DD291673A7

DD291673A7 - Verfahren zur herstellung von cellulaseenzymen und zellwandlytischen enzymen

Info

Publication number: DD291673A7
Application number: DD29096386A
Authority: DD
Inventors: Elke Dalchow; Guenter Klappch; Ivica Labudova; Jelena Kude; Vladimir Farkas; Stefan Bauer; Dietrich Meyer; Gerhard Kerns
Original assignee: Institut Fuer Biotechnologie,De; Institut Fuer Chemie Der Sav,Cs
Priority date: 1986-06-04
Filing date: 1986-06-04
Publication date: 1991-07-11
Also published as: CS261811B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cellulaseenzymen und zellwandlytischen Enzymen durch aerobe Kultivierung von Pilzmutanten. Es ist das Ziel der Erfindung bei Einsatz kostenguenstiger Substrate hohe Cellulaseaktivitaeten und gleichzeitig hohe substratbezogene Enzymausbeuten zu erreichen, um somit eine effektive Ausnutzung von Fermentorvolumen und Substrat zu gewaehrleisten. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, leistungsverbesserte Mutanten zu gewinnen, welche mittels geeigneter Kultivierungsverfahren dies ermoeglichen. Erfindungsgemaesz wird die Aufgabe geloest, indem die Mutanten Trichoderma reesi ZIMET 43 803 und/oder T. reesi ZIMET 43 804 aerob und submers ein einem Naehrmedium kultiviert werden, welches ein oder mehrere die Cellulasebildung und/oder die Bildung zellwandlytischer Enzyme induzierende Substrate allein oder in Kombination mit einem oder mehreren nichtinduzierenden Substraten enthaelt. Die Mutanten vermoegen bei geeigneter Prozeszfuehrung auch auf Basis loeslicher Substrate, wie beispielsweise Glucose oder Lactose, den Cellulase-Enzymkomplex ins Kulturmedium auszuscheiden. Die Erfindung ist anwendbar zur Herstellung von Cellulasenzymen und/oder zellwandlytischen Enzymen als Biochemikalie, beispielsweise fuer den Einsatz in der Lebensmittel-, Brennerei- und Brauereiindustrie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cellulaseenzymen und/oder zeiiwandlytischen Enzymen durch aerobe Submerszüchtung von Pilzmutanten.

Die gebildeten Enzymkomplexe können zum teilweisen oder vollstä idigen Abbau von Cellulose sowie Hemicellulose in industriellen Produkten, Abfallstoffen, Abwässern oder beim Abbau von lebenden oder toten pflanzlichen Zellwänden verwendet werden. Mögliche Anwendungsgebiete betreffen beispielsweise die Obst- und ^emüseverarbeitungsindustrie, die Brennerei- und Brauereiindustrie, die Extraktion pflanzlicher Zellinhaltsstoffe sowie die Silierung von Futtermitteln in der Landwirtschaft. Die gewonnenen Enzymkomplexe können auch als Biochemikalie Anwendung finden, beispielsweise zur Herstellung von Protoplasten oder zur analytischen Futtermittelbewertung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, Enzyme des Cellulasekomplexes durch aerobe Submerszüchtung von Pilzen herzustellen. Die bekannten Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich in bezug auf die eingesetzten Pilzstämme, die verwendeten Substrate beim Fermentationsprozeß sowie die Prozeßführung. Die Wirtschaftlichkeit bei der Cellulasegewinnung wird wesentlich bestimmt durch die im Fermentationsmedium erzielte Enzymaktivität, durch die pro Zeiteinheit gebildete Enzymmenge (Enzymproduktivität) sowie durch die bezogen auf das eingesetzte Substrat gebildete Enzymmenge {Enzymausbeute). Als geeignete Cellulasebildner sind besonders Pilzstämme der Gattungen Aspergillus, Penicillium und Trichoderma bekannt. Beispielsweise wird gemäß DD-WP 225712 Penicillium janthinellum als Cellulasebildner eingesetzt, wobei Cellulose in Kombination mit vorbehandeltem Grünmehl als Substr'j' jr die Cellulasefermentation dient. In einer fed-batch-Kultivierung wird bei Einsatz von insgesamt 6% Cellulose zuzüglich Grünmehl nach 8 Tagen eine Cellulaseaktivität von 6IU/ml Filterpapieraktivität erreicht, was einer Ausbeute von 100IU/g Cellulose entspricht.

In einem anderen Verfahren gemäß JP 59-151888 wird ein Trichoderma koningii Stamm als Cellulasebildner verwendet; als Substrat dient mikrokristalline Cellulose (Avicel) in einer Konzentration von 3%, Die resultierenden Enzymaktivitäten betragen nach 7 Tagen 11,5 IU/ml Endo-ß-glucanasoaktivität und 0,85 IU/ml Exo-cellobiohydrolase, was einer Ausbeute der ^r den Abbau von mikrokristalliner Cellulose erforderlichen Exocellobiohydrolase von 28,3IU je Gramm Cellulose entspricht; die entsprechende Produktivität beträgt 5IU/I h Exo-cellobiohydrolase.

Die aus der Patent- und Fachliteratur bekannten Cellulasebildner mit dem bisher höchsten Cellulasebildungsvermögen gehören zur Art Trichoderma reesei (früher Trichoderma viride). Mit dem Ziel einer Verbesserung des Cellulasebildungsvermögens wurden verschiedene Trichoderma reesei-Mutanten hergestellt.

In der Patentschrift WO 80/01080 wird die Cellulasebildung mit der Mutante Trichoderma reesei MCG 77 beschrieben. Die Cellulasebildung wird durch Glucose reprimiert, nicht jedoch durch Glycerol; Lactose wirkt induzierend auf die Cellulasebildung. Die mit 1 % Cellulose im Nährmedium erhaltene Cellulaseaktivität beträgt 1... 1,8IU/ml FPA, die mit 1 % Lactose erhaltene Aktivität beträgt 1,35 IU/ml FPA und die mit 1 % Lactose plus 1 % Cellulose beträgt 1,75 IU/ml FPA.

In der Patentschrift US 4,472,504 wird die Cellulasebildung mit der Mutante Trichoderrr.i reesei MCG 80 beschrieben, welche aus der Mutante Trichoderma reesei Rut C 30 gewonnen wurde. Bei Verwendung eines Nährmediums mit 8% Cellulose und Zusatz von Biotin wird in diskontinuierlicher Fermentation eine Cellulaseaktivität von 17,2 IU/ml FPA erreicht, was einer Ausbeute von 215IU FPA/g Cellulose entspricht.

Bei Kultivierung des gleichen Stammes auf einem Nährmedium mit 2% Lactose wird eine Cellulaseaktivität von 1,7IU/ml FPA erzielt, entsprechend einer Ausbeute von 85IU FPA/g Lactose, Diese T. reesei-Mutanten bilden auf Basis von Cellulose, insbesondere mikrokristalliner Cellulose und Baumwollcellulose, relativ hohe Cellulaseaktivitäten, nicht jedoch auf Basis

löslicher Substrate wie beispielsweise Glucose, Daraus ergeben sich neben hohen Substratkosten auch Nachteile für die Prozeßführung. *

Es wurden auch Trichoderma reesei-Mutanten hergestellt, welche auf Basis von Glucose als Kohlenstoffquelle Cellulase bilden können. Über das Cellulasebildungsvermögen von T. reesei-Mutanten bei Einsatz von Glucose als Substrat wurde auf dem 3.Europäischen Kongreß über Biotechnologie berichtet (München, BRD; 10.-14.Sept. 1984; M.Baily: „Cellulase Production by Mutant Strains of Trichoderma reesei on non-Cellulosic Media"). Die höchste beschriebene Cellulaseaktivität wird mit der Mutante T. reesei VTT-D-79125 auf Basis von 4% Glucose plus 4% Brennerei-Traber erhalten und beträgt 6,4 !U/ml FPA. Mit Cellulose anstatt Glucose wurde bei diesem Stamm etwa die gleiche Cellulaseaktivität erhalten.

Alle bekannten Verfahren zur Cellulasegewinnung haben den Nachteil, daß die bezogen auf das eingesetzte Substrat erhaltenen Cellulaseausbeuten relativ niedrig sind oder daß kostenintensive Substrate wie mikrokristalline Cellulose oder Baumwoll-Cellulose als Substrat für die Collulasefermentation benötigt werden oder daß die im Fermentationsmedium erzielten Cellulaseaktivitäten niedrig sind oder daß eine proportionale Erhöhung der Cellulaseaktivität mittels Erhöhung der Substratkonzentration nicht möglich ist.

2IeI der Erfindung

Es Ist das Ziel der Erfindung, hohe Aktivitäten des Cellulase-Enzymkomplexes bei'Einsatz kostengünstiger Substrate und gleichzeitig hohen eubstratbezogenen Enzymausbeuten zu erreichen, um somit uine effektive Ausnutzung von Fermentorvolumen und Substrat zu gewährleisten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, leistungsverbesserte Cellulase-Mutanten zu gewinnen und In einem Kultivierungsverfahren einzusetzen, wobei in einer Fermentationsstufe hohe Cellulaseaktivitäten bei gleichbleibender hoher substratbezogener Cellulaseausbeute und bei Einsatz von kostengünstigen Substraten ermöglicht werden. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Pilz-Mutanten Trichoderma reesei ZIMET 43803 und/oder Trichoderma reesei ZIMET 43 804 aerob und submers nach an sich bekannter Weise in einem Nährmedium kultiviert werden, welches ein oder mehrere die Cellulasebildung und/oder die Bildung zellwandlytischer Enzyme induzierende Substrate allein oder in Kombination mit einem oder mehreren nichtinduzierenden Substraten enthält.

Es wurde gefunden, daß diese Mutanten ein partiell-katabolitdereprimiertes Cellulasebildungsvermögen auch in bezug auf Glucose besitzen und daß diese Mutanten auch auf löslichen Substraten wie beispielsweise Glucose oder Lactose hohe Konzentrationen der Enzyme des Cellulasekomplexes in das Medium ausscheiden.

Beide genannten Stämme wurden durch Mutation aus der Mutante Trichoderma reesei CCI gewonnen und in der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kulturensamrnlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DuR hinterlegt und unter den Nummern ZIMET 43803 bzw. ZIMET 43804 registriert. Die Stämme sind durch folgende Merkmale charakterisiert.

Stammbeschreibung/Morphologie, Physiologie

Beide Stämme weisen die für Trichoderma typischen morphologischen Merkmale auf und unterscheiden sich in physiologischen Eigenschaften bezüglich Cellulasebildung.

Die Erhaltung der Stämme ist auf den fürTrichoderma-Stämme geeigneten Nährmedien möglich. Beispielsweise sind Kartoffel-Dextrose-Agar oder Sporulationsagar (Ammoniumsulfat 0,2%; Kaliumdihydrogenphosphat 0,5%; Glucose 2%; Hefeextrakt 0,7%; Agar 2%) hierfür geeignet. Wenig geeignet für die Stammerhaltung ist Czapek-Dox-Agar, da eine Verwertung von Nitraten als Stickstoffquelle durch die beschriebenen Stämme nicht gefunden werden konnte. Die Bebrütungstemperatur beträgt zweckmäßig 28 bis 30°C, die Bebrütungsdauer etwa 5 bis 6 Tage und weitere 5 bis 7 Tage bei Raumtemperatur bis zur vollen Entwicklung der Stämme. Die Überimpfung wird mittels Konidien vorgenommen; die Farbe der Konidien ist grün, anfänglich gelb-grün.

Eine Erhaltung der Stämme in lyophilisierter Form oder über bzw. in flüssigem Stickstoff ist mittels der allgemein praktizierten Methoden möglich, ohne daß ein Rückgang des Cellulasebildungsvermögens bisher beobachtet werden konnte.

Beide Stämme besitzen ein partiell-katabolitdereprimiertes Cellulasebildungsvermögen, d. h. in Gegenwart leicht verwertbarer Substrate wie beispielsweise verschiedene Zucker oder Glycerol werden bis zu einer bestimmten Substratkonzentration Cellulaseenzyme gebildet. Das Cellulasebildungsvermögen der beiden hinterlegten Stämme unterscheidet sich in bezug auf den Konzentrationsbereich der leicht verwertbaren Substrate, in welchem die Cellulasebildung noch nicht reprimiert wird.

Das katabolitdereprimierte Cellulasebiidungsvermögen läßt sich in Anlehnung <tn die Methode von B. S. Montenecourt und

D. E. Evelelgh (Applied and Environmental Microbiology 33,1977,178-183) testen. Als Substrat im Agarmedium dienen säuregequollene Cellulose in Kombination mit dem jeweils untersuchten Repressor, insbesondere Glucose, Fructose, Xylose, Lactose bzw. Glycerol. Zur Begrenzung der Koloniegröße wird Bengalrosa in einer Konzentration von 30mg/l dem Agarmedium zugesetzt. Die Dicke der Agarschicht wird auf 4 mm eingestellt. Bei einem Plattendurchmesser von 9cm werden zweckmäßig 100 bis 200 Konidien je Platte überimpft. In Anlehnung an die genannte Methode wird die Ausbildung von clearing-Zonen durch eine an die Bebrütung sich anschließende Inkubation bei 45°C über 20 Stunden vorgenommen, wobei die Lebensfähigkeit der Konidien erhalten bleibt.

Somit kann auch die Klonselektionierung auf diese Weise vorgenommen werden. Die Form und Größe der Einzelkolonien sind bei den beschriebenen Stammt»", unterschiedlich, in Abhängigkeit des verwendeten Substrates.

Auf Celluloseagar bilden sich große Kolonien mit niederliegendem dünnen Myzel, während die Kolonien auf Glucose bzw. Fructose kleiner sind, ähnlich kolonialen Mutanten, eine dickere Myzelschicht aufweisen und stärker sporulieren.

Allgemein tritt eine Entfärbung des Bengalrosaagars in der Umgebung kräftig ausgebildeter Kolonien auf.

Die Testung des katabolitdoroprimierten Cellulasebildungsvermögens der beschriebenen Stemme ist auch in Röhrchen möglich. Beispielsweise werden Konidien auf ein Agarmedium mit säuregequollener Cellulose in Kombination mit dem jeweils untersuchten Repressor, jedoch ohne Zusatz von Bengalrosa, überimpft. Der Röhrchendurchmesser beträgt zwe-kmäßig 9 mm. Als Maß für das Cellulasebildungsvermögen dient die clearing-Tiefe; die Bebrütung und Inkubation bei 45⁰C werden wie bei dem beschriebenen Plattentest vorgenommen.

Der Stamm ZIMET 43 804 weist in bezug auf Glucose und Fructose ein stärker ausgeprägtes partiell-katabolitdereprimiertes Cellulasebildungsvermögen auf:

Substrat	ZIMET 43 803	ZIMET 43 804
1% Cellulose	2 mm	2 mm
1 % Cellulose + 5% Lactose	8mm	5mm
1 % Cellulose + 5% Glucose	0mm	3 mm
1 % Cellulose + 5% Fructose	0 mm	3 mm
1 % Cellulose + 5% Glycerol	2 mm	3 mm
{säuregequollene Cellulose)	(clearing-Tiefe im Röhrchentest)

Die Kultivierungstemperatur der Mutanten T.reesei ZIMET43803 und T. reesei ZIMET 43804 beträgt 22 bis 36⁰C, vorzugsweise 30 bis 34⁰C für das Myzelwachstum und 25 bis 30°C für die Enzymbildung. Der pH-Wert für die Kultivierung liegt im Bereich von 2 bis 7, vorzugsweise von 2,5 bis 5,6 für das Myzelwschstum und von 3,2 bis 6,0 für die Enzymbildung.

Als Kultivierungsgefäße sind alle unter Ausschluß von Fremdinfektionen betreibbaren Fermentoren geeignet, weiche eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff gewährleisten und in welchen keine dauernden und extrem hohen Scherfelder auftreten, denen große Teile des Fermentationsmediums ständig ausgesetzt sind. Ausgangspunkt für die Kultivierung sind Konidien von Emerskulturen, insbesondere von Schrägagarkulturen auf Kartoffel-Dextrosaagar.

Als Inokulum für das Fermentationsmedium dienen Konidien, vorzugsweise in einer Konzentration von 10⁷ bis 10⁹ je Liter Fermentationsmedium, oder Suspensionen vegetativen Myzels, vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 15 Vol.-% des zu beimpfenden Mediums. Für die Beimpfung großer Fermentoren wird das Inokulum zweckmäßig in mehreren Stufen nacheinander angezogen.

Di j Prozeßführung bei der Züchtung der Mutanten T.reesei ZiMET 43 803 oder T.reesei ZIMET 43 804 zur Gewinnung von Cellulaseenzymen oder zellwandlytischen Enzymen ist in Abhängigkeit der verwendeten Substrate oder Substratkombinationen und der zu erzielenden Enzymzusammensetzung verschieden.

Zur Bildung des Cellulaseenzymkomplexes ohne erhöhten Anteil an Nebenaktivitäten, wie beispielsweise Xylanaseaktivität, Glucanaseaktivhät, kann reine Cellulose als induzierendes Substrat eingesetzt werden, zweckmäßig bei Einstellung eines Temperatur- und pH-Profiles des Fermentationsmediums gemäß dem Beispiel 1.

Bis zu einer Konzentration von etwa 3% Cellulose ist in diskontinuierlicher Fermentation die gebildete Cellulaseenzymmenge der eingesetzten Cellulosemenge proportional. Höhere Cellulosekonzentrationen führen zu einer höheren Cellulasekonzentration, wobei die Zunahme der Cellulasekonzentration dann jedoch nicht mehr der eingesetzten Cellulosemenge proportional ist, so daß die Cellulaseausbeute absinkt. Eine der eingesetzten Cellulosemenge proportionale Erhöhung der Cellulasekonzentration ist gemäß einer beschriebenen fed-batch-Technik möglich, bei welcher die Zuführung der Cellulose mittels einer Regeleinrichtung oder einer rechnergestützten Prozeßsteuerung vom Kohlendioxidgehalt des Fermentationsabgases in einer solchen Weise angesteuert wird, daß die auf das Myzelprotein bezogene Kohlendioxidentwicklung bei sonst gleichen Prozeßparametern während der Substratnachführung etwa konstant bleibt.

Mittels Weizenkleie oder anderer komplexer Nährmediumsbestandteile kann die Bildung von Nebenaktivitäten wie Cellobiase und Xylanase erhöht werden.

Für die Herstellung zellwandiytischer Enzyme werden zweckmäßig Pilzzellwände als induzierendes Substrat bei diskontinuierlicher Betriebsweise eingesetzt. Der gebildete Enzymkomplex hat eine Zusammensetzung, auf Grund derer er beispielsweise zur Herstellung von lebenden Pilzprotoplasten geeignet ist.

Die Gewinnung von Collulaseenzymen auf Basis löslicher induzierender Substrate oder löslicher nichtinduzierender Substrate in Kombination mit induzierenden Substraten wird erfindungsgemäß mittels einer fed-batch-Technik durchgeführt, in welcher die löslichen induzierenden Substrate oder die löslichen nichtinduzierenden Substrate oder eine Kombination löslicher induzierender und löslicher nichtinduzierender Substrate in einer solchen Weise dem Fermentationsmedium zugeführt werden, daß die sich im Fermentationsmedium einstellende aktuelle Konzentration der löslichen Substrate in einem Bereich liegt, in welchem die Cellulasebildung induziert oder nicht reprimiert wird. Die obere Grenze dieses Bereiches wird durch den Grad des partiell-katabolitdereprimierten Cellulasebildungsvermögens der Mutanten bestimmt, welcher dem jeweils eingesetzten Substrat entspricht.

Der Fermentationsprozeß der fed-batch-Technik besteht aus einem diskontinuierlichen Abschnitt (batch) und der Substratnachführungsphase (fad-batch-Abschnitt). Die batch-Phase dient der Anzucht von Myzel, während in der Substratnachführungsphase vorwiegend die Enzymbildung erfolgt. Die Substratnachführung wird mittels der Kohlendioxidkonzentration des Fermentationsabgases angesteuert. Werden nichtinduzierende Subutrate nachgeführt, so muß das Grundnährmedium mindestens ein induzierendes Substrat enthalten, wie z. B. Cellulose, Weizenkleie oder Brennereischlempe. Werden lösliche induzierende Substrate nachgeführt, so braucht das Nährmedium keine anderen induzierenden Substanzen zu enthalten; in diesem Fall ist es auch möglich, das Myzel im batch-Abschnitt der Fermentation auf Basis nichtinduzierender Substrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Glycerol, anzuziehen.

Es ist auch möglich, gleich nach der Beimpf ung mit der Zuführung der löslichen induzierenden Substrate zu beginnen, wenn die Beimpfung mit vegetativem Myzel in einer Konzentration von zweckmäßig 2 bis 8g/l bezogen auf Myzeltrockensubstanz erfolpt.

Bei Einsatz löslicher induzierender Substrate, wie z.B. Lactose, ist es auch möglich, die in das Fermentationsmedium ausgeschiedenen Enzyme mittels bekannter Membrantrennoperationen kontinuierlich vom Fermentationsmedium abzutrennen. Mittels einer Mikrofiltration werden die Feststoffe (Pilzmyzel) und mittels Ultrafiltration die niedermolekularen löslichen Bestandteile des Nährmediums von den Enzymen abgetrennt. Die Feststoffe werden zweckmäßig unmittelbar in das

Fermentationsmediuni zurückgeführt, während ein Teil oder das gesamte Ultrafiltrat zur Aufnahme der zuzuführenden induzierenden Substrate dienen kann'und gemeinsam mit diesen in das Fermentationsmedium rückgeführt wird.

Die Abtrennung und Reinigung der gewonnenen Enzyme kann mittels bekannter Verfahren vorgenommen werden. Je nach Applikation können das nicht aufgearbeitete Fermentationsmedium, das Kulturfiltrat, das Kulturkonzentrat, getrocknete Rohenzyme oder gereinigte Enzyme eingesetzt werden.

Die spezifische Aktivität der Cellulase-Rohenzyme, fermentiert auf Basis von Holzzellstoff oder Lactose, liegt im Bereich von 1,4 bis 1,9IU FPA/mg Protein.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

In einem Rührformentor mit einem Bruttovolumen von 30Litern wird der Stamm Trichoderma reesei ZIMET 43803 für die Gewinnung von Cellulaseenzymen kultiviert.

Als Substrat wird der Holzzellstoff Heweten 10 Hz eingesetzt; die Fermentation wird in diskontinuierlicher Prozeßführung durchgeführt.

Fermentor

Der Fermentor ist mit einem allgemein gebräuchlichen Sechsblatt-Scheibenrührer versehen, dessen Gesamtdurchmesser etwa ein Drittel des Fermentorinnendurchmessers beträgt. Die Einbauhöhe des Rührers im Fermentor beträgt etwa ein Fünftel der Gesamthöhe des Fermentorinnenraumes. Die Begasung des Fermentors erfolgt über einen, unterhalb des Rührers befindlichen Ring, welcher etwa den gleichen Durchmesser wie der Rührer aufweist und mit je 1 mm breiten Öffnungen im Abstand von jo 8 mm versehen ist.'Der Fermentor ist mit der allgemeinen gebräuchlichen Meß- und Regeltechnik ausgestattet, insbesondere mit einer Temperatur-, Meß- und Regeleinrichtung, einer pH-Meß- und Regeleinricht ng, einer Gelöst-Sauerstoff-Meß- und Regeleinrichtung, einer Meßeinrichtung für die COj-Konzentration des Fermentorabgases gekoppelt mit einem Steuersignal, beispielsweise zur Ansteuerung von Dosierpumpen, sowie mit einer automatisch geregelten Schaumbekämpfung, weiche die Vermeidung einer überschüssigen Entschäumerzugabe gewährleistet, Besonders geeignet ist ein Fermentor, welcher eine rechnergestützte Prozeßführung ermöglicht

Die Bestandteile des Nährmediums werden folgendermaßen zusammengesetzt:

Heweten 10 Hz	30 g/l
(NH₄I₂SO₄	4,8 g/l
KH₂PO₄	3 g/l
MgSO₄-7 H₂O	0,4 g/l
CaCI₂	0,3 g/l
Pepton	1,5 g/l
Tween 80	1g/l
Spurensalzlösung	10 ml/l

Zusammensetzung der Spurensalzlösung:

FeSO₄-7 H₂O 0,50 g/l

MnSO₄-7 H₂O 0,16 g/l

ZnSO₄ -7 H₂O 0,14 g/i

CoCI₂ 0,20 g/l

Die für 16 Liter erforderlichen Nährmediumsbestandteile werden in geeigneter Weise in 16 Liter Wasser gelöst bzw. suspendiert und unter Ausschluß von Fremdkeimen in den sterilisierten Fermentor gegeben. Anschließend wird der Fermentor mit 1 Liter einer frischen Myzelsuspension als Inokulum beimpft.

Inokulum

Das Inokulum wird in Schüttelkulturen hergestellt. Es werden die gleichen Nährmediumsbestandteile wie für den 30-l-Fermentor verwendet, jedoch wird die Konzentration des KH₂PO₄ auf 15g/l erhöht und zusätzlich werden 0,9g/l Harnstoff dem Medium zugeführt; die Konzentration der übrigen angegebenen Nährmediumsbestandteile ist die gleiche, wie im Nährmedium für den Fermentor.

Es werden 10 Schüttelkolben mit je 100ml dieses Nährmediums hergestellt und unter Ausschluß von Fremdkeimen wird jeder Schüttelkolben mit etwa 10⁷ Konidien einer Abimpfung des hinterlegten Stammes T. reesei ZIMET 43803 beimpft. Die Kultivierung erfolgt auf einer für die Kultivierung von Mikroorganismen allgemein gebräuchlichen Schüttelmaschine bei 30°C.

Die Kultivierungsdauer beträgt 36 bis 60 h bis zur Beimpfung des Fermentors.

Fermentation

Die Kultivierungstemperatur wird zu Beginn der Fermentation auf 3O⁰C eingestellt; die Regelgrenzen für den pH werden auf 3,5 (untere Regelgrenze) und 5,5 (obere Regelgrenze) eingestellt; die Rührerdreruahl wird auf 500U/min eingestellt und die Begasungsintensität auf 30 Norm-Liter Luft je Stunde und Liter Fermentationsmedium, entsprechend einer Begasungsmenge von 450 Norm-Liter Luft pro Stunde, Als Antischaummittel wird Silikonentschäumer NM 40 verwendet.

Der pH-Wert liegt zu Beginn der Fermentation innerhalb dos Sollbereiches, je nach Zustand und Alter de.« Inokulums bei etwa 4,0 bis 5,4. Während der Fermentation tritt ein Abfall des pH ein, bei Erreichen der unteren Regelgrenze wird mittels 12%iger Ammoniaklösung der pH bei 3,5 konstant geregelt. Mitunter ist in der Anfangsphase ein zwischenzeitlicher Anstieg des pH zu verzeichnen, derbeiErreichenderoberenRegalgrenzeeine Konstantregelung despH mittels 10%igerSchwefelsäurebei5,5 erfordert.

Bei Erreichen eines Myzelwachstums, welches etwa der logarithmischen Wachstuimphase einzelliger Mikroorganismen entspricht, wird die Fermentationsternperatur auf 28⁰C eingestellt. Dieser Zeitpunkt ist nach etwa 35 bis 60 Stunden erreicht, erkennbar an dem Anstieg der Kohlendioxidkonzentration im Fermentorabgas. Im vorliegenden Beispiel wird bei Erreichen einer CC>2-Konz6ntration im getrockneten Fermentorabgas von 0,2VoI.-% die Fermentationstemperatur auf 28°C eingestellt. Die CO₂-Konzentration steigt weiter an und fällt nach Überschreitung eines Maximums wieder ab. Die Fermentation wird nach 120 bis 150 Stunden beendet, wenn die C(^-Konzentration im Abgas auf 0,05 Vol.-% oder darunter abgesunken ist und der pH-Wert ansteigt.

Die Celluiaseaktivität im Kulturfiltrat beträgt am Ende der Fermente ion 9,0 bis 9,4 IU/ml Filterpapieraktivität, entsprechend einer Ausbeute von 300 bis 310IU Filterpapieraktivität pro Gramm Holzzellstoff Heweten 10Hz. Mittels bekannter Verfahren der Mikrofiltration und Ultrafiltration wird der Enzymkomplex von den übrigen Nährmediumskomponenten abgetrennt und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Rohenzym weist folgende Zusammensetzung bzw. Aktivitäten auf:

Proteingehalt:	4Λ5%
Filterpapieraktivität
(IU/mg Protein):	1,52
Cellobiase (iU/mg Protein):	0,034
a-Amylase (IU/mg Protein; 3O⁰C):	0,54
Xylanase (IU/mg Protein):	5,8
Protease:	nicht nachweisbar

Die vom Fermentationsmedium abgetrennten Feststoffe, welche überwiegend aus Zellwänden des eingesetzten Pilzes bestehen, werden sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet und anschließend pulverisiert. Diese Zellwände sind beispielsweise als Substrat für die Herstellung zellwandlytischer Enzyme geeignet.

Bestimmung der Enzymaktivltfiten

Die Bestimmung der Cellulaseaktivität sowie des Proteingehaltes erfolgt nach den von der IUPAC empfohlenen Analysenmethoden (T.K, Ghose; „Final Recommendations on the Measurement of Cellulase Aktivities"; prepared for:

International Union of Pure and Applied Chemistry, Commission on Biotechnology; July 1983).

Die Bestimmung der Amylaseaktivität erfolgt bei 30°C, alle anderen Enzymaktivitäten werden bei 5O⁰C bestimmt; 11U entspricht einem Substratabbau von 1 Mikromol pro Minute.

Beispiel 2

In einem Rührfermentor, wie im Beispiel 1 beschrieben, wird der Pilz T. reesei ZIMET 43803 für die Gewinnung von Cellulaseenzymen kultiviert. Als Substrat wird der Holzzellstoff Heweten 10Hz eingesetzt.

Die Fermentation wird in einer fed-batch-Technik durchgeführt, bei welcher die Substratnachführung von der Stoffwechselaktivität des Pilzmyzels angesteuert wird.

Die Bestandteile des Grundnährmediums werden folgendermaßen zusammengesetzt:

Heweten 10 Hz	300 g
(NH₄I₂SO₄	72₃
KH₂PO₄	60 g
MgSO₄-7 H₂O	7,5 g
CaCI₂	7,5 g
Pepton	45,0 g
Tween 80	15,0 g
Spurensalzlösung
(wie im Beispiel 1)	150 ml.

Diese Bestandteile werden in Wasser gelöst bzw. suspendiert, auf ein Volumen von 10,5 Litern gebracht und in den Fermentor gegeben.

Als Inokulum dient 1 Liter einer Myzelsuspension, wie im Beispiel 1 beschrieben.

Das Medium für die Substratnachführung wird folgendermaßen hergestellt:

1350 Gramm Heweten 10Hz und 45 Gramm Carboxymethylcellulose werden in trockenem Zustand gleichmäßig vermischt und unter Rühren in Wasser suspendiert, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4,5 Litern gebracht und sterilisiert.

Fermentation

Die Einstellung des Temperaturprofiles und der Rührerdrehzahl sowie die Regelung des pH und die Schaumbekämpfung werden wie im Beispiel 1 vorgenommen.

Die Begasungsmenge wird auf 420 Norm-Liter Luft pro Stunde eingestellt.

Mit der Zuführung der Cellulosesuspension wird begonnen, nachcnm die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas das Maximum überschritten hat und auf etwa 80% des Maximalwertes abgesunken ist, bei gleicher Einstellung der Prozeßparaneter. Das Maximum der Kohlendioxidkonzentration liegt bei etwa 0,7 bis 0,9 Volumenprozent im getrockneten Fermentationsabgas; ein mitunter zeitlich vorgelagertes und schwächer ausgeprägtes Maximum der Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas wird für die Prozeßsteuerung nicht berücksichtigt.

Diese Kohlendioxidkonzentration von 80% des Maximalwertes wird zu Beginn der Substratnachführung als Regelgrenze eingestellt; bei Unterschreitung der Regelgrenze wird eine Förderpumpe eingeschaltet, we'che die Cellulosesuspension dem Fermentationsmedium so lange zuführt, bis die Kohlendioxidkonzentration die Regelgrenze überschreitet. Die Förderleistung der

Pumpe wird auf eine Menge von 0,5% je Stunde der Masse des Fermentationsmediums eingestellt, zu Beginn der Nachführung somit auf 53g/h Cellulosesuspensiom Die Konzentration des Myzelproteines im Fermentationsmedium wird zu Beginn der Substratnachführung ermittelt; die Kohlendioxid-Regelgrenze wird der sich verändernden Konzentration des Myzelproteines angepaßt, also mit steigender Myzelproteinkonzentration proportional erhöht.

Es werden Insgesamt 4,5 Liter der 30%lgen Cellulosesuspension lh das Fermentationsmedium nachgeführt. Die Fermentation wird nach 320 bis 360 Stunden beendet, wenn die Kohlendioxidkonzentration im Abgas auf 0,2% oder darunter abgesunken ist und der pH-Wert ansteigt.

Die Celluloseaktivität im Kulturfiltrat beträgt am Ende der Fermentation 32 IU/ml an Filterpapieraktivität, entsprechend einer Ausbeute von 290IU FPA pro Gramm Holzzellstoff Heweten 10Hz.

Beispiel 3

Zur Herstellung von zellwandlytischen Enzymen wird der Pilz T. reesei ZIMET 43803 in Schüttelkulturen fermentiert. Als Substrat werden Pilzzellwände eingesetzt, welche beispielsweise wie im Beispiel 1 beschrieben gewonnen werden.

Das Nähimedium ist folgendermaßen zusammengesetzt:

getrocknete Pilzzellwände	25g/l
KH₂PO₄	15g/l
(NH₄I₂SO,	4,8 g/l
MgSO₄ 7 H₂O	0,4 g/l
CaCI₂	0,3 g/l
Harnstoff	0,6 g/l
Pepton	1,5g/l
Tween 80	1,0 g/l
Spurensalzlösung
(wie im Beispiel 1)	10ml/l

Die Schüttelkolben, beispielsweise Rundkolben.mit einem Bruttovolumen von 500ml, werden mit 100ml des Nährmediums gefüllt und mit Konidien in einer Konzentration von 5 x 10⁸/l Nährmedium beimpft. Die Kultivierungstemperatur beträgt 30°C, die Kultivierungsdauer 8 Tage. Das gewonnene Kulturfiltrat wird mittels Ultrafiltration bzw. Dialyse im Verhältnis 10:1 eingeengt. Das Kulturkonzentrat, welches auch zum Enzymti ockenprodukt aufgearbeitet werden kann, ist beispielsweise zur Herstellung lebensfähiger Pilzprotoplasten geeignet.

Beispiel 4

In einem Rührfermentor, wie im Beispiel 1 beschrieben, wird der Pilz T.reesei ZIMET 43804 für die Gewinnung von Cellulaseenzymen kultiviert. Das Nährmedium enthält Weizenkleie und Cellulose als induzierende Substrate in Kombination mit Glucose als nichtinduzierendem Substrat.

Die Fermentation wird in einer fed-batch-Technik durchgeführt, bei welcher die Substratnachführung regelungstechnisch wie im Beispiel 2 beschrieben erfolgt.

Die Bestandteile des Grundnährmediums werden folgendermaßen zusammengesetzt:

Weizenkleie	140g
Heweten 10Hz	140g
Glucose	210g
(NH₄J₂SO₄	67 g
KH₂PO₄	45 g
MgSO₄ -7H₁O	5,6 g
CaCI₂	5,6 g
Pepton	2ig
Tween 80	14g
Spurensalzlösung
(wie im Beispiel 1)	140 ml.

Diese Bestandteile werden in 12,6 Litern Wasser in den Fermentor gegeben. Als Inokulum dienen 2 Liter einer Myzelsuspension, welche auf einem Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie das Grundnährmedium in einer Vorstufe (Schüttelkultur oder Fermentor) 24 bis 36 Stunden kultiviert wird; die Vorkultur wird mit Konidien beimpft. Als Medium für die Substratnachführung wird eine 50%ige Glucoselösung eingesetzt.

Fermentation

Die Begasungsmenge wird auf 490 Norm-Liter Luft pro Stunde eingestellt. Die übrigen Prozeßparameter sind die gleichen, wie in den Beispielen 1 bzw. 2 angegeben,

Mit der Zuführung der Glucoselösung wird begonnen, nachdem die Kohlendioxidkonzentration nach Überschreiten des Maximums auf etwa 70% des Maximalwertes abgesunken ist.

Die Förderleistung der Pumpe wird auf 75ml/h eingestellt. Die Pumpe wird, wie im Beispiel 2 beschrieben, bei einem Absinken

der COj-Konzentration auf Werte unterhalb der Regelgrenze eingeschaltet und bei Überschreiten der Regelgrenze wieder ausgeschaltet. Die Kohlendioxid-R&gelgrenze wird, wie im Beispiel 2 beschrieben, der sich verändernden Konzentration des Myzelproteins angepaßt. Die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas hat während der Substratnachführung einen oszillatorischen Verlauf..

Es werden insgesamt 1,4 Liter der 50%igen Glucoselösung in das Fermentationsmedium zugeführt. Die Fermentation wird nach 120 bis 140 Stunden beendet, wenn die Kohlendioxidkonzentration auf 0,1% oder darunter abgesunken ist und der pH-Wert ansteigt.

Die Celluloseaktivität im Kulturfiltrat beträgt am Ende der Fermentation 12,5IU/ml an Filterpapieraktivität.

Beispiel 5

Der Pilz T. reesei ZIMET 43804 wird für die Gewinnung von Cellulaseenzymen auf Basis von Lactose kultiviert. Die Prozeßführung erfolgt in einer fed-batch-Technik, wie sie in den Beispielen 2 und 4 beschrieben ist. Die Bestandteile des Grundnährmediums werden folgendermaßen zuseammengesetzt:

Lactose	140g
(NhM₂SO₄	67 g
KH₂PO₄	45 g
MgSO₄-7H₂O	5,6 g
CaCI₂	5,6 g
Peptoh	21g
Tween bO	14g
Spurensalzlösung	140 ml.

Diese Bestandteile werden in 12,8 Litern Wasser in den Hermentor gegeben. Als Impfmaterial dient 1 Liter einer Myzelsuspension, welche 35 bis 40 Stunden auf einem Nährmedium gleicher Zusammensetzung in Schüttelkolben kultiviert wird; die Schüttelkultur wird mit Konidien beimpft

Für die Substratnachführung wird eine 20%ige Lactoselösung eingesetzt.

Fermentation

Dei Begasungsmenge wird auf 420 Norm-Liter Luft pro Stunde eingestellt; die übrigen Prozeßparameter werden wie in den Beispielen 1 bzw. 2 angegeben eingestellt.

Mit der Zuführung der Lactoselösung wird begonnen, nachdem die Kohlendioxidkonzentration auf etwa 80% des Maximalwertes abgesunken ist.

Die Förderleistung der Pumpe wird auf 100ml/h eingestellt. Die Fermentation wird nach ca. 100 bis 110 Stunden beendet, wenn insgesamt 2,8 Liter der 20%igen Lactoselösung in das Fermentationsmedium zugeführt worden rind. Die Celluloseaktivität im Kulturfiltrat beträgt 10,5IU/ml an Filterpapieraktivität. Das mittels Membrantrennoperationen vom Fermentationsmedium abgetrennte und anschließend gefriergetrocknete Rohenzym weist folgende Zusammensetzung bzw. Aktivitäten auf:

Proteingehalt:	45,7%
Filterpapieraktivität
(IU/mg Protein):	1,46
Cellobiase (IU/mg Protein):	0,035
a-Amylase (IU/mg Protein; 3O⁰C):	0,50
Xylanase (IU/mg Protein):	5,6
Protease:	nicht nachweisbar.

Beispiel β

Das Cellulosebildungsvermögen der Pilzstämme T. raesoi ZIMET 43803 und T. reesei ZIMET 43804 wird mittels Kultivierung auf verschiedenen Substraten in Schüttelkulturen untersucht und mit der Ausgangsmutante T. reesei CCI verglichen.

Das Nährmedium ist folgendermaßen zusammengesetzt:

KH₂PO₄	15 g/l
(NH₄I₂SO₄	1,4 g/l
CaCI₂	0,3 g/l
MgSO₄-7H₂O	0,3 g/l
Harnstoff	0,3 g/l
Pepton	1,5g/l
Tween 80	1 g/l
Spurensalz, ösung
(wie im Beispiel 1)	10 ml/l
Substrat

Es werden Schüttelkolben mit je 100ml des zu testenden Nährmediums gefüllt und mit 10⁷ Konidien ein und derselben Konidiensuspension des jeweiligen Stammes beimpft. Die Kultivierungszeit beträgt 7 Tage, die Kultivierungstemperatur 3O⁰C. Folgende Cellulaseaktivitäten werden erhalten:

Substrat ZIMET 43 803 ZIMET 32 804 CCI

0,5% Weizenkleie+ 0,5% Holzzellstoff 3,0 2,9 1,5

0,5% Glucose +0,5 %Holzze!lstoff 2,0 2,1 1,0

0,5% Lactose +0,5 %Hol2zells:of* 1,4 1,8 1,2

0,5%Glucose + Brennereischleinpe(50%ig)1,0 1,3 0,6

(Cellulaseaktivität in IU/ml FPA)

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Cellulaseenzymen und/oder zellwandlytischen Enzymen durch Pilze im Submersverfahren, gekennzeichnet dadurch, daß die Pilzmutanten Trichoderma reesei ZIMIiT 43803 und/oder Trichoderma reesei ZIMET 43804 nach an sich bekannter Weise in einem Nährmedium kultiviert werden, welches ein oder mehrere die Cellulasebildung und/oder die Bild .mg zellwandlytischer Enzyme induzierende Substrate allein oder in Kombination mit einem ode- mehreren nichtinduzierenden Substraten enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß lösliche induzierende Substrate und/ oder lösliche nichtinduzierende Substrate verwendet werden und daß die Zugabe dieser Substrate mitteis fed-batch-Technik in einer solchen Weise erfolgt, daß die zugeführten Substrate im Ferm6ntationsmedium die Enzymbildung induzieren oder nicht reprimieren,

3. Verfahrennach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als induzierende Substrate sowohl lösliche, wie Lactose, Molke als auch unlösliche, wie Cellulose, cellulosehaltige Abfallprodukte oder Pilzzellwände verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß Getreidekleie oder Brennereischlempe als induzierendes Substrat in Kombination mit löslichen Kohlenhydraten, wie Glucose, Xylose, Lactose oder Molke verwendet wird.