ES2359381T3 - Variantes de pectato liasa. - Google Patents
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Abstract
Una variante de una enzima parental con actividad de pectato liasa, EC 4.2.2.2, teniendo la variante la estabilidad detergente mejorada en comparación con dicha enzima parental, y comprendiendo la variante una alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en el número de posiciones: 5, 9, 11, 26, 28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86, 87, 91, 99, 105, 106, 107, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136, 139, 140, 141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 193, 194, 196, 199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234, 235, 237, 251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378, 381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 393 y 397, donde a) la o las alteraciones son independientemente i) una inserción de un aminoácido debajo del aminoácido que ocupa la posición, ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, o iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente; b) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 2: c) la enzima parental es la pectato liasa mostrada en SEC ID N.º 2 o una pectato liasa con al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2 y d) la variante tiene actividad de pectato liasa.
Description
Variantes de pectato liasa.
La presente invención se refiere a variantes de
pectato liasa que muestran alteraciones en relación a una enzima
parental que muestra la actividad de pectato liasa como su actividad
enzimática principal; a un método para producir tales enzimas y a
métodos para usar tales enzimas en las industrias de tratamiento de
fibra de celulosa, de detergentes y textiles. En comparación con la
enzima parental, las variantes de pectato liasa de la presente
invención pueden mostrar estabilidad mejorada en detergentes.
Lo polímeros de pectina son ingredientes
importantes de las paredes celulares vegetales. La pectina es un
heteropolisacárido con un esqueleto compuesto de forma alternante
por homogalacturonano (regiones homogéneas) y ramnogalacturonano
(regiones velludas). Las regiones homogéneas son polímeros lineales
de ácido alfa-D-galacturónico
unidos por enlaces 1,4. Los residuos de ácido galacturónicos se
pueden metil-esterificar en el grupo carboxilo a un
grado variable, normalmente en una forma no aleatoria con bloques de
ácido poligalacturónico que son metil-esterificados
completamente.
Las enzimas pectolíticas (pectinasas) se pueden
clasificar según su sustrato preferencial, pectina altamente
metil-esterificada o pectina
metil-esterificada baja y ácido poligalacturónico
(pectato) y su mecanismo de reacción,
beta-eliminación o hidrólisis. La pectinasas pueden
ser principalmente endoactivas, cortando el polímero en sitios al
azar dentro de la cadena para dar una mezcla de oligómeros, o pueden
ser exoactivas, atacando desde un extremo del polímero y
produciendo monómeros o dímeros. Diferentes actividades de pectinasa
que actúa sobre las regiones homogéneas de pectina se incluyen en
la clasificación de enzimas proporcionada por la Nomeclatura
Enzimática (1992) tal como pectato liasa (EC 4.2.2.2), pectina liasa
(EC 4.2.2.10), poligalacturonasa (EC 3.2.1.15),
exo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.67),
exo-poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) y
exo-poli-alfa-galacturonosidasa
(EC 3.2.1.82).
Las pectato liasas han sido clonadas a partir de
distintos géneros bacterianos tales como Erwinia, Pseudomonas,
Klebsiella y Xanthomonas. También se ha descrito la clonación de una
pectato liasa a partir de Bacillus subtilis (Nassen et
al. (1993) FEBS 335:319-326) y Bacillus
sp. YA-14 (Kim et al. (1994) Biosci.
Biotech. Biochem. 58:947-949).
Las pectato liasas generalmente se caracterizan
por un pH alcalino óptimo y un requisito absoluto de cationes
bivalentes, siendo Ca^{2+} el más estimulador.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una variante de enzima degradadora de la pared celular,
especialmente, una variante de enzima de pectato liasa, que muestra
rendimiento mejorado por encima de la pectato liasa parental cuando
se aplica, por ejemplo, en detergentes o en procesos de la industria
textil.
La invención es tal y como se define en las
reivindicaciones. Los inventores han detectado ahora que
determinadas sustituciones de aminoácido de enzimas degradadoras de
la pared celular, especialmente las pectato liasas con una
estructura que incluye una hélice beta, producen variantes
enzimáticas con rendimiento mejorado en la gama de pH alcalino o
neutro en comparación con la enzima parental. Las variantes de
pectato liasa de la invención, cuando se las usa en composiciones
de detergentes, han mejorado la estabilidad de almacenamiento, es
decir, menor sensibilidad a los detergentes.
Así, en un primer aspecto, la presente invención
se refiere a una variante de pectato liasa que comprende
alteraciones en una o más posiciones seleccionadas del grupo que
consiste en el número de posiciones:
5, 9, 11, 26, 28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86,
87, 91, 99, 105, 106, 107, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136,
139, 140, 141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 193,
194, 196, 199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234,
235, 237, 251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302,
303, 305, 307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334,
335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378,
381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 393 y 397, donde las
alteraciones son independientemente
(i) una inserción de un aminoácido abajo del
aminoácido que ocupa la posición,
(ii) una deleción del aminoácido que ocupa la
posición, o
(iii) una sustitución del aminoácido que ocupa
la posición con un aminoácido diferente,
y caracterizadas por el hecho de que cada
posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos
de la pectato liasa con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2,
y donde la enzima parental es la pectato liasa mostrada
en SEC ID N.º 2 o una pectato liasa con al menos 95% de identidad con la secuencia de
en SEC ID N.º 2 o una pectato liasa con al menos 95% de identidad con la secuencia de
\hbox{aminoácidos de SEC ID N.º 2.}
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la
variante de pectato liasa.
En un tercer aspecto de la invención, se
proporciona un vector de expresión.
En un cuarto aspecto de la presente invención,
se proporciona una célula huésped microbiana transformada con el
vector de expresión anteriormente mencionado.
En un quinto aspecto de la presente invención,
se proporciona un método para mejorar la estabilidad del detergente
de una pectato liasa que comprende la alteración de uno o más
aminoácidos.
En un sexto aspecto de la invención, se
proporcionan métodos para producir una variante de pectato liasa
según la invención. Los mismos comprenden el cultivo de una célula
en la cual se ha introducido un vector de expresión como se
describe más arriba, por el cual dicha célula expresa la variante
codificada por la secuencia de ácidos nucleicos y la recuperación
de la variante de pectato liasa.
La variante de pectato liasa de la invención es
útil para el tratamiento de material celulósico, especialmente,
fibra con celulosa, hilo, tela tejida o no tejida, tratamiento de
pastas de papel de producción de papel mecánicas o desperdicios de
papel para reciclaje, y para el enriado de fibras. El tratamiento
puede llevarse a cabo durante el tratamiento de material celulósico
en un material preparado para la producción de prendas o producción
de tejidos, por ejemplo, en el paso de desencolado o descrudado; o
durante el lavado industrial o doméstico de tales tejidos o
prendas.
Por consiguiente, en otros aspectos, la presente
invención se refiere a una composición de detergente que comprende
una variante de pectato liasa con considerable actividad de
degradación de la pared celular. También se refiere al uso de la
variante de pectato liasa de la invención para el tratamiento, por
ejemplo, de la limpieza de fibras con celulosa, hilo, tela tejida o
no tejida.
Además, aspectos adicionales de la invención se
refieren a una composición enzimática que comprende la variante de
pectato liasa de la invención en combinación con otras enzimas, y a
una composición de detergente o de limpieza, preferiblemente, una
composición de lavado de platos o de lavandería, comprendiendo la
variante de pectato liasa de la invención.
La variante de pectato liasa de la invención es
muy eficaz para el uso en un proceso de descrudado enzimático en la
preparación de material celulósico, por ejemplo, para una respuesta
apropiada en operaciones de tinte posteriores.
Otro aspecto de la invención se refiere al
tratamiento de vino y zumo. La enzima o preparación enzimática se
puede utilizar en el tratamiento de trituración de frutas y verduras
para mejorar la capacidad extractiva y de degradación de la
trituración.
Además, un aspecto de la invención es la
aplicación como un aditivo de pienso. Cuando se agrega a pienso con
material vegetal de soja, semilla de colza, lupín, etc., la variante
de pectato liasa mejora significativamente la descomposición in
vivo del material de la pared celular vegetal, por lo que se
consigue una mejor utilización de los nutrientes vegetales por
parte del animal.
Antes de describir esta invención con más
detalle, se definirán primeramente los siguientes términos y
convenciones.
El término "enzima de tipo salvaje" denota
una enzima que es endógena a un microorganismo de origen natural
tal como un hongo o una bacteria encontrada en la naturaleza.
El término "enzima parental", según se
utiliza en este caso, significa una enzima en la que las
modificaciones se realizan para producir las variantes enzimáticas
de la invención. Una enzima parental puede ser una enzima aislada
de una fuente natural, o una enzima en la cual las modificaciones
precedentes se han hecho al tiempo que se retuvo la actividad
característica de la enzima en cuestión. La pectato liasa
progenitora de la invención puede ser un pectato liasa de tipo
salvaje.
El término "variante enzimática" significa
una enzima que comprende diferencias en su secuencia de aminoácidos
con la de la enzima parental. Las diferencias comprenden
sustituciones, deleciones y/o inserciones en comparación con la
enzima parental.
El término "ortólogo" (u "homólogo de
especie") denota un polipéptido o una proteína obtenida a partir
de una especie que tiene homología con un polipéptido análogo o
proteína de una especie diferente.
El término "parálogo" denota un polipéptido
o una proteína obtenida a partir de una especie dada que tiene
homología con un polipéptido o proteína diferente de esa misma
especie.
El término "vector de expresión" denota una
molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que
codifica un polipéptido de interés operativamente vinculado a
segmentos adicionales que propician su transcripción. Tales
segmentos adicionales pueden incluir secuencias de promotor y
terminador, y pueden opcionalmente incluir uno o más orígenes de
replicación, uno o más marcadores seleccionables, un intensificador,
una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión
generalmente se derivan de ADN plásmido o vírico, o pueden contener
elementos de ambos. El vector de expresión de la invención puede ser
un vector de expresión que sea convenientemente sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
frecuentemente dependerá de la célula huésped en la cual se
introducirá el vector. Así, el vector puede ser un vector de
replicación autónoma, es decir, un vector existente como una
entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido.
Alternativamente, el vector puede ser uno que, al ser introducido en
una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y
se replica junto con el/los cromosoma/s en que ha sido
integrado.
El término "expresado recombinante" o
"expresado de manera recombinante" utilizado en el presente en
relación con la expresión de un polipéptido o una proteína se define
según la definición estándar en la técnica. La expresión
recombinante de una proteína generalmente es realizada usando un
vector de expresión como se describe inmediatamente arriba.
El término "aislado", cuando se aplica a
una molécula polinucleótida, denota que el polinucleótido ha sido
eliminado de su ambiente genético natural y está, de esa manera,
libre de otras secuencias de codificación indeseadas o extrañas, y
está en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de
producción de proteínas creadas genéticamente. Tales moléculas
aisladas son aquellas que se separan de su entorno natural e
incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de
la presente invención están libres de otros genes con los cuales se
asocian comúnmente, pero pueden incluir regiones no codificantes 5'
y 3' de origen natural tales como promotores y terminadores. La
identificación de regiones asociadas será evidente para cualquier
experto con conocimientos básicos en la materia (véase, por ejemplo,
Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985). El término
"un polinucleótido aislado" puede alternativamente ser
denominado "un polinucleótido clonado".
Cuando se aplica a una proteína o un
polipéptido, el término "aislado" indica que la proteína se
encuentra en una condición diferente de su entorno nativo. En una
forma preferida, la proteína aislada está sustancialmente libre de
otras proteínas, particularmente otras proteínas homólogas (es
decir, "impurezas homólogas" (véase a continuación)). Se
prefiere proporcionar la proteína en una forma mayor de 40% de
pureza, más preferiblemente una forma mayor de 60% de pureza.
Incluso más preferiblemente, se prefiere proporcionar la proteína en
una forma altamente purificada, es decir, más que 80% de pureza,
más preferiblemente más que 95% de pureza, e incluso más
preferiblemente más que 99% de pureza, según se determine por
SDS-PAGE.
El término "proteína/polipéptido aislado"
puede denominarse de forma alternativa "proteína/polipéptido
purificado".
El término "impurezas homologas" significa
cualquier impureza (p. ej. otros polipéptidos aparte del
polipéptido de la invención) que se origina de la célula homologa de
la cual se obtiene la enzima de la invención originalmente.
El término "obtenido a partir de" según se
utiliza en este caso en relación con una fuente microbiana
específica, significa que el polinucleótido y/o el polipéptido es
producido por la fuente específica, o por una célula en la que se
ha insertado un gen de la fuente.
El término "vinculado operativamente",
cuando se refiere a segmentos de ADN, denota que los segmentos
están dispuestos de modo que funcionen en concierto para sus
objetivos determinados, por ejemplo, la transcripción se inicia en
el promotor y procede a través del segmento de codificación al
terminador.
El término "polinucleótido" denota un
polímero monocatenario o bicatenario de bases de
desoxirribonucleótido o ribonucleótido leído del extremo 5' al 3'.
Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y se pueden aislar de
fuentes naturales, sintetizar in vitro u obtener a partir de
una combinación de moléculas sintéticas y naturales.
El término "complementos de moléculas de
polinucleótido" denota moléculas de polinucleótidos con una
secuencia de base complementaria y orientación inversa en
comparación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la
secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.
La expresión "secuencia de nucleótidos
degenerados" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno
o más codones degenerados (en comparación con una molécula de
polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los
codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos,
pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, tripletes
GAU y GAC codifican cada uno Asp).
El término "promotor" denota una porción de
un gen que contiene secuencias de ADN que permiten la unión de
polimerasa de ARN e iniciación de la transcripción. Se encuentran
comúnmente, pero no siempre, secuencias de promotor en las regiones
no codificantes 5' de genes.
El término "secuencia de señal secretora"
es una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido
secretor") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige
el polipéptido mayor a través de una trayectoria secretora de una
célula en la que se sintetiza. El péptido mayor se divide comúnmente
para separar el péptido secretor durante el tránsito a través de la
trayectoria secretora.
El término "pectina" denota pectato, ácido
poligalacturónico y pectina que se puede esterificar a un grado
inferior o superior.
El término "pectinasa" denota una enzima de
pectinasa definida según la técnica donde las pectinasas son un
grupo de enzimas que disocian enlaces glicosídicos de sustancias
pécticas principalmente
poli(1,4-alfa-D-galacturonido
y sus derivados (véase la referencia Sakai et al., Pectin,
pectinase and protopectinase: production, properties and
applications, págs. 213-294 en: Advances in Applied
Microbiology vol: 39, 1993).
Preferiblemente, una pectinasa de la invención
es una enzima de pectinasa que cataliza la escisión aleatoria de
enlaces alfa-1,4-glicosídicos en
ácido péctico también llamado ácido poligalacturónico por
transeliminación tal como la poligalacturonato liasa de clase
enzimática (EC 4,2,2,2) (PGL) también conocida como
poli(1,4-alfa-D-galacturonida)
liasa conocida también como pectato liasa.
El término "termoestabilidad" o
"estabilidad térmica" significa la estabilidad de la proteína
ante la influencia térmica. Todas las proteínas enzimáticas se
desestabilizan y finalmente se degradan con el aumento de la
temperatura. Cada proteína enzimática tiene una determinada gama de
temperatura en la cual la proteína es estable y retiene su
actividad enzimática. Termoestabilidad aumentada significa que la
proteína enzimática siempre retiene su actividad enzimática y/o
muestra una actividad relativa más alta a temperaturas
aumentadas.
El término "estabilidad de detergente" o
"estabilidad de almacenamiento" significa la estabilidad de la
proteína en una formulación con detergentes, por ejemplo,
tensioactivos aniónicos. Los tensioactivos aniónicos se
caracterizan por la combinación de un grupo aniónico y una cola
hidrofóbica. Cuando se une a la proteína, un residuo cargado
positivamente como lisina o arginina, y un área hidrofóbica son así
posibles puntos de interacción. De forma similar, la dinámica de
las regiones particularmente flexibles es la abertura para la
accesibilidad a aminoácidos normalmente aplastados en el interior de
la proteína. Estos residuos son típicamente hidrofóbicos y son, por
tanto, atractivos para la cola del tensioactivo. Una interacción
química entre la enzima y el tensioactivo con gran certeza dejarán
la enzima inactiva. Por tanto, la estabilidad de almacenamiento o
de detergente significa que a una cierta concentración de detergente
y temperatura, se retendrá una mayor actividad enzimática después
de un periodo de tiempo determinado (actividad residual
superior).
Por consiguiente, la termoestabilidad y la
estabilidad de detergente son dos características independientes de
una proteína o una enzima.
Las variantes de pectato liasa de la invención
con estabilidad de detergente mejorada pueden mostrar al menos 120%
(preferiblemente al menos 140%, más preferiblemente al menos 160%,
incluso más preferiblemente al menos 180%, incluso más
preferiblemente al menos 200%, de forma más preferible al menos 250%
y en particular al menos 300%) de actividad residual en comparación
con la pectato liasa parental, cuando son sometidas al método de
análisis descrito en el ejemplo 1.
En el contexto de esta invención, se emplea una
numeración específica de las posiciones de residuos de aminoácidos
en las enzimas degradadoras de la pared celular, especialmente, las
enzimas de pectato liasa. Por ejemplo, al alinear las secuencias de
aminoácidos de pectato liasas conocidas es posible asignar sin
ambigüedad un número de posición de aminoácido en cualquier residuo
de aminoácido en cualquier enzima de pectato liasa, si se conoce su
secuencia de aminoácidos.
Usando el sistema de numeración originado a
partir de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa
codificada por el polinucleótido presente en el plásmido de la cepa
de Bacillus subtilis DDSM 14218, descrito en SEC ID N.º 2,
alineado con la secuencia de aminoácidos de otras pectato liasas, es
posible indicar la posición de un residuo de aminoácido en una
enzima de pectato liasa sin ambigüedad.
Al describir las distintas variantes de enzima
degradadoras de la pared celular contempladas o producidas según
esta invención, las siguientes nomenclaturas se adaptan para
facilidad de referencia:
Por consiguiente, la sustitución de serina por
isoleucina en la posición 72 se designa como S72l.
Las mutaciones múltiples son separación por
marcas de adición ("+"), por ejemplo, M169l + F198V,
representando mutaciones en las posiciones 169 y 198 sustituyendo
la metionina (M) con isoleucina (I), y fenilalanina (F) con valina
(V), respectivamente.
Una deleción de glicina en la posición 195
estará indicada por:
- Gly195* o G195*
- Correspondientemente, la deleción de más de un residuo de aminoácido, tal como la deleción de glicina y leucina en las posiciones 195 y 196 será designada
- Gly195*+Leu196* o G195*+L196*
La inserción de un residuo de aminoácido
adicional tal como, por ejemplo, una lisina después de G195 está
indicada por:
- Glyl95GlyLys o G195GK;
- o, cuando se inserta más de un residuo de aminoácido, tal como, por ejemplo, un Lys y Ala después de G195, esto se indicará como:
- Glyl95GlyLysAla o G195GKA
En tales casos, el/los residuo/s de aminoácido
insertado/s se numeran por la adición de letras minúsculas al
número de posición del residuo de aminoácido que precede al residuo
o los residuos de aminoácido insertado/s. En el ejemplo anterior,
entonces, se cambiarían las secuencias 194 a 196 de:
- 194 195 196
- A - G - L
- a 194 195 195a 195b 196
- A - G - K - A - L
En casos en los cuales es insertado un residuo
de aminoácido idéntico al residuo de aminoácido existente, está
claro que se produce degeneración en la nomenclatura. Si, por
ejemplo, una glicina es insertada después de la glicina en el
ejemplo anterior, esto se indicaría por G195GG. El mismo cambio real
podría también indicarse como A194AG para el cambio de:
- 194 195 196
- A - G - L
- a
- 194 195 195a 196
- A - G - G - L
- o 194 194a 195 196
Tales ejemplos serán evidentes para el experto
en la materia y la indicación G195GG y las indicaciones
correspondientes para este tipo de inserciones, de este modo, están
destinadas a comprender tales indicaciones de degeneración
equivalentes.
Todas las posiciones a las que se hace
referencia en este caso por numeración de pectato liasas de
refieren, a menos que se indique de otro modo, a la numeración
anteriormente descrita, y se determinan en relación a la secuencia
de aminoácidos de la pectato liasa codificada por el polinucleótido
presente en el plásmido de la cepa de Bacillus subtilis DSM
14218, descrita en SEC ID N.º 2.
La presente invención se refiere a variantes de
una pectato liasa parental (EC 4.2.2.2). Las variantes tienen
mejores propiedades en comparación con la enzima parental,
especialmente, la estabilidad de detergente o estabilidad de
almacenamiento en composiciones de detergentes es mejor.
\newpage
En el proceso de mejoramiento de las propiedades
de la pectato liasa parental, los inventores detectaron que las
alteraciones de aminoácidos específicos en el esqueleto de
polipéptido progenitor alterarían significativamente la estabilidad
de detergente de la enzima.
Dentro de las formas de realización preferidas
de la invención, se contempla que un polinucleótido que codifica la
enzima parental de la variante de pectato liasa de la invención
hibridará a regiones de tamaño similar del polinucleótido
correspondiente de SEC ID N.º1, o una secuencia complementaria a
ella, bajo condiciones de astringencia al menos media,
preferiblemente condiciones de astringencia altas.
En particular, los polinucleótidos de la
invención hibridarán a una sonda de ADN bicatenario desnaturalizada
que comprende la secuencia de variante completa correspondiente a
las posiciones 1-1200 de SEC ID N.º 1 con
alteraciones de secuencia apropiadas correspondientes a
sustituciones de aminoácido reales hechas o cualquier sonda que
comprende una subsecuencia variante de la misma con una longitud de
al menos aproximadamente 100 pares de bases bajo condiciones de
astringencia al menos media, pero preferiblemente con condiciones de
astringencia alta como se describe en detalle más abajo. Las
condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridación
a astringencia media o alta entre una sonda de nucleótido y una
secuencia de ADN o ARN homóloga implica prerremojo del filtro con
los fragmentos de ADN o ARN para que hibriden en 5 x SSC (sodio
cloruro/sodio citrato, Sambrook et al. 1989) durante 10
min, y prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x
solución del Denhardt (Sambrook et al. 1989), SDS al 0,5% y
100 microgramo/ml de ADN de esperma del salmón desnaturalizado y
sometido a un baño de ultrasonido (Sambrook et al. 1989),
seguido de hibridación en la misma solución con una concentración
de 10 ng/ml de una sonda de cebado aleatorio (Feinberg, A. P. y
Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13),
etiquetada con 32P dCTP (actividad específica superior a 1 x 109
cpm/microgramo) durante 12 horas a aproximadamente 45 grados
Celsius. El filtro luego es lavado dos veces durante 30 minutos en 2
x SSC, SDS al 0,5% al menos 60 grados Celsius (astringencia media),
todavía más preferiblemente al menos 65 grados Celsius (astringencia
media/alta), incluso más preferiblemente al menos 70 grados Celsius
(astringencia alta), e incluso más preferiblemente al menos 75
grados Celsius (astringencia altísima).
La moléculas a las que la sonda de
oligonucleótidos hibridiza bajo estas condiciones se detectan usando
una película radiográfica.
Como se observó anteriormente, los
polinucleótidos que codifican las variantes de pectato liasa de la
presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para aislamiento
ADN y ARN se conocen en la técnica. El ADN y el ARN que codifican
genes de interés se pueden clonar en Bancos de genes o bibliotecas
de ADN mediante métodos conocidos en la técnica.
Lo polipéptidos de codificación de
polinucleótidos con actividad de pectato liasa de la invención luego
son identificados y aislados por, por ejemplo, hibridación o PCR.
Las especies homólogas de la pectato liasa parental usada en la
preparación de las variantes de pectato liasa de la invención pueden
clonarse usando información y composiciones proporcionadas por la
presente invención en combinación con técnicas de clonación
convencionales. Por ejemplo, el ADN puede clonarse usando ADN
cromosómico obtenido a partir de un tipo de célula que expresa la
proteína. Fuentes adecuadas de ADN pueden identificarse evaluando
manchas del norte con sondas diseñadas a partir de las secuencias
descritas aquí. Luego se prepara una biblioteca a partir de ADN
cromosómico de una línea celular positiva. Un ADN que codifica un
polipéptido con actividad de pectato liasa de la invención luego
puede ser aislado por una variedad de métodos, tal como sonda con un
ADN parcial o completo o con uno o más conjuntos de sondas
degeneradas según las secuencias descritas. Un ADN también puede
clonarse usando la reacción en cadena de polimerasa, o PCR (Mullis,
patente estadounidense 4.683.202), usando cebadores diseñados de
las secuencias descritas aquí. Dentro de un método adicional, la
biblioteca de ADN puede utilizarse para transformar o transfectar
células huéspedes, y la expresión del ADN de interés se puede
detectar con un anticuerpo (policlonal o monoclonal) aumentado
frente a la pectato liasa clonada de la cepa de B. subtilis
cepa depositada como IFO 3134, o por una prueba de actividad
relacionada con un polipéptido con actividad de pectato liasa.
También pueden aplicarse técnicas similares al aislamiento de clones
genómicos.
La parte de codificación de polipéptido de la
secuencia de ADN clonó un plásmido presente en Bacillus
subtilis DSM 14218 y/o una secuencia de ADN análoga de la
invención se puede clonar a partir de una cepa de especies
bacteriana Bacillus subtilis, preferiblemente la cepa
depositada como IFO 3134, produciendo la enzima con actividad de
degradación de pectina u otro o organismo relacionado como se
describe en este caso.
Alternativamente, la secuencia análoga puede ser
construida basándose en la secuencia de ADN obtenible de un
plásmido presente en Bacillus subtilis DSM 14218, por
ejemplo, ser una subsecuencia de la misma y/o por introducción de
sustituciones de nucleótido que no dan lugar a otra secuencia de
aminoácidos de la pectato liasa codificada por la secuencia de ADN,
pero que corresponde al uso de codón del organismo huésped
destinado a la producción de la enzima, o por introducción de
sustituciones de nucleótido que pueden dar lugar a una secuencia de
aminoácidos diferente (es decir, una variante de la enzima
degradadora de la pectina de la invención).
La secuencia de aminoácidos n.º
1-399 de SEC ID N.º 2 es una secuencia de pectato
liasa madura correspondiente a una pectato liasa de tipo salvaje de
la especie Bacillus subtilis depositada como IFO 3134
(Institute for Fermentation, Osaka, 1 7-85, J
usohonmachi 2-chome, Yodagawa-ku,
Osaka 532-8686, Japón).
La presente invención también proporciona
variantes de pectato liasa de polipéptidos que son sustancialmente
homólogos a los polipéptidos de SEC ID N.º 2 y sus homólogos de
especies (parálogos u ortólogos). El término "sustancialmente
homólogo" se utiliza en este caso para indicar polipéptidos con
70%, más preferiblemente al menos 85%, e incluso más
preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia a la
secuencia mostrada en SEC ID N.º 2 o sus ortólogos o parálogos.
Tales polipéptidos serán más preferiblemente al menos 95% idénticos,
y de forma más preferible 98% o más idénticos a la secuencia
mostrada en SEC ID N.º 2 o sus ortólogos o parálogos. La identidad
de la secuencia de porcentaje se determina por métodos
convencionales, mediante programas informáticos conocidos en la
técnica tales como GAP proporcionados en el paquete del programa GCG
(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, agosto de
1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, EE. UU. 53711) según se describe en Needleman, S.B. y
Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-4531.
443-4531.
GAP se usa con los siguientes ajustes para
comparación de secuencias polipeptídicas: penalización de creación
GAP de 3,0 y penalización de extensión de GAP de 0,1.
La identidad de secuencias de moléculas
polinucleótidas se determina por métodos similares usando GAP con
los siguientes ajustes para comparación de secuencias de ADN:
penalización de creación GAP de 5,0 y penalización de extensión de
GAP de 0,3.
La pectato liasa parental es preferiblemente
derivada de un microorganismo, preferiblemente de una bacteria, una
arquea o un hongo, especialmente a partir de una bacteria tal como
una bacteria que pertenece a Bacillus, preferiblemente a una
cepa Bacillus alkalofilic que puede ser seleccionada del
grupo que consiste en la especies Bacillus subtilis y
especies Bacillus altamente relacionadas en las que todas las
especies son preferiblemente al menos 95%, incluso más
preferiblemente al menos 98%, homólogas a Bacillus subtilis
según secuencias de ADNR 16s alineadas. Las pectato liasas
progenitoras de la invención son sustancialmente homólogas a los
polipéptidos de SEC ID N.º 2 y sus homólogos de especies (parálogos
u ortólogos). El término "sustancialmente homólogo" se utiliza
en este caso para indicar polipéptidos con 70%, más preferiblemente
al menos 85%, e incluso más preferiblemente al menos 90%, de
identidad de secuencia a la secuencia mostrada en SEC ID N.º 2 o
sus ortólogos o parálogos. Tales polipéptidos serán más
preferiblemente al menos 95% idénticos, y de forma más preferible
98% o más idéntico a la secuencia mostrada en SEC ID N.º 2 o sus
ortólogos o parálogos.
La proteínas parentales sustancialmente
homólogas y los polipéptidos se caracterizan por tener una o más
sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácido. Estos cambios
son preferiblemente de una naturaleza menor, es decir,
sustituciones conservadoras de aminoácido (véase la tabla 1) y otras
sustituciones que no afectan significativamente el pliegue o la
actividad de la proteína o el polipéptido; deleciones pequeñas,
típicamente de una a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas
extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de
metionina aminoterminal, un pequeño péptido de enlace de hasta
20-25 residuos aproximadamente, o una pequeña
extensión que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad),
tal como un tracto de polihistidina, proteína A (Nilsson et
al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods
Enzymol. 198:3, 1991. Véase en general Ford et al., Protein
Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los
ADNs que codifican las etiquetas de afinidad están disponibles de
proveedores comerciales (p. ej., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ;
New England Biolabs, Beverly, MA).
No obstante, aunque los cambios anteriormente
descritos son preferiblemente de una naturaleza menor, tales
cambios también pueden ser de una naturaleza más grande tales como
fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más
como extensiones tanto amino como carboxilo terminales.
Además de los 20 aminoácidos estándares, los
aminoácidos no estándares (tales como
4-hidroxiprolina,
6-N-metil lisina, ácido
2-aminoisobutírico, isovalina y
a-metil serina) se pueden sustituir por residuos de
aminoácidos de un polipéptido de tipo salvaje. Un número limitado de
aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no se codifican por
el código genético y aminoácidos no naturales se pueden sustituir
por residuos de aminoácidos. Los "aminoácidos no naturales"
han sido modificados después de la síntesis de proteína y/o tienen
una estructura química en sus cadena/s lateral/es diferente de
aquella de los aminoácidos estándares. Los aminoácidos no naturales
pueden ser sintetizados químicamente, o preferiblemente, están
disponibles comercialmente e incluyen ácido pipecólico, ácido
tiazolidina carboxílico, dehidroprolina, 3- y
4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.
Aminoácidos esenciales en el polipéptido progenitor pueden ser
identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tal
como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de
alanina (Cunningham y Wells, Science 244:
1081-1085, 1989). En esta última técnica, mutaciones
únicas de la alanina se introducen a cada residuo en la molécula, y
las moléculas mutantes resultantes se evalúan por su actividad
biológica (es decir, actividad de pectato liasa) para identificar
residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la
molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem.
271:4699-4708, 1996. El sitio activo de la enzima u
otra interacción biológica puede también determinarse por análisis
físico de la estructura, como se determina por tales técnicas como
resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica
o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de
aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de
Vos et al., Science 255:306-312, 1992; Smith
et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992;
Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992.
Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden ser
inferidas de análisis de homologías con polipéptidos que están
relacionados con un polipéptido según la invención.
Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples
pueden ser hechas y evaluadas usando métodos conocidos de
mutagénesis, recombinación y/o redistribución, seguido de un
procedimiento de selección pertinente, tal como aquellos descritos
por Reidhaar-Olson y Sauen (Science
241:53-57, 1988), Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:2152-2156, 1989), WO95/17413 o WO
95/22625. Brevemente, estos autores revelan métodos para
aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido,
o recombinación/redistribución de diferentes mutaciones
(WO95/17413, WO95/22625), seguido de selección para funcional un
polipéptido, y luego secuenciación de polipéptidos mutagenizados
para determinar el espectro de sustituciones admisibles a cada
posición. Otros métodos que pueden ser usados incluyen exposición en
fago (p. ej., Lowman et al., Biochem. 30:
10832-10837, 1991; Ladner et al., patente
estadounidense n.º 5.223.409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) y
mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene
46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Métodos de mutagénesis/redistribución pueden ser
combinados con métodos de selección automatizados de alto
rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y
mutagenizados en células huéspedes. Las moléculas de ADN
mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden ser
recuperadas de las células huéspedes y rápidamente secuenciadas
usando equipos modernos. Estos métodos permiten la determinación
rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en
un polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a polipéptidos de
estructura desconocida. Usando los métodos mencionados
anteriormente, un técnico en la materia puede identificar y/o
preparar una variedad de polipéptidos que son sustancialmente
homólogos a los residuos 1 a 399 de SEC ID N.º 2 y retener la
actividad de pectato liasa de la enzima parental.
No obstante, los mismos métodos también son
útiles para suministrar las variantes de pectato liasa de la
invención con propiedades más ventajosas que la proteína de tipo
salvaje. Usando estos métodos, los inventores presentes han
identificado varias posiciones en las que la pectato liasa de tipo
salvaje de SEC ID NO.º 2 puede ventajosamente ser sustituida para
preparar variantes con propiedades mejoradas.
Las variantes de pectato liasa preferidas de las
invenciones están sustituidas en una o más de las siguientes
posiciones (numeración en relación a SEC ID N.º 2): 5, 9, 11, 26,
28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68,
69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86, 87, 91, 99, 105, 106, 107, 111, 115,
116, 118, 122, 123, 134, 136, 139, 140, 141, 146, 148, 156, 158,
170, 182, 185, 186, 189, 193, 194, 196, 199, 201, 202, 204, 213,
215, 218, 224, 228, 229, 234, 235, 237, 251, 256, 257, 258, 272,
277, 286, 295, 298, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 314, 316, 323,
324, 326, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341,
349, 356, 357, 363, 366, 378, 381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 393
y 397.
Las variantes preferidas de la presente
invención además comprenden variantes en las que la carga global de
la enzima ha sido hecha más negativa. En tales variantes, se pueden
haber sido sustituido los aminoácidos positivamente cargados y/o se
pueden haber introducido aminoácidos negativamente cargados bajo las
condiciones de aplicación.
Así, de acuerdo con este documento, las
variantes preferidas pueden haber sustituido un residuo de
aminoácido que está parcialmente o completamente cargado
positivamente bajo condiciones de aplicación, es decir, un His, Lys
o un Arg. Además, las variantes preferidas pueden haber sustituido
cualquier residuo por un residuo de aminoácido con una carga
negativa bajo las condiciones de aplicación, es decir, Asp, Glu, y
Tyr.
Las variantes especialmente preferidas son
aquellas en las que un residuo de lisina se ha sustituido en una o
más de las siguientes posiciones (numeración en relación a SEC ID
N.º 2): 26, 47, 54, 59, 71, 79, 87, 90, 99, 100, 115, 118, 139,
148, 213, 218, 247, 257, 263, 265, 274, 314, 317, 334, 386 y
397.
Asimismo, las variantes especialmente preferidas
son aquellas en las que se ha sustituido un residuo de arginina en
una o más de las siguientes posiciones (numeración en relación a SEC
ID N.º 2): 38, 110, 112, 120, 155, 206, 217, 272, 279, 282 y
284.
Además, las variantes preferidas son también
aquellas en el que se ha sustituido un residuo de histidina en una
o más de las siguientes posiciones (numeración en relación a SEC ID
N.º 2): 5, 31, 193, 198, 221, 222, 243, 245, 269, 270, 289, 376 y
384.
Variantes preferidas de las enzimas de pectato
liasa han sido modificadas para cambiar la constante de unión ppr
Ca2+, mejorando así la estabilidad de depleción de calcio. En una
pectato liasa de la presente invención, los tres residuos de
aminoácidos D184, D223 y D227 están coordinando la unión de Ca2+ al
sitio de unión de calcio primario. Por reclutar un cuarto residuo
de aminoácido en esta coordinación, es posible cambiar la constante
de unión por Ca2+. La presencia de Ca2+ en el sitio de unión de
calcio primario puede influir en el evento catalítico (reduciendo
la pKa del residuo catalítico), la alineación del sustrato o
determinar si la enzima funciona como una hidrolasa o una liasa
(siendo la presencia de Ca2+ un prerrequisito para la actividad de
liasa). Tales variantes con estabilidad de depleción de calcio
mejorada pueden comprender una de las sustituciones Q182D y
Q182E.
Otros ejemplos de variantes preferidas son
aquellas con estabilidad de oxidación mejorada en las que se ha
sustituido un residuo de aminoácido lábil a la oxidación. Por
"lábil a la oxidación" se hace referencia a aminoácidos que
retienen un grupo hidróxilo o sulfuro, por ejemplo, metionina,
cisteína, treonina, serina y tirosina. Variantes preferidas son
aquellas en las que se ha sustituido un residuo de aminoácido lábil
a la oxidación en una o más de las siguientes posiciones
(numeración en relación a SEC ID N.º 2): 64, 122, 199 y 237.
Otros ejemplos de variantes preferidas son
aquellas que tienen una sustitución de aminoácido en un residuo
flexible, donde se ha introducido un residuo de aminoácido menos
flexible. En el presente contexto, el término "flexible" se
refiere al número de ángulos phi y psi posibles del átomo
C-alfa en el aminoácido. La flexibilidad del
esqueleto peptídico se limita por impedimento estérico de los átomos
unidos al átomo C-alfa. En general, sólo la cadena
lateral de aminoácido difiere de un residuo al otro, así el tamaño
de la cadena lateral (el radio Van der Waals) determina la
flexibilidad. Una glicina tiene la cadena lateral más pequeña, un
átomo de hidrógeno; por lo tanto, un residuo de glicina introduce
más flexibilidad. La situación opuesta se aplica para la prolina,
donde las conformaciones posibles están limitadas no sólo por una
cadena lateral grande sino también debido a la estructura anular.
Así, un residuo de prolina es menos flexible que el promedio, y da
rigidez y estabilidad al péptido.
Tales variantes menos flexibles incluyen en
particular, pero de forma no limitativa, variantes en las que se ha
sustituido un residuo de glicina con cualquiera de los otro 19
aminoácidos de origen natural o variantes en las que cualquier
aminoácido ha sido sustituido con un residuo de prolina. En
variantes especialmente preferidas se ha introducido un residuo de
aminoácido menos flexible en una o más de las siguientes regiones
(numeración de posiciones en relación a SEC ID N.º 2):
26-31, 45-50, 66-72,
81-89, 90-106,
134-137, 169-178,
210-217, 253-262,
275-286, 297-308,
328-343, 354-356,
361-365, 368-372 y
376-379.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la variante de pectato liasa de Bacillus
subtilis comprende al menos un residuo de aminoácido sustituido
seleccionado del grupo que consiste en: H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T,
S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E,
D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*,
N69*, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A,
K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E,
K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K,
M122N, M122Q, V123I, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M,
K139N, K139S, 1140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H,
Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E,
N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L,
N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P,
G224S, A228I, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E,
K257N, T258l, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H,
S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F,
N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S,
T335R, I336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I,
S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, 1357V,
N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A,
V389I, I390N, I390T, S391N, A393V y K397D.
Actualmente se contempla que una o más de estas
sustituciones ya sea sola o en combinación aumentan la estabilidad
de detergente de la variante de pectato liasa cuando se la compara
con la enzima parental.
Las sustituciones múltiples preferidas que
aumentan la estabilidad de detergente incluyen:
A228I+F251I,
S134L+K257E,
K115I+K213E,
K139I+K213N,
H5R+K257N+S302A,
K99I+I196V,
K115A+K118A,
K115A+K118A+M122N,
V141E+C199S+K213E,
K115I+Q146H,
K71E+K118E,
T49P+N156S,
K314N+S340P,
V141E+1235V,
G46D+K257N,
S28T+S30F+K334E+N363S,
D48E+L106Q+I140V+F215Y+K218E,
H193Y+S256C+V389I+A393V,
E9G+H31N+N50D+L106Q+A111E+T136S+V141L+F201L+N202K+F215Y+G286A+A381D+H384N,
K213N+T258I,
E9G+H31N+L106Q+D303S+A305P+T335S+H384N+S391N,
E9G+H31N+D48E+L106Q+A111E+S301Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N,
L45V+N50Y+N185H,
N11Y+K87E+K99N,
E9G+D48E+L106Q+S318F+A381D,
S30P+K115I+K139I+Q146H+S337C,
E9G+H31N+D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N,
H31N+T105A+L106Q+A111E+V141L+K218E+D303S+A305P+D326N+T335S+H384N+S391N,
K26Q+K47N+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N,
D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N,
K213T+K218L+A305P,
M64F+K213T+K218L+A305P,
M64F+M122K+K118E+K213T+K218L+A305P,
K139I+Q146H+K257N+S337C,
M64F+K139I+Q146H+S337C,
K139I+Q146H+S337C y
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+
T258I+A305P+S331P+S337K.
Los polipéptidos de la presente invención,
incluidas las proteínas en toda su longitud, los fragmentos de las
mismas y las proteínas de fusión, se pueden producir en células
huéspedes creadas genéticamente según técnicas convencionales.
Células huésped adecuadas son aquellos tipos de células que pueden
transformarse o transfectarse con ADN exógeno y desarrollarse en
cultivo, e incluyen células bacterianas, fúngicas y células
eucarióticas superiores cultivadas. Se prefieren las células
eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos
multicelulares. Se prefieren especialmente las células
gram-positivas del género de Bacillus, tales
como B. licheniformis, B. lentus, B. brevis,
B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B.
amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans,
B. lautus, B. thuringiensis, B. agaradherens,
o en particular B. subtilis.
Técnicas para manipular moléculas de ADN
clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células
huéspedes son descritas por Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et
al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
and Sons, Inc., NY, 1987; y (Bacillus subtilis and Other
Gram-Positive Bacteria, Sonensheim et al.,
1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.).
En general, una secuencia de ADN que codifica
una pectato liasa de la presente invención está vinculada
operativamente a otros elementos genéticos requeridos para su
expresión, incluyendo generalmente un promotor y un terminador
dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá
comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes
de replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que
dentro de ciertos sistemas los marcadores seleccionables pueden
proporcionarse en vectores separados y la replicación del ADN
exógeno puede proporcionarse mediante integración en el genoma de la
célula huésped. La selección de promotores, terminadores,
marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto
de diseño habitual dentro del nivel de la experiencia normal en la
técnica. Muchos de tales elementos se describen en la literatura y
están disponibles a través de suministradores comerciales.
Para dirigir un polipéptido a la ruta secretora
de una célula huésped, una secuencia de señal secretora (también
conocida como una secuencia líder, preprosecuencia o presecuencia)
se proporciona en el vector de expresión. La secuencia de señal
secretora puede ser la de polipéptidos o puede derivarse de otra
proteína secretada o sintetizarse de novo. Numerosas
secuencias de señal secretora se conocen en la técnica y se hace
referencia a Bacillus subtilis y otras bacterias
gram-positivas, Sonenshein et al., 1993,
(American Society for Microbiology, Washington D.C.) y Cutting, S.
M.(eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", (John
Wiley e hijos, 1990) para mayor descripción de secuencias de señal
secretora adecuadas especialmente para la secreción en una célula
huésped de Bacillus. La secuencia señal secretora se une a la
secuencia de ADN en el marco de lectura correcto. Las secuencias de
señal secretora están situadas comúnmente 5' con respecto a la
secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque
ciertas secuencias de señal secretora pueden situarse en cualquier
parte de la secuencia de DNA de interés (véase, por ejemplo, Welch
et al., patente estadounidense n.º 5.037.743; Holland et
al., patente estadounidense n.º 5.143.830). Las células
huéspedes transformadas o transfectadas se cultivan según
procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene
nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las
células huéspedes elegidas. Una variedad de medios adecuados,
incluidos medios definidos y medios complejos, se conocen en la
técnica e incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los
medios también pueden contener componentes tales como factores de
crecimiento o suero, según sea necesario. El medio de crecimiento
se seleccionará generalmente con respecto a células que contienen el
ADN exógenamente añadido mediante, por ejemplo, selección con
fármacos o deficiencia en un nutriente esencial, que está
complementado por el marcador seleccionable transportado en el
vector de expresión o cotransfectado en la célula huésped.
La fermentación se puede realizar por cultivo de
la célula huésped bajo condiciones aeróbicas en un medio nutritivo
que contiene fuentes de nitrógeno y carbono junto con otros
nutrientes esenciales, estando compuesto el medio conforme a los
principios de la técnica conocida. El medio puede ser un medio rico
complejo o un medio mínimo. La fuente de nitrógeno puede ser de
naturaleza orgánica y/o inorgánica. Las fuentes de nitrógeno
inorgánicas adecuadas son nitratos y sales amónicas. Entre las
fuentes de nitrógeno orgánico, un número significativo se usa
regularmente en las fermentaciones. Ejemplos son harina de soja,
caseína, maíz, licor de maíz fermentado, extracto de levadura, úrea
y albúmina. Fuentes de carbono adecuadas son carbohidratos o
carbohidrato que contiene materiales. Preferiblemente, el medio
nutritivo contiene pectato, ácido poligalacturónico y/o pectina
esterificada a un grado inferior o superior como fuente de carbono
y/o inductor de producción de pectinasa. Alternativamente, el medio
contiene un material rico en pectina tal como harina de soja, pulpa
de manzana o cáscara cítrica.
El cultivo preferiblemente puede ser conducido a
valores de pH alcalino tal como al menos pH 8 o al menos pH 9, que
se puede obtener por adición de tampones adecuados tal como
carbonato de sodio o mezclas de carbonato de sodio y bicarbonato
sódico después de la esterilización del medio de crecimiento.
Cuando el polipéptido expresado recombinante se
segrega, el polipéptido se puede purificar de los medios de
crecimiento. Preferiblemente, las células huéspedes de expresión se
eliminan de los medios antes de la purificación del polipéptido (p.
ej. por centrifugado).
Cuando el polipéptido expresado recombinante no
es segregado de la célula huésped, la célula huésped es
preferiblemente interrumpida y el polipéptido librado en un
"extracto" acuoso que es la primera fase de tales técnicas de
purificación. Preferiblemente, las células huéspedes de expresión se
eliminan de los medios antes de la rotura celular (p. ej. por
centrifugado).
La rotura celular se puede realizar por técnicas
convencionales como por digestión de lisozima o forzando las
células a través de alta presión. Véase (Robert K. S cobes, Protein
Purification, Second edition, Springer-Verlag) para
obtener una mayor descripción de tales técnicas de rotura
celular.
Ya sea que los polipéptidos recombinantes
expresados (o polipéptidos quiméricos) sean segregados o no, pueden
ser purificados usando fraccionamiento y/o métodos de purificación y
medios convencionales.
La precipitación de sulfato amónico y ácido o
extracción caotrópica se puede utilizar para el fraccionamiento de
muestras. Pasos de purificación ejemplares pueden incluir
hidroxiapatita, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía en fase
líquida de fase inversa de alto rendimiento. Los medios de
intercambio de aniones adecuados incluyen dextranas derivatizadas,
agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad y
similares. Se prefieren particularmente los derivados de DEAE, QAE
y Q con Fast-Flow Sepharose (Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ). Medios cromatográficos ejemplares incluyen
aquellos medios derivatizados con fenilo, butilo o grupos de
octilo, tal como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia),
Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA),
Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas
poliacrílicas, tal como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares.
Soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas
basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas
de agarosa reticulada, perlas de poliestireno, resinas de
poliacrilamida reticulada y similares que son insolubles bajo las
condiciones en las que deben ser usadas. Estos soportes se pueden
modificar con grupos reactivos que permiten fijación de proteínas
por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidril, grupos
hidróxilo y/o fracciones de carbohidrato. Ejemplos de químicas de
acoplamiento incluyen activación de bromuro cianógeno, activación
de N-hidroxisuccinimida, activación epóxida,
activación de sulfhidrilo, activación de hidracida y carboxilo y
derivados de amino para químicas de acoplamiento de carbodiimida.
Estos y otros medios sólidos se conocen y son muy usados en la
técnica, y están disponibles de proveedores comerciales.
La selección de un método particular es un
materia de diseño de rutina y es en parte determinada por las
propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, cromatografía
de afinidad: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology,
Uppsala, Suecia, 1988.
Los polipéptidos de la invención o los
fragmentos de los mismos también pueden ser preparados a través de
síntesis química. Los polipéptidos de la invención pueden ser
monómeros o multímeros; no glicosilados o glicosilados; pegilados o
no pegilados; y pueden o pueden no incluir un residuo de aminoácido
de metionina inicial.
Por consiguiente, en otro aspecto, la presente
invención también se refiere a un método para producir la
preparación enzimática de la invención, el método que comprende el
cultivo de un microorganismo capaz de producir la variante de
pectato liasa bajo condiciones que permitan la producción de la
enzima y recuperar la enzima del cultivo. El cultivo puede ser
realizado usando técnicas de fermentación convencionales, por
ejemplo, el cultivo en matraces de agitación o fermentadores con
agitación para asegurar aireación suficiente en un medio de
crecimiento que induzca la producción de la variante de pectato
liasa. El medio de crecimiento puede contener una fuente N
convencional, tal como peptona, extracto de levadura o ácidos de
casamino, una cantidad reducida de una fuente C convencional tal
como dextrosa o sacarosa, y un inductor tal como pectato o pectina
o sustratos de planta compuestos tales como salvado de cereal (p.
ej., salvado de trigo o cáscara de arroz). La recuperación puede
ser realizada usando técnicas convencionales, por ejemplo,
separación de biomasa y sobrenadante por centrifugado o filtración,
recuperación del sobrenadante o rotura de células si la enzima de
interés es intracelular, quizás seguido de otra purificación como se
describe en EP 0 406 314 o por cristalización como se describe en
WO 97/15660.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una variante de pectato liasa aislada con las propiedades
anteriormente descritas y que está libre de impurezas homólogas y es
producida usando técnicas convencionales recombinantes.
La pectato liasa corta el ácido
poligalacturónico a través de un mecanismo de transeliminación. Esto
significa que deja un doble enlace C-C para cada
división de sustrato. Este enlace absorbe a 235 nm permitiendo la
detección directa de la acción de pectato liasa en ácido
poligalacturónico soluble midiendo la absorbencia en esa longitud
de onda.
Se diluye una muestra enzimática en tampón de
ensayo (100 mM Tris-HCl, 0,68 mM CaCl_{2}, pH 8,0)
a una concentración entre 5 y 100 ng/ml. Si la muestra enzimática
contiene detergente, debe ser diluida al menos un 1000 veces
respecto al detergente. 100 \mul de la dilución de tampón
enzimática se mezcla con 100 \mul sustrato (1% (p/v) ácido
poligalacturónico de Sigma, P-3850, agitado en
tampón de ensayo durante al menos 15 min y centrifugado durante 5
min a 2300 g, sobrenadante es usado.) en una placa de calentamiento
y calentado a 40ºC durante 10 min. en un bloque de calentamiento,
preferiblemente una máquina de PCR o equipo de exactitud y
velocidades de calentamiento equivalentes.
100 \mul solución de sustrato/enzima se mezcla
con 100 \mul reactivo de parada (50 mM H_{3} PO_{4}) en una
placa de microtitulación transparente de UV. La placa UV se agita
brevemente y suavemente, y se mide la absorbencia a 235 nm en un
espectrómetro de microtitulación (Molecular Devices,
Spectra-MAX 190). Las lecturas de absorbencia se
corrigen en cuanto a la absorbencia de antecedentes substrayendo la
absorbencia de una muestra de control, realizada sin enzima
adicionada, a todos los valores medidos.
Una curva estándar basada en la actividad de la
pectato liasa de SEC ID N.º 2 (de Bacillus subtilis
depositado como IFO 3134) fue lineal entre 2,5 y 100 ng/ml enzima en
la mezcla reactiva:
Alternativamente, la actividad catalítica de
pectato liasa se puede determinar por el ensayo de viscosidad,
APSU.
Unidades APSU: El ensayo APSU mide el cambio en
viscosidad de una solución de ácido poligalacturónico en ausencia
de iones de calcio adicionados.
Un 5% p/v de solución de poligalacturonato de
sodio (Sigma P-1879) se solubiliza en 0,1 M tampón
de glicina, pH 10, 4 ml de esta solución se preincuba durante 5 min
a 40 grados Celsius. Luego, se agregan 250 microlitros del
enzimático (o dilución enzimática), después de lo cual la reacción
se mezcla durante 10 seg en un mezclador a la velocidad máxima y es
incubada durante 20 min a 40 grados Celsius o a otra
temperatura.
La viscosidad se mide usando un viscosímetro
MIVI 600 (Sofrasen, 45700 Villemandeur, Francia). La viscosidad se
mide como mV después de 10 seg. Para el cálculo de unidades APSU, se
usa la siguiente curva estándar:
En otros aspectos, la presente invención se
refiere a una composición de detergente que comprende la variante
de pectato liasa o preparación de variante de pectato liasa de la
invención, y a un proceso para el tratamiento de tejidos que
comprende el tratamiento de tejidos durante un ciclo de lavado de un
proceso de lavado de máquina con una solución de lavado que
contiene la variante de pectato liasa o la preparación de la
variante de pectato liasa de la invención.
Típicamente, la composición de detergente de la
invención comprende ingredientes convencionales tales como
tensioactivos, (aniónico, no iónico zwitteriónico, anfotérico),
constructores y otros ingredientes, por ejemplo, como se describe
en WO 97/016291.
La variante de pectato liasa de la presente
invención se puede usar en combinación con otras enzimas
degradadoras de carbohidratos (por ejemplo, hemicelulasas, tales
como arabinanasa, xiloglucanasa, mananasa y pectinasa) para
biopreparación de fibras o para limpieza de fibras en combinación
con detergentes. Las fibras de algodón consisten en una capa de
pared celular primaria con pectina y una capa secundaria con
celulosa principalmente. Bajo preparación de algodón o refinando el
algodón, parte de la pared celular será eliminada. La presente
invención se refiere a cualquiera de las ayudas durante el refinando
de algodón por eliminación de la pared celular primaria, o durante
la limpieza del algodón para eliminar sustancias pécticas residuales
y prevenir que la tela se torne de color gris.
En el contexto presente, el término "material
celulósico" se destina a significar fibras, tejidos cosidos y
tejidos no cosidos, incluidos géneros de punto, tejidos, telas
vaqueras, hilados y toalla, hechos de algodón, mezclas de algodón o
derivados celulósicos naturales o artificiales (p. ej. originados de
fibras celulósicas con xilano tales como de pulpa de madera) o
mezclas de los mismos. Ejemplos de mezclas son mezclas de algodón o
rayón/viscosa con uno o varios materiales acompañantes tales como
lana, fibras sintéticas (p. ej. fibras de poliamida, fibras
acrílicas, fibras de poliéster, fibras de polivinil alcohol, fibras
de polivinil cloruro, fibras de cloruro de polivinilideno, fibras
de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) y fibras con
celulosa (p. ej. rayón/viscosa, ramio, cáñamo, lino/tela de lino,
yute, fibras de acetato de celulosa, liocel).
La preparación de la presente invención es útil
en la industria de tratamiento de fibra celulósica para el
pretratamiento o enriada de fibras de cáñamo, lino.
El procesamiento de material celulósico para la
industria textil, como por ejemplo fibra de algodón, en un material
preparado para la producción de prendas de vestir implica diferentes
fases: hilatura de la fibra en un hilo; construcción de tejido
tejido o de punto hecho a partir del hilado y operaciones
posteriores de preparación, tinte y de acabado. Los productos
tejidos se construyen tejiendo un hilo de trama entre una serie de
hilos de urdimbre; los hilos podrían ser de dos tipos diferentes.
Los productos de punto son construidos formando una red de bucles
entrecruzados de una longitud continua de hilo. Las fibras
celulósicas pueden también ser usadas para tejido no tejido.
El proceso de la preparación prepara el textil
para la respuesta apropiada en operaciones de coloración. Las
sub-fases implicadas en la preparación son
a. Desencolado (para productos tejidos) usando
cola polimérica como por ejemplo almidón, CMC o PVA se añade antes
del entretejido para aumentar la velocidad de urdimbre. Este
material debe ser eliminado antes del tratamiento posterior.
b. Descrudado, el objetivo del cual es eliminar
el material no celulósico de la fibra de algodón, especialmente, la
cutícula (que consiste principalmente en ceras) y la pared celular
primaria (que consiste principalmente en pectina, proteína y
xiloglucano). Es necesaria una eliminación de cera apropiada para
obtener una alta humectabilidad, siendo ésta una medida para
obtener un buen tinte. La eliminación de la pared celular primaria
-especialmente las pectinas- mejora la eliminación de cera y asegura
un tinte más uniforme. Además, mejora la blancura en el proceso de
blanqueamiento. El químico principal usado en el descrudado es
hidróxido sódico en altas concentraciones, hasta 70 g/kg de algodón
y a temperaturas altas, 80-95 grados Celsius; y
c. Blanqueamiento; normalmente, el descrudado es
seguido por un blanqueo usando peróxido de hidrógeno como el agente
oxidante en orden a obtener un tejido completamente blanqueado
(blanco) o para asegurar un matiz limpio del colorante.
En la industria también se utiliza proceso
combinado de descrudado/blanqueo en un paso. Aunque los procesos de
preparación son más frecuentemente empleados en el estado del
tejido; el descrudado, el blanqueamiento y las operaciones de tinte
también pueden realizarse en la fase de la fibra o el hilo.
El régimen del procesamiento puede ser bien
discontinuo o continuo con el tejido siendo contactado por la
corriente del procesamiento líquido en forma de anchura abierta o de
cuerda. Las operaciones continuas generalmente usan un saturador
por lo cual un peso aproximadamente igual de baño químico por peso
de tejido se aplica al tejido, seguido de una cámara de reposo
calentada donde se desarrolla la reacción química. Una sección de
lavado luego prepara el tejido para la siguiente fase de
tratamiento. El procesamiento discontinuo generalmente se
desarrolla en un baño de procesamiento por el cual el tejido se
contacta con aproximadamente 8-15 veces su peso en
baño químico. Después de un periodo de reacción, los productos
químicos son drenados, el tejido es enjuagado y el siguiente
químico es aplicado. El procesamiento pad-batch
(tintura semi-continua) implica un saturador por el
cual un peso aproximadamente igual de baño químico por peso de
tejido se aplica al tejido, seguido de un periodo de reposo que en
el caso de pad-batch frío puede ser uno o más
días.
Productos tejidos son la forma predominante de
construcción de tejidos textiles. El proceso de tejedura requiere
un "encolado" del hilo de urdimbre para protegerlo de la
abrasión. Almidón, alcohol polivinílico (PVA),
carboximetilcelulosa, ceras y ligantes acrílicos son ejemplos de
productos químicos de encolado típicos usados debido a su
disponibilidad y coste. La cola debe ser eliminada después del
proceso de tejedura como la primera etapa de la preparación de los
productos tejidos. El tejido encolado bien en forma de cuerda o de
anchura abierta se pone en contacto con el líquido del procesamiento
que contiene los agentes de desencolado. El agente de desencolado
empleado depende del tipo de cola que deba ser eliminada. Para colas
de PVA, se usa frecuentemente agua caliente o procesos oxidantes.
El agente de encolado más común para tejido de algodón se basa en
almidón. Por lo tanto, muy a menudo, los tejidos de algodón tejidos
se desencolan por una combinación de agua caliente, la enzima
a-amilasa para hidrolizar el almidón y un agente
humectante o surfactante. Se deja reposar el material celulósico
con los productos químicos del desencolado durante un "periodo de
permanencia" suficientemente largo para realizar el desencolado.
El periodo de permanencia es dependiente del tipo de régimen de
procesamiento y la temperatura y puede variar de 15 minutos a 2
horas, o en algunos casos, varios días. Típicamente, los productos
químicos de desencolado se aplican en un baño saturador que
generalmente varía de aproximadamente 15ºC a aproximadamente 55
grados Celsius. El tejido es luego mantenido en un equipamiento tal
como un "J-box" que proporciona calor
suficiente, normalmente entre aproximadamente 55 grados Celsius y
aproximadamente 100 grados Celsius, para aumentar la actividad de
los agentes de desencolado. Los productos químicos, incluyendo los
agentes del encolado eliminados, son lavados del tejido después de
la finalización del periodo de permanencia. Para asegurar una
blancura elevada o una buena humectabilidad y teñibilidad
resultante, los productos químicos de la cola y otros productos
químicos aplicados deben ser íntegramente eliminados. Es
generalmente creído que un desencolado eficaz es de importancia
crucial para los procesos de preparación siguientes: descrudado y
blanqueamiento.
El proceso del descrudado elimina muchos de los
compuestos no celulósicos encontrados en el algodón de forma
natural. Además de las impurezas naturales no celulósicas, el
descrudado puede eliminar la suciedad, manchas y materiales
residuales introducidos en la fabricación tales como lubricantes de
hilatura, enconado o corte. El proceso de descrudado emplea
hidróxido sódico o agentes de causticación relacionados tales como
carbonato de sodio, hidróxido potásico o mezclas derivadas.
Generalmente, un surfactante alcali estable se añade al proceso
para mejorar la solubilización de compuestos hidrofóbicos y/o
prevenir su redeposición en el tejido. El tratamiento está
generalmente a una alta temperatura, 80ºC-100ºC,
utilizando soluciones fuertemente alcalinas, pH
13-14, del agente de descrudado. Debido a la
naturaleza no específica de los procesos químicos no sólo las
impurezas sino la celulosa misma es atacada, conduciendo a daños en
la resistencia u otras propiedades del tejido deseables. La
suavidad del tejido celulósico es una función de ceras de algodón
naturales residuales. La naturaleza no específica del proceso de
descrudado fuertemente alcalino de alta temperatura no puede
discriminar entre los lubricantes de algodón naturales deseables y
los lubricantes introducidos en la fabricación. Además, el proceso
de descrudado convencional puede causar problemas medioambientales
debido al efluente altamente alcalino de estos procesos. La fase
del descrudado prepara el tejido para la respuesta óptima en el
blanqueo. Un tejido descrudado de forma poco adecuada necesitará un
nivel más alto de blanqueador químico en las fases de blanqueo
posteriores. La fase de blanqueo decolora los pigmentos naturales
del algodón y elimina cualquier componente impuro del algodón
fibroso residual natural no eliminado completamente durante el
desmotado, el cardado o el descrudado. El principal proceso en uso
actualmente es un blanqueador de peróxido de hidrógeno alcalino. En
muchos casos, especialmente cuando no se necesita una blancura
altísima, el blanqueo se puede combinar con el descrudado.
En los ejemplos a continuación se demuestra que
el paso de descrudado puede llevarse a cabo usando la pectato liasa
o preparación de pectato liasa de la presente invención a una
temperatura de aproximadamente 50-80ºC y un pH de
aproximadamente 7-11, sustituyendo o suplementando
así los agentes altamente caustificantes. Un proceso enzimático
optimizado asegura una alta eliminación de pectina y humectabilidad
completa.
La enzima o la preparación enzimática según la
invención se usan preferiblemente como un agente para la
degradación o la modificación de paredes celulares vegetales o
cualquier material con pectina originado de paredes celulares
vegetales debido a la alta actividad de degradación de la pared
celular vegetal de la variante de pectato liasa de la
invención.
La variante de pectato liasa de la presente
invención puede ser utilizado sola o junto con otras enzimas como
glucanasas, pectinasas y/o hemicelulasas para mejorar la extracción
de aceite de material vegetal rico de aceite, como aceite de soja
de semillas de soja, aceite de aceituna de aceitunas o aceite de
semilla de colza de semilla de colza o aceite de girasol de
girasol.
La variante de pectato liasa de la presente
invención puede ser utilizada para la separación de componentes de
materiales de célula vegetal. Resulta de interés particular la
separación de azúcar o material vegetal rico en almidón en
componentes de interés comercial considerable (como sacarosa de
remolacha azucarera o almidón de patata) y componentes de poco
interés (como pulpa c fracciones de cáscara). También, resulta de
interés particular la separación de brotes ricos en aceite o ricos
en proteína en fracciones de cáscara invaluables y valiosas
proteínas y aceite. El proceso de separación puede ser realizado
usando métodos conocidos en la técnica.
La variante de pectato liasa de la invención
puede también usarse en la preparación de fruta o zumo vegetal para
aumentar el rendimiento, y en la hidrólisis enzimática de varios
materiales derivados de la pared celular vegetal o materiales de
desperdicio, por ejemplo, la producción de vino o zumo, o residuos
agrícolas tales como cáscaras vegetales, cáscaras de vainas, pulpa
de remolacha azucarera, pulpa de aceituna, pulpa de patata y
similares.
El material vegetal se puede degradar para
mejorar diferentes tipos de tratamiento, facilitar la purificación
o la extracción de otro componente además de los galactanos como
purificación de pectinas de cítrico, mejorar el valor de pienso,
reducir la capacidad enlazante del agua, mejorar la degradabilidad
en plantas de aguas residuales, mejorar la conversión de material
vegetal a ensilaje, etc.
Mediante una preparación enzimática de la
invención, es posible regular la consistencia y la apariencia de
frutas o verdura procesadas. Se ha demostrado que la consistencia y
la apariencia son producto de la combinación real de enzimas usadas
para el tratamiento, es decir, la especificidad de las enzimas con
las que se combina la variante de pectato liasa de la invención.
Ejemplos incluyen la producción de zumo claro, por ejemplo, de
manzanas, peras o bayas; zumo estable turbio por ejemplo de
manzanas, peras, bayas, cítricos o tomates; y purés, por ejemplo,
de zanahorias y tomates.
La variante de pectato liasa de la invención se
puede utilizar en la modificación de la viscosidad de material
derivado de pared celular vegetal. Por ejemplo, la variante de
pectato liasa se puede utilizar para reducir la viscosidad de
pienso con galactano y para promover el tratamiento de material con
galactano viscoso. La reducción de la viscosidad puede obtenerse
tratando el material vegetal con galactano con una preparación
enzimática de la invención bajo condiciones adecuadas para la
degradación parcial o completa del material con galactano.
La variante de pectato liasa se puede usar, por
ejemplo, en combinación con otras enzimas para la eliminación de
sustancias pécticas de fibras vegetales. Esta eliminación es
esencial, por ejemplo, en la producción de fibras textiles u otros
materiales celulósicos. Para este propósito, el material de fibra
vegetal se trata con una cantidad adecuada de la pectato liasa de
la invención bajo condiciones adecuadas para obtener degradación
parcial o completa de sustancias pécticas asociadas al material de
fibra vegetal.
Las variantes de pectato liasa de la presente
invención se pueden utilizar para la modificación de pienso para
animales y pueden ejercer su efecto in vitro (modificando
componentes del pienso) o in vivo. La variante de pectato
liasa es particularmente adecuada para la adición a composiciones de
pienso para animales con cantidades altas de arabinogalactanos o
galactanos, por ejemplo, pienso que contiene material vegetal de
soja, semilla de colza, lupin, etc. Cuando se agrega al pienso, la
variante de pectato liasa mejora significativamente la
descomposición in vivo de material de pared celular vegetal,
por lo que se consigue una mejor utilización de los nutrientes de
la planta por parte del animal. Así, se mejora el índice de
crecimiento y/o relación de conversión de pienso (es decir, el peso
de pienso ingerido en relación al aumento de peso) del animal. Por
ejemplo, el galactano indigerible se degrada por pectato liasa, por
ejemplo, en combinación con beta-galactosidasa, a
galactosa o galacto oligómeros que son digeribles por el animal y
así contribuyen a la energía disponible del pienso. También, por la
degradación de galactano, la pectato liasa puede mejorar la
digestibilidad y la ingesta de ingredientes de pienso que no son
carbohidratos tales como proteína, grasa y minerales.
Para mayor descripción, se hace referencia a
PCT/DK 96/00443 y un ejemplo práctico aquí.
\newpage
La enzima o la preparación enzimática de la
invención se puede utilizar para despectinización y la reducción de
viscosidad en zumo de frutas o vegetales, especialmente, en zumo de
manzana o pera. Este puede realizarse tratando la fruta o zumo
vegetal con una preparación enzimática de la invención en una
cantidad eficaz para degradar material con pectina contenido en la
fruta o zumo vegetal.
La enzima o preparación enzimática se puede
utilizar en el tratamiento de trituración de frutas y verduras para
mejorar el extractabilidad o degradabilidad de la trituración. Por
ejemplo, la preparación enzimática puede ser utilizada en el
tratamiento de trituración de manzanas y peras para la producción de
zumo, y en el tratamiento de trituración de uvas para la producción
de vino.
La aplicabilidad de variantes de pectato liasa
con estabilidad de detergente mejorada se aprecia siempre que las
variantes se usan en un entorno que comprende tensioactivos.
Las composiciones detergentes según la presente
invención comprenden un sistema tensioactivo, caracterizado por el
hecho de que el tensioactivo se puede seleccionar de tensioactivos
aniónicos y/o no iónicos y/o catiónicos y/o anfolíticos y/o
zwitteriónicos y/o semipolares.
El tensioactivo está típicamente presente a un
nivel de 0,1% al 60% en peso.
El tensioactivo es preferiblemente formulado
para ser compatible con componentes enzimáticos presentes en la
composición. En composiciones de gel o líquido, el tensioactivo es
formulado de forma más preferible de manera que promueve, o al
menos no degrada, la estabilidad de ninguna enzima en estas
composiciones.
Los sistemas preferidos para ser usados según la
presente invención comprenden como un tensioactivo uno o más de los
tensioactivos aniónicos y/o nos iónicos descritos aquí.
Condensados de polietileno, polipropileno y
óxido de polibutileno de alquilfenoles son adecuados para el uso
como el tensioactivo no iónico de los sistemas tensioactivos de la
presente invención, siendo preferidos los condensados de óxido de
polietileno. Estos compuestos incluyen los productos de condensación
de alquilfenoles con un grupo alquilo que contiene de
aproximadamente 6 a aproximadamente 14 átomos de carbono,
preferiblemente de aproximadamente 8 a sobre 14 átomos de carbono,
en una configuración de cadena lineal o cadena ramificada con el
óxido alquileno. En una forma de realización preferida, el óxido de
etileno está presente en una cantidad igual a de aproximadamente 2
a aproximadamente 25 moles, más preferiblemente de aproximadamente 3
a aproximadamente 15 moles, de óxido de etileno por mol de
alquil-fenol. Agentes tensioactivos no iónicos
disponibles comercialmente de este tipo incluyen Igepal^{TM}
CO-630, comercializados por la Corporación GAF; y
Triton^{TM} X-45, X-114,
X-100 y X-102, todos comercializados
por la Rohm & Haas Company. Estos tensioactivos son comúnmente
denominados alcoxilatos de alkilofenol (p. ej., etoxilatos de
alquil-fenol).
Los productos de condensación de alcoholes
alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente 1 a
aproximadamente 25 moles de óxido de etileno son adecuados para uso
como el tensioactivo no iónico de los sistemas tensioactivos no
iónico de la presente invención. La cadena de alquilo del alcohol
alifático puede bien ser recto o ramificado, secundario o primario,
y contiene generalmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 22
átomos de carbono. Se prefieren especialmente los productos de
alcoholes con grupo alquilo que contiene aproximadamente 8 a
aproximadamente 20 átomos de carbono, más preferiblemente de
aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono, con
aproximadamente 2 a aproximadamente 10 moles de óxido de etileno por
mol de alcohol. Aproximadamente 2 a aproximadamente 7 moles de
óxido de etileno y de forma más preferible de 2 a 5 moles de óxido
de etileno por mol de alcohol están presentes en dichos productos de
condensación. Ejemplos de tensioactivos no iónicos de este tipo que
pueden obtenerse comercialmente son Tergitol®
5-S-9 (producto de condensación de
un alcohol C_{11}-C_{15} secundario lineal con 9
moles de óxido de etileno), Tergitol®
24-L-NMW (producto de condensación
de un alcohol C_{12}-C_{14} primario lineal con
6 moles de óxido de etileno en el caso de una distribución de pesos
molares estrecha), ambos comercializados por Union Carbide
Corporation; Neodol^{TM} 45-9 (el producto de la
condensación de C_{14}-C_{15} alcohol lineal con
9 moles de óxido de etileno), Neodol^{TM} 23-6.5
(el producto de la condensación de C_{12}-C_{13}
alcohol lineal con 3,0 moles de óxido de etileno),Neodol^{TM}
45-7 (el producto de la condensación de alcohol
C_{14}-C_{15} lineal con 7 moles de óxido de
etileno), Neodol^{TM} 45-5 (el producto de la
condensación de alcohol C_{14}-C_{15} lineal
con 5 moles de óxido de etileno), comercializada por Shell Chemical
Company, Kyro^{TM} EOB (el producto de condensación de alcohol
C_{13}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno)
comercializado por The Procter & Gamble Company y Genapol LA
050 (el producto de la condensación de alcohol
C_{12}-C_{14} con 5 moles de óxido de etileno),
comercializado por Hoechst. La gama preferida de HLB en estos
productos es de 8 a 11 y más preferidas de 8 a 10.
También son útiles como el tensioactivo no
iónico de los sistemas tensioactivos de la presente invención los
alquilpolisacáridos descritos en US 4.565.647, con un grupo
hidrofóbico que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 30
átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 10 a
aproximadamente 16 átomos de carbono y un polisacárido, por ejemplo
una poliglucosida, grupo hidrofílico conteniendo de aproximadamente
1,3 a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 1,3 a
aproximadamente 3, de forma más preferible de aproximadamente 1,3 a
aproximadamente 2,7 unidades de sacáridos. Puede usarse cualquier
sacárido reductor que contenga 5 o 6 átomos de carbono, por
ejemplo, glucosa, galactosa y fracciones de galactosil pueden ser
sustituidas por las fracciones glucosilicas (opcionalmente, el grupo
hidrófobo está unido en las posiciones 2, 3, 4, etc., dando así una
glucosa o galactosa a diferencia de un glucósido o galactósido). Los
enlaces intersacáridos pueden estar, por ejemplo, entre la posición
uno de las unidades de sacárido adicionales y las posiciones 2, 3,
4 y/o 6 en las unidades de sacárido precedentes.
Los alquilpoliglucósidos preferidos tienen la
fórmula
R^{2}O(C_{n}H_{2n}O)_{t}
(glicosilo)_{x}
donde R^{2} es seleccionado del
grupo que consiste en alquilo, alquilfenilo, hidroxialquilo,
hidroxialquilfenilo, y sus mezclas derivadas en las que los grupos
alquilo contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 18,
preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 14 átomos de
carbono; n es 2 o 3, preferiblemente 2; t es de 0 a aproximadamente
10, preferiblemente 0; y x es de aproximadamente 1,3 a
aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 1,3 a
aproximadamente 3, de forma más preferible de aproximadamente 1,3 a
aproximadamente 2,7. El glicosilo se deriva preferiblemente de la
glucosa. Para preparar estos compuestos, se forma primero el
alcohol o alcohol de alquilpolietoxi y entonces reacciona con la
glucosa, o con una fuente de glucosa para formar el glucósido
(unión a la posición 1). Las unidades adicionales de glicosilo
pueden entonces unirse entre su posición 1 y las unidades de
glicosilo precedentes de las posiciones 2, 3, 4 y/o 6,
preferiblemente en su mayoría la posición
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de condensación de óxido de
etileno con una base hidrofóbica formada por la condensación del
óxido de propileno con glicol de propileno son también adecuados
para el uso como sistemas tensioactivos no iónicos adicionales de
la presente invención. La parte hidrófoba de estos compuestos
presenta preferiblemente un peso molecular entre aproximadamente
1500 y aproximadamente 1800. La adición de fracciones de
polioxietileno a esta parte hidrofóbica tiende a aumentar la
solubilidad en agua de la molécula en conjunto, y el carácter
líquido del producto se retiene hasta el punto en el cual el
contenido de polioxietileno es aproximadamente 50% del peso total
del producto de condensación, que corresponde a la condensación con
hasta aproximadamente 40 moles de óxido de etileno. Ejemplos de
compuestos de este tipo incluyen determinados tensioactivos
disponible comercialmente de Pluronic^{TM}, comercializados por
BASF.
También son adecuados para el uso como el
tensioactivo no iónico del sistema tensioactivo no iónico de la
presente invención, los productos de condensación de óxido de
etileno con el producto que resultan de la reacción de óxido de
propileno y etilenodiamina. La fracción hidrófoba de estos
compuestos está constituida por el producto de reacción de
etilendiamina con óxido de propileno en exceso y presenta en general
un peso molecular de aproximadamente 2500 a 3000. Esta fracción
hidrofóbica se condensa con óxido de etileno en la medida en que el
producto de condensación contiene de aproximadamente 40% a
aproximadamente 80% en peso de polioxietileno y tiene un peso
molecular de de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 11.000.
Ejemplos de este tipo de tensioactivo no iónico incluyen
determinados compuestos disponible comercialmente a Tetronic^{TM},
comercializados por BASF.
Se prefieren para el uso como el tensioactivo no
iónico de los sistemas tensioactivos de la presente invención
condensados de óxido de polietileno de
alquil-fenoles, productos de condensación de
alcoholes alifáticos secundarios y primarios con de aproximadamente
1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno,
alquilpolisacáridos, y mezclas de los mismos. Los más preferidos
son etoxilatos de alquil-fenol
C_{8}-C_{14} con de 3 a 15 grupos etoxi y
etoxilatos de alcohol C_{8}-C_{18}
(preferiblemente C_{10} avg.) que tienen de 2 a 10 grupos etoxi,
y sus mezclas derivadas. Agentes tensioactivos no iónicos altamente
preferidos son tensioactivos de amida de ácido graso de polihidroxi
de la fórmula:
donde R^{1} es H, o R^{1} es
hidrocarbilo C_{1}-C_{4},
2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo, o
una mezcla de ellos, R^{2} es hidrocarbilo
C_{5}-C_{31} y z es un polihidroxihidrocarbilo
que tiene una cadena de hidrocarbilo lineal con 3 hidroxilos, por
lo menos, conectados directamente a dicha cadena, o un derivado
alcoxilado del mismo. Preferiblemente, R^{1} es metilo, R^{2}
es cadena recta de alquilo de C_{11-15} o alquilo
C_{16-18} o alquenilo tal como alquilo de coco o
mezclas derivadas, y Z se deriva de una azúcar de reducción tal como
glucosa, fructosa, maltosa o lactosa, en una reacción de aminación
reductiva.
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Tensioactivos aniónicos altamente preferidos
incluyen tensioactivos de sulfato de alquilo alcoxilado. Ejemplos
de los mismos son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula
RO(A)_{m}SO_{3}M donde R es un alquilo o grupo de
hidroxialquilo C_{10}-C-_{24} no
sustituido con un componente de alquilo
C_{10}-C_{24}, preferiblemente un alquilo o
hidroxialquilo C_{12}-C_{20}, más
preferiblemente alquilo o hidroxialquilo
C_{12}-C_{18}, A es un etoxi o unidad de
propoxi, m es mayor que cero, típicamente entre aproximadamente 0,5
y aproximadamente 6, más preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y
aproximadamente 3, y M es H o un catión que puede ser, por ejemplo,
un catión metálico (p. ej., sodio, potasio, litio, calcio, magnesio,
etc.), amonio o catión de amonio sustituido. Se contemplan aquí los
sulfatos de alquilo etoxilado al igual que sulfatos alquilo
propoxilados. Ejemplos específicos de cationes de amonio sustituidos
son cationes de metil, dimetil, trimetilamonio y amonio cuaternario
como cationes de tetrametilamonio y dimetilpiperidinio, así como
aquellos que se derivan de alquilaminas como etilamina,
dietilamina, trietilamina o mezclas de las mismas, y similares.
Tensioactivos ejemplares son alquil polietoxilato
C_{12}-C_{18} (1.0) sulfato
(C_{12}-C_{18} E(1.0)M), alquil
polietoxilato C_{12}-C_{18} (2.25) sulfato
(C_{12}-C_{18} (2.25)M, y alquil
polietoxilato C_{12}-C_{18} (3.0) sulfato
(C_{12}-C_{18} E(3.0)M), y alquil
polietoxilato C_{12}-C_{18} (4.0) sulfato
(C_{12}-C_{18} E(4.0)M), donde M
es convenientemente seleccionado de sodio y potasio.
Tensioactivos aniónicos adecuados para ser
usados son surfactivos sulfonato de éster alquílico incluidos
ésteres lineales de ácidos carboxílicos
C_{8}-C_{20} (es decir, ácidos grasos) que se
sulfonatan con SO_{3} gaseoso según "The Journal of the
American Oil Chemists Society", 52 (1975), págs.
323-329. Materias primas adecuadas incluyen
sustancias grasas naturales como las derivadas de sebo, aceite de
palma, etc.
El tensioactivo sulfonato de éster alquílico
preferido, especialmente para aplicaciones de lavandería, comprende
surfactivos sulfonato de éster alquílico de la fórmula
estructural:
donde R^{3} es un hidrocarbilo
C_{8}-C_{20}, preferiblemente un alquilo, o
combinación de los mismos, R^{4} es un hidrocarbilo
C_{1}-C_{6}, preferiblemente un alquilo, o
combinación de los mismos y M es un catión que forma una sal
hidrosoluble con el sulfonato de éster alquílico. Cationes de
formación de sal adecuados incluyen metales tales como sodio,
potasio y litio, y cationes de amonio no sustituidos o sustituidos,
tal como monoetanolamina, dietonolamina y trietanolamina.
Preferiblemente, R^{3} es alquilo
C_{10}-C_{16}, y R4 es metilo, etilo o
isopropilo. Especialmente se prefieren los sulfonatos de éster
metílico donde R^{3} es alquilo
C_{10}-C_{16}.
Otros tensioactivos aniónicos adecuados incluyen
los tensioactivos de sulfato de alquilo que son sales hidrosolubles
o ácidos de la fórmula ROSO_{3}M donde R es preferiblemente un
hidrocarbilo C_{10}-C_{24}, preferiblemente un
alquilo o hidroxialquilo con un componente de alquilo
C_{10}-C_{20}, más preferiblemente un alquilo o
hidroxialquilo C_{12}-C_{18}, y M es H o un
catión, por ejemplo, un catión de metal alcalino (p. ej. sodio,
potasio, litio), o amonio o amonio sustituido (p. ej., de metilo de
dimetil, y cationes de amonio de trimetil y cationes de amonio
cuaternarios tal como tetrametil-amonio y cationes
de piperdinio de dimetil y cationes de amonio cuaternarios
derivados de alquilaminas tal como etilamina, dietilamina,
trietilamina, y sus mezclas derivadas, y similares). Típicamente,
se prefieren las cadenas de alquilo de
C_{12}-C_{16} para temperaturas de lavado
inferiores (p. ej. por debajo de aproximadamente 50ºC) y se
prefieren cadenas de alquilo C_{16}-C_{18} para
temperaturas de lavado más altas (p. ej. por encima de
aproximadamente 50ºC).
Otros tensioactivos aniónicos útiles para
objetivos detersivos pueden también ser incluidos en las
composiciones detergentes de lavado de la presente invención. Estos
puede incluir sales (incluidas, por ejemplo, sodio, potasio, amonio
y sales amónicas sustituidas tal como mono-di- y
sales de trietanolamina) de jabón, alcanosulfonatos
C_{8}-C_{22} secundarios o primarios,
olefinsulfonatos C_{8}-C_{24}, ácidos
policarboxílicos sulfonatados preparados por sulfonación del
producto pirolizado de citratos de metal alcalinotérreo, por
ejemplo, como se describe en la descripción de la patente británica
n.º 1.082.179, alquilpoliglicoletersulfatos
C_{8}-C_{24} (conteniendo hasta 10 moles de
etileno óxido); sulfonatos de alquilo glicerol, sulfonatos de
glicerol de acilos graso, sulfatos de oleil glicerol graso,
sulfatos de éter de óxido de etileno de fenol de alquilo,
sulfonatos de parafina, alquil fosfatos, isetionatos tal como los
isetionatos de acilo, n-acil tauratos, alquil
succinamatos y sulfosuccinatos, monoésteres de sulfosuccinatos
(especialmente monoésteres C_{12}-C_{18}
insaturados y saturados) y diésteres de sulfosuccinatos
(especialmente diésteres C_{6}-C_{12}
insaturados y saturados), acilsarcosinatos, sulfatos de
alquilpolisacáridos tal como los sulfatos de alquilpoliglucósidos
(los compuestos no iónico no sulfatados que están descritos abajo)
alquilsulfatos primarios ramificados y alquilpolietoxicarboxilatos
como los de fórmula
RO(CH_{2}CH_{2}O)_{k}-CH_{2}COO^{-}M^{+}
en la que R es alquilo C_{8} a C_{22}, K es un número entero de
1 a 10, y M es un catión de formación de sal soluble. Los ácidos
resínicos y los ácidos resínicos hidrogenados también son
adecuados, tal como colofonia, colofonia hidrogenada, y ácidos
resínicos y ácidos resínicos hidrogenados presentes en o derivados
de aceite de resina.
Los alquilbenceno sulfonatos son especialmente
preferidos. Especialmente preferidos son los alquilbenceno
sulfonatos lineales (cadena linear) (LAS) donde el grupo alquilo
contiene preferiblemente de 10 a 18 átomos de carbono.
Otros ejemplos están descritos en "Surface
Active Agents and Detergents" (Vol. I y II por Schwartz, Perry y
Berch). Una variedad de tales tensioactivos son también descritos en
general en US 3.929.678, (columna 23, línea 58 hasta la columna 29,
línea 23).
Cuando se las incluye, las composiciones
detergentes de lavado de la presente invención típicamente
comprenden de aproximadamente 1% a sobre 40%, preferiblemente de
aproximadamente 3% a sobre 20% en peso de tales tensioactivos
aniónicos.
Las composiciones detergentes de lavado de la
presente invención también pueden contener tensioactivos
catiónicos, anfolíticos, zwitteriónicos y semipolares, al igual que
los tensioactivos aniónicos y/o no iónicos aparte de los ya
descritos aquí.
Los tensioactivos detersivos catiónicos
adecuados para uso en las composiciones de detergente de lavado de
la presente invención son aquellas con un grupo de hidrocarbilo de
cadena larga. Ejemplos de tales tensioactivos catiónicos incluyen
los tensioactivos de amonio tal como halogenuros de
alquiltrimetilamonio, y aquellos tensioactivos con la fórmula:
[R^{2}(OR^{3})_{y}][R^{4}(OR^{3})_{y}]_{2}R^{5}N^{+}X^{-}
donde R^{2} es un grupo de
alquilo o de alquilbencilo con aproximadamente 8 a aproximadamente18
átomos de carbono en la cadena de alquilo, cada R^{3} es
seleccionado del grupo que consiste en -CH_{2}CH_{2}-,
-CH_{2}CH(CH_{3})-, CH_{2}CH(CH_{2}OH)-,
-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-, y sus mezclas derivadas; cada R4 es
seleccionado del grupo que consiste en hidroxialquilo
C_{1}-C_{4}, C_{1}-C_{4},
estructuras de anillo de bencilo formadas juntando los dos grupos
R^{4}, -CH_{2}CHOHCHOHCOR_{6}CHOH
CH_{2}OH, donde R^{6} es cualquier hexosa o polímero de hexosa con un peso molecular inferior a aproximadamente 1000, e hidrógeno cuando y no es 0; R^{5} es igual que R^{4} o es una cadena de alquilo, en la cual el número total de átomos de carbono o R^{2} más R^{5} no es más que aproximadamente 18; cada y es de 0 a aproximadamente 10,y la suma de los valores de y es de 0 a aproximadamente 15 y X es cualquier anión compatible.
CH_{2}OH, donde R^{6} es cualquier hexosa o polímero de hexosa con un peso molecular inferior a aproximadamente 1000, e hidrógeno cuando y no es 0; R^{5} es igual que R^{4} o es una cadena de alquilo, en la cual el número total de átomos de carbono o R^{2} más R^{5} no es más que aproximadamente 18; cada y es de 0 a aproximadamente 10,y la suma de los valores de y es de 0 a aproximadamente 15 y X es cualquier anión compatible.
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Los tensioactivos catiónicos altamente preferido
son los compuestos de amonio cuaternarios solubles en agua útiles
en la presente composición con la fórmula:
(i)R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}N^{+}
X^{-}
en la cual R_{1} es alquilo
C_{8}-C_{16}, cada uno de R_{2}, R_{3} y
R_{4} es independientemente alquilo
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{4}, bencilo y
-(C_{2}H_{40})_{x}H donde x tiene un valor de 2 a 5, y
X es un anión. No más de uno de R_{2}, R_{3} o R_{4} debería
ser
bencilo.
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La longitud de cadena de alquilo preferida para
R_{1} es C_{12}-C_{15}, particularmente donde
el grupo alquilo es una mezcla de longitudes de cadena derivada de
grasa de avellana de palma o coco o se deriva sintéticamente por
olefina desarrollan o síntesis de alcoholes OXO.
Grupos preferidos para R_{2}, R_{3} y
R_{4} son grupos metilo e hidroxietilo y el anión X se puede
seleccionar de haluro, metosulfato, acetato y iones de fosfato.
Ejemplos de compuestos de amonio cuaternarios
adecuados de fórmulas (i) para el uso aquí son:
bromuro o cloruro de amonio de trimetil de
coco;
bromuro o cloruro de amonio metil dihidroxietilo
de coco;
decil trietil cloruro de amonio;
bromuro o cloruro de amonio decil dimetil
hidroxietilo;
bromuro o cloruro de amoniohidroxietil dimetil
C_{12}-_{15};
bromuro o cloruro de amonio dimetil
hidroxietilo;
miristil trimetil amonio metil sulfato;
bromuro o cloruro de amonio lauril dimetil
bencil;
cloruro de amonio o bromuro lauril dimetil
(etenoxi)4;
ésteres de colina (compuestos de fórmula (i) en
la cual R_{1} es
di-alquilo
imidazolinas [compuestos de fórmula
(i)].
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Otros tensioactivos catiónicos útiles aquí son
también descritos en US 4.228,044 y en EP 0 000 224.
Cuando son incluidas, las composiciones de
detergente de lavado de la presente invención típicamente
comprenden de 0,2% a sobre 25%, preferiblemente de aproximadamente
1% a aproximadamente 8% en peso de tales tensioactivos
catiónicos.
Los tensioactivos anfolíticos son también
adecuados para uso en las composiciones de detergente de lavado de
la presente invención. Estos tensioactivos pueden ser ampliamente
descritos como derivados alifáticos de aminas secundarias o
terciarias, o derivados alifáticos de aminas heterocíclicas
secundarias y terciarias en las que el radical alifático puede ser
de cadena ramificada o recta. Uno de los sustituyentes alifáticos
contiene al menos aproximadamente 8 átomos de carbono, típicamente
de aproximadamente 8 a sobre 18 átomos de carbono, y al menos uno
contiene un grupo sublilizante en agua aniónica, por ejemplo
carboxi, sulfonato, sulfato. Véase US 3.929.678 (columna 19, líneas
18-35) para ejemplos de tensioactivos
anfolíticos.
Cuando están incluidas, las composiciones de
detergente de lavado de la presente invención típicamente
comprenden de 0,2% a aproximadamente 15%, preferiblemente de
aproximadamente 1% a aproximadamente 10% en peso de tales
tensioactivos anfolíticos.
Los surfactivos bipolares también son adecuados
para uso en composiciones de detergente de lavado. Estos
tensioactivos pueden ser aproximadamente descritos como derivados de
aminas secundarias y terciarias, derivados de aminas heterocíclicas
secundarias y terciarias, o derivados de amonio cuaternario,
fosfonio cuaternario o compuestos de sulfonio terciario. Véase US
3.929.678 (columna 19, línea 38 hasta la columna 22, línea 48) para
ejemplos de surfactivos bipolares.
Cuando están incluidas, las composiciones de
detergente de lavado de la presente invención típicamente
comprenden de 0,2% a aproximadamente 15%, preferiblemente de
aproximadamente 1% a aproximadamente 10% en peso de tales
surfactivos bipolares.
Agentes tensioactivos no iónicos semipolares son
una categoría especial de agentes tensioactivos no iónicos que
incluyen óxidos de amina hidrosolubles que contienen una fracción de
alquilo de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de
carbono y 2 fracciones seleccionadas del grupo que consiste en
grupos alquilo y grupos de hidroxialquilo que contienen de
aproximadamente 1 a aproximadamente 3 átomos de carbono; óxidos de
fosfina hidrosolubles que contienen una fracción de alquilo de
aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono y 2
fracciones seleccionadas del grupo que consiste en grupos alquilo y
grupos de hidroxialquilo que contienen de aproximadamente 1 a
aproximadamente 3 átomos de carbono; y sulfóxidos hidrosolubles que
contienen una fracción de alquilo de aproximadamente 10 a
aproximadamente 18 átomos de carbono y una fracción seleccionada
del grupo que consiste en fracciones de alquilo e hidroxialquilo de
aproximadamente 1 a aproximadamente 3 átomos de carbono.
Tensioactivos de detergente semipolares no
iónicos incluyen los tensioactivos óxido de amina con la
fórmula:
donde R^{3} es un alquilo,
hidroxialquilo, o grupo alquil-fenil o mezclas
derivadas que contienen de aproximadamente 8 a aproximadamente 22
átomos de carbono; R^{4} es un grupo de alquileno o
hidroxialquileno que contiene de aproximadamente 2 a
aproximadamente 3 átomos de carbono o mezclas derivadas; x es de 0 a
aproximadamente 3: y cada R^{5} es un grupo de alquilo o
hidroxialquilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente
3 átomos de carbono o un grupo de óxido de polietileno que contiene
de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 grupos de óxido de
etileno. Los grupos de R^{5} se pueden unir uno a otro, por
ejemplo, a través de un átomo de oxígeno o nitrógeno, para formar
una estructura
anular.
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Estos tensioactivos de óxido de amina en
particular incluyen óxidos de alquil dimetil amina
C_{10}-C_{18} y C_{8}-C_{12}
óxidos de amina etil dihidroxi alcoxietilo.
Cuando están incluidas, las composiciones de
detergente de lavado de la presente invención típicamente
comprenden de 0,2% a aproximadamente 15%, preferiblemente de
aproximadamente 1% a aproximadamente 10% en peso de tales agentes
tensioactivos no iónicos semipolares.
Las composiciones según la presente invención
pueden comprender además un sistema constructor. Cualquier sistema
constructor convencional es conveniente para ser usado aquí
incluyendo materiales de aluminosilicato, silicatos,
policarboxilatos y ácidos grasos, materiales como tetraacetato de
etilenodiamina, secuestrantes de metales iónicos como
aminopolifosfonatos, particularmente ácido fosfónico de
tetrametileno de etilenodiamina y ácido pentametilenofosfónico de
dietilentriamina. Aunque son menos preferidos para cuestiones
medioambientales obvias, los constructores de fosfato también
pueden ser usados aquí.
Constructores adecuados pueden ser un material
de intercambio iónico inorgánico, comúnmente un material de
aluminosilicato hidratado inorgánico, más particularmente una
zeolita sintética hidratada como zeolita hidratada A, X, B, HS o
MAP.
Otro material de constructor adecuado inorgánico
es silicato estratificado, por ejemplo, SKS-6
(Hoechst). SKS-6 es un cristalino silicato
estratificado que consiste en silicato sódico
(Na_{2}Si_{2}O_{5}).
Los policarboxilatos adecuados que contienen un
grupo carboxi incluyen ácido láctico, ácido glicólico y derivados
de éter de los mismos como se describe en las patentes belgas n.º
831.368, 821.369 y 821.370. Los policarboxilatos que contienen dos
grupos carboxi incluyen las sales hidrosolubles de ácido succínico,
ácido malónico, ácido (etilenodioxi) diacético, ácido maleico, ácido
diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido fumárico, al
igual que los carboxilatos de éter descritos en publicación de
patente alemana 2.446.686, y 2.446.487, 3.935.257 y los sulfinil
carboxilatos descritos en la patente belga n.º 840.623. Los
policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi incluyen, en
particular, citratos, aconitratos y citraconatos solubles en agua,
así como derivados de succinatos como los carboximetiloxisuccinatos
descritos en la patente británica n.º 1.379.421, lactoxisuccinatos
descritos en la patente británica nº 1.389.732 y aminosuccinatos
descritos en la solicitud holandesa 7205873 y los materiales de
oxipolicarboxilatos como los
2-oxa-1,1,3-propano-tricarboxilatos
descritos en la patente británica n.º 1.387.447.
Los policarboxilatos que contienen cuatro grupos
carboxi incluyen los oxidisuccinatos descritos en la patente
británica n.º 1.261.829,
1,1,2,2-etano-tetracarboxilatos,
1,1,3,3-propano-tetracarboxilatos.
Los policarboxilatos que contienen sustituyentes sulfo incluyen los
derivados de sulfosuccinatos descritos en las patentes británicas
n.º 1.398.421 y 1.398.422 y la patente estadounidense n.º 3.936.448
y los citratos pirolizados sulfonados descritos en la patente
británica n.º 1.082.179, mientras que los policarboxilatos que
contienen sustituyentes de fosfona están descritos en la patente
británica n.º 1.439.000.
Los policarboxilatos alicíclicos y
heterocíclicos incluyen
ciclopentano-cis,cis,cis-tetracarboxilatos,
ciclopentadienido-pentacarboxilatos,
2,3,4,5-tetrahidrofurano-cis,cis,cis-tetracarboxilatos,
2,5-tetrahidrofurano-cis-dicarbocilatos,
2,2,5,5-tetrahidrofurano-tetracarboxilatos,
1,2,3,4,5,6-hexano-hexacarboxilatos
y derivados carboximetílicos de alcoholes polihidroxilados como
sorbitol, manitol y xilitol. Los policarboxilatos aromáticos
incluyen ácido melítico, ácido piromelítico y los derivados de
ácido ftálico descritos en la patente británica n.º 1.425.343.
De los anteriores, los policarboxilatos
preferidos son hidroxicarboxilatos que contienen hasta tres grupos
carboxi por molécula, más particularmente citratos.
Los sistemas constructores preferidos para uso
en las presentes composiciones incluyen una mezcla de un
constructor de aluminosilicato insoluble en agua como zeolita A o de
un silicato estratificado (SKS-6), y un agente
quelante de carboxilato hidrosoluble tal como ácido cítrico.
Un quelante adecuado para inclusión en las
composiciones de detergente conforme a la invención es ácido
etilendiamina N,N' disuccinico (EDDS) o el metal alcalino, metal
alcalinotérreo, amonio, o sales amónicas sustituidas de los mismos,
o mezclas derivadas. Los compuestos de EDDS preferidos son la forma
ácida libre y el sodio o sal magnésica de la misma. Ejemplos de
tales sales sódicas preferidas de EDDS incluyen Na_{2} EDDS y
Na_{4} EDDS. Ejemplos de tales sales magnésicas preferidas de EDDS
incluyen MgEDDS y Mg_{2} EDDS. Las sales magnésicas son las más
preferidas para la inclusión en composiciones conforme a la
invención.
Los sistemas de constructor preferidos incluyen
una mezcla de un constructor de aluminosilicato insoluble en agua
tal como zeolita A y un agente quelante de carboxilato soluble en
agua como ácido cítrico.
Otros materiales de constructor que pueden
formar parte del sistema constructor para uso en composiciones
granulosas incluyen materiales inorgánicos como carbonatos de metal
alcalino, bicarbonatos, silicatos y materiales orgánicos como los
fosfonatos orgánicos, polialquileno fosfonatos de amino y
policarboxilatos de amino.
Otras sales orgánicas hidrosolubles adecuadas
son el homo- o ácidos co-poliméricos o sus sales, en
las que el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales
de carboxilo separados uno de otro por no más de dos átomos de
carbono.
Los polímeros de este tipo están descritos en
GB-A-1.596.756. Ejemplos de tales
sales son poliacrilatos de MW 2000-5000 y sus
copolímeros con anhídrido maléico, tales copolímeros con un peso
molecular de de 20.000 a 70.000, especialmente, aproximadamente
40.000.
Las sales de constructor de detergencia son
normalmente incluidas en cantidades de de 5% a 80% en peso de la
composición. Los niveles preferidos de constructor para detergentes
líquidos son de 5% a 30%.
Las composiciones detergentes preferidas, además
de la preparación de pectato liasa de la invención, comprenden
otra/s enzima/s que proporciona/n ventajas de rendimiento de
limpieza y/o cuidado del tejido. Conforme a la presente invención,
las enzimas adicionales se pueden modificar para mejorar la
oxidación y la estabilidad de depleción de calcio.
Tales enzimas incluyen proteasas, lipasas,
cutinasas, amilasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas (p. ej.
lacasas), hemicelulasas, como mananasas, xilanasas, galactanasas,
arabinofuranosidasas, esterasas, liquenasas, arabinanasas y otras
pectato liasas.
Proteasas: Puede utilizarse cualquier
proteasa adecuada para uso en soluciones alcalinas. Las proteasas
adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano.
Se prefiere el origen microbiano. Están incluidos los mutantes
modificados química o genéticamente. La proteasa puede ser una
serina proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana N alcalina
o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son
subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus, por ejemplo,
subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309,
subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279).
Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (p. ej. de
origen bovino o porcino) y la Proteasa de fusarium descrita en WO
89/06270.
Las enzimas proteásicas preferidas disponibles
comercialmente incluyen aquellas vendidas bajo los nombres
comerciales Alcalase, Savinase, Primase, Durazym, y Esperase de Novo
Nordisk A/S (Deinamarca), las vendidas bajo el nombre comercial
Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect y Purafect OXP de
Genencor International, y las vendidas bajo el nombre comercial
Opticlean y Optimase por Solvay Enzymes. Las enzimas proteásicas se
pueden incorporar en las composiciones conforme a la invención a un
nivel de de 0,00001% a 2% de proteína enzimática en peso de la
composición, preferiblemente, a un nivel de de 0,0001% a 1% de
proteína enzimática en peso de la composición, más preferiblemente
a un nivel de de 0.001% a 0.5% de proteína enzimática en peso de la
composición, incluso más preferiblemente a un nivel de 0,01% a 0,2%
de proteína enzimática en peso de la composición.
Lipasas: Se puede utilizar cualquier
lipasa adecuada para uso en soluciones alcalinas. Las lipasas
adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Están
incluidos los mutantes modificados química o genéticamente.
Ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa
de Humicola lanuginosa, p. ej. como se describe en EP 258
068 y EP 305 216; una lipasa de Rhizomucor miehei, p. ej.
como se describe en EP 238 023, una lipasa de Candida, tal como un
lipasa de C. antarctica, por ejemplo, la lipasa de C.
antarctica A o B descrita en EP 214 761, una Lipasa de
pseudomonas tal como un lipasa de alcaligenes y P.
pseudoalcaligenes, por ejemplo, como se describe en EP 218 272,
una lipasa de P. cepacia, por ejemplo, como se describe en EP
331 376, una lipasa P. stutzeri, por ejemplo, como se
describe en GB 1.372.034, una lipasa de P. fluorescens, una
lipasa de Bacillus, por ejemplo, una lipasa de B.
subtili (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica
acta 1131, 253-260), una lipasa de B.
stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa de B.
pumilus (WO 91/16422).
Además, varias lipasas clonadas pueden ser
útiles, incluidas la lipasa P enicillium camembertii
descrita por Yamaguchi et al., (1991), Gene 103,
61-67), la lipasa de Geotricum candidum
(Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106,
383-388), y varias lipasas Rhizopus como una
lipasa R. delemar (Hass, M.J et al., (1991), Gene
109, 117-113), una lipasa R. niveus (Kugimiia
et al., (1992), Bio Sci. Biotech. Biochem. 56,
716-719) y una lipasa R. oryzae.
Otros tipos de enzimas lipolíticas como
cutinasas también pueden ser útiles, por ejemplo, una cutinasa
derivadas de Pseudomonas mendocina como se describe en WO
88/09367, o una cutinasa derivada de Fusarium solani pisi
(p. ej. descrita en WO 90/09446).
Las ipasas especialmente adecuadas son lipasas
como M1 Lipase^{TM}, Luma fast^{TM} y Lipomax^{TM}
(Genencor), Lipolase^{TM} y Lipolase Ultra^{TM} (Novo Nordisk
A/S), y Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Las lipasas son normalmente incorporadas en la
composición de detergente a un nivel de de 0,00001% a 2% de
proteína enzimática en peso de la composición, preferiblemente a un
nivel de de 0,0001% a 1% de proteína enzimática en peso de la
composición, más preferiblemente a un nivel de 0,001% a 0.5% de
proteína enzimática en peso de la composición, incluso más
preferiblemente a un nivel de 0,01% a 0,2% de proteína enzimática en
peso de la composición.
Amilasas: se puede utilizar cualquier
amilasa (alfa y/o beta) adecuada para uso en soluciones alcalinas.
Amilasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o
bacteriano. Están incluidos los mutantes modificados química o
genéticamente. Las amilasas incluyen, por ejemplo,
alfa-amilasas obtenidas de una cepa especial de
B. licheniformis, descritas en más detalle en GB 1.296.839.
Las amilasas disponibles comercialmente Duramyl^{TM},
Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM} (disponibles de Novo
Nordisk A/S) y Rapidase^{TM}, Maxamyl P^{TM}, Purastar^{TM} y
Purastar OxAm^{TM} (disponibles de Genencor). Además, es adecuada
una amilasa con más que 70% de homología a SP707 (Tsukamoto, A.
et al, 1988. Biochem. B iophys. Res. C ommun. 1 51:25) o K 38
(Kao Corp. E P1022334)''.
Las amilasas son normalmente incorporadas en la
composición de detergente a un nivel de 0,00001% a 2% de proteína
enzimática en peso de la composición, preferiblemente a un nivel de
0,0001% a 1% de proteína enzimática en peso de la composición, más
preferiblemente a un nivel de de 0,001% a 0,5% de proteína
enzimática en peso de la composición, incluso más preferiblemente a
un nivel de 0,01% a 0,2% de proteína enzimática en peso de la
composición.
Celulasas: Puede utilizarse cualquier
celulasa adecuada para uso en soluciones alcalinas. Las celulasas
adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Están
incluidos los mutantes modificados química o genéticamente. Las
celulasas adecuadas son descritas en US 4.435.307, que divulga
celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens. Las
celulasas especialmente adecuadas son las celulasas con ventajas de
cuidados del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas
descritas en la solicitud de patente europea n.º 0 495 257.
Las celulasas disponibles comercialmente
incluyen Celluzyme^{TM} producido por una cepa de Humicola
insolens, (Novo Nordisk A/S), y
KAC-500(B)^{TM} (Kao
Corporation).
Las celulasas normalmente son incorporadas en la
composición de detergente a un nivel de de 0,00001% a 2% de proteína
enzimática en peso de la composición, preferiblemente a un nivel de
de 0,0001% a 1% de proteína enzimática en peso de la composición,
más preferiblemente a un nivel de de 0,001% a 0,5% de proteína
enzimática en peso de la composición, incluso más preferiblemente a
un nivel de de 0,01% a 0,2% de proteína enzimática en peso de la
composición.
Peroxidasas/oxidasas: las enzimas de
peroxidasa se usan en combinación con peróxido de hidrógeno o una
fuente del mismo (p. ej. un percarbonato, perborato o persulfato).
Las enzimas oxidasas se usan en combinación con oxígeno. Ambos
tipos de enzimas se usan para "blanqueamiento de solución", es
decir, para prevenir transferencia de un tinte textil de un tejido
teñido a otro tejido cuando dichos tejidos son lavados juntos en una
solución de lavado, preferiblemente junto con un intensificador
como se describe en, por ejemplo, WO 94/12621 y WO 95/01426. Las
peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico,
bacteriano o vegetal. Están incluidos los mutantes modificados
química o genéticamente.
Las enzimas peroxidasas y/o oxidasas son
normalmente incorporadas en la composición de detergente a un nivel
de 0,00001% a 2% de proteína enzimática en peso de la composición,
preferiblemente a un nivel de 0,0001% a 1% de proteína enzimática
en peso de la composición, más preferiblemente a un nivel de 0,001%
a 0,5% de proteína enzimática en peso de la composición, incluso más
preferiblemente a un nivel de de 0,01% a 0,2% de proteína enzimática
en peso de la composición.
Pectato liasas: las pectato liasas han sido
clonadas de distintos géneros bacterianos como Erwinia, Pseudomonas,
Klebsiella y Xanthomonas. También se ha descrito la clonación de
una pectato liasa a partir de Bacillus subtilis (Nassen
et al. (1993) FEBS 335:319-326) y Bacillus
sp. YA-14 (Kim et al. (1994) Biosci. Biotech.
Biochem. 58:947-949).
Las pectato liasas son generalmente
caracterizadas por un pH alcalino óptimo y un requisito absoluto de
cationes bivalentes, siendo Ca^{2+} el más estimulador.
Las mezclas de las enzimas anteriormente
mencionadas son incluidas aquí, en particular, una mezcla de una
proteasa, una amilasa, una lipasa y/o una celulasa.
La pectato liasa de la invención, o cualquier
otra enzima incorporada en la composición de detergente, es
normalmente incorporada en la composición de detergente a un nivel
de 0,00001% a 2% de proteína enzimática en peso de la composición,
preferiblemente a un nivel de 0,0001% a 1% de proteína enzimática en
peso de la composición, más preferiblemente a un nivel de 0,001% a
0.5% de proteína enzimática en peso de la composición, incluso más
preferiblemente a un nivel de 0,01% a 0,2% de proteína enzimática en
peso de la composición.
Blanqueadores: los ingredientes de
detergente adicionales opcionales que se pueden incluir en las
composiciones detergentes de la presente invención incluyen
blanqueadores como PB1, PB4 y percarbonato con un tamaño de
partícula de 400-800 micras. Estos componentes
blanqueadores pueden incluir uno o más blanqueadores de oxígeno y,
dependiendo del blanqueador elegido, uno o más activadores de
blanqueamiento. En caso de estar presentes, los compuestos
blanqueadores de oxígeno típicamente estarán presentes en niveles de
aproximadamente 1% a aproximadamente 25%. En general, los
compuestos blanqueadores son componentes agregados opcionales en
formulaciones de no líquidas, por ejemplo detergentes
granulosos.
\newpage
El componente blanqueador para usar aquí puede
ser cualquiera de los blanqueadores útiles para composiciones
detergentes incluidos blanqueamientos con oxígeno al igual que otros
conocidos en la técnica.
El blanqueador adecuado para la presente
invención puede ser un blanqueador activado o no activado.
Una categoría de blanqueador con oxígeno que
puede ser usado incluye blanqueadores de ácido percarboxílico y
sales derivadas. Ejemplos adecuados de esta clase de agentes
incluyen hexahidrato de monoperoxiftalato de magnesio, la sal
magnésica de ácido meta-cloro perbenzoico, ácido
4-nonilamino-4-oxoperoxibutírico
y ácido diperoxidodecanedioico. Los blanqueadores son descritos en
US 4.483.781, US 740.446, EP 0 133 354 y US 4.412.934. Los
blanqueadores altamente preferidos también incluyen ácido
6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico
como se describe en US 4.634.551.
Otra categoría de blanqueadores que puede ser
usada comprende los blanqueadores halogenados. Ejemplos de
blanqueadores de hipohalita, por ejemplo, incluyen ácido
isocianúrico de tricloro y dicloroisocianuratos de sodio y de
potasio y alcano sulfonamidas de N-cloro y
N-bromo. Tales materiales son normalmente
adicionados a 0,5-10% en peso del producto acabado,
preferiblemente 1-5% en peso.
Los agentes de liberación de peróxido de
hidrógeno se pueden usar en combinación con activadores de blanqueo
como tetraacetiletilenodiamina (TAED) nonanoiloxibencenosulfonato
(NOBS, descrito en US 4.412.934),
3,5-trimetil-hexsanoloxibencenosulfonato
(ISONOBS, descrito en EP 120 591) o pentaacetilglucosa (PAG), que
se perhidroliza para formar un perácido como las especies de
blanqueamiento activas, conduciendo a efecto blanqueador mejorado.
Además, son muy adecuados los activadores de blanqueo
C8(6-octanamido-caproil)
oxibenceno-sulfonato,
C9(6-nonanamido caproil) oxibencenosulfonato
y C10 (6-decanamido caproílo) oxibencenosulfonato o
mezclas derivadas. También son activadores adecuados los ésteres de
citrato acilado como los descritos en solicitud de patente europea
n.º 91870207.7.
Blanqueadores útiles, incluidos peroxiácidos y
sistemas blanqueantes que comprenden activadores de blanqueo y
compuestos blanqueantes de peroxígeno para el uso en composiciones
de limpieza según la invención son descritos en la solicitud USSN
08/136.626 (WO 95/27772).
El peróxido de hidrógeno también puede estar
presente añadiendo un sistema enzimático (es decir. una enzima y un
sustrato) que sea capaz de generar peróxido de hidrógeno al
principio o durante el proceso de lavado y/o enjuague. Tales
sistemas enzimáticos son descritos en solicitud de patente europea
EP 0 537 381.
Los blanqueadores diferentes de los
blanqueadores de oxígeno también son conocidos en la técnica y
pueden ser utilizados aquí. Un tipo de blanqueador que no es de
oxígeno de interés particular incluye blanqueadores fotoactivados
como el zinc sulfonatado y/o ftalocianinas de aluminio. Estos
materiales se pueden depositar sobre el sustrato durante el proceso
de lavado. Al irradiar con luz, en presencia de oxígeno, tal como
tender ropa afuera para secar a la luz solar, la ftalocianina de
zinc sulfonatado es activada y, consecuentemente, el sustrato es
blanqueado. La ftalocianina de zinc preferida y un proceso de
blanqueamiento fotoactivado son descritos en US 4.033.718.
Típicamente, la composición de detergente contendrá aproximadamente
0,025% a aproximadamente 1,25%, en peso, de ftalocianina de zinc
sulfonatado.
Los blanqueadores también pueden comprender un
catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, por
ejemplo, ser uno de los compuestos descritos en, "Efficient
manganese catalysts for low-temperature
bleaching" Nature 369, 1994, pp. 637-639.
Supresores de espuma: otro ingrediente
opcional es un supresor de espuma, ejemplificado por siliconas y
mezclas de silicona de sílice. Las siliconas generalmente pueden
ser representadas por materiales de polisiloxano alquilados,
mientras que el sílice es normalmente usado en forma finamente
dividida ejemplificado por aerogeles de sílice y xerogeles y
sílices hidrofóbicos de varios tipos. Estos materiales se pueden
incorporar como partículas, en las que el supresor de espuma es
ventajosamente incorporado de forma móvil en un portador impermeable
de detergente sustancialmente no tensioactivo hidrodispersable o
hidrosoluble. Alternativamente, el supresor de espuma puede ser
disuelto o disperso en un portador líquido y aplicado pulverizando
en uno o más de los otros componentes.
Un agente de control de espuma de silicona
preferida se describe en US 3.933.672. Otros supresores de espuma
particularmente útiles son los supresores de espuma de silicona
autoemulsificantes, descritos en la solicitud de patente alemana
DTOS 2.646.126. Un ejemplo de tal compuesto es
DC-544, disponible comercialmente de Dow Coming,
que es un copolímero de siloxano-glicol. Agentes de
control de espuma especialmente preferidos son el sistema supresor
de espuma que comprende una mezcla de aceites de silicona y
2-alquil-alcanoles.
2-alquil-alcanoles son
2-butil-octanoles que están
disponibles comercialmente bajo el nombre comercial Isofol 12R.
Tal sistema supresor de espuma es descrito en la
solicitud de patente europea EP 0 593841.
Agentes controladores de espuma de silicona
especialmente preferidos son descritos en la solicitud de patente
europea n.º 92201649.8. Dichas composiciones pueden comprender una
mezcla de sílice/silicona en combinación con sílice pirógeno no
poroso como AerosilR.
Los supresores de espuma anteriormente descritos
son normalmente empleados en niveles de 0,001% a 2% en peso de la
composición, preferiblemente de 0,01% a 1% en peso.
Otros componentes: Pueden emplearse otros
componentes usados en composiciones detergentes como agentes de
suspensión de suciedad, agentes de liberación de la suciedad,
blanqueadores ópticos, abrasivos, bactericidas, inhibidores de
decoloración, agentes colorantes, y/o perfumes no encapsulados o
encapsulados.
Materiales de encapsulación especialmente
adecuados son cápsulas solubles en agua que consisten en una matriz
de compuestos de polisacárido y polihidroxi tal como se describe en
GB 1.464.616.
Otros materiales de encapsulación hidrosolubles
adecuados comprenden dextrinas derivadas de ésteres de ácido de
almidón no gelatinizado de ácidos dicarboxílicos sustituidos como se
describe en US 3.455.838. Estas dextrinas de éster de ácido son,
preferiblemente, obtenidas a partir de tales almidones como maíz
céreo, sorgo céreo, sagú, tapioca y patata. Ejemplos adecuados de
dichos materiales de encapsulación incluyen N-Lok
fabricado por National Starch. El material de encapsulación
N-Lok consiste en un almidón de maíz modificado y
glucosa. El almidón es modificado añadiendo grupos sustituidos
monofuncionales tal como anhídrido de ácido octenil succínico.
Los agentes de suspensión de tierra y
antirredeposición adecuados aquí incluyen derivados de celulosa tal
como metilcelulosa, carboximetilcelulosa y hidroxietilcelulosa, y
ácidos policarboxílicos homo- o co-poliméricos o
sus sales. Los polímeros de este tipo incluyen los copolímeros de
ácidos poliacrilatos y acrílico anhídrido maléico previamente
mencionados como constructores, al igual que copolímeros de
anhídrido maléico con etileno, metil vinil éter o ácido
metacrílico, el anhídrido maléico constituyendo al menos 20 mol
porcentaje del copolímero. Estos materiales son normalmente usados
a niveles de 0,5% a 10% en peso, más preferiblemente de 0,75% a 8%,
de forma más preferible de 1% a 6% en peso de la composición.
Los blanqueadores ópticos preferidos son
aniónicos, cuyos ejemplos son
4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2:2'.disulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-6-triazina-6-ilamino-estilbeno-2:2'-disulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2:2'-disulfonato,
monosodio
4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2-sulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidroxietilamino)-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato,
di-sodio
4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)-estilbeno-2,2'-disulfonato,
di-sodio
4,4'bis(2-anilino-4-(1-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato,
sodio
2(estilbil-4''-(nafto-1',2':4,5)-1,2,3,-triazola-2''-sulfonato
y
4,4'-bis(2-sulfostiril)bipenil.
Otros materiales poliméricos útiles son los
glicoles de politileno, particularmente aquellos de peso molecular
de 1000 a 10000, más particularmente 2000 a 8000 y de forma más
preferible aproximadamente 4000. Estos se usan en niveles de 0,20%
a 5% más preferiblemente de 0,25% a 2.5% en peso. Estos polímeros y
las sales de policarboxilato homo o co-poliméricas
previamente mencionadas son valiosos para mejorar el mantenimiento
de blancura, la deposición de ceniza del tejido, y el rendimiento de
limpieza en arcilla, tierras oxidables y proteínicas en presencia
de impurezas de metales de transición.
Agentes de liberación de suciedad útiles en
composiciones de la presente invención son, de manera convencional,
copolímeros o termopolímeros de ácido tereftálico con etilenglicol
y/o unidades de propilenoglicol en varias disposiciones. Ejemplos
de tales polímeros son descritos en US 4.116.885 y 4.711.730 y EP 0
272 033. Un polímero particular preferido conforme a EP 0 272 033
tiene la fórmula:
(CH_{3}(PEG)_{43})_{0,75}
(POH)_{0,25} [T-PO)_{2,8}
(T-PEG)_{0,4}]T(POH)_{0,25}
((PEG)_{43}
CH_{3})_{0,75}
en la cual PEG es
-(OC_{2}H_{4})O-, PO es (OC_{3}H_{6}O) y T es
(pOOC_{6}H_{4}CO).
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También resultan muy útiles los poliésteres
modificados como copolímeros aleatorios de dimetil tereftalato,
dimetils ulfoisoftalato, etilenglicol y
1,2-propanediol, las grupos terminales que consisten
principalmente en sulfobenzoato y secundariamente de monoésteres de
etilenglicol y/o 1,2-propanediol. El objetivo es
obtener un polímero cubierto en ambos extremos por grupos de
sulfobenzoato, "principalmente", en el presente contexto la
mayor parte de dichos copolímeros aquí estará recubierto en los
extremos por grupos de sulfobenzoato. No obstante, algunos
copolímeros estarán menos que completamente cubiertos, y, por lo
tanto, sus grupos terminales pueden consistir en monoéster de
etilenglicol y/o 1,2-propanediol; los mismos
consisten "secundariamente" en tales especies.
Los poliésteres seleccionados aquí contienen
aproximadamente 46% en peso de ácido dimetil tereftálico,
aproximadamente 16% en peso de 1,2-propanediol,
aproximadamente 10% etilenglicol en peso, aproximadamente 13% en
peso de ácido dimetil sulfobenzoico y aproximadamente 15% en peso de
ácido sulfoisoftálico, y tienen un peso molecular de
aproximadamente 3.000. Los poliésteres y su método de preparación
son descritos en detalle en EP 311 342.
Agente suavizante: Los agentes suavizantes de
tejido también pueden también ser incorporados en composiciones de
detergente de lavado conforme a la presente invención. Estos agentes
puede ser de tipo inorgánico u orgánico.. Los agentes suavizantes
inorgánicos son ejemplificados por las arcillas tipo esmectita
descritas en GB-A-1 400898 y en US
5.019.292 Agentes suavizantes de tejido orgánicos incluyen las
aminas terciarias insolubles de agua como se describen en
GB-A1 514 276 y EP 0 011 340 y su combinación con
sales amónicas cuaternarias mono C_{12}-C_{14}
son descritas en EP-B-0026 528 y
amidas de cadena larga como las descritas en EP 0 242 919. Otros
ingredientes orgánicos útiles de sistemas suavizantes de tejido
incluyen materiales de óxido de polietileno de peso molecular alto
como se describen en EP 0 299 575 y 0 313 146.
Los niveles de arcilla tipo esmectita están
normalmente en la gama de 5% a 15%, más preferiblemente de 8% a 12%
en peso, con el material que se adiciona como un componente seco
mezclado al resto de la formulación. Agentes suavizantes de tejido
orgánicos tal como las aminas terciarias insolubles en agua o
materiales de amida de cadena dilong se incorporan en nivele de
0,5% a 5% en peso, normalmente de 1% a 3% en peso mientras los
materiales de óxido de polietileno de peso molecular alto y los
materiales catiónicos hidrosolubles se agregan en niveles de 0,1% a
2%, normalmente de 0,15% a 1,5% en peso. Estos materiales son
normalmente adicionados a la parte secada por atomización de la
composición, aunque en algunos ejemplos puede ser más conveniente
añadirlos como partículas secas mezcladas, o rociarlas como líquido
fundido sobre otros componentes sólidos de la composición. Agentes
poliméricos inhibidores de la transferencia de tintes: las
composiciones detergentes según a la presente invención también
pueden comprender de 0,001% a 10%, preferiblemente de 0,01% a 2%,
más preferiblemente de 0,05% a 1% en peso de agentes poliméricos
inhibidores de transferencias de tintes. Dichos agentes poliméricos
inhibidores de transferencia de tintes son normalmente incorporados
en composiciones detergentes para inhibir la transferencia de
tintes desde tejidos coloreados a tejidos lavados con lo los
mismos. Estos polímeros tienen la capacidad de complejar o adsorber
los tintes fugaces que se quitaron de tejidos teñidos antes de que
los tintes tengan la oportunidad a apegarse a otros artículos en el
lavado.
Agentes poliméricos inhibidores de transferencia
de tintes especialmente adecuados son polímeros N-óxido poliamina,
copolímeros de N-vinil-pirrolidona y
N-vinilimidazola, polímeros de polivinilpirrolidona,
poliviniloxazolidonas y polivinilimidazolas o mezclas
derivadas.
La adición de tales polímeros también mejora el
rendimiento de las enzimas conforme a la invención.
La composición de detergente según la invención
puede ser en formas de líquido, pasta, geles, barras o
gránulos.
Los granulados no polvorientos pueden ser
producidos, por ejemplo, como se describe en US 4.106.991 y
4.661.452 (ambos de Novo Industri A/S) y opcionalmente pueden ser
revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de
materiales de recubrimiento cerosos son productos de poli(óxido de
etileno) (polietilenoglicol; PEG) con pesos moleculares medios de
1000 a 20000 nonilfenoles etoxilados con 16 a 50 unidades de óxido
de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol
contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los cuales hay 15 a 80
unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y
mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de
materiales de recubrimiento que forman películas adecuados para la
aplicación por técnicas de lecho fluidificado se dan en GB
1483591.
Las composiciones granulosas según la presente
invención también pueden estar en "forma compacta", es decir,
pueden tener una densidad relativamente más alta que los detergentes
granulosos convencionales, es decir, de 550 a 950 g/l; en tal caso,
las composiciones detergentes granulosas según la presente invención
contendrán una cantidad inferior de "sal de relleno
inorgánico", en comparación con detergentes granulosos
convencionales; sales de relleno típicas son sales de metal
alcalinotérreo de sulfatos y cloruros, típicamente sulfato de
sodio; el detergente "compacto" típicamente comprende no más
que 10% de sal de relleno. Las composiciones líquidas según la
presente invención también pueden estar en "forma concentrada",
en tal caso, las composiciones de detergente líquido según la
presente invención contendrán una cantidad inferior de agua, en
comparación con detergentes líquidos convencionales. Típicamente,
el contenido de agua del detergente líquido concentrado es inferior
a 30%, más preferiblemente menos que 20%, de forma más preferible
menos que 10% en peso de las composiciones detergentes.
Las composiciones de la invención pueden, por
ejemplo, ser formuladas como composiciones de detergente de lavado
a mano y a máquina incluidas composiciones de aditivo de lavandería
y composiciones adecuadas para uso en la pretratamiento de tejidos
manchados, composiciones de suavizante adicionado al enjuague y
composiciones para uso en operaciones de limpieza de superficies
duras del hogar en general y operaciones de lavado de la
vajilla.
Los siguientes ejemplos tienen el objeto de
ejemplificar las composiciones para la presente invención, pero no
necesariamente tienen el objeto de limitar o definir de otra manera
el ámbito de la invención.
En las composiciones detergentes, las
identificaciones de componente abreviadas tienen los siguientes
significados:
LAS: sulfonato sódico de alquil benceno lineal
C_{12}
TAS: alquil sulfato de sebo de sodio
XYAS: alquil sulfato de sodio
C_{1X}-C_{1Y}
SS: tensioactivo de jabón secundario de
fórmula ácido 2-butil octanoico
25EY: un alcohol primario lineal
C_{12}-C_{15} predominantemente condensado con
un promedio de moles Y de óxido de etileno
45EY: un alcohol primario lineal
C_{14}-C_{15} predominantemente condensado con
un promedio de moles Y de óxido de etileno
XYEZS: alquil sulfato de sodio
C_{1X}-C_{1Y} condensado con un promedio de
moles Z de óxido de etileno por mol
No iónico: alcohol graso etoxilado/propoxilado
mezclado C_{13}-C_{15} con un grado medio de
etoxilación de 3,8 y un grado medio de
CFAA: propoxilación de 4,5 vendido bajo el
nombre comercial de Plurafax LF404 por BASF Gmbh alquil
N-metil glucamida
C_{12}-C_{14}
TFAA: alquil N-metil
C_{16}-C_{18} glucamida
Silicato: silicato sódico amorfo
(SiO_{2}:Na_{2} O proporción = 2,0)
NaSKS-6: silicato cristalino
estratificado de fórmula \delta-Na_{2} Si_{2}
O_{5}
Carbonato: carbonato de sodio anhidro
Fosfato: tripolifosfato de sodio
MA/AA: copolímero de 1:4 ácido
maléico/acrílico, peso molecular medio aproximadamente 80.000
Poliacrilato: homopolímero de poliacrilato con
un peso medio molecular de 8.000 vendido bajo el nombre comercial
PA30 por BASF Gmbh
Zeolita A: aluminoxsilicato de sodio hidratado
de fórmula Na_{12} (AlO_{2}SiO_{2})_{12} 27H_{2}O
con un tamaño de partícula primaria en la gama de 1 a 10
micrómetros
Citrato: dihidrato de citrato trisódico
Cítrico: ácido cítrico
Perborato: blanqueo de monohidrato de
perborato sódico anhidro, fórmula empírica
NaBO_{2}H_{2}O_{2}
PB4: perborato sódico tetrahidrato anhidro
Percarbonato: blanqueo de percarbonato de sodio
anhidro de fórmula empírica 2Na_{2}CO_{3}3H_{2}O_{2}
TAED: tetraacetil etilenodiamina
CMC: carboximetilcelulosa de sodio
DETPMP: dietilentriamina penta (ácido
fosfónico del metileno), comercializado por Monsanto bajo el nombre
comercial Dequest 2060
PVP: polímero de polivinilpirrolidona
EDDS: ácido
etilenodiamina-N,N'-disuccínico,
[S,S] isómero en forma de la sal sódica
Espumas 25% cera de parafina Mpt 50ºC, 17%
sílice hidrofóbico, 58%
Supresor: aceite de parafina
espuma granulosa 12% silicona/sílice, 18% de
estearil alcohol, 70%
supresor: almidón en forma granulosa
Sulfato: sulfato de sodio anhidro
HMWPEO: óxido de polietileno de peso molecular
alto
TAE 25: etoxilato de alcohol de sebo (25)
\newpage
Ejemplo de detergente
I
Una composición de limpieza de tejido granulosa
conforme a la invención se puede preparar de la siguiente
manera:
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Ejemplo de detergente
II
Una composición de limpieza de tejido granulosa
compacta (densidad 800 g/l) conforme a la invención se puede
preparar de la siguiente manera:
\newpage
Ejemplo de detergente
III
Composiciones de limpieza de tejido granulosas
conforme a la invención especialmente útiles en el lavado de
tejidos coloreados fueron preparados de la siguiente manera:
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo detergente
IV
Composiciones de limpieza de tejido granulosas
conforme a la invención que proporcionan capacidad "suavidad a
través del lavado" se puede preparar de la siguiente manera:
Ejemplo detergente
V
Composiciones de limpieza de tejido líquidas de
gran resistencia conforme a la invención se puede preparar de la
siguiente manera:
La estabilidad detergente de las variantes de
pectato liasa de la presente invención es evaluada midiendo la
actividad de las variantes tras la incubación de una mezcla de
detergente de enzima, que se describe más abajo.
30 microlitros de una solución enzimática
(sobrenadante del cultivo o enzima purificada) se mezcla con 1 ml
de detergente líquido típico de gran resistencia europeo o
estadounidense en dos tubos de muestra. Uno de los tubos se
almacena en hielo mientras que el otro se incuba a 40ºC durante 90
minutos. Como referencia, 30 microlitros de agua se mezclan con 1
ml de detergente y se incuban en hielo. Tras la incubación, 9 ml de
agua helada se añade a las muestras, que se mezcla enérgicamente y
se almacena en hielo hasta el análisis posterior.
La actividad enzimática primero se mide
mezclando 50 microlitros de mezcla de detergente de enzima con 5 ml
de tampón de ensayo (100 mM Tris-HCL, 0,68 mM
CaCl_{2}, pH 8,0), en segundo lugar, de esa solución, 75
microlitros se mezclan con 75 microlitros de solución de sustrato
recién preparada (ácido poligalacturónico al 1% en tampón de
ensayo) y se incuba a 40 grados Celsius durante 10 minutos. En
tercer lugar, 100 microlitros de la mezcla de incubación se añaden
en 100 microlitros de tampón de parada (50 mM H_{3} PO_{4}) en
una placa de microvaloración transparente de UV y la absorbencia a
235 nm se mide en un espectofotómetro. La muestra de detergente
hidrosoluble se utiliza para ajustar en cero el
espectofotómetro.
Ahora la actividad residual se calcula como la
actividad (absorbencia A235) en la muestra incubada a 40 grados
Celsius durante 90 minutos en relación a la actividad en la muestra
almacenada en hielo:
Actividad
residual (AR) = absorbencia [muestra incubada a 40ºC/absorvencia
[muestra incubada a 0º] x
100
Así, la actividad residual es equivalente a la
estabilidad detergente de la enzima. La tabla 2 presenta la
actividad residual mejorada de varias sustituciones de la pectato
liasa de SEC ID N.º 2 incubadas en un detergente líquido de gran
resistencia europeo típico. El mayoría de las sustituciones dan
lugar a más que 50% de mejora en la estabilidad detergente en
comparación con la pectato liasa progenitora como se muestra en SEC
ID N.º 2. De forma equivalente, las sustituciones de pectato liasa
de SEC ID N.º 2 catalogadas en la tabla 3 mejoran
significativamente la estabilidad de la enzima cuando es incubada en
un detergente líquido estadounidense de gran resistencia
típico.
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La estabilidad detergente de las variantes de
pectato liasa de la presente invención es evaluada midiendo la
actividad de las variantes tras la incubación de una mezcla de
detergente de enzima, que es descrita más abajo.
30 microlitros de una solución enzimática
(sobrenadante del cultivo o enzima purificada) se mezcla con 1 ml
de detergente líquido europeo de gran resistencia típico en dos
tubos de muestra. Uno de los tubos se almacena en hielo mientras
que el otro se incuba a 40 grados Celsius durante 18 o 24 horas.
Como referencia, 30 microlitros de agua se mezclan con 1 ml de
detergente y se incuban en hielo. Tras la incubación, 9 ml de agua
helada se añade a las muestras, que se mezcla enérgicamente y se
almacena en hielo hasta el análisis posterior.
La actividad enzimática primero se mide
mezclando 50 microlitros de mezcla de detergente de enzima con 5 ml
de tampón de ensayo (100 mM Tris-HCL, 0,68 mM
CaCl_{2}, pH 8,0), en segundo lugar, de esa solución, 75
microlitros se mezclan con 75 microlitros de solución de sustrato
recién preparada (ácido poligalacturónico al 1% en tampón de
ensayo) y se incuba a 40 grados Celsius durante 10 minutos. En
tercer lugar, 100 microlitros de la mezcla de incubación se añaden
en 100 microlitros de tampón de parada (50 mM H_{3} PO_{4}) en
una placa de microvaloración transparente de UV y la absorbencia a
235nm se mide en un espectofotómetro. La muestra de detergente
hidrosoluble se utiliza para ajustar en cero el
espectofotómetro.
Ahora, la actividad residual se calcula como la
actividad (absorbencia A235) en la muestra incubada a 40 grados
Celsius durante 90 minutos en relación a la actividad en la muestra
almacenada en hielo:
Actividad
residual (AR) = absorbencia [muestra incubada a 40ºC/Absorvencia
[muestra incubada a 0º] x
100
Así, la actividad residual es equivalente a la
estabilidad detergente de la enzima. La tabla 4 presenta la
actividad residual mejorada de varias sustituciones de la pectato
liasa de SEC ID N.º 2 incubadas en un detergente líquido europeo de
gran resistencia típico durante 18 horas. Asimismo, la tabla 5
presenta la actividad residual de variantes de pectato liasa
incubadas durante 24 horas.
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\vskip1.000000\baselineskip
La termoestabilidad de variantes de pectato
liasa de la invención fue medida calorimetría por análisis
diferencial (DSC). Los experimentos fueron conducidos en un tampón
(a diferencia del detergente). Muestras de enzima purificadas
fueron dializadas dos veces contra 5 L 20 mM HEPES tampón, 0,68 mM
CaCl_{2}, pH 8,0 en 10 kDa
Slide-A-Lyzers (Pierce; EE. UU.)
cortado y concentradas a aprox. 10 mg/ml por 2.400 g centrifugado en
un Biofuge Stratos (Kendro, Alemania) en YM 10 kDa Centricon cells
(Amicon). La DSC fue realizada en un MCS 4100 (Calorimetry Sciences
Corporation, EE. UU.) con un gradiente 1ºC/min de 5 a 110ºC y datos
analizados por software CpCalc 2,1 (Applied Thermodynamics, EE.
UU.).
Se observa que todas las variantes son
térmicamente estabilizadas en comparación con el progenitor.
<110> Novozymes A/S
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<120> variantes de pectato liasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10190.010-DK
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3,2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1200)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (29)
1. Una variante de una enzima parental con
actividad de pectato liasa, EC 4.2.2.2, teniendo la variante la
estabilidad detergente mejorada en comparación con dicha enzima
parental, y comprendiendo la variante una alteración en una o más
posiciones seleccionadas del grupo que consiste en el número de
posiciones: 5, 9, 11, 26, 28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47, 48, 49,
50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86, 87, 91,
99, 105, 106, 107, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136, 139, 140,
141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 193, 194, 196,
199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234, 235, 237,
251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302, 303, 305,
307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334, 335, 336,
337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378, 381, 384,
386, 387, 389, 390, 391, 393 y 397, donde
- a)
- la o las alteraciones son independientemente
- i)
- una inserción de un aminoácido debajo del aminoácido que ocupa la posición,
- ii)
- una deleción del aminoácido que ocupa la posición, o
- iii)
- una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente;
- b)
- cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 2:
- c)
- la enzima parental es la pectato liasa mostrada en SEC ID N.º 2 o una pectato liasa con al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2 y
- d)
- la variante tiene actividad de pectato liasa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Variante según la reivindicación 1 donde la
o las alteraciones son sustitución o sustituciones.
3. Variante según la reivindicación 1 o 2 que
comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que
consisten en: H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N,
N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L,
N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*, K71 E,
G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N,
K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N,
K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V123I,
S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V,
V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E,
K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D,
H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E,
K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A228I, S229T,
Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y,
R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A,
D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N,
S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, I336S, S337C,
S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N,
S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, I357V, N363S, S366N, T378G,
T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A, V389I, I390N, I390T, S391
N, A393V y K397D, y caracterizada por el hecho de que cada
posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos
de la pectato liasa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º
2.
4. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que comprende un conjunto de
sustituciones seleccionadas del grupo que consisten en:
K139I+Q146H+S337C;
D48P+K99I+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S33IP;
D48P+M64F+K139I+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337C;
D48P+M64F+K139I+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337K;
D48P+M64F+K1391+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337R;
D48P+M64F+K99I+K118E+M122K+Q146H+K213N+K218P+A305P+S331P;
D48P+M64F+K99R+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K;
D48P+M64F+L106Q+K139I+Q146H+K213T+K218L+Y234H+A305P+S331P+S337C;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+C199S+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K148E+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337R;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K148Q+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337R;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S340P;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K+S340P;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+K334E+S340P;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+K334E+
S337K+S340P;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+
S337K;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+K334E+S337K;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+Y295H+A305P+S331P+S337K;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+N189D+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337R;
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+N189D+K213T+K218P+T258I+S298N+A305P+
S331P+S337R;
D48P+M64F+T105P+K139I+V141E+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K;
D48P+M64F+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+5337K;
D48P+M64F+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337R;
D48P+M64F+T105P+K139N+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P;
D48P+M64F+T105P+M122K+K118E+K213T+K218P+A305P+S331P;
D48P+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P;
D48P+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K;
D48P+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337R;
M64F+M122K+K118E+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337K;
M64F+M122K+K118E+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337R;
y
M64F+M122K+K118E+Q146H+K213T+K218L+A305P+S340P;
\vskip1.000000\baselineskip
5. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la pectato liasa progenitora se
codifica por un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de
astringencia alta, con el polinucleótido de SEC ID N.º 1 o su
cadena complementaria.
6. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es trece.
7. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es doce.
8. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es once.
9. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es diez.
10. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es ocho.
11. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es siete.
12. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es cuatro.
13. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es tres.
14. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el número total de
alteraciones es dos.
15. Polinucleótido que codifica la variante de
cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
16. Vector de expresión que comprende el
polinucleótido según la reivindicación 15.
17. Célula huésped microbiana transformada con
el vector de expresión según la reivindicación 16.
18. Célula huésped microbiana según la
reivindicación 17, en la que la célula es una Bacillus
subtilis.
19. Célula huésped microbiana según la
reivindicación 17, en la que la célula es una Aspergillus.
20. Método para la producción de una variante de
pectato liasa según cualquiera de las reivindicaciones
1-14, en el que una célula huésped microbiana según
cualquiera de las reivindicaciones 17-19 es
cultivada bajo condiciones conductoras a la expresión y la
secreción de la variante, y siendo la variante es recuperada.
21. Método para mejorar la estabilidad
detergente de una pectato liaza, que comprende la aleración de una
o más posiciones seleccionadas a partir del grupo que consiste en el
número de posiciones: 5, 9, 11, 26, 28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86,
87, 91, 99, 105, 106, 107, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136,
139, 140, 141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 193,
194, 196, 199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234,
235, 237, 251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302,
303, 305, 307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334,
335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378,
381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 393 y 397, caracterizada
por el hecho de que
- a)
- la o las alteraciones son independientemente
- i)
- una inserción de un aminoácido debajo del aminoácido que ocupa la posición,
- ii)
- una deleción del aminoácido que ocupa la posición, o
- iii)
- una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente;
- b)
- cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2;
- c)
- la pectato liasa tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2 y
- d)
- la variante tiene actividad de pectato liasa.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Método según la reivindicación 21, donde la
o las alteraciones son sustituciones.
23. Método según la reivindicación 21 o 22 que
comprende una o más sustituciones seleccionadas a partir del grupo
que consisten en: H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T,
H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D,
N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*,
K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I,
K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N,
K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V123I,
S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V,
V141G, V141 E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E,
K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D,
H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E,
K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A228I, S229T,
Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y,
R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A,
D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N,
S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, I336S, S337C,
S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N,
S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, I357V, N363S, S366N, T378G,
T378S, A381 D, H384N, K386P, K386R, S387A, V389I, I390N, I390T,
S391N, A393V y K397D, y donde cada posición corresponde a una
posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa con la
secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2.
24. Composición de detergente o limpieza,
preferiblemente una composición de lavado de lavandería o de
vajillas, que comprende la variante tal y como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y además
comprende un tensioactivo.
25. Composición según la reivindicación 24, que
adicionalmente comprende una celulasa, una lipasa, una cutinasa,
una oxidorreductasa, una proteasa, una amilasa, una hemicelulasa,
tal como una mananasa, una xilanasa, una galactanasa, una
arabinofuranosidasa, una esterasa, un liquenasa, una arabinanasa,
otra pectato liasa o una mezcla de las mismas.
26. Uso de una variante de pectato liasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en una
composición de detergente.
27. Uso de una variante de pectato liasa según
cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en el
tratamiento de fibra celulósica y textil.
28. Método de descrudado enzimático, que
comprende el contacto del material de la pared celular con la
variante de pectato liasa definida en cualquiera de las
reivindicaciones 1-14.
29. Método para la eliminación enzimática de
material de pared celular de tejidos, que comprendiente el contacto
del tejido con la variante de pectato liasa definida en cualquiera
de las reivindicaciones 1-14.
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