CN101175851A - 酶的生产 - Google Patents

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CN101175851A CNA2006800167501A CN200680016750A CN101175851A CN 101175851 A CN101175851 A CN 101175851A CN A2006800167501 A CNA2006800167501 A CN A2006800167501A CN 200680016750 A CN200680016750 A CN 200680016750A CN 101175851 A CN101175851 A CN 101175851A
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Abstract

本发明涉及在宿主细胞中产生期望的酶的方法，包括使用供用于宿主细胞的含有液化的和/或糖化的含淀粉植物原料的底物，在利于产生该期望的酶的条件下，培养能产生期望的酶的所述宿主细胞。

Description

酶的生产
发明领域
本发明涉及在宿主细胞中产生期望的酶的方法。
背景技术
目前，广泛使用微生物宿主细胞通过发酵产生酶。大量需要酶，特别是用于工业用途，例如，将含淀粉植物原料转化成糖浆和/或发酵产物的酶，但其仅能以相对低的价格出售。这使得酶的生产成本成为市场上成功的重要因素。底物的成本可构成总的酶生产成本的多至40-50％。底物可从商业供应商得到或根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。产生酶最常用的碳源底物是纯化的葡萄糖以及类似的糖。纯化的葡萄糖以及类似的糖价格昂贵。因此，需要提供易于获得且廉价的底物，其能替代昂贵的纯化的底物，所述昂贵的纯化的底物用于产生特别是工业应用中使用的期望的酶。
发明概述
本发明的目的是提供使用易于获得且廉价的底物作为目前所用的纯化的葡萄糖或类似底物的替代物，在宿主细胞中产生期望的酶的方法。
根据第一方面，本发明涉及在宿主细胞中产生期望的酶的方法，其包括使用宿主细胞的底物，在益于产生所述期望的酶的条件下，培养能产生期望的酶的所述宿主细胞，所述宿主细胞的底物含有液化的和/或糖化的含淀粉植物原料。
本发明也涉及液化的和/或糖化的含淀粉植物原料在宿主细胞中产生期望的酶的用途。
附图说明
图1显示APE-[35～40]的SDS-PAGE。
图2显示PCS水解对酶(培养液中的相关蛋白/g纤维素)加样。APE-35至APE-37葡萄糖进料控制，进料中含纤维素以及分批中含纤维素，如图中所示。
图3显示PCS水解对酶(相对体积培养液/g纤维素)加样。操作APE-35至APE-37为葡萄糖进料控制，进料中含纤维素以及分批中含纤维素，如图中所示。
发明详述
本发明的目的是提供在宿主细胞中产生期望的酶的方法，其使用易于获得且廉价的底物替代目前所用的包括纯化葡萄糖的昂贵底物。
本发明人令人吃惊地发现，在酶产生过程中，液化的和/或糖化的含淀粉植物原料如玉米醪液(即液化的玉米)，可有利地替代纯化的葡萄糖或其它类似的糖作为碳底物。本发明的一个优势是，用于将含淀粉植物原料转化成期望的糖浆或发酵产物的酶可使用在生产场所已经可用的底物来产生。换句话说，当产生酶的底物在现场是可以利用的，就可以避免或至少显著减少从外部供应商购买昂贵的碳源底物如纯化的葡萄糖的需要。
产生酶的方法
在真菌来源如丝状真菌或细菌来源的宿主细胞中产生酶是本领域内公知的。本发明的方法可以是公知的方法，只是所用的底物是液化的和/或糖化的含淀粉植物原料。
将能产生期望的酶的宿主细胞以具体的生长速率在准确的培养条件下培养。将宿主细胞培养物导入发酵培养基时，接种的培养物将经过许多阶段。最初生长并不进行。这个时期称为滞后期(lag phase)，可认为是适应期。在称为“指数期(exponential phase)”的下一个阶段中，宿主细胞的生长速率逐渐增加。在最大生长速率一段时间后，速率停止，培养物进入稳定期(stationary phase)，在又一段时间后，培养进入死亡期(death phase)并且活细胞的数目减少。大多数酶在指数期产生。然而，酶也可在稳定期或恰好在孢子形成(sporulation)之前产生。
换句话说，根据本发明，在适宜的培养基中以及在使酶表达并优选地分泌和任选地回收的条件下，培养宿主细胞。培养发生于含有底物的发酵培养基中。根据本发明，碳底物是液化的和/或糖化的含淀粉植物原料。酶的产生方法在本领域内是公知的。酶可以是胞内的或胞外的。在本发明的上下文中，预期的酶优选且主要是宿主细胞分泌至发酵培养基的胞外酶。可用本领域公知的方法回收酶。例如，在胞外酶的情况下，可通过常规方法完成从发酵培养基中的回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。回收胞内酶的方法也是本领域中公知的。
至少在本发明的上下文中，术语“培养”或“发酵”意指用一种或多种宿主细胞的大量培养物(mass culture)产生期望的酶的任何方法。本发明可用于工业规模的酶生产，例如，具有至少50升，优选至少100升，更优选至少500升，甚至更优选1000升，特别是至少5000升的培养基。
本发明的方法可以作为分批、补料分批、重复补料分批或连续方法进行。
可在有氧或无氧的条件下实施本发明的方法。一些期望的酶可通过深层培养(submerged cultivation)产生，而一些可通过表面培养(surface cultivation)产生。对于根据本发明产生的期望的酶，深层培养是最普通的。
因此，根据第一方面，本发明涉及在宿主细胞中产生期望的酶的方法，其包括使用宿主细胞的底物，在益于产生所述期望的酶的条件下，培养能产生期望的酶的所述宿主细胞，所述宿主细胞的底物含有液化的和/或糖化的含淀粉植物原料。
底物
用于本发明方法的底物可以是任何液化的和/或糖化的含淀粉植物原料。优选为选自下组的含淀粉原料：块茎(tuber)、根(root)和整谷粒(whole grain)以及其任何组合。在实施方案中，含淀粉原料获自谷类(cereals)。含淀粉原料例如可选自下组：玉米(corn)(玉米(maize))、小麦(wheat)、大麦(barely)、木薯(cassava)、高粱(sorghum)、黑麦(rye)、买罗高粱(milo)、柳枝稷(switch grass)以及马铃薯(potato)，或其任何组合。在优选的实施方案中，液化的和/或糖化的植物原料是玉米醪液(corn mash)。通常，玉米醪液含有10-50wt.％TS(总固体(total solids))，优选25-40wt.％TS。约70wt.％的TS玉米醪液是淀粉。
在实施方案中，在开始产生酶的生产过程(即底物装入发酵罐)之前，将液化的和/或糖化的含淀粉植物原料导入，至少部分地导入发酵罐中，并且在初始温育期用作碳源。优选地，在酶产生过程的时间间隔中，以与公知的现有技术方法中加入纯化葡萄糖明显相同的方式加入，至少部分地加入液化的和/或糖化的含淀粉植物原料作为底物进料(substrate feed)。通常，大多数底物作为底物进料加入。底物进料的最佳剂量倚赖于所产生的酶、宿主细胞和/或所选的工艺条件(process condition)。例如，当使用木霉属(Trichoderma)，如里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株作为宿主细胞产生纤维素酶时，将碳源底物水平保持较低，即1g碳源底物/L以下，例如，1g葡萄糖/L。本发明的方法可与使用例如纯化葡萄糖的相应方法持续相同的时间。木霉属发酵通常持续5-9天。
在实施方案中，过滤液化的和/或糖化的含淀粉植物原料(即过滤的玉米醪液(Filtered Corn Mash)(FCM)，例如，如在下文“材料和方法”中“制备FCM”部分所述)。粗过滤的底物使底物易于泵送入至进料管线(feed lines)。然而，可以理解，过滤液化的和/或糖化的含淀粉植物原料不是强制性的。然而，如果液化的和/或糖化的底物(例如FCM)的浓度太稀，例如，低于200g底物/L，它可能不适于作为底物进料。因此，底物/底物进料可根据本发明浓缩和/或与其它的底物组合，以将底物的浓度增加至适宜的水平。优选，底物进料浓度为200g底物/L以上，优选400g底物/L以上，优选500g底物/L以上，更优选约600g底物/L，例如300-800g底物/L，优选400-700g底物/L，如约600g底物/L。
液化的和/或糖化的含淀粉植物原料可以是在产生期望的酶的时间间隔过程中加入的唯一底物或碳源底物，或可构成底物或碳源底物的相当大的百分比，例如，所有底物或碳源底物的至少10wt.％，优选至少30wt.％，更优选至少50wt.％，更优选至少70wt.％，甚至更优选至少90wt.％，或最优选至少95wt.％。
其它的碳源或底物，例如(纯化的)葡萄糖或类似的底物，可构成含有液化的和/或糖化的底物的底物剩余部分。可加入氮源、诱导物和其它生长刺激物以提高发酵和酶产量。氮源包括氨(NH4Cl)和肽。可以使用蛋白酶，例如，来消化蛋白产生游离的氨基氮(free amino nitrogen(FAN))。此类游离的氨基酸可作为宿主细胞的营养物起作用，因而提高生长和酶产量。优选的用于生长的发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素(multivitamins)、生物素(biotin)、泛酸(pantothenate)、烟酸(nicotinic acid)、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素(thiamine)、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸(para-aminobenzoic acid)、叶酸(folic acid)、核黄素(riboflavin)以及维生素A、B、C、D和E。矿物质的实例包括能供给营养物的矿物质和无机盐，其含有P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
是否加入诱导物以及加入哪种诱导物依赖于宿主细胞以及待产生的期望的酶。例如，当产生纤维素酶时，经常使用纤维素作为诱导物。
根据本发明，在以相应于通常使用的(即根据本发明取代的/替代的)纯化葡萄糖或类似碳源底物的量接种宿主细胞培养物之前或之后，可将液化的和/或糖化的含淀粉植物原料(即底物)加入培养基。这意味着可以与通常使用的葡萄糖相等的量加入液化的和/或糖化的植物原料。换句话说，液化的和/或糖化的含淀粉植物原料与葡萄糖的比例(即，kg液化的和/或糖化的植物原料每kg葡萄糖或其它的类似碳源底物)是约2∶1至3∶1。然而，如上文所述，也可以将液化的和/或糖化的含淀粉植物原料浓缩或与其它的底物组合，以获得如上文所述的适宜的浓度。
如上文所述，以与公知的产生酶的方法中通常使用纯化葡萄糖作为底物的相同的方式，使用液化的和/或糖化的含淀粉植物原料。在本发明的方法过程中的底物的浓度对应于本领域公知的方法中葡萄糖水平，但在某种程度上依赖于期望的酶。本领域的技术人员可以容易地确定在发明的过程中加入哪种量的底物。其它的指导可见于例如James E Bailey和David F.Ollis的BiochemicalEngineering Fundamentals，Second Edition，McGraw-Hill Book Company 1986。
根据本发明，“液化的含淀粉植物原料”意指已经过了合适时间的淀粉酶，如α-淀粉酶水解或酸处理的植物原料。在优选的实施方案中，在水解前，已将植物原料在微粒大小上减小，例如，通过干或湿磨(dry or wet milling)，以增加对植物原料表面的可及性(accessibility)。
也可将含淀粉植物原料或液化的植物原料进行糖化。“糖化的”意指将植物原料，例如麦芽糊精(如液化的含淀粉植物原料)或未蒸煮过的(uncooked)含淀粉植物原料，转化成能被所述宿主细胞代谢的低分子量的糖，例如，DP1-3，例如葡萄糖和麦芽糖(即，糖源(carbohydrate source))。
本发明的优势在于，在酶产生的场所可利用液化的和/或糖化的植物原料。本发明的方法特别适于在含淀粉的原料已转化成适宜的底物的场所产生酶。换句话说，本发明的方法特别适于例如产生用于糖浆生产方法或发酵方法的含葡萄糖或含淀粉的工业生产液流(process stream)的场所。然而，也可产生液化的和/或糖化的植物原料，用作根据本发明的酶生产的底物。在液化的和/或糖化的植物原料是例如淀粉到糖浆或淀粉到发酵产物过程中的中间产物的情况下，本发明的方法特别有利。对于现场(on site)产生酶来说，这使底物特别易于获得并且廉价。
期望的酶
根据本发明的方法产生的酶可以是任何酶。优选的酶是水解酶(根据酶的命名法，EC3类)，其包括尤其是纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶或其它水解酶，特别地用于将植物原料转化成糖浆和发酵底物，例如通过酵母转化成乙醇。
酶可以和宿主细胞同源或异源。
术语“同源酶”意指由源自产生该酶的宿主细胞的基因编码的酶。
术语“异源酶”意指由对于产生该酶的宿主细胞外源的基因编码的酶。
在一个实施方案中，期望的酶是单组分酶。在另一个实施方案中，期望的酶是由获得自野生型宿主细胞或其突变体的两种或多种酶组成的酶制备物或酶复合物。酶复合物的实施例是公知的含有内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的纤维素酶复合物。酶制备物的实例是上述的纤维素酶复合物，其中一个或多个编码酶的基因，例如，内切葡聚糖酶基因，已从野生型宿主细胞中缺失。可通过野生型宿主细胞或其突变体产生纤维素酶复合物或制备物。在一实施方案中，在与供体细胞不同的适宜的重组宿主细胞中重组产生酶，编码酶的基因是从该供体细胞获得的。期望的酶可以是胞内的或是胞外的。优选胞外酶。期望的酶也可以是野生型酶的变体。
纤维素酶和半纤维素酶
纤维素酶和/或半纤维素酶可以是根据本发明产生的期望的酶。
预期的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterases)、葡萄醛酸糖苷酶(glucuronidases)、内切半乳聚糖酶(endo-galactanase)、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶(endo-or exo-arabinases)以及外切半乳聚糖酶(exo-galactanase)。
预期的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些酶。包括化学修饰或蛋白工程变体。适宜的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单孢菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)以及木霉属的纤维素酶，例如由特异腐质霉(Humicolainsolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)和里氏木霉产生的真菌纤维素酶。在优选的实施方案中，期望的酶是纤维素酶复合物，其是由里氏木霉同源产生的。
在另一个优选的实施方案中，期望的酶是在里氏木霉中异源产生的纤维素酶制备物，其中产生一种或多种对于里氏木霉外源的水解酶。
在另一个实施方案中，期望的酶是纤维素酶复合物，其是由特异腐质霉同源产生的。
淀粉酶
淀粉酶可以是根据本发明产生的期望的酶。预期的淀粉酶包括α-淀粉酶菌、β-淀粉酶以及产麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylases)。
α-淀粉酶可以获得自芽孢杆菌属，例如获得自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.sultilis)以及嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株。其它的α-淀粉酶包括获得自芽孢杆菌属菌种NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375菌株的α-淀粉酶，所有这些都详细描述于WO 95/26397中，或Tsukamoto et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，151(1988)，pp.25-31描述的α-淀粉酶。
其它的α-淀粉酶包括获得自丝状真菌的α-淀粉酶，优选曲霉属(Aspergillus)的菌株，例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)。
在优选的实施方案中，期望的酶是获得自米曲霉的α-淀粉酶，例如具有WO 96/23874(其在此引入作为参考)的SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶。
期望的酶也可以是获得自黑曲霉的α-淀粉酶，特别是在Swiss-prot/TeEMBL数据库以原始登录号P56271作为“AMYA_ASPNG”公开的α-淀粉酶。
期望的酶也可以是β-淀粉酶，例如W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress inIndustrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979(其在此引入作为参考)中公开的任何植物和微生物的β-淀粉酶。
期望的酶也可以是产麦芽糖淀粉酶。“产麦芽糖淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。特别预期的产麦芽糖淀粉酶是获得自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，上述文献在此引入作为参考。
葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶可以是根据本发明产生的期望的酶。可从任何适宜的来源获得葡糖淀粉酶，例如，从微生物或植物中获得。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，例如选自下组的葡糖淀粉酶：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel et al.，1984，EMBO J.3：5，p.1097-1102)；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO 84/02921)，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55：4，p.941-949)。其它的葡糖淀粉酶包括Athelia rolfsii(以前表示为Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(参阅美国专利号4,727,026以及Nagasaka，Y.et al.(1998)Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是获得自Talaromyces emersonii(WO 99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利号Re.32，153)、Talaromyces duponti、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)的葡糖淀粉酶。预期的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135，138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。
能产生酶的宿主细胞
宿主细胞可以是任何属的宿主细胞。如上文所提到的，期望的酶可与能产生该期望的酶的宿主细胞同源或异源。
如本文所用的，术语“重组宿主细胞”意指，含有编码期望的酶的基因并且能表达所述的基因以产生期望的酶的宿主细胞。用本领域公知的技术，可将编码期望的酶的基因转化、转染、转导或类似方式入重组宿主细胞中。
当期望的酶是异源的酶时，能产生该期望的酶的重组宿主细胞优选是真菌或细菌来源的。重组宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码期望的酶的基因以及所述酶的来源。
如本文所用的，术语“野生型宿主细胞”指天然含有编码期望的酶的基因并且能表达所述的基因的宿主细胞。当期望的酶是同源酶制备物或复合物时，能产生该期望的酶的野生型宿主细胞或其突变体优选是真菌或细菌来源的。
“其突变体”可以是其中已缺失一个或多个基因例如以使在一定组分中富集期望的酶制备物的野生型宿主细胞。突变野生型宿主细胞也可以是用编码附加酶的一个或多个附加基因转化以将一种或多种附加的酶活性导入由野生型宿主细胞天然产生的期望的酶复合物或制备物的野生型宿主细胞。附加酶可以具有相同的活性(例如纤维素酶活性)，但其仅是另一种酶分子，例如，具有不同的特性。突变野生型宿主细胞也可具有转化、转染、转导或类似方式优选整合入基因组的附加的同源酶编码基因，以增加该基因的表达从而产生更多的酶。
在优选的实施方案中，重组或野生型宿主细胞是丝状真菌来源的，宿主细胞的实例包括选自下组的宿主细胞：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、黑粉类酵母属(Filobasidium)、镰孢属、腐质霉属、瘟病菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃弧菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为选自下组的菌株：泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉或米曲霉。在另一个优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞的菌株。在另一个优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞选自下组：黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa或Ceriporiopsis subvermispora、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、土生梭孢霉、Trametes versicolor、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)。
在另一个优选的实施方案中，重组的或野生型宿主细胞是细菌来源的。宿主细胞的实例包括选自下组的宿主细胞：其包括革兰氏阳性细菌，例如芽孢杆菌属的菌株，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，或链霉菌属菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌(E.coli)或假单孢菌属的菌种(Pseudomonas sp)。
用途
本发明的第二方面涉及液化的和/或糖化的含淀粉植物原料在宿主细胞中产生期望的酶的用途。
本文描述和要求的本发明在范围上不受本文公开的具体的实施方案的限制，因为这些实施方案意图作为本发明几个方面的示例性说明。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。实际上，除本文中所显示和描述的那些外，根据前面的描述，本发明的各种改变对本领域的技术人员而言是显然的。这些改变也意欲落入所附的权利要求范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
文中引用了多种参考文献，其公开的内容在此全部引入作为参考。
材料和方法
材料
里氏木霉SMA135-04公开于美国专利公开号2005/0233423的实施例8中。
痕量金属制备物
 成分 g/L
 FeCl3·6H2O 216
 ZnSO4·7H2O 58
 MnSO4·H2O 27
 CuSO4·5H2O 10
 H3BO3 2.4
 柠檬酸 336
种子瓶制备物(seed flask preparation)
成分 g/L
葡萄糖 20
玉米浸渍固体(Corn Steep Solids) 10
(NH4)2SO4 1.45
KH2PO4 2.08
CaCl2·2H2O 0.36
MgSO4·7H2O 0.42
痕量金属(mL) 0.2
PluronicL61 每SF(1-2)滴
pH 5
高压灭菌时间(min) 30
种子瓶接种
接种物(cm2PDA平板) 1
种子瓶容积(mL) 100
温育时间(hrs) 45
摇床温度 28
摇床RPM 200
转移标准(Transfer Criteria)     pH＜4.0
容器接种体积(mL)     50
灭菌后添加(泡沫控制剂)
成分1∶5 PluronicL61：H2O     量5mL根据需要 灭菌方法高压灭菌
实施例1
液化的和糖化的玉米醪液用于产生纤维素酶
在水中加热粗略研磨的玉米颗粒并用α-淀粉酶(TERMAMYLTMSC来自Novozymes)处理以液化浓稠的混合物，该混合物含有大约34％的干重固体。通过加入葡糖淀粉酶(SPIRIZYMETM FUEL来自Novozymes)并在65℃温育48小时，将混合物糖化。将此混合物以约4500×g离心10分钟以除去不溶的固体，通过Miracloth(Calbiochem)过滤，并且使用以5mM的硫酸洗脱的AminexHPX87H柱(BioRad)通过HPLC分析并以折射率检测器检测，来测试所得过滤的玉米醪液上清液的糖含量。葡萄糖、纤维二糖、木糖以及乙醇的标准溶液用于校对检测的糖和乙醇的定量。在含糖的玉米醪液上清液糖浆中，葡萄糖的通常浓度大约为300g/升。
在Applikon 2L玻璃夹套容器(glass jacketed vessels)中进行发酵，该容器具有1.8L的工作容积。通过电子热电偶(electronic thermocouples)测量温度并且用循环水浴控制温度。用购自Broadley James Corporation的传感器探针测量溶解氧和pH。ADI 1030控制器进行成比例的反馈控制(feedback control)以基于pH设置点以及死区(deadband)使用酸和碱进料泵(feed pumps)来调节pH。ADI 1012搅拌控制器用于驱动Applikon P310马达从而以1100至1300rpm的速度搅拌培养液(broth)。利用无挡板(baffles)的Rushton径流式叶轮(radial-flowimpellers)。用无菌的气流以约1wm的速度给培养液通气，空气经由位于叶轮下面的发酵罐底部的鼓泡器(sparger)进入。
用里氏木霉菌株SMA-135-04进行发酵。已制备甘油冷冻储备物(stocks)并用作种子瓶的接种物。如下表所示培养种子瓶。如所示的，减小了一些接种体的体积。
里氏木霉菌株SMA-135-04发酵持续约165小时，此时收获发酵罐。使用在进料中具有纤维素以诱导纤维素酶产生的葡萄糖进料。如果需要，使用P1uronicL61表面活性剂以减少起泡。将具有葡萄糖进料的实例(APE-35，-36，37)与玉米醪液滤液进料(APE-38，-39，-40)进行比较。
发酵培养基
APE-35  APE-36  APE-37  APE-38  APE-39  APE-40
成分 g  g  g  g  g  g
玉米浸渍固体 18.0  18.0  18.0  18.0  18.0  18.0
纤维素 75.0  150.0  150.0  75.0  150.0  150.0
成分 g/L g
葡萄糖 4 7.2
CaCl2·2H2O 2.64 4.8
(NH4)2SO4 3.8  6.8
KH2PO4 2.8  5.0
MgSO4·7H2O 1.63  2.9
痕量金属(mL) 0.75  1.4
PluronicL61(mL) 1.8  3.2
加入发酵罐的培养基体积(L) 1.8  1.8
pH 4.3
高压灭菌的时间(min) 60
进料组合物
APE-35  APE-36  APE-37  APE-38  APE-39  APE-40
成分 g  g  g  mL  mL  mL
葡萄糖 454.5  454.5  454.5
FCM  1500.0  1500.0  1500.0
水 1500mL总体积
操作条件
起始体积(L) 1.8
温度(℃) 28
pH 4.75±0.1
起始搅拌(rpm) 1100
气流(VVM) 1
最小DO(％) 25    25
Hrs 标准 APE-35 APE-36 APE-37 APE-38 APE-39 APE-40
进料(g湿进料/hr) 0 0 0 0 0 0 0 0
18 3.6 1× 0.75× 1× 0.5× 0.5× 0.75×
33 7.2 1× 0.75× 1× 0.5× 0.5× 0.75×
pH控制 酸 5N H3PO4 1×＝以g葡萄糖/hr表示的标准进料速率(维持DO＞25％和葡萄糖＜1g/L)
碱 28％NH4OH
将最终的发酵培养液的等分试样在DDI水中稀释5倍。接着，将1体积的稀释样品与2体积的与5％的β-巯基乙醇混合的SDS样品缓冲液(BioRad)混合，煮沸5分钟。将15微升的每种样品加样于8-16％的Tris-HCl凝胶(BioRad)上，进行电泳并用BioSafe Coomassie Blue染色(图1)。APE35-40在～18kD处显示清晰的条带，有些在＜10kD处也显示条带。如在凝胶上所看到的，在APE-38、-39和-40中表达的蛋白高于含有葡萄糖的发酵。
通过酶培养液水解稀酸预处理的玉米秸(PCS)的能力和产生可通过化学测定其还原性末端检测的糖的能力，来测量酶培养液的活性。葡聚糖含量为53.2％(NREL数据)的PCS由National Renewable Energy Laboratory(NREL，Golden CO)提供。将1kg PCS悬浮于盛料桶(bucket)内～20升双去离子水(double deionized water)中，PCS沉降(settled)后，将水倾析。重复此步骤直到洗涤水高于pH 4.0，此时还原糖低于0.06g/L。通过100 Mesh筛子筛沉降的浆液以确保移取的能力(ability to pipette)。通过在105℃烘箱中将样品干燥24+小时(直到恒重)并且与湿重比较，来测定洗涤的PCS的百分比干重含量。
在通过平板密封物(ALPS-300，ABgene)密封的96深孔板(AxygenScientific)中进行PCS水解。PCS的浓度为10g/L，具有50mM乙酸盐(acetate)，pH 5.0。在50℃，总反应体积为1.0ml，而无额外搅拌的条件下进行PCS水解。每个反应重复进行三次。如下所述，通过p-羟基苯甲酸酰肼(p-hydroxybenzoic acid hydrazide，PHBAH)试剂分析释放的还原糖。
具体而言，将0.8ml的PCS(12.5g/L)移取至96深孔板的每一个孔中，并且向其中加入0.10ml的醋酸钠缓冲液(0.5M，pH5.0)，接着，加入0.10ml稀释的酶溶液，以启动反应并且产生1.0ml的终反应体积和10g/L的PCS浓度。通过在水解开始时以及在取得每一个样品的时间点之前颠倒深孔板，将反应混合物混合。混合后，将深孔板以3000rpm离心2分钟(Sorvall RT7带有RTH-250转子)，然后移出20微升水解物(上清液)并将其加至96-孔微量平板中的180微升4％NaOH。如果需要，可将此终止的溶液进一步稀释到还原糖的适当范围。通过对-羟基苯甲酸酰肼试剂(para-hydroxy benzoic acidhydrazide reagent，PHBAH，Sigma，4-hydroxy benzyhydrazide)测定释放的还原糖：将50微升的PHBAH试剂(1.5％)与100微升样品在V形底96-孔Thermowell平板(Costar 6511)中混合，在平板加热块(plate heating block)上在95℃温育10分钟，然后将50微升DDI水加入每个孔，混合并将100微升转移至另一个平底96-孔板(Costar 9017)并在410nm读取吸光度。在相同的条件下，用葡萄糖校对曲线(glucose calibration curve)计算还原糖。将纤维素到还原糖的百分比转化率计算为：
％转化率＝还原糖(mg/ml)/(添加的纤维素(mg/ml)×1.11)
因数1.11修正了将纤维素水解成葡萄糖中的重量增加。
产生第二高的蛋白水平(图3)的APE-39，还产生了利用玉米醪液发酵的最有效的纤维素酶混合物(图2)。所有的发酵显示了纤维素酶活性的产生。

Claims (22)

1.在宿主细胞中产生期望的酶的方法，其包括使用用于宿主细胞的含有液化的和/或糖化的含淀粉的植物材料的底物，在有利于产生期望的酶的条件下，培养能产生所期望的酶的所述宿主细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中宿主细胞是重组宿主细胞或野生型宿主细胞或其突变体。
3.根据权利要求1或2的方法，其中宿主细胞是细菌或真菌来源的。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中酶是水解酶(根据酶的命名法EC3类)，优选纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶或葡糖淀粉酶。
5.根据权利要求4的方法，其中期望的酶是通过野生型宿主细胞或其突变体，优选木霉属的野生型宿主细胞或其突变体，优选里氏木霉的菌株产生的纤维素酶复合物/制剂。
6.根据权利要求4的方法，其中期望的酶是通过重组宿主细胞，优选木霉属，特别是里氏木霉的菌株的重组宿主细胞产生的纤维素酶制剂。
7.根据权利要求4的方法，其中期望的酶是通过腐质霉属的菌株，优选特异腐质霉的菌株产生的纤维素酶复合物/制剂。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中期望的酶是在至少50升的罐中产生的。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中液化的和/或糖化的含淀粉的植物材料构成在发酵间隔中加入的底物的至少50％(w/w)。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中在使用之前，将液化的和/或糖化的含淀粉的植物材料过滤。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在期望的酶的产生方法的时间间隔中，至少部分地加入所述底物作为底物进料。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中在使用之前，将液化的和/或糖化的含淀粉的植物材料浓缩至高于200g底物/L的浓度。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中底物进料浓度高于200g底物/L，优选约600g底物/L。
14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其中在发酵过程中的底物浓度保持低于1g底物/L。
15.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中液化的和/或糖化的含淀粉的植物材料源自块茎、根或整谷粒，或其任何组合。
16.根据权利要求15的方法，其中含淀粉的材料源自玉米、木薯、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、柳枝稷和马铃薯，或其任何组合。
17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中液化的和/或糖化的含淀粉的植物材料是来自发酵产物生产如乙醇生产的侧线流或共享液流。
18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其中从含淀粉的植物材料制备底物，所述含淀粉的植物材料已用α-淀粉酶液化或进行了酸处理。
19.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中从含淀粉的植物材料或液化的含淀粉的植物材料中制备底物，所述材料已用葡糖淀粉酶糖化。
20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中在发酵后回收期望的酶。
21.液化的和/或糖化的含淀粉的植物材料作为底物用于在宿主细胞中产生酶的用途。
22.根据权利要求21的用途，其中所述酶是水解酶，优选糖酶，特别是纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶或葡糖淀粉酶。
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