CN104411832A - 使用脂肪酸使生产菌株失活 - Google Patents

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CN104411832A CN201380034104.8A CN201380034104A CN104411832A CN 104411832 A CN104411832 A CN 104411832A CN 201380034104 A CN201380034104 A CN 201380034104A CN 104411832 A CN104411832 A CN 104411832A
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M·埃勒高
S·雅各布森
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Abstract

一种使发酵液中的微生物宿主细胞失活的方法，该发酵液包括一种感兴趣的酶和生产该感兴趣的酶的微生物宿主细胞，该方法包括：a)将一种具有C4-C12链长的脂肪酸加入该发酵液中；并且b)将该发酵液混合一段充足的时间直到该微生物宿主细胞失活。

Description

使用脂肪酸使生产菌株失活
技术领域
本发明涉及一种生产作为粗产品的所希望的一种或多种酶的方法。
背景技术
目前，微生物宿主细胞被广泛地用于通过发酵来生产酶。酶被大量需要，尤其在生物燃料领域用于工业用途，例如，诸如用于将植物材料转化为糖浆剂和/或发酵产物的纤维素酶。这些酶只能够以相当低的价格出售。这使得酶生产成本成为在市场中成功的一个重要因素。
解决这个问题的一种方式是生产粗产品，这意味着在发酵液中的微生物宿主细胞已经失活，但是尚未进行回收步骤诸如离心和/或过滤。
发明概述
诸位发明人已经发现通过使用脂肪酸可以使微生物宿主细胞失活，因此我们要求：
一种使发酵液中的微生物宿主细胞失活的方法，该发酵液包括一种感兴趣的酶和生产该感兴趣的酶的微生物宿主细胞，该方法包括
a)将一种具有C4-C12链长的脂肪酸加入该发酵液中；并且
b)将该发酵液混合一段充足的时间直到该微生物宿主细胞失活。
诸位发明人已经发现通过使用脂肪酸盐可以使微生物宿主细胞失活，因此我们要求：
一种使发酵液中的微生物宿主细胞失活的方法，该发酵液包括一种感兴趣的酶和生产该感兴趣的酶的微生物宿主细胞，该方法包括
a)将一种具有C4-C12链长的脂肪酸盐加入该发酵液中；并且
b)将该发酵液混合一段充足的时间直到该微生物宿主细胞失活。
在本发明的一个具体实施例中，该脂肪酸具有C6-C8的链长。在一个更具体实施例中，该脂肪酸具有C8的链长。
在一个具体实施例中，优选的是具有C6-C8链长的脂肪酸盐。在一个更具体实施例中，优选的是具有C8链长的脂肪酸盐。
发明的详细披露
本发明的目的是提供一种以工业规模生产作为粗产品的所希望的一种或多种酶的方法。
能够生产感兴趣的一种或多种酶的微生物宿主细胞
该微生物宿主细胞可以是任何属。该所希望的一种或多种酶对于能够生产该感兴趣的一种或多种酶的宿主细胞可以是同源的或异源的。
术语“同源酶”意指由来源于生产它的宿主细胞的基因编码的酶。
术语“异源酶”意指由对于生产它的宿主细胞外源的基因编码的酶。
如本文所用的术语“重组型宿主细胞”意指含有编码所希望的一种或多种酶的一种或多种基因并且能够表达所述一种或多种基因以生产所希望的一种或多种酶的宿主细胞。使用本领域熟知的技术可以将对所希望的一种或多种酶编码的一种或多种基因转化、转染、转导等至该重组型宿主细胞中。
当该所希望的酶是一种异源酶时，能够生产该所希望的酶的重组细胞优选是真菌或细菌来源。重组型宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该所希望的酶的基因和所述酶的来源。
如本文所用的术语“野生型宿主细胞”指的是天然地含有编码所希望的一种或多种酶的一种或多种基因并且能够表达所述一种或多种基因的宿主细胞。
“其突变体”可以是例如，为了丰富所希望的酶制剂，一种或多种基因被缺失的野生型宿主细胞。
突变型野生型宿主细胞还可以是用一种或多种编码另外的酶的另外基因转化的野生型宿主细胞，以便将一种或多种另外的酶活性引入至天然地由该野生型宿主细胞产生的所希望的酶复合物或制剂。
该另外的酶可以是同一或另一种酶分子。
该突变型野生型宿主细胞还可以已经将另外的同源酶编码基因转化、转染、转导等，优选地整合至基因组，以便增加那个基因的表达以产生更多的酶。
在一个优选实施例中，该重组型或野生型微生物宿主细胞是一种细菌或一种真菌。
该微生物宿主细胞可以是一种酵母细胞，诸如假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)菌株。在另一个方面中，该菌株是卡氏酶母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酶母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酶母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)菌株。
该微生物宿主细胞可以是丝状真菌菌株，诸如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)菌株。
在另一个方面中，该菌株是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、粟酒裂殖酵母、无色梭孢壳霉(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳霉(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉(Thielaviaaustraleinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳霉(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳霉(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳霉(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。
在一个方面中，该真菌宿主细胞是一种选自下组的菌株，该组由以下各项组成：假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、以及木霉属(Trichoderma)。
在一个更优选的实施例中，该丝状真菌宿主细胞是选自下组，该组由以下各项组成：木霉属(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)宿主细胞，特别是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)或米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，尤其是里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株。
在另一个优选的实施例中，该重组型或野生型微生物宿主细胞是一种细菌。微生物宿主细胞的实例包括选自下组的宿主细胞，该组包括：革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)，或革兰氏阴性细菌，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、黄质菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)。
在一个方面中，该细菌宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
在另一个方面中，该细菌宿主细胞是马链球菌(Streptococcusequisimilis)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubspecies Zooepidemicus)。
在另一个方面中，该细菌宿主细胞是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、热紫链霉菌(Steptomyces thermoviolaceus)、褐色链霉菌(Streptomycesfusca)、哈茨链霉菌(Steptomyces harzianum)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)。
在另一个方面中，该细菌宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个方面中，该细菌宿主细胞是选自下组，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属、链霉菌属、埃希氏杆菌属和假单胞菌属。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
感兴趣的酶
在本发明的背景下的酶可以是通过发酵可获得的任何酶或不同酶的组合。因此，当提及“一种酶”时，这通常将被理解为包括一种单一的酶以及多于一种酶的组合两者。
应该理解的是，酶变体(例如由重组技术产生)被包括在术语“酶”的意义之内。
因此，可以被适当地并入本发明的酶产品中的酶的类型包括氧化还原酶(EC 1.-.-.-)、转移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂解酶(EC 4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)以及连接酶(EC 6.-.-.-)。
本发明相关的水解酶包括以下(EC编号位于括号中)：
α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纤维素酶(3.2.1.4)、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、内切-1,4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、右旋糖酐酶(3.2.1.11)、壳多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、脂肪酶(EC 3.1.1.3)、植酸酶(EC 3.1.3.-)，如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1,6-葡糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1,4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖内切-1,3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精内切-1,6-α-葡糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖内切-1,3-α-葡糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶(3.2.1.75)、阿聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、壳聚糖酶(3.2.1.132)以及木糖异构酶(5.3.1.5)。
根据本发明所产生的该一种或多种酶可以是任何一种或多种酶。优选的酶是水解酶，尤其包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖苷酶、植酸酶、脂肪酶或任何其他的水解酶，尤其是用于将植物材料转化为糖浆剂和发酵底物(例如，通过酵母转化为乙醇)的酶。
根据本发明，特别地优选的酶是选自下组，该组由以下各项组成：纤维素酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶以及β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，这种感兴趣的酶是一种单组分酶。在另一个实施例中，这种感兴趣的酶是一种酶制剂或由来源于野生型宿主细胞或其变体的两种或更多种酶组成的酶复合物。
酶复合物的一个实例是熟知的里氏木霉纤维素酶复合物，该复合物包括内切葡聚糖酶、木聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。酶制剂的一个实例是以上提到的纤维素酶复合物，其中一种或多种酶编码基因如一种或多种内切葡聚糖酶基因已经被从野生型宿主细胞缺失。纤维素酶复合物或制剂可以由野生型宿主细胞或其变体产生。在一个实施例中，该酶是在一个合适的重组型宿主细胞内重组地产生，该合适的重组型宿主细胞不同于供体细胞，酶编码基因来源于该供体细胞。该所希望的酶可以是细胞外的或细胞内的。优选的是细胞外的酶。所希望的酶还可以是一种野生型酶的变体。
纤维素酶和半纤维素酶
纤维素酶和/或半纤维素酶复合物可以是根据本发明生产的所希望的酶。
半纤维素包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、和外切半乳聚糖酶。
纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、青霉菌属、热单孢子属(Thermonospore)、梭状芽孢杆菌属、纤维单胞菌属、肉座菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳菌属、枝顶孢属、以及木霉属的纤维素酶，例如，由特异腐质霉、嗜热毁丝菌、土生梭孢霉、尖孢镰刀菌以及里氏木霉产生的真菌纤维素酶。
在一个优选的实施例中，该所希望的酶是由里氏木霉同源地产生的纤维素酶复合物。
在另一个优选的实施例中，该所希望的酶是在里氏木霉中异源地产生的纤维素酶和半纤维素酶复合物，其中产生对里氏木霉外源的一种或多种水解酶，例如由诺维信(Novozymes A/S)生产的CTec产品。
在另一个优选的实施例中，该所希望的酶是由特异腐质霉同源地产生的纤维素酶复合物。
淀粉酶
一种淀粉酶可以是根据本发明而生产的所希望的酶。淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶以及麦芽糖淀粉酶。
α-淀粉酶可以来源于芽孢杆菌属，例如来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(B.sultilis)以及嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。其他α-淀粉酶包括来源于芽孢杆菌属菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶，所有的这些详细描述在WO95/26397中，或冢本(Tsukamoto)等人，《生物化学和生物物理研究通讯》(Biochemical and Biophysical Research Communications)，151(1988)，25-31页中描述的α-淀粉酶。
其他α-淀粉酶包括来源于丝状真菌、优选曲菌属菌株(例如米曲霉和黑曲霉)的α-淀粉酶。
在一个优选的实施例中，该所希望的酶是来源于米曲霉的α-淀粉酶，如在WO 96/23874中的具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的α-淀粉酶。
该所希望的酶还可以是来源于黑曲霉的α-淀粉酶，尤其是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主登录号P56271下作为“AMYA_ASPNG”披露的α-淀粉酶。
该所希望的酶还可以是β-淀粉酶，如W.M.(福格蒂)Fogarty和C.T.(凯利)Kelly在《工业微生物学进展》(Progress in IndustrialMicrobiology)第15卷，112-115页、1979中所披露的任何植物和微生物的β-淀粉酶。
所希望的酶还可以是一种麦芽糖淀粉酶。一种“麦芽糖淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链淀粉和支链淀粉水解为α构型的麦芽糖。一种感兴趣的麦芽糖淀粉酶是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048；4,604,355；以及6,162,628中。
葡糖淀粉酶
一种葡糖淀粉酶可以是根据本发明而生产的所希望的酶。葡糖淀粉酶可以来源于任何适合的来源，如来源于一种微生物或一种植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源，例如，选自下组，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3:5，1097-1102页)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)，米曲霉葡糖淀粉酶(《农业.生物.化学》(Agric.Biol.Chem.)，1991，55:4，941-949页)。其他的葡糖淀粉酶包括罗氏阿太菌(先前表示为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)，Y.等人(1998)来自罗氏阿太菌的粗-淀粉-降解葡糖淀粉酶的纯化和特性(Purificationand properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticiumrolfsii)，《应用微生物学与生物技术》(Appl Microbiol Biotechnol)50:323-330)，踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于爱默生踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)，Talaromyces leycettanus(美国专利参考号32,153)，Talaromyces duponti，嗜热踝节菌(美国专利号4,587,215)。细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属，特别是热解淀粉梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)，以及热硫化氢梭状芽孢杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。
发酵液
如在本发明的背景中所使用的术语“发酵液”应被理解为一种水性组合物，其包括一种感兴趣的酶和在发酵过程中产生该感兴趣的酶的生产菌株两者。
该发酵液的组成是复杂的，由结束于发酵液中的任何物质组成。这包括：
1原底物
2发酵产物
3微生物和衍生物组分
4添加至发酵罐的化学添加剂
5气体诸如氧气和其他的代谢气体
本发明可以用于工业规模的任何深层发酵，例如用于具有至少10,000升、优选地至少20,000升、更优选地至少50,000升、更优选地至少100,000升，甚至更优选地至少200,000升培养基，特别是具有从20,000升至2,000,000升培养基；尤其是具有从50,000升至500,000升培养基的任何发酵。
可以通过本领域中任何已知的方法来发酵宿主细胞。发酵培养基可以是复合培养基，包括复合的氮源和/或碳源，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米浆、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、马铃薯蛋白、马铃薯蛋白水解物、糖蜜、等。发酵培养基可以是化学成分确定的培养基，例如在WO 98/37179中所定义的培养基。
发酵可以以分批、分批补料、反复分批补料或连续发酵过程进行；特别是以分批补料发酵过程进行。
脂肪酸
脂肪酸是一种具有脂肪族尾(链)的羧酸，其或者是饱和的或者是不饱和的。具有双键的脂肪酸被称为不饱和的。没有双键的脂肪酸被称为饱和的。它们的长度也不同。脂肪酸通常来源于甘油三酸酯或磷脂。当它们不附接至其他分子时，它们还被称为“游离”脂肪酸。
游离脂肪酸链长：
脂肪酸因链长而不同，经常以短、中、或长分类。
·短链脂肪酸(SCFA)是具有少于6个碳的脂肪族尾的脂肪酸。
·中链脂肪酸(MCFA)是具有6-12个碳的脂肪族尾的脂肪酸。
·长链脂肪酸(LCFA)是具有长于12个碳的脂肪族尾的脂肪酸。下面是饱和脂肪酸的清单：
根据本发明，各种液体脂肪酸是优选的。
根据本发明，具有C3至C11的脂肪族尾的脂肪酸(该脂肪酸具有C4-C12链长)是优选的：
在一个具体实施中，优选的是C4-C12的盐。
根据本发明，具有C4至C7的脂肪族尾的脂肪酸(该脂肪酸具有C5-C8链长)是尤其优选的：
戊酸(Valeric acid)戊酸(Pentanoic acid)CH3(CH2)3COOH C5
己酸(Caproic acid)己酸(Hexanoic acid)CH3(CH2)4COOH C6
庚酸(Enanthic acid)庚酸(Heptanoic acid)CH3(CH2)5)COOH C7
辛酸(Caprylic acid)辛酸(Octanoic acid)CH3(CH2)6COOH C8
在一个具体的实施例中，优选的是具有C5-C8链长的脂肪酸盐。
在本发明的一个具体实施例中，该脂肪酸具有C6-C8的链长。在另一个具体的实施例中，该脂肪酸具有C7-C8的链长。在一个更具体的实施例中，该脂肪酸具有C8的链长。
己酸(Caproic acid)己酸(Hexanoic acid)CH3(CH2)4COOH C6
庚酸(Enanthic acid)庚酸(Heptanoic acid)CH3(CH2)5)COOH C7
辛酸(Caprylic acid)辛酸(Octanoic acid)CH3(CH2)6COOH C8
在一个具体实施例中，优选的是具有C6-C7链长的脂肪酸盐。在一个更具体实施例中，优选的是具有C8链长的脂肪酸盐。
在一个具体实施例中，优选的是具有C6-C8链长的脂肪酸盐。在一个更具体实施例中，优选的是具有C8链长的脂肪酸盐。
根据本发明，尤其优选的是己酸或辛酸。在一个具体的实施例中，优选的是己酸盐和/或辛酸盐。己酸具有–3.4摄氏度的熔点，并且辛酸具有16.7摄氏度的熔点。
失活
脂肪酸在低浓度下具有强的杀菌效果，并且其在抵抗细菌和酵母以及霉菌方面非常有效。脂肪酸将使存在于发酵液中的生物机体失活和/或减少生物机体。
脂肪酸可以按0.01％至5.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.01％至4.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.01％至3.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.01％至2.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.01％至1.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.02％至1.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.03％至1.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.04％至1.0％(w/w)/kg发酵液；特别是0.05％至1.0％(w/w)/kg发酵液的量加入。
加入脂肪酸后，可以调节pH。在一个优选的实施例中，pH调节为pH 3.0至pH 7.0范围的pH；特别地，pH调节为pH 3.0至pH 6.5范围的pH；特别地，pH调节为pH 3.0至pH 6.0范围的pH；特别地，pH调节为pH 3.0至pH 5.5范围的pH；特别地，pH调节为pH 3.0至pH 5.0范围的pH；特别地，pH调节为pH 3.5至pH 5.0范围的pH；特别地，pH调节为pH 4.0至pH 5.0范围的pH；尤其地，pH调节为4.5左右的pH。
pH可以通过使用本领域已知的任何酸或碱例如乙酸或氢氧化钠调节。
脂肪酸与发酵液混合充足的时间。可以在不同的时间取出样品，以便发现为了使微生物宿主细胞失活所需要的小时。
发酵液与脂肪酸混合一个高达40小时的时间；例如高达1分钟的时间；例如高达2分钟的时间；例如高达3分钟的时间；例如高达4分钟的时间；例如高达5分钟的时间；例如高达6分钟的时间；例如高达7分钟的时间；例如高达8分钟的时间；例如高达9分钟的时间；例如高达10分钟的时间；例如高达11分钟的时间；例如高达12分钟的时间；例如高达13分钟的时间；例如高达14分钟的时间；例如高达15分钟的时间；例如高达16分钟的时间；例如高达17分钟的时间；例如高达18分钟的时间；例如高达19分钟的时间；例如高达20分钟的时间；例如高达21分钟的时间；例如高达22分钟的时间；例如高达23分钟的时间；例如高达24分钟的时间；例如高达25分钟的时间；例如高达26分钟的时间；例如高达27分钟的时间；例如高达28分钟的时间；例如高达29分钟的时间；具体地，0.5至40小时的时间。
温度将典型地是室温。可以通过本领域已知的方法例如通过搅拌进行混合。应该以这样的一种方式进行混合，即全部发酵液都被散布开并且很好地混合。
应用
根据本发明的方法可以在许多工业应用中使用，其中粗酶溶液可以是充足的，例如在生物乙醇应用中(例如，生物质转化)。
实例
微生物宿主细胞的纯化
将脂肪酸以不同的浓度(0.09％(w/w)；0.28％(w/w)；0.46％(w/w)；0.65％(w/w))加入至发酵液。
使用乙酸(CAS 64-19-7)和/或水性氢氧化钠(CAS 1310-73-2)水溶液调节pH值至4.5。
在室温，pH 4.5下，恒定地搅拌具有不同浓度脂肪酸的发酵液24小时。
24小时后测试该发酵液并且如果在琼脂板上没有生长，则该微生物宿主细胞失活是成功的–样品在30摄氏度下孵育4天。
粗酶产品备用。
实例1
在里氏木霉中产生纤维素酶随后使生产菌株失活
使用里氏木霉作为微生物宿主细胞进行发酵。生产纤维素酶的里氏木霉菌株可公开获得，例如从DSMZ。
冷冻甘油原种被用作接种烧瓶的接种物。接种烧瓶如下表所示地生长。在接种过程中，使用主罐溶剂的10％(大约10,000升)。
微量金属制备
组分 g/L
FeCl3·6H20 216
ZnSO4·7H2O 58
MnSO4·H2O 27
CuSO4·5H2O 10
接种底物混合物
组分 g/kg
葡萄糖浆(73％w/w) 27
玉米浆液 19
(NH4)2SO4 1.5
KH2PO4 2.1
CaCO3 0.2
MgSO4·7H2O 0.4
柠檬酸 0.05
微量金属 0.06
消泡油 0.4
灭菌方法：用25％NaOH或25％H3PO4调节pH至5.0。升温至123摄氏度，持续1.5小时。
灭菌后：调节温度至28摄氏度。用25％NaOH或25％H3PO4调节pH至5.0。
接种：用里氏木霉孢子接种。
发酵阶段：
当pH下降至低于4.5时(大约40小时后)，发酵完成。
主罐：
主罐底物混合物
(终浓度) g/kg
(NH4)2SO4 3.7
CaCO3 0.8
K2SO4 0.9
Na2SO4 0.3
MgSO4·7H2O 0.9
柠檬酸 0.27
微量金属 0.16
消泡油 0.25
接种：将如以上所述产生的接种材料泵进主罐中。
供料系统：
使用具有一种或多种碳水化合物的供料系统，如在WO2006/125068中所披露。
原料在123摄氏度1.5小时灭菌的一个标准搅拌罐中制备和储存。逐渐加入原料。当达到目标产品的浓度时，发酵完成。
微生物宿主细胞的失活
将己酸(100％溶液，CAS 142-62-1)以不同浓度(0.09％(w/w)；0.28％(w/w)；0.46％(w/w)；0.65％(w/w))加入发酵液中。
使用乙酸(CAS 64-19-7)和/或水性氢氧化钠(CAS 1310-73-2)水溶液调节pH值至4.5。
在室温，pH 4.5下，恒定地搅拌具有不同浓度己酸的发酵液24小时。
24小时后，使里氏木霉微生物宿主细胞失活(在琼脂板上没有生长-将样品在30摄氏度下孵育4天)。
通过脂肪酸处理，感兴趣的酶(纤维素酶产品)的活性没有显著地减少。
该粗酶产品备用。

Claims (16)

1.一种使发酵液中的微生物宿主细胞失活的方法，该发酵液包括一种感兴趣的酶和生产该感兴趣的酶的微生物宿主细胞，该方法包括
a)将一种具有C4-C12链长的脂肪酸加入该发酵液中；并且
b)将该发酵液混合一段充足的时间直到该微生物宿主细胞失活。
2.如权利要求1所述的方法，其中该脂肪酸具有C6-C12链长。
3.如权利要求1所述的方法，其中该脂肪酸具有C6-C8链长。
4.如权利要求1所述的方法，其中该脂肪酸具有C7-C8链长。
5.如权利要求1所述的方法，其中该脂肪酸具有C8链长。
6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该微生物宿主细胞是一种细菌或一种真菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该细菌是一种选自下组的菌株，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属、链霉菌属、埃希氏杆菌属以及假单胞菌属。
8.根据权利要求6所述的方法，其中该真菌是一种选自下组的菌株，该组由以下各项组成：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、耶氏酵母属、枝顶孢霉属、曲霉属、镰刀菌属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、以及木霉属。
9.根据以上权利要求中任一项所述方法，其中该酶是选自下组，该组由以下各项组成：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶以及连接酶。
10.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该酶是选自下组，该组由以下各项组成：纤维素酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶以及β-葡糖苷酶。
11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该脂肪酸是一种液体脂肪酸。
12.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该脂肪酸是己酸或辛酸。
13.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该脂肪酸是以0.01％-5.0％(w/w)/kg发酵液的量加入的。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该混合持续高达40小时。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该混合持续从0.5至40小时。
16.一种使发酵液中的微生物宿主细胞失活的方法，该发酵液包括一种感兴趣的酶和生产该感兴趣的酶的微生物宿主细胞，该方法包括
a)将一种具有C4-C12链长的脂肪酸盐加入该发酵液中；并且
b)将该发酵液混合一段充足的时间直到该微生物宿主细胞失活。
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