequência reveladas na presente invenção que se referem a uma sequência de polinucleotideos que codifica uma mananase da invenção podem ser usadas como uma ferramenta para identificar
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11/68 outras mananases homólogas. Por exemplo, a reação de cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar sequências que codificam outras mananases homólogas a partir de uma variedade de fontes biológicas. Além disso, abordagens de mineração de genoma podem ser usadas para identificar sequências que codificam outras mananases homólogas a partir de bancos de dados de genoma.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [040] A Figura 1 mostra representação esquemática do vetor pEVl para replicação em Bacillus.
[041] A Figura 2 mostra esquematicamente os cassetes de expressão usados na transformação de protoplastos de Trichoderma reesei para superproduzir as proteínas de recombinantes de mananase (Man6, Man7 e Manl4). Os genes de mananase estiveram sob o controle de promotor cel7A/cbhl de T. reesei (pcbhl) e a terminação da transcrição foi assegurada usando-se sequência terminadora cel7A/cbhl de T. reesei (tcbhl). O gene amdS foi incluído como um marcador de transformação.
[042] A Figura 3 descreve o efeito de pH na atividade de proteínas de mananase Man6, Man7 e Manl4 recombinante (produzidas de Bacillus) em tampão de Britton-Robinson de 40 mM a pH 4 a pH 11. A temperatura de reação foi 50 °C e o tempo de reação foi 10 min. Galactomanano de alfarroba reticulado com azurina foi usado como um substrato. Todas as medições foram feitas pelo menos duas vezes. Os pontos de dados são médias de medições separadas.
[043] A Figura 4 mostra o perfil de temperatura de mananases de Man6, Man7 e Manl4 recombinante (produzidas de Bacillus) ensaiadas em tampão de Britton-Robinson de 40 mM a pH 7 com o uso de tempo de reação de 10 min, galactomanano de alfarroba reticulado com azurina foi usado como um substrato. Todas as medições foram feitas pelo menos duas vezes. Os pontos de
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12/68 dados são médias de medições separadas.
[044] A Figura 5 mostra análise de SDS PAGE de mananases bacterianas.
[045] A Figura 6 descreve o desempenho de remoção de mancha de Man6 e Man7 (produzidas em Bacillus e Trichoderma) como um aumento de luz (soma de AL*de 4 manchas) na presença de 4,4 g/L de detergente líquido de uso pesado Comercial A a 40 °C, 285,71 mg/L, 60 min, pH aprox. 8,3 e enzimas dosadas como unidades de atividade. Preparação comercial de Mannawaye4,0 L foi usada para comparação.
[046] A Figura 7 descreve o desempenho de remoção de mancha de Man6 e Man7 (produzidas em Bacillus) como um aumento de luz (soma de AL*de 4 manchas) na presença de 4,4 g/L de detergente líquido de uso pesado Comercial A a 40 °C, 285,71 mg/L, 60 min, pH aprox. 8,3 e enzimas dosadas como proteína de enzima ativa (AEP). A preparação comercial Mannawaye4,0 L foi usada para comparação.
[047] A Figura 8 descreve o desempenho de remoção de mancha de Man6 e Man7 (produzidas em Bacillus) como um aumento de luz (soma de AL*de 4 manchas) na presença de 3,8 g/L de pó de detergente de cor Comercial a 40 °C, 285,71 mg/L, 60 min, pH aprox. 10 e enzimas dosadas como unidades de atividade. A preparação comercial Mannawaye4,0 Lfoi usada para comparação.
[048] A Figura 9 descreve o desempenho de remoção de mancha de Man6 e Man7 (produzidas em Bacillus) como um aumento de luz (soma de AL*de 4 manchas) na presença de 3,8 g/L de pó de detergente de cor Comercial a 40 °C, 285,71 mg/L, 60 min, pH aprox. 10 e enzimas dosadas como proteína de enzima ativa. A preparação comercial Mannaway 4,0 L foi usada para comparação.
[049] A Figura 10 descreve o desempenho de remoção de mancha de Man6 e Man7 (produzidas em Bacillus) como um aumento de luz (soma de AL* de 3 manchas) na presença de 4,2 g/L de pó de detergente de branqueamento
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Comercial a 40 °C, 285,71 mg/L, 60 min, pH aproximadamente 9,5 e enzimas dosadas como proteína de enzima ativa. A preparação comercial Mannawaye4,0 Lfoi usada para comparação.
[050] A Figura 11 descreve o desempenho de remoção de mancha de Manl4 (produzida em Bacillus) como um aumento de luz (soma de AL*de 2 manchas) na presença de 5 g/L de detergente líquido de uso pesado Comercial B a 40 °C, 285,71 mg/L, 60 min, pH aproximadamente 8,3 e enzimas dosadas como unidades de atividade. A preparação comercial Mannawaye4,0 L foi usada para comparação.
[051] A Figura 12 descreve o desempenho de remoção de mancha de Manl4 (produzida em Bacillus) como um aumento de luz (soma de AL*de 2 manchas) na presença de 5 g/L de detergente líquido de uso pesado Comercial B a 40 °C, 285,71 mg/L, 60 min, pH aproximadamente 8,3 e enzimas dosadas como proteína de enzima ativa. A preparação comercial Mannawaye4,0 L foi usada para comparação.
[052] A Figura 13 descreve a estabilidade de Man6 e Man7 (produzidas em Bacillus) em detergente líquido (Cor OMO) a 37 °C. A preparação comercial Mannawaye4,0 Lfoi usada para comparação [053] A Figura 14 descreve a estabilidade de Man7 (produzida tanto em Bacillus quanto em Trichoderma) e Man6 (produzida em Bacillus) em detergente líquido de uso pesado Comercial A. A preparação comercial Mannawaye4,0 L foi usada para comparação.
[054] A Figura 15 mostra um fluxograma de produção de café instantâneo que envolve o uso da mananase da invenção.
LISTAGENS DE SEQUÊNCIA [055] SEQ ID NO: 1 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man6_l [056] SEQ ID NO: 2 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man6_2
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14/68 [057] SEQ ID NO: 3 Sequência do iniciador de oligonucleotideo Man7_l [058] SEQ ID NO: 4 Sequência do iniciador de oligonucleotideo Man7_2 [059] SEQ ID NO: 5 Sequência do iniciador de oligonucleotideo Manl4_l [060] SEQ ID NO: 6 Sequência do iniciador de oligonucleotideo Manl4_2 [061] SEQ ID NO: 7 Sequência do iniciador de oligonucleotideo Vec l [062] SEQ ID NO: 8 Sequência do iniciador de oligonucleotideo Vec_2 [063] SEQ ID NO: 9 A sequência de nucleotídeos da man6 de Bacillus clausii [064] SEQ ID NO: 10 A sequência de nucleotídeos da man6 de Bacillus clausii sem sequência de codificação de peptideo-sinal e com otimização de códon para Trichoderma reesei [065] SEQ ID NO: 11 A sequência de aminoácidos deduzida da Man6 de Bacillus clausii [066] SEQ ID NO: 12 A sequência de aminoácidos deduzida da Man6 de Bacillus clausii sem peptideo-sinal [067] SEQ ID NO: 13 A sequência de nucleotídeos da man7 de Bacillus hemicellulosilyticus [068] SEQ ID NO: 14 A sequência de nucleotídeos da man7 de Bacillus hemicellulosilyticus sem sequência de codificação de peptideo-sinal e com otimização de códon para Trichoderma reesei [069] SEQ ID NO: 15 A sequência de aminoácidos deduzida da Man7 de Bacillus hemicellulosilyticus [070] SEQ ID NO: 16 A sequência de aminoácidos deduzida da Man7 de Bacillus hemicellulosilyticus sem peptideo-sinal [071] SEQ ID NO: 17 A sequência de nucleotídeos da manl4 de Virgibacillus soli [072] SEQ ID NO: 18 A sequência de nucleotídeos da manl4 de Virgibacillus soli sem sequência de codificação de peptideo-sinal e com otimização de códon
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15/68 para Trichoderma reesei [073] SEQ ID NO: 19 A sequência de aminoácidos deduzida da Manl4 de Virgibacillus soli [074] SEQ ID NO: 20 A sequência de aminoácidos deduzida da Manl4 de Virgibacillus soli sem peptideo-sinal [075] SEQ ID NO: 21 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo BMAN1 [076] SEQ ID NO: 22 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo BMAN2 [077] SEQ ID NO: 23 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo BMAN3 [078] SEQ ID NO: 24 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo BMAN4 [079] SEQ ID NO: 25 A sequência de nucleotideos de man31 de Bacillus pumilus [080] SEQ ID NO: 26 A sequência de aminoácidos deduzida da Man31 de Bacillus pumilus [081] SEQ ID NO: 27 A sequência de nucleotideos da man32 de Bacillus amyloliquefaciens [082] SEQ ID NO: 28 A sequência de aminoácidos deduzida da Man32 de Bacillus amyloliquefaciens [083] SEQ ID NO: 29 A sequência de nucleotideos da man33 de Amphibacillus xylanus [084] SEQ ID NO: 30 A sequência de aminoácidos deduzida da Man33 de Amphibacillus xylans [085] SEQ ID NO: 31 A sequência de nucleotideos da man34 de Paenibacillus polymyxa [086] SEQ ID NO: 32 A sequência de aminoácidos deduzida da Man34 de Paenibacillus polymyxa [087] SEQ ID NO: 33 A sequência de nucleotideos da man35 de Bacillus hemicellulosilyticus
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16/68 [088] SEQ ID NO: 34 A sequência de aminoácidos deduzida da Man35 de Bacillus hemicellulosilyticus [089] SEQ ID NO: 35 A sequência de nucleotídeos da man36 de Bacillus alcalophilus [090] SEQ ID NO: 36 A sequência de aminoácidos deduzida da Man36 de Bacillus alcalophilus [091] SEQ ID NO: 37 A sequência de nucleotídeos da man37 de Bacillus sp.
[092] SEQ ID NO: 38 A sequência de aminoácidos deduzida da Man37 de Bacillus sp.
[093] SEQ ID NO: 39 A sequência de nucleotídeos da man38 de Bacillus circulans [094] SEQ ID NO: 40 A sequência de aminoácidos deduzida da Man38 de Bacillus circulans [095] SEQ ID NO: 41 A sequência de nucleotídeos da man39 de Paenibacillus sp.
[096] SEQ ID NO: 42 A sequência de aminoácidos deduzida da Man39 de Paenibacillus sp.
[097] SEQ ID NO: 43 A sequência de nucleotídeos da man40 de Bacillus circulans [098] SEQ ID NO: 44 A sequência de aminoácidos deduzida da Man40 de Bacillus circulans [099] SEQ ID NO: 45 A sequência de nucleotídeos da man41 de Bacillus nealsonii [0100] SEQ ID NO: 46 A sequência de aminoácidos deduzida da Man41 de Bacillus nealsonii [0101] SEQ ID NO: 47 A sequência de nucleotídeos da man42 de Bacillus circulans
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17/68 [0102] SEQ ID NO: 48 A sequência de nucleotídeos da Man42 de Bacillus circulans
DESCRIÇÃO DETALHADA [0103] Manano se refere a polissacarídeos que consistem em uma estrutura de manose ligada em conjunto por 3-l,4-ligações com cadeias laterais de galactose fixada à estrutura por ot-l,6-ligações. Mananos compreendem material à base de planta, como goma guar e goma de sementes de alfarroba. Glucomananos são polissacarídeos que têm uma estrutura de manose e glicose ligadas a β-1,4 que se alternam mais ou menos regularmente, galactomananos e galactoglucomananos são mananos e glucomananos com ramificações laterais de galactose ligada a alfa-1,6.
[0104] Conforme usado na presente invenção, o termo mananase ou galactomananase denota uma enzima mananase definida de acordo com aquilo que é conhecido na técnica como endo-l,4-beta-manosidase de manano e que tem os nomes alternativos beta-mananase e endo-l,4-mananase e hidrólise catalisadora de ligações 1,4-beta-D-manosídicas em mananos, galactomananos, glucomananos e galactoglucomananos. Mananases são classificadas de acordo com a Nomenclatura Enzimática como EC 3.2.1.78.
[0105] Conforme usado na presente invenção, isolado significa uma substância em uma forma ou em um ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida a partir de um ou mais ou de todos os constituintes de ocorrência natural aos quais a mesma é associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação à substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada aumentando-se ou
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18/68 diminuindo-se a quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais a mesma é naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; uma ou múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; e uso de um promotor alternativo ao promotor naturalmente associada ao gene que codifica a substância). Em uma modalidade, um polipeptídeo, uma enzima, um polinucleotídeo, uma célula hospedeira ou uma composição da invenção é isolada.
[0106] Conforme usado na presente invenção, o termo que compreende inclui os significados mais amplos de que inclui, que contém e que compreende, assim como as expressões mais estreitas que consiste em e que consiste apenas em.
[0107] Conforme usado na presente invenção, fragmento significa uma proteína ou um polinucleotídeo que tem um ou mais aminoácidos ou nucleotídeos deletados. No contexto de DNA, um fragmento inclui DNA tanto de filamento único quanto de filamento duplo de qualquer comprimento. Um fragmento pode ser um fragmento ativo, o qual tem a função biológica, como atividade enzimática ou atividade regulatória, da proteína ou do polinucleotídeo. Um fragmento também pode ser um fragmento inativo, isto é, o mesmo não tem um ou mais efeitos biológicos da proteína ou polinucleotídeo nativo.
[0108] Conforme usado na presente invenção, um peptídeo e um polipeptídeo são sequências de aminoácidos que incluem uma pluralidade de resíduos de aminoácidos polimerizados consecutivos. Para o propósito desta invenção, peptídeos são moléculas que incluem até 20 resíduos de aminoácido, e polipeptídeos incluem mais de 20 resíduos de aminoácido. O peptídeo ou polipeptídeo pode incluir resíduos de aminoácido modificados, resíduos de aminoácido de ocorrência natural não codificados por um códon e resíduos de aminoácido de ocorrência não natural. Conforme usado na presente invenção,
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19/68 uma proteína pode se referir a um peptídeo ou um polipeptideo de qualquer tamanho. Uma proteína pode ser uma enzima, uma proteína, um anticorpo, uma proteína de membrana, um hormônio de peptídeo, um regulador ou qualquer outra proteína.
[0109] O termo polinucleotídeo denota m polímero de filamento único ou duplo de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo lidas a partir da extremidade 5' a 3'. Os polinucleotideos incluem RNA e DNA e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas.
[0110] Conforme usado na presente invenção, modificação, modificado e termos semelhantes no contexto de polinucleotideos se referem a modificação em uma região de codificação ou não codificação do polinucleotídeo, como uma sequência regulatória, região 5' não traduzida, região 3' não traduzida, elemento genético de regulação crescente, elemento genético de regulação decrescente, aprimorador, supressor, promotor, região de éxon ou intron. A modificação pode, em algumas modalidades, ser apenas estrutural, não tendo nenhum efeito sobre o efeito biológico, ação ou função do polinucleotídeo. Em outras modalidades, a modificação é uma modificação estrutural, que fornece uma alteração no efeito biológico, na ação ou na função do polinucleotídeo. Tal modificação pode aprimorar, suprimir ou alterar a função biológica do polinucleotídeo.
[0111] Conforme usado na presente invenção, identidade significa a porcentagem de correspondências exatas de resíduos de aminoácido entre duas sequências alinhadas sobre o número de posições em que existem resíduos presentes em ambas as sequências. Quando uma sequência tem um resíduo sem nenhum resíduo correspondente na outra sequência, o programa de alinhamento permite um vão no alinhamento e aquela posição não é contada no denominador do cálculo de identidade. A identidade é um valor determinado
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20/68 com a ferramenta de Alinhamento de Sequência em Pares EMBOSS Needle no website de EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).
[0112] Conforme usado na presente invenção, célula hospedeira significa qualquer tipo celular que é suscetível a transformação, transfecção, transdução, correspondência, cruzamento ou semelhantes com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo. 0 termo célula hospedeira abrange qualquer progênie que não é idêntica devido a mutações que ocorrem durante replicação. Exemplos não limitantes de uma célula hospedeira são células fúngicas, células fúngicas filamentosas de Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotincr, preferencialmente a partir do grupo que consiste em membros da Classe Sordariomycetes, Subclasse Hypocreomycetidae, Ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicola; mais preferencialmente a partir do grupo que consiste em Famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae e Gêneros Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium e Scedosporium; mais preferencialmente a partir do grupo que consiste em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, , Fusarium oxysporum, F gramineanum, F pseudograminearum, F venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum e Scedosporium apiospermum e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophile, Humicola insolens e Humicola grisea, ainda mais preferencialmente
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Trichoderma reesei. Exemplos não limitantes de uma célula hospedeira são células bacterianas, preferencialmente Bacilli gram-positivas (por exemplo, Bacillus subtilis, B. Hcheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus), bactérias gram-negativas (por exemplo, Escherichia coli), actinomicetos (por exemplo, Streptomyces sp.) e leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pi chi a pastoris, Yarrowia lipolytica).
[0113] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula fúngica, preferencialmente uma célula fúngica filamentosa, como Trichoderma ou Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, preferencialmente uma célula de Bacillus grama-positiva, como B. subtilis, B. Hcheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus.
[0114] Uma célula recombinante ou célula hospedeira recombinante se refere a uma célula ou célula hospedeira, que foi geneticamente modificada ou alterada para compreender uma sequência de ácido nucleico que não é nativa à dita célula ou célula hospedeira. Em uma modalidade, a modificação genética compreende integrar o polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade, o polinucleotídeo é exógeno na célula hospedeira.
[0115] Conforme usado na presente invenção, expressão inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptideo em uma célula hospedeira que inclui, mas sem limitação, transcrição, tradução, modificação pós-translacional e secreção. Expressão pode ser seguida pela colheita, isto é, recuperação, das células hospedeiras ou do produto expresso.
[0116] O termo vetor de expressão denota uma molécula de DNA, linear ou circular, que compreende um segmento que codifica um polipeptideo de interesse ligado operacionalmente a segmentos adicionais que possibilitam sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e terminadoras e podem incluir opcionalmente uma ou mais origens de replicação,
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22/68 um ou mais marcadores selecionáveis, um aprimorador, um sinal de poliadenilação, carreador e semelhantes. Vetores de expressão são geralmente derivados a partir de DNA de plasmídeo ou viral ou podem conter elementos de ambos. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor de expressão que é convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e a escolha de vetor dependerá normalmente da célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. Dessa forma, o vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor, que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma de célula hospedeira e replicado em conjunto com o cromossomo (ou cromossomos) nos quais o mesmo foi integrado.
[0117] O termo produzido por recombinante ou recombinantemente produzido usado na presente invenção em conexão com produção de um polipeptídeo ou uma proteína é definido de acordo com a definição padrão na técnica.
[0118] O termo obtido a partir de e obtenível, conforme usado na presente invenção em conexão com uma fonte microbiana específica significa que o polinucleotídeo é expresso pela fonte específica (expressão homóloga) ou por uma célula em que um gene da fonte foi inserido (expressão heteróloga).
[0119] O termo composição enzimática significa um produto de fermentação enzimática convencional, possivelmente isolado e purificado, a partir de uma única espécie de um microrganismo, em que tal preparação compreende normalmente diversas atividades enzimáticas diferentes; ou uma mistura de enzimas de monocomponente, preferencialmente enzimas derivadas a partir de espécies bacterianas ou fúngicas usando-se técnicas recombinantes
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23/68 convencionais, em que as enzimas foram fermentadas e possivelmente isoladas e purificadas separadamente e as quais podem originar de espécies diferentes, preferencialmente espécies fúngicas ou bacterianas ou o produto de fermentação de um microrganismo que atua como uma célula hospedeira para produção de uma mananase recombinante, mas o microrganismo produz simultaneamente outras enzimas.
[0120] O termo operacionalmente ligado, quando se refere a segmentos de DNA, denota que os segmentos são dispostos de forma que os mesmos funcionem em conjunto para seus propósitos pretendidos, por exemplo, a transcrição inicia no promotor e procede através do segmento de codificação até o terminador.
[0121] O termo promotor denota uma porção de um gene que contém sequências de DNA que possibilitam a ligação de RNA polimerase e iniciação de transcrição. As sequências promotoras são comumente, mas nãos sempre, encontradas nas regiões de não codificação 5' de genes.
[0122] O termo sequência-sinal secretora denota uma sequência de DNA que codifica um polipeptideo (um peptídeo secretório) que, como um componente de um polipeptideo maior, direciona o polipeptideo maior através de uma trajetória secretória de uma célula hospedeira na qual o mesmo é produzido. A sequência-sinal secretora pode ser nativa ou a mesma pode ser substituída por sequência-sinal secretora ou sequência portadora de outra fonte. Dependendo da célula hospedeira, o peptídeo maior pode ser clivado para remover o peptídeo secretório durante trânsito através da trajetória secretória.
[0123] O termo sítio ativo denota um domínio de uma enzima, o qual pode ou não ter sido modificado ou alterado, mas que reteve pelo menos parte de sua atividade original; o domínio catalítico como conhecido na técnica permaneceu funcional. O sítio ativo de uma mananase de acordo com a invenção
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24/68 corresponde aos aminoácidos alinhados com os aminoácidos 27-331 de Man7, SEQ ID NO: 16, aminoácidos 35-324 de Man6, SEQ ID NO: 12 ou aminoácidos 17314 de Manl4, SEQ ID NO: 20.
[0124] O termo ligante ou espaçador é destinado a significar um polipeptideo que compreende pelo menos dois aminoácidos que podem estar presentes entre os domínios de uma proteína de múltiplos domínios, por exemplo, uma enzima que compreende um núcleo enzimático e um domínio de ligação, como um módulo de ligação de carboidrato (CBM) ou qualquer outro híbrido enzimático, ou entre duas proteínas ou polipeptideos produzidos como um polipeptideo de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão que compreende duas enzimas nucleares. Por exemplo, a proteína de fusão de um núcleo enzimático com um CBM é fornecida fundindo-se uma sequência de DNA que codifica o núcleo enzimático, uma sequência de DNA que codifica o ligante e uma sequência de DNA que codifica o CBM sequencialmente em um quadro de leitura aberto e expressa esse construto.
[0125] Quantidade eficiente significa uma quantidade, que é suficiente para degradar manose na aplicação selecionada.
[0126] Os termos composição de detergente e detergente incluem, a menos que indicado de outro modo, agentes de lavagem de uso pesado em forma sólida, granular ou em pó, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem de propósito geral em forma líquida, de gel ou pasta, especialmente os tipos líquidos chamados de uso pesado (HDL); detergentes de tecido fino líquidos; agentes de lavagem de louças manual ou agentes de lavagem de louças leves, especialmente aqueles do tipo de alta formação de espuma; agentes de lavagem de louça em máquina, incluindo os diversos tipos de comprimido, granular, líquido e ajuda de enxágue para uso doméstico e institucional; agentes de limpeza e desinfecção líquidos, shampoos de carro ou carpete, limpadores de
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25/68 banheiro; limpadores de metal; assim como auxiliadores de limpeza, como aditivos de branqueamento e tipos de bastão de remoção de mancha ou prétratamento. Os termos detergente, composição de detergente e formulação de detergente são usados em referência a misturas, que são destinadas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em algumas modalidades, o termo é usado em referência a lavagem de tecidos e/ou vestuário (por exemplo, detergentes de lavanderia). Em modalidades alternativas, o termo se refere a outros detergentes, como aqueles usados para limpar louças, talheres, etc. (por exemplo, detergentes de lavagem de louças). Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer formulação ou composição de detergente particular. Pretende-se que, além das mananases de acordo com a invenção, o termo abranja detergentes que podem conter, por exemplo, tensoativos, construtores, quelantes ou agentes quelantes, sistema de branqueamento ou componentes de branqueamento, polímeros, condicionadores de tecido, propulsores de espuma, supressores de bolhas, tintas, perfume, inibidores de bronzeamento, branqueadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão de sujeira, agentes anticorrosivos, hidrótropos, agentes de matização de tecido, dispersantes, agentes inibidores de transferência de tinta, agentes de branqueamento fluorescentes, polímeros de liberação de sujeira, agentes antirredeposição, agentes antiencolhimento, agentes antienrugamento, bactericidas, ligantes, carreadores, tintas, estabilizadores enzimáticos, amaciadores de tecido, cargas, reguladores de espuma, perfumes, pigmentos, supressores de bolhas, solventes e estruturantes para detergentes líquidos, agentes de elastecimento de estrutura, inibidores ou estabilizadores enzimáticos, ativadores enzimáticos, transferase (ou transferases), enzimas hidrolíticas, oxido reductases, agentes de azulamento e tintas fluorescentes, antioxidantes e solubilizantes.
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26/68 [0127] O termo têxtil significa qualquer material têxtil que inclui fios, intermediários de fio, fibras, materiais de não tecido, materiais naturais, materiais sintéticos e qualquer outro material têxtil, tecidos produzidos a partir desses materiais e produtos produzidos a partir de tecidos (por exemplo, vestuário, linho e outros artigos). O têxtil ou o tecido pode ser na forma de tricô, tecidos, brim, não tecidos, feltros, fios e toalhas. O têxtil pode ser à base de celulose, como celulósicos naturais que incluem algodão, linhaça/linho, juta, rami, sisal ou cairo ou celulósicos feitos pelo homem (por exemplo, que originam de polpa de madeira) que incluem viscose/raiom, rami, fibras de acetato de celulose (tricel), liocel ou mesclas do mesmo. O têxtil ou tecido também pode ser não à base de celulose, como poliamidas naturais que incluem lã, camelo, caxemira, alpaca, coelho e seda ou polímero sintético, como náilon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno e fibra elástica/elastano, ou mesclas destes, assim como mesclas de fibras à base de celulose e não à base de celulose. Exemplos de mesclas são mesclas de algodão e/ou raiom/viscose com um ou mais materiais companheiros, como lã, fibras sintéticas (por exemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de álcool polivinílico, fibras de cloreto polivinílico, fibras de poliuretano, fibras de poliureia, fibras de aramida) e fibras que contêm celulose (por exemplo, raiom/viscose, rami, linhaça/linho, juta, fibras de acetato de celulose, liocel). O tecido pode ser roupa lavável de modo convencional, por exemplo, roupa doméstica manchada. Quando o termo tecido ou vestuário é usado, o mesmo também é destinado a incluir o termo mais amplo têxteis.
[0128] O termo estabilidade inclui estabilidade de armazenamento e estabilidade durante uso, por exemplo, durante um processo de lavagem (em estabilidade de lavagem) e refletir a estabilidade da mananase de acordo com a invenção como uma função de tempo, por exemplo, quanta atividade é retida
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T7/Ç>8 quando a mananase é mantida em solução, em particular em uma solução de detergente. A estabilidade é influenciada por muitos fatores, por exemplo, pH, temperatura, composição de detergente, por exemplo, proteases, estabilizadores, construtores, tensoativos etc. A estabilidade de mananase pode ser medida com o uso do 'ensaio de atividade', conforme descrito nos exemplos.
[0129] Atividade de mananase, conforme usado na presente invenção, se refere à atividade de degradação de manano de um polipeptídeo. Degradar ou modificar, conforme usado na presente invenção, significa que unidades de manose são hidrolisadas a partir do polissacarídeo manano por meio da mananase. A atividade de degradação de manano dos polipeptideos, de acordo com presente invenção, pode ser testada de acordo com procedimentos de teste padrões conhecidos na técnica. O Exemplo 7 fornece um exemplo de um método padrão para determinar atividade de mananase.
[0130] Em uma modalidade adicional da invenção, a pelo menos uma enzima tem atividade de mananase. As mananases compreendidas na presente composição enzimática da invenção são adequadas para degradar e modificar material que contém manano em diversos ambientes químicos, preferencialmente em composições de detergente.
[0131] Em uma modalidade da presente invenção, a composição enzimática compreende adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo que consiste em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, pectateliase, enzima pectinolítica, esterase, fitase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, DNAse, lacase e/ou peroxidase, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em proteases, amilases, celulases e lipases.
[0132] A presente composição enzimática que compreende mananase e uma enzima adicional é vantajosa no fornecimento de efeito sinérgico. Tais
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28/68 enzimas adicionais são desejadas quando a presente composição enzimática que compreende mananase é usada em detergentes, por exemplo, quando se lava manchas. Enzimas sinérgicas particularmente vantajosas que funcionam com mananase são amilases, proteases e celulases, ou uma combinação destas, como uma composição que compreende mananase, amilase e protease.
[0133] Em geral, as propriedades da enzima (ou enzimas) selecionada deveriam ser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é, pH ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.) e a enzima (ou enzimas) deveria estar presente em quantidades eficazes.
[0134] Uma composição para uso em detergente de lavanderia sólido, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 5%, como 0,000005 a 2%, como 0,00001% a 1%, como 0,00001% a 0,1% de proteína enzimática em peso da composição.
[0135] Uma composição para uso em líquido de lavanderia, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 3%, como 0,000005% a 1%, como 0,00001% a 0,1% de proteína enzimática em peso da composição.
[0136] Uma composição para uso em máquina de lavar louças automática, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 5%, como 0,000005% a 2%, como 0,00001% a 1%, como 0,00001% a 0,1% de proteína enzimática em peso da composição.
[0137] Em uma modalidade adicional da presente invenção, a composição de detergente está na forma de uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido que tem duas ou mais camadas, uma bolsa que tem um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel ou um líquido regular, compacto ou concentrado. Em uma modalidade, a composição de detergente pode ser uma composição de detergente de lavanderia, preferencialmente uma composição líquida ou sólida de detergente de lavanderia. Existem diversas formas de formulação de detergente, como
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29/68 camadas (fases iguais ou diferentes), bolsas, assim como formas para unidade de dosagem de máquina.
[0138] Em uma modalidade, a presente composição enzimática compreende adicionalmente:
a. pelo menos um conservante selecionado a partir de ácido benzoico, benzoato de sódio, hidroxibenzoato, ácido cítrico, ácido ascórbico ou uma combinação destes;
b. opcionalmente pelo menos um poliol selecionado a partir de propilenoglicol, glicerol, um açúcar, álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, derivado de ácido bórico, éster de borato aromático, derivado de ácido fenil borônico, peptídeo ou uma combinação destes;
c. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir de proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, enzimas pectinolíticas, pectato liases, carboidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanase, lacases, peroxidases e oxidases com ou sem um mediador, ou uma combinação destas; e
d. opcionalmente pelo menos uma carga selecionada a partir de maltodextrina, farinha, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou uma combinação destes.
[0139] Os componentes adicionais a a d fornecem propriedades aperfeiçoadas para a presente composição enzimática. A composição enzimática é compatível com os componentes adicionais e aperfeiçoa a aplicabilidade da composição enzimática em diversos usos.
[0140] Sais, como cloreto de sódio e sulfato de sódio, funcionam como auxílios de secagem.
[0141] Em uma modalidade do primeiro aspecto, a presente composição enzimática está na forma de uma composição líquida ou uma composição sólida,
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30/68 como solução, dispersão, pasta, pó, grânulo, granulado, granulado revestido, comprimido, bolo, cristal, pasta fluida de cristal, gel ou pélete.
[0142] A presente invenção se refere adicionalmente a diferentes usos da composição enzimática, como revelado na presente invenção, como para degradar manano, e para uso em um processo de lavanderia.
[0143] Uma composição enzimática também pode ser usada em agentes ou propulsores de limpeza que são adicionados em cima do detergente durante ou antes da lavagem e que estão, por exemplo, na forma de líquido, gel, pó, grânulos ou comprimidos. A composição enzimática e os componentes de detergente também podem ser embebidos em um carreador, como têxteis.
[0144] Em uma modalidade, a mananase tem atividade relativa de pelo menos 50% na faixa de pH de 5,5 a 8,5. A atividade relativa pode ser determinada por meio do método descrito no Exemplo 7.
[0145] Em uma modalidade da presente invenção, a mananase tem uma atividade relativa de pelo menos 30% na faixa de temperatura de 45° a 65 °C.
[0146] Fornecer mananases que retêm atividade em temperaturas acima da temperatura ambiente é vantajoso para aplicações em que a degradação de manano é exigida em tais condições. Além disso, as mananases de acordo com invenção podem ter boa estabilidade e atividade em condições alcalinas, o que é vantajoso no uso de detergente e no processamento de biomassa.
[0147] Em uma modalidade, a enzima mananase tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos ou cerca de 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 12.
[0148] Em uma modalidade, a enzima mananase tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos ou cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência
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31/68 a SEQ ID N0:16.
[0149] Em uma modalidade, a enzima mananase tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos ou cerca de 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 20.
[0150] Em uma modalidade, a enzima mananase tem uma sequência de aminoácidos que não é 100% idêntica a SEQ ID NO: 12 [Man6], SEQ ID NO: 16 [Man7] ou SEQ ID NO: 20 [Manl4], [0151] Em uma modalidade, a presente composição enzimática compreende a célula hospedeira recombinante do segundo aspecto.
[0152] Em uma modalidade do segundo aspecto, o recombinante do polipeptídeo recombinante é uma proteína de fusão que, além de ter uma sequência de aminoácidos que tem atividade de mananase, compreende pelo menos uma dentre:
uma sequência de aminoácidos que fornece uma sequência-sinal secretora, como sequência-sinal de xilanase de Bacillus amyloliquefaciens-, uma sequência de aminoácidos que facilita purificação, como um marcador de afinidade, His-tag;
uma sequência de aminoácidos que aprimora produção, como uma sequência de aminoácidos que é um carreador, como CBM;
uma sequência de aminoácidos que tem uma atividade enzimática; e uma sequência de aminoácidos que fornece a proteína de fusão com afinidade de ligação, como uma porção química de ligação de carboidrato.
[0153] O CBM, porção química de ligação de carboidrato, como um carreador é vantajoso, por exemplo, em produção de Trichoderma.
[0154] Em uma modalidade, a célula hospedeira é não patogênica. Isso é particularmente vantajoso para usar a célula hospedeira em ração e em
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32/68 aplicações de detergente, como em detergentes de lavanderia domésticos.
[0155] Em uma modalidade do quinto aspecto, o material que contém manano é selecionado a partir de material à base de planta, têxtil, água de refugo, esgoto, petróleo ou uma combinação destes.
[0156] Em outra modalidade, o material que contém manano é papel de refugo reciclado; polpa mecânica, polpa química, polpa semiquímica, Kraft ou outras polpas de fabricação de papel; fibras submetidas a um processo de maceração; ou material que contém goma guar ou goma de sementes de alfarroba.
[0157] Em outra modalidade, a degradação ou modificação é executada em um ambiente aquoso em que mananase mostra atividade.
[0158] Em uma modalidade preferencial, o material que contém manano, que é degradado ou modificado no método, está em um têxtil ou um tecido opcionalmente com manchas de manano. Por meio da degradação do manano fixado ao têxtil ou ao tecido, impurezas ou sujeira ligada ao manano é liberada e não tem capacidade para se ligar novamente ao manano ou às manchas de manano. O têxtil ou o tecido podem ser de qualquer material, por exemplo, algodão, linhaça/linho, juta, rami, sisal ou cairo ou celulósicos feitos pelo homem (por exemplo, que se originam de polpa de madeira) incluindo viscose/raiom, modal, fibras de acetato de celulose (tricel), liocel, cupro ou mesclas destes.
[0159] Em uma modalidade do sexto aspecto, o animal é um animal monogástrico ou um ruminante. Em outra modalidade, o animal é uma carne de frango, um frango de postura de ovos, suínos, peru ou um organismo de aquacultura, como peixe. Em outra modalidade, o animal é um ruminante.
[0160] Em uma modalidade, a ração compreende ou consiste em milho e refeição de soja.
[0161] Em uma modalidade, a fonte proteica de origem vegetal
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33/68 compreende ou consiste em soja, cereal, como cevada, trigo, centeio, aveia ou milho.
[0162] Em uma modalidade, o produto ou subproduto que contém manano compreende ou consiste em óleo de palma, bagaço de guar ou farinha de copra.
[0163] Em uma modalidade do sexto ou sétimo aspecto, a ração animal ou o suplemento alimentar é formulado na forma de uma composição úmida ou uma composição seca.
[0164] Em uma modalidade ou no nono aspecto, o detergente é um detergente líquido ou um detergente sólido preferencialmente em uma forma de um pó, barra, comprimido, bolsa, pasta, gel, líquido, grânulo ou granulado.
[0165] Em uma modalidade, a composição que compreende pelo menos uma enzima mananase é usada na indústria de polpa e papel, biobranqueamento, modificação de fibra, aperfeiçoamento de drenagem e na indústria de petróleo, isto é, na extração de petróleo ou indústria de serviço de petróleo para hidro-faturamento ou controle da viscosidade de fluidos de extração.
[0166] Em uma modalidade, a composição que compreende pelo menos uma enzima mananase é usada na indústria têxtil e de detergente, processamento de biomassa e hidrólise de biomassa, preferencialmente nas indústrias de biocombustível, amido, polpa e papel, alimento, cozimento, ração ou bebida.
[0167] Em uma modalidade, a mananase hidrolisa ligações endo-beta-1,4manosídicas aleatoriamente.
[0168] Em uma modalidade, a mananase é obtenível ou derivável a partir de uma fonte bacteriana.
[0169] Em uma modalidade, a mananase pode ser fundida com pelo menos um polipeptídeo adicional, formando, dessa forma, um polipeptídeo de fusão. O
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34/68 polipeptídeo de fusão ou o polipeptídeo adicional pode ter outras atividades catalíticas ou de ligação além daquelas de mananase. Em uma modalidade, o polipeptídeo adicional compreende ou consiste em módulo de ligação de carboidrato, que é opcionalmente um fragmento de outra proteína ou enzima derivada a partir do mesmo organismo ou de um organismo diferente que a mananase.
[0170] Em uma modalidade, a mananase é conectada ao polipeptídeo adicional com um ligante.
[0171] Em uma modalidade, fornece-se um processo para tratamento de máquina de tecidos, em que o processo compreende tratar tecido durante um ciclo de lavagem de um processo de lavagem em máquina com uma solução de lavagem que contém a composição enzimática do primeiro aspecto, a enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante do segundo aspecto ou o polipeptídeo recombinante do terceiro aspecto.
[0172] Em uma modalidade, fornece-se um uso da composição enzimática do primeiro aspecto, da enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante do segundo aspecto ou do polipeptídeo do terceiro aspecto em conjunto com uma enzima selecionada a partir de protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolítica, pectato liase, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para limpeza de tecido e/ou remoção de mancha de tecido.
[0173] Em uma modalidade, fornece-se um uso da composição enzimática do primeiro aspecto, da enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante do segundo aspecto ou do polipeptídeo do terceiro aspecto em conjunto com uma enzima selecionada a partir de protease, amilase, celulase,
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35/68 lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolitica, pectato liase, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para limpar superfícies rígidas, como chãos, paredes, azulejos de banheiro e semelhantes.
[0174] Em uma modalidade, fornece-se um uso da composição enzimática do primeiro aspecto, da enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante do segundo aspecto ou do polipeptídeo do terceiro aspecto em conjunto com uma enzima selecionada a partir de protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolitica, pectato liase, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para lavagem de louças manual e de máquina.
EXEMPLOS [0175] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar diversos aspectos da presente invenção. Os mesmos não são destinados a limitar a invenção, a qual é definida pelas reivindicações anexas.
Exemplo 1. Triagem [0176] Para identificação de novos bancos de dados públicos de beta-1,4mananases (NCBI, EBI) e propriedade selecionada e genomas públicos foram triados. Todos os genomas proprietários e públicos usados nesse trabalho são mostrados na Tabela 1. Todos os acessos foram agrupados e, finalmente, 15 genes de origem bacteriana foram selecionados para clonagem em Bacillus com base na distância filogenética entre uma e outra (Tabela 2) [0177] Tabela 1. Lista de genomas proprietários e públicos usados para triagem de beta-l,4-mananases
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Espécie Cepa Fonte
Bacillus pumilus MS8 ABE
Amphibacillus xylanus NBRC 15112 NCBI
Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 NCBI
Bacillus clausii KSM-K16 NCBI
Bacillus amyloliquefaciens RH1330 ABE
Virigibacillus soli PL205 NCBI
[0178] Tabela 2. Lista de genes selecionados para clonagem em Bacillus.
Domínios de PFAM previstos e comprimentos de aminoácidos das proteínas são mostrados
ID de Sequência Espécie família deGH Comprimento
orf2511 Bacillus amyloliquefaciens 26 360 aa
AXY08250 Amphibacillus xylanus 5 497 aa
man7 Bacillus hemicellulosilyticus 5 490 aa
T1Z249.2 Bacillus nealsonii 5 369 aa
man6 Bacillus clausii 5 324 aa
Q9EYQ3 Clostridium cellulolyticum 5 424 aa
YdhT Bacillus cellulosilyticus 26 1183 aa
V5X1N9 Paenibacillus polymyxa 5 588 aa
Q9ZI87 Geobacillus stearothermophilus 5 694 aa
Q49HI4 Bacillus circulans 5 327 aa
orf0659 Bacillus pumilus 5 376 aa
JCM9152 1090 Bacillus hemicellulosilyticus 26 489 aa
D3HC62 Streptococcus gallolyticus 5 487 aa
A0LSH9 Acidothermus cellulolyticus 5 763 aa
manl4 Virgibacillus soli 5 482 aa
Exemplo 2. Clonagem de mananases bacterianas em Bacillus [0179] A menos que declarado de outro modo, os métodos biológicos moleculares que incluem transformações e manipulações de DNA foram realizados conforme descrito em Sambrook e Russell (2001) e Harwood e Cutting
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37/68 (1990). Os genes man6, man7 e manl4 foram amplificados por PCR com o uso de Polimerase Principal de Pfx Accu (Invitrogen). PCRs foram realizados de acordo com instruções de fabricante. Após, as condições de PCR foram usadas para construção dos plasmídeos de expressão: desnaturação inicial de 120 segundos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 15 segundos a 94 °C, 30 segundos de recozimento a um dentre os seguintes 50/55 °C, 110/290 segundos de extensão a 68 °C e a extensão final a 68 °C por 10 min. Para amplificação de DNA genômico de man7 de Bacillus hemicellulosilyticus, JCM 9152 foi usado. A man6 e a manl4 foram ordenados como genes sintéticos sem otimização de códon (Eurofins MWG, Alemanha). Sequências de iniciadores usados para clonar são mostradas na Tabela 3. Suspensões para hibridização são assinaladas.
[0180] Tabela 3. Lista de iniciadores usados para amplificação de man6, man7 e manl4
Modelo Iniciador bp Sequência Seq ID No
syn. gene man6 Man6_l 39 CAACCG CCTCTG C AGCTTATG CAC AAAACG G ATTTCA
CG 1
syn. gene man6 Man6_2 39 CGGTATATCTCTGTCTTAATCACTCTTAAGCCCAI 1 1 1
C 2
gDNA B. hemicellulosilytic Man7 1 37 CAACCG CCTCTG C AGCTTCTG ATGGTC ATAG CC AAAC 3
US
gDNA B. hemicellulosilytic Man7 2 36 CGGTATATCTCTGTCTTATTGGATTGTTACATGATC 4
US
syn. Gene manl4 Manl4 40 CAACCGCCTCTGCAGCTGCAAGCGGG1 1 1 IATGTAA
1 ACGG 5
syn. Gene manl4 Manl4 39 CGGTATATCTCTGTCTTATTTAATGGTAACGTTATCA
2 AC 6
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derivado pUBllO de Vec_l 17 AGCTGCAGAGGCGGTTG 7
derivado pUBllO de Vec_2 21 GACAGAGATATACCGACAGTG 8
[0181] Genes foram clonados em um vetor padrão pEVl (Figura. 1), um derivado de pUBUO que inclui promotor PaprE a partir de Bacillus licheniformis e peptídeo-sinal de xilanase a partir de Bacillus amyloliquefaciens, usando-se NEBuilder®Hifi DNA Assembly Master Mix (NEB, Frankfurt). Uma razão de vetor:inserção de 1:3 foi aplicada para clonagem. A quantidade total de fragmentos foi 0,2 pmol em um volume total de 20 μΙ_. Amostras foram incubadas por 40 min a 50 °C. Para propósitos de construção, plasmídeos de expressão foram transformados por competência induzida em Bacillus subtilis SCK6, conforme descrito em Zhang & Zhang 2011. As células transformadas foram plaqueadas em placas LB (Luria-Bertani) suplementadas com 10 mg/L de Canamicina. Placas foram incubadas por 20h a 37 °C. Colônias resultantes foram escolhidas e plasmídeo foi isolado com o uso de QiaPrep MiniPrep Kit (Qiagen, Hilden). O procedimento de isolamento foi executado de acordo com as recomendações dos fabricantes para preparações de plasmídeo Gram-positivo. Insertos foram sequenciados por meio de sequenciamento de Sanger (GATC, Alemanha) e revelaram as sequências de DNA que correspondem às partes maduras das mananases Man6, Man7 e Manl4. As comparações de sequência foram feitas com o uso de alinhamento de sequênia ClustalW (Thompson et al 1994). Finalmente, plasmídeos de expressão foram transformados em uma cepa de produção de Bacillus apropriada por meio de eletroporação. A cepa de produção de Bacillus foi cultivada em meio de eletroporação que contém 20 g/L de Trypton, 10 g/L de extrato de levedura, 10 g de NaCI e 2 M de sacarose e 10 mL foram colhidos a um OD (600nm) de 0,4. As células foram lavadas com
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39/68 tampão de eletroporação que contém 0,272 M de sacarose, 1 mM de MgCb e 7 mM de KH2PO4 e finalmente ressuspensas em 250 μΙ_ de tampão de eletroporação. A eletroporação foi realizada com o uso das seguintes condições: 1,2 kV, 150 Ω, 50 μΕ lmL de meio de eletroporação foi adicionado posteriormente e células foram incubadas por 3h a 37 °C. As células foram plaqueadas em placas de LB suplementadas com 20 mg/L de canamicina e incubadas por 18h a 37 °C. Clones foram verificados conforme descrito acima e usados para geração de material para testes analíticos. Portanto, cepas foram inoculadas em uma expressão padrão sob condições de indução de proteína e incubadas por 30h a 37 °C. Sobrenadantes foram colhidos e usados para testes analíticos e de aplicação. Genes e características enzimáticas são mostrados nas Tabelas 4 e 5.
[0182] Tabela 4. O sumário sobre os genes de codificação de mananase da família GH5 a partir de Bacillus clausii KSM-K16, Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 e Virgibacillus soli PL205.
Gene Comprimento que inclui SP (bp) SEQ ID NO
man6 975 9
man7 1.473 13
man!4 1.449 17
[0183] Tabela 5. O sumário das sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências genéticas que codificam mananase de GH5 a partir de Bacillus clausii KSM-K16, Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 e Virgibacillus soli PL205.
Man proteína n2de AAs Comprimento de SS CBM MW previsto (Da), ss não incluído Pl previsto, ss não incluído SEQ ID NO
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40/68
Man6 324 35 31,84 4,56 11
Man7 490 21 Sim 51,36 4,81 15
Manl4 482 16 Sim 50,68 4,35 19
Exemplo 3. Clonagem por PCR de mananases bacterianas man6 e man7 em
Trichoderma reesei [0184] Métodos de biologia molecular padrão foram usados nos tratamentos de isolamento e enzima de DNA (por exemplo, isolamento de DNA de plasmídeo, digestão de DNA para produzir fragmentos de DNA), em transformações de E. coli, sequenciamento etc. Os métodos básicos usados foram conforme descrito pelo fabricante de enzima, reagente ou kit ou conforme descrito no manual de biologia molecular padrão, por exemplo, Sambrook e Russell (2001). Isolamento de DNA genômico foi realizado conforme descrito em detalhes por Raeder e Broda (1985).
[0185] Man6 e man7 a partir de Bacillus clausii e Bacillus hemicellulosilyticus, respectivamente, também foram clonados para expressão em Trichoderma reesei. Os genes foram clonados com PCR com o uso de genes sintéticos com otimização de códon para Trichoderma reesei. As sequências de DNA que codificam os peptídeos de sinal de man6 e man7 foram removidas usando-se PCR e novos sítios de clonagem foram criados. As sequências dos iniciadores são mostradas na Tabela 6 (SEQ ID NOs: 21-24).
[0186] Tabela 6. Os oligonucleotídeos usados como iniciadores de PCR para amplificar genes de mananase de Bacillus hemicellulosilyticus e Bacillus clausii.
Modelo, (sintético) DNA de Oligonucleot ídeos Compri mento (bp) Sequência(a SEQ ID NO:
Bacillus hemicellulo silyticus BMAN1 60 5'-AGTCAATCGCG ACAAG CG CCAG ACCCACTCG G G CTTC TACATCG AG G G CTCG ACG CTCTA-3' (s) 21
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41/68
Bacillus hemicellulo silyticus BMAN2 46 5'-CGCGCCGGATC CTTACTG G ATCGTG ACGTG GTCCAG G TAGATGGCG-3' (as) 22
Bacillus clausii BMAN3 60 5'-AGTCAATCGCG ACAAG CG CCAG AACG G CTTCCACGTC TCCGGCACGGAGCTCCTGGACAA-3' (s) 23
Bacillus clausii BMAN4 50 5'-CGCGCCGGATC CTTAGTCG CTCTTCAG G CCGTTCTCG C CGTAGACGATGCG-3' (as) 24
[0187] (a s no parêntese = filamento de sentido, as = filamento antihorário.
[0188] Os genes foram amplificados por PCR com iniciadores descritos na Tabela 6 e com o uso de DNAs sintéticos como modelos nas reações. As misturas de PCR de man6 de Bacillus clausii e man7 de Bacillus hemicellulosilyticus contiveram, cada uma, lx de tampão de HF para Phusion HF Polimerase (NEB/BioNordika, Finlândia), 0,2 mM de mistura de dNTP (Thermo Fisher Scientific, Finlândia), 1 μΜ de cada iniciador, 3% de DMSO (Thermo Fisher Scientific), 1 unidade de Phusion Polimerase de Alta Fidelidade (NEB/BioNordika, Finlândia) e 50 ng do DNA correspondente de plasmídeo. As condições para as reações de PCR foram as seguintes: 30 segundos de desnaturação inicial a 98 °C, seguido de 28 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos de cozimento a um dentre os seguintes 45/50/55/60 °C, 45 segundos de extensão a 72 °C e a extensão final a 72 °C por 7 min.
[0189] A combinação iniciadora descrita na Tabela 6 produziu produtos de DNA específicos que têm os tamanhos esperados. Os produtos de PCR foram isolados a partir de gel de agarose com GenJet Kit de Extração de Gel (Thermo Fisher Scientific) de acordo com instruções de fabricante, digeridos com enzimas de restrição Nrul e BamHI (Thermo Fisher Scientific) e clonados em um vetor de
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42/68 expressão clivado com Nrul e BamHI. Misturas de ligação foram transformadas em Escherichia coli XL1 Azul (AH Diagnostics) e plaqueadas em placas de LB (Luria-Bertani) que contêm 50 a 100 pg/mL de ampicilina. Diversas colônias de E. coli foram coletadas a partir das placas e DNA foi isolado com GenJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific). Clones positivos foram triados com o uso de digestões de restrição. Os genes que codificam as mananases de GH5 de man6 de Bacillus clausii e man7 de Bacillus hemicellulosilyticus sem sua própria sequência de codificação de peptídeo de sinais foram sequenciados e os plasmídeos foram nomeados pALK4274 e pALK4273, respectivamente (Para detalhes, consultar Exemplo 6).
Exemplo 4. Clonagem de mananase manl4 bacteriano sintética [0190] Métodos de biologia molecular padrão foram usados nos tratamentos de isolamento e enzima de DNA (por exemplo, isolamento de DNA de plasmídeo, digestão de DNA para produzir fragmentos de DNA), em transformações de E. coli, sequenciamento etc. Os métodos básicos usados foram conforme descrito pelo fabricante de enzima, reagente ou kit ou conforme descrito no manual de biologia molecular padrão, por exemplo, Sambrook e Russell (2001). Isolamento de DNA genômico foi realizado conforme descrito em detalhes por Raeder e Broda (1985).
[0191] Gene de mananase manl4 a partir de Virgibacillus soli também foi clonado para expressão de Trichoderma. O gene que codifica a mananase Manl4 da família GH5 a partir de Virgibacillus soli foi ordenado a partir de GenScript como um construto sintético com otimização de códon para Trichoderma reesei.
[0192] O DNA de plasmídeo obtido a partir de GenScript que inclui o gene de manl4 foi ressuspenso em água estéril, digerido com enzimas de restrição Nrul e BamHI (Thermo Fisher Scientific) de acordo com instruções de fabricante e clonado em um vetor de expressão clivado com Nrul e BamHI. A mistura de
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43/68 ligação foi transformada em Escherichia coli XL1 Azul (AH Diagnostics) e plaqueada em placas de LB (Luria-Bertani) que contém 50-100 pg/mL de ampicilina. Diversas colônias de E. coli foram coletadas a partir das placas e DNA foi isolado com GenJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific). Clones positivos foram triados com o uso de digestões de restrição e os mesmos mostraram que continham insetos de tamanhos esperados. Sítios de fusão de manl4 de Virgibacillus soli ao plasmídeo de expressão foram sequenciados e o plasmídeo foi nomeado pALK4414 (Para detalhes, consultar Exemplo 6).
Exemplo 5. Produção de proteínas de mananase GH5 bacterianas recombinantes em Bacillus [0193] Plasmídeos de expressão foram construídos para produção de proteínas de mananase de GH5 (Man6, Man7 e Manl4) recombinantes a partir de Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus e Virgibacillus soli. Os plasmídeos de expressão construídos são listados na Tabela 7. Os genes de GH5 recombinantes (man6, man7 e manl4), sem suas próprias sequências-sinal, foram fundidos ao promotor de PaprE Bacillus licheniformis e peptídeo-sinal de xilanase B. amyloliquefaciens. A terminação de transcrição foi assegurada por um terminador forte e um marcador de resistência de canamicina foi usado para seleção dos transformantes. As transformações foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2.
[0194] Tabela 7. Os plasmídeos de expressão construídos para produzir proteínas recombinantes Man6, Man7 e Manl4 a partir de Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus e Virgibacillus soli em uma cepa de expressão de Bacillus apropriada.
Proteína de mananase (GH5) Plasmídeo de expressão
Man6 pEVl Man6
Man7 pEVl Man7
Manl4 pEVl Manl4
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44/68 [0195] A produção de GH5 dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura dos cultivos de frasco de agitação. Os transformantes foram inoculados a partir das placas de LB para agitar frascos que contêm 2% de glicose, 6% de pó de maceração de milho, 1,3% (NHzihHPOzi, 0,05% MgSÜ4X 7ΗζΟ e 0,5% CaCb. O pH foi ajustado para pH 7,5. A produção de proteína de GH5 dos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura após cultivar os mesmos por 30 horas a 37 °C, 180 rpm. A produção heteróloga de proteínas recombinantes foi analisada por SDS-PAGE com manchamento de Coomassie subsequente.
[0196] Os melhores transformantes de produção foram escolhidos para serem cultivados em biorreatores de escala laboratorial. Os transformantes foram cultivados em biorreatores a 37 °C sob condições de indução de proteína e ração adicional até que um rendimento adequado fosse atingido. Os sobrenadantes foram recuperados para testes de aplicação por meio de centrifugação ou filtração.
Exemplo 6. Produção de proteínas de mananase GH5 bacterianas recombinantes em Trichoderma reesei [0197] Plasmídeos de expressão foram construídos para produção de proteínas de mananase GH5 recombinantes (Man6, Man7 e Manl4) a partir de Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus e Virgibacillus soli (Consultar Exemplos 3 e 4) em Trichoderma reesei. Os plasmídeos de expressão construídos são listados na Tabela 8. Os genes de GH5 recombinantes (man6, man7 e manl4), sem suas próprias sequências-sinal, foram fundidos ao promotor cel7A/cbhl de T. reesei com carreador de T. reesei cel6A/cbh2 CBM e ligante seguido de sítio de reconhecimento de protease Kex2. A terminação de transcrição foi assegurada pelo terminador de T. reesei cel7A/cbhl e o gene marcador de amdS de A. nidulans foi usado para seleção dos transformantes
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45/68 conforme descrito em Paloheimo et al. (2003). Os cassetes de expressão lineares (Figura. 2) foram isolados das estruturas de vetor após digestões de Notl e foram transformadas em protoplastos de T. reesei. As cepas hospedeiras usadas não produzem qualquer uma dentre as quatro celulases principais de T. reesei (CBHI, CBHII, EGI, EGII). As transformações foram realizadas como em Penttilã et al. (1987) com as modificações descritas em Karhunen et al. (1993), selecionando acetamidase como uma fonte de nitrogênio única (gene marcador amdS). Os transformantes foram purificados em placas de seleção através de conídias únicas antes de esporular as mesmas em PD.
[0198] Tabela 8. Os cassetes de expressão construídos para produzir proteínas recombinantes Man6, Man7 e Manl4 a partir de Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus e Virgibacillus soli em Trichoderma reesei. A estrutura geral dos cassetes de expressão foi conforme descrito na Figura. 2.
Proteína mananase (GH5) Plasmídeo de expressão Cassete de expressão(a
Man6 pALK4274 7,0kb Notl
Man7 pALK4273 7,5 kb Notl
Manl4 pALK4414 7,6 kb Notl
(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolada da estrutura de vetor usando-se digestão de Notl.
[0199] A produção de mananase dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura dos cultivos de frasco de agitação. Os transformantes foram inoculados a partir de declives de PD para agitar frascos que contêm 50 mL de meio de indução de celulase à base de lactose complexa (Joutsjoki atai. 1993) tamponado com 5% de KH2PO4. A produção de proteína de GH5 dos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura após cultivar os mesmos por 7 dias a 30 °C, 250 rpm. A produção heteróloga de proteínas recombinantes foi analisada por SDS-PAGE com manchamento de Coomassie subsequente.
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46/68 [0200] Os melhores transformantes de produção foram escolhidos para serem cultivados em biorreatores de escala laboratorial. Os transformantes foram cultivados em biorreatores em batelada ou por meio do tipo de ração adicional de processo sob condições de indução de proteína a uma temperatura de cultivo fúngico mesofílico típica e condições levemente ácidas. O cultivo foi continuado até o esgotamento dos açúcares do meio ou até o rendimento adequado ser alcançado. Os sobrenadantes foram recuperados para testes de aplicação por meio de centrifugação ou por meio de filtração.
Exemplo 7. Ensaio de atividade de galactomananase por meio de método de DNS [0201] A atividade de mananase (MNU) foi medida como a liberação de açúcares de redução a partir de galactomanano (0,3 % em p/p) a 50 °C e pH 7,0 em 5 min. A quantidade de carboidratos de redução liberados foi determinada espectrofotometricamente com o uso de ácido dinitrosalicílico.
[0202] O substrato (0,3 % em p/p) usado no ensaio foi preparado conforme a seguir: 0,6 g de goma de sementes de alfarroba (Sigma G-0753) foi colocado em 50 mM de tampão de citrato de sódio de pH 7 (ou tampão de citrato de fosfato de pH 7) a cerca de 80 °C com o uso de um agitador magnético de aquecimento e aquecido até ponto de ebulição. A solução foi resfriada e deixada para dissolver de um dia para o outro em uma câmara fria (2 a 8 °C) com agitação contínua e resíduos insolúveis foram removidos por meio de centrifugação. Após aquela solução ser carregada até 200 mL pelo tampão, o substrato foi armazenado como congelado e derretido aquecendo-se o mesmo em um banho de água fervente a cerca de 80 °C, resfriado para temperatura ambiente e misturado cuidadosamente antes do uso.
[0203] O reagente de DNS usado no ensaio foi preparado dissolvendo-se 50 g de ácido 3.5-dinitrosalissílico (Sigma D-550) em cerca de 4 litros de água. Com
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47/68 agitação magnética contínua 80,0 g de NaOH foram gradualmente adicionados e deixados para dissolver. Uma quantidade de 1.500 g de Sal Rochelle (K-Natratrato, Merck 8087) foi adicionada em pequenas porções com agitação contínua. A solução que foi cuidadosamente aquecida a uma temperatura máxima de 45 °C., foi resfriada a temperatura ambiente e carregada para 5.000 mL. Após isso, a mesma foi filtrada através de papel de filtro Whatman 1 e armazenado em uma garrafa escura a temperatura ambiente.
[0204] A reação foi, primeiro, iniciada adicionando-se 1,8 mL de solução de substrato a cada um dentre os dois tubos de teste e deixada para equilibrar a 50 °C por 5 minutos, após os quais 200 pL de solução enzimática adequadamente diluída foram adicionados a um dentre os tubos, misturada bem com misturador de vórtice e incubada exatamente por 5 min a 50 °C. Brancos de enzima não precisaram ser equilibrados ou incubados. A reação foi parada adicionando-se 3,0 mL de reagente de DNS em ambos os tubos e misturada. 200 pL de solução de amostra foram adicionados aos tubos de branco de enzima. Ambos os tubos foram colocados em um banho de água fervente. Após ebulição por exatamente 5 minutos, os tubos foram colocados em um banho de água de resfriamento e permitiu-se que os mesmos resfriassem a temperatura ambiente. A absorção de amostra foi medida contra o branco de enzima a 540 nm e atividade foi lida a partir da curva de calibração e multiplicada pelo fator de diluição. Uma amostra diluída adequada rendeu uma diferença de absorção de 0,15 a 0,4.
[0205] A curva padrão foi preparada com 20 mM a partir de solução de estoque de manose dissolvendo-se 360 mg de manose (SigmaM-6020, armazenado em um dissecador) em tampão de ensaio e diluída para soluções que contêm 3, 6, 10 e 14 pmol/mL de manose. Padrões foram tratados como as amostras exceto para incubação a 50 °C. As absorbâncias foram medidas contra o vazio de reagente (que contém tampão em vez de diluição padrão de manose)
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48/68 a 540 nm. A curva de calibração foi construída para cada série de ensaios.
[0206] Uma unidade de mananase (MNU) foi definida como a quantidade de enzima que produz carboidratos redutivos que tem uma potência redutiva que corresponde a um nmol de manose a partir de galactomanano em um segundo sob as condições de ensaio (1 MNU = lnkat).
Exemplo 8. Purificação de mananase Man6 [0207] Células e sólidos foram removidos do meio de cultura de fermentação por meio de centrifugação por 10 min, 4.000 g a 4 °C. O sobrenadante de 10 mL foi usado para purificação de proteína. A amostra foi filtrada através de 0,44 pm de membrana de PVDF (Millex-HV, Merck Millipore Ltd,Carrigtwohill, IRL). O filtrado foi carregado em uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) equilibrada em 20 mM de HEPES a pH 7. A amostra dessalinizada foi, então, carregada em uma coluna de HiTrap Q HP de 5 mL (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) pré-equilibrada com HEPES de 20 mM a pH 7. Após carregamento de amostra, a coluna foi lavada com o mesmo tampão para 20 mL. Proteínas foram eluídas com gradiente de sal linear de 20 mM de HEPES, 500 mM de NaCI a pH 7 em 15 CVs. Frações de 5 mL foram coletadas e analisadas em SDS-PAGE. As frações que contêm proteína-alvo foram combinadas e concentradas a 2 mL com o uso de Vivaspina 20, dispositivos de ultrafiltração de MWCO de 10 kDa (GE Healthcare). A amostra concentrada foi adicionalmente fracionada com o uso de gel de Superdex 75 26/60-coluna de filtração equilibrada com 20 mM de MES, 200 mM de NaCI a pH 6,5. Frações de 2 mLforam coletadas e analisadas por SDS-PAGE. Frações que contêm mananase pura foram combinadas. Outras mananases foram purificadas com o uso do mesmo protocolo, mas alterando a composição de tampão em etapas de dessalinização e troca iônica. Composições de tampão são mostradas na Tabela
9.
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49/68 [0208] Tabela 9. Tampões usados em cromatografia de troca iônica
Mananase Tampões usados em cromatografia de troca iônica
Man6 20 mM de HEPESa pH 7
Man7 20 mM de HEPESa pH 7
Manl4 20 mM de MESa pH 6
[0209] Amostras purificadas foram mais de 95% puras.
[0210] O teor de enzima da amostra purificada foi determinado com o uso de medições de 280 nm de absorção UV. Coeficientes de excitação para cada uma das mananases foram calculados com base na sequência de aminoácidos da enzima usando-se ExPASy (Servidor http://web.expasy.org/protparam/). (Gasteiger et al. 2005).
[0211] A atividade enzimática (MNU) de amostras purificadas foi medida como liberação de açúcares de redução, conforme descrito no Exemplo 7.
[0212] A atividade específica (MNU/mg) de mananases foi calculada dividindo-se atividade de MNU de amostra purificada com a quantidade de enzima purificada. Valores obtidos foram usados para calcular dosagens de enzima usadas nos Exemplos 10 e 11.
Perfis de pH de mananases [0213] Os perfis de pH de mananases purificadas foram determinados com o uso do galactomanano de alfarroba reticulado com azurina de ensaio em comprimido com beta-manazima (T-MNZ 11/14) a partir de Megazima com modificações menores ao protocolo sugerido. A linearidade do ensaio foi verificada com cada enzima purificada. O ensaio foi realizado em tampão de Britton-Robinson de 40 mM ajustado a valores de pH entre 4 e 11. A solução enzimática foi diluída no tampão de ensaio e 500 μΙ de solução enzimática foi equilibrada em banho de água a 50 °C por 5 min antes de adicionar um comprimido de substrato. Após 10 minutos, a reação foi parada adicionando-se 10 mL de Tris a 2% a pH 12. Os tubos de reação foram deixados a temperatura
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50/68 ambiente por 5 min, agitados e o líquido filtrado através de um filtro de papel NO 1 Whatman. Liberação de tinta azul do substrato foi quantificada medindose a absorção a 595 nm. A atividade enzimática a cada pH foi relatada como atividade relativa em que a atividade ao pH ideal foi definida para 100%. Os perfis de pH foram mostrados na Figura 3.
[0214] A atividade relativa (%) de mananase é calculada dividindo-se atividade de mananase de uma amostra pela atividade de mananase de uma amostra de referência. No caso de perfil de pH, a amostra de referência é uma amostra ao pH ideal. No caso de perfil de temperatura, a amostra de referência é uma amostra à temperatura ideal.
Perfis de temperatura de mananases [0215] A temperatura ideal de mananases purificadas foi determinada com o uso do galactomanano de alfarroba reticulado com azurina de ensaio em comprimido com beta-manazima (T-MNZ 11/14) a partir de Megazima com modificações menores ao protocolo sugerido. O ensaio foi realizado a temperaturas que variam entre 30 a 90 °C por 10 minutos em tampão de BrittonRobinson de 40 mM a pH7. A atividade enzimática foi realizada como atividade relativa em que a atividade a temperatura ideal foi definida para 100%. Os perfis de temperatura foram mostrados na Figura 4.
Características de temperatura e pH de mananases [0216] Man6 tem uma massa molecular entre 30 a 35 kDa. A temperatura ideal da enzima a pH 7 é de 50 °C a 70 °C. A dita enzima tem pH ideal à faixa de pH de pelo menos pH 6 a pH 9 a 50 °C. A temperatura ideal e o pH ideal foram determinados com o uso de tempo de reação de 10 min e galactomanano de alfarroba reticulado com azurina como um substrato.
[0217] Man7 tem uma massa molecular entre 50 a 55 kDa. A temperatura ideal da enzima a pH 7 é de 40 °C a 60 °C. A dita enzima tem pH ideal à faixa de
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51/68 pH de pelo menos pH 7 a pH 10 a 50 °C. A temperatura ideal e o pH ideal foram determinados com o uso de tempo de reação de 10 min e galactomanano de alfarroba reticulado com azurina como um substrato.
[0218] Manl4 tem uma massa molecular entre 30 a 40 kDa. A temperatura ideal da enzima a pH 7 é de 50 °C a 60 °C. A dita enzima tem pH ideal à faixa de pH de pelo menos pH 7 a pH 8 a 50 °C. A temperatura ideal e o pH ideal foram determinados com o uso de tempo de reação de 10 min e galactomanano de alfarroba reticulado com azurina como um substrato.
Exemplo 9. Desempenho de remoção de mancha de mananases Man6 e Man7 com detergentes comerciais sem agentes de clareamento [0219] Mananases Man6 e Man7 produzidas em Bacillus (conforme descrito no Exemplo 5) e em Trichoderma (conforme descrito no Exemplo 6), foram testadas para sua capacidade de remover manchas sensíveis padrão de mananase a 40 °C e dureza de água de 285,71 mg/L com detergentes comerciais sem agentes de clareamento e em comparação com preparação de mananase comercial Mannaway® 4,0 L (Novozimas). Os seguintes panos de teste artificialmente sujos do Centro para B.V. de material de teste (os Países Baixos) foram usados: Mananase de pudim de chocolate sensível em algodão (E-165), goma de sementes de alfarroba, com pigmento em algodão (C-S-73) e em poliéster/algodão (PC-S-73) e Goma guar com negro-de-fumo em algodão (C-S43). O tecido foi cortado em amostras de 6 cm x 6 cm e 2 pedaços de cada uma foram usados no teste.
[0220] O detergente líquido de uso pesado comercial A que contém todas outras enzimas exceto mananase foi usado em concentração de 4,4 g por litro de licor de lavagem e detergente em pó de Cor Comercial sem enzimas foi usado a 3,8 g/L . Detergente que contém licores de lavagem foi preparado em água de torneira sintética com dureza de 285,71 mg/L. Protease Savinase® 16 L (0,5 % em
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52/68 p/p) e amilase Stainzyme® 12 L (0,4 % em p/p) foram adicionadas em água rígida usada com detergente em pó de cor comercial, o detergente líquido já conteve amilase e protease. pH do licor de lavagem de Detergente em pó de cor foi aproximadamente 10 e com o detergente líquido aproximadamente 8,3.
[0221] As dosagens de mananase estiveram na faixa 0 a 0,2/0,25% de peso de detergente, mas para a avaliação, as dosagens foram calculadas como unidades de atividade enzimática (MNU) por licor de lavagem em mL ou como mg de proteína de enzima ativa (AEP) por L de licor de lavagem. A atividade foi medida conforme descrito no Exemplo 7. O teor de AEP de cada preparação foi calculado dividindo-se a atividade enzimática pela atividade específica, definida no Exemplo 8. A amostra de controle conteve a solução de detergente, mas nenhuma mananase.
[0222] Para água de torneira sintética com dureza de 285,71 mg/L as seguintes soluções em estoque foram preparadas em água deionizada (Milli-Q ou equivalente):
A solução em estoque com dureza de Cálcio de 17.857,14 mg/L: 26,22 g/L de CaCb x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, Alemanha)
Solução em estoque com dureza de Magnésio de 3.571,42 mg/L: MgSCU x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, Alemanha) 8,79 g/L de H2O
NaHCCh de solução em estoque: 29,6 g/L de NaHCOs (1.06329.1000 Merck KGaA, Alemanha)
13,3 mL de solução de CaCb, 13,3 mL de solução de MgSCU e 10,0 mL de solução de NaHCCb há pouco feita foram adicionados em frasco volumétrico na dada ordem, constituíram 1 litro com água deionizada e foram misturados. A dureza de água foi determinada por meio de titulação complexométrica e constatada correta.
[0223] Os tratamentos de remoção de mancha foram realizados em Atlas
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LP-2 Launder-Ometer como a seguir. Launder-Ometer foi pré-aquecido primeiro a 40 °C. Então, detergente, 250 mL água de torneira sintética com dureza de 285,71 mg/L e enzima diluída (<l,0 mL) foram adicionados em recipientes de 1,2 litro. Manchas foram adicionadas e o Launder-Ometer foi operado a 40 °C por 60 min com uma velocidade de rotação de 42 rpm. Após isso, as amostras foram cuidadosamente enxaguadas sob água corrente e secas de um dia para o outro em ar interior, em uma rede protegida contra luz solar.
[0224] O efeito de remoção de mancha foi avaliado medindo-se a cor como valores de reflexão com espectrofotômetro de Konica Minolta CM-3610A com o uso de coordenadas de espaço de cor L*a*b* (iluminante D65/100, corte de 420 nm). O desvanecimento das manchas, indicando desempenho de mananase (eficiência de remoção de mancha), foi calculado como AL* (delta L*), o que significa valor de luz L* de tecido tratado com enzima menos o valor de luz I* de tecido tratado com licor de lavagem sem mananase (controle). Resultados finais (efeito de remoção de mancha total) foram mostrados como soma de AL* de cada mancha. Os valores de cor de cada mancha foram ponderados de 2 amostras.
[0225] Os resultados obtidos com detergente líquido comercial são mostrados nas Figuras 6 a 7. As mananases de acordo com a invenção têm desempenho de remoção de mancha semelhante (Man6) ou consideravelmente melhor (Man7) com detergente líquido quando dosadas como unidades de atividade ou como proteína de enzima ativa em comparação com a preparação de mananase comercial Mannaway® 4,0 L. Desempenho semelhante foi obtido com Man6 e Man7 independentemente do hospedeiro de expressão, Bacillus ou Trichoderma (Figura 6).
[0226] Os resultados obtidos com detergente em pó de cor comercial (Figuras 8 a 9) mostram que as mananases de acordo com a invenção têm melhor
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54/68 desempenho de remoção de mancha com detergente em pó de cor quando dosadas como unidades de atividade ou como proteína de enzima ativa em comparação com preparação de mananase comercial Mannaway® 4,0 L.
Exemplo 10. Desempenho de remoção de mancha de mananases Man6 e Man7 com detergente que contém lixívia [0227] Mananases Man6 e Man7 produzidas em Bacillus (conforme descrito no Exemplo 5) foram testadas para sua capacidade para remover manchas sensíveis padrão de mananase a 40 °C e dureza de água de 285,71 mg/L com detergente em pó de lixívia comercial e em comparação com a preparação de mananase comercial Mannaway® 4,0 L (Novozimas). O sistema de teste foi semelhante àquele descrito no Exemplo 9, exceto pelo fato de que panos de teste artificialmente sujos diferente do Centro para B.V. de material de teste (os Países Baixos) foram usados: Mananase de pudim de chocolate sensível em algodão (E165), Goma de sementes de alfarroba, com pigmento em algodão (C-S-73) e Goma guar com negro-de-fumo em algodão (C-S-43). O detergente em pó de Cor Comercial foi usado a concentração de 4,2 g por litro de licor de lavagem e pH do licor de lavagem foi aprox. 9,5. Protease Savinase® 16 L (0,5 % em p/p) e amilase Stainzyme® 12 L (0,4 % em p/p) foram adicionados em água rígida usada em teste, uma vez que o detergente não conteve quaisquer enzimas.
[0228] A cor das amostras após tratamento foi medida e resultados calculados como soma de AL* de cada uma das 3 manchas conforme descrito no Exemplo 9.
[0229] Os resultados (Figura. 10) obtidos com detergente comercial que contém lixívia indicam que a mananase de acordo com a invenção (Man7) tem desempenho de remoção de mancha consideravelmente melhor em comparação com mananase comercial Mannaway® 4,0 L quando dosadas como proteína de enzima ativa. Com Man6 pelo menos desempenho semelhante em
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55/68 comparação com uma mananase bacteriana comercial é obtido.
Exemplo 11. Desempenho de remoção de mancha de mananase Manl4 com detergente líquido comercial [0230] Mananase Manl4 produzida em Bacillus (conforme descrito no Exemplo 5) foi testada para sua capacidade para remover manchas sensíveis padrão de mananase a 40 °C e dureza de água de 285,71 mg/L com detergente líquido de uso pesado comercial B e em comparação com preparação de mananase comercial Mannaway® 4,0 L (Novozimas). O sistema de teste foi semelhante àquele descrito no Exemplo 9, exceto pelo fato de que dois panos de teste artificialmente sujos diferentes do Centro para B.V. de material de teste (os Países Baixos) foram usados: Mananase de pudim de chocolate sensível em algodão (E-165) e Goma de sementes de alfarroba, com pigmento em algodão (C-S-73). Detergente líquido de uso pesado comercial B foi usado a concentração de 5 g por litro de licor de lavagem e o pH do licor de lavagem foi aproximadamente 8,3. Protease Savinase® 16 L (0,5% em p/p) e amilase Stainzyme® 12 L (0,4 % em p/p) foram adicionadas em água rígida usada em teste, uma vez que o detergente não conteve quaisquer enzimas.
[0231] A cor das amostras após o tratamento foi medida e resultados calculados como soma de AL* de cada 2 manchas conforme descrito no Exemplo
9.
[0232] Os resultados (Figuras 11 a 12) obtidos com líquido comercial que contém detergente indicam que Manl4 teve bom desempenho em um detergente líquido, em comparação com o produto comercial, quando dosada como unidades de atividade ou como proteína de enzima ativa.
Exemplo 12. Estabilidade de mananases Man6 e Man7 em detergentes comerciais líquidos [0233] A estabilidade de preparações de mananase Man6 e Man7
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56/68 produzidas em Bacillus foi testada em líquido de Cor 0M0 obtido no supermercado local e comparado com a preparação de mananase comercial Mannaway® 4,0 L. Preparações de mananase foram adicionadas 0,5% % em p/p em detergentes e amostras foram incubadas em tubos de plástico com tampas a 37 °C por 5 semanas. A atividade foi medida em determinados intervalos por meio de ensaio de atividade descrito no Exemplo 7 exceto pelo fato de que tempo de incubação de 30 min foi usado. Resultados foram calculados como atividade residual (%), os quais foram obtidos dividindo-se a atividade de uma amostra tomada em determinado ponto temporal por atividade inicial da amostra.
[0234] A estabilidade de Man7 produzida tanto em Bacillus quanto Trichoderma e Man6 produzida em Trichoderma foi testada contra Mannaway® 4,0 L também em detergente de uso pesado líquido comercial A que contém protease, mas nenhuma mananase. Nesse teste, 1 % -(p/p) de mananases foi usada e amostras incubadas por 37 °C por 12 semanas.
[0235] Os resultados em Cor Omo (Figura. 13) mostraram que Man6 tiveram estabilidade consideravelmente melhor e semelhante Man7 em comparação com Mannaway® 4,0 L. Tanto Man7 quanto, especialmente, Man6 foram mais estáveis do que Mannaway® 4,0 L com outro detergente líquido comercial A, conforme mostrado na Figura 14. Os resultados obtidos em outro teste nas mesmas condições mostraram que Man6 teve estabilidade semelhante independentemente do hospedeiro de expressão, Bacillus ou Trichoderma (dados não mostrados).
[0236] Os resultados dos experimentos de estabilidade mostram que a mananase de acordo com a invenção é estável em detergentes por diversas semanas mesmo quando armazenada a alta temperatura como 37 °C. A estabilidade das mananases de acordo com a invenção (Man6 e Man7) é
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57/68 aperfeiçoada em comparação com uma mananase bacteriana comercial em detergente líquido.
Exemplo 13. Estudo de eficiência com mananase individualmente e em combinação com um polissacarídeo de não amido (NSP) de degradação de enzima em carnes de frango [0237] Efeitos de recombinantes de mananase da invenção são estudados no crescimento em carnes de frango. Ultrafiltrado do caldo de fermentação que inclui a mananase recombinante é seco e níveis-alvo aplicados a uma dieta de carne de frango em péletes individualmente ou em combinação com um produto à base de xilanase comercialmente disponível.
[0238] Uma dieta de controle à base de milho e refeição de soja de solvente descorticado extraído é alimentada sem enzima ou adicionada por níveis diferentes da mananase recombinante da invenção individualmente ou em combinação com uma dose padrão de uma xilanase comercial.
[0239] O peso inicial das carnes de frango está entre 30 g e 50 g. O teste dura entre três e cinco semanas. Cada tratamento consiste no mínimo de seis replicados com 10 carnes de frango cada. Em cada caso, a dieta é analisada para umidade, proteína bruta, fibra bruta, gordura, cinza e proteína enzimática.
Cinco dietas são preparadas:
1) controle não suplementado (BD)
2) BD + mananase 1 a 500 mg/kg
3) BD + mananase 1 a 1.000 mg/kg
4) BD + mananase 1 a 500 mg/kg + xilanase 1 a 10 mg/kg
5) BD + xilanase 1 a 10 mg/kg [0240] O estado de saúde e a mortalidade dos animais é verificado diariamente por meio de inspeção visual. Nos dias 0, 14 e 35, o ganho de peso corporal (BW), a ingestão de ração (Fl) e a razão de conversão de ração (FCR) são
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58/68 medidas. FCR é calculada como a ração total consumida dividida pelo ganho de peso durante o mesmo período. A determinação do efeito dos recombinantes de mananase é baseada na comparação com aqueles animais que tiveram a mesma dieta ou a mesma dieta, mas adicionada por xilanase.
Exemplo 14. Produção de café instantâneo [0241] Manano puro é o componente de polissacarídeo de armazenamento principal de endospermas de café e é responsável por sua alta viscosidade, o que afeta negativamente o processamento tecnológico de café instantâneo e aumenta consumo energético durante secagem. Esses efeitos são atribuídos a manano que forma estruturas cristalinas insolúveis rígidas, β-mananase, normalmente em conjunto com outras enzimas, como pectinase e celulase, é adicionada durante a etapa de concentração de produção de café instantâneo para reduzir viscosidade em extratos de café. Mananase também é empregada para hidrolisar galactomananos presentes em um extrato de café líquido a fim de inibir formação de gel durante liofilização de café instantâneo. Adicionalmente, devido ao uso de tratamento enzimático, os extratos de grão de café podem ser concentrados por um procedimento de baixo custo, como evaporação.
[0242] O teste é realizado de acordo com o seguinte fluxograma da Figura 15 a temperaturas de 10 °C e uma dosagem de enzima de 0,15% de d.s.
[0243] Mananases da invenção são testadas em mistura composta de enzimas diferentes, como pectinases e celulases.
[0244] A viscosidade do extrato de café aumenta significativamente ao longo do tempo sob condições de processo padrões. Entretanto, a viscosidade é significativamente reduzida com o uso da mistura enzimática que contém as mananases da invenção resultando em um processamento a jusante aperfeiçoado, como aspersão ou liofilização.
Exemplo 15. Processamento de abacaxi
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59/68 [0245] Em particular, mananase é útil para extração e clarificação de suco de moagem de abacaxi, como abacaxi, contém uma grande fração de mananos, incluindo glucomananos e galactomananos.
[0246] Mananase ajuda a aperfeiçoar extração de componentes valiosos de fruta, abaixar a viscosidade de suco de frutas antes da concentração e aumentar taxa de filtração e estabilidade do produto final.
[0247] Os abacaxis são esmagados em um moedor de carne e carregados em mosto de 500 g em uma proveta de 1.000 mL. A enzima é aplicada a 21 °C com um tempo de reação de 60 minutos. O mosto é, então, prensado com uma prensa Hafico pequena de acordo com o protocolo de prensagem: 0 bar 2 min 5 MPa (50 bar) 2 min - 10 MPa (100 bar) 2 min - 15 MPa (150 bar) 2 min - 20 MPa (200 bar) 1 min - 30 MPa (300 bar) 1 min - 40 MPa (400 bar) lmin. O suco obtido é, então, centrifugado a 4.500 rpm por 5 minutos e analisado para turbidez e viscosidade.
[0248] Mananases da invenção são testadas em misturas enzimáticas A, B e C (Tabela 10).
[0249] As enzimas são, primeiro, diluídas com água de torneia antes de serem adicionadas ao mosto de abacaxi [0250] Tabela 10. Misturas enzimáticas
Atividade enzimática Dosagem [ppm] 5 mL de [solução enzimática em %]
vazio 5 mL H2O
Mistura A Pectinase 50 0,50%
Mistura B Pectinase + Arabanase 50 0,50%
Mistura C Pectinase + Mananase 50 0,50%
[0251] Aplicar mananases da invenção leva a rendimento aumentado e
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60/68 turbidez menor de suco em processamento de abacaxi.
Exemplo 16. Tratamento de mananase de grãos de soja para produção de leite de soja [0252] Para o tratamento enzimático de grãos de soja para conseguir leite de soja, o processo quente é comumente usado. Para o processo de leite de soja quente, os grãos de soja secos foram misturados e esmagados em um misturador com água de torneira fervente em uma razão de 1:7 (grãos embebidos: água). Toda a pasta fluida de soja é resfriada para 50 a 55 °C antes da adição de enzima. O nível de pH para a pasta fluida de soja deve ser cerca de pH 6,5 e pode ser ajustado com NaHCOs. A enzima mananase é dosada a 1 kg/t de grãos de soja secos na pasta fluida e agitada por 30 min. Após conclusão do tempo de reação, a pasta fluida é prensada com o uso de uma prensa laboratorial para obter o produto final: leite de soja. A fim de assegurar o mesmo perfil de prensa, a pressão assim como o tempo de prensa correspondente é especificado, conforme mostrado na tabela 11. Além da amostra para reação enzimática, uma amostra de controle sem qualquer enzima é preparada, em que a solução enzimática foi substituída com água.
[0253] Tabela 11. Esquema de prensa
pressão [MPa] [bar] 0 5 (50) 10 (100) 30 (300)
tempo [min] 2 2 2 1
[0254] Após da prensa, o leite de soja é aquecido em um micro-ondas até ebulição para parar a reação enzimática. Análise do leite de soja:
• Rendimento em grama/tempo • °Brix, que rende uma correlação direta da quantidade de açúcar no leite de soja, é determinado com um refratômero • A turbidez do suco é medida com um fotômetro de NTU, o qual mede a turbidez nefelométrica.
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61/68 • A luminosidade será medida com uma medição de LAB • Teor de proteína é determinado com um Analisador CN (método de combustão) • Sabor
Leite de soja tratado com as mananases da invenção mostra um rendimento aumentado, cor mais clara, °Brix aumentado, uma turbidez menor, um teor de proteína maior e um gosto melhor (remoção de sabor ruim).
Exemplo 17. Desempenho de lavagem de composições de detergente líquido de acordo com a invenção [0255] O desempenho de lavagem de composições de detergente líquido de acordo com presente invenção foi determinado usando-se manchas padronizadas obteníveis a partir de CFT (Centro para Materiais de teste) B.V., Vlaardingen, Países Baixos (CFT), Eidgenõssische Material- und Prüfanstalt Testmaterialien AG [Materiais federal e agência de teste, Materiais de teste], St. Gallen, Suíça (EMPA) e Warwick Equest Ltd Unidade 55, Consett Business Park, Consett, County Durham (Equest).
[0256] Um agente de lavagem líquido com a seguinte composição foi usado como formulação-base (todos os valores em porcentagem em peso):
[0257] Tabela 12.
Nome químico Material bruto de substância ativa [%] Formulação de detergente de substância ativa [%]
Demin, de água 100 Descanso
Ácido alquil benzeno sulfônico 96 2-7
Tensoativos aniônicos 70 6-10
C12-C18 Sal de sódio de ácido graxo 30 1-4
Tensoativos não iônicos 100 4-7
Fosfonatos 40 0,1-2
Ácido cítrico 100 1-3
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62/68
NaOH 50 1-4
Ácido borônico 100 0,1-2
Agente antiformação de espuma 100 0,01-1
Glicerol 100 1-3
Enzimas 100 0,1-2
Agente conservante 100 0,05-1
Etanol 93 0,5-2
Branqueador óptico 90 0,01-1
Perfume 100 0,1-1
Tinta 100 0,001-0,1
[0258] O pH da composição de detergente foi entre 8,2 a 8,6.
[0259] Com base nessa formulação-base, composições de detergente líquido 1 e 2 foram preparados adicionando-se respectivas enzimas, como indicado abaixo:
Composição 1: Enzima de acordo com SEQ ID NO:12 (Man6)
Composição 2: Enzima de acordo com SEQ ID NO:16 (Man7) [0260] A lavagem foi realizada como segue de acordo com o Método AISE: 3,5 kg de Pano de balastro limpo, 4 Panos de SBL, Máquina de lavagem Miele, 20 °C e 40 °C no Programa curto.
[0261] Todas as mananases foram adicionadas nas mesmas quantidades com base em teor de proteína total.
[0262] A razão de dosagem do agente de lavagem líquido foi 4,0 gramas por litro de licor de lavagem. O procedimento de lavagem foi realizado por 60 minutos a uma temperatura de 20 °C e 40 °C, a água tendo uma dureza de água entre 276,78 e 294,64 mg/L (15,5 e 16,5° graus alemães de dureza).
[0263] Os resultados obtidos são os valores de diferença entre as unidades de remissão obtidas com os detergentes e as unidades de remissão obtidas com o detergente que contém a mananase de referência comercialmente disponível (Mannaway 4,0 L, obtida a partir de Novozimas). Um valor positivo, portanto, indica um desempenho de lavagem aperfeiçoado das composições de
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63/68 detergente que compreendem as mananases da presente invenção em comparação com a mesma composição de detergente que compreende a mananase de referência. Dentro do teste de lavagem uma ampla faixa de manchas foi testada.
[0264] A brancura, isto é, a luminosidade das manchas, foi determinada fotometricamente como uma indicação de desempenho de lavagem. Um dispositivo de espectrômetro Minolta CM508d foi usado, o qual foi calibrado anteriormente com o uso de um padrão branco dotado da unidade.
[0265] Os resultados obtidos são os valores de diferença entre as unidades de remissão obtidas com os detergentes e as unidades de remissão obtidas com o detergente que contém as combinações enzimáticas. Um valor positivo, portanto, indica um desempenho de lavagem aperfeiçoado devido às combinações enzimáticas presentes no detergente. Mananases da invenção em composições de detergente mostram desempenho aperfeiçoado em uma variedade de manano que compreende manchas.
[0266] Tabela 13.
20 °C 40 °C
Mancha Comp. 1 Comp. 2 Comp. 1 Comp. 2
Sorvete de Chocolate (Equest) 1,3 4,2 n.d. n.d.
Sorvete de Chocolate Carte Dór (Equest) n.d. 3,3 n.d. 0,7
Cacau [CO] (Equest) n.d. 2,3 n.d. n.d.
cor Maionese/Negro-de-fumo (CFT CS05S [CO]) 1,3 4,3 1,1 2,2
Molho para salada, com preto natural (CFT CS06 [CO]) 1,2 3,5 1,2 2,6
Batom, diluído, Vermelho (CFT CS216 [CO]) n.d. 1,5 n.d. 0,7
Exemplo 18. Desempenho de lavagem de composições em pó de detergente de acordo com a invenção [0267] O desempenho de lavagem de composições em pó de detergente de acordo com a presente invenção foi determinado usando-se manchas
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64/68 padronizadas obteníveis a partir de CFT (Centro para Materiais de teste) B.V., Vlaardingen, Países Baixos (CFT), Eidgenõssische Material- und Prüfanstalt Testmaterialien AG [Materiais federais e agência de teste, Materiais de teste], St. Gallen, Suíça (EMPA) e Warwick Equest Ltd Unidade 55, Consett Business Park, Consett, County Durham (Equest).
[0268] Um agente de lavagem sólido com a seguinte composição foi usado como para formulação-base (todos os valores em porcentagem em peso):
Tabela 14.
Nome químico Material bruto de substância ativa [%] Formulação de detergente de substância ativa [%]
Demin, de água 100 1-4
Ácido alquil benzeno sulfônico 97 9-13
Tensoativos não iônicos 100 4-7
Percarbonatos 88 9-13
TAED 92 1-5
Fosfonatos 60 0,1-3
Poliacrilatos 45 1-4
Silicato de sódio 40 5-10
Carbonato de sódio 100 18-22
Carboximetilcelulose 69 1-4
Polímero de liberação de sujeira 100 0,1-1
Branqueador óptico 70 0,1-1
Agente antiformação de espuma t.q. 0,01-1
Sulfato de sódio 100 22-30
Enzimas 100 0,1-1
Perfume 100 0,1-1
NaOH 100 0,1-1
Descanso - 1-4
[0269] Com base nessa formulação-base, composições de detergente sólido 3 e4foram preparadas adicionando-se respectivas enzimas como indicado abaixo:
Composição 3: Enzima de acordo com SEQ ID NO:12 (Man6)
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Composição 4: Enzima de acordo com SEQ ID NO:16 (Man7) [0270] A lavagem foi realizada como segue de acordo com o Método AISE: 3,5 kg de Pano de balastro limpo, 4 Panos de SBL, Máquina de lavar Miele, Programa curto a 20 °C e 40 °C. Todas as mananases foram adicionadas nas mesmas quantidades com base no teor de proteína total.
[0271] A razão de dosagem do agente de lavagem em pó foi 3,8 gramas por litro de licor de lavagem. A composição do detergente é listada na Tabela 14. O procedimento de lavagem foi realizado por 60 minutos a uma temperatura de 20 °C e 40 °C, a água tendo uma dureza de água entre 15,5 e 16,5° (Graus alemães de dureza).
[0272] A brancura, isto é, a luminosidade das manchas, foi determinada fotometricamente como uma indicação de desempenho de lavagem. Um dispositivo de espectrômetro Minolta CM508d foi usado, o qual foi calibrado anteriormente com o uso de um padrão branco dotado da unidade.
[0273] Os resultados obtidos são os valores de diferença entre as unidades de remissão obtidas com os detergentes e as unidades de remissão obtidas com o detergente que contém a mananase de referência (Mannaway 4,0L, obtida a partir de Novozimas). Um valor positivo, portanto, indica um desempenho de lavagem aperfeiçoado das mananases no detergente. Mananases da invenção mostram desempenho aperfeiçoado em diversas manchas na Tabela 15. Portanto, é evidente que mananases de acordo com a invenção mostram desempenho de lavagem aperfeiçoado em comparação com Mannaway.
Tabela 15. Pó a 20/40 °C
20 °C 40 °C
Mancha Comp. 3 Comp. 4 Comp. 3 Comp. 4
Sorvete de Chocolate Carte Dór (Equest) 1,4 2,8 2,1 0,5
Vienetta (Equest) 0,5 0,8 0,5 n.d.
Sorvete de Chocolate L [CO] (Equest) 0,9 0,9 1,1 n.d.
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66/68
Mingau (EMPA 163 [CO]) n.d. n.d. 1,3 5,1
Cacau (CFT CS02 [CO]) 1,8 3,1 n.d. n.d.
Cor Maionese/Negro-de-fumo (CFT CS05S [CO]) n.d. 1,0 n.d. 2,7
Molho para Salada, com preto natural (CFT CS06 [CO]) 2,0 4,8 1,3 5,1
Sebo BEY com negro-de-fumo (CFT CS32 [CO]) 0,7 1,4 0,5 0,7
Bebida de chocolate, pura (CFT CS44 [CO]) n.d. 1,4 n.d. 0,8
[0274] Sem limitar o escopo e a interpretação das reivindicações-mãe, determinados efeitos técnicos de um ou mais dentre os aspectos ou as modalidades reveladas na presente invenção são litados a seguir: A efeito técnico é degradação ou modificação de manano. Outro efeito técnico é provisão de mananase que tem boa estabilidade de armazenamento.
[0275] A descrição supracitada forneceu por meio de exemplos não limitantes de implantações particulares e modalidades da invenção uma descrição completa e informativa do melhor modo aqui contemplado pelos inventores para executar a invenção. No entanto, está claro para um técnico no assunto que a invenção não é restrita a detalhes das modalidades apresentadas acima, mas que a mesma pode ser implantada em outras modalidades com o uso de meios equivalentes sem desvio das características da invenção.
[0276] Adicionalmente, algumas das características dos aspectos e modalidades revelados acima desta invenção podem ser usadas para tomar vantagem sem o uso correspondente de outras características. Assim, a descrição supracitada deve ser considerada como meramente ilustrativa dos princípios da presente invenção e não em limitação destes. Logo, o escopo da invenção é apenas restrito pelas reivindicações anexas.
[0277] Em uma modalidade, pelo menos um componente das composições da invenção tem uma característica química, estrutural ou física diferente em comparação com o componente natural correspondente a partir do qual o pelo menos um componente é derivado. Em uma modalidade, a dita característica é
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67/68 pelo menos uma dentre tamanho uniforme, dispersão homogênea, isoforma diferente, degeneração de códon diferente, modificação pós-translacional diferente, metilação diferente, estrutura terciária ou quaternária diferente, atividade enzimática diferente, afinidade diferente, atividade de ligação diferente e imunogenicidade diferente.
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Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uma composição enzimática compreendendo pelo menos uma enzima mananase que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 16 (Man7), pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12 (Man6) e/ou pelo menos 79% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20 (Manl4).
  2. 2. A composição enzimática da reivindicação 1, que compreende adicionalmente:
    a. pelo menos um conservante selecionado a partir de ácido benzoico, benzoato de sódio, hidroxibenzoato, ácido cítrico, ácido ascórbico ou uma combinação destes;
    b. opcionalmente pelo menos um poliol selecionado a partir de propilenoglicol, glicerol, um açúcar, álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, derivado de ácido bórico, éster de borato aromático, derivado de ácido fenil borônico, peptídeo ou uma combinação destes;
    c. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir de proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, enzimas pectinolíticas, pectato liases, carboidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases com ou sem um mediador ou uma combinação destas ; e
    d. opcionalmente pelo menos uma carga selecionada a partir de maltodextrina, farinha, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou uma combinação destes.
  3. 3. A composição enzimática das reivindicações 1 a 2 na forma de uma composição líquida ou uma composição sólida como solução, dispersão, pasta, pó, grânulo, granulado, granulado revestido, comprimido, bolo, cristal, pasta fluida de cristal, gel ou pélete.
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    2/6
  4. 4. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo elementos genéticos que permitem produzir pelo menos um polipeptídeo recombinante que tem atividade de mananase e pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, pelo menos 93% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e/ou pelo menos 79% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em:
    células fúngicas, células fúngicas filamentosas da Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotincr, preferencialmente a partir do grupo que consiste em membros da Classe Sordariomycetes, Subclasse Hypocreomycetidae, Ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicolcr, mais preferencialmente a partir do grupo que consiste em Famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae e Gêneros Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium e Scedosporiunr, mais preferencialmente a partir do grupo que consiste em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F gramineanum, F. pseudograminearum, F venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M.
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    3/6 anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, Scedosporium apiospermum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens e Humicola grisea, células bacterianas, preferencialmente Bacilli gram-positivas, como B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, bactérias gram-negativas, como Escherichia coli, actinomicetos, como Streptomyces sp., e leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, ainda mais preferencialmente Trichoderma reesei ou Bacillus.
  5. 5. A célula hospedeira recombinante da reivindicação 4, em que o polipeptideo recombinante é uma proteína de fusão que, além de ter a sequência de aminoácidos que tem atividade de mananase, compreende pelo menos uma dentre:
    uma sequência de aminoácidos que fornece uma sequência-sinal secretora, como peptídeo-sinal de xilanase de Bacillus amyloliquefaciens·, uma sequência de aminoácidos que facilita a purificação, como um marcador de afinidade, His-tag;
    uma sequência de aminoácidos que aprimora a produção, como uma sequência de aminoácidos que é um carreador, como CBM;
    uma sequência de aminoácidos que tem uma atividade enzimática; e uma sequência de aminoácidos que fornece à proteína de fusão afinidade de ligação, como uma porção de ligação de carboidrato.
  6. 6. Um polipeptideo recombinante que tem atividade de mananase e é obtenível usando-se a célula hospedeira das reivindicações 4 a 5.
  7. 7. Um método para produzir mananase compreendendo:
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    4/Ç>
    a. cultivar uma célula hospedeira recombinante das reivindicações 4 a 5, em que
    i. os elementos genéticos que compreendem pelo menos uma sequência de controle que controla a produção do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira recombinante sob condições que permitem a produção do polipeptídeo;
    ii. os elementos genéticos compreendem opcionalmente pelo menos uma sequência que codifica uma sequência-sinal para transportar o polipeptídeo fora da célula hospedeira; e iii. o cultivo é realizado em condições que permitem a produção do polipeptídeo; e
    b. recuperar o polipeptídeo.
  8. 8. Um método para degradar ou modificar material que contém manano que compreende tratar o dito material que contém manano com uma quantidade eficaz da composição enzimática das reivindicações 1 a 3 ou o polipeptídeo recombinante da reivindicação 6.
  9. 9. O método da reivindicação 8, em que o material que contém manano é material à base de planta, têxtil, água de refugo, esgoto, petróleo ou uma combinação destes.
  10. 10. Uma ração animal que compreende a composição enzimática das reivindicações 1 a 3 ou a enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante das reivindicações 4 a 5, e pelo menos uma fonte proteica de origem vegetal ou um subproduto ou produto que contém manano e
    a. Opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase ou uma combinação destas; e
    b. Opcionalmente pelo menos uma carga selecionada a partir de
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    5/6 maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou uma combinação destes.
  11. 11. Um suplemento alimentar que compreende a composição enzimática das reivindicações 1 a 3 ou a enzima obtenível a partir da célula hospedeira das reivindicações 4 a 5; e
    a. Opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase ou uma combinação destas; e
    b. Opcionalmente pelo menos uma carga selecionada a partir de maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou a combinação destes.
  12. 12. Uso da ração animal da reivindicação 10 ou do suplemento alimentar da reivindicação 11, na:
    a. alimentação de animais, preferencialmente animais monogástricos ou ruminantes; e/ou
    b. no aprimoramento de ganho de peso de animais.
  13. 13. Um uso da composição enzimática das reivindicações 1 a 3 ou da enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante das reivindicações 4 a 5, em um detergente.
  14. 14. O uso da reivindicação 13 em que o detergente é um detergente líquido ou um detergente seco, preferencialmente na forma de um pó, barra, pastilha, bolsa, pasta, gel, líquido, grânulo ou granulado.
  15. 15. Um uso da composição enzimática das reivindicações 1 a 3 ou da enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante das reivindicações 4 a 5, na extração de petróleo.
  16. 16. Um uso da composição enzimática das reivindicações 1 a 3 ou da enzima obtenível a partir da célula hospedeira recombinante das reivindicações 4 a 5,
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