DE10036753A1 - Neues amylolytisches Enzym aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein neues amylolytisches Enzym aus dem Mikroorganismus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) sowie hinreichend ähnliche Proteine mit amylolytischer Funktion, Verfahren zu deren Herstellung sowie diverse Verwendungsmöglichkeiten für diese Proteine. Über die ausgeführten Verwendungsmöglichkeiten hinaus können sie auf andere, vor allem technische Verwendungsmöglichkeiten hin weiterentwickelt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues amylolytisches Enzym aus dem Mikroorganismus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), sowie hinreichend ähnliche Proteine mit amylolytischer Funktion, Verfahren zu deren Herstellung, sowie diverse Verwendungsmöglichkeiten für diese Proteine. Ohne auf die genannten Verwendungsmöglichkeiten beschränkt zu sein, werden einige besonders hervorgehoben. Das mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellte Enzym sowie die hinreichend ähnlichen amylolytischen Proteine können über diese Verwendungsmöglichkeiten hinaus auf andere, vor allem technische Verwendungsmöglichkeiten hin weiterentwickelt werden.

α-Amylasen (E.C. 3. 2. 1. 1) hydrolysieren im Polymerinneren gelegene α-1,4- glycosidische Bindungen von Stärke und stärkeähnlichen Polymeren, wie beispielsweise Amylose, Amylopektin oder Glykogen, unter Bildung von Dextrinen und β-1,6-verzweigten Oligosacchariden. Sie gehören zu den wichtigsten industriell genutzten Enzymen überhaupt. Dies aus zwei Gründen: Zum einen werden sie zumeist wie viele substratabbauende Enzyme von Mikroorganismen in das umgebende Medium abgegeben, so daß sie durch Fermentation und Aufreinigung aus dem Kulturmedium mit vergleichsweise geringem Aufwand in industriellem Maßstab gewonnen werden können. Zum anderen werden Amylasen für ein breites Anwendungsspektrum benötigt.

An erster Stelle der technischen Verwendungen von α-Amylase steht die Herstellung von Glucosesirup. Andere Verwendungen sind beispielsweise die als aktive Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln, zur Behandlung von Rohmaterialien in der Textilherstellung, zur Herstellung von Klebstoffen oder zur Herstellung von zuckerhaltigen Lebensmitteln oder Lebensmittelbestandteilen.

Ein Beispiel für eine technisch besonders intensiv eingesetzte Amylase ist die α-Amylase aus Bacillus licheniformis, die von der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark, unter dem Handelsnamen Termamyl® angeboten wird. Die aus B. subtilis, beziehungsweise B. amyloliquefaciens gewonnene und in der US-Anmeldung US 1 227 374 offenbarte Amylase wird von derselben Firma unter dem Namen BAN® vertrieben.

Dieses Amylase-Molekül, beziehungsweise dessen nahen Verwandte, sind in zahlreichen Erfindungen weiterentwickelt worden, denen die Aufgabe zugrunde gelegen hat, mithilfe diverser molekularbiologischer Modifikationen ihre enzymatischen Eigenschaften auf spezifische Anwendungen hin zu optimieren. Solche Optimierungen können beispielsweise die Substratspezifitäten, die Stabilität des Enzyms unter verschiedenen Reaktionsbedingungen oder die enzymatische Aktivität selbst betreffen. Beispielhaft für solche Optimierungen seien folgende Anmeldungen genannt: EP 0410498 für das Schlichten von Textilien und WO 96/02633 zur Stärkeverflüssigung.

Da Entwicklungen, die lediglich in Optimierungen von nur wenigen bekannten Ausgangsenzymen bestehen, möglicherweise in den erzielbaren Ergebnissen beschränkt sind, findet parallel dazu eine intensive Suche nach vergleichbaren Enzymen aus anderen natürlichen Quellen statt. Identifiziert wurden stärkespaltende Enzyme beispielsweise aus Pimelobacter, Pseudomonas und Thermus für die Lebensmittelherstellung, Kosmetik und Pharmaka (EP 0 636 693), ebensolche aus Rhizobium, Arthrobacier, Brevibacterium und Micrococcus (EP 0 628 630), aus Pyrococcus (WO 94/19454) und Sulfolobus zur Stärkeverflüssigung bei hohen Temperaturen, beziehungsweise stark sauren Reaktionsbedingungen (EP 0 727 485 und WO 96/02633). Für den Einsatz bei alkalischen pH-Werten sind Amylasen aus Bacillus sp. (WO 95/26397 und WO 97/00324) gefunden worden. Wegen ihrer geringen Empfindlichkeit gegenüber Detergenzien eignen sich andere Amylasen aus verschiedenen Bacilli (EP 0 670 367) zur Verwendung in Wasch- oder Reinigungsmitteln.

Weitere Optimierungen der aus natürlichen Quellen isolierten Enzyme für das jeweilige Anwendungsgebiet können beispielsweise über molekularbiologische Methoden (etwa gemäß US 5171673 oder WO 99/20768) oder über chemische Modifikationen vorgenommen werden (DE 40 13 142). In der Patentanmeldung WO 99/43793, beispielsweise, wird eine Weiterentwicklung der bekannten Novamyh-α-Amylase beschrieben. Darin werden Sequenzähnlichkeiten zwischen Novamyl® und bekannten Cyclodextringlucanotransferasen (CGTasen) ausgenutzt, um mithilfe molekularbiologischer Techniken eine Schar verwandter Moleküle zu konstruieren. Bei diesen handelt es sich um α-Amylasen mit zusätzlichen CGTase-spezifischen Consensus-Sequenzen (Boxen) und Funktionen oder, umgekehrt, um CGTasen mit zusätzlichen für α-Amylasen typischen Bereichen und Funktionen oder um Chimären beider Moleküle. Der Sinn dieser Entwicklung besteht darin, Novamyl® für diese Anwendungen zu optimieren.

Die Anmeldung WO 99/57250, beispielsweise, gibt eine Lehre an die Hand, für die Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignete Enzyme über einen chemischen Linker mit einer Bindungsdomäne zu verknüpfen, welche die effektive Enzymkonzentration auf dem Reinigungsgut erhöht.

Trotz all dieser Entwicklungen besteht aber unverändert die Aufgabe, neben den wenigen natürlichen amylolytischen Enzymen, die unverändert oder in Gestalt von Weiterentwicklungen tatsächlich industriell genutzt werden, weitere aufzufinden, die a priori ein breites Anwendungsspektrum aufweisen und als Ausgangspunkt für spezifsche Weiterentwicklungen dienen können.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein natürlich vorkommendes Enzym zur Verfügung gestellt, welches aufgrund seiner Sequenzhomologien zu den bislang bekannten Enzymen und aufgrund seiner enyzmatischen Aktivität als α-Amylase angesehen werden muß. Es kann prinzipiell für alle Verwendungen eingesetzt werden, die einer amylolytischen Funktion bedürfen. Es eignet sich besonders für solche Verwendungen, die bei alkalischen pH-Werten und mittleren Temperaturbereichen ablaufen, insbesondere bei pH-Werten oberhalb von 9 und/oder Temperaturen oberhalb von 40°C. Das Anwendungsspektrum wird erweitert durch die vergleichsweise hohe Stabilität des Enzyms gegenüber Detergenzien und Proteasen. Es kann über die im Stand der Technik etablierte Methodik auf spezielle Anwendungen hin weiterentwickelt werden, weil mit der vorliegenden Erfindung sowohl die Aminosäure- als auch die Nukleotidsequenzen zur Verfügung gestellt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Idee zugrunde, Vertreter eines Proteintyps, der über die amylolytische Funktion und gleichzeitig die hohe Homologie zu den in den Sequenzprotokollen angegebenen Sequenzen definiert wird, mithilfe der zugehörigen genetischen Information zu erhalten, quantitativ herzustellen und all den Anwendungen zuzuführen, für die sie sich naturgemäß besonders eignen, um sie gegebenenfalls weiterzuentwickeln.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind amylolytische Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder einer von den Positionen 32 bis 515 der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz entsprechenden Teilsequenz mindestens zu 96%, vorzugsweise mindestens zu 98% und besonders bevorzugt zu 100% identisch sind. Diesem Erfindungsgegenstand werden auch jene amylolytischen Proteine zugerechnet, die sich von Nukleinsäuren ableiten, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch, bevorzugt mindestens zu 90% und besonders bevorzugt zu 100% identisch sind, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäuren 32 bis 515 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht. Diesem Erfindungsgegenstand werden auch amylolytische Proteinfragmente oder amylolytische, durch Deletionsmutation erhaltene, entsprechend homologe Proteine zugerechnet. Amylolytische, durch Insertionsmutation erhaltene Proteine oder amylolytische chimäre Proteine werden diesem Erfindungsgegenstand zugerechnet, welche wenigstens in einem eine amylolytische Aktivität verleihenden Teil aus einem Protein bestehen, das mit entsprechend homologen Proteinen oder Fragmenten identisch ist. Das gleiche gilt für amylolytisch aktive Derivate entsprechender Proteine. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes sind entsprechende amylolytische Proteine oder Derivate, die natürlicherweise aus Mikroorganismen erhältlich sind, bevorzugt von gram-positiven Bakterien, besonders bevorzugt von solchen der Gattung Bacillus und ganz besonders bevorzugt von solchen der Species Bacillus sp. A 7-7, und zwar Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368).

Ein zweiter Erfindungsgegenstand sind für amylolytische Proteine codierende Nukleinsäuren, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch, bevorzugt mindestens zu 90% und besonders bevorzugt zu 100% identisch sind, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäuren 32 bis 515 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht. Diesem Erfindungsgegenstand werden auch all jene Nukleinsäuren zugerechnet, die für Proteine des ersten Erfindungsgegenstandes codieren.

Ein dritter Erfindungsgegenstand sind Vektoren, die Nukleinsäurebereiche des zweiten Erfindungsgegenstandes enthalten oder solche Nukleinsäurebereiche, die für ein Protein oder Derivat nach dem ersten Erfindungsgegenstand codieren. Darunter sind Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren bevorzugt.

Ein vierter Erfindungsgegenstand sind Wirtszellen, die eines der Proteine oder Derivate des ersten Erfindungsgegenstandes exprimieren oder zu dessen Expression angeregt werden können. Dazu gehören insbesondere Bakterien und darunter besonders solche, die das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretieren, und/oder Wirtszellen der Gattung Bacillus, insbesondere der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus. Zum vierten Erfindungsgegenstand gehören auch eukaryontische Wirtszellen, insbesondere solche, die das gebildete Protein posttranslational modifizieren.

Den fünften Erfindungsgegenstand bilden Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Derivats nach dem ersten Erfindungsgegenstand unter Verwendung einer Wirtszelle nach dem vierten Erfindungsgegenstand und/oder unter Verwendung eines Vektors nach dem dritten Erfindungsgegenstand und/oder unter Verwendung einer Nukleinsäure nach dem zweiten Erfindungsgegenstand.

Ein sechster Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines Proteins nach dem ersten Erfindungsgegenstand allein oder zusammen mit mindestens einem anderen reinigungsaktiven oder die Reinigungswirkung unterstützenden Wirkstoff zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.

Ein siebter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines Proteins nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entschlichten von Baumwolle, zur Stärkeverflüssigung, insbesondere in einem Verfahren zur Ethanolproduktion, oder zur Herstellung von linearen und/oder kurzkettigen Oligosacchariden.

Ein achter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines Proteins nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Hydrolyse von Cyclodextrinen oder zur Freisetzung von niedermolekularen Verbindungen aus Polysaccharidträgern oder Cyclodextrinen.

Ein neunter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines Proteins nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Herstellung von Lebensmitteln und/oder Lebensmittelbestandteilen oder zur Herstellung von Tierfutter und/oder Tierfutterbestandteilen.

Ein zehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines Proteins nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Auflösung stärkehaltiger Klebeverbindungen.

Ein elfter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines Proteins nach dem ersten Erfindungsgegenstand in einem temporären Klebeverfahren.

Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes Polymer zu verstehen.

Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biochemische Funktion ausübt. Unter amylolytischen Proteinen oder Enzymen mit amylolytischer Funktion sind solche zu verstehen, die α-1,4-glykosidische Bindungen von Polysacchariden hydrolysieren, insbesondere solche, die im Inneren der Polysaccharide liegen, und deshalb auch als α-1,4-Amylasen bezeichnet werden können.

Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so daß dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne den zunächst vorhandenen N- Terminus ausübt.

Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.

Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet.

Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions- oder Insertionsmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfülllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.

Durch Vergleich mit bekannten Enzymen läßt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid- Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen. Unter dem Begriff des erfindungsgemäßen amylolytischen Proteins ist deshalb nicht allein eines mit der reinen, die Hydrolyse von α(1-4)-glycosidischen Bindungen durchführenden Funktion zu verstehen, die auf die wenigen Aminosäurereste eines vermutlichen katalytisch aktiven Zentrums zurückzuführen sind. Er umfaßt darüberhinaus alle Funktionen, wie sie sich durch das Einwirken des gesamten übrigen Proteins oder eines Teils oder mehrerer Teile des übrigen Proteins auf die eigentlich katalytisch aktiven Bereiche ergeben, als auch allein solche modifizierenden Funktionen. Denn einerseits ist nicht genau bekannt, welche Aminosäurereste des erfindungsgemäßen Proteins tatsächlich die Hydrolyse katalysieren, und andererseits können nie irgendwelche Einzelfunktionen definitiv von der Beteiligung an der Katalyse ausgenommen werden. Die zweite Voraussetzung dafür, daß es sich um ein erfindungsgemäßes Protein handelt, ist allerdings, daß sich durch das chemische Verhalten der eigentlich aktiven Reste allein oder zusätzlich durch das Einwirken der modifizierenden Teile eine Hydrolyse von α(1-4)- glycosidischen Bindungen von Stärke oder stärkeähnlichen Polymeren ergibt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Begriff amylolytische Aktivität also weit auszulegen: sowohl die allein auf die Aminosäuren des katalytisch aktiven Zentrums zurückzuführende, einer α-Amylase entsprechende Aktivität, als auch jede von anderen Teilbereichen des Proteins ausgeübte Hilfsfunktion zur Hydrolyse von α-1,4- glycosidischen Bindungen sollen erfindungsgemäß als amylolytische Funktion aufgefaßt werden, sofern es sich bei der beeinflußten Reaktion selbst um eine Amylase-Aktivität handelt. Zu den Hilfsfunktionen oder Teilaktivitäten gehören beispielsweise die Bindung eines Substrats, eines Zwischen- oder Endprodukts, die Aktivierung oder die Inhibierung oder Vermittlung eines regulierenden Einflusses auf die hydrolytische Aktivität. Dabei kann es sich beispielsweise auch um die Ausbildung eines Strukturelements handeln, das fern vom aktiven Zentrum liegt, oder um ein Signalpeptid, dessen Funktion die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der Zelle und/oder dessen korrekte Faltung betrifft und ohne das in vivo in der Regel kein funktionsfähiges Enzym gebildet wird.

Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind solche mit gleichen Funktionen, die sich durch Übereinstimmungen in der primären Aminosäuresequenz erkennen lassen. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.

Das Maß für die Homologie ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Prozentsatz an Identität, wie er beispielsweise nach der von D. J. Lipman und W. R. Pearson in Science 227 (1985), S. 1435-1441 angegebenen Methode bestimmt werden kann. Die Homologie kann auf das gesamte Protein bezogen sein oder auf den jeweils zuzuordnenden Bereich mit entsprechender Funktion. Homologieangaben können sich auf die Aminosäuresequenz beziehen oder auf die Nukleotidsequenz. Bei letzterer sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge der doppelsträngigen DNA in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann. Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden.

Das erfindungsgemäße Enzym einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann durch Isolierung aus dem Kulturüberstand von Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) gewonnen werden, also dem Organismus, von dem es natürlicherweise gebildet wird. Dieser ist gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen vom 28. April 1977 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig (DSMZ) hinterlegt worden. Er trägt dort die Registrierungsnummer DSM 12368 (DSM 98-587). Die maßgeblichen Angaben über die Merkmale dieses biologischen Materials, wie sie von der DSMZ bei der Hinterlegung bestimmt worden sind, werden in folgender Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Mikrobiologische Eigenschaften des Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) (Bestimmt von der DSMZ am 9.10.1998)

Wie über diese Charakterisierung hinaus nun überrachenderweise festgestellt werden konnte, weist das von diesem Stamm produzierte amylolytische Enzym Eigenschaften auf, die es für den Einsatz in einer Vielzahl von technischen Prozessen prädestinieren. Zudem verfügt der Stamm über Eigenschaften, die die Kultivierbarkeit günstig gestalten. Das gefundene Enzym läßt sich, wie in Beispiel 2 im einzelnen dargelegt, folgendermaßen biochemisch charakterisieren:
Das erfindungsgemäße amylolytische Enzym des Stammes Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) weist als reifes Protein in der denaturierenden SDS- Polyacrylgelelektrophorese ein apparentes Molekulargewicht von 58 kD auf, während sich aus der 515 Aminosäuren umfassenden Proteinsequenz (SEQ ID NO. 2) ein Molekulargewicht von circa 59 kD ableiten läßt, beziehungsweise nach Abspaltung des 31 Aminosäuren umfassenden Signalpeptids eines von 55,5 kD. Gemäß isoelektrischer Fokussierung liegt der isoelektrische Punkt des reifen Proteins bei 6,0. Es weist stärkespaltende Aktivität auf. Es ist bei Inkubation für 10 min bei pH 10 bis 50°C stabil. Bei 60°C werden noch 50% Restaktivität gefunden. Das Enzym ist bei Inkubation über 10 min bei 40°C weitgehend stabil zwischen pH-Werten von 5 und 12, die beste Stabilität wird bei pH 9 beobachtet. In Gegenwart von 0,1% SDS, nach 15minütiger Inkubation bei pH 10 und 50°C weist das Enzym noch 98% Restaktivität auf. In Gegenwart von zusätzlich 10 HPE/ml an Proteaseaktivität und nach 15minütiger Inkubation bei pH 10 und 50°C weist das Enzym noch 74% Restaktivität auf.

Die Nukleotidsequenz dieses Enzyms wird im Sequenzprotokoll unter der Bezeichnung SEQ ID NO. 1 angegeben. Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms wird im Sequenzprotokoll unter der Bezeichnung SEQ ID NO. 2 angegeben.

Vergleichbare amylolytische Proteine stellen ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar und werden insoweit beansprucht, wie sie Protein- oder DNA- Sequenzen aufweisen, die innerhalb des Ähnlichkeitsbereichs zu den in in SEQ ID NO. 1 und/oder SEQ ID NO. 2 angegebenen Sequenzen liegen. Dieser Ähnlichkeitsbereich umfaßt alle Proteine, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96%, zu 96,5%, zu 97%, zu 97,5%, zu 98%, zu 98,5%, zu 99%, zu 99,5% oder zu 100% identisch ist. Der Ähnlichkeitsbereich umfaßt auch alle Proteine, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85%, zu 87,5%, zu 90%, zu 92,5%, zu 95%, zu 96%, zu 97%, zu 98%, zu 99% oder zu 100% identisch ist. Dies gilt insbesondere für jene Teilbereiche des Proteins, die die Aminosäuren 32 bis 515 betreffen.

Bei dem nächstähnlichen, bis zum 17. 3. 2000 bekannten Protein handelt es sich um die α-Amylase aus Bacillus alcalophilus, mit der Bezeichnung P 19571 in der "SWISS- PROT"-Datenbank (Genf, Schweiz). Dieses weist zum erfindungsgemäßen amylolytischen Enzym aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) eine Sequenz-Homologie von 93,4% Identität auf Proteinebene auf. Das erfindungsgemäße Protein ist über die homologen Bereiche eindeutig als α-Amylase charakterisiert. Repräsentative verwandte Proteine werden im Alignment der Fig. 1 vorgestellt.

Besonderes Interesse gilt der Teilsequenz, die den Aminosäuren 32 bis 515 aus der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Sequenz entspricht. Denn die ersten 31 Aminosäuren stellen, wie aus der Aminosäuresequenz geschlossen werden kann, ein Signalpeptid dar, welches bei Produktion in entsprechenden Mikroorganismen die Ausschleusung des Proteins aus dem Zellinneren in das die Zellen umgebende Medium einleitet. Dieses Signalpeptid wird in vivo nach der Ausschleusung abgespalten, so daß die eigentliche amylolytische Aktivität vom übrigen Teil des Proteins ausgeübt wird.

Für die eigentliche amylolytische Funktion sind die Aminosäuren 1 bis 31 wahrscheinlich nicht von Bedeutung, wohl aber für die Produktion, weshalb sie nicht aus dem Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen werden.

Unter Fragmenten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als jene Proteine, die denen von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 entsprechen, zu ihnen in den entsprechenden Teilsequenzen aber hinreichend homolog sind. Sofern sie eine amylolytische oder wenigstens eine die Hydrolyse einer α- 1,4-glycosidischen Bindung unterstützende Funktion ausüben, werden sie als amylolytisch aktive Fragmente angesehen und stellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Das betrifft beispielsweise solche Fragmente, die zur Komplexierung eines Substrats oder zur Ausbildung eines für die Hydrolyse erforderlichen Strukturelements beitragen. Bei den Fragmenten kann es sich beispielsweise um einzelne Domänen handeln oder um Bruchstücke, die nicht mit den Domänen übereinstimmen. Solche Fragmente können kostengünstiger herzustellen sein, bestimmte eventuell nachteilige Charakteristika des Ausgangsmoleküls nicht mehr besitzen, wie möglicherweise einen aktivitätssenkenden Regulationsmechanismus, oder ein günstigeres Aktivitätsprofil entfalten. Derartige Proteinfragmente können auch nicht- biosynthetisch, sondern beispielsweise chemisch hergestellt werden. Sie fallen in den Bereich der vorliegenden Erfindung, weil das Ergebnis der chemischen Synthese in jedem Fall ein Peptid darstellt, welches in seiner Aminosäureabfolge nach der SEQ ID NO. 2 beschreibbar ist; insofern wird wiederum die mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellte genetische Information genutzt, um einen erfindungsgemäßen Faktor herzustellen. Die chemische Synthese kann beispielsweise dann vorteilhaft sein, wenn im Anschluß an die Synthese chemische Modifikationen vorgenommen werden sollen.

Den Fragmenten sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen auch durch Deletionsmutation erhaltene Proteine zuzuordnen. Während Fragmente eher kleine Bruchstücke des gesamten Proteins umfassen, versteht man unter deletionsmutierten Proteinen solche Varianten der Ausgangsproteine, bei denen eher kurze Bereiche fehlen. Solche können biochemisch weitgehend mit den Ausgangsmolekülen übereinstimmen oder einzelne Funktionen gerade nicht mehr aufweisen. Dies erscheint beispielsweise bei der Deletion inhibierender Bereiche besonders sinnvoll. Im Ergebnis können mit den Deletionen sowohl eine Spezialisierung als auch eine Erweiterung des Anwendungsbereichs des Proteins einhergehen. Sofern dadurch eine im weitesten Sinne amylolytische Funktion aufrechterhalten, modifiziert, spezifiziert oder auch erst erreicht wird, handelt es sich bei den durch Deletionsmutation erhaltenen Proteinen wie bei den Fragmenten um erfindungsgemäße Proteine; einzige zusätzliche Voraussetzung dafür ist, daß sie über die noch vorhandene homologe Teilsequenz hinweg innerhalb des oben bereits angegeben Ähnlichkeitsbereichs zu den Sequenzen SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 liegen.

So ist es beispielsweise in Anlehnung an WO 99/57250 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein oder Teile davon über peptidische oder nicht-peptidische Linker mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Solche Konstrukte liegen dann innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung, wenn sie amylolytische Aktivitäten ausüben und die Teile des Konstrukts, die diese Funktion ausüben, zu den angegebenen erfindungsgemäßen Sequenzen hinreichend ähnlich sind. Ebenso könnten auch erfindungsgemäße amylolytische Proteine beispielsweise auch mit Proteasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.

Als natürlicherweise gebildete Fragmente, beziehungsweise deletionsmutierte Proteine kann man auch die von Präproteinen durch Abspaltung der N-terminalen Aminosäuren erhältlichen Proteine und Signalpeptide ansehen. Solch ein Spaltungsmechanismus kann auch dazu verwendet werden, um mithilfe bestimmter Sequenzbereiche, die von Signalpeptidasen erkannt werden, in rekombinanten Proteinen spezifische Spaltstellen vorzugeben. Somit können in vitro Aktivierung und/oder Deaktivierung erfindungsgemäßer Proteine vorgenommen werden. Auf jedes dieser Proteine erstreckt sich der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, sofern es innerhalb des beanspruchten Schutzbereichs liegt und es eine amylolytische Aktivität vermittelt.

Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling- Mutagenese genannt. Es handelt sich dann um erfindungsgemäße chimäre Proteine, wenn die durch die Fusion erhaltenen Proteine eine im weitesten Sinne amylolytische Aktivität aufweisen. Diese kann von einem Molekülteil ausgeübt oder modifiziert werden, das sich von einem erfindungsgemäßen Protein herleitet und innerhalb des beanspruchten Ähnlichkeitsbereichs liegt. Der Sinn einer solchen Fusion kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine amylolytische oder die Hydrolyse von α-1,4-glycosidischen Bindungen unterstützende Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf welche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können. Zur Realisierung der letztgenannten Alternative ist es beispielsweise möglich, posttranslational oder erst nach einem Aufreinigungsschritt durch eine gezielte proteolytische Spaltung eine einzelne chimäre Polypeptidkette in mehrere zu zerlegen.

Bestimmte Bereiche eines Enzyms, sogenannte Consensus-Sequenzen oder Boxen, können über ihre hoch konservierte Homologie zu den Enzymen aus anderen Organismen erkannt werden. Solche Bereiche verleihen dem Enzym zumeist seine charakteristischen enzymatischen Funktionen. Sie können auch über verschiedene Domänen, also globuläre Bereiche des Proteinmoleküls verteilt liegen. Zum Gegenstand der Erfindung gehören daher auch solche chimären Proteine, die aufgrund ihrer Konstruktion über ihre gesamte Aminosäure- und oder Nukleotidsequenz hinweg eine gegebenenfalls geringere Identität aufweisen als für den erfindungsgemäßen Ähnlichkeitsbereich oben definiert, die ihm aber in mindestens einer der durch Fusion eingebrachten Bereiche zugerechnet werden können und in diesem Teil dieselben Funktionen wie in einer Amylase ausüben, die über ihre ganze Länge in den genannten Homologiebereich fällt.

Unter durch Insertionsmutation erhaltenen Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Varianten von den über ihre volle Sequenzlänge in die bezeichneten Schutzbereiche der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 fallenden Proteine zu verstehen, die durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die betreffenden Sequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten oder mit den Sequenzen nach SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 übereinstimmenden Proteinteile zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen.

Der Sinn von Insertionsmutagenese kann wie der der Hybridbildung darin bestehen, einzelne oder Eigenschaften erfindungsgemäßer Proteine mit denen anderer Proteine zu kombinieren. Es handelt sich dann um erfindungsgemäße, durch Insertionsmutation erhaltene Proteine oder chimäre Proteine, wenn die über ihre Homologie auf die Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 zurückzuführenden Bereiche entsprechende Homologiewerte aufweisen und das Protein aufgrund dieser Bereiche eine im weitesten Sinne amylolytische Funktion besitzt.

Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Durch Inversionsmutagenese erhaltene Proteine sind somit in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingechlossen. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.

Unter amylolytisch aktiven Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Patentanmeldung solche Proteine verstanden, die sich von Proteinen ableiten, die selbst eine amylolytische Aktivität besitzen oder die Hydrolyse von internen α-1,4-glycosidischen Bindungen unterstützen. Dies können beispielsweise solche Proteine sein, die nach ihrer Synthese modifiziert worden sind. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch erfolgen, etwa im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese über Prozessierung durch den Wirtsorganismus; hierfür sind molekularbiologische Methoden erforderlich, wie sie weiter unten angeführt werden. Sie können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein.

Proteine, die zu dem erfindungsgemäßen Enzym entsprechende Ähnlichkeiten aufweisen und aus natürlichen Quellen stammen, sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn sie aus Mikroorganismen wie einzellige Pilze oder Bakterien stammen. Denn diese lassen sich zumeist einfacher handhaben als vielzellige Organismen oder die von Vielzellern abgeleiteten Zellkulturen; obgleich diese für spezielle Ausführungsformen sinnvolle Optionen darstellen können und somit nicht grundsätzlich vom Erfindungsgegenstand ausgeschlossen sind.

Besonders bevorzugt sind gram-positive Bakterien, weil diese keine äußere Membran besitzen und sekretierte Proteine somit unmittelbar ins umgebende Medium abgeben.

Ganz besonders bevorzugt sind gram-positive Bakterien der Gattung Bacillus, weil diese als Produktionsorganismen mit einer besonders hohen Produktionsleistung in technischen Prozessen etabliert sind.

Unter den Bacillus-Species, wiederum, sind alkaliphile Bacilli bevorzugt, und darunter insbesondere der Stamm Bacillus sp. A 7-7 (DSM-12368). Denn aus diesem wurde die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Enzyms, deren zugehörige Sequenzen im Sequenzprotokoll angegeben sind und dessen enzymatische Charakteristika in den Beispielen beschrieben sind, ursprünglich erhalten.

Bevorzugt sind jeweils solche Stämme, die das gebildete amylolytische Protein in das sie umgebende Medium abgeben. Es ist möglich, daß natürlich vorkommende Produzenten zwar ein erfindungsgemäßes amylolytisches Enzym herstellen können, dieses aber unter den zunächst ermittelten Bedingungen nur in geringem Maße exprimieren und/oder in das umgebende Medium abgeben. Sie unterfallen dennoch solange dem Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, wie die Möglichkeit besteht, geeignete Umweltbedingungen oder niedermolekulare oder sonstige Faktoren experimentell zu ermitteln, unter deren Einwirken sie zu einer Produktion des erfindungsgemäßen Proteins angeregt werden können, die eine wirtschaftliche Nutzung sinnvoll erscheinen läßt.

Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation eines Proteins kann es mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, insbesondere wenn es aus natürlichen Produzenten dieses Proteins gewonnen worden ist. Es kann dann, aber auch unabhängig davon, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität. Unter dem Begriff des erfindungsgemäßen Proteins sind deshalb zusätzlich auch alle Präparationen des eigentlichen erfindungswesentlichen Proteins zu verstehen. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, daß es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine amylolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise vom Faltungszustand des Proteins abhängig sein oder aus der reversiblen Bindung eines oder mehrer Begleitstoffe aus der Präparation oder aus einem sonstigen Kontrollmechanismus resultieren.

Die erfindungsgemäßen Proteine können vor allem während der Lagerung durch Stabilisatoren beispielsweise vor Denaturierung, Zerfall oder Inaktivierung, etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder Proteolyse geschützt werden. Vielfach werden auch sich ergänzende oder gegenseitig steigernde Kombinationen von Stabilisatoren verwendet.

Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren, wie beispielsweise Benzamidin-Hydrochlorid und Leupeptin, Borax, Borsäuren, Boronsäuren, deren Salze oder Ester, Peptidaldehyde oder rein peptidische Inhibitoren wie Ovomucoid oder spezifische Subtilisin-Inhibitoren. Weitere geläufige Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -propanolamin, aliphatische Carbonsäuren bis zu C₁₂, Dicarbonsäuren, niedere aliphatische Alkohole, v. a. aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit. Ebenso werden Calciumsalze verwendet, wie beispielsweise Calciumacetat oder Calcium-Formiat, Magnesiumsalze, verschiedenste Polymere wie beispielsweise Lignin, Cellulose-Ether, Polyamide oder wasserlösliche Vinyl-Copolymere, um die Enzym-Präparation v. a. gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen zu stabilisieren. Reduktionsmittel und Antioxidantien, wie beispielsweise Natrium-Sulfit oder reduzierende Zucker, erhöhen die Stabilität der Proteine gegenüber oxidativem Zerfall.

Auch in der Ausführungsform entsprechender Nukleinsäuren wird die vorliegende Erfindung verwirklicht, sofern die betreffenden Nukleinsäuren für ein im weitesten Sinne amylolytisches Protein codieren und zu der unter SEQ ID NO. 1 angegebenen Sequenz eine hinreichende, oben definierte Ähnlichkeit aufweisen, insbesondere solche Nukleinsäuren, die für ein Protein codieren, das dem Teilbereich der Aminosäuren von 32 bis 515 der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht. Es sind in jedem Fall beide Stränge eines DNA-Doppelstranges und bei diesen jeweils alle drei möglichen Leseraster zu berücksichtigen.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen stellen jene Nukleinsäuren dar, die für eines der oben ausgeführten erfindungsgemäßen amylolytischen Proteine codieren. Dies schließt auch jene Varianten ein, die nicht über ihre ganze Sequenzlänge hinweg in den nach SEQ ID NO.1 definierten Ähnlichkeitsbereich fallen, dies aber in einzelnen Bereichen tun. Dazu gehören beispielsweise die Nukleotidsequenzen, die, wie oben ausgeführt, durch Insertions- oder Deletionsmutation erhalten worden sind, chimäre Proteine oder Proteinfragmente. Aber auch sogenannte Antisense-Konstrukte, beispielsweise über einzelne Teilabschnitte, stellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, weil sie zur Regulation der amylolytischen Aktivität eingesetzt werden können.

Nukleinsäuren bilden den Ausgangspunkt für molekularbiologische Untersuchungen und Weiterentwicklungen. Solche Methoden sind beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989 beschrieben. Auf dem Gen, insbesondere auf dem klonierten Gen beruhen auch alle im Stand der Technik unter dem Begriff Protein Engineering zusammengefaßten gentechnischen und Protein-biochemischen Methoden. Mit solchen können erfindungsgemäße Proteine in Hinblick auf verschiedene Verwendungen weiter optimiert werden, beispielsweise durch Punktmutagenese oder durch Fusion mit Sequenzen aus anderen Genen.

Zu den über an sich bekannte molekularbiologische Methoden erhältlichen Varianten eines Proteins gehören insbesondere solche mit einzelnen gezielten Aminosäureaustauschen oder randomisierten Punktmutationen, Deletionen einzelner Aminosäuren oder von Teilsequenzen, Fusionen mit anderen Fragmenten oder anderen Enzymen, Insertionen oder Inversionen, also partielle Sequenzumkehrungen. Derartige Mutationen oder Modifikationen können bevorzugte Ausführungsformen für spezifische Anwendungen darstellen. Solch eine Mutagenese kann zielgerichtet oder über zufallsgemäße Methoden durchgeführt werden. Dies kann beispielsweise mit einem anschließenden auf die Aktivität gerichteten Erkennungs- und/oder Auswahlverfahren (Screening und Selektion) an den klonierten Genen kombiniert werden. Die durch Mutantion erhaltenen Gene unterliegen dem Schutzbereich der hier beschriebenen Erfindung, wenn sie für im weitesten Sinne amylolytische Proteine codieren und in dem oben definierten Ähnlichkeitsbereich liegen; letzteres zumindest in den homologen und funktionsrelevanten Bereichen.

Um mit Nukleinsäuren umzugehen, wird die DNA geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Die molekularbiologische Dimension der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen für die entsprechenden Proteine. Dazu können beispielsweise solche gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren, sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.

Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins und für erfindungsgemäße Weiterentwicklungen und letztlich für die Amplifikation und Produktion erfindungsgemäßer Proteine. Sie stellen insofern Erfindungsgegenstände dar, als die Sequenzen der enthaltenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche innerhalb des oben näher bezeichneten Homologiebereichs liegen.

Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Klonierungsvektoren. Diese eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa über das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagerfähige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion.

Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ähnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Proteinen optimierten Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflußt, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus.

Bevorzugte Ausführungsformen sind solche Expressionsvektoren, die über Änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind. Expressionsvektoren ermöglichen, daß das zugehörige Protein heterolog, also in einem anderen Organismus als dem, aus dem es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Auch eine homologe Proteingewinnung aus einem das Gen natürlicherweise exprimierenden Wirtsorganismus über einen passenden Vektor liegt innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Diese kann den Vorteil aufweisen, daß natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationsreaktionen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.

Die In-vivo-Synthese eines erfindungsgemäßen amylolytischen Enzyms, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden.

Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine.

Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegenüber Eukaryonten in der Regel durch kürzere Generationszeiten und geringere Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Proteine etabliert werden. Bei gram­ negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli, besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so daß sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.

Eine Variante dieses Versuchsprinzips stellen Expressionssysteme dar, bei denen zusätzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen amylolytische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beinflussen.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) selbst, um erfindungsgemäße Proteine homolog zu exprimieren. Dies kann beispielsweise über einen eingebrachten Vektor erfolgen, der das bereits endogen vorhandene Gen, oder erfindungsgemäße Abwandlungen desselben, in diese Zellen einbringt, beispielsweise in einer vielfachen Kopienzahl. Dies kann dann besonders vorteilhaft sein, wenn das Protein im Anschluß an seine Synthese Modifikationen erfahren soll, die geeigneterweise von den betreffenden Zellen selbst durchgeführt werden.

Demgegenüber ist jedoch die heterologe Expression bevorzugt. Zu den für die heterologe Expression bevorzugten Bakterien gehören solche der Gattung Bacillus, insbesondere solche der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus.

Auch eukaryontische Zellen können sich zur Produktion erfindungsgemäßer amylolytischer Proteine eignen. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Dazu gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccaride.

Alle bereits oben ausgeführten Elemente können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Sie alle verwirklichen die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Idee, nämlich Vertreter eines über die amylolytische Funktion und gleichzeitig die hohe Homologie zu den in den Sequenzprotokollen angegebenen Sequenzen definierten Proteintyps mithilfe der zugehörigen genetischen Information quantitativ herzustellen. Das optimale Verfahren muß für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.

Prinzipiell wird dabei folgendermaßen vorgegangen: Erfindungsgemäße Nukleinsäuren, also solche die innerhalb des oben definierten Ähnlichkeitsbereiches zu der Seqzuenz von SEQ ID NO. 1 liegen, werden geeigneterweise in Form der DNA in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert. Dieser wird in die Wirtszelle transformiert, beispielsweise in Zellen eines leicht zu kultivierenden Bakterienstammes, der die Proteine, deren Gene unter der Kontrolle entsprechender genetischer Elemente stehen, in das umgebende Nährmedium ausschleust; regulierende Elemente dafür können beispielsweise vom Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden. Aus dem umgebenden Medium kann das erfindungsgemäße Protein über mehrere Aufreinigungsschritte, wie beispielsweise Fällungen oder Chromatographien, aufgreinigt werden. Ein Fachmann ist in der Lage, ein System, welches im Labormaßstab experimentell optimiert worden ist, auf einen großtechnischen Produktionsmaßstab zu übertragen.

Im folgenden werden die wichtigsten technischen Verwendungsmöglichkeiten für erfindungsgemäße Proteine ausgeführt. Zahlreiche in der Technik etablierte Anwendungsmöglichkeiten für amylolytische Enzyme werden in Handbüchern, wie beispielsweise dem Buch "Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley- Verlag, New York, 1998, ausgeführt. Folgende Zusammenstellung ist nicht als abschließende Aufzählung zu verstehen, sondern stellt eine Auswahl aus allen theoretisch denkbaren Verwendungsmöglichkeiten dar. Sollte sich herausstellen, daß einzelne, innerhalb des Ähnlichkeitsbereichs liegende Proteine aufgrund ihrer enyzmatischen, das heißt amylolytischen Eigenschaften für zusätzliche hier nicht ausdrücklich beanspruchte Anwendungsmöglichkeiten geeignet sind, so werden diese hiermit in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen.

Ein wichtiges Einsatzgebiet für amylolytische Enzyme ist ihre Verwendung als aktive Komponenten in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Reinigung von Textilien oder von festen Oberflächen, wie beispielsweise Geschirr, Fußböden oder Arbeitsgeräten. In diesen Anwendungen dient die amylolytische Aktivität dazu, kohlenhydrathaltige Verunreinigungen und insbesondere solche auf Stärkebasis hydrolytisch aufzulösen oder vom Untergrund abzulösen. Dabei können sie allein, in geeigneten Medien oder auch in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Anwendung gebracht werden. Diese Mittel zeichnen sich dadurch aus, daß die amylolytischen Enzyme und die übrigen Komponenten synergistisch die Beseitigung der Verunreinigungen bewirken. Das geschieht beispielsweise so, daß die Hydrolyseprodukte der amylolytischen Proteine durch andere Bestandteile der Mittel wie etwa Tenside solubilisiert werden. Ein erfindungsgemäßes Protein kann sowohl in Mitteln für Großverbraucher oder technische Anwender als auch in Produkten für den Privatverbraucher Anwendung finden, wobei alle im Stand der Technik etablierten Darreichungsformen auch Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.

Rohmaterialien und Zwischenprodukte der Textilherstellung, beispielsweise für solche auf Baumwollbasis, werden im Rahmen ihrer Herstellung und Weiterverarbeitung mit Stärke ausgerüstet, um eine bessere Verarbeitung zu ermöglichen. Dieses sowohl auf Garne, auf Zwischenprodukte, als auch auf Textilien angewendete Verfahren nennt man Schlichten (sizing). Zur Entfernung der Schlichte, also der stärkehaltigen Schutzschicht (Entschlichten, desizing) sind erfindungsgemäße amylolytische Proteine geeignet.

Zur Stärkeverflüssigung wird in Wasser oder Puffer gequollene Stärke mit amylolytischen Enzymen inkubiert, wodurch das Polysaccharid in kleinere Bestandteile, zuletzt überwiegend in Maltose gespalten wird. Erfindungsgemäße Enzyme werden bevorzugt für diesen Prozeß oder einen Teilschritt davon verwendet, wenn sie sich aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften gut in ein entsprechendes Produktionsverfahren einpassen lassen. Dies kann beispielsweise dann der Fall sein, wenn sie in einem Schritt zusätzlich zu anderen Enzymen eingebracht werden sollen, die die gleichen Reaktionsbedingungen benötigen. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße amylolytische Proteine, wenn gerade die von ihnen selbst gebildeten Produkte im Zentrum des Interesses stehen. Die Stärkeverflüssigung kann auch einen Schritt in einem mehrstufigen Verfahren zur Gewinnung von Ethanol oder davon abgeleiteten Folgeprodukten, beispielsweise Essigsäure darstellen.

Aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität bilden erfindungsgemäße amylolytische Proteine aus stärkeähnlichen Polymeren nach kürzerer Inkubationszeit überwiegend höhermolekulare Oligosaccharide, wie beispielsweise Maltohexaose, Maltoheptaose oder Maltooctaose. Nach längerer Inkubationszeit steigt unter den Reaktionsprodukten der Anteil niedrigerer Oligosaccharide, wie beispielsweise Maltose oder Maltotriose an. Bei besonderem Interesse an bestimmten Reaktionsprodukten können entsprechende Varianten erfindungsgemäßer Proteine verwendet und/oder die Reaktionsbedingungen entsprechend gestaltet werden. Dies ist insbesondere dann attraktiv, wenn es nicht auf reine Verbindungen, sondern auf Gemische ähnlicher Verbindungen ankommt, wie beispielsweise bei der Bildung von Lösungen, Suspensionen oder Gelen mit lediglich bestimmten physikalischen Eigenschaften.

Cyclodextrine sind α-(1,4)-glycosidisch verknüpfte, cyclische Oligosaccharide, von denen die aus 6, 7 oder 8 Glucose-Monomeren, die α-, β-, beziehungsweise γ-Cyclodextrine (oder Cyclohexa-, -hepta-, beziehungsweise -octa-Amylosen), wirtschaftlich die größte Bedeutung besitzen. Sie können mit hydrophoben Gastmolekülen, wie beispielsweise Duftstoffen, Geschmacksstoffen oder pharmazeutischen Wirkstoffen, Einschlußverbindungen bilden, aus welchen die Gastmoleküle bei Bedarf wieder freigesetzt werden können. Solche Einschlußverbindungen sind je nach Einsatzgebiet der Inhaltsstoffe beispielsweise für die Herstellung von Nahrungsmitteln, die Pharmazie oder die Kosmetik, beispielsweise in entsprechenden Produkten für den Endverbraucher von Bedeutung. Die Freisetzung von Inhaltsstoffen aus Cyclodextrinen stellt somit eine Verwendungsmöglichkeit für erfindungsgemäße Proteine dar.

In ähnlicher Weise können erfindungsgemäße amylolytische Proteine niedermolekulare Verbindungen auch aus anderen α-(1,4)-glycosidisch verknüpften Polysacchariden freisetzen. Dieses kann sich wie bei den Cyclodextrinen auf molekularer Ebene abspielen als auch an größeren Systemen, wie beispielsweise Inhaltsstoffen, die in Form von Mikrokapseln verkapselt sind. Beispielsweise Stärke ist ein im Stand der Technik etabliertes Material, um Verbindungen wie beispielsweise Enzyme, die in definierten Mengen in Reaktionsansätze eingebracht werden sollen, während der Lagerung einzukapseln. Der kontrollierte Freisetzungsprozeß aus derartigen Kapseln kann von erfindungsgemäßen amylolytischen Enzymen unterstützt werden.

Wo immer Stärke oder von Stärke abgeleitete Kohlenhydrate als Lebensmittel- oder Tiernahrungsbestandteil eine Rolle spielen, kann eine amylolytische Aktivität zur Herstellung dieser Artikel zum Einsatz kommen. Sie erhöht den Anteil von Mono-, oder Oligomeren gegenüber dem polymeren Zucker, was beispielsweise dem Geschmack, der Verdaubarkeit oder der Konsistenz des Lebensmittels zugute kommen kann. Dies kann zur Herstellung bestimmter Tierfutter erforderlich sein, beispielsweise aber auch bei der Herstellung von Fruchtsäften, Wein oder anderer Lebensmittel, wenn der Anteil polymerer Zucker verringert und der von süßen und/oder leichter löslichen Zuckern erhöht werden soll. Die weiter oben ausgeführte Verwendungsmöglichkeit zur Stärkeverflüssigung und/oder Ethanolproduktion kann als großtechnische Variante dieses Prinzips angesehen werden.

Amylasen wirken darüberhinaus auch dem unter Altbacken-Werden bekannten Geschmacksverlust von Backwaren (Anti staling-Effekt) entgegen. Dafür werden sie geeigneterweise dem Teig vor dem Backen zugesetzt. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind also solche, bei denen erfindungsgemäße Proteine zur Herstellung von Backwaren verwendet werden.

Neben anderen Naturstoffen wird auch Stärke bereits seit Jahrhunderten als Bindemittel in der Papierherstellung und dem Verkleben unterschiedlicher Papiere und Pappen verwendet. Dies betrifft beispeilsweise Graphiken und Bücher. Im Laufe langer Zeiträume können solche Papiere unter ungünstigen Einflüssen, wie beispielsweise Feuchtigkeit, Wellen aufwerfen oder brechen, was bis zu deren völliger Zerstörung führen kann. Bei der Restaurierung solcher Papiere und Pappen kann das Auflösen der Klebeschichten erforderlich sein und durch Verwendung eines erfindungsgemäßen amylolytischen Proteins erheblich erleichtert werden.

Pflanzliche Polymere wie Stärke oder Cellulose und deren wasserlösliche Derivate werden unter anderem als Klebstoffe oder Kleister verwendet. Dafür müssen sie in Wasser zunächst quellen und nach Aufbringen auf dem Klebegut trocknen, wodurch dieses am Untergrund fixiert wird. Das erfindungsgemäße Enzym kann solch einer wäßrigen Suspension zugesetzt werden, um die Klebeeigenschaften des entstehenden Kleisters zu beeinflussen. Es kann aber auch stattdessen oder zusätzlich zu dieser Funktion dem Kleister zugesetzt werden, um nach dem Antrocknen für lange Zeit, beispielsweise einige Jahre, inaktiv auf dem Klebegut zu verharren. Gezieltes Ändern der Umgebungsbedingungen, beispielsweise durch Anfeuchten, kann dann dazu verwendet werden, um das Enzym zu einem späteren Zeitpunkt zu aktivieren und damit ein Auflösen des Kleisters herbeizuführen. Auf diese Weise ist das Klebegut leichter wieder vom Untergrund abzulösen. In dieser Verwendung fungiert das erfindungsgemäße Enzym aufgrund seiner amylolytischen Aktivität als scheidendes Agens in einem temporären Klebeverfahren oder als sogenannter "Schalter" zum Ablösen des Klebeguts.

Beispiele Beispiel 1

Unter den Kandidaten eines mikrobiologischen Screenings auf amylasebildende Mikroorganismen mit dem Auswahlkriterium Wachstum und Hofbildung auf Agarplatten mit Stärke als einziger Kohlenstoff-Quelle befand sich auch der Bacillus-Stamm Bacillus sp. (RNA-Gruppe VI, alcaliphil) A 7-7, der bei der DSMZ hinterlegt worden ist. (DSM ID 98-587, Hinterlegung DSM 12368).

Die Anzucht erfolgte in YPSS-Medium, enthaltend 15 g/l lösliche Stärke, 4 g/l Hefeextrakt, 1 g/l K₂HPO₄ und 0,5 g/l MgSO₄ × 7H₂O. Der pH-Wert wurde nach dem Autoklavieren mit 20%iger Natriumcarbonatlösung auf 10,3 eingestellt. Jeweils 25 ml Medium wurden in sterile 100 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikane eingefüllt und mit einer Kultur Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) beimpft, die auf einer YPSS-Agarplatte gewachsen war. Die Anzucht erfolgte bei 30°C über 48 h unter Schütteln bei 200 rpm.

Beispiel 2

Über folgende Aufreinigungsschritte wurde aus dem Kulturmedium ein singuläres Enzym erhalten: Fällung des Kulturüberstands mit Ethanol; Aufnahme des Proteinpellets in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,5; Dialyse gegen 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,5; Kationenaustauschchromatographie an Fast-flow-S-Sepharose® (Fa. Pharmacia- Amersham Biotech, Freiburg) mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,5 als Eluens; Umpufferung des Amylase-haltigen Durchbruchs gegen 20 mM Glycin/NaOH-Puffer, pH 10, über PD10®-Säulen der Firma Pharmacia-Amersham Biotech; Anionenaustauschchromatographie über Mono-Q® (Fa. Pharmacia-Amersham Biotech) unter Elution mit demselben Puffer mit einem ansteigenden Salzgradienten von 0 bis 1 M NaCl. Die Amylase eluierte bei ca. 0,25 M NaCl.

Aus 250 ml Kulturmedium wurden auf diese Weise, wie über die BCA-Methode (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) ermittelt wurde, 2,6 mg eines gemäß SDS-Gelektrophorese und Silber-Färbung reinen Proteins gewonnen.

Bei denaturierender SDS-Polyacrylgelelektrophorese in einem 8-25%igem Gel, im PHAST®-System der Fa. Pharmacia-Amersham und bei Vergleich mit relevanten Größenmarkern weist das amylolytische Enyzm aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) ein Molekulargewicht von 58 kD auf.

Gemäß isoelektrischer Fokussierung von pH 3 bis 9 im PHAST®-System der Fa. Pharmacia-Amersham liegt sein isoelektrischer Punkt bei 6,0.

Die amylolytische Aktivität des gereinigten Enzyms wurde mithilfe der sogenannten DNS- Methode, also unter Verwendung von Dinitrosalicylsäure bestimmt. Dafür werden die durch das Enzym bei der Hydrolyse von Stärke freigesetzten Oligosaccharide, Disaccharide und Glucoseeinheiten durch Oxidation der reduzierenden Enden mit Dinitrosalicysäure (DNS) nachgewiesen. Die Intensität der Farbentwicklung ist dabei proportional zur Anzahl der entstandenen Spaltprodukte. Dieser Test wird folgendermaßen durchgeführt: Nach einer Inkubation von 50 µl Enzymlösung mit 100 µl 1 % löslicher Stärke in Tris/Maleat-Puffer pH 6.5 (12,11 g Tris + 11,61 g Maleinsäure ad 1 l, pH mit 0.2 N NaOH eingestellt) bei 50°C für 15 min werden die reduzierten Saccharide mit 300 µl DNS-Lösung (8.8 g Dinitrosalicylsäure, 915 ml destilliertes Wasser, 250 g K-Na- Tartrat, 334 ml 4.5% NaOH, 6.3 g Natriumdisulfit) bei 100°C für 20 min oxidiert. Nach Abkühlung im Eisbad wird die Absorption photometrisch bei 540 nm gegen einen Blank- Wert detektiert. Die Kalibrierung des Assays erfolgt über eine Maltose- Konzentrationsreihe. Die Aktivität wird angegeben in µmol reduzierende Zucker (bezogen auf Maltose) pro min und ml.

Das beispielgemäße Protein weist nach diesem Test eindeutig amylolytische Aktivität auf. Im Folgenden dient die auf diese Weise bestimmbare Aktivität als Parameter für die Stabilität des Enzyms unter jeweils verschiedenen Bedingungen.

Die Temperaturstabilität des Enzyms wurde jeweils bei 10minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 10 gemessen. Bei Raumtemperatur, 30°C, 40°C und 50°C liegt die Aktivität bei mindestens 85%. Bei 40°C hat die Amylase ihr Maximum von 90% Restaktivität. Bei 60°C hat das Enzym 50% Aktivität. Bei Temperaturen von mehr als 60°C verliert es stark an Aktivität, weist aber bei 80-90°C immer noch 10% Restaktivität auf.

Das amylolytische Enyzm aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) ist bei pH-Werten zwischen 5 und 12, wenn es jeweils für 10 min bei 40°C inkubiert wird, weitgehend stabil. Bei pH- Werten von 8 bis 9 ist die Amylase bis zu 100% stabil. Bei pH-Werten darunter und darüber fällt die Aktivität langsam ab; das Enzym verfügt bei pH 5 und pH 12 aber immer noch über 65% Restaktivität.

Zur weiteren Charakterisierung wurde die Beeinträchtigung der enzymatischen Aktivität durch möglicherweise störende Faktoren wie Protease oder Detergenzien untersucht: Nach Einwirken von 10 HPE/ml der Protease Savinase® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark; die HPE-Einheiten sind bestimmbar nach der in Tenside 7 (1970), S. 125-132 angegebenen Methode) und 0,1% SDS bei pH 10 für 15 Minuten und 50°C zeigt das Enzym 74% Restaktivität. Nach Einwirken von 0,1% SDS unter gleichen Bedingungen (pH 10, 15 Minuten, 50°C) weist das Enzym 98% Restaktivität auf. Und ebenfalls unter diesen Bedingungen (pH 10, 15 Minuten, 50°C) besitzt es in Gegenwart von 3 mM EDTA noch 10% Restaktivität und in Gegenwart von 1 mM EDTA noch 65% Restaktivität.

Beispiel 3

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, angegeben sind.

Zunächst wurde zur Bestimmung interner Aminosäure-Sequenzen das gemäß Beispiel 1 gewonnene und gemäß Beispiel 2 gereinigte Protein mit Ethanol gefällt und mittels denaturierender SDS-Polyacrylgelelektrophorese aufgetrennt. Nach Ausschneiden der entsprechenden Bande aus dem SDS-Polyacrylamid-Gel wurde in situ tryptisch verdaut, die resultierenden Peptide mittels HPLC getrennt und durch Edman-Abbau und MALDI- TOF analysiert. Aus den zahlreichen auf diese Weise erhaltenen tryptischen Fragmenten wurden folgende beiden, D1 und D6, ausgewählt:

Nach deren (links angegebenen) Aminosäuresequenzen wurden die entsprechenden degenerierten PCR-Primer konstruiert. Deren Nukleotidsequenzen sind rechts abgegeben (N steht für beliebige Basen; H steht für A oder C oder T; R steht für A oder G; D steht für A, G oder T).

Aus standardmäßig präparierter chromosomaler DNA von Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) als Matrize konnte mit diesem Primer-Paar in einer Standard-PCR ein ca. 1.000 bp großes Fragment amplifiziert werden. Dieses PCR-Fragment wurde zur Lagerung in den Vektor pGEM-Teasy® (Fa. Promega, Madison, Wisconsin, USA) kloniert.

Beispiel 4

Das gereinigte PCR-Fragment wurde nach Anleitung mit dem nichtradioaktiven DIG-High- Prime® Labeling-Kit der Fa. Boehringer Mannheim (Deutschland; Produkt-Nr. 1745832) als DNA-Sonde markiert. Für die anschließende Hybridisierung wurde chromosomale DNA des Stammes Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) mit dem Restriktionsenzym Xba I gespalten und über ein 0,9%iges Agarosegel aufgetrennt. Die DNA konnte mit Hilfe eines Vakuum-Blotters auf eine positiv geladene Nylonmembran (Fa. Roche, Mannheim) übertragen werden. Die DNA-Hybridisierung und immunologische Detektion des als Sonde verwendeten PCR-Fragments erfolgte anhand der Vorschrift des DIG-High-Prime® Labeling-and-Detection-Starter Kits I® der Fa. Boehringer Mannheim. Es stellte sich heraus, daß sich das gesuchte Gen in einem scheinbar ca. 3.000-4.000 bp großen DNA- Abschnitt befindet. Die Fragmente dieser Größenordnung wurden über ein 0,9%iges Agarosegel aufgereinigt und anschließend in den mit den Restriktionsenzymen Xba I und Nhe I geschnittenen Vektor pCB56C (aus B. subtilis DB104; beschrieben in der Anmeldung WO 91/02792) ligiert. Nach Transformation in einen Amylase-negativen Bacillus subtilis-Stamm konnten Amylase-positive Klone auf Stärkehaltigen Agarplatten über Hofbildung identifiziert werden. Ein repräsentatives Isolat trug das gewünschte Insert.

Beispiel 5

Die Sequenzierung des erhaltenen Plasmids erfolgte nach der Kettenabbruchmethode nach Standardverfahren. Das Plasmid enthielt ein Insert mit einer Größe von 2.015 bp. Darauf liegt das 1.545 bp umfassende Gen für das interessierende Enzym, welches unter SEQ ID NO. 1 im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung angegeben ist. Dem entspricht ein Polypeptid von 515 Aminosäuren, dessen Sequenz in SEQ ID NO. 2 im Sequenzprotokoll angegeben ist. Das aus dieser Aminosäuresequenz abgeleitete Molekulargewicht beträgt 59 kD, beziehungsweise für das durch Abspalten des 31 Aminosäuren umfassenden Signalpeptids erhaltene reife Protein 55,5 kD.

Sequenzvergleiche nach der BLAST-Methode (S. F. Altschul et al., Nuci. Acids Res., 25 (1997), S. 3389-3402), durchgeführt am 17. 3. 2000, charakterisieren das Enzym als α- Amylase. Die Homologie dieses Proteins zu bekannten Proteinen liegt, wie folgende Tabelle 2 zeigt, auf Proteinebene zwischen 71 und 95% Identität.

Tabelle 2

Homologie des erfindungsgemäßen Enzyms aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) zu den nächstähnlichen und weiteren repräsentativen Proteinen; angegeben in % Identität auf Protein-Ebene. Mit ID werden die Einträge bei der Swiss-Prot-Datenbank (Genf, Schweiz) bezeichnet.

Ein Alignment mit repräsentativen Proteinen ist in Fig. 1 dargestellt. Bei allen handelt es sich um α-Amylasen, so daß aufgrund der weitgehenden Übereinstimmungen davon ausgegangen werden muß, daß es sich auch bei dem erfindungsgemäßen Enzym um eine α-Amylase handelt. Dies deckt sich mit der ursprünglichen Gewinnung des Gens aus einem stärkeabbauenden Mikroorganismus (Beispiel 1) und der Feststellung der amylolytischen Aktivität einer Transformante mit dem insertragenden Plasmid (Beispiel 4). Die Eigenschaften des aus diesem Produktionsstamm erhältlichen amylolytischen Proteins stimmen mit denen des Wüdtypstammes (Beispiel 2) überein. Solch ein Produktionsstamm kann gemäß Beispiel 4 hergestellt werden.

Beschreibung der Figuren Fig. 1 Alignment des erfindungsgemäßen amylolytischen Enzyms aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) mit den drei nächstähnlichen Amylasen

Darin bedeuten:

• 1. Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368)
• 2. Reife Amylase aus Bacillus sp. # 707 gemäß: Tsukamoto, Kimura, Ishii, Takano und Yamane, Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 (1988), S. 25-31
• 3. Amylase der SEQ ID NO. 1 aus der Anmeldung WO 96/23873
• 4. Amylase der SEQ ID NO. 2 aus der Anmeldung WO 96/23873

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (36)

1. Amylolytisches Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96% identisch ist.

2. Amylolytisches Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98% identisch ist.

3. Amylolytisches Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz in den Positionen 32 bis 515 mindestens zu 96% identisch ist.

4. Amylolytisches Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz in den Positionen 32 bis 515 mindestens zu 98% identisch ist.

5. Amylolytisches Protein, das sich von einer Nukleotidsequenz ableitet, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäuren 32 bis 515 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.

6. Amylolytisches Protein, das sich von einer Nukleotidsequenz ableitet, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäuren 32 bis 515 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.

7. Amylolytisches Protein, das mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz insgesamt und/oder in den Positionen 32 bis 515 identisch ist und/oder das mit einer von der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz insgesamt und/oder in den Positionen 32 bis 515 identisch ist.

8. Amylolytisches Proteinfragment oder amylolytisches, durch Deletionsmutation erhaltenes Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Amylolytisches, durch Insertionsmutation erhaltenes oder amylolytisches chimäres Protein, welches wenigstens in einem eine amylolytische Aktivität verleihenden Teil aus einem Protein besteht, das mit einem Protein oder Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 identisch ist.

10. Amylolytisch aktives Derivat eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.

11. Amylolytisches Protein oder Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es natürlicherweise aus einem Mikroorganismus erhältlich ist.

12. Amylolytisches Protein oder Derivat gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt.

13. Amylolytisches Protein oder Derivat gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt.

14. Amylolytisches Protein oder Derivat gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus sp. A 7-7, insbesondere um Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) handelt.

15. Für ein amylolytisches Protein codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ iD NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäuren 32 bis 515 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.

16. Für ein amylolytisches Protein codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäuren 32 bis 515 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.

17. Für ein amylolytisches Protein codierende Nukleinsäure, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zu 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäuren 32 bis 515 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.

18. Nukleinsäure, die für eines der in den Ansprüchen 1 bis 14 bezeichneten Proteine codiert.

19. Vektor, der einen in den Ansprüchen 15 bis 18 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält oder einen Nukleinsäurebereich enthält, das für eines der in den Ansprüchen 1 bis 14 bezeichneten Proteine codiert.

20. Klonierungsvektor gemäß Anspruch 19.

21. Expressionsvektor gemäß Anspruch 19.

22. Wirtszelle, die eines der in Ansprüchen 1 bis 14 bezeichneten Proteine oder Derivate exprimiert oder zu dessen Expression angeregt werden kann.

23. Wirtszelle gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Bakterium ist, insbesondere eines, das das gebildete Protein oder Derivat ins umgebende Medium sekretiert.

24. Wirtszelle gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Bakterium der Gattung Bacillus, insbesondere der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus ist.

25. Wirtszelle gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine eukaryontische Zelle ist, insbesondere eine, die das gebildete Protein posttranslational modifiziert.

26. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 unter Verwendung einer Zelle, die dieses natürlicherweise bildet, insbesondere eine nach einem der Ansprüche 11 bis 14, oder unter Verwendung einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25 und/oder unter Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21 und/oder unter Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18.

27. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 allein oder zusammen mit mindestens einem anderen reinigungsaktiven oder die Reinigungswirkung unterstützenden Wirkstoff zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.

28. Verwendung eines Proteins oder gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entschlichten von Baumwolle.

29. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Stärkeverflüssigung, insbesondere in einem Verfahren zur Ethanolproduktion.

30. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung von linearen und/oder kurzkettigen Oligosacchariden.

31. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Hydrolyse von Cyclodextrinen.

32. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Freisetzung von niedermolekularen Verbindungen aus Polysaccharidträgern oder Cyclodextrinen.

33. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung von Lebensmitteln und/oder Lebensmittelbestandteilen.

34. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung von Tierfutter und/oder Tierfutterbestandteilen.

35. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Auflösung stärkehaltiger Klebeverbindungen.

36. Verwendung eines Proteins oder Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 in einem temporären Klebeverfahren.