CS261811B1 - Process for preparing cellulose enzymes and/or enzymes for the degradation of cell wall - Google Patents

Description

281811 Předkládaný vynález sa týká postupu vý-roby celulázových enzýmov a/alebo enzý-mov na odbúranie bunkovej blány prostred-níctvom aeróbnej submerznej kultivácie mu-tantov pliesní. Vytvořený komplex enzýmovmožno použit na čiastočné alebo úplné od-búranie celulózy, ako aj hemicelulóz v prie-myselných produktocb, odpadech, odpado-vých vodách alebo pri odbúraní živých ale-bo odumretých rastlinných buňkových stien.

Je známe, že enzýmy celulázového kom-plexu sa vyrábajú aeróbnou submerznoukultiváciou pliesní. Známe postupy sa líšiahlavně čo do použitých kmeňov pliesní, čodo substrátov, použitých pri fermentačnomprocese a čo do spósobu vedenia procesu.Hospodárnost získavania celuláz je v pod-statě definovaná enzymatickou aktivitou,docielenou v jednotke objemu fermentačné-ho média, množstvom enzýmu, vyproduko-vaného za časovú jednotku (enzymatickouproduktivitou], ako aj množstvom enzýmu,vytvořeného a vztiahnutého na použitý sub-strát (výťažok enzýmu], Ako vhodní produ-centi celuláz sú známe najma pliesňovékmene rodov Aspergillus, Penicillium a Tri-choderma.

Napr. podl'a patentu DD-WP 225 712 sapoužívá ako producent celulázy Penicilliumjanthinellum, pričom ako substrát sa pou-žívá celulóza v kombinácii s předpřiprave-nou zelenou rezankou. Pri šaržovitej kulti-vácii sa pri použití spolu 6 % celulózy, pri-danej k zelenej rezanke po 8 dňoch dosiah-ne celulázová aktivita 6 medzinárodnýchjednotiek/cm3 pri skúške na filtračnom pa-pieri, čo zodpovedá výtažku 100 medziná-rodných jednotiek/g celulózy. V inom postu-pe, podlá JP 59—151 888 sa ako producentcelulázy používá kmen Trichoderma konin-gii: ako substrát slúži mikrokryštalická ce-lulóza (Avicel) v koncentrácii 3 °/o. Výsled-né enzymatické aktivity po 7 dňoch holi11,5 medzinárodnej jednotky/cm3 (m. j./cm3)v případe endo-beta-glukanázovej aktivity a0,85 m. j./cm3 v případe exo-celobiohydro-lázy, čo zodpovedá výtažku exocelobiohyd-rolázy potrebnej na odbúranie mikrokryšta-lickej celulózy v rozsahu 28,3 m. j. na gramcelulózy; zodipovedajúca produktivita je 5 m. j. exocelobiohydrolázy na dm3 a hodi-nu. Z patentovej a odbornej literatúry zná-mi producentami celuláz s dosial' najvyššouznámou tvorbou celuláz, patria k druhuTrichoderme reesei (predtým Trichodermaviride). Za účelom zlepšenia tvorby celu-láz sa vypěstovali rožne mutanty Tricho-derma reesei. V patentovom spise DD—VO 80/01080 sapopisuje tvorba celuláz pomocou mutantuTrichoderma reesei MCG 77. Tvorba celulázsa potláča glukózou, nie však glycerolom;laktóza indukuje tvorbu celuláz. Celulázováaktivita v živnom médiu obsahujúcom 1 %celulózy představuje 1 až 1,8 m. j./cm3 FPA,v živnom médiu s 1 % laktózy 1,35 m. j./cm3FPA a v živnom médiu s 1 % laktózy a 1 % celulózy 1,75 m. j./cm3 FPA. V patentovomspise US 4 472 504 sa popisuje tvorba celu-láz pomocou mutanta Trichoderma reeseiMCG 80, ktorý bol vyšfachtený z mutantaTrichoderma reesei Rut C 30. Při použití živ-ného média s 8 % celulózy a s přísadoubiotínu sa pri diskontinuálnej fermentáciidosahuje celulázová aktivita 17,2 m. j./cm3FPA, čo zodpovedá výtažku 215 m. j. FPA/gcelulózy. Pri kultivácii rovnakého kmeňana živnej pode s 2 % laktózy sa dociefujecelulázová aktivita 1,7 m. j./cm3 FPA, čozodpovedá výtažku 85 m. j. FPA/g laktózy.Tieto mutanty Trichoderma reesei vytvárajúna základe celulózy, najmá mikrokryštalic-kej celulózy a bavlnenej celulózy poměrněvysoké celulázové aktivity, nie však na zá-klade rozpustných substrátov, ako napr. glu-kózy. Z toho okrem vysokých nákladov nasubstrát vyplývájú aj nedostatky pre vede-me procesu.

Vyšfachtili sa aj mutanty Trichodermareesei, ktoré sú schopné produkovat celu-lázy na základe glukózy, ako zdroja uhlíka.O produkcii celuláz mutantmi T. reesei pripoužití glukózy ako substrátu sa referovalona 3. európskom kongrese o biotechnologii(Mnichov, NSR, 10. až 14. septembra 1984;M. Bailey: „Produkcia celulázy mutantmiTrichoderma reesei na necelulózovej pode“).Najvyššia popísaná celulázová aktivita sazískala pomocou mutanta T. reesei VTT-D--79 125 na základe 4 °/o glukózy + 4 % lie-hovarského mláta a představovala 6,4 m. j.//cm3 FPA. S celulózou namiesto glukózy sapri tomto kmeni dosahovala přibližné rov-naká celulázová aktivita. Všetky známe postupy na získavanie celu-láz majú tú nevýhodu, že výtažky celulázy,vztiahnuté na použitý substrát sú poměrněnízké, alebo že vyžadujú nákladné substrá-ty, ako mikrckryštalickú celulózu alebo ba-vlnenú celulózu, alebo že celulázové aktivi-ty dosahované vo fermentačnom médiu súnízké, alebo že zvýšením koncentrácie sub-strátu nie je možné proporcionálně zvýšeniecelulázovej aktivity.

Ciefom vynálezu je dosiahnúf vysoké akti-vity celulázového enzýmového komplexu pripoužití cenovo výhodných substrátov a sú-časne dosiahnúf vysoké výtažky enzýmu vpřepočte na substrát, aby sa tak zaručiloefektívne využitie objemu fermentora a vy-užitie substrátu.

Podstatou vynálezu je získat vylepšenécelulázové mutanty a použit ich v kultivač-nom procese, pričom v jedinom fermentač-nom stupni dosiahnúf vysoké celulázovéaktivity pri rovnomernom vysokom výtažkucelulázy vzhfadom na substrát a pri použitícenovo výhodných substrátov.

Podfa vynálezu sa úloha rieši tak, že mu-

tanty pliesne Trichoderma reesei ZIMET

43 803 a/alebo Trichoderma reesei ZIMET 43 804 sa kultivujú aeróbne na submerzne známým sposobom v živnej pode, ktorá ob- 2 6 1 811 s 6 sáhuje jeden alebo viac substrátov, ktorésamé alebo v kombinácii s jedpým aleboviacerými neindukujúcimi substrátmi indu-kujú tvorbu celulázy a/alebo tvorbu enzý-mov, odbúravajúcich bunkovú blánu.

Zistilo sa, že tieto mutanty sa vyznačujútvorbou celulázy s čiastočne potlačenoutvorbou katabolitov aj vo vztahu ku glukó-ze a že tieto mutanty vylučujú do pody vy-soké koncentrácie enzýmov celulázovéhokomplexu aj na rozpustných substrátoch,ako je napr. glukóza alebo laktóza. Obidvauvedené kmene holi získané mutáciou zkmeíía Trichoderma reesei CCI a boli depo-nované v depozite zbierky kultur ZIMET v·Ústrednom ústave pre mikrobiológiu a ex-iperimentálnu terapiu Akadémie vied NDR aregistrované pod číslami ZIMET 43 80i3, po-tažné ZIMET 43 804.

Kmene sú charakterizované nasledovnýmiznakmi.

Popis kmeňa (morfológia, fyziológia):

Obidva kmene sa vyznačajú morfologický-mi znakmi, typickými pre rod Trichodermaa líšia sa vo fyziologických vlastnostiach,čo do tvorby celulázy.

Udržiavanie kmeňov je možné na živnýchpódach vhodných pre kmene rodu Tricho-derma. Vhodný je napr. zemiakovo-glukózo-vý agar alebo sporulačný agar (síran amon-ný 0,2 %; primárný fosforečnan draselný 0,5percent; glukóza 2 %; kvasničný extrakt0,7 °/o; agar 2 %). Málo vhodný pre udržia-vanie kmeňa je Czapek-Doxov agar, lebo sa<nezistilo, že by popísané kmene boli schop-né asimilovat dusitany ako zdroj dusíka.Vhodná kultivačná teplota je 28 až 30 °C,trvanie kultivácie asi 5 až 6 dní a dalších5 až 7 dní pri izbovej teplote až do plnéhovyvinu,tia kmeňa. Preočkovanie sa robí pro-stredníctvom konídií; farba konídií je zele-ná, zo začiatku žltozelená.

Udržiavanie kmeňa v lyofilizovanej forměalebo nad potažné v kvapalnom dusíku jemožné pomocou všeobecne praktizovanýchmetod, bez toho, že by sa doteraz mohol po-zorovat pokles schopnosti syntetizovat celu-lózu.

Obidve kmene majú schopnost produko-vat celulázu pri čiastočnom potlačení rep-resívneho vlivu katabolitov, t. j. v přítom-nosti 1'ahkO' asimilovatelných substrátov,ako sú napr. rózne cukry alebo glycerol, saSubstrát ZIMET 43 803 až do určitej koncentrácie substrátu tvoriacelulážové enzýmy. Schopnost tvořit celulá-zu sa u obidvoch deponovaných kmeňov líšičo do oblasti koncentrácií 1'ahko asimilova-telných substrátov, v ktorých tvorba celu-lázy nie je ešte potlačená.

Schopnost vytvárať celulázu s potla-čením tvorby katabolitov sa dá testovat spoužitím metódy B. S. Montecourta a D. E.Eveleigha (Applied and Enviromental Mic-robiology 33, 1977, 178—183).

Ako substrát na agarovom médiu slúži vkyselině napučaná ‘celulóza v kombinácii spříslušným skúmaným represorom, najmáglukózou, fruktózou, xylózou, laktózou, po-tažné glycerolom. Za účelóm obmedzeníavelkosti kolónií sa do agarovej pódy přidá-vá bengálska červeň v koncentrácii 30 mg//dm3. Hrúbka agarovej vrstvy sa upraví na4 mm. Pri priemere misky 9 cm je účelnéprecčkovať na jednu misku 100 až 200 ko-nídií. Na základe uvedenej metódy sa kulti-váciou a na ňu navádzujúcou inkubáciou pri45 °C počas 20 hodin vytvoria vyčírené zó-ny, pričom životaschopnost konídií ostanezachovaná.

Preto možno týmto spósobom uplatnit ajklonovú selekciu. Tvar a velkost jednotli-vých kolónií je u popísaných kmeňov roz-dielna, v závislosti od použitého substrátu.Na celulózovom agare sa tvoria velké koló-nie s priliehavým tenkým mycéliom, zatiaíčo kolónie na glukóze, potažné fruktóze súmenšie, podobné koloniálnym mutantom,majú hrubšiu vrstvu mycélia a silnejšiesporulujú. Vo všeobecnosti v okolí silné vy-vinutých kolónií dochádza k odfarbeniu a-garu s ibengálskou červeňou. Testovanieschopnosti produkovat celulázu pri potlače-ní tvorby katabolitov u popísaných kmeňovje možné aj v skúmavkách. Napr. konídiesa preočkujú na agarovú pódu s celulózounapučanou v kyselině v kombinácii s pří-slušným skúmaným represorom, avšak bezpřídavku bengálskej červene. Je účelné, abypriemer skúmaviek bol 9 mm. Ako měřítkoschopnosti tvorby celulázy slúži híbka vyčí-renia; kuultivácia a inkubácia pri 45 °C sarobí rovnako, ako v případe doškového tes-tu.

Kmeň ZIMET 43 804 vykazuje s ohíadomna glukózu a fruktózu výraznejšiu schop-nost produkovat celulázu pri čiastočne po-tlačenej produkcii katabolitov: ZIMET 43 804 1 % celulózy 1 % celulózy -|- 5 % laktózy1 % celulózy -j- 5 °/o glukózy1 % celulózy + '5 % fruktózy1 °/o celulózy + 5 % glycerolu, 2 mm8 mm0 mm0 mm2 mm :2 mm'5 mm3 mm3 mm3 mm (celulóza napučaná v kyselině) (hlbka vyčírenia pri skúmavkovom teste) r 261 til 8 Ί

Teplota kultivácie mutantov T. reesei ZI-MET 43 803 a T. reesei ZIMET 43 804 je 22až 36 °C, přednostně 30 až 34 °C ipre rastmycélia a 25 až 30 °C pre tvorbu enzýmu.Hodnota pH pre kultiváciu je v oblasti 2 až7, přednostně 2,5 až 5,5 pre rast mycélia a 3,2 až 6,0 pře tvorbu enzýmu. Ako kultivač-ně nádoby sú vhodné všetky fermentory,prevádzkovateřné s vyléčením cudzej infek-cie, ktoré zaručujú dostatočné zásobovaniekyslíkom a v ktorých nedochádza k trvalýma extrémně vysokým střihovým silám, kto-rým je neustále vystavená značná časť fer-mentačnéhO' média. Východiskům pře kultiváciu sú konídiápovrchových kultúr, najmá kultúr na ší'k-mom agare na zemiakovo-dextrózovej póde.Ako inokulum pre fermentačné médium slú-žia konídiá, přednostně v koncentrácii 107až 109 na liter fermentačnej pódy, alebosuspenzie vegetatívneho mycélia, přednost-ně v množstve 1 až 15 obj. % pódy, ktorása má zaočkovať. Na očkovanie velkých fer-mentorov je účelné inokulum přidávat voviacerých stupňoch po sebe. Vedenie proce-su pri kultivácii mutantov T. reesei ZIMET43 803 alebo T. reesei ZIMET 43 804 za úče-lom získavania celulázových enzýmov ale-bo enzýmov, odbúravajúcich buňkové steny,je rozdielne v závislosti od použitých sub-strátov alebo substrátových kombináclí, akoaj od zloženia enzýmov, ktoré sa má dosiah-nuť. Na vytvorenie celulázového enzýmové-ho komplexu bez zvýšeného podielu vedlej-ších aktivit, ako je napr. xylanázová aktivi-ta a glukanázová aktivita, možno použit akoindukujúci substrát čistú celulózu, pričomvýhodné je upravit pH a teplotný profil fer-mentačného média podlá příkladu 1. AŽ dokoncentrácie asi 3 % celulózy je pri dis-kontinuálnej fermentácii vytvořené množ-stvo celulázového enzýmu úměrného množ-stvu použitej celulózy. Vyššie koncentráciecelulózy vedú sice k vyššej koncentrácii ce-luláz, avšak prírastok koncentrácie celulázuž nie je úměrný množstvu použitej celu-lózy, takže výťažnosť celuláz vzttahnutá namnožstvo substrátu klesá. Zvýšenie koncen-trácie enzýmu celulázy, úměrné množstvúpoužitej celulózy je možné podlá popísanejprítokovanej techniky (fed-batch), pri kto-rej sa přívod celulózy riadi regulačným za-riadením alebo počítačom riadeným ovládá-ním procesu v závislosti od obsahu oxiduuhličitého CO2 vo fermentačnom odpadovomplyne tak, že vývoj oxidu uhličitého, vztiah-nutý na bielkoviny mycélia ostává pri inakrovnakých procesových parametroch počaspodávania substrátu přibližné rovnakým.Pomocou pšeničných otrúb alebo inej zlož-ky komplexného živného média sa móžezvýšit rozvoj vedlejších aktivit, ako celobiá-zovej a xylanázovej. Na výrobu enzýmov naodbúranie bunkovej steny pliesní sa ako in-dukujúci substrát pri diskontlnuálnom pro-cese s výhodou používajú buňkové steny pliesní. Vytvořený enzymatický komplex má zloženie, na základe ktorého je vhodný na- příklad na výrobu živých pliesňových proto- plastov. Získavanie celulázových enzýmov na bázerozpustného indukujúceho subtrátu aleborozpustných neindukujúcich substrátov vkombinácii s indukujúcimi substrátmi, savykonává pódia tohoto vynálezu pomocoufed-batch techniky, pri ktorej sa rozpust-né indukujúce substráty alebo rozpustné ne-indukujúce substráty alebo kombinécie roz-pustných indukujúcich a rozpustných nein-dukujúcich substrátov privádza do fermen-tačného média tak, že skutečná koncentrá-cia rozpustných substrátov vo fermentač-nom médiu sa upraví tak, aby bola v oblasti,v ktorej sa tvorba celuláz indukuje, aleboaspoň nepotláča. Horná hranica tejto ob-lasti sa stanovuje stupňom schopnosti pro-dukovat' celulázu pri čiastočnom potlačenítvorby katabolitov, ktorý stupeň zodpovedápříslušnému použitému substrátu.

Fermentačný proces fed-batch techniky saskládá s dlskontinuálneho úseku (batchj afázy doplňovania substrátu (úsek fed-batch).Diskontinuálna fáza slúži na kultiváciu my-célia, zatial čo vo fáze doplňovania substrá-tu dochádza prevážne ku tvorbě enzýmu.Dodávanie substrátu sa riadi prostredníc-tvom koncentrácie oxidu uhličitého vo fer-mentačných odpadových plynoch. Ak sa ne-pridávajú neindukujúce substráty, musí zá-kladné živné médium obsahovat aspoň je-den indukujúci substrát, ako napr. celuló-zu, pšeničné otruby alebo liehovarské vý-palky. Ak sa pridávajú rozpustné indukujú-ce substráty, nemusí živné médium obsaho-vat žiadne dalšie indukujúce látky; v tomtopřípade je aj možné kultivovat mycélium vdiákontinuálnom úseku fermentácie na bázeneindukujúcich substrátov, ako napr. glu-kózy, sacharózy alebo glycerolu.

Je aj možné začat' s přívodem rozpustnýchindukujúcich substrátov ihned po zaočko-vaní, ked sa očkovanie robí pomocou ve-getatívneho mycélia v koncentrácii najrad-šej 2 až 8 g/dm3 v přepočte na sušinu. Pripoužití rozpustných indukujúcich substrá-tov, ako napr. laktozy, je aj možné kontinu-álně oddělovat z fermentačného média vy-lúčené enzýmy pomocou známých membrá-nových separačných procesov. Pomocoumikrofiltrácie sa od enzýmov oddelia tuhélátky (plesňové mycélium) a pomocou ul-trafiltrácie nízkomolekulárne rozpustnézložky živnej pódy. Je účelné tuhé látkyokamžité vracať do živného média, zatial' čočasť alebo celý ultrafiltrát sa zavádza dopřidávaného indukujúceho substrátu a spo-lu s týmto sa vracia do fermentačného mé-dia.

OddeTovanie a čistenie získávaných enzý- mov sa móže robit pomocou známých po- stupov. Podlá aplikácie možno použit ne- spracované fermentačné médium, končen- 10 2B1811 trát kultúry, sušené surové enzýmy aleborafinované enzýmy.

Specifická aktivita surových celulázovýchenzýmov, fermentovaných na báze drevitejcelulózy alebo laktózy, je v rozmedzí 1,4 až1,9 m. j. (FPA)/mg bielkoviny. Příklad 1:

Vo fermentori s hrubým objemom 30 dm3sa za účelom získavania celulázových enzý-mov kultivuje kmeň Trichoderma reeseiZIMET 43 803. Ako substrát sa používá dře-vitá celulóza Heweten 10 Hz; fermentáciasa vedie v diskomtinuálnom procese.

Fermentor je opatřený všeobecne použí-vaným šesťlistovým vrtulovým miešadlom,ktoréhoi celkový priemer je asi třetina vnú-torného priemeru fermentora. Výška zabu-dovania miešadla vo fermentori je asi jed-na pátina celkovej výšky vnútorného pries-toru fermentora. Zésobovanie fermentoraplynom sa robí cez krúžok, nachádzajúci sapod miešadlom, pričom tento krúžok mápriemer přibližné rovnaký ako miešadlo aje opatřený 1 mm širokými otvormi vo vzdia-lenosti po 8 mm. Fermentor je vybavenýbežne používanou meracou a regulačnoutechnikou, najmá zariadením na meranie areguláciu teploty, zariadením na meranie areguláciu pH, zariadením na meranie areguláciu rozpuštěného kyslíka, zariadenímna meranie koncentrácie oxidu uhličitého vodpadových fermentačných plynoch, s ovlá-dacím signálom, například na ovládaniedávkovačích čerpadiel, čo zaručuje ochranupřed nadměrným přidáváním odpeňovača.Osobitne vhodný je fermentor, ktorý umož-ňuje proces riadený počítačom. Živné médium má následovně zloženie: celulóza He.weten 10 Hz 30,0 g/dm3 síran amónny 4,8 g/dm3 dihydrogénfosforečnan draselný 3,0 g/dm3, síran horečnatý, heptahydrát 0,4 g/dm3 chlorid vápenatý 0,3 g/dm3 peptón 1,5 g/dm3 Tween 80, polyoxyetylén- sorbitan monooleát 1,0 g/dm3 roztok stopových solí 10,0 cm3/dm3 Zloženie roztoku stopových solí: heptahydrát síranu železnatého 0,50 g/dm3 heptahydrát síranu manganatého 0,16 g/din3 heptahydrát síranu zinočnatého 0,14 g/dm3 chlorid kobaltnatý 0,20 g/dm3 sterilizovaného fermentora. Napokon sa dofermentora zaočkuje 1 dm3 čerstvej suspen-zie mycélia ako inokula.

Inokulum sa připravuje v trepačkovejkultúre. Používajú sa rovnaké zložky živné-ho média ako pre 30-litrový fermentor, alekoncentrácia KH2PO4 sa zvýši na 15 g/dm3a navýše sa do média přidá 0,9 g/dm3 močo-viny; koncentrácia ostatných přidávanýchzložiek je rovnaká, ako v živnom médiu vofermeptori. Připraví sa 10 baniek po 100 cm3 tohtoživného média a s vylúčením cudzích zá-rodkov sa každá banka zaočkuje asi 107 ko-nídiami deponovaného kmeňa T. reeseiZIMET 43 803. Kultivácia sa robí na bežnejtrepačke, používanej na kultiváciu mikro-organizmov pri teplote 30 °C. Dlžka kultivá-cie je 36 až 60 h. až do zaočkovania fermen-tora.

Teplota kultivácie sa na začiatku fermen-tácie nastaví na 30 CC; regulačně medze prepH sa nastavia na 3,5 (dolná hranica) a 5,5(horná hranica regulácie) počet otáookmiešadla sa nastaví na 500/min. a intenzitaplynenia na 30 normálnyoh dm3 vzduchu zahodinu a 1 dm3 fermentačného média, čozodpovedá celkovému množstvu 450 normál-nych dm3 vzduchu za hodinu. Proti tvorběpěny sa používá silikonový odpeňovač. Po-dlá stavu a veku inokula je hodnota pH nazačiatku fermentácie v želanom rozmedzíasi od 4,0 do 5,4. Počas fermentácie dochá-dza k poklesu pH, pri dosiahnutí dolnej re-gulačnej hranice sa pomocou 12 %-néhočpavkového roztoku udržiava konštanitnýmna úrovpi 3,5. Niekedy sa zaznamená v po-čiatočnej fáze dočasný rast pH, ktorý sa pridosiahnutí hor.nej regulačnej hranice zastavía udržiava na úrovni 5,5 pomocou 10 %-nejkyseliny sírovej.

Pri dosiahnutí rastu mycélia, ktorý zodpo-vedá logaritmické] fáze rastu jednobunko-vých organizmov, nastaví sa teplota fermen-tácie 11a 28 °C. Tento okamžik sa dosiahneasi po 35 až 60 hodinách a je rozoznatelnýstúpaním koncentrácie oxidu uhličitého vodpadovom plyne fermentora. V predklada-nom příklade sa pri dosiahnutí koncentrácieCO2 vo vysušenom odpadovom plyne vo výš-ke 0,2 % obj. nastaví fernientačnů teplotana 28 °C. Koncentrácia CO2 rastie ďalej apo překročení maxima opať klesá. Fermen-tácia sa ukončí po 120 až 150 hodinách, keďkoncentrácia CO2 v odpadovom plyne z fer-mentora klesne na 0,05 % obj. alebo nlžšiea hodnota pH stúpne.

Celulázová aktivita v kultivačnom filtrátepředstavuje na konci fermentácie 9,0 až9,4 m. j. FPA/cm3 na filtračný papier, čo zod-povedá výtažku 300 až 310 m. j. FPA nagram drevitej celulózy Heweten 10 Hz. Po-mocou známého postupu mikrofiltrácie aultrafiltrácie sa enzymatický komplex oddě-lí od ostatného živného média a lyofilizujesa. Lyofilizovaný surový enzým má násle-dovně zloženie, potažné aktivity:

Zložky živného média potřebné na přípra- vu 16 dm3 sa vhodným spósobom rozpustia v 16 dm3 vody, potažné sa suspendujú a s vylúčením cudzích zárodkov $a zavedú do 261811 11 12 obsah bielkovín 44,5 % aktivita na filtračný papier '(FPA) (m. j./mg bielkoviny) 1,52 celobiáza (m. j./mg bielkoviny) 0,034 alfa-amyláza (m. j./mg bielkoviny, 30 °C) 0,54 xylanáza (m. j./mg bielkoviny) 5,8 proteáza nedokaza- telná

Tuhé látky, oddělené od fermentačnéhomédia, ktoré sa skladajú prevažne z buňko-vých stien použitej pliesne, sa podrobia su-šeniu rozprašováním alebo lyofilizácii a na-pokon sa pulverizujú. Tieto buňkové stenysú vhodné napr. ako substrát na výrobu en-zýmov na odbúranie buňkových stien.

Stanovenie celulázovej aktivity, ako aj ob-sahu bielkovín sa robí podlá metod, odpo-rúčaných IUPAC (T. K. Ghose: „Finál Re-commendations on the Measurement cf Cel-lulase Activities“, připravené pre IUPAC,Komisia pre biotochnológiu; júl 1983). Sta-novenie amylázovej aktivity sa robu pri 30stupňoeh Celzia, všetky ostatně enzymatickéaktivity sa stanovujú pri 50 °C; 1 medziná-rodná jednotka zodpovedá uvoíneniu 1 mik-romólu glukózy za 1 minutu z použitéhosubstrátu. Příklad 2

Vo fermentori, ako je popísaný v příklade1 sa kultivuje pleseň T. reesei ZIMET 43 803za účelom získavania celulázových enzý-mov. Ako substrát sa používá dřevitá celu-lóza Heweten 10 Hz. Fermentácia sa vyko-nává technikou fed-batch, pri ktorej sa do-datočné privádzanie substrátu riadi metabo-lickou aktivitou mycélia pliesne.

Zloženie základného živného média je ná-sledovně: celulóza Heweten 10 Hz 300,0 g síran amónny 72,0 g dihydrogénfosforečnan draselný 60,0 g heptahydrát síranu horečnatého 7,5 g chlorid vápenatý 7,5 g peptón 45,0 g Tween 80, polyoxyeíylčnsorbitan monooleát 15,0 g roztok stopových solí 150 cm3 (ako v příklade 1)

Tieto zložky sa rozpustia vo vodě, potažnésa suspendujú, upravia sa na objem 10,5 dm3a zavedu sa do fermentora. Ako inokulumslúži 1 dm3 suspenzie mycélia, ako je popí-sané v příklade 1. Médium na doplňovaniesubstrátu sa připraví následovně: 1 350 gcelulózy Heweten 10 Hz a 45 g karboxyme-tylcelulózy sa za sucha rovnoměrně premie-ša a za miešania sa suspenduje vo vodě, vo-dou sa doplní na celkový objem 4,5 dm3 asterilizuje sa.

Fermentácia:

Nastavenie teplotného profilu a otáčokmiešadla, ako aj regulácia pH a odpeňova-nie sa robí ako v příklade 1. Vzdušnenie sanastaví na 420 normálnych dm3 vzduchu zahodinu. S privádzaním suspenzie celulózy sazačne, akonáhle koncentrácia oxidu uhliči-tého vo fermentačnom odpadovom plynepřekročí maximum a poklesne asi na 80 %maximálnej hodnoty, za rovnakého nastave-nia procesných parametrov. Maximum kon-centrácie oxidu uhličitého je asi 0,7 až 0,9objemových vo vysušenom odpadovom plynez fermentácie; občasné slabo výrazné ma-ximum koncentrácie oxidu uhličitého v od-padovom plyne z fermentora netřeba z hla-dí ska riadenia procesu brat dO' úvahy. Táto koncentrácia oxidu uhličitého vo výš-ke 80 % maximálnej hodnoty sa na začiatkudoplňovania substrátu nastaví ako regulač-ně medza; pri poklese pod regulačnú medzusa zapne podávacie čerpadlo, ktoré privá-dza celulózovú suspenziu do fermentačnéhomédia tak dlho, kým koncentrácia oxiduuhličitého nepřekročí regulačnú medzu. Po-dávači výkon čerpadla sa nastaví na množ-stvo 0,5 % hmotnosti fermentačného médiaza hodinu, pri začiatku pridávania substrátuteda na 53 g/h celulózovej suspenzie. Kon-centrácia bielkovín mycélia vo fermentač-nom médiu sa stanoví na začiatku pridéva-nia substrátu; regulačná medza oxidu uhli-čitého sa iprispósobí meniacej sa koncentrá-cii bielkovín mycélia, teda s rastúcou kon-centráciou bielkovín mycélia sa proporcio-nálně zvyšuje.

Spolu sa přidá 4,5 dm3 30' % celulózovejsuspenzie do fermentačného média. Fermen-tácia sa ukončí po 320 až 360 h., keď kon-centrácia oxidu uhličitého' v odpadovom ply-ne poklesne na 0,2 % alebo nižšie a hodno-ta pH stupně.

Celulázová aktivita v kultivačnom filtrátena konci fermentácie je 32 m. j. FPA/cm3, čozodpovedá výtažku 290 m. j. FPA na gramcelulózy Heweten 10 Hz. P r í k 1 a d 3

Na výrobu enzýmov na odbúranie buko-vých stien sa v trepačkovej kultúre fermen-tuje plieseň T. reesei ZIMET 43 803. Akosubstrát sa používajú buňkové steny plies-ne, ktoré sa získá napr. ako je popísanév příklade 1. Živné médium má následovnězloženie: sušené pliesňové buněčné steny 25,0 g/dm3 dihydrogénfosforečnandraselný 15,0 g/dm3 síran amonný 4,8 g/dm3 heptahydrát síranu horečnatého 0,4 g/dm3 chlorid vápenatý 0,3 g/dm3 2 81311 13 močovina 0,6 g/dm3 peptón 1,5 g/dm3 Tween 80, polyoxyetylén- sorbitean monooleát 1,0 g/dm3 roztok stopových solí (ako v příklade 1) 10,0 cm3/dm3 Třepáčkové banky, napr. okrúhle banky s brutto objemem 500 cm3, sa naplnia po100 cm3 živného média a zaočkujú sa koní-diami v koncentrácii 5 X 108/dm3 živnéhomédia. Kultivačná teplota je 30 °C, čas kul-tivácie 8 dní. Získaný kultivačný filtrát saultrafiltráciou alebo dialýzou zahustí v po-měre 10 : 1. Kultivačný koncentrát, ktorý samóže spracovať na sušený enzymatický pro-dukt, je vhodný napr. na výrobu živýchplesňových protoplastov. Příklad 4

Vo fermentori s miešadlom, ako je popí-saný v příklade 1, sa kultivuje pleseň T. ree-sei ZIMET 43 804 za účelom získavania ce-lulázových enzýmov. Živné médium obsahu-je pšeničné otruby a celulózu ako indukujú-ce substráty v kombinácii s glukózou akoneindukujúcim substrátom. Fermentácia savykonává technikou fed-batch, pri ktorej jedodatočné pridávanie substrátu z regulačne-technického hfadiska riešené ako je to po-písané v příklade 2.

Zloženie základného živného média je ná-sledovně: pšeničné otruby 140,0 g celulóza Heweten 10 Hz 140,0 g glukóza 210,0 g síran amónny 67,0 g dihydrogénfosforečnan draselný 45,0 g heptahydrát síranu horečnatého 5,6 g chlorid vápenatý 5,6 g peptón 21,0 g Tween 80 polyoxyetylén sorbitan monooleát 14,0 g roztok stopových soilí (ako v příklade 1) 140 cm3

Tieto· zložky sa pridajú do fermentora v12,6 dm3 vody. Ako inokulum sa použijú2 dm3 suspenzie mycélia, ktoré sa v před-stupni (trepačková kultúra alebo fermen-tor) kultivuje na živnej pode rovnakého zlo-ženia, ako je základné živné médium, 24 až36 hodin; predkultúra sa inokuluje konídia-mi. Ako médium na doplňovanie substrátusa používá 50 %-ný roztok glukózy.Fermentácia:

Vzdušnemie sa nastaví na 490 normálnychdm3 za hodinu. Ostatně procesně parametresú rovnaké, ako je udané v příkladech 1, po-tažné 2. S prívodom glukózového roztokusa začne, akonáhle koncentrácia oxidu uhli-čitého po překročení maxima poklesne naasi 70 % maximálnej hodnoty. Podávači vý- 14 kon čerpadla sa nastaví na 75 cm3/h. Čer-padlo, ako je popísané v příklade 2, sa za-píná pri poklese koncentrácie COz na hod-notu pod regulačnou medzou, a po překro-čení regulačnej medze sa znovu vypíná. Re-gulačně medza koncentrácie oxidu uhličité-ho, ako je popísané v příklade 2, sa prispo-sobí meniacej sa koncentrácii mycéliovýchbielkovín.

Koncentrácia oxidu uhličitého vo fermen-tačných odpadových plynoch má počas do-iplňovania substrátu oscilačný priebeh. Spo-lu sa přidá 1,4 dm3 50 % roztoku glukózydo fermentačného média. Fermentácia saukončí po: 120 až 140 hodinách, keď kon-centrácia oxidu huličitého poklesne na 0,1percenta alebo nižšie a stúpne hodnota pil.Celulázová aktivita v kultivačnom filtráteje na konci fermentácie 12,5 m. j. FPA/cm3.Příklad 5

Kultivuje sa pleseň T. reesei ZIMET 43 804za účelom získania celulázových enzýmovna báze laktózy. Vedenie procesu sa usku-točňuje technikou fed-batch, ako je popísa-né v príkladoch 2 a 4. Zloženie základnéhoživného média je následovně: laktóza 140,0 g síran amónny 67,0 g dihydrogénfosforečnan draselný 45.0 g chlorid vápenatý 5,6 g heptahydrát síranu horečnatého 5,6 g peptón 21,0 g Tween 80, polyoxyetylén sorbitan monooleát 14,0 g roztok stopových solí (ako v příklade 1) 140 cm3

Tieto zložky sa dajú do fermentora v 12,8'decimetra3 vody. Ako inokulačný materiálslúži 1 dm3 suspenzie mycélia, ktoré sa kul-tivuje 35 až 40 hodin na živnom médiu rov-nakého zloženia v třepáčkových bankách;trepačková kultúra sa inokuluje konídiami.Na doplňovanie substrátu sa použije 20 %--ný roztok laktózy.

Fermentácia:

Vzdušnenie sa nastaví na 420 normálnychdm3 vzduchu za hodinu; ostatně procesněparametre sú nastavené ako v příklade 1,pofažne 2. S privádzaním roztoku laktózysa začne, akonáhle koncentrácia oxidu uhli-čitého poklesne asi na 80 % maximálnejhodnoty. Podávači výkon čerpadla sa nasta-ví na 100 cm3/h. Fermentácia sa ukončí asipo 100 až 110 hodinách, kedy sa do fermen-tačného média přidalo spolu 2,8 dm3 20percentého roztoku laktózy. Celulázová ak-tivita v kultivačnom filtráte je 10,5 m. j. FPAna cm3. Pomocou membránových separač-ných procesov z fermentačného média od-dělený a napokon lyofilizovaný surový en-

Claims (4)

16 281811 1S zým má následovně zloženie,vity: potažné akti- obsah bielkovín 45,7 % aktivita na filtračný papier (FPA) (m. j./mg bielkoviny) 1,46 celobiózy (m. j./mg bielkoviny) 0,035 alfa-amyláza (m. j./mg bielkoviny, 0,50 30 °C) 5,6 xylanáza proteáza zatelná proteáza tel'ná Příklad 6 Schopnost plesňových kmeňov T. reeseiZIMET 43 803 a T. reesei ZIMET 43 804 pro-dukovat celulózy sa skúma kultiváciou naroznych substrátoch a porovnává sa s vý-chodzím mutantom T. reesei CCI. Živné mé-dium má následovně zloženie: Substrát ZIMET 43 803 0,5 % pšeničných otrúb -j- 3,0 0,5 % drevitej celulózy 0,5 % glukózy + 2,0 0,5 % drevitej celulózy 0,5 % laktózy + 1,4 0,5 °/o drevitej celulózy 5,5 % glukózy + liehovarské výpalky 1,0 (50 %-né) Celulázová aktivita je udávaná v m. j. FPA/cm3. Možné oblasti použita sa týkajú napří-klad priemyslu spracovania ovocia a zele-niny, liehovarského a pivovarského priemys-lu, extrakcie rastlinných látok, obsahujúcichbuničinu, ako aj zlepšovania strávitelnosti dihydrogénfosforečnan draselný 15,0 g/dm3 síran amonný 1,4 g/dm3 chlorid vápenatý 0,3 g/dm3 heptahydrát síranu horečnatého 0,3 g/dm3 močovina 0,3 g/dm3 peptón 1,5 g/dm3 Tween 80, polyoxyetylén sorbitan monooleát 1,0 g/dm3 roztok stopových solí (ako v příklade 1) 10,0 cm3/dm3 substrát 10,0 g/dm3 Třepáčkové banky sa naplnia po 100 cm3testovaného živného média a zaočkuje sa107 konídiami jednej a tej istej suspenziepříslušného kmeňa. Cas kultivácie je 7 dní,kultivačná teplota 30 C°. Získajú sa nasle-rovné celulázové aktivity: ZIMET 43 804 CCI 2,9 1,5 2,1 1,0 1,8 1,2 1,3 0,6 objemových krmív a silážovania krmív vpofnobospodárstve. Získané enzýmové kom-plexy sa můžu používat aj ako biochemiká-lie, například na výrobu protoplastov a naanalytické hodnotenie krmív. PREDMET

1. Sposob přípravy celulázových enzýmova/alebo enzýmov na odbúranie bunkovej ste-ny pomocou plesní v submerznom procese,vyznačujúci sa tým, že plesňové mutantyTrichoderma reesei, ZIMET 43 803 a/aleboTrichoderma reesei ZIMET 43 804 sa kulti-vujú pri teplote 22 až 36 °C, pri pH 2 až 7,za podmienok známých pre kultiváciu kme-ňov rodu Trichoderma, v živnom médiu, kte-ré obsahuje jeden alebo viac substrátov in-dukujúcich tvorbu celulázových enzýmova/alebo enzýmov na odbúranie bunkovej ste-ny, buď jednotlivo, alebo v kombinácii sjedným alebo viacerými, neindukujúcimisubstrátmi.

2. Sposob přípravy podl'a bodu 1, vyzna-čujúci sa tým, že indukujúce substráty sapoužívajú buď rozpustné, ako je laktóza, ale- VYNÁLEZU bo srvátka, alebo nerozpustné, ako je celu-lóza, celulózové odpady alebo buněčné ste-ny plesní.

3. Sposob přípravy podlá bodov· 1 a 2 vy-značujúci sa tým, že sa použijú rozpustnéindukujúce substráty a/alebo rozpustné ne-indukujúce substráty, ktoré sa pridávajú domédia technikou fed-batch tak, že přidáva-né substráty indukujú vo ferrnentačnom mé-diu tvorby enzýmov alebo ju aspoň nepo-tláčajú.

4. Sposob přípravy podlá TOdov 1 až 3,vyznačujúci sa tým, že sa používajú ako in-dukujúci substrát otruby alebo' liehovarskévýpalky v kombinácii s rozpustnými sacha-ridmi, ako je glukóza, xylóza, laktóza aleboso srvátkou. Severografla, n. p., zívod 7, Most Cena 2,40 KCs