CN100491525C - 从芽孢杆菌a7-7(dsm 12368)中提取的新型淀粉分解酶以及含有该新型淀粉分解酶的洗涤剂和清洗剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从微生物芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中提取的新型淀粉分解酶、具有淀粉分解功能的足够相似的蛋白、生产它们的方法以及这些蛋白的各种应用领域。此外，它们可进一步开发在实施的应用领域以外的其他首要技术目的。本发明具体涉及含有前述类型淀粉分解蛋白的洗涤剂和清洗剂，涉及清洗织物或硬表面的方法，所述方法包括这些淀粉分解蛋白或类似物试剂的用途，以及涉及它们用于清洗织物或硬表面。

Description

从芽孢杆菌A7-7(DSM 12368)中提取的新型淀粉分解酶以及含有该新型淀粉分解酶的洗涤剂和清洗剂

本发明涉及来自微生物芽孢杆菌(Bacillus sp.)A7-7(DSM 12368)的新淀粉分解酶以及具有淀粉分解活性的足够相似的蛋白，还涉及它们的生产方法以及这些蛋白各种潜在的应用。除提及的潜在的应用以外，它们可进一步开发用于其他最重要的工业目的。更具体而言，本发明涉及含有这些淀粉分解蛋白的洗涤剂/清洗剂，涉及淀粉分解蛋白或对应的组合物参与其中的用于清洗织物或硬表面的方法，以及涉及它们清洗织物或硬表面的用途。

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)水解淀粉和淀粉样多聚体如直链淀粉、支链淀粉或糖原的内α-1，4-糖苷键，以形成糊精以及β-1，6-支链寡糖。它们是最重要的工业用酶之一。对此有两个理由。第一，象许多底物降解酶一样，它们从微生物释放到外围培养基中，以便通过发酵和纯化在工业规模上可相对容易地从培养基中分离出来。第二，大范围的应用需要淀粉酶。

α-淀粉酶的一个重要工业用途是生产葡萄糖浆。其他应用是例如作为活性成分用于洗涤剂/清洗剂、处理织物制造中的原材料、粘合剂的生产以及含糖食品或食品成分的生产中。

数十年来，酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶或纤维素酶一直作为活性成分用于洗涤剂/清洗剂中。它们对特定组成的洗涤/清洗性能的特殊贡献如下：在蛋白酶的情况下，具有降解含蛋白污迹的能力；在淀粉酶的情况下，是降解含淀粉污迹；以及在脂肪酶的情况下，具有脂解活性。纤维素酶优选用于洗涤剂中，首要是依据它们对洗涤剂的多洗涤循环性能的贡献以及它们对织物的纤维效应。特定水解产物由洗涤剂的其他成分攻击、溶解、乳化或悬浮，或依据它们相对高的溶解度，用洗涤液漂浮，以便在酶和其他组成物之间发生协同效应。

通常用于洗涤剂/清洗剂中的α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶。例如，丹麦Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd和美国Genencor Int.，Rochester，New York的对应产品分别是商业上已知的

和

从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)中分离并公开在美国专利申请US 1,227,374中的同系物已被Novo Nordisk A/S以

的名称推向市场。

该淀粉酶分子或其密切相关物已在众多发明中被进一步开发，这些发明陈述了通过各种分子生物学修饰使它们的酶特性最佳化用于特定应用的问题。这些最佳化可涉及例如底物特异性，涉及各种反应条件下酶的稳定性或涉及酶活性自身。提及下列专利申请作为最适于特定应用的例子：EP 0 410 498用于织物筛分以及WO 96/02633用于淀粉液化。

总之，尽管α-淀粉酶有关用于洗涤剂/清洗剂中的开发一直在进行。提及下列专利申请仅作为此的一些例子：WO 99/02702中的淀粉酶在相对高的温度下比出发分子更稳定。WO 99/23211中的酶在高pH值、有钙离子存在以及相对高温度下是稳定的。WO 97/43424中的α-淀粉酶对钙离子表现修饰的结合能力，并因此修饰酶特性。WO99/20768中的诱变方法导致α-淀粉酶变体，这些变体在洗涤剂成分存在下尤其稳定。类型修饰尚在争论中，个别酶特性的变化几乎总是对特定酶的其他特性和洗涤性能具有效应。以此种途径获得的现已上市的最佳化产品的一个例子是

(WO 94/02597)，其降低了对氧化的灵敏度(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark；

 123，(1997)，pp.723-731)。

由于开发仅包括若干已知的出发酶的最佳化，这可能被限制在所获得结果中，因此对来自其他天然来源的可比较的酶一直进行平行且深入的研究。该研究已鉴定淀粉—分裂的酶，例如来自脂肪杆菌(Pimelobaeter)、假单胞菌(Pseudomonas)以及栖热菌(Thermus)用于食品生产、化妆品和制药产品(EP 0 636 693)中，来自根瘤菌(Rhizobium)、节杆菌(Arthrobacter)、短杆菌(Brevibacterium)以及微球菌(Micrococcus)(EP 0 628 630)，来自火球菌(Pyrococcus)(WO 94/19454)以及硫化叶菌(Sulfolobus)用于高温下或高酸性反应条件下的淀粉液化(EP 0 727 485和WO 96/02633)。来自芽孢杆菌的淀粉酶已被发现(WO 95/26397和WO 97/00324)用于碱性pH值下。依据它们对洗涤剂的灵敏度低，来自各种芽孢杆菌的其他淀粉酶(EP 0 670367)适用于洗涤剂/清洗剂中。

依据它们的起源，来自新公开生物的酶可能比若干确定的酶可能更适用于针对特定应用的进一步开发中。这种酶的一个例子是来自Thermoalcalibacter的淀粉酶(WO 98/13481)，其中天然活性很大程度上不受钙离子的影响，因此从一开始，其就具有用于洗涤剂的正选资格。

从天然资源中分离的酶对特殊用途的进一步最佳化需要采用分子生物学方法(例如根据US 5,171,673或者WO99/20768)或者化学修饰(DE 4013142)的方法得到。例如，专利申请WO99/43793描述了进一步开发已知酶

α-淀粉酶。这篇文献中，通过微生物技术，和已知的环糊精葡聚糖转移酶(CGTases)之间的序列相似性被用来建立一组相关分子。这些相关分子是具有其他CGTase特异的共有序列(框)和功能的α—淀粉酶，或与此相反，是具有典型α-淀粉酶的其他区段或功能的CGTase或者两分子的嵌合。改进的目的是为了使

最适于这些应用。

专利申请WO 99/57250公开了另一种提高洗涤酶的洗涤性能的方法，例如利用脂肪酶、纤维素、蛋白酶、淀粉酶或者甚至CGTases。其中所述原理在于通过非氨基酸连接体将特定酶与细菌起源的纤维素结合域(CBD)共价结合在一起。这确保了酶以更大的强度作用于织物的表面。从这种意义上来讲，WO 99/57252包括其他可能的连接体，因为WO 99/57254包括其他酶例如糖基转移酶或者酰基转移酶，它们与纤维素结合域结合以形成嵌合蛋白，或者通过WO 99/57252中提到的连接体结合。

用于洗涤剂的每一种淀粉酶都有其自己的性能特点，这可以从如下事实反应出来：有些污垢能够被一种酶有效清除，而其他一些污垢却被另一种酶有效清除。这进一步表明用其他淀粉分解酶丰富本领域的必要性，所述其他淀粉分解酶也有着自己的性能范围。这种必要性也随消费者需求和习惯的改变而显现，据此例如，对在低温和中等温度的环境下洗涤的洗涤剂就有增长的需求。

除此以外，从生物中获取的迄今还未为此目的而开发的新酶可能作为初始产品，以待通过蛋白质工程对其进一步进行基因工程的修饰。他们的目的是产生一些目前已知的酶或者从这些酶中衍生的洗涤酶没有或不具有的特性。

然而，从另一方面讲，那些与典型的洗涤成分结合使用，从一开始就显示洗涤或清洗性能的天然酶，似乎是特别适合于这些最佳化的候选物。

然而，尽管有这些改进，但是除了工业规模上实际使用或以进一步改进形式的天然淀粉分解酶以外，仍需要找到其他的淀粉分解酶，它的初始产品就具有广泛的应用范围，并且可作为进一步特异改造的起始点。

因此，本发明所要解决的问题是鉴定迄今还未被记述过的天然α-淀粉酶，它适合于投入工业应用，更具体是在洗涤剂/清洗剂方面，或者其能够被用作特定应用进一步改进基础。

其次的一个问题是得到编码这种淀粉酶的核酸序列，因为这对它的生物技术生产以及进一步开发这些酶是必需的。

再其次的问题是找到一种生物，其能够天然的生产这种特定的淀粉酶

再其次的问题是使找到的α-淀粉酶能够采用生物技术生产。

再其次的问题是提供洗涤剂/清洗剂，它们的洗涤或清洗性能能够被所发现的α-淀粉酶提高，也即，其洗涤或清洗性能部分可归功于根据本发明所述的淀粉酶。

再其次的问题是提供对应的洗涤/清洗方法并且指出对应的潜在用途。

另一其次的问题是确定主要显现适用于洗涤剂/清洗剂的α-淀粉酶进一步潜在的工业应用。

以上问题的解决方式，也是本发明的第一个实施方案在于淀粉分解蛋白，其氨基酸序列具有至少96％，优选至少98％以及更优选100％的同一性于SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，更具体是同一性于SEQ ID NO.2的第32-516位氨基酸的区域。

这包括衍生自核苷酸序列的淀粉分解蛋白，所述核苷酸序列是至少85％，优选至少90％以及更优选100％同一性于SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列，更具体是对应于SEQ ID NO.2的第32-516位氨基酸的区域。也包括另一些淀粉分解酶，它们与上述的淀粉分解蛋白足够的相似，或能够从已知的方法本身得到。优选的代表是能够从微生物中天然分离，杆菌属的革兰氏阳性菌，尤其是芽孢杆菌A7-7(DSM12368)，更具体是来自芽孢以及更具体是芽孢杆菌A7-7(DSM12368)。

本发明的第二个实施方案是编码淀粉分解蛋白的核酸，其核苷酸序列是至少85％，优选至少90％，以及更优选100％同一性于SEQ IDNO.1中所示的核苷酸序列，更具体是对应于SEQ ID NO.2的第32-516位氨基酸的区域。这些核酸优选对应地包括编码本发明第一个实施方案中的特定蛋白的核酸。

本发明第三个实施方案是天然生物，它们能够合成第一个实施方案的衍生物，或包含蛋白或者编码此蛋白或衍生物的核酸。具体优选的实施方案是芽孢杆菌A7—7菌株，它已经以DSM(12368)名称保藏。

本发明第四个实施方案是含有第二个实施方案的核酸的载体、用这些载体转化的宿主细胞，以及任何生产本发明第一个实施方案的蛋白或衍生物的生物技术方法。

本发明第五个实施方案是洗涤剂/清洗剂，其特征在于它们含有第一个实施方案的蛋白或其衍生物。这些洗涤剂/清洗剂优选包括含有淀粉分解蛋白或其衍生物的洗涤剂/清洗剂，所述淀粉分解蛋白或其衍生物的量按重量计为0.000001％到5％，以及更具体为0.00001％到3％，洗涤剂/清洗剂包括其他酶，洗涤剂/清洗剂作为本身已知的补充形式存在，或在洗涤剂/清洗剂中淀粉分解活性执行释放洗涤/清洗剂的成分的功能，或是自控的。

本发明的第六个实施方案是清洗织物或者硬表面的方法，其特征在于第一个实施方案的蛋白或其衍生物在至少一个方法步骤中发挥作用。第五个实施方案中的洗涤剂/清洗剂优选用作此目的，以及淀粉分解蛋白或其衍生物优选使用的量是每次应用0.01mg到200mg，以及在特殊的方法步骤中使用量是每次应用0.02mg到100mg。

本发明的第七个实施方案是第一个实施方案的蛋白或衍生物或者第五个实施方案的洗涤剂/清洗剂的对应的潜在用于清洗清洗织物或硬表面或用于释放对应洗涤剂/清洗剂的成分；优选的使用量为在洗碗机或洗衣机中每次应用加入0.01mg到200mg淀粉分解蛋白或其衍生物，以及更具体地加入0.02mg到100mg的淀粉分解蛋白或衍生物。

本发明的第八个实施方案为所发现的α—淀粉酶进一步潜在的工业用途。这些用途包括淀粉的液化方法，更具体是乙醇的生产方法，暂时的结合方法和多种潜在的用途，更具体是用于纺织物生产中的原材料或中间产品的处理，更具体是用于棉花的退浆，用于线性和/或短链寡糖的生产，用于环糊精的水解，用于从多糖载体或环糊精中释放低分子量的化合物，用于食品和/或食品成分的生产，用于动物饲料和/或动物饲料成分的生产，以及用于溶解含淀粉的粘合键。

本发明上下文中的蛋白指基本上是线性的多聚体，由天然氨基酸组成，一般认为发挥功能的三维结构。在本说明书中，这19种组成蛋白的，自然形成的L—氨基酸由国际上认可的1个字母的和3个字母的代码所命名。

本发明上下文中的酶是指一种蛋白质，它起着某种生化功能。淀粉分解蛋白或者有淀粉分解功能的酶理解为那些水解多糖的α—1，4—糖苷键的蛋白或酶，更具体是那些位于多糖中的蛋白或酶。因此，它们也被叫做α—1，4—淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。

很多蛋白质形成所谓的蛋白前体，即具有一个信号肽部分。这意味着这种蛋白的N端，其功能通常是保证蛋白在细胞中合成以后被释放到周质或者周围的介质中，以及/或者保证其正确的折叠。然后信号肽在自然状态下被一种信号肽酶从蛋白上切下来，与蛋白的其他部分分开，从而使蛋白在没有N端的情况下发挥其真正的催化活性。例如，来自芽孢杆菌A-7-7(DSM 12368)的天然α—淀粉酶长度为516个氨基酸，如SEQ ID NO.2.中所示。如SEQ ID NO.1中所示，这种酶的信号肽含有31个氨基酸，所以成熟的酶长度为485个氨基酸。

由于它们的酶活性，成熟的肽即合成后经处理的酶比起蛋白前体来说更受应用的青睐。

前体蛋白就是没有活性的蛋白前体。它们的前体及其信号频率被认为是前体蛋白的前体。

在本发明的上下文中，核酸是那些由核苷酸天然组成的分子，这些核酸的功能是作为信息载体，并且在蛋白质或酶中编码线性氨基酸序列。它们可能是单链的，也可能是互补于此单链的单链，或者是双链。作为天然永久的信息载体，这些核酸DNA更适用于分子生物学工程。相比之下，为了在自然环境中例如在正在表达的细胞中实施本发明，RNA形成，从而对于本发明有很重要作用的RNA亦代表本发明的实施方案。

在DNA中，所有三个读码框中的两条互补链都必须考虑到。另一点需要注意的是，不同的密码三联体可能编码同一种氨基酸，因此，某种特定氨基酸序列可以从一些不同的也许仅有最低相似性的核苷酸序列(遗传密码子的简并性)得到。除此以外，不同的生物在应用密码子上也存在差异。由于这些原因，不管是氨基酸序列还是核苷酸序列都必须列入保护范围，并且公开的核苷酸序列应只被看作编码某氨基酸序列的举例。

在本说明书中，与蛋白对应的信息单位亦称作基因。

在常用方法的帮助下，如化学合成或者聚合酶链式反应(PCR)，结合分子生物学和/或蛋白质化学的标准方法，专家们已经能够在已知DNA和/或氨基酸序列的基础上生产对应的核酸，其长达和包括完整的基因。这种方法已经掌握了，例如来自“Lexikon der Biochemie”，Spektrum Akademischer Verlag，Berlin，1999，Vol.1，第267-271页和Vol.2.，第227-229页。

核苷酸序列的变化被称为突变，其可以通过已知的分子生物学方法得到。根据变化的类型，突变分为例如缺失、插入、替代突变，或者不同的基因抑或基因的不同部分被融合在一起(“改组”的突变)；这些就是基因突变。与此相关的生物就称为突变体。从这些突变核酸中得到的蛋白被称为变体。例如，缺失、插入或者替代突变，或者融合导致了基因的缺失、插入、替代突变或融合，以及在蛋白质水平上，导致对应的缺失、插入或者替代变体或者融合蛋白。

片段是指那些比天然蛋白质或那些对应于完全翻译的基因短并且例如也可通过合成得到的任何蛋白或者肽。在氨基酸序列的基础上，它们能被设计成特异的完整蛋白。例如它们可以具有相同的结构，或可发挥蛋白水解活性或者部分活性，例如底物的络合。片段及初始蛋白的缺失变体基本上是一样的。然而，片段是相对较小的，缺失变体只是缺失小区域因此仅缺乏个别的部分功能。

在本发明的上下文中，嵌合或者杂交蛋白由那些由相同或不同生物的不同多肽链天然发出的元件组成。这个过程也就是改组或融合突变。融合的目的在于在融合部分蛋白的帮助下生成或者修饰某种酶的功能。

通过插入突变得到的蛋白被称为是变体，这种变体能够通过已知的方法把核酸或蛋白片段插入到起始序列中而得到。因为它们基本是一致的，它们能被置于一个嵌合蛋白中，在这些嵌合蛋白中，区别仅在于蛋白的不变部分与整个蛋白的大小比例不同。在插入突变蛋白中，外源蛋白的比例低于嵌合蛋白。

倒置突变，即部分序列的倒置，被看作一种缺失与插入的特殊形式。同样适用于分子不同部分的重组，这与原始的氨基酸序列相异。这也可以被看作是一种缺失变体，作为原始蛋白的插入变体或者改组变体。

在本发明的上下文中，衍生物是指已经化学修饰的纯氨基酸链的蛋白。这种衍生化作用可通过宿主生物以生物方法结合蛋白合成进行。分子生物学的方法可以用于此目的。这些衍生物也可以化学方法来实施，例如根据发明将氨基酸的侧链化学地转化或者通过共价结合将另一个化合物结合到蛋白上。该化合物可以如通过双功能化合物与根据本发明所述的蛋白结合的另一蛋白。衍生化作用也被认为包括对大分子载体地共价结合。

在本发明上下文，所有的酶、蛋白、片段及衍生物被集体的冠以蛋白的名字除非它们需要清晰的指称。

在本发明上下文中，载体被认为是由核酸组成的元件，这些核酸包括一个有趣的基因作为特征核酸区。它们能够在物种或细胞系中经若干代或细胞分裂作为稳定的遗传元件建立起来，所述遗传元件能够独立于基因组的其他部分复制。载体是特殊的质粒，即环形的遗传元件，尤其是它们被用于细菌的时候。在基因工程中，用于储存的进而进行所谓的基因操作(即所谓的克隆载体)的载体与在宿主细胞中生成有趣的基因即促进特定蛋白的表达的载体是有区别的。这些载体都被认为是表达载体。

通过与例如在常用数据库中保存的已知酶相比较，被研究酶的特征分子部分，如结构单元或者酶活，能够从氨基酸及核苷酸序列推导得到。这种比较是通过确定被研究蛋白彼此之间核苷酸或氨基酸序列的相似性来完成的。这就是所谓的同源化。对特定位点的列表称为比对。在对核苷酸序列的分析中，其互补链以及所有可能的三个读码框都必须列入考虑范围，除此以外，还有遗传密码子的简并性和生物特异密码子的利用率。现在，比对是由计算机程序产生的，例如通过FASTA或者BLAST算法。这个程序例如由D.J.Lipman和W.R.Pearson(1985)在Science，Vol.227，第1435-1441页中描述。所有与被比较序列一致的位置的总汇称为共有序列。

这样的比较也为被比较序列之间的相似性或同源性提供了信息。此信息通过同一性的百分数来表示，即相同核苷酸或位置相同的氨基酸残基的比例。同源性的更广泛的定义包括保守氨基酸的替换。这样，同一性百分率就可以变成相似性百分率。这种插入可以针对整个蛋白或者基因，或者单独的一个区域。

不同蛋白的同源区一般有相同的结构单元和/或功能，可以通过与原始氨基酸序列相对照而识别出来。在很小区域所谓框中是完全同一性的，这些框仅包含一些氨基酸并且一般对于整个活性发挥至关重要的作用。同源区的功能只代表蛋白整体功能的一小部分，例如络合底物或过渡复合体中单个氢键桥的形成。

酶活性能够被那些不参与实际反应的其他蛋白区域定性或者定量的修饰。这关系到酶的稳定性、活性、反应条件或底物特异性。

因此，根据本发明所述的淀粉水解蛋白的定义不仅适用于实施水解α—1，4—糖苷键的纯功能，所述键可归功于可能的催化活性中心的数个氨基酸残基。同时它也包括所有支持α—1，4—糖苷键水解的功能。这些功能可由单个肽以及蛋白的一个或多个单个部分作用于实际催化活性区域来进行。淀粉分解功能定义也涵盖了修饰功能本身。这是因为，一方面，现在还不确切知道根据本发明所述的蛋白是哪些氨基酸残基真正催化水解，另一方面，从一开始某种单个功能不能确定性地排出在参与催化之外。辅助功能或者部分活性包括，例如底物的结合、中间产物或者终产物、激活或抑制或赋予对水解活性的控制效果。这也可以包含结构单元的形成，其远离活性中心或信号肽，信号肽的功能涉及所形成蛋白从细胞的释放和/或它的正确的折叠，并且如果没有信号肽，具有功能的酶一般就不能在体内形成。总之，无论如何，淀粉或者淀粉样的聚合体的α—1，4—糖苷键必须被水解。

酶的性能被认为是在所属技术领域里的效力。这是基于实际的酶活性，但是也依赖于其他与这个过程相关的因素。这些因素包括稳定性、底物结合、与携底物的物质相互作用或与其他成分相互作用，尤其是协同作用。例如，考察一种酶是否适用于清洗剂也将包括此酶对与其他成分制成的洗涤剂或清洗剂的洗涤或清洗性能贡献的判断。利用已知的分子生物学技术，尤其是前面提到的方法，酶能够被进一步改进并最适于多种技术应用。

依据1977年4月28日布达佩斯条约微生物保藏的国际认可，下面的微生物是保藏在the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and CellCultures GmbH)in Braunschweig(DSMZ)：芽孢杆菌A7-7.其保藏号是DSM 12368(DSM 98-587).与这种生物材料的特点相关的重要数据，如DSMZ对保藏数据所定，列在了下表1中

表1.

芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)的微生物学特性(如DSMZ 1998年10月9日所确定)

 

特性	结果
		细胞形状宽[μm]长[μm]	小杆状体3.0-4.50.8-1.0
孢子	阳性/椭圆形
		孢子囊	轻微膨胀
氧化酶	阳性
		过氧化氢酶	阳性
厌氧生长	阳性
		VP反应	阴性
VP培养基中的pH	9.1
		生长于40℃生长于50℃	阳性/弱阴性
生长于培养基pH7.0NaCl 2％NaCl 5％NaCl 7％NaCl 10％NaCl 12％NaCl 16％溶菌酶培养基	阴性阳性阳性阳性阳性阴性阴性阳性
		酸来自：D-葡萄糖L-阿拉伯糖D-木糖D-甘露醇D-果糖	阴性阴性阴性阳性阳性
水解淀粉凝胶干酪素酪氨酸吐温  80吐温  60吐温  40吐温  20	阳性阳性阳性弱阳性阳性阳性阴性
		卵磷脂酶	阳性
普鲁兰	阳性
		马尿酸盐水解	阳性
马栗树糖苷	阳性

 

使用柠檬酸盐丙酸盐	阳性阳性
		NO<sub>2</sub>自NO<sub>3</sub>	阳性
吲哚反应	阴性
		苯丙氨酸脱氨酶	阴性
结果	芽孢杆菌(RNA组VI，alcaliphilic)
		评论	生理实验结果是物种嗜碱芽孢杆菌(B.Alcalophilus)或B.horikoshii，但是不能明确鉴定提到的任何一个物种。此菌株显示两个群落形式，被确定为变异体，并且通过脂肪酸分析确定为相同物种。16S rDNA的部分测序有94.8％与嗜碱芽孢杆菌一致。菌种A 7-7可能是一种新物种的代表。

现在，正如我们已经惊奇地发现上述这个特征，由这个菌株产生的淀粉水解酶有使它注定用于很多工业方法的特性。除此以外，此菌株还有利于影响其培养的特性。

如实施例2中详细所示，根据本发明的芽孢杆菌A 7—7(DSM12368)菌株的淀粉水解酶具有如下的生化特征：作为一种成熟蛋白，它有58kD的表现分子量，由变性SDS聚丙烯凝胶电泳测得，然而一种分子量在59kD左右的蛋白能够从516个氨基酸的蛋白序列得到(SEQ ID NO.2)和在除去31个氨基酸的信号肽后，得到55.5kD的蛋白。根据等电聚焦，成熟蛋白的等电点在6.0。它有淀粉水解的活性。温浴10分钟pH10/50℃仍然稳定。在60℃下，50％的残留活性能够观察到。这种酶温浴在40℃/pH 5-12下10分钟大致稳定，pH 9时，稳定性最好。在0.1％SDS存在下，酶温浴在pH 10/50℃下15分钟显示98％残留活性。在外加10HPE/ml蛋白酶并在pH 10/50℃下温浴15分钟后，酶仍有74％残留活性。

因此，本发明提供了一种天然发生的酶，根据其与迄今已知酶的序列同源性及其酶活性的强度，它应看作α—淀粉酶。原则上，这种酶可被用在需要淀粉水解功能的地方。尤其适于应用在碱性pH值和中等温度下，更具体地是pH值高于9和/或温度高于40℃。由于该酶较高的稳定性，应用范围被扩大到洗涤剂和蛋白酶。因此，它看上去尤其适合于洗涤剂/清洗剂中。

这种酶的核苷酸序列显示在序列表中，编号为SEQ ID NO.1。因此，应用已知的分子生物学方法它可以进一步改进。这种酶的氨基酸序列显示于序列表中，编号为SEQ ID NO.2。

类似的淀粉水解蛋白质也是本发明的实施方案，只有他们的蛋白质或DNA序列在SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2中所示序列相似的范畴之内，就受到保护。这种相似性范畴包含所有这样的蛋白质：它们的氨基酸序列同SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％的同一性。同样，相似性范畴也包含所有这样的蛋白质：它们的核苷酸序列同SEQID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少85％、87.5％、90％、92.5％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。这尤其适用于那些涉及第32至516位氨基酸的蛋白质的部分范围。

截至到2000年3月17日，已知的最相似的蛋白质是从嗜碱芽孢杆菌中提取出来的α—淀粉酶，其在瑞士蛋白数据库保藏号为P19571(Geneva Bioinformatics(GeneBio)S.A.，Geneva，Switzerland；http://www.genebio.com/sport.html)。在蛋白质水平，这个蛋白质同本发明的从芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中提取的淀粉水解酶具有93.4％的序列同源性。通过同源性区域上述较本发明的蛋白清楚地具有α-淀粉酶的特征。图1中列举比对了几种典型相关的蛋白质。

基于这个比对，本发明的蛋白质与用于同源比较的蛋白质基本表现出相同的二级和三级结构。他们的结构单元可以从一般容易获得的数据库中提取出来，比方说从英国剑桥的EMBL欧洲生物信息学研究所(EBI)数据库，瑞士蛋白库或GenBank(National Center forBiotechnology Information NCBI，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)。比方说在考虑最适反应条件或者底物特异性的条件下，如果出现不同的结构，或者如果最终结果是不同的折叠变体有不同的淀粉水解特性，那么所有这些都包含在本发明的保护范畴之内。这是因为：首先，这种折叠结构主要依赖于生产条件，例如说在有或无引导肽的条件下；其次，这些变体最终被证实特别适合用于各种潜在的用途，如淀粉的定量液化，环式糊精的水解以及用在洗涤剂/清洗剂上。

SEQ ID NO.2所示序列中第32—516位氨基酸所对应的部分序列值得特别关注。这是因为，如同可从氨基酸序列中得出结论一样，前31个氨基酸表示信号肽，其在相应的微生物生产条件下，这个信号肽可能引发蛋白质从细胞内部向周围介质释放出来。蛋白质释放以后，信号肽就体内分解了，以至实际淀粉分解活性是由余下的蛋白质部分完成的。

因此，对于实际淀粉分解功能来说，第1—31位的氨基酸可能意义不大，但是对于生产过程特别是对于所需要的折叠很重要。正因为如此，它们不能被排除在本发明的保护范围之外。

应该指出的是，如果在生产过程中信号肽和/或成熟蛋白质的长度上存在菌种之间的差异，有关SEQ ID NO.2第1—31或者第31—516位置方面的权利要求同样适用于对应的变体。例如，来自芽孢杆菌A7-7(DSM 12368)的蛋白质的转变要使用位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列前面的多达六个核苷酸。在此可能的开始前存在6个核苷酸ATGACG。这些核苷酸可翻译为甲硫氨酸—苏氨酸，这样信号肽就在N端多了两个氨基酸，这样就获得了与图1编号2所示的来自芽孢杆菌#707淀粉酶有一定的相似性。信号肽在分裂过程中本身也发生变化。

在落入上述相似区域的变体中，尤其优先考虑那些对于潜在的应用有最优化特性的变体。正如开头所述，这种变体可以通过方法获得，优选是分子生物学的方法。例如可能缺失本发明蛋白质当中的甲硫氨酸、色氨基酸、米胱氨酸和/或酪氨酸残基，和/或根据WO 94/18314的教导，用不容易氧化的氨基酸残基替换它们。氧化稳定性、pH值活性范围和/或热稳定性都可以通过这种方法改进。例如，根据WO99/09183和WO 99/23211，通过点突变可进一步进行改进。

根据本发明，片段可以理解为任何蛋白质或者肽，这些蛋白质或者肽小于SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2中对应的蛋白质，但是同它们在对应的部分序列上有足够的同源。如果这些片段显示出淀粉分解功能，或者至少有能够支持水解α-1，4-糖苷键的功能，那么它们就会被看成具有淀粉分解活性的片段，并且表示本发明的实施方案。例如，这适用于那些对底物络合或者水解所需的结构单元的形成作出贡献的片段。这些片段可以是单个结构域或者与结构域不一致的片段。这些片段的获得相对较为便宜，不再具有出发分子的一些不好的特性，如可能的活性降低的调节机制，或者可发展成更好的活性范围。这些蛋白质片段也可以通过化学方法而不是通过生物合成方法取得。例如当合成后进行化学修饰时，化学合成是有利的。

根据它们基本的相似性，通过缺失突变所得到的蛋白质也可以被转到片段当中。这些蛋白质主要在生化上对应于起始分子或不再具有单个的功能。这一点看起来特别适合于如抑制区域的缺失中。在最后的分析中，这些缺失被用来产生特异性和扩展蛋白质的应用范围。如果淀粉水解功能在广义上被保持、修饰、特异化或甚至以此途径首先得到了，那么这些缺失变体和片段也是本发明的蛋白质。这方面唯一的额外要求是上面同源的部分序列依然存在，它们应位于上面所提到的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列相似性的范围之内。

例如，按照WO 99/57250，有可能提供本发明蛋白质或者其部分，它具有来自其他蛋白质的结合域，通过肽或非肽连接体与本发明的蛋白质连接，从而使得对底物的水解更为有效。当这些构建体具有淀粉分解功能，并且构建体的那些部分所行使的功能与本发明的序列足够的相似时，这些构建体就落入本发明的保护范围之内。同样，按照本发明的淀粉分解蛋白质也可跟蛋白酶连接来执行双重功能。

通过从前体蛋白切割N端的氨基酸所得到的蛋白质和信号肽也被认为是自然形成的片段或者缺失突变的蛋白质。在信号肽酶所识别的某些序列区域的帮助下，这种分离机制也用来预先确定重组蛋白质的特定切割位点。这样，本发明的蛋白质就可以在体外激活和/或失活。本发明的保护范围也包括所有这些蛋白质，只要它落在所要求的保护范围之内并且具有淀粉分解活性。

本发明的嵌合或杂交蛋白质可以这样理解：它们由从各种多肽链中自然产生的元件所构成。这个过程也称为改组或融合突变。当通过融合所获得的蛋白质具有最广义上的淀粉分解活性时，那么它们就是本发明的嵌合蛋白质。这可以由被源自本发明蛋白质的分子的一部分加以改善或者修饰而得到，也落入所要求的相似性范围内。这种融合的目的可以是例如产生或者修饰淀粉分解功能，或者在本发明蛋白质的融合部分的帮助下支持水解α-1，4-糖苷键的功能。在本发明的上下文中，我们不关心这种嵌合蛋白质是否是由一个单一的多肽链组成，还是由其中可分布各种功能的若干亚单位构成。为了实现第二种选择，例如，有可能将单一的嵌合多肽链切割成多个多肽链，切割过程或者通过翻译后的可控制的蛋白水解切割来完成，或者在纯化步骤后完成。本发明也涉及嵌合蛋白，由于它们的结构特征，这些嵌合蛋白质在所有氨基酸和/或核苷酸序列上比上文所定义的本发明相似性范围具有任选较低的同一性，但是也可将其归因于至少一个通过融合而引入的区域中去，并在这个部分里它们和整个长度落入上述同源性范围内的淀粉酶具有同样的功能。

通过插入突变而得到的本发明蛋白质是蛋白质的变体，这些变体在整个序列长度上落入SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的保护范围之内，并且通过在各自序列中插入核酸或者蛋白质片段而得到。就像采用杂交形成一样，插入突变的目的是将本发明的蛋白质单个特性同其他蛋白质的那些性质结合起来。本发明的蛋白质可以是通过插入突变得到的蛋白质，也可以是嵌合蛋白质，当其区域在同源性上与SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2具有相应的同源性值，并且由于这些区域蛋白具有最广义上的淀粉分解功能时。

从而，通过倒位突变得到的蛋白质以及通过将不同于原始氨基酸序列的分子的不同部分加以重组得到的蛋白质都包括在本发明的保护范围之内。这可以被看作是原始蛋白质的缺失变体、插入变体或者改组变体。

本发明的淀粉分解活性的衍生物可以理解为淀粉分解蛋白质，这些蛋白质结构经过了修饰，例如，修饰过程可以通过在宿主生物中的加工而与蛋白质生物合成相结合；或者是化学修饰，例如通过氨基酸侧链的转换或者通过共价结合将另一化合物与蛋白质连接。此化合物可以例如由与本发明的蛋白质结合的蛋白质所组成，例如通过双功能化合物。这些修饰可以影响，例如，底物的特异性，或者与底物结合的强度，或者当所偶联底物是抑制剂时可以暂时阻断酶活性。这可能适合于例如储藏期。另一实施方案是衍生物，它们通过与大分子载体共价连接而得到，这些载体例如聚乙二醇或多糖。

对于本发明所述问题的其他解决办法有淀粉分解蛋白质或者衍生物，其与上述蛋白质或者衍生物中的一个至少有一个相同的抗原决定簇。

这是因为酶活性的产生不仅由蛋白质的纯氨基酸序列所决定，也由它的二级结构单元和三维折叠结构所控制。这样，在一级结构上相互之间明显不相同的结构域能够形成空间上基本对应的结构，从而具有相同的酶的行为。在二级结构上的共同特征通常被认为是抗血清的相应抗原决定簇，或者是纯的或单克隆抗体。因而，结构上相似的蛋白质或者衍生物能够通过免疫化学的交叉反应来检测和分类。

从而，本发明的保护范围也包括蛋白质或者衍生物，它们具有淀粉分解活性并且能够通过免疫化学关系、而不是通过一级结构的同源性值被归入上面定义的本发明的蛋白质或衍生物中。

源于天然物中的本发明蛋白质是本发明的优选实施方案，特别是当其来源于如单细胞真菌或者细菌的微生物时。这是因为这些微生物比多细胞微生物或来源于它们的细胞培养物更容易处理。这些代表了特殊实施方案的合适选择。

本发明的蛋白质或者衍生物首选来源于革兰氏阳性细菌，因为它们没有外膜，因此能直接分泌蛋白质到周围介质中去。

来源于芽孢杆菌属的本发明的蛋白质或者衍生物尤其首选，因为它们公认在工业过程中具有非常高的生产能力。

在本发明来自于芽孢杆菌物种的蛋白质或者衍生物当中，那些来源于嗜碱杆菌(alcaliphilic bacilli)的物种是优选的，来源于芽孢杆菌A7-7的尤其优选，以及来源于芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)的最首选。这是因为本发明酶的实施方案最初是来源于这一菌株，该酶的相关序列显示在序列表中，其酶特性在实施例中有所描述。

出于生产原因，能够释放所形成的淀粉分解蛋白质进入到周围介质中的菌株是首选的。

有可能的是，尽管自然界的菌株能够产生本发明的淀粉分解酶，但是它们在初始确定的条件下仅能很小程度地表达和/或释放酶到周围介质中。它们仍然落入本发明的保护范围之内，只要可能来用试验测定合适的环境条件或者低分子量或者其他因素，在这些因素的影响下，它们能够被刺激产生本发明的蛋白质，其生产水平使得经济利用成为可能。象这样的调节机制能目的性地用来进行生物技术生产，例如用来调节可靠的启动子。

依赖于它的分离、生产或制备，蛋白质能够跟其他物质结合起来，特别是当它从蛋白质的天然产物中回收之后。然后某些其他物质就可以有目的地—甚至独立地—加入到其中，例如来增加它的存储稳定性。因此，本发明的蛋白质的定义也包含了所有对本发明必需的实际蛋白质的制品。这也与蛋白质在某—制品中是否有真正的酶活性无关，因为有可能需要蛋白质在储藏阶段没有或很少活性，而仅仅在使用时表现它的淀粉分解特性。这取决于，例如，蛋白质的折叠状态，或可能产生于来源自制品中的一种或多种伴随物质的可逆结合或另一控制机制。

本发明的蛋白质能够用稳定剂加以保护，特别是在储存阶段，例如防止其由于自然影响、氧化或者蛋白水解切割而变性、降解或者失活。对于从微生物中获得的蛋白质，抑制蛋白质水解更为重要，因为大部分微生物能够分泌各种蛋白酶作为消化酶进入到周围介质当中。这些酶在以后的提纯步骤中能够严重破坏所需的蛋白质。

一组稳定剂是可逆的蛋白酶抑制剂，例如，苯甲脒氢氯化物和亮抑蛋白酶肽、硼砂、硼酸、盐或其脂、肽醛或者纯肽抑制剂，例如卵类粘蛋白或者特异枯草芽孢杆菌蛋白酶抑制剂。其他常见的酶稳定剂有氨基醇，如单-、双-、三-乙醇胺和-丙醇胺，多达C₁₂的脂肪族羧酸、二羧酸、低级脂肪醇，此外还有多元醇，例如甘油、乙烯二醇、丙二醇或山梨醇。钙盐如乙酸钙、甲酸钙，镁盐，各种聚合体如木质素、纤维素醚、聚酰胺或水溶性的乙烯共聚物也可用来对酶制品起稳定作用，主要的是防止自然影响或pH值变化。还原剂和抗氧化剂例如亚硫酸钠或还原糖可提高蛋白的稳定性，增加抗氧化分解能力。

本发明也体现在相应的核酸中，假识该核酸编码最广义上的淀粉分解蛋白，并且显示同SEQ ID NO.1序列足够的相似性，如上定义，更具体体现在一种核酸，该核酸编码蛋白，所述蛋白对应于SEQ IDNO.1中所示氨基酸序列的第32—516位氨基酸的部分范围。

特别优选的实施方案是核酸，它们编码上述本发明的淀粉分解蛋白质之一。这也包括在整体序列长度上并没有落入SEQ ID NO.1中所定义的相似性范围之内但在个别区域中确实落入范围之内的变异体。这些包括，例如上面所解释的通过插入或者缺失突变得到的核苷酸序列、嵌合蛋白质或者蛋白质片段。然而，所谓反义构建体，例如通过个别部分区段，也代表本发明的实施方案，因为它们可用来调节淀粉分解活性。

核酸形成了分子生物学研究和进一步发展的起点。例如在Fritsch，Sambrook和Maniatis编的“分子克隆：试验手册”，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York，1989中描述了一些这样的方法。在现有技术中蛋白质工程标题下的所有基因工程和蛋白质生化方法也基于基因，特别是克隆基因。本发明的蛋白质通过这些方法被进一步优化用作各种用途，例如，通过点突变或者与来自其他基因的序列相融合。

通过已知分子生物学方法得到的本发明蛋白质的变异体本身尤其包括那些个别的特定氨基酸交换或个别氨基酸或部分序列的随机点突变、缺失，同其他片段或者其他酶的融合、插入或者倒置即部分序列的倒置。这些突变或者修饰可代表特殊用途的优选实施方案。这样的诱变能够有目的地进行，或者通过随机方法取得。其能够例如与随后以活性为目标的筛选和对克隆基因的选择过程结合使用。通过突变获得的基因落入本发明的保护范围之内，假识它们以最广义编码的淀粉分解蛋白质，并且落入上文所定义的相似性范围之内，至少在同源和功能上相关区域之内。

本发明所提问题的另一个解决方案以及本发明的另一实施方案是有机体，这种有机体能够自然形成本发明的蛋白质或者衍生物，或者包含编码本发明蛋白质或者衍生物的核酸。这是因为它们的发现使得发明构思付诸实施。这类有机体可以通过一般已知的技术获得，例如可以通过从自然环境中分离菌株，或通过筛选基因库。SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列可用作，例如一个筛选探针，或者作为构建相应的PCR引物的母板。相类似，短链或者具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的完整的肽可以用来形成相应的抗血清，用来鉴定相应的生物或者从它们中释放出的蛋白质。

根据前述的观察，微生物，优选细菌，尤其是革兰氏阳性菌包括那些芽孢杆菌属的细菌，更尤其芽孢杆菌A7-7，以及最尤其芽孢杆菌A7—7(DSM 12368)，由于它们的培养性，是首选。

本发明的另一实施方案是载体，它包含第二个实施方案中的一个核酸区域。

这是因为，为了使用核酸，将DNA合适地克隆到载体中。这些载体包括例如来自细菌质粒、来自病毒或细菌噬菌体的那些载体，或带有不同来源元件的主要合成的载体或质粒。在其他基因元件存在下，载体能够作为稳定单元经过若干代存在于各自宿主细胞中。在本发明的上下文中，它们是否作为染色体外的独立单元，还是整合入染色体，并不重要。现有技术中已知的许多系统到底选择哪一种将取决于个案情况。这方面的关键因素包括例如，所能制成的拷贝数、可得到的选择系统，最主要包括抗生素抗性，以及能够容纳载体的宿主细胞的可培养性。

载体成为特定基因或者相关蛋白质的分子生物学和生化研究的起点，也为依照本发明所进行的进一步研究以及最终本发明蛋白质的扩增和生产提供了起点。它们代表了本发明的实施方案，只要根据本发明核酸区域的序列位于前文详细描述的同源性范围之内。

本发明优选的实施方案是克隆载体。除了储藏、生物扩增和筛选目的基因以外，克隆载体适于特定基因的特征，例如通过绘制限制性酶切图或者测序。克隆载体也是本发明优选的实施方案，因为它们代表了要求保护的DNA的可转运和可储存形式。它们也是分子生物技术优选的起点，这些分子生物技术不局限于细胞，例如聚合酶链式反应。

表达载体具有部分序列，其能够在最适于生产蛋白的宿主生物中复制以及能够表达在宿主生物体中存在的基因。优选的实施方案是表达载体，它们自己携带对表达必须的基因元件。表达例如受到启动子的影响，所述启动子调节基因转录。这样，表达可以通过原先位于基因前的天然启动子来产生，也可以通过与表达载体上提供的宿主细胞的启动子以及通过修饰启动子或另一生物的完全不同的启动子在遗传工程融合后产生。

本发明优选的实施方案是表达载体，其能够通过培养条件的改变或者添加一定的化合物，如细胞密度或者特殊因子来调节。表达载体使得相关蛋白质能够被异源产生，也就是说在不是它自然获得的生物中产生。在通过合适的载体自然表达该基因的宿主生物中产生的同源蛋白产物也处于本发明的保护范围内。这种优势在于：如它们会自然发生一样，对所形成的蛋白质也进行与翻译有关的自然修饰反应。

本发明的其他实施方案可以是无细胞的表达酶，其中蛋白质生物合成体外完成。象这样的表达系统在现有技术中也存在。

本发明的另一个实施方案是细胞，其包含上面所定义的载体的一种，更尤其是克隆或表达载体。这是因为例如在对于诱变、测序或者载体储存所必需的分子生物学操作中，这些载体能够被转染入相应的细胞。依据这种方法，例如革兰氏阳性细菌，但具体是革兰氏阴性细菌，能适用于此目的。

另一实施方案是宿主细胞，其表达第一个实施方案的蛋白质或衍生物，或者优选使用以上定义类型的表达载体，能够被刺激来表达该蛋白质或衍生物。

这是因为，根据本发明的淀粉分解酶的体内合成需要将相关的基因转移入宿主细胞。一般来说，合适的宿主细胞包括所有生物，如原核生物、真核细胞或蓝藻等。优选的宿主细胞是那些容易进行遗传操作的细胞，例如就其表达质粒转化及其稳定建立而言，如单细胞的真菌或者细菌。此外，优选的宿主细胞的区别在于容易进行微生物和生物技术操作。这包括例如易培养、高生长率、对发酵培养基的要求最低、产量高以及对外源蛋白质的分泌速率。特定个例的最佳表达系统往往需要从现有技术所提供的大量不同的系统中通过试验确定。通过这种方法，本发明的每个蛋白质可以从大量宿主生物中得到。

优先的实施方案是宿主细胞，它们的活性可以通过基因调节元件进行调节，这些元件例如由表达载体提供，但也可一开始就存在于这些细胞中。我们正讨论的宿主细胞能够在受到刺激的情况下表达，例如通过受控添加化学物质作为激活剂，通过改变培养条件或者达到一定的细胞密度。这提供特别经济的目的蛋白质的生产方法。

本发明的试验原理的变体是表达系统，其中其他基因，例如那些在其它载体上存在的基因，能够影响本发明的蛋白质的产生。它们可以修饰基因产物，或者那些与本发明的蛋白质一起有待纯化的产物，例如以便影响它的淀粉分解功能。这些可以是例如其它蛋白质或酶、抑制剂或影响同各种底物的相互作用的元件。

优选的宿主细胞是原核细胞或者细菌细胞。同真核细胞相比，细菌一般具有更短的换代时间和不太严格的培养条件。较便宜的生产本发明蛋白质的方法就这样建立起来了。

尤其优先这样的宿主细胞，尤其是细菌，它们能将所形成的蛋白或衍生物分泌到周围介质中，从而本发明的表达蛋白能够直接被纯化。

本发明的一个实施方案使用芽孢杆菌A 7-7(DSM12368)本身用于同源性表达本发明的蛋白质。做到这一点可以例如通过引入的载体，该载体将已经内源性存在的本发明基因或其修饰成分如以多拷贝数的形式引入到这些细胞中。如果合成以后蛋白质受到修饰，这些修饰可由讨论中的细胞本身适当进行，则尤其有利。

相反，可以优选异源表达。革兰氏阳性细菌如放线菌类或芽孢杆菌没有外膜，从而它们可以直接将分泌的蛋白质释放到周围介质中。因此，对于异源表达，优选的细菌包括芽孢杆菌属，特别是地衣芽孢杆菌、液化芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或者嗜碱芽孢杆菌.

革兰氏阴性菌也可以用于异源表达。这种情况下，大量的蛋白质被分泌出来进入细胞外间隙，也就是进入细胞周围两个细胞膜的间隔区。这对特殊的应用是有利的。革兰氏阴性菌包括例如克雷伯氏(Klebsiella)属或埃希氏(Escherichia)属，优选大肠杆菌(E.coli)以及更优选E.coli JM 109、E.coli DH 100B或E.coli DH 12S。

真核细胞也适合生产本发明的淀粉分解蛋白质。例子包括酶母如酵母(Saccharomyces)或克鲁伯氏酵母(Kluyveromyces)。当蛋白质与其合成结合置于这些系统所允许的修饰时，这一点特别有利。这些修饰包括例如，低分子量化合物的结合，例如膜锚分子或寡糖。

上述讨论的所有元件都能够结合到本发明的蛋白质的生产方法中。对于本发明的每一个蛋白质，有许多可能的方法步骤的组合。它们都是本发明基于的理论的具体实施方案，即定量生产某种蛋白类型的代表—这种类型通过淀粉分解功能所限定，同时也通过同序列表中所示的序列高的同源性得到限定—在相关基因信息的协助下。针对每一个实际个案，最优方法还得通过试验确定。

原则上，采用以下步骤：本发明的核酸也就是那些落入上述限定的与SEQ ID.1的相似性范围内的核酸，可以DNA的形式适当地连接到表达载体上。这可以转化入宿主细胞，例如转化到容易培养的细菌菌株的细胞中，它释放出蛋白质至周围的营养介质中，这些蛋白质的基因受对应基因元件的控制；调节元件可以例如通过表达载体而得到。本发明的蛋白质可通过若干纯化步骤例如沉淀或色谱从周围介质中纯化出来。专家可把实验室中已实验性最优化的系统放大到工业规模生产。

对于本发明蛋白质，最重要的工业用途如下。淀粉分解酶的许多成熟工业用途在手册中有所描述，例如H.Uhlig的书名为“工业酶及其应用”，Wiley，纽约，1998。下面仅列出一些理论上可行的应用，绝不完整。如果本发明的蛋白质适用于这里没有专门要求的其他应用方式，那么这些应用也应当包括在本发明的保护范围之内。

淀粉分解酶的重要应用是作为清洗织物或硬表面的洗涤剂/清洗剂的活性成分。在这些应用中，淀粉分解活性用于将含碳水化合物，更特别的是淀粉样的污渍加以水解，和/或将它们从底物上除掉。为此目的，在适当的介质或甚至在洗涤剂/清洗剂中，酶可独自使用。这些组合物的区别在于下列事实，淀粉分解酶和其他成分可以协同方式将污渍清除，例如，淀粉分解蛋白质的水解产物被组合物中的其他成分所溶解，例如表面活性剂。本发明的蛋白质既既可用于研究或工业用途的组合物，又可用于家用消费产品。

相应地，本发明的另一个实施方案是任何洗涤剂/清洗剂，其特征在于它们包含本发明的淀粉分解蛋白质或其衍生物。

这意味着，所有可能类型的洗涤组合物，既包括浓缩物也包括不用稀释的组合物；商业规模的使用，用于洗衣机或用于手洗。这些组合物包括例如用于织物、地毯或天然纤维的洗涤剂，对此术语洗涤剂用于本说明书中。它们也包括例如用于洗碗机或手工洗碗的洗涤剂或用于硬表面，例如金属、玻璃器皿、陶瓷、瓦片、宝石、涂漆面、塑料、木制品或皮革的清洗剂。对于这些来说，术语清洗剂用于本说明书中。任何类型的清洗组合物都代表本发明的一个实施方案，只要其中包含本发明的蛋白质。

本发明的实施方案包含现有技术中确定的本发明组合物的所有提供形式，和/或本发明组合物的所有适当的提供形式。这些包括例如固体、粉末、液体、胶状或膏状组合物，任选由若干相组成，挤压式或非挤压式。提供形式还包括包装在大容器内和部分中的压出胶、颗粒、片剂及小袋。

除了对本发明必需的酶之外，本发明的组合物任选包含其他成分，例如表面活性剂，如非离、负离子和/或两性表面活性剂，和/或漂白剂和/或增洁剂以及任选其他典型成分。

优选的非离子表面活性剂为烷氧基化的，有利的是乙氧基化的，更具体为优选含有8-18个碳原子以及平均每mol醇1-12mol环氧乙烷(EO)的伯醇，其中醇残基可以是直链的，或优选2-甲基支链的，或通常以羰基合成醇残基存在的混合物形式可含有直链和甲基支链的残基。然而，尤其优选的是包含具有12-18碳原子、天然来源的醇的直链残基的醇乙氧基化物，例如椰子油醇、棕油醇、动物脂醇或油醇以及平均每mol醇2-8EO。优选的乙氧基化醇包括，例如含有3或4EO的C_12-14醇、含有7EO的C_9-11醇、含有3EO、5EO、7EO或8EO的C_13-15醇，含有3EO、5EO或7EO的C_12-18醇及其混合物，例如含有3EO的C_12-14醇和含有5EO的C_12-18醇的混合物。上述乙氧化的程度是统计平均值，对于特殊产品来说，这个平均值可能是整数或分数。优选的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范围乙氧基化物，NRE)。除了这些非离子表面活性剂之外，也可以使用高于12EO的脂肪醇。这类脂肪醇的例子是包含14EO、25EO、30EO或40EO的动物脂醇。

另一类或作为非离子表面活性剂单用或与其他非离子表面活性剂合用的优选非离子表面活性剂是烷氧基化的、优选乙氧基化的、或乙氧基化和丙氧基化的脂肪酸烷基酯，优选在烷基链中包含1-4个碳原子，更具体的是脂肪酸甲酯。

另一类可用的具有优势的非离子表面活性剂是烷基多糖苷(APG)。合适的烷基多糖苷对应于通式RO(G)_z，其中R是直链或支链的，更具体是2-甲基支链的，饱和或不饱和的脂族基团，该基团含有8-22个以及优选12-18个碳原子，G是含有5或6个碳原子的单糖单元，优选是葡萄糖。糖苷化的程度z介于1.0-4.0之间，优选在1.0-2.0之间，以及更优选在1.1-1.4之间。优选使用直链烷基多糖苷，即烷基多糖苷，其中多糖基部分是葡萄糖单元以及烷基部分是正-烷基基团。

氧化胺类型的非离子表面活性剂，例如N-椰子油烷基-N，N-二甲胺氧化物以及N-动物脂烷基-N，N-二羟乙胺氧化物，和脂肪酸链烷醇酰胺类也适用。这些非离子表面活性剂的所用量优选不多于，尤其不多于所用的乙氧基化的脂肪醇量的一半。

其它合适的表面活性剂为多羟基脂肪酸胺，对应于公式(II)：

其中RCO是包含6-22个碳原子的脂族酰基基团，R¹是氢、含有1-4个碳原子的烷基或羟烷基基团，以及[Z]是直链或支链的多羟烷基，其包含3-10个碳原子和3-10个羟基基团。多羟基脂肪酸胺为已知物质，其通常可通过将还原糖用氨、烷基胺或链烷醇胺加以还原性胺化，继而用脂肪酸、脂肪酸烷基酯或脂肪酸氯化物加以酰化而获得。

这组多羟基脂肪酸酰胺还包括对应于公式(III)的化合物：

其中R是直链或支链烷基或者链烯基，其含有7-12个碳原子，R’是直链、支链或环化的烷基基团或者芳香基团，其含有2-8个碳原子以及R²是含有1-8个碳原子的直链、支链、环化的烷基基团或芳香基团或者是烷氧基基团，但优选C_1-4的烷基或者苯基基团，以及[Z]是直链的多羟基烷基基团，其烷基链至少被2个羟基取代，或者是该基团的烷氧基化，优选乙氧基化或丙氧基化的衍生物。

[Z]优选由还原糖的还原性胺化而获得，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖或木糖。然后通过例如以醇盐作为催化剂与脂肪酸甲酯反应，可将N-烷氧基或芳氧基取代的化合物转化成所需的多羟基脂肪酸酰胺。

合适的阴离子表面活性剂例如是那些磺酸酯和硫酸酯类的。合适的磺酸酯类表面活性剂优选是C_9-13的烷基苯磺酸酯、烯烃磺酸酯，即烯烃和羟烷基磺酸酯的混合物，以及例如通过气态三氧化硫的磺酸化接着碱化或酸化磺酸化产物而从带有中间或末端双键的C_12-18单烯烃中获得的二磺酸酯。其它磺酸酯类的合适的表面活性剂是例如通过氯磺化或氯氧化接着水解或中和而从C_12-18烷烃获得的烷磺酸酯。-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)，例如氢化椰子油、棕榈油或动物脂肪酸的-磺酸化甲酯也适用。

其它合适的阴离子表面活性剂有磺基化脂肪酸甘油酯。本发明上下文中的脂肪酸甘油酯是指单酯、二酯和三酯及其混合物，其由单甘油与1-3mol的脂肪酸的酯化反应或者是由甘油三酯和0.3-2mol的甘油发生转酯化反应而得来的。优选的磺基化脂肪酸甘油酯是含6-22个碳原子的饱和脂肪酸的磺化产物，例如己酸、辛酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸或山萮酸。

优选的烷基(烯基)硫酸盐是碱金属盐，以及具体是C_12-18的脂肪醇的磺酸半酯钠盐，例如椰油脂肪醇、动物脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或硬脂醇或C_10-20的羰基合成醇以及具有同样链长仲醇的对应的半酯。其它的烷基(烯基)硫酸盐具有上述链长，含有基于石化产品合成的、直链烷基链，并且它们的降解行为类似于相应的基于油化学品原材料的化合物。C_12-16烷基硫酸酯、C_12-15烷基硫酸酯以及C_14-15烷基硫酸酯从洗涤技术的观点出发而优选。其它合适的阴离子表面活性剂是2，3-烷基硫酸酯。

硫磺酸与用1-6mol的环氧乙烷乙氧基化的直链或者支链的C_7-21醇的单酯，例如含有平均3.5mol环氧乙烷(EO)的2-甲基支链C_9-11醇或者是含有1-4EO的C_12-18脂肪醇也同样适用。鉴于他们高的发泡能力，他们仅以相对小的量使用，例如按重量计在清洗剂中的量为1％-5％。

其它合适的阴离子表面活性剂是烃基取代的磺基琥珀酸酯，已知为磺基琥珀酸盐或磺基琥珀酸酯，以及表示磺基琥珀酸与醇，优选脂肪醇，以及更具体为乙氧基化的脂肪醇，所形成的单酯或/或二酯。优选的磺基琥珀酸酯含有C_8-18脂肪醇残基或其混合物。特别优选的磺基琥珀酸酯含有衍生自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分，其在分离中考虑时，代表非离子的表面活性剂(描述参见下文)。在这些磺基琥珀酸盐中，那些衍生自窄范围乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分尤其优选。在烷(烯)基链中优选含有8-18个碳原子的烷(烯)基琥珀酸或其盐也同样适用。

其它合适的阴离子表面活性剂尤其是肥皂。合适的肥皂是饱和脂肪酸的，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、氢化芥子酸和山萮酸的盐，以及尤其衍生自天然脂肪酸例如椰油、棕榈油或动物脂肪酸的肥皂混合物。

阴离子表面活性剂包括肥皂，可以钠、钾或铵盐以及作为有机碱如单-、二-或三乙醇胺的可溶性盐的形式存在。阴离子表面活性剂优选以钠或钾盐的形式存在，更为优选的是钠盐形式。

表面活性剂在本发明的洗涤剂中存在的总量按重量计优选5％-50％，更优选8％-30％，含量是基于最终洗涤剂。

依据本发明漂白剂可以存在。在那些能在水中产生H₂O₂而起漂白作用的化合物中，过碳酸钠，过硼酸钠盐四水合物和过硼酸钠—水合物是特别的重要。其它有效的漂白剂，例如过氧焦磷酸盐、柠檬酸的过氧氢合物和产生H₂O₂的过酸盐或过酸，如过硫酸盐或过硫酸。脲过氧水合物过尿素，化学式是H₂N—CO—NH₂·H₂O₂，也可以用。如果需要，组合物中也可含有有机类的漂白剂，特别是用于硬质表面，例如洗碗机，虽然原则上有机漂白剂也可以用于洗衣剂。典型的有机漂白剂是二酰基过氧物，例如联苯甲酰过氧物.其它典型的有机漂白剂是过氧酸，其中过氧酸和芳基过氧酸尤其作为例子提及。优选的代表是过氧苯甲酸及其环取代的衍生物，例如烷基过氧苯甲酸，以及过氧α-萘甲酸和单过邻苯二甲酸镁盐、脂族或取代的脂族过氧酸，例如过氧月桂酸、过氧肉豆蔻酸、ε-苯二(甲)酰氨基己酸(PAP)、o-羧基苯甲氨基己酸、正壬烯氨基过酸性脂肪酸和正壬烯氨基过琥珀酸盐以及脂族的和araliphatic过二羧酸，例如1，12-二过氧羧酸、1，9-二过氧壬酸、二过氧癸酸、二过氧巴西基酸、二过氧邻苯二甲、2-癸基二过氧丁烷-1，4-二酸、N，N-对酞酰-二(6-氨基过氧己酸)。

漂白剂的含量按重量计可以从1-40％，以及在具体的实施方案中，从10-20％，过硼酸一水合物或者过碳酸盐有利使用。淀粉酶与过碳酸盐或者淀粉酶与过羧酸的协同作用公开在WO 99/63036和WO99/63037中。

当漂白温度等于或者低于60℃时，以及特别在衣物洗涤前处理时，为了提高漂白效果，组合物中可含有漂白活化剂。合适的漂白活化剂是形成脂族过氧羧酸的化合物，所述脂族过氧羧酸优选含有1-10个碳原子，以及更优选含有2-4个碳原子和/或在过水解条件下任选取代的过苯甲酸。携带具有上述碳原子数的O-和/或N-酰基和/或任选取代的苯酰基的物质是适用的。优选的漂白活化剂是聚酰化的烷撑二胺，更具体的是四酰化的乙烯二氨(TAED)、酰化的三嗪衍生物，更具体的是1，5-二酰基-2，4-二氧代六氢化-1，3，5-三嗪(DADHT)、酰化的甘脲，更具体的是1，3，4，6-四酰化甘脲(TAGU)、N-酰胺，更具体的是正壬酰基琥珀酰亚胺(NOSI)、酰化的苯酚磺酸盐，更具体的是正壬酰基或者是异壬酰化苯酚的磺酸盐(正-或异-NOBS)、酰化的水合羧酸，例如三乙基-O-乙酰基柠檬酸盐(TEOC)、羧酸酐，更具体的是邻苯二甲酸酐、靛红酸酐和/或琥珀酸酐、羧酸酰胺，例如N-甲基二乙酰胺、乙交酯、酰化的多羟基醇，更具体的是三醋精、乙二醇二乙酸酯、异丙烯基乙酸酯、2，5-二乙酸基-2，5-二氢化呋喃和烯醇的酯，从德国专利申请DE 196 16 693和DE 196 16 767中得知，乙酰化的山梨醇和甘露醇及其混合物(SORMAN)，其在欧洲专利申请EP 0 525239中描述，酰化的糖衍生物，更具体的是五酰化葡萄糖(PAG)、五酰化果糖、四酰化木糖和八酰化乳糖，以及酰化的任选N-酰化的葡糖胺和葡萄糖内酯、三唑和三唑的衍生物和/或粒状的己内酰胺和/或己内酰胺衍生物，优选的是N-酰化的内酰胺，例如N-苯甲酰己内酰胺和N-乙酰己内酰胺，这些是从国际专利申请WO-A-94/27970、WO-A-94/28102、WO-A-94/28103、WO-A-95/00626、WO-A-95/14759和WO-A-95/17498中得来。从德国专利申请DE-A-196 16 769中得知的取代的亲水酰基乙缩醛和在德国专利申请DE-A-196 16 770以及国际专利申请WO-A-95/14075中描述的酰基内酰胺也优选采用。与从德国专利申请DE-A-44 43 177中得知的传统漂白活化剂组合也可采用。腈衍生物，例如兰色吡啶、四腈，例如N-烃基铵基乙腈，和/或氨腈衍生物也可以使用。优选的漂白活化剂为钠-4-(辛酸氧基)-苯磺酸酯、正壬酰基或异壬酰化苯酚的磺酸酯(正或异-NOBS)、十一酰基氧化苯磺酸酯(UDOBS)、十二酰基苯磺酸钠(DOBS)、十一酰基羟苯甲酸(DOBA，OBC 10)和/或十二酰基氧化苯磺酸酯(OBS 12)以及N-甲基吗啉乙腈(MMA)。这样的漂白活化剂常用量基于组合物作为整体按重量计为0.01-20％，优选0.1％-15％，以及更优选1％-10％。

除了或代替上述的传统漂白活化剂以外，所谓的漂白催化剂也可掺入。漂白催化剂是促进漂白的的过渡金属盐或者是过渡金属复合体如锰、铁、钴、钌或者钼-salen的复合体或者羰基复合体。具有含氮的三角配体的锰、铁、钴、钌、钼、钛、钒和铜的复合体，以及钴、铁、铜、钌-氨合物的复合体也可以用做漂白催化剂，优选使用在DE 19709 284 A1中描述的化合物。依照WO 99/63038，乙腈的衍生物以及依照WO 99/63041，漂白活化的过渡金属化合物与淀粉酶组合后也能发生漂白活化的效果。

本发明的组合物通常含有一种或多种助洗剂(builder)，更具体的是沸石、硅酸盐、碳酸盐、有机复合助洗剂以及磷酸，假如它们的使用对生态环境没有反对意见。磷在洗碗机洗涤剂中是尤其优选的助洗剂。

合适的晶体层的硅酸钠对应于通式NaMSi_xO_2x+1·y H₂O，其中M是钠或者氢，x是1.6-4之间的数，以及y是0-20之间的数，x优选值为2、3或4。这样的晶体层的硅酸盐记载在例如，欧洲专利申请EP-A-0 164 514。对应于上述公式的优选的晶体层硅酸盐是其中M为钠，x为2或3的那些。-和-钠二硅酸盐Na₂Si₂O₅·y H₂O均特别优选。这些化合物是商购的，如

(Clariant)。因此

主要是-钠二硅酸盐，化学式为Na₂Si₂O₅·y H₂O，而

主要是-钠二硅酸盐。通过与酸(例如柠檬酸或碳酸)反应，-钠二硅酸盐生成kanemiteNaHSi₂O₅·H₂O，其以

和

(Clariant)在市场上销售。对于这些层化硅酸盐进行化学修饰也有优势。例如，这些层化的硅酸盐的碱度可受到适度的影响。与-钠二硅酸盐相比，掺杂磷酸或者掺杂碳酸的层化硅酸盐已经修饰了晶体的构型，他们溶解更快而且显示出与-钠二硅酸盐相关的钙结合能力增加。层化硅酸盐具有一般的经验式x Na₂O·y H₂O·z P₂O₅，其中x与y的比例对应于0.35-0.6，x和z的比例对应于1.75-1200，以及y和z的比例对应于4-2，800，在专利申请DE 19601063中有记载。层化硅酸盐的溶解性还可特别利用精细颗粒层化的硅酸盐而提高。晶体层化的硅酸钠盐和其他成分的混合物也可采用。尤其引人关注的是与纤维素衍生物的混合物，其在崩解效果上具有优势，并尤其用于洗涤剂片剂，以及与聚羧酸酯形成混合物，例如柠檬酸，或者聚羧酸酯聚合物，例如与丙烯酸的共聚物。

其他有用的助洗剂是无定形硅酸钠盐，具有比例系数(Na₂O:SiO₂)为1:2-1:3.3，优选为1:2-1:2.8，以及更优选的是1:2-1:2.6，其可以延迟解并展现多重洗涤循环特性。与传统无定形硅酸钠相关的推延迟解可由多种方法获得，例如表面处理、混合/压实或通过过干燥法。在本发明的上下文中，术语“无定形”同样可理解为包括“无定形的X-射线”。换一种说法，硅酸盐并不产生任何强烈的X-射线反射，这在X-射线衍射实验中是晶体物质的特征，但最多有一个或多个具有若干度衍射角的宽度的分散X-辐射的最大值。然而，在电子衍射实验中，当硅酸盐粒子产生弯曲或者甚至尖锐的衍射最大值时才能获得特别好助洗剂特性。这个可解释表示这些产品具有微晶区域大小介于10-数百nm，上限为50nm以及更具体上限达20nm。特别优选压实的无定型硅酸盐、混合的无定型硅酸盐以及过干的X-射线-无定形硅酸盐。

精细的晶体，合成的沸石含有根据本发明所用的结合水优选沸石A和/或沸石P。沸石

(Crosfield)是尤其优选的P-型沸石。然而，沸石X和A、X和/或P的混合物也是可适用的。依照本发明，优选的是使用例如，商业上可得到的沸石X和沸石A的共晶体化物(按重量计约80％的沸石X)，其由CONDEA Augusta S.p.A.以VEGOBOND

名称上市，以及由下列公式描述：

nNa₂O·(1-n)K₂O·Al₂O₃·(2-2.5)SiO₂·(3.5-5.5)H₂O.

适当的沸石平均粒子尺寸小于10m(体积分布，正如由CoulterCounter方法测量)，并且按重量计优选含有18-22％，以及更优选的20-22％的结合水。

众所周知的磷酸盐当然也可用作助洗剂，倘若它们的应用在生态场合不可避免。在大量商业上可得到的磷酸盐中，碱金属磷酸盐在洗涤剂工业中最为重要，五钠三磷酸和五钾三磷酸(钠和钾的三磷酸盐)尤其优选。

“碱金属磷酸盐”是各种磷酸的碱金属盐的集合术语(更具体的是钠和钾)，包括偏磷酸(HPO₃)_n和正磷酸(H₃PO₄)和更高分子量的代表。磷酸盐组合各种好处：他们充当碱度来源，阻止石灰沉积在机器上以及在织物上石灰结壳，此外，有助于清洁效果。

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)以二水化合物(密度1.91gcm^-3，熔点60°)和一水化合物(密度2.04gcm^-3)形式存在。这两种盐都是白色易溶于水的粉末，加热失结晶水，并在200℃时，会转化为弱酸性的二磷酸(二磷酸氢二钠，Na₂H₂P₂O₇)，以及在更高温度时，转化为三偏磷酸钠(Na₃P₃O₉)和Maddrell盐(参见下文)。NaH₂PO₄显示酸性反应。用氢氧化钠调整磷酸到pH值为4.5，然后喷雾干燥所得的“糊状物”就可以形成NaH₂PO₄。磷酸二氢钾(一级或者单碱磷酸钾，磷酸氢钾，KDP)KH₂PO₄是白色盐，密度2.33gcm^-3，熔点253°(分解形成多磷酸钾(KPO₃)_x)，且易溶于水。

硫酸氢二钠(次磷酸钠)Na₂HPO₄是无色、易溶于水的晶体盐。有多种存在形式：无水、带2mol水(密度2.066gcm^-3，95°时失水)、带7mol水(密度1.68gcm^-3，熔点48°时失去5mol水)以及12mol水(密度1.52gcm^-3，熔点35°失去5mol水)，在100°时变成无水，以次强度加热，就会转变成二磷酸盐Na₄P₂O₇。以酚酞作指示剂，用苏打水中和磷酸就能制备磷酸氢二钠。磷酸氢二钾(次级或者二碱基磷酸钾)K₂HPO₄是无定型的白色盐，易溶于水。

磷酸三钠，三级磷酸钠，Na₃PO₄，由无色晶体组成，密度1.62gcm^-3，十二水合物的熔点73-76℃(分解)，十水合物的熔点为100℃(对应于19-20％ P₂O₅)，无水形式的密度为2.536gcm^-3(对应于39-40％ P₂O₅)。通过碱性反应磷酸三钠易溶于水，其制备方法是蒸发浓缩正好1mol的磷酸氢二钠和1mol的氢氧化钠的溶液。磷酸三钾(三级或者三碱基磷酸钾)K₃PO₄是白色易潮解的颗粒粉末，密度2.56gcm^-3，熔点1340°，通过碱性反应易溶于水。当托马斯(Thomas)矿渣与煤和硫酸钾一起加热就形成磷酸三钾。尽管价钱很高，但由于它们更易溶，所以在洗涤剂工业中，高效率的磷酸钾通常比相应的钠化合物更受欢迎。

二磷酸四钠(焦磷酸钠)Na₄P₂O₇以无水的形式存在(密度2.534gcm^-3，熔点988°，也有人认为是880°)，以及以十水合物的形式存在(密度1.815-1.836gcm^-3，熔点94°时失水)。这两个物质都是无色的晶体，通过碱性反应溶于水中。当磷酸氢二钠加热到200°以上就形成焦磷酸盐，或通过磷酸与苏打在化学计量比率条件下反应并且喷雾干燥溶液就可以得到。十水化合物络合重金属盐和硬盐，由此减少了水的硬度。二磷酸钾(焦磷酸钾)K₄P₂O₇以三水化合物的形式存在，是一种无色的吸湿性0粉末，密度2.33gcm^-3，溶于水，在25°时，1％浓度的溶液pH值为10.4。

相对高分子量的磷酸钠和磷酸钾是通过浓缩NaH₂PO₄或KH₂PO₄形成的。它们可划分成环型，称为钠和钾的偏磷酸盐，以及划分成链型，则称为钠和钾的多磷酸盐。特别是链型有很多不同的名称：熔化或者煅烧的磷酸盐、Graham盐、Kurrol盐以及Maddrell盐。所有更高分子量的钠和钾的磷酸盐都共同已知为浓缩的磷酸盐。

在工业上有重要用途的三磷酸五钠Na₅P₃O₁₀是非吸湿性白色水溶性盐，能无水结晶或者带6个水分子，其具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]_n-Na，其中n＝3。在室温条件下，大约17克无结晶水的盐溶于100克的水中，在60°时是约20克溶于100克水中，而在100°时大约是32克。将这种溶液加热2小时到100°，大约8％的正磷酸盐和15％的二磷酸通过水解形成。在制备三磷酸五钠时，将磷酸与苏打水溶液或者氢氧化钠在化学计量比率条件下反应，然后溶液经过喷雾干燥。同Graham盐和二磷酸钠盐相似，三磷酸五钠溶解许多不溶性的金属化合物(包括石灰肥皂等)。市场上的三磷酸五钠K₅P₃O₁₀按重量计都是50％的溶液(>23％ P₂O₅，25％ K₂O)。多磷酸钾广泛应用于洗涤剂工业中。三磷酸钾钠也存在，根据本发明，也有使用价值。例如当三偏磷酸钠用氢氧化钾水解时形成三磷酸钾钠：

(NaPO₃)₃+2KOH→Na₃K₂P₃O₁₀+H₂O

根据本发明，它们可以完全相同的方式用作三磷酸钠、三磷酸钾或者它们的混合物。根据本发明，三磷酸钠和三磷酸钠钾两者的混合物或者三磷酸钾和三磷酸钾钠两者的混合物或者三磷酸钠和三磷酸钾和三磷酸钠钾三者的混合物也可使用。

根据本发明，能够应用到洗涤剂/清洗剂中的有机增洁剂包括多羧酸盐或多羧酸、聚体多羧酸盐、多天冬氨酸、聚乙缩醛、任选氧化糊精、其他有机增洁剂(参见下文)和膦酸酯。下面描述这些类物质。

有用的有机增洁剂是例如以钠盐形式可用的多羧酸，在本发明的上下文中，多羧酸可以理解为带有多于一个酸官能团的羧酸。只要对生态是安全的，这些羧酸包括例如柠檬酸、脂肪酸、琥珀酸、戊二酸、苹果酸、酒石酸、马来酸、反丁烯二酸、糖酸、氨基羟基酸、次氮基三乙酸(NTA)及其混合物。优选的盐是多羧酸的盐，如柠檬酸、脂肪酸、琥珀酸、戊二酸、酒石酸、糖酸及其混合物。

这些酸本身就可利用。除了它们增洁效应以外，这些酸也通常具有使成分酸化的性质，因此在洗涤剂或清洗剂中用来建立相对较低和适中的pH值，除非pH值要求通过混合其他成分而得到。在这方面特别提及具有系统相容性和对环境安全的酸，如柠檬酸、乙酸、酒石酸、马来酸、乳酸、乙醇酸、琥珀酸、戊二酸、脂肪酸、葡萄酸以及它们的混合物。然而，无机酸尤其是硫酸或碱，尤其是铵或碱金属的氢氧化物也可以用作pH调节剂。这些调节剂存在于本发明的组合物中，其量按重量计不高于20％，以及更具体为1.2％-17％。

其他合适的增洁剂有聚体多羧酸盐，也就是例如具有相对分子量为500-700,000g/mol的聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的碱金属盐。

本说明书中提及的聚体多羧酸盐的分子量是特定酸形式的平均分子量M_w，其使用紫外检测仪通过凝胶渗透层析(GPC)测定。测定根据聚丙烯酸的外标进行，这种标准根据其与所研究的聚合物的结构相似性而提供实际的分子量值。这些值完全不同于以聚乙苯烯磺酸为标准测定的分子量值。以聚乙苯烯磺酸为标准测定的分子量一般高于本说明书中提到的分子量。

尤其合适的聚合物是聚丙烯酸酯，其优选具有2,000-20,000g/mol的分子量。由于具有优良的可溶性，该组优选的代表是短链聚丙烯酸酯，其分子量为2,000-10,000g/mol，以及更具体3,000-5,000g/mol。

合适的还有共聚的聚羧酸酯，特别是那些带有甲基丙烯酸的丙烯酸，或者带有马来酸的甲基丙稀酸或丙烯酸。按重量计含有50-90％丙烯酸以及50-10％马来酸的丙烯酸/马来酸共聚体尤其合适。基于游离酸，它们的相对分子量一般在2,000 to 70,000g/mol，优选在20,000-50,000g/mol，更优选在30,000-40,000g/mol的范围内。这种共聚体的聚羧酸酯可以粉末形式或者水溶液的形式利用。这种共聚体的聚羧酸酯在清洗剂中所占的含量按重量计为0.5-20％，更具体的为1-10％的范围之内。

为了增加其水中的溶解度，这种聚合体也可包含烯丙基磺酸，如烯丙基羟苯磺酸以及甲代烯丙基磺酸作为单体。

其他特别优选的聚合物是由2种以上不同单体构成的可生物降解的聚合物，如那些含有以丙烯酸和马来酸以及乙烯醇或者乙烯醇的衍生物作为单体的盐，或者那些含有以丙烯酸和2烷基烯丙基磺酸和糖的衍生物作为单体的盐。

其他优选的共聚物是那些优选含有丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸盐或者丙烯醛和乙烯基醋酸酯作为单体的共聚物。

其他优选的增洁剂是聚合的氨基双羧酸、盐或其前体。聚天冬氨酸或者盐及其衍生物除了有它们共增洁特性以外，还有漂白稳定效应，是特别优选的。

其他合适的增洁剂是聚缩醛，这些聚缩醛可通过二醛与含有5-7个碳原子和至少3个羟基的多羟基羧基酸反应得到。优选的聚缩醛可通过二醛得到，如乙二醛、戊二醛、苯对二甲醛及其混合物，以及可通过多羟基羧酸获得，如葡萄糖酸和/或葡萄糖庚糖酸。

其他的合适的有机增洁剂是糊精，如碳水化合物的寡聚体或多聚体，这些可以通过淀粉的部分水解获得。通过标准方法如酸或者酶催化的方法进行水解反应。终产物优选是平均分子量为400-500,000g/mol的水解产物。优选具有0.2-40右旋糖当量(DE)，更具体为2-30右旋糖当量的多糖，与具有100DE的右旋糖比较，这里的DE是可接受的衡量多糖还原效果的标准。DE为3-20的麦芽糊精和DE为20-37的干葡萄糖糖浆以及具有相对高分子量为2,000-30,000g/mol的所谓黄、白糊精都可以使用。

这些糊精的氧化衍生物是糊精与氧化剂的反应产物，这些氧化剂能将糖环的至少一个醇官能团氧化成羧酸官能团。本发明组合物尤其优选的有机增洁剂是根据EP 472 042、WO 97/25399和EP 755 944的氧化淀粉或其衍生物。

其他合适的共增洁剂是氧化二琥珀酸盐以及其他二琥珀酸的衍生物，优选乙二胺-N，N’-二琥珀酸盐。乙二胺-N，N’-二琥珀酸盐优选以钠盐或者镁盐形式使用。丙三醇二琥珀酸酯和丙三醇三琥珀酸酯在本文中也是优选的对象。在含沸石和/或含硅酸盐的制剂中所用的量按重量计为3-15％。

其它有用的有机增洁剂是例如乙酰化的的羟基羧酸及其盐，其可以内酯形式出现并且含有至少4个碳原子、至少一个羟基和最多2个酸性官能团。

具有增洁特性的另一类物质有膦酸盐，更具体的是羟基烷烃和氨基烷烃膦酸盐。在羟基烷烃膦酸盐中，1-羟基乙烷基-1，1-二膦酸盐(HEDP)作为增洁剂尤为重要。优选使用钠盐、显示中性反应二钠盐以及显示碱性反应(pH9)的三钠盐。优选的氨基烷烃膦酸盐有乙二胺四亚甲基膦酸盐(EDTMP)、二乙基三胺五乙撑膦酸盐(DTPMP)以及更高的同系物。优选使用它们的中性反应钠盐，如EDTMP的六钠盐或者DTPMP的七和十钠盐。膦酸盐中，HEDP优选用作增洁剂。另外，氨基烷烃膦酸盐具有显著的重金属结合特性。因此，尤其如果泡沫里亦含有漂白剂，使用氨基烷烃膦酸盐，更具体为DTPMP，或者上述膦酸盐的混合物是有益的。

另外，任何能与碱土金属离子形成复合物的化合物都可用作共增洁剂。

本发明的组合物可任选包含增洁剂，其量按重量计多达90％，以及优选多达75％。本发明的洗涤剂具有的增洁剂，其含量按重量计尤其为5-50％的范围内。在硬表面上本发明清洗剂尤其是洗碗机洗涤剂，增洁剂的含量按重量计尤其为5-88％。在优选的实施方案中，这样的组合物没有水溶性的增洁剂。在另一个实施方案中，本发明的组合物特别是洗碗洗涤剂按重量计包含20-40％的水溶性有机增洁剂，更尤其碱金属柠檬酸盐，按重量计含有5-15％的碱金属碳酸盐以及20-40％的碱金属二硅酸盐。

在液体或凝胶形式的洗涤剂/清洗剂的组合物中可用的溶剂例如属于单氢或者多氢醇、烷醇胺或乙二醇醚，条件是它们能与水以指定的浓度范围内混合。这些溶剂优选选自乙醇、正丙醇/异丙醇、丁醇、乙二醇甲基醚、乙二醇乙醚、乙二醇丙醚、乙二醇月丁基醚、二乙二醇甲基醚、二乙二醇二乙基醚、丙二醇甲基、乙基或丙基醚、二丙二醇单甲基或单乙基醚、二异二丙醇单甲基或单乙基醚、甲氧基、乙氧基或丁氧基三甘醇、1-丁氧基乙氧基-2-丙醇、3-甲基-3-甲氧基丁醇、丙二醇叔-丁基醚以及这些溶剂的混合物。

根据本发明，溶剂可以液体或凝胶形式存在于洗涤剂/清洗剂中，其量按重量计0.1-20％，优选低于15％，以及更优选低于10％。

为了调节粘稠度，本发明的组合物中可加入一个或者多个增稠剂，例如增稠系统。这些高分子量物质也称为膨胀剂，在最终变成粘滞的、纯的或胶状溶液之前，通常可以吸收液体并且在此过程中发生膨胀。

合适的增稠剂是无机或者聚合体的有机化合物。无机增稠剂包括例如聚硅酸、粘土矿物如蒙脱石、沸石、硅石和斑脱土。有机增稠剂属于天然聚合体、修饰的天然聚合体和完全合成聚合体的组别。天然产生的聚合体的例子有琼脂、角叉菜、黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、胶质、聚糖、瓜拉尼胶、蝉豆胶、淀粉、糊精、明胶以及干酪素。可用作增稠剂的修饰的天然聚合体首先属于改良淀粉和纤维素的组别，并包括例如羧甲基纤维素及其他纤维素醚、羟基乙基和羟基丙基纤维素以及树胶醚。完全合成的增稠剂包括聚合体，如聚丙烯和聚甲基丙烯化合物、乙烯基聚合体、聚羧酸、聚醚、聚亚胺、聚酰胺和聚氨酯。

基于最终组合物，增稠剂可使用的量按重量计多达5％，优选在0.05-2％之间，以及更优选在0.1-1.5％的范围内。

本发明的洗涤剂/清洗剂可以任选含有螯合剂、电解液还有其他的辅助剂，如光学增光剂、再沉淀抑制剂、银腐蚀抑制剂、颜色改变抑制剂、泡沫抑制剂、研磨剂、染料和/或香精，以及微生物试剂和/或紫外吸收剂作为它的补充成分。

本发明的衣物洗涤剂可以包含二胺1，2-二苯乙烯二磺酸的衍生物或其碱金属盐作为增光剂。合适的增光剂有例如4，4’-二-(2-苯胺基-4-吗啉基-1，3，5-三嗪基-6-氨基)-二苯乙烯-2，2’-二磺酸或者相似组合物的化合物，所述化合物包含二乙醇氨基、甲氨基、苯胺基或者2-甲氧基乙氨基而不是吗啉基。增光剂也可使用取代的联苯乙烯基类型，如4，4’-二-(2-磺苯乙烯基)-联苯、4，4’-二-(4-氯-3-磺苯乙烯基)联苯或者4-(4-氯苯乙烯基)-4’-(2-磺苯乙烯基)联苯。上述增光剂的混合物也可以使用。

再沉淀抑制剂的作用是使污渍从悬浮于洗涤液中的纤维分离。合适的再沉淀抑制剂一般是溶于水的有机胶体，如淀粉、胶质、明胶、淀粉或纤维素的羧酸乙醚或者磺酸乙醚的盐，也可以是纤维素或淀粉的酸性硫酸酯的盐。包含酸性基团的可溶性聚酰胺也适用于此目的。淀粉衍生物除了上面提及的以外，例如还有乙醛淀粉等也都可以使用。纤维素乙醚如羧甲基纤维素(钠盐)、甲基纤维素、羟烷基纤维素以及混合醚，如甲基羟乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、甲基羧甲基纤维素及其混合物优选使用，如基于组合物，其使用量按重量计为0.1-5％。

为了保护银器免遭腐蚀，可以在本发明的洗碗洗涤剂中使用银腐蚀抑制剂。现有技术中，银腐蚀抑制剂是已知的并且包括例如，苯并三唑、三价铁氯化物以及硫酸钴。例如，从欧洲专利EP 0 736 084 B1中可了解到，特别适合与酶一起使用的银腐蚀抑制剂有锰、钛、锆、铪、钒、钴或铈盐和/或络合物，在这些络合物中上述金属元素以氧化数II、II、IV、V或VI的一种形式存在。这些化合物的例子有MnSO₄、V₂O₅，V₂O₄，VO₂、TiOSO₄、K₂TiF₆、K₂ZrF₆、Co(NO₃)₂、Co(NO₃)₃及其混合物。

污渍释放剂或污渍驱除剂通常是聚合体，当这些聚合体应用到衣物洗涤剂中时，它们就能给洗衣纤维提供污渍排斥特性和/或支持洗涤剂的其他成分悬浮污渍的能力。如果这些聚合体用于硬物表面的清洗剂中时，也能观测到可比拟的效果。

特别有效并长期确立的污渍释放剂有含有二羧酸、亚烃基乙二醇以及聚链烯乙二醇单元的共聚多脂。例子是共聚物或者聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚氧乙二醇(DT 16 17 141或DT 22 00 911)的共聚物。DE-OS 2253063中提到酸性组合物，其中含有由二碱性羧酸和亚烃基或环亚烃基组成的共聚体。在DE-PS 28 57 292、DE-PS 33 24 258以及EP 0253 567中描述了乙烯对苯二酸盐和聚环氧乙烷对苯二酸盐的共聚体和它们在洗涤剂中的应用。欧洲专利EP 066 944涉及组合物，其含有乙二醇、聚乙二醇、芳香二羧酸和磺酸化的芳香二羧酸以一定的摩尔比率构成的共聚脂。欧洲专利EP 0 185 427描述了末端甲基或乙基的聚酯，其含有乙烯和/或丙稀对苯二酸盐单元和聚环氧乙烷对苯二酸盐单元，以及描述了含有此种污渍释放聚合体的洗涤剂。欧洲专利EP 0241 984涉及聚酯，这种聚酯除了含有氧乙烯基和对苯二酸基以外，还包含取代的乙烯单元和甘油单元。欧洲专利EP 0 241 985描述了聚酯，其除了含有氧乙烯基和对苯二酸基以外，还含有1，2-丙烯、1，2-丁烯和/或3-甲氧基-1，2-丙烯基和甘油单元，以及以C_1-4烃基为末端。欧洲专利申请EP 0 272 033描述了包含聚丙烯对苯二酸盐和聚氧化乙烯对苯二酸盐单元的至少部分以C_1-4烷基或酰基为末端的聚酯。欧洲专利EP 0 274 907描述了包含以磺乙基为末端的对苯二酸盐的污渍释放聚酯。根据欧洲专利申请EP 0357 280，包含对苯二酸盐、亚烃基乙二醇和聚-C_2-4-乙二醇单元的污渍释放聚酯能够通过不饱和末端基的磺化得到。国际专利申请WO 95/32232涉及酸性芳族污渍释放聚酯。国际专利申请WO 97/31085描述用于棉花织物的污渍驱除剂，其含有若干官能团单元：第一单元例如可能是阳离子的，能够通过静电相互作用吸附到棉花表面，以及第二单元是疏水的，负责保留在水/棉花分界面上的活性物质。

适合用在本发明的洗衣洗涤剂中的颜色转移抑制剂尤其包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯咪唑、聚合N-氧化物，如聚乙烯-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡咯烷酮与乙烯基咪唑的共聚物。

如果组合物用在机器清洗过程中，把典型的泡沫抑制剂加入到它们里面会大有好处。合适的泡沫抑制剂有例如具有较高百分含量的C_18-24脂肪酸的天然的或者合成来源的肥皂。合适的非表面活性的泡沫抑制剂有例如有机聚硅氧烷以其与微细的任选硅烷化的硅石，还有石腊、腊、微晶腊的混合物，以及它们与硅烷化的硅石或者二—硬酯酰乙二胺的混合物。不同泡沫抑制剂的混合物，如硅树脂、石蜡和蜡的混合物也可以被有效的利用。泡沫抑制剂，更具体是硅树脂和/或含石蜡的泡沫抑制剂优选固定到粒状水溶性的或水分散的支持物上。尤其优选石蜡和二—硬酯酰乙氨基化合物的混合物。

另外，本发明的硬表面清洗剂可能含有研磨剂成分，更具体是来源于硅石粉、木料粉、塑胶粉末、粉笔和玻璃状微珠以及它们的混合物。存在于本发明清洗剂中的研磨剂，其量按重量计优选不超过20％，更优选在5-15％的范围内。

将染色剂和香精加入到本发明洗涤剂/清洗剂中以改善产品带来的美学感受，并给消费者不仅提供所需要的洗涤和清洁性能而且也提供了视觉和感观上“特有和明白”的产品。合适的香精油或者芳香剂包括个别的芳香化合物，如酯、醚、醛、酮、醇和烃类的合成产品。酯类的芳香化合物有例如苯甲基醋酸酯、苯氧基乙基异丁酸酯、乙酸p-叔丁基环己酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基苯甲基carbinyl酯、乙酸苯基乙酯、安息香酸芳樟酯、甲酸苯甲基酯、甘氨酸乙基甲基苯基酯、丙酸烯丙基环己基酯、丙酸苏合香酯(styrallyl propionate)和水杨酸苯甲酯。醚包括例如苯甲基乙醚；醛包括例如含有8-18个碳原子的直链链烷醛(alkanals)、柠檬醛、香茅醛、香茅氧乙醛、樱草属植物醛、烃基香茅醛和铃兰醛(lilial)和bourgeonal；酮包括例如紫罗兰酮、α-异甲基紫罗兰酮以及甲基柏木酮；醇包括茴香脑醇、香茅醇、丁子香酚、香叶醇、沉香醇、苯乙基醇和松油醇；以及碳氢化合物最主要包括萜烯，如柠檬油精和松萜。然而，尤其使用各种香精一起产生诱人香气的混合物。象这样的香油也可以包含自然香精混合物，这些混合物是从植物源如松树、柑橘类植物、茉莉、天竺薄荷、玫瑰或依兰树油中提取出来的。还可适合的是鼠尾草植物油、春黄菊油、丁香油、蜜蜂花油、薄荷油、桂皮叶油、酸橙花油、杜松子油、岩兰油、乳香油、枫子香油和岩蔷薇油，以及橙花油、桔皮油和檀香油。洗涤剂/清洗剂的染料含量按重量计通常低于0.01％，而香油却可以占到总制剂的2％。

香油可直接掺入到洗涤剂/清洗剂中，虽然把香味应用到载体上会更好，这些载体能够增强香气与正被洗涤/清洗的物质之间的粘着，并且通过较慢释放香气给处理过的织物提供较持久的香气。合适的载体物质有例如环糊精、环糊精/香气复合物，其任选用其它辅助剂包被。另一优选的芳香载体是已经描述过的X沸石，它也能够吸收香气而不是或在表面活性剂的混合物中。因此，含有描述过的X沸石的洗涤剂/清洗剂和优选至少部分吸收在沸石上的芳香是优选的。

专家易于找到的优选的染料在储藏时具有高的稳定性，不受组合物中的其他成分和受光的影响，并且不显示出对织物纤维具有显著的直接性染色从而不给它们上色。

为了控制微生物，洗涤剂/清洗剂可以含有抗菌剂。依赖抗菌谱和作用机制，抗菌剂分为细菌抑制剂和杀菌剂、抑制真菌剂和杀真菌剂等。这些组重要的代表是例如苄烷铵氯化物、烷基芳基磺酸盐、卤代苯酚和苯酚汞醋酸盐。在本发明教导的情况下，术语“抗微生物活性”和“抗菌剂”具有通常的意思，如K.H.

在“Praxis derSterilisation，Desinfektion-Konservierung：Keimidentifizierung-Betriebshygiene”(第5版，Stuttgart/New York：Thieme，1995中所定义，在这里描述的任何具有抗微生物活性的物质是可用的。合适的抗菌剂优选选自醇、胺、醛、抗菌剂酸和它的盐、羧酸酯、酸酰胺、苯酚、苯酚衍生物、联苯、联苯基烷、尿素衍生物、氧和氮乙缩醛和缩甲醛、苄脒、异噻唑啉(isothiazolines)、苯邻二甲酰亚胺衍生物、吡啶衍生物、抗菌剂表面活性化合物、胍、杀菌剂两性化合物、喹啉、1，2-二溴代-2，4-二氰丁烷、碘-2-丙基丁氨基甲酸酯、碘、碘递体、过氧化合物、卤素化合物以及上述的混合物。

抗菌剂载体可选自乙醇、正丙醇、异丙醇、丁烷-1，3-二醇、苯氧基乙醇、1，2-丙二醇、甘油、十一碳烯酸、安息香酸、水杨酸、二水乙酸、邻-苯基酚、N-甲基吗啉乙腈(MMA)、2-苯甲基-4-氯酚、2，2’-亚甲基-二-(6-溴代-4-氯酚)、4，4’-二氯-2’-羟基联苯乙醚(Dichlosan)、2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚(Trichlosan)、氯代hexidine、N-(4-氯代苯基)-N-3，4-二氯苯基)-尿素、N，N′-(1，10-decanediyldi-1-嘧啶基-4-ylidene)-二-(1-八胺)-二氢氯化物、N，N′-二-(4-氯苯基)-3，12-双亚氨基-2，4，11，13-四氮杂四葵烷二亚氨基酰胺、糖精蛋白、抗菌表面活性四元化合物、胍包括二胍和聚胍，如1，6-双-(2-乙基己基二胍基己烷)-二氢氯化物、1，6-双-(N₁，N₁′-苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷三氢氯化物、1，6-双-(N₁，N₁′-苯基-N₁，N₁-甲基二胍基-N₅，N₅′)-己烷二氢氯化物、1，6-双-(N₁，N₁′-邻-氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷二氢氯化物、1，6-双-(N₁，N₁′-2，6—二氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷二氢氯化物、1，6-双-[N₁N₁′-β-(p-甲氧基苯基)-二胍基-N₅，N₅′]-己烷二氢氯化物、1，6-双-(N₁N₁′-α-甲基-β-苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N₁，N₁′-p-硝基苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷二氢氯化物、ω:ω-双-(N₁，N₁′-苯基二胍基-N₅，N₅′)-双-n-丙醚二氢氯化物、ω:ω′-双-(N₁，N₁′-p-氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-双-n-丙醚四氢氯化物、1，6-双-(N₁，N₁′-2，4-二氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷四氢氯化物、1，6-二-(N₁，N₁′-p-甲基苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N₁，N₁′-2，4，5-三氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷四氢氯化物、1，6-二-[N₁，N₁′-α-(p-氯苯基)-乙基二胍基-N₅，N₅′]-己烷二氢氯化物、ω:ω-二-(N₁，N₁′-p-氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-m-二甲苯二氢氯化物、1，12-二-(N₁，N₁′-p-氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-十二烷二氢氯化物、1，10-二-(N₁，N₁′-苯基二胍基-N₅，N₅′)-癸烷四氢氯化物、1，12-二-(N₁，N₁′-苯基二胍基-N₅，N₅′)-十二烷四氢氯化物、1，6-二-(N₁，N₁′-o-氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N₁，N₁′-o-氯苯基二胍基-N₅，N₅′)-己烷四氢氯化物、乙烯-双-(1-甲苯基双缩胍)、乙烯-双-(p-甲苯基双缩胍)、乙烯-双-(3，5-二甲基苯基双缩胍)、乙烯-双-(p-特戊基苯基双缩胍)、乙烯-双-(壬基苯基双缩胍)、乙烯-双-(苯基双缩胍)、乙烯-双-(正丁基苯基双缩胍)、乙烯-双-(2，5-二乙氧基苯基双缩胍)、乙烯-双-(2，4-二甲基苯基双缩胍)、乙烯-双-(o-联苯双缩胍)、乙烯-双-(混合-戊基萘基双缩胍)、正丁基乙烯-双-(苯基双缩胍)、三亚甲基-双-(o-甲苯基双缩胍)、正丁基三亚甲基-双-(苯基双缩胍)以及相应的盐，如醋酸盐、葡萄酸盐、氢氯化物、氢溴化物、柠檬酸盐、重亚硫酸盐、氟化物、聚马来酸盐、N-可可烷基肌氨酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐、过氟辛酸盐、硅酸盐、山梨酸盐、水杨酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、乙二胺、四乙酸盐、亚氨基醋酸盐、肉桂酸盐、硫氰氢酸盐、精氨酸盐、苯四酸盐、四羧酸丁酸盐、安息香酸盐、戊二酸盐、单氟磷酸盐、过氟丙酸盐和它们的混合物。卤化二甲苯和甲酚衍生物，如p-氯-m-甲酚或p-氯-m-二甲苯，并且植物起源(如香料和香草)以及动物和微生物起源的天然抗菌剂也是合适的。优选的抗菌剂有抗菌剂表面活性四元化合物、植物起源和/或动物起源的天然抗菌剂，以及最优选的是至少一个植物起源的抗菌剂来自咖啡因、可可碱以及茶碱和香精油如丁子香酚、麝香草酚和香叶醇，和/或至少一个动物起源的抗菌剂，来自酶如来自牛奶的蛋白质、溶菌酶以及乳酸过氧物酶和/或至少一个抗菌表面活性四元化合物，所述四元化合物包含铵、锍、鏻、碘鎓或砷鎓基、过氧化合物和氯化合物。微生物起源的物质也称为bacteriozines也可以使用。

适合做抗菌剂的季铵化合物(QUATS)具有通式(R¹)(R²)(R³)(R⁴)N⁺X^-，其中R¹-R⁴可以相同或不同，并代表C_1-22烷基、C_7-28芳烷基或杂环基、两个或在芳香化合物如吡啶存在的情况下甚至是三个基团同氮原子结合形成杂环，如吡啶鎓或咪唑鎓化合物，以及X^-代表卤化物离子、硫酸根离子、氢氧根离子或类似的阴离子。为了达到最佳的抗微生物活性的目的，优选的是这些替代物中的至少一个具有8-18，更优选12-16个碳原子的链长。

QUATS可以通过叔胺与烷基化试剂反应得到。这些烷基化试剂如氯甲烷、苯甲基氯化物、硫酸二甲酯、十二烷基溴化物，以及还有环氧乙烷。带一个长烷基链和两个甲基的叔胺的烷基化作用尤其简单。使用氯甲烷在温和条件下，含两个长链和一个甲基的叔胺的季铵化作用也可进行。含三个长烷基链或者羟基取代的烷基链的胺缺乏活性，并且优选用二甲基硫酸盐季铵化。

合适的QUATS有例如苄烷铵氯化物(N-烷基-N，N-二甲基苯甲基铵氯化物，CAS No.8001-54-5)、benzalkon B(m，p-二氯苯甲基二甲基-C₁₂-烷基铵氯化物，CAS No.58390-78-6)、benzoxonium氯化物(苯甲基十二基-双-(2-羟乙基)-铵氯化物)、cetrimonium溴化物(N-十六碳烷基-N，N-三甲基铵溴化，CAS No.57-09-0)、benzetonium氯化物(N，N-二甲基-N-[2-[2-[p-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基]-乙基]-苯甲基铵氯化物，CAS No.121-54-0)、二烷基二甲基铵氯化物，如二-n-癸基二甲基铵氯化物(CAS No.7173-51-5-5)、二癸基二甲基铵溴化物(CASNo.2390-68-3)、二辛基二甲基铵氯化物、1-十六烷基吡啶鎓氯化物(CASNo.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及它们的混合物。尤其优选的QUATS是含有C_8-18烷基的苄烷铵氯化物，更具体是C_12-14烷基苯甲基二甲基铵氯化物。

苄烷铵卤化物和/或取代的苄烷铵卤化物可商业上获得，如来自Lonza的

来自Mason的来自Witco/sherex的

以及来自Lonza的

和来自Lonza的其他可商业上获得的抗菌剂有N-(3-氯烯丙基)-hexaminium氯化物，如来自Dow的

和

)、benzethonium氯化物，如来自Rohm&Haas的1622)、甲基benzethonium氯化物，如来自Rohm &Haas的

10X)、十六烷基吡啶鎓氯化物，如来自Merrell Labs的cepacolchloride)。

抗菌剂的用量按重量计在0.0001-1％的范围内，优选在0.001-0.8％的范围内，更优选在0.005-0.3％的范围内，以及最优选在0.01-0.2％的范围内。

另外，这些组合物可任选含有紫外吸收剂，这种吸收剂可吸附在处理过的织物上，并增强纤维的光稳定性和/或其他制剂成分的光稳定性。紫外吸收剂是有机物质(光滤器)，能够吸收紫外线并以长波辐射如热的形式释放吸收的能量。

具有这些所需特性的化合物是例如通过无辐射钝化作用而发挥作用的化合物以及具有2位和/或4位取代基的二苯甲酮的衍生物。其他合适的紫外吸收剂是取代的苯并三唑、3-苯基-取代的丙烯酸盐(2位上任选用氰基取代的苯乙烯酸衍生物)、水杨酸盐、有机Ni复合物和天然物质，如7-羟基香豆素和其本身的咪唑丙烯酸。联苯基具有特殊的重要性，以及首要的是例如在EP 0728749 A中描述的商业上以

 FD和

 FR ex Ciba可得到的1，2-二苯乙烯衍生物。合适的紫外光-B吸收剂包括3-苯亚甲基樟脑或3-苯亚甲基非樟脑和它的衍生物，如在EP-B1 0693471中所述的3-(4-甲基苯亚甲基)-樟脑；4-氨基安息香酸衍生物，优选4-(二甲基氨基)-安息香酸-2-乙基己基酯、4-(二甲基氨基)-安息香酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)-安息香酸戊酯；苯乙烯酸的酯，优选4-甲氧基苯乙烯酸-2-乙基己基酯、4-甲氧基苯乙烯酸丙基酯、4-甲氧基苯乙烯酸异戊基酯、2-氰基-3，3-苯基苯乙烯酸-2-乙基己基酯(Octocrylene)；水杨酸的酯，优选水杨酸-2-乙基己基酯、水杨酸-4-异丙基苯甲基酯、水杨酸高薄荷基酯；二苯甲酮的衍生物，优选2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮；苯亚甲基丙二酸的酯，优选4-甲氧基苯亚甲基酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，如2，4，6-三苯胺-(p-碳-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪和EP 0818450 A1中所述的辛基三嗪酮或者二辛基丁氨基三嗪酮

 HEB)；丙烷-1，3-二酮如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮；EP 0694521 B1中所述的酮三环(5.2.1.0)癸烷衍生物。其他合适的UV-B吸收剂有2-苯基苯并咪唑-5-硫酸和碱金属、碱土金属、铵、烷基铵、烷醇铵及其葡萄铵盐；二苯甲酮的硫酸衍生物，优选2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-硫酸及其盐；3-苯亚甲基樟脑的硫酸衍生物，如4-(2-氧代-3-bornylidene甲基)-苯硫酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-bornylidene)-硫酸及其盐。

典型的UV-A过滤剂具体有苯酰甲烷的衍生物，如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮、4-叔丁基-4′-甲氧基联苯甲酰甲烷(Parsol 1789)、1-苯基-3-(4′-异丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮和DE19712033 A1(BASF)中所述的烯铵化合物。UV-A和UV-B过滤剂当然可以混合物的形式利用。除了上面提到的可溶性物质外，不溶的光封闭色素，也就是精细分散的优选“毫微化的”金属氧化物或盐也可以用于这种目的。适合的金属氧化物的例子有氧化锌、二氧化钛以及铁、锆、硅，镁、铝和铈的氧化物以及它们的混合物。硅酸盐(滑石)、硫酸钡和硬脂酸锌也可以作为盐使用。氧化物和盐以色素的形式可以应用在护肤的乳剂和装饰性化妆品上。颗粒直径平均要小于100nm，优选在5-50nm之间，以及更优选在15-30nm之间。它们一般为球形，尽管椭圆或其他非球形颗粒也能用。这些色素也可以是经过表面处理的，也就是说亲水性的或疏水性的。典型的例子是包被二氧化钛，如Titandioxid T 805(Degussa)和 T2000(Merck)。合适的疏水型包被材料首要是硅树脂，以及其中尤其是三烷氧基辛硅烷或者simethicones。微粉化的氧化锌优选使用。其他合适的UV过滤剂可以在

 122，543(1996)的P.Finkel的综述中找到。

UV吸收剂常用量按重量计在0.01-5％的范围内，以及优选在0.03-1％的范围内。

本发明的蛋白质和/或其他蛋白质在洗涤剂和清洗剂中也需要特别的保护。本发明的组合物可含有稳定剂用于这种目的。

其中一组稳定剂是可逆的蛋白酶抑制剂，它能在组合物稀释在洗涤液中之后解离。苄脒氢氯化物和leupeptin就为此目的而确立。硼砂、硼酸或它们的盐或酯，其中首先包括例如根据WO 95/12655被芳香基临位取代的苯基硼酸、根据WO 92/19707被芳香基间位取代的苯基硼酸和根据US 5,972,873被芳香基对位取代的苯基硼酸或它们的盐或酯，也经常用于这种目的。WO 98/13460和EP 583 534公开肽醛，也就是具有还原C末端寡肽，特别是那些含有2-50个单体的肽，用于可逆性抑制洗涤剂蛋白酶。肽的可逆性蛋白酶抑制剂包括卵类粘蛋白(WO 93/00418)和其他的物质。例如WO 00/01826公开针对蛋白酶枯草杆菌素的特异性可逆的肽抑制剂，用于含蛋白酶的组合物中，而WO 00/01831公开了相应的蛋白酶和抑制剂的融合蛋白质。

其他酶的稳定剂有氨基醇，如单-、双-、三-乙醇-和-丙醇胺和它们的混合物、例如从EP 0 378 261和WO 97/05227中得知多达C₁₂的脂肪族羧酸，如琥珀酸，其他羧酸或上述酸的盐。德国专利申请DE19650537中为此目的公开了末端戴帽的脂肪酸酰胺烷氧酸盐。如WO97/18287中所公开，某些用作增洁剂的有机酸额外能够稳定存在的酶。

低级脂族醇，除了上面所有多羟基化合物如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨醇以外，也是其他常用酶的稳定剂。根据更近的申请(EP 0 965268)，二甘油磷酸盐也能防止酶受到自然影响而发生变性。在EP 0 028865中为此目的公开了钙盐，例如醋酸钙或甲酸钙，例如根据欧洲专利申请EP 0 378 262，镁盐也可作此用途。

聚酰胺寡聚体(WO 99/43780)或者聚合体的化合物，例如木质素(WO 97/00932)，水溶性乙烯基共聚物(EP 828 762)或者如EP 702712中所公开的纤维素乙醚、丙烯酸聚合体和/或聚酰胺可对酶制剂产生稳定作用，以克服自然影响或者pH值的变化。包含了聚胺-N-氧化物(EP 587 550和EP 581 751)的聚合体同时担当酶稳定剂和染料转移抑制剂。其它聚合体稳定剂是除了在WO97/05227所公开的其他成分以外的直链C_8-18聚乙二醇。烷基聚糖苷可稳定本发明组合物中的酶成分，甚至提高它们的性能，如在WO 97/43377和WO98/45396中所公开。如WO 98/17764所公开，包含交联氮的化合物担当着污渍释放剂和酶稳定剂的双重作用。根据WO 97/32958，疏水性非离子聚合物与其它稳定剂的混合物对纤维素酶有稳定的作用，因此这些或者相似的成分也同样适合本发明中所必需的酶。

还原剂和抗氧化剂，如在EP 780 466中所公开的其它成分，将增加酶对氧化分解的稳定性。含硫的还原剂例如从EP 0 080 748和EP 0080 223中得知。其它的例子是亚硫酸钠(EP 533 239)和还原糖类(EP656 058)。

在很多情况下，还采用稳定剂的组合，例如在WO 96/31589中多羟基化合物、硼酸和/或硼砂的组合，在EP 126 505中硼酸或硼酸盐、还原盐与丁二酸或其它二羧酸的组合，或者硼酸或硼酸盐与多羟基或多氨基化合物的组合以及与如EP 080 223中所披露的还原盐的组合。根据WO 98/13462，肽/乙醛稳定剂的效果可通过与硼酸和/或硼酸衍生物和多羟基化合物的组合来增强，根据WO 98/13459其还可通过添加钙离子而进一步增强。

具有稳定的酶活性的组合物代表着本发明的优选实施方案。特别优选的是含有以上面提到的几种方法而加以稳定的酶的组合物。

本发明组合物含有对本发明必需的蛋白质或衍生物，其量按重量计优选为0.000001-5％，以及优选递增的是0.00005-4％、0.00001-3％、0.0001-2％，在最特别优选的实施方案中，其量按重量计为0.001-1％。蛋白质浓度可用已知方法来测定，例如BAC法(bicinchonic acid(二弱金鸡纳碱酸)；2，2’-biquinolyl(二喹啉基)-4，4’-dicarboxylic acid(二羧酸))或者缩二脲法(A.G.Gornall，C.S.Bardawill和M.M.David，J.Biol.Chem.177，(1948)，第751-766页)。

除了对本发明必需的蛋白质外，本发明的组合物可以包含其它的淀粉分解酶，更特别是α-淀粉酶。这些也可包括从开始提到的用于洗涤剂/清洗剂中而确立的酶。商业上可得到的淀粉酶的例子是

和/或

 Ox-Am。多种酶彼此能互补是明智的。这种补充作用可以发生例如在调整意义上，例如通过彼此的活化作用或者失活作用。这可出现例如，通过至少对本发明必需的、不与已知α-淀粉酶同源的这部分酶对本发明不必需的淀粉分解活性产生影响。

然而，针对不同的底物特异性，联合使用也是合适的。二者都是本发明的实施方案。

特别对于化学成分复杂的污渍，将洗涤剂/清洗剂中的淀粉分解酶和其它清洗酶和/或有清洁活性的酶一起使用是很有优势的。因而，以除本发明蛋白质之外的其它酶为特征的洗涤剂/清洗剂代表本发明优选的实施方案。

除其它淀粉酶如蛋白酶之外，这些其它的酶包括例如脂肪酶、角质酶、酯酶、普鲁兰酶、纤维素酶、半纤维素酶和/或木聚糖酶和它们的混合物。蛋白酶、脂肪酶、β-葡聚糖酶和/或纤维素酶是特别优选的。其它酶通过它们特殊的酶活性增加相应组合物的清洗性能。这些包括例如，作为酶漂白系统的成分的氧化还原酶或过氧物酶、虫漆酶(WO00/39306)、β-葡聚糖酶(WO 99/06515和WO 99/06516)或者果胶溶解酶(WO 00/42145)，这些具体用于专门的清洗剂中。

商业上可得到的用在本发明组合物中酶的例子有蛋白酶、如枯草杆菌蛋白酶BPN’、

和/或或

和脂肪酶，如

和/或

这些组合物中蛋白酶的活性可用Tenside Vol.7(1970)，第125-132页中所述的方法来测定。它因此以PU(蛋白酶单位)来表示。优选的组合物的蛋白酶活性能够高达每克1,500,000蛋白酶单位(PU，用TensideVol.7(1970)，第125-132页中所述的方法测定)。

就分离而言，首先，合适的酶是从微生物中获得的那些，例如细菌或真菌，例如来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、灰色链霉菌、绒毛状腐殖菌、鞭毛腐殖菌、类产碱假单胞菌或洋葱假单胞菌，更为特别的是通过这些菌株自然形成的酶的混合物或者与其它菌株的混合物。他们用已知方法从合适的微生物中通过发酵方法而分离，这些微生物在德国专利DE 1940488和DE 2121397，在美国专利US3,623,957和US 4,264,738，在欧洲专利申请EP 006 638和在国际专利申请WO 91/02792中有所描述。

这些任选附加的酶也可被吸附到载体和/或装入胶囊密封在膜材料中以保护它们过早的失活，例如在欧洲专利EP0 564 476或者国际专利申请WO 94/23005中所描述的那样。它们在洗涤剂中存在的量按重量计优选多达10％，以及更优选0.2％-2％，具有抗氧化降解的稳定性酶，如从国际专利申请WO 94/18314中得知，是特别优选的。

本发明的组合物可由几种相组成，例如为了释放在时间或空间上彼此独立存在的活性成分。这些相可以是各种各样的聚集状态，但是，在特定的实施方案中，在同一个聚集聚合状态下有两种相。

由几种固态成分构成的本发明化合物可以容易地通过各种粉末和颗粒的混合来生产，这些粉末和颗粒具有各种各样的成分和/或以整体的松散形式具有彼此不同的释放行为。本发明固态、单相或多相组合物的生产能够用已有的方法来生产，例如通过喷射干燥或造粒，酶和其它任选的热敏感成分如漂白剂可在后阶段单独添加。本发明的组合物具有大的容积密度，更具体在650-950g/升的范围内，优选通过包含从EP 0 0486 592中得知的挤压步骤的方法来生产。基于造粒的另一优选的生产方法描述在欧洲专利EP 0 0642 576中。

蛋白质能够以干燥、颗粒状或胶囊化的形式或者胶囊化另加干燥的形式用于固态洗涤剂/清洗剂。它们可以单独即作为单相添加，或者与其它有或没有压实的同相中的成分一起添加。如果微胶囊化的酶一定要以固态形式生产，则水可经过加工例如通过喷雾干燥、离心或者再溶解从水溶液中除去。以这种方式获得的颗粒大小通常为50-200μm。

胶囊化形式适合用来保护酶不受其它成分的影响，例如漂白剂或者用于促进缓释的成分。按照它们的大小，胶囊是毫胶囊、微胶囊或者纳胶囊，微胶囊特别优选于酶。例如，微胶囊在专利申请WO 97/24177和DE 19918267中公开。在另一可能的胶囊化方法中，其从有淀粉或淀粉衍生物的溶液或悬浮液与酶溶液的混合物开始，适用于洗涤剂或清洗剂的酶在淀粉或淀粉衍生物中胶囊化。一个如此胶囊化的方法在德国申请DE 19956382“微胶囊酶的生产方法(A process for theproduction of microencapsulated enzymes)”中公开。

另一种生产本发明固态组合物的方法是压片或者压实。所产片剂可以为单相或者多相片剂。因而这种提供形式也使得本发明的固态组合物以两相生产。为了生产单相或者多相形式的本发明组合物，单色或者多色片剂由若干层组成，任选各层的所有成分可在混合器里一起混合，在50-100kN.cm²和以及优选的60-70kN.cm²的应用压力下以常规压片机，例如离心压片机或者旋转压片机将所得混合物压片。尤其如果是多层片剂，至少预压一层是有好处的。以5-20kN.cm²和更特别10-15kN.cm²的应用压力是优选的。以这种方式生产的片剂优选具有10-50g且更特别15-40g的重量。片剂可以是任何的形状，包括圆形、椭圆形或角形以及它的变化形式。

起始于常规操作的蛋白质分离和制备在浓缩的水或者非水溶液中的酶和甚至对本发明所需的蛋白质可以添加到液体、凝胶体或糊状体的本发明组合物中，例如以液体形式，即作为溶液、悬浮液或者乳液，也可以凝胶形式或胶囊形式或干粉。这种在典型溶剂里以溶液形式存在的本发明洗涤剂或者清洗剂一般通过简单混合成分来制备，所述成分以原样或溶液的形式引入到自动搅拌器中。

本发明的实施方案是液态、凝胶体或者糊状体组合物，已向其中以胶囊形式加入了对本发明必需的蛋白质和/或一种其它现有蛋白质和/或一种其它现有的成分。含有淀粉酶敏感物质的对应组合物是特别优先的。淀粉酶敏感物质和对本发明必需的淀粉分解酶一起使用在洗涤剂或清洗剂中可具有协同效应，例如淀粉分解酶支持微胶囊的分解然后释放胶囊化的成分，以至它们只能在一定时间而不在存储期间和/或不能在清洗程开始的时候释放。这种机理可形成含有代表本发明优选实施方案的各种成分和各种类型胶囊的复杂洗涤剂或清洗系统的基础。

类似的作用也可观察到，当洗涤剂或清洗剂分布在至少两个不同的相中时，例如两个或者多个片剂形式的洗涤剂或清洗剂的固体结合在一起的相，或者在相同粉状的洗涤剂/清洗剂中各种颗粒。用在洗碗机和洗涤剂中的两相或多相清洗剂是已知的。在前一激活相中的淀粉分解酶活性对于被淀粉酶敏感的膜或者包衣所围绕的后一相的活化来说是必需的，或者淀粉酶敏感材料是固相的完整部分，在其部分或完整水解过程中，争论中的相分解。因而为此目的，本发明所必需的酶的利用是本发明优选的实施方案。

洗涤剂/清洗剂的成分在它们的性能上能够适当的相互支持。为了提高清洗性能，淀粉酶和染料转移抑制剂协同应用公开在例如专利申请WO 99/63035中。还已知的是聚合体能够同时用作共增洁剂，例如烷基聚糖苷，可稳定和增加存在酶的活性和稳定性，参照专利申请WO 98/45396。对本发明必需的淀粉分解活性也能够通过上面提到的其它成分的一种得到修饰，更尤其得到稳定和/或提高。因而，用于本发明组合物对应适合制剂尤其代表着本发明优选的实施方案。特别在组合物的洗涤或清洗性能以这种方式得到增强时应用。

该发明的基本概念也体现在清洗织物或硬表面的方法中，其特征在于本发明的淀粉分解蛋白质或衍生物在至少其中一个方法步骤中变成活性的。

机械清洗方法通过多级清洗程序来区分，即通过各种具有清洗活性的成分在相互不同的时间段应用于待清洗物品的实际情况而定。将这些方法应用于例如清洗规定的食物制备单元中。另一方面，由于它们的酶活性，对本发明必需的蛋白质本身能够进攻含碳水化合物的污渍，甚至以部分或全部不需要洗涤剂或其它以洗涤剂或者清洗剂为特性的成分。因而，在本发明的一种实施方案中，用于织物或者硬表面的机械清洗方法也可以选择，其中对本发明必需的蛋白质在一定时期内作用于污渍上而不用其它的清洗活性成分。

本发明优选的实施方案是任何清洗方法，包括人工，但尤其是机械清洗方法，其特征在于对本发明必需的淀粉分解蛋白质或衍生物在至少一个方法步骤中变成活性的。这些方法可以是清洗织物或类似材料的方法以及清洗硬表面的方法。

如实施例所示，对本发明必需的来自芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶是合适的，当其掺入在合适的洗涤剂或清洗剂中时，既用于提高织物的机械洗涤剂的清洗性能，也用于增加洗碗机洗涤剂的清洗性能。

因而，本发明其它优选的实施方案是任何清洗方法，包括人工，但尤其是机械清洗方法，其特征在于本发明组合物用于至少一个方法步骤中。这些方法既可以是清洗织物或类似材料的方法也可以为清洗硬表面的方法。

特别适用于清洗方法例如常规家用洗碗机或者家用洗衣机中的本发明蛋白或片段，其每次应用的量为0.02mg-400mg的淀粉分解蛋白或片段，优选0.01mg-200mg，以及更优选0.02mg-100mg的淀粉分解酶或片段。

在机械清洗织物或硬表面方法的一个可能的实施方案中，每升洗涤液活性浓度为0.0005mg-10mg，以及优选为0.0005mg-8mg已经证明对本发明必需的蛋白质来说特别合适。因而，它们代表着本发明优选的实施方案。在其它合适的实施方案中，相应值可以和上述数值有显著地区别，特别是当考虑机械消耗5-50升的洗涤液时，实际上机械清洗方法需要同样数量的洗涤剂。

本发明蛋白质或者组合物的应用代表本发明的另一种实施方案。这种应用可通过机器或任何其它尤其是人工的方式进行。这种方法涉及到各种各样的材料，更具体是织物或者硬表面的清洗。对本发明必需的蛋白质可包埋到其它清洁物质的制剂中，或者依赖于其性质，甚至可以在很大程度上不与这些化合物伴随存在。

另一种相应的实施方案是利用本发明蛋白质自身来清洗织物和硬表面，更具体是在多级步骤的清洗方法中。

优选的实施方案是任何潜在的应用，其中本发明组合物用来清洗织物或硬表面。

重要应用的特征在于淀粉分解蛋白质或片段在洗碗机或洗衣机中每次使用量为0.02mg-400mg，优选0.01mg-200mg，以及更优选0.02mg-100mg。

本发明蛋白质或衍生物用于完全或部分地溶解固态洗涤剂或清洗剂成分周围的保护层或者采用存在于它们之中或周围的淀粉酶敏感材料分解固态相，是本发明的另一种实施方案。这同样适用于实施方案，其中淀粉分解蛋白质以它们自己或与至少一种其它清洁物质或支持清洗效果的活性物质一起的这些相中的一种而存在。要达到这种程度，淀粉分解蛋白质意在激活由一种以上相组成的洗涤剂或者清洗剂中的相关相或者其它相。为了在硬表面或者织物类材料上产生清洗效果，这些成分的释放从此观点上也是尤其优选的。

利用本发明的酶来部分或者全部分解液体、凝胶形式或者糊状组合物中的含碳水化合物的胶囊，更具体是纳胶囊、微胶囊或者毫囊体，是本发明的实施方案，其中组合物的胶囊化成分缓释的重要性在前面已经讨论过了。当成分缓释用于在硬表面或织物样材料上产生清洗效果的时候，这种实施方案是尤其优选的本发明的实施方案。

另一种实施方案是利用本发明的蛋白质或其衍生物来处理织物加工中的原材料或中间产品，更具体是用于脱浆棉。

用于织物生产的原材料就中间产品，例如基于棉花的那些织品，为了便于更好加工，在他们生产以及进一步加工过程中以上浆来完成。这个过程既用在纱线和中间产品也用在织物上，已知为上浆。本发明淀粉分解蛋白质适合于除浆，即含淀粉的保护层(脱浆)。

本发明的另一种实施方案是液化淀粉的方法，更特别用来生产乙醇，其特征在于它们使用本发明的蛋白质或者其衍生物。

对于液化淀粉来说，将溶胀在水或缓冲液中的淀粉与淀粉分解酶温育，这样多糖分解成更小的成分，最终主要转换成麦芽糖。本发明的酶优选用于此方法或用于其中包含的一个步骤，其中它们的生化特性使得它们容易地整合到相应的生产方法中。可以是这种情形，例如，当它们要引入到除了需要同样反应条件的其它酶的方法步骤中的时候。本发明淀粉分解蛋白质尤其优选于它们自身所形成的产品是目的焦点的地方。淀粉液化也可代表用于生产乙醇或者其衍生物例如乙酸的多级方法中的一步。

本发明的另一种实施方案是利用本发明蛋白质或者衍生物来生产直链和/或短链寡糖。

由于酶的活性，本发明淀粉分解蛋白质主要形成相对高分子量的寡糖，如经过相对短的温育期后来自淀粉样聚合体的麦芽六糖、麦芽七糖或者麦芽八糖。经过相对长的培育期后，在反应产物中低级寡糖如麦芽糖和麦芽三糖的比例增加。如果对某些反应产物特别感兴趣，本发明蛋白质的相应的变体和/或反应条件可相应得到修饰。当纯化合物不是主要事情而是如在仅具有某些物理特性的溶液、悬浮液或者凝胶的形成中的相似化合物的混合物，这尤其是诱人的。

本发明另一实施方案是将本发明蛋白质或衍生物用于水解环糊精。

环糊精是α-1，4-糖苷的环寡糖，其中那些6、7或8个葡萄糖单体，α-、β-和γ-环糊精(或者环六-、-七-或-八-淀粉酶)具有最大的经济价值。采用疏水性外来分子，如芳香剂、香精或者药物活性素，它们能够形成外来分子从中按需要释放的内含化合物。依赖于这些成分的应用领域，如此内含化合物是重要的，例如用在食品、药物或化妆品的生产，例如在终端消费者的相应产品中。因此，从环糊精中释放成分是对本发明蛋白质的一种实际应用。

另一种实施方案是将本发明蛋白质或衍生物用于从多聚糖载体或环糊精中释放低分子量的化合物。

由于它们的酶活性，本发明淀粉分解蛋白质也能从其它α-1，4-糖苷的多糖中释放低分子量的化合物。如采用环糊精，这可在分子水平以及甚至更大系统上发生，例如在微胶囊形式中胶囊化的成分。例如淀粉是在存贮过程中用于使如酶的化合物胶囊化的确定的原料，它们能以规定量介入到反应混合物中去。来自这些胶囊的缓释方法可由本发明的淀粉分解酶来支持。

另一实施方案将本发明蛋白质或衍生物用来生产食物和/或食物成分。

用蛋白质或衍生物来生产动物饲料和/或动物饲料成分是本发明的另一实施方案。

无论何地，淀粉或者淀粉衍生的碳水化合物都扮演着食物成分或者动物饲料的角色，淀粉分解的活性可用于生产这些物品。它能增加和多聚糖相关的单体或寡聚体的比例，所述多聚糖能有益于食物的味道、消化性和稠度。对于一些动物饲料的生产这可能是必需的，并且例如在果汁、酒类或其它食物的生产中，如果多聚糖的水平减少，则甜度和/或更容易溶解的糖水平增加。上面提到的液化淀粉和/或生产乙醇的应用可看作是这个原理的工业变体。

此外，淀粉酶也可以通过腐败阻止面包或者糖果失去味道(抗腐效应)。为达到此目的，它们在烘焙前适当地加在生面团里。因而，本发明优选的实施方案是本发明蛋白质用在面包和糖果的生产中。

另一实施方案是将本发明蛋白质或者衍生物用于溶解含淀粉的粘合键。

暂时性的粘合方法其特征在于它们用本发明蛋白质或衍生物来代表本发明的另一实施方案。

除了其它天然材料以外，淀粉作为一种粘结剂在纸品生产和在不同纸和纸板的粘结中已经使用了数个世纪。例如，这适用于制图和书籍中。在很长的一段时期里，这些纸能变卷曲或在不利影响下能断裂，例如潮湿导致它们完全的破坏。为了存贮这些纸和板，有必要溶解粘合层，通过利用本发明的淀粉溶解蛋白质会使这很容易实现。植物聚合体，例如淀粉或纤维素及其水溶性衍生物，用作粘合剂或者浆糊。为达此目的，它们首先必须膨胀在水中接着在用到待粘合表面之后干燥，这样它就可以固定到底物上。为了影响所形成浆糊的粘合特性，本发明的酶可添加至这种水悬浮液里。然而，代替或者除了这项功能之外，为了干燥后在表面上停留不动长时间如数年，它也可添加在浆糊里。控制周围环境条件的变化，例如通过润湿，能够用来在后一段时期内激活酶并因此诱导溶解浆糊。以此方式，粘合的表面更易与底物分离。在这个过程中，本发明的酶通过它的淀粉分解活性作为临时粘合过程的分离剂或者分离粘合物品所谓“开关”。

实施例

实施例1

对形成淀粉酶的微生物进行微生物筛选，用淀粉作为唯一的碳源，在琼脂板上生长和晕圈形成作为筛选标准，候选株包括芽孢杆菌菌株芽孢杆菌(RNA组VI，嗜碱性)A7-7，其已保藏于DSMZ(DSM ID98-587，保藏号DSM 12368)。

所用的培养基是YPSS培养基，包括15g/l可溶性淀粉、4g/l酵母提取物、1g/l K₂HPO₄和0.5g/l MgSO₄ x 7H₂O。高温灭菌后，用20％的碳酸钠溶液将pH值调整到10.3。把25ml的培养基加入到消过毒的100ml的厄伦美厄烧瓶中，并用已在YPSS琼脂平板上生长的芽孢杆菌A7-7(DSM 12368)培养物接种。在30℃/200r.p.m摇动48小时进行培养。

实施例2

单个酶通过下面的纯化步骤从培养基中获得：用乙醇沉淀培养上清液；将蛋白质沉淀溶入50mM的tris/HCl缓冲液中，pH8.5；对50mM的tris/HCl缓冲液、pH8.5透析；用50mM的tris/HCl缓冲液、pH8.5作为洗脱液在

(Pharmacia-Amersham Biotech，Freiburg)柱上进行阳离子交换层析；用包含20mM甘氨酸/NaOH缓冲液、pH10，在

柱上(Pharmacia-Amersham Biotech)使含淀粉酶的穿透峰进行重新缓冲；用同样的缓冲液作为洗脱液，盐梯度为0-1MNaCl，在

(Pharmacia-Amersham Biotech)柱上进行阴离子交换层析。淀粉酶在大约0.25M NaCl处洗脱下来。

用这种方法可以从250ml的培养基中获得2.6mg的蛋白质，即BCA方法(双奎宁基酸；2，2’-二喹啉基-4，4’-乙二酸)。SDS胶体电泳法显示蛋白质为纯色，并用银着色。

用含8-25％胶体的改性聚丙烯酸凝胶电泳相系统中(药剂-Amersham)测定，并用相关尺寸标记，测的芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中淀粉分解酶的分子量为58kD。

在相系统中，根据等电子聚焦在pH＝3～6之间，可以得出淀粉分解酶的等电点为pH＝6.0。

DNS方法能够测量纯淀粉分解酶的活度，例如，用二硝基水杨酸。在淀粉水解过程中被酶分解的低聚糖、二糖、葡萄糖可以用氧化还原性的二硝基水杨酸(DNS)冷凝液的方法检测出来。蛋白质颜色的强度与水解程度成正比。实验条件如下：在tris/三马来酸酯缓冲器中，用100μl 1％的溶解性淀粉溶液熟化50μl酶溶液，pH＝6.5(12.11gtris+11.61g马来酸溶解于1升水中，用0.2N NaOH调节pH值)，静置15分钟，温度为50℃，氧化被还原的糖类20分钟。100℃，300μl DNS溶液(8.8g二硝基水杨酸，915ml蒸馏水，250g钾-钠水石酸盐，334ml 4.5％的NaOH，6.3g二硫化钠)。冰室中冷却，对照空白值，吸收值可以在540nm处通过光谱测量检测出来。用一序列浓度的麦芽糖溶液作校准。分解酶的活度可以表示为还μmol原糖(以麦芽糖为标准)/min.ml。

实验结果表明，实验中蛋白质有明显的分解行为。这种分解行为可以用不同条件下酶的稳定性参数来表示。

在pH＝10的条件下熟化10分钟来测量酶的温度稳定性。在室温、30℃、40℃和50℃条件下，活度为85％。40℃时，酶残留活度达到最大，为90％。60℃时，酶只有50％的活度。当温度大于60℃，活度随着温度的升高而逐渐减弱，但在80-90℃时仍有10％的残留活度。

pH＝5-12，熟化10分钟，芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中大部分淀粉分解酶很稳定。T＝40℃，pH＝8-9时，淀粉分解酶稳定性达到100％。当pH>9时，分解酶的活度随着pH值的升高而降低，而pH<8时，分解酶的活度随着pH值的降低而降低，但是在pH＝5或pH＝12时，仍然有65％的残留活度。

为了进一步证明上述观点，研究了可能阻碍酶分解行为的干扰因子，例如蛋白酶或清洁剂。在pH＝10，温度为50℃条件下，暴露于10ml或10个HPE单位的蛋白酶

(丹麦，Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd；HPE单位参见Tenside 7(1970)，pp.125-132中描述的方法)，和0.1％SDS的混合液中15分钟，酶有74％残留活度。同样条件下(pH＝10，T＝50℃，t＝15分钟)，仅暴露于0.1％ SDS溶液中，酶有98％的残留活度。同样的实验条件下，暴露于3mM乙二胺四乙酸溶液中，酶的残留活度为10％，而暴露于1mM乙二胺四乙酸溶液中，酶的残留活度则为65％。

实施例3

所有的分子生物过程步骤均遵循标准方法，这些方法在手册指南中均有描述，例如，Fritsch和mbrook、aniatis编辑的《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring Harbour实验室出版，纽约，1989年。

为了测定内在的氨基酸序列，实验1中获得的蛋白质用实验2的方法净化，净化后，先用酶使之沉淀，然后用改性的SDS聚丙烯酸凝胶电泳法分离。被聚丙烯酰胺胶体分离下来的部分用tryptically胰蛋白酶原位浸提，产生的缩氨酸用高效液相色谱分离，用Edman裂解法和MELDI-TOF分析法分析。从获得的tryptic片段中选取两段(D1和D6)：

D1：GITAVWIPPAWK 5’-GTN TGG ATH CCN CCN CGNTGG-3’

D6：QGYPSVFYGDYYGIPTH5’-CGD ATN CCN TAN TARTCN CC-3’

相应退化的聚合酶键反应第一层由氨基酸序列(见左边)构造而成。核苷酸序列见右边(N代表任何一种基层；H代表A或C、T；R代表A或G；D代表A或G，T)

将通常准备的芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)的DNA染色体作为培养基，对1000bp大片段进行PCR扩增，为了储存，该PCR片段在载体

(Promega，Madison，Wisconsin，USA)中克隆。

实施例4

用非放射性核素Boehringer Mannheim(Germany：product No.1245832)DIG-High-

标记盒，净化的PCR片段标记方法与探针DNA标记方法相同。对于并发的杂交，芽孢杆菌链A7-7(DSM 12368)中DNA染色体被限制性内切酶Xba 1裂解，并被0.9％琼脂糖胶体分割。DNA被一个真空印迹仪转移到一个阳性尼龙膜上(Roche，Mannheim)。根据DIG-High-

标注仪-Boehringer Mannheim启动器工具包探测仪的指导，用探针DNA对PCR片段的DNA进行杂交和免疫逻辑识别。结果发现在3000-4000大DNA片段探测到目的基因。用0.9％琼脂糖胶体净化这个尺寸的基因片段，然后用pCB56C载体捆扎(见B.Subtilis DB 104；WO 91/02792应用中所描述)用限制性内切酶Xba I和Nhe I切割。经枯草芽孢杆菌链中阴性淀粉酶的转化，用含有淀粉的琼脂平板来识别阳性淀粉酶克隆体。代表性的隔离体携带着必需的插入物。

实施例5

标准链终止法可获得质粒序列。质粒含有大小为2015bp.的插入物。最上层是1545bp.大基因，它组成的酶在现在应用的一序列草案中位于序列号1中。与之对应的是516氨基酸多肽位于序列号2中。氨基酸序列中提取的分子量为59kD，而由31氨基酸裂解的单个缩氨酸而形成的成熟的蛋白质分子量则为55.5Kd。

BLAST方法(S.F.Altschul et al.，Nucl.Acids Res.，25(1997)，pp.3389-3402)给出了序列之间的比较，该方法于2000年3月17日采用，用于描述了α-淀粉酶。蛋白质含量表达为，蛋白质的同聚物占已知蛋白质的71-95％，见表2。

表2

表2列出了与芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)最相似蛋白质的酶同聚物以及其它代表性蛋白质；用蛋白质表达含量的百分比表示。ID指瑞士Prot资料库条目(日内瓦城，瑞士)。

 

有机体	资料库条目	识别(％)
			B.alcalophilusB.alcalophilusB.licheniformisB.amyloliquefaciensB.stearothermophilus	P 19751WO 96/23873P 06278P 00692P 06297	9591727271

图1为代表性蛋白质的组合。所有的蛋白质都是α-酶，所以，芽孢杆菌产生的酶也必须假设是α-酶。这与淀粉降解微生物(实验1)中基因的原始隔离体和携带插入物的质粒(实验4)转化株的淀粉分解活度是一致的。从产物链中可获得的淀粉分解蛋白质量与野生型链(实验2)中蛋白质量成正比。实验4能够产生这种产物链。

实施例6

在标准条件下，用四种不同材料处理棉纤维，这四种材料分别是A(巧克力甜点)，B(含可可粉的燕麦片)，C(含可可和牛奶的燕麦片)以及D(土豆淀粉)，这些材料中的各种清洁剂用流式仪表检测以表征其洗涤性能。实验中，配制固液比为1：12，T＝30℃，纤维清洗30分钟。每升清洗液中清洁剂的量为5.88g。水硬度为16°德氏硬度。

A，B，C中控制清洁剂的基本成分为(用重量百分比表示)：4％烷基苯磺酸盐(钠盐)，4％ C_12-18脂肪酒精硫酸盐(钠盐)，5.5％ C_12-18脂肪酒精x7 EO，1％钠肥皂，11％碳酸钠，2.5％无定型二矽酸钠，20％过硼酸钠四水化合物，5.5％TAED，25％沸石A，4.5％多羧酸酯，0.5％磷酸盐，2.5％粒状泡沫抑止剂，5％硫酸钠，1％蛋白酶颗粒，其余为水、荧光增白剂、香精和盐。不同的实验序列，加入不同淀粉酶以控制清洁剂浓度使其最终浓度为每升清洗液中淀粉分解活度为44TAU。

在TAU中用改进的p-硝基苯麦芽糖测量淀粉分解活度，改进的p-硝基苯麦芽糖的最小单位——葡萄糖被苯亚甲基聚合体包裹，苯亚甲基聚合体被淀粉酶裂解成自由p-硝基苯低聚糖，这种低聚糖反过来与辅助葡糖淀粉酶和α-葡萄糖苷酶作用形成葡萄糖和P-硝基酚。

P-硝基酚的释放量与淀粉酶活度成正比。可用Abott Quick-

 Testkit(Abott Park，Illinois，USA)来测量活度。3分钟以后织物吸附量(在405纳米处)逐渐增加。37℃，对照空白值，吸收值可以在540nm处通过光谱测量检测出来。标准酶的已知活度用作校准(例如

 of Genencor的活度为2900TAU/g)。用作图法来估算单位标准酶液含量每分钟(405纳迷)吸附量差异。

芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)的产物淀粉分解酶与

和

(manufacturer：Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)相比较。用于材料D的清洁剂基本成分相同，只是没有蛋白酶，清洁剂用与材料A、B、C或加入淀粉酶的情况对照。

本实验中，CIELAB方法中纤维的白度用Minolta CR 310清洗前后的测量值与标准的100％白度比较而得。各个实验所得结果差异见表3。列出的值是5次测量的平均值。可作为使用的清洗剂中起清洗效果的淀粉酶所作贡献的直接指标。

表3

从表中可以看出，与其他三个材料的酶相比，材料B中芽孢杆菌A7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶有明显强的洗涤性能。与其他材料相比，尽管材料B没有淀粉分解酶，其测定值较其他三个要好的多，但是其改良洗涤性能优势并不大(在误差范围内)。由于所检验的清洁剂均含有漂白剂，其对野生型酶通常非常敏感，所以这个结果更有说服力。

实施例7

在标准条件下，用材料B(含可可粉的燕麦片)和材料C(含可可粉和一点牛奶的燕麦片)处理棉纤维。如实验1中用另一个流水槽式仪表测定清洁剂的成分(重量百分比表示)：14％ Na烷基苯磺酸钠，6％脂肪酒精硫酸钠，7％ 7x-乙氧基化物C_12-18脂肪酒精，1％肥皂，25％沸石NaA，10％碳酸钠，5％羧酸酯聚合体(

 CP5)，11％三钠柠檬酸二水化合物，4％柠檬酸，1％泡沫抑制剂微粒，1％蛋白酶颗粒，5％硫酸钠，其余为水和盐。不同的实验序列，在这些基本成分中加入不同淀粉酶以使最终浓度为每升清洗液中淀粉分解活度为33.5TAU。与实验1方法相同。芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中淀粉分解酶与

 and 

(manufacturer：NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)比较。每升洗涤液中清洁剂含量为4.45g。

清洗后，洗涤过的纤维白度用前面实验描述的方法测定。表4列出了白度差异。列出的值是5次测量的平均值，可作为使用的清洗剂中起清洗效果的淀粉酶所作贡献的直接指标。

从表中可以看出，与其它条件下的酶比较，B和C材料中，无漂泊清洁剂组分的芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶有较好的洗涤性能。

实施例8

在标准条件下，用两种不同类型商用牛奶可可粉(E和F)处理棉纤维。用实验1中的流水槽仪表测定清洁剂成分。所用的控制清洁剂基本成分与实验2中相同，但没有蛋白酶。不同实验序列，按照实验2方法所示加入不同的淀粉酶。清洁剂使用相同的剂量。

清洗后，用硫酸钡作为100％的标准，与之对比可测出洗过的布的白度。测量用的是Datacolor SF500-2光谱仪，测试条件：460纳米处(紫外光波长)，孔径30mm，选择无光泽表面，光源类型d65，10°，d/8°。测试结果以反射率(％)表示，即和硫酸钡相比的百分数，下面表4列出了具体的起始值。列出的值是5次测量的平均值，可作为使用的清洗剂中起清洗效果的淀粉酶所作贡献的直接指标。

表5

从表中可以看出，与F材料中各试验条件的酶比较，E材料中，芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶的洗涤性能明显要好。

实施例9

导向应用清洗实验中，在标准条件下，用以下材料处理具有坚硬光滑表面的容器：A(燕麦薄片)、B(水中膨胀的燕麦薄片)和C(混合淀粉)，T＝45℃，家用洗碗机( G 575)正常操作程序控制下清洗容器。清洁剂含量为每一清洁循环20g，水的硬度为16德氏硬度。

清洁剂的基本成分(重量百分比)为：55％三磷酸钠(无水)，4％无定型二硒酸钠(无水)，22％碳酸钠，9％过硼酸钠，2％ TAED，2％非离子表面活性剂，1.4％蛋白酶颗粒，其余为水、染料和香精。不同实验序列，按照实验1方法所示将淀粉酶，即

(manufacturer：Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)，或芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中淀粉酶加入到基本清洁剂组分中，以达到每一清洁循环淀粉分解活度为150TAU的有效剂量。

清洗后，用碘酒染色后，通过碘酒与淀粉反应，被材料A的量被赋值，赋值区间为0(不变，例如材料几乎没有被去除)到10(鉴别不到材料，材料计划完全被去除)。材料B和C用重量百分比表示。结果表明，污染的和清洗的容器重量的差异和容器初始重量与未清洗容器重量和其初始的重量差异有关。这种关系便是去除率。

表6列出了实验测定结果，A和B是9次测量的平均值，C是18次测量的平均值。它们可作为使用的清洗剂中起清洗效果的淀粉酶所作贡献的直接指标。

表6

测定结果表明，T＝45℃时，在三种洗碗机清洁剂中，三种材料中芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)α-淀粉酶清洗性能好于所有其它检测的酶。

实施例10

用实验9中所用材料处理具有坚硬光滑表面的容器，温度为55℃清洗容器，清晰条件和清洁剂组分与实验9中相同。

清洗后，利用碘酒与淀粉的反应，材料A的去除量可以用实验4中的数值范围0-10来计算。与实验4不同，材料B和C的去除率用重量百分比表示。表7列出了测定结果，A是9次测试的平均值，B是10次测试的平均值，而C是18次测试的平均值。它们可作为使用的清洗剂中起清洗效果的淀粉酶所作贡献的直接指标。

表7

测定结果表明，设置在T＝55℃时，在三种洗碗机清洁剂中，三种材料中芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)α-淀粉酶清洗性能仍然好于所有其它检测的酶。

附图说明

图1：

根据芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)产物，淀粉分解酶聚合体与三种最相似的酶。

在图1中，

1＝芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中的酶

2＝芽孢杆菌#707(根据Tsukamoto，Kimura，Ishii)中成熟酶

3＝WO 96/23873中SEQ ID位居 第一的酶

4＝WO 96/23873中SEQ ID位居 第二的酶

序列表

<110>汉高两合股份公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien)

<120>从芽孢杆菌A 7-7(DSM 12368)中提取的新型淀粉分解酶

     以及含有该新型淀粉分解酶的洗涤剂和清洗剂

     (Neues amylolytisches Enzym aus Bacillus sp.A 7-7

     (DSM 12368)sowie wasch-und Reinigungsmittel mit

     diesem neuen amylolytischen Enzym)

<130>SCT022689-09

<140>

<141>

<150>DE10036752

<151>2000-07-28

<150>DE10036753

<151>2000-07-28

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1551

<212>DNA

<213>芽孢杆菌A 7-7(Bacillus sp.A 7-7)(DSM 12368)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1551)

<220>

<221>mat_肽

<222>(94)

<400>1

<210>2

<211>516

<212>PRT

<213>芽孢杆菌A 7-7(Bacillus sp.A 7-7)(DSM 12368)

<400>2

Claims (61)

1.一种淀粉分解蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少96％的同一性和至少相同的淀粉分解活性。

2.一种淀粉分解蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少98％的同一性和至少相同的淀粉分解活性。

3.一种淀粉分解蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2中所示第32-516位的氨基酸序列具有至少96％的同一性和至少相同的淀粉分解活性。

4.一种淀粉分解蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2中所示第32-516位的氨基酸序列具有至少98％的同一性和至少相同的淀粉分解活性。

5.一种由核苷酸序列编码的淀粉分解蛋白质，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少87.5％的同一性，所述蛋白质的淀粉分解活性与SEQ ID NO.1编码的蛋白质至少相同。

6.一种由核苷酸序列编码的淀粉分解蛋白质，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，所述蛋白质的淀粉分解活性与SEQ ID NO.1编码的蛋白质至少相同。

7.一种淀粉分解蛋白质，其与SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列在整体上和/或在第32-516位置上具有同一性，和/或与由SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列在整体上和/或在第32-516位置上具有同一性。

8.一种通过缺失突变得到的如权利要求1-7中任一项所述的淀粉分解蛋白质，条件是缺失突变后剩余的同源部分序列与SEQ ID NO：1具有至少87.5％的同一性或与SEQ ID NO：2具有至少96％的同一性。

9.一种通过插入突变得到的淀粉分解蛋白质，或一种至少部分由与权利要求1-8中任一项所述蛋白质或片段具有同一性的蛋白质的淀粉分解活性部分组成的淀粉分解嵌合蛋白，条件是在同源性上归结于序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的区域合起来与权利要求1-7任一项所限定的序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2具有同一性

10.一种权利要求1-9中任一项所述的蛋白质的淀粉分解活性衍生物，通过转化氨基酸的侧链或通过使另一化合物与所述蛋白质共价结合而得以修饰，所述衍生物具有与氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质至少相同的淀粉分解活性。

11.一种淀粉分解蛋白质，其与权利要求1-10中所述蛋白质或衍生物的一种具有至少一个共同的抗原决定簇，并具有与权利要求1-10之一的蛋白质或衍生物至少相同的淀粉分解活性。

12.一种如权利要求1-11中任一项所述的淀粉分解蛋白质，其特征在于它是从微生物中天然获得的。

13.一种如权利要求12中所述的淀粉分解蛋白质，其特征在于所述微生物是革兰氏阳性细菌。

14.一种如权利要求13中所述的淀粉分解蛋白质，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是芽孢杆菌属的一种。

15.一种如权利要求14中所述的淀粉分解蛋白质，其特征在于所述芽孢杆菌是芽孢杆菌A7-7。

16.一种编码淀粉分解蛋白质的核酸，其核苷酸序列与SEQ IDNO.1中所示核苷酸序列具有至少87.5％的同一性，所述蛋白质的淀粉分解活性与SEQ ID NO.1编码的蛋白质至少相同。

17.一种编码淀粉分解蛋白质的核酸，其核苷酸序列与SEQ IDNO.1中所示核苷酸序列具有至少90％的同一性，所述蛋白质的淀粉分解活性与SEQ ID NO.1编码的蛋白质至少相同。

18.一种编码淀粉分解蛋白质的核酸，其核苷酸序列与SEQ IDNO.1中所示核苷酸序列具有100％的同一性。

19.一种核酸，其编码权利要求1-15中所述蛋白质的一种。

20.一种天然微生物，其形成权利要求1-15中所述蛋白质的一种或包含编码这些蛋白质的核酸。

21.一种如权利要求20所述的天然微生物，其特征在于它是细菌。

22.一种如权利要求21所述的天然微生物，其特征在于所述细菌是革兰氏阳性细菌。

23.一种如权利要求22所述的天然微生物，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是芽孢杆菌属的一种。

24.一种载体，其包含根据权利要求16-19所述的核酸区域或编码权利要求1-15中所述蛋白质的一种的核酸区域。

25.一种如权利要求24所述的载体，其是克隆载体。

26.一种如权利要求24所述的载体，其是表达载体。

27.一种细胞，其包含权利要求24-26中任一项所述的载体。

28.一种宿主细胞，其表达权利要求1-15中所述蛋白质的一种或能受激后表达该蛋白质或衍生物。

29.一种如权利要求28所述的宿主细胞，其特征在于它是细菌。

30.一种如权利要求28或29所述的宿主细胞，其特征在于它是芽孢杆菌属的细菌。

31.一种如权利要求28或29所述的宿主细胞，其特征在于它是革兰氏阴性细菌。

32.一种如权利要求31所述的宿主细胞，其特征在于它属于埃希氏属(genus Escherichia)。

33.一种如权利要求28中所述的宿主细胞，其特征在于它是真核细胞。

34.一种用来生产权利要求1-15中任一项所述蛋白质的方法，其使用权利要求16-19中任一项所述的核酸和/或使用权利要求24-26中任一项所述的载体和/或使用权利要求28-33中任一项所述的宿主细胞或使用天然形成蛋白质或衍生物的细胞。

35.一种洗涤剂或清洗剂，其特征在于它包含权利要求1-15中任一项所述的蛋白质。

36.一种如权利要求35中所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于它包含按重量计为0.000001-5％的淀粉分解蛋白质。

37.一种如权利要求35或36中所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于它另包含一种或多种其它淀粉分解蛋白质。

38.一种如权利要求35或36所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于它另包含其它酶。

39.一种如权利要求35或36所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于它由一种以上的相组成。

40.一种如权利要求35或36所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于它是固态的，以及在于至少两种不同的粉末或颗粒以整体松散的形式相互混合存在。

41.一种如权利要求39中所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于至少两种固相相互连接。

42.一种如权利要求35或36所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于相的至少一种包含淀粉酶敏感的物质，或至少部分被该物质所包围或包被。

43.一种如权利要求35或36所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于它是液体、胶状或浆状，而且存在的蛋白和/或存在的酶的至少一种和/或存在的其它成分的至少一种独自或与其它成分一起被封装在微胶囊中。

44.一种如权利要求35或36所述的洗涤剂或清洗剂，其特征在于淀粉分解活性由洗涤剂/清洗剂其他成分中的一种进行修饰。

45.一种清洗织物或硬表面的方法，其特征在于权利要求1-15中任一项所述的淀粉分解蛋白质或衍生物在至少一个方法步骤中变成活性的。

46.一种清洗织物或硬表面的方法，其特征在于将权利要求35-44中任一项所述的洗涤剂/清洗剂用于至少一个方法步骤中。

47.一种如权利要求45或46中所述的方法，其特征在于淀粉分解蛋白质在所述方法步骤中的用量每次为0.01-200mg。

48.一种权利要求1-15中任一项所述的淀粉分解蛋白质的用途，其独自或与至少一种其它清洗剂或对清洗织物或硬表面的清洗效果起支持作用的活性物质一起使用。

49.一种权利要求35-44中任一项所述的洗涤剂的用途，其用于清洗织物或硬表面。

50.一种权利要求48或49所述的用途，其特征在于淀粉分解蛋白质的用量每次为0.01-200mg。

51.一种权利要求1-15中任一项所述的淀粉分解蛋白质的用途，其独自或与至少一种其它清洗剂或在洗涤剂或清洗剂中对清洗效果起支持作用的活性物质一起使用，所述洗涤剂或清洗剂由一种以上的相组成，用于激活这些或其它相。

52.一种权利要求1-15中任一项所述的淀粉分解蛋白质的用途，其独自或与至少一种其它清洗剂或在洗涤剂或清洗剂中对清洗效果起支持作用的活性物质一起使用，所述洗涤剂或清洗剂含有封装在胶囊内的成分，用于将成分从胶囊中释放出来。

53.一种权利要求1-15中任一项所述蛋白质的用途，其用于在织物生产过程中对原料或中间产物进行处理。

54.一种液化淀粉的方法，特别用来生产乙醇，其特征在于其中使用权利要求1-15中任一项所述的蛋白质。

55.一种权利要求1-15中任一项所述蛋白质的用途，其用来生产直链和/或短链寡糖。

56.一种权利要求1-15中任一项所述蛋白质的用途，其用来水解环糊精。

57.一种权利要求1-15中任一项所述蛋白质的用途，其用于从多糖载体或环糊精中释放低分子量化合物。

58.一种权利要求1-15中任一项所述蛋白质的用途，其用来生产食品和/或食品成分。

59.一种权利要求1-15中任一项所述蛋白质的用途，其用来生产动物饲料和/或动物饲料成分。

60.一种权利要求1-15中任一项所述蛋白质的用途，其用来溶解含淀粉的粘合键。

61.一种短暂的键合方法，其特征在于其中使用权利要求1-15中任一项所述的蛋白质。

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