JPS6276A - 酵素阻害性新規物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 几 （式中孔は水素原子または水酸基を意味する）で表わさ
れる物質、その薬学的に許容できる塩またはその水和物
に関するものである。

上記の新規物質は少なくとも酵素阻害活性を有してなる
医薬または研究用試薬として有用である。

従来技術 従来、チオールプロテアーゼ阻害物質は、抗炎症作用を
有することが知られており、これらのチオールプロテア
ーゼ阻害物質としては人尿中量白質（特開昭５９−１５
５３２４号公報）、Ｂ−６４（Ａｇｒｉｃ　、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ　４２．５２３　５２８．１９７８　）
、Ａｎｔｉｐａｉｎ　（Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔ、　２
５．２６３−２６６、１９７２）、エポキシ化物（特開
昭５５−１５３７７８号公報、特開昭５５−１１５８７
８号公報、特開昭５５−４７６６８号公報、特開昭５５
−３５０１２号公報、特開昭５４−１４１７５０号公報
、特開昭５４−１４１７３７号公報、特開昭５４−１４
１７９５号公報、特開昭５４−１４１７３４号公報、特
開昭５３−１０８９４８号公報、特開昭５３−１．０８
９３６号公報、特開昭５３−１０８９２３号公報、特開
昭５２−３１０２４号公報などが知られている。

合成法については上記同類の化合物であるＢ　−６４の
■Ｎ−カルボベンジルオ中クシ−１，４ジアミノブタン
炭酸塩（以下カルボベンジルオキシをＣＢＺと略す）を
出発原料とし、ニトログアニジル化、脱ＣＢＺ化、ブチ
ルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシン−スクシンイミドエ
ステルＣ以下ＢＯＣ−Ｌ　−Ｌｅｕ　−Ｏ８ｕと略す）
による縮合、ＢＯＣ基およびニトロ基の除去、エチル水
素トランスーエポキシコハク酸の縮合、加水分解による
方法、■Ｎ−ＣＢＺ−１．４−ジアミノブタン炭酸塩を
出発原料としてＢＯＣＬ　　Ｌｅｕ　　Ｏ８ｕによる縮
合、ＢＯＣ基の除去、エチル水素トランス−エポキシコ
ハク酸の縮合、脱ＣＢＺ化、ニトログアニジル化、加水
分解、ニトロ基の除去による製法が報告されている（　
Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４２（３）５２
９−５３６（１９７８九発明が解決しようとする問題点 、本発明者らは、微生物の生産する新規な生理活性物質
の探索を行い、土壌から新たに分離したマイセリオフト
ラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　）属に属する微生
物の培養物中にパパインの活性を強く阻害する生理活性
物質として、上記一般式ＣＩ、１　”’Ｃ表わされる本
発明の物質が蓄積さ」Ｌること金知り、これらを単離し
た。

その結果、本発明の一般式（１）で表わされる物質は、
従来の物質に比べて酵素阻害活性が強く、また本発明の
一般式〔Ｉ〕で表わされる物質は、その理化学的性質、
生物学的性質から、同一化学的構造または同一物性を有
する物質は天然界または化学的に合成された化合物にも
ないことから新規物質であると判断し、一般式（１”］
で表わされる物質をエスタチン（ｇｓｔａｔｉｎ　）と
命名し、一般式〔工〕で表わされる物質における基Ｒが
水素原子を意味する場合をエスタチン人と命名し、また
一般式〇）で表わされる物質における基孔が水酸基を意
味する場合をエスタチンＢと命名した。

合成法においては上記Ｅ−６４の製法■では出発原料で
あるＮ−ＣＢＺ−１，４−ジアミノブタン炭酸塩の１！
製が困難である。合成ステップ途中でグアニジル基の保
護基であるニトロ基を除去するため脂溶性を失い精製が
困難となるなどの欠点を有し、又■では■と同様に出発
原料のＩｉＩ！製困難が１１、さら【合成工程の後手に
ニトログアニジル基を導入しているがこの反応は副生成
物が多く出現し収率も良くない。

本発明は合成法によシエスタチンＡ、Ｂのアミ／　酸ｆ
ｉ基であるフェニルアラニン、チロシンヲ導入し、次い
でエボキシフハク醒′ｆｆ：導入する際グアニジル基の
保護基であるニトロ基をそのまま有しておシ、又その後
の工程でもニトロ基を有したまま進め、最後にニトロ基
を接触還元により除去する。このような方法によりシリ
カゲルによる精製も容易となりかつ収率も向上する。

、　問題点を解決するための手段 本発明はパパイン、フィシン及びプロメラインなどのチ
オールプロテアーゼに対して強い酵素阻九 （式中几は水素原子または水酸基を意味する）で表わさ
れる新規物質、その薬学的に許容できる塩またはこれら
の水和物、およびマイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐ
ｈｔｈｏｒａ　）属に属する一般式ＩＩＩ）で表わされ
る物質生産菌を培地に培養し、その培養物より上記一般
式ＣＩ〕で表わされる物質を採取すること及び合成法に
よシ上記一般式ＣＩ）で表わされる物質を得ることを特
徴とする一般式〔工〕で表わされる物質の製法に関する
ものである。

本明細書においては、上記の一般式ＣＤにおいて基孔が
水素原子の場合にはエスタチンＡ（Ｅｓｔａｔｉｎ人）
と呼称し、基孔が水酸基の場合にはエスタチンＢ　（Ｅ
ｓｔａｔｉｎ　Ｂ　）と呼称する。

本発明者らは、これらの知見に基づいて研究を重ねた結
果本発明を完成した。

本発明の新規物質エスタチンＡおよびＢはチオール基が
生理的活性発現に関与するパパイン等のチオールプロテ
アーゼ、カルシウム依存性中性テオールグロテアーゼ等
を強力に阻害し、従って、エスタチンＡおよびエスタチ
ンＢは炎症、筋ジストロフィー等の治療に有効である可
能性がある。

更に、エスタテンＡおよびエスタチンＢはアレルギー性
疾患に関与するＩｇＥ抗体産生を抑制するが、ＩｇＧ抗
体産生は抑制しない。従って、抗アレルギー作用を有す
る可能性が考えられる。このように、チオールグロテア
ーゼ阻害剤であるエスタチンＡおよびエスタチンＢは医
薬あるいは研究用試薬等としての利用が期待できる。

（１）物理化学的性状　　エスタチンＡ　　エスタチン
Ｂａ、外観　　　　　　　　白色針状結晶　　白色針状
結晶す、中性・酸比・塩勘按認別　塩基性物質　　　塩
基性物質Ｃ０元素分析 実測値 Ｃ−５２，８％、Ｈ−６，３７％、Ｎ−１７，４０％Ｃ
−５０，９３，ｌ−１−６，４９，Ｎ−１６，７３理論
値 Ｃ−５′２．．８０．　Ｈ−６，６５，Ｎ−１７，１０
Ｃ−５０，８２，Ｈ−６，４０，Ｎ−１６，４６（ＣＩ
６Ｈ２５Ｎ５０５・Ｈ２Ｏとして＞　　　（Ｃ１１１Ｈ
２５Ｎ５０６・Ｈ２Ｏとして）ｄ０分子式　　　Ｃｌ１
ｌＨ２５Ｎ５０５　　　Ｃ＋１ｌＨ２５Ｎ５０４ｆ、比
旋光度〔α〕ｂ ｇ、紫外部吸収スペクトル エスタチンＡ及びエスタチンＢの水溶液中での紫外部吸
収スペクトルをそれぞれ第１図及び第２図に示す。エス
タチンＡの結果は次の如くである。

λＨ２０（８１％）　２４７　ｎｙｔ　（４，１）　、
２５２　ｍｔｔ　（４，６）ａＸ１Ｕ ２５９１ｎμ（５，１）　、２６４　ｔｎμ（４，１＞
２６９７Ｆ１μ（２，２） エスタチンＢの結果は次の如くである。

２８３ｍμ（３１，８） ｈ、赤外部吸収スペクトル エスタチンＡ及びエスタチンＢの臭化カリニスタチンＡ
：　３２６０，１６４０，１５５０，１４４０，１３８
０，１２５０９００ｃｒＩｔ−’に特徴的な吸収帯を有
する。

エスタテンＢ　：　３２８０，１６５０，１５５０，１
５２０，１４６０．１４００゜１３００　、１２５０　
、９００ｎｌ−’に特徴的な吸収帯を有する。

ｉ、フロトン核磁気共鳴スペクトル エスタチンＡの重水中の１００八ＨｚプロトンＮ　Ｍ　
Ｒ（内部標準ＤＳＳ）で測定した化学シフトプロトン数
、多重度は次の通りである。

１．３７　ｐｐｍ　　（ｍ、　４Ｈ） ３．０９　ｐｐｍ　　（ｍ　、　６Ｈ）３．２４　ｐｐ
ｍ　　（ｄ　、　Ｊ−２，１、ＩＨ）ニス々テンＢの重
水中、重環酸を添り口し１００ＭＨｚプロトンＮＭＲ（
内部標準ＤＳＳ）ｔ−測定した時の化学シフト、プロト
：ノ数、多３を度は次の通りである。

１．３３　ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）　　　　　６．８５　ｐ
ｐｍ（ｄ、Ｊ＝８．３．２Ｈ）３．０５　ｐｐｍ（ｍ、
６Ｈ）　　　　　７．１４　ｐｐｍ（ｄ、Ｊ−８，３，
２Ｈ）３．５２　ｐｐｍ（ｄ、Ｊ”’ＬＯ，ＩＨ）３．
７６　ｐｐｍ（ｄ、Ｊ−１２，０，ＩＨ）４．５０　ｐ
ｐｍ（ｔ、Ｊ＝６．０．ＩＨ）ｊ、Ｃ−１３核磁気共鳴
スペクトル 工スタチン人の重水中２５　ＭＨｚ　（内部標準ジオキ
サン；　６７．４　ｐｐｍ　）にて測定した化学シフト
、多重度は次の通シである。

２５．９ｐｐｍ（ｔ）　５３．６ｐｐｍ（ｄ）　１２９
．６ｐｐｍ（ｄ）　１７０．１ｐｐｍ（ｓ）２６、２　
ｐ　ｐｍ　（リ　５５．２ｐｐｍ（ｄ）１３０．０ｐｐ
ｍ（ｄ）１７３．１ｐｐｍ（ｓ）３７．８ｐｐｍ（ｔ）
　５６．１ｐｐｍ（ｄ）　１３０．０ｐｐｍ（ｄ）　１
７４．２ｐｐｍ（ｓ）３９．４１）ｐｍ（ｔ）　１２８
．０ｐｐｍ（ｄ）　１３６．９ｐｌ）ｍ（Ｓ）４１．５
ｐｐｍ（ｔ）　１２９．６ｐｐｍ（ｄ）　１５７．３ｐ
ｐｍ（８）エスタチンＢの重水中、重環酸を添加し、２
５　ＭＨｚ　（内部標準、ジオキサン；　６７．４　ｐ
ｐｒｎ）にて測定した化学シフト、多重度は次の通りで
ある。

２５．９ｐｐｍ（ｔ）　　５３．０ｐｐｍ（ｄ）　１２
８．６ｐｐｍ（ｓ）　１６８．５ｐｐｍ（ｓ）２６．２
ｐｐｍ（ｔ）　　５４．１ｐｐｍ（ｄ）　１３１．４ｐ
ｐｍ（ｄ）　１７１．１ｐｐｍ（ｓ）３７．１ｐｐｒｎ
（ｔ）　　５６．３ｐｐｍ（ｄ）　　１３１．４ｐｐｍ
（ｄ）　　１７３．０ｐｐｒｎ（ｓ）３９．６ｐｐｒｎ
（ｔ）　　１１６．３ｐｐｍ（ｄ）　　　１５５．３ｐ
ｐｍ（ｓＪ４１．６ｐｐｍ（ｔ）　　ｉｌＧ、３ｐｐｍ
（ｄＪ　　１５７．４ｐｐｍ（ｓ）エスタチンＡ　　　
　エスタチンＢ ｋ、　ラ鶏＊Ｓ／を主　　水、酢酸、ジメチルスルホキ
サイド、ピリジンに 可溶。ベンゼン、クロロ　　　　同左 ホルム、酢酸エチル、石 匍エーテルに不溶。

■、呈色反応　過マンガン酸カリ脱色反応、坂口反応、
陽性。ニ ンヒドリン反応、モーリ　　　　同左 ツシュ反応、塩化第二鉄 反応陰性。

ｍ、加水分解 ６Ｎ、ＨＣＪ、　　１０５℃、１８時間密封中加水分解
後、アミノ酸自動分析装　　　　同左置にて測定 Ｌ−Ｐｈｅｎｙ　ｌ　ａ　Ｉ　ａｎ　ｉ　ｎｅ　　　　
　　　　Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅｎ、　Ｒｆ値（東京化成
社製、シリカゲルｆ使用）クロロホルム：メタ／−ル：
水　　　　　　凡ｆ−０，６２几ｆ−０，５３Ｃ３ニア
：１） 酢酸エチル：メタノール：水　　　　　　　Ｒｆ−０，
６５几ｆ−０，５６（３：５＝２） アセトニトリル；水　　　　　　　　Ｒ，ｆ−０，１４
Ｒｆ−０，０９〇・安定性 ｐ）１２〜９で安定　　同左 ｐ、水９ＫＪ物−４７ｔは薬学的に許容でさ゛る埴不発
明のエスタチンＡ　、エスタチンＢは１永和物として形
成せしめでもよく、さらに塩酸、硫酸などの無機酸、酢
酸、クエン酸、酒石酸などの有ｆｉｆとの塩や水酸化す
）　ＩＪウム、水酸化カリウムなどの塩基との塩を形成
せしめてもよい。

さらに塩形成に当っては、例えばエスタテンＡ葦たけエ
スタチンＢｇ含有する溶液に、上記の酸で友は塩基を県
別して反応せしめて形成された塩全回収すればよい。

（２）生物学ｒＪ：Ｊ性質 １）酵素阻害活性 エスタテンＡおよびエスタチンＢの酵素阻害活性を以下
に示す。

酵素量　　　使用酵素量　基質　　　ＩＣ５゜濃度（μ
ｇ／−）（μ９蛋白Ｄ　　　　　　　　　エスタチンＡ
　　エスタチンＢパパイン　　　　　　　６０　　　沢
イン　　０．０２６　　　０．０２７フイシン　　　　
　　　　６０　　　た直ン　　０．０３９　　　　０．
０４１プロメライン　　　　　１００　　　　カゼイン
　　０．１４５　　　　０．１４５α−キモトリプシン
　　　　　２００　　　　　メトビイン　　　　）５０
　　　　　　　＞５０トリプシン　　　　１０００　　
　かピン　　＞５０　　　　＞５０ペプシン　　　　　
１００　　　か自ン　　＞ｓｏ　　　　＞ｓ。

サラに合成したエポキシ部ＤＬ体エスタテンＡのハハイ
ン阻害活性におけるＩＣ５゜は０．０２８８μ９２勺で
あシ、Ｌ体エスタチンＡの活性と同等のものであった。

酵素反応はすべて所定の方法に準じて測定した。

（尚、α−キモトリプシン、ペプシンは、ＰＬバイオケ
ミカル社製、トリプシンは、和光純薬社製のものを使用
した。） エスタチンＡおよびエスタチンＢは、トリプシンで代表
されるセリンプロテアーゼ及びペプシンで代表される酸
性プロテアーゼのカゼイン氷解活性を阻害することなく
チオール基がその活性発現に関与するパパイン、フィシ
ン、プロメライン等のチオールプロテアーゼの活性を特
異的に阻害する。

２）マウスでのＩｇＥ産生およびＩｇＧ産生に対する作
用 ＩｇＥ産生に対する作用は以下の方法に従って行なった
。

ＢＤＦ、糸雄性マウス（体重１８〜２２ｇ）ｋｌＷ５匹
とし、エスタチンＡ１エスタチンＢを被検薬とし、また
エスタチンＡ１エスタチンＢを全く含まないものをフン
トロールとし、それぞれを２００　ｍｙ／Ｋｇで別個の
群のマウスに腹腔的投与した。なおコントロールは１群
１０匹として行なった。被検薬投与２時間後、１０μり
卵白アルブミンを吸着した水酸化アルミニウム４〜を腹
腔的投与して免疫した。免疫、１４日後に採血し、ＰＣ
Ａ反応によって抗体産生量を求めた（　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ
　ａｎｄ　Ａｐｈｌｉｅｄ　ｌ［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４
８巻１６頁、１９７５年参照）。

すなわち、採血血清を各種濃度に希釈し、ウィスター系
雄性ラット（体重２００〜２５０り）の背部に成因注射
した。４８時間後に卵白アルブミン２ｍ９を１％エバン
スブルー生理食塩水１−に溶解し、これを１１ｎｔ静脈
内投与し、２５分後殺処分し、色素浸出血清境界濃度を
求め念。その結果を以下に示す。

ＰＣＡ抗体価 被検薬　　　　　　　　ＩｇＥ抗体価 エスタテンＡ　　　　　　　　（１００（１００（１０
０エスタチンＢ　　　　　　　（１００（１００（１０
０フントロール　　　　　　４００．　８００．　８０
０８００、　８００．　８００ １６００、　１６００．　１６００ ＩｇＧ産生に対する作用は、以下の方法に従って行った
。

ＢＤＦ”、糸雄性マウス（体重１８〜２２ｇ）を１群５
匹としエスタチンな９、エスクチンＢを被検薬とし、ま
たエスタチンＡ１エスタテンＢ′Ｊｔ全く含まないもの
をコントロールとし、それぞれ２００　ｍｙＡ９ｔ−別
個の群のマウスに腹腔内投与した。尚コントロールは１
群１０匹として行った。

被検薬投与２時間後に卵白アルブミン２―を等量の７０
インドコンプリート・アジュバントと混合し、その０．
２　ｎｄ！　ｋ　０．１ｗｒｅづつ背部皮下２ケ所に免
疫し、その２週間後に採血して間接赤血球凝集反応によ
シ抗体価を測定した。その結果を以下に示す。

被検薬　　　　　　ＩｇＧ抗体価 エスタチンＡ　　　１２８００．　６４５０．２５６０
０１２８００、１２８００ エスタチンＢ　　　　６４００，２５６００．１２８０
０２５０００、１２８００ コントロール　　１２８００．２５６００．２５６００
．１２８００．　６４５０１２８００、１２８００．１
２８００．１２８００．１２８００ノルルギー性疾患全
惹起するＩｇＥの産生は伸側するが正常な免疫反応に関
与するＩｇＱの産生は抑制しない。

３）急性毒性 エスタチンＡ及びエスタチンＢは、４ｏ。

〃１１０マウス腹腔内投与で何ら影響がなかった。

４）投与方法および投与量 本発明のエスタチン（エスタテンＡ１エスタテンＢ）の
投与形態は、経口、注射、直腸坐剤の何れでも良い。

注射剤を１４　ｇする場合は、エスタテンにｐＨ調整剤
、紛衝剤、安定化剤、賦形剤を添加し常法によシ凍結乾
燥を行ない、凍結乾燥注射剤を作る事ができる。”また
エスタチンにｐＨ１ｌＨ１剤、緩衝剤、安定化剤、等張
剤、局麻剤等を添］ＪＯし、常法によシ皮下、筋肉内、
静脈内注射剤を作る事もできる。

経口用固形製剤を調製する場合は、エスクチンに賦形剤
、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味
剤、矯臭剤を加え友後常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒
剤、散剤、カプセル剤等を作る事が出来る。経口液状製
剤を調製する場合には、本化合物に矯味剤、安定化剤、
緩衝剤、矯臭剤等を加えて、常法によりシ゛ロツプ剤、
ドライシロップ剤を作ることができる。

直腸生薬製剤を調製する場合には、エスタチンに賦形剤
、更に必要に応じて界面活性剤を加えた後常法によシ坐
剤とする事ができる。

エスクチンの投与量は症状及び治療目的によシ異なるが
成人では、１回エスタチンとして１０〜１０００〜ｆ：
ｉ日３回投与できる。

調製法 まず発酵法について述べる。

本発明のエスタテンＡ１エスタテンＢ−ｉ産生するに用
いられる微生物生産菌の菌学的性質は以下の通りである
。

上記菌株の菌学的性質 （１）各培地に′：、５ける生育状態 １）ツアペック寒天培地 生育は３０℃の場合速く、培養７日間で直径４８−５０
１１１１に達する。２６℃の場合遅く７−１３１゜菌叢
は平担でビロード状。分生子が形成されろてつれ粉状と
なる。周辺部はややくもの巣状（ａｒａｃｈｎｏｉｄ　
）。表面の色は褐色がかつ念オレンジ色（ｂｒｏｗｎｉ
ｓｈ　ｏｒａｎｇｅ　６Ｃ４）　０浸出液および拡散性
色素は出さない。裏面の色は褐色がかったオレンジ色（
ｂｒｏｗｎｉｓｈ　ｏｒａｎｇｅ　６ｅ４）。

２）麦芽汁寒天培地 生育は３０℃の場合非常に速く、培養７日以内に内径８
５絹のベトリ皿全面に達する。２６℃の場合３５　４５
喘。菌叢は平担であるが、気中山系の形成によシわずか
に綿毛状を呈する。

分生子ガ形成さ士しるにつれ粉状となる。周辺部はやや
くもの巣状。表面の色は灰色がかったオレンジ色（ｇｒ
ｅｙｉｓｈ　ｏｒａｎｇｅ　６Ｂ３　）　ｏ浸出液およ
び拡散性色素は出さない。裏面の色は灰色がかった黄色
（ｇｒｅｙｉｓｂ　ｙｅｌｌｏｗ　４Ｂ５　）　。

３）バレイジョブドウ糖寒天培地 生育は３０℃のｊゐ合非常に速く、培養７日間で６５−
６７Ｒに達する。２６℃の場合遅＜１１−１２１゜菌治
は平担でビロード状。分生子が形成されるにつれ粉状と
なる。周辺部はややくもの巣状。表面の色は褐色がかっ
たオレンジ色（ｂｒｏｗｎｉｓｈ　ｏｒａｎｇｓ　６Ｃ
４）　。ｉ出液および拡散性色〉先は出さない。裏面の
色Ｏ′よ淡褐色（ｌｉｇｈｔｂｒｏｗｎ　５Ｄ５　）　
。

（２）生理的詫性状 生育し得るｐｉｑ　　　２．４−８．２最適生￥ＩｐＨ
５，０７，５ 生ブｆし得る湿度　２５　４９℃ 最適生育温度　　３７−４３Ｃ （３）顕微鏡下における形態的特色 栄養菌糸は気中菌糸と基質＆糸とで大きさが異なる。気
中菌糸（−１，直径１−３４ｍ１無色、壁は滑面。基質
菌糸はｉｎ径５．５１ｔｍ−までになる。

分生子は分芽胞子形成法により形成される。

分生子は気中菌糸から直接形成されるか、または短い分
生子形成細胞の先端に形成される。時にはアンプル状に
膨らんだ細胞から１−４個形成される。連鎖はしない。

倒卵形ないし洋梨形、４、５−１０　Ｘ　Ｚ　５−５．
５　ｐｍ、無色ないし淡黄褐色、壁は滑面、時にわずか
に粗面、単細胞。

（４）菌の分離源と同定、寄託 本発明のＭ　４３２３菌株は沖縄県西表島の在役の土壌
から分離された糸状菌である。有性生殖をせず分生子を
形成し、菌糸は隔壁を持つことから不完全に属する。分
生子形成様式が分芽胞子形成型であり、分生子柄が形成
されないか、されても短い。分生子は菌糸から直接ある
いはアンプル状の細胞から形成され、単細胞である。

以上の特色から重囲はマイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉ
−ｏｐｈｔｈｏｒａ　）属に属するものと同定された。

マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　）
属に近い属にクリソスボリューム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ　）　Ｊｊｉがある。マイセリオフトラ（Ｍｙ
ｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　）は発芽胞子を形成するの
に対しクリソスポリューム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕ
ｍ　）は介接胞子または粉状胞子を形成することから区
別される。８種認められているが、褐色に近い集落を形
成し、生育適温が３７−４３℃と高く、好高温菌である
こと、分生子が淡黄褐色になる等の特色からＭ　４３２
３菌株はマイセリオフトラ・サーモフイーラ（Ｍｙｃｅ
　−１ｉｏｐｈｔｈｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ　
）と同定され、マイセリオフトラ・サーモフイーラＭ　
４３２３（Ｍｙｃｅ　−１ｉｏｐｈｔｈｏｒａ　ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌａ　Ｍ　４３２３　）と命名され、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８１３４　
（ＦＢＲＭ−Ｐ黒８１３４　）として寄託された。

（文中の色の標示はＫｏｒｎｅｒｕｐ、　Ａ、、　ａｎ
ｄ　Ｊ、　Ｈ。

Ｗａｎｓｃｈｅｒ、　１９７８．　Ｍｅｔｈｕｅｎ　ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｃｏｌｏｕｒ。

３ｒｄ　ｅｄ、、　Ｅｙｒｅ　Ｍｅｔｈｅｒ、、　Ｌｏ
ｎｄｏｎの標示法に従った。） なお菌株の同定は次の諸文献を参考して行なった。

ｖａｎ　Ａｒｘ、　Ｊ、　Ａ−＊　１９８１．　Ｔｈｅ
　Ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　Ｆｕｎｇｉ８ｐｏｒｕｌａｔｉ
ｎｇ　　ｉｎ　Ｐｕｒｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、４２４　ｐ
ｐ、Ｊ。

Ｃｒａｍｅｒ。

ｖａｎ　０ｏｒｓｃｈｏｔ、Ｃ，Ａ、Ｎ、、　　１９７
７、Ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ
、　　Ｐｅｒｓｏｏｎｉａ　９：４０１−４０８０また
本発明のエスタチンを産生ずるための培養条件としては
、一般に３０℃付近で、通常３〜７Ｈ間培養を行なえば
よい。

さらに本発明に用いられる培地としては、例えば以下の
各培地成分があげられる。

カビの生育に適し、エスクチンを生産し得るものであれ
ばどのような培地でもよい。例えば炭素源としてはグル
ツース、フラクトース、マルトース、シュクロース、ラ
クトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉、グリセ
リン、ソルビトールなどの糖類および大豆油等の植物性
油脂類が用いられる。

窒素源としては、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、カゼイン、大豆粉、綿実粉、ＣＡＬ。

麦芽エキス、アミノ酸、尿素、アレモニウム塩類、硝酸
塩等が用いられる。

その池、リン酸カリウム、カルシウム、マグネシウム、
ナトリウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の無機塩
類、ビタミンＢ１パントテン酸カルシウムなどのビタミ
ン類などの微量栄養素を適宜添加することもできる。

培養にあたっては培地は固体でも良いが、通常は液体培
地による振盪培養又は通気攪拌培養が用いられる。

さらに培養後、本発明のエスタテンＡ１エスタテンＢを
採取するに当っては、例えば以下の手段によって得られ
るものである。

本物質は主として培養七ｐ液中に存在するので培養後、
菌体を除去したプ戸液を吸着剤に吸着および脱離させる
方法で好収率で採取できる。吸着剤としては、活性炭、
非イオン性吸着樹脂及びイオン交換樹脂などが使用でき
る。例えばエスタチンは、活性炭に吸着され、５０％ア
セトン溶液で溶出する。また、アンバーライトｌＲ１２
０Ｂ（ｆ（＋型）に吸着され、アンモニア水で溶出する
。

更に精製する場合には、シリカゲル、活性アルミナ−１
活性炭、非イオン性吸着樹脂による吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフ
ィー、セルロース等てよる分配クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過担体によるゲル濾過、アルキル基結合シリカゲル
による逆相分配クロマトグラフィー等、通常の有機物質
を分離精製する手段を適宜組み合せて゛情調できる。

より具体的には、シリカゲル、アルミナなどの吸着剤金
詰めたカラムに粗物質を注入し、吸着させた後に、酢酸
エチル：メタノール：水、クロロホルム：メタノール：
水、アセトニトリル；水すどの混合溶媒を用いて溶出す
る。また脱塩、脱シリカゲル等は、セファデックスＧ１
５全用いたゲル口過法によって行うことも出来る。

次て合成法の一例について述べる。

（式中Ｗは水素原子または接触還元にょシ脱離される例
えばベンジル、ｐ−ニトロベンジル基金含む核に置換基
を有してもよいベンジル基の如き保護基で保護された水
酸基を意味する。Ｂ１はけん化によシ脱離される、例え
ばメチルま几はエチル基等の低級アルキル基の如きエス
テル残基、または、接触還元により脱離されるベンジル
、ｐ−二トロベンジル基を含む核に置換基金有してもよ
いベンジル基の如きエステル残基を意味する。）の合成 上記の化゛合物は下記の方法で製造することができる。

コノ反応は溶媒、例えばジメチルホルムアミド中ジエチ
ルホスホロシアニデート、トリエチルアミンを加え行な
われる。（８）のＤＬ体は市販のものが利用できる。Ｌ
体または０体はに、　Ｍｏｒｉ等Ｔｅｔｒａ−ｈｅｄｒ
ｏｎ　３６．８７　（１９８０）に記載の方法にょ〕合
成できる。

一般式（９）かけん化により脱離するエステル残基金有
する場合、メタ／−ル中、ＫＯＩ（１乃至１．１等量に
よりりん化して得る。反応時間Ｆｉ、３時間であ〔Ｉ〕 一般式α０）または接触還元により脱離するエステル残
基を有する一般式（９）ヲメタノール、酢酸、水に溶か
し、炭素担体パラジウムｋＩＩＤえ、水素接触還元によ
り得る。反応時間は１０乃至１５時間である。また、プ
ラチナあるいは炭素担体プラチナ等を用いてもよい。

〔４〕参考までに一般式（７）の合成法を示せば下記の
通りである。

上記の化合物は下記の方法で製造することができる。

この反応はエタノール等低級アルコール中１．１等量の
化合物（２）に溶かし、トリエチルアミンを加え３時間
還流して得られる。化合物（１）は市販のもの化合物（
８）を２５％ＨＢｒ酢酸溶液で室温にて３０分反応させ
て得る。代わりにＩＮＦ　、Ｎａ　−ＮＨ，ｋ用い上記
の化合物は下記の方法で製造することかでこの反応はそ
れぞれ等モルづつ用い、１，２−ジメトキシエタン中、
室温で２〜６時間行なわれる。

■−一般式７）の合成 一般式（６１９９％蟻酸と室温で２時間反応させて得る
。蟻酸の代わりにＨＣ７、Ｈ２ＳＯ４などの酸を用いて
もよい。

目的物質の検定は、抗パパイン活性、シリカゲルＴ、Ｌ
、Ｃ，等を用い坂口反応による呈色反応、あるいは、過
マンガン酸カリウム脱色反応等によシ行なう。

なお本発明のエスタチンの検定方法としては、以下の通
りである。

酵素阻害剤エスタチンＡおよびエスタチンＢＵ、そｈぞ
れ抗ハハイン活性を有するため、この作用に基づいて定
量が可能であシ、培養液からのエスタチンＡ１エスタチ
ンＢの抽出、精製、単離などの目的に利用することが出
来る。定量法を以下に記す。

５ｗＭＥ［ＴＡ浴溶液溶解した０、０４Ｍシスティン溶
液（ｐＨ６，８）　０．２５　ｆｎｔＩＣ０，０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，８）にて作製したパパイン溶液０
．２　ｔｄ　（６０μり蛋白量、ベーリンガーマンハイ
ム社製）、同緩衝液０．３５−および各種濃度の阻害剤
（エスタチン人および、又はエスタチンＢ）０．２１ｎ
ｔ’ｉ混合した溶液を４００１０分間ブレインキュベー
ションした後、１．５％カゼイン溶液（０，０５Ｍ）リ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，８）　４−を加え、４０℃、１５
分間反応後、１．１　Ｍ　）　＋７クロル酢酸２７！を
加え反応を停止させた。室温１時間放置後、３５００　
ｒｐｍ、　１０分間遠心し、トリクロル酢酸可溶画分の
２８０　ｍμに於ける吸光度（Ｓ）を測定する。同様に
阻害剤無添加の時の２５０ｍμに於ける吸光度（Ｂｌを
測定し、次式によって阻害度を求めた。

阻害度（１）−Ｂ　−Ｓ／ＢＸ　１００阻害度５０％の
時の阻害剤濃度ＩＣ，。を求めた。

フ・ｆンン（６０μり蛋白量、ペーリンガーマンハイム
社製）プロメライン（１００μｑ蛋白量、ベーリンガー
マンハイム社製）活性も同様の方法で行った。

実施例 実施例１ マイセリオフトラ・サーモフイーラＭ４３２３株（Ｍｙ
ｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ　
）　（微工研菌寄第８１３４号）の斜面培地から一白金
耳をグルコース１％、デキストリン１％、酵母エキス０
．５％、カゼイン氷解物０．５％、炭散カルシウム０．
１％、セライト１％を含む培地（ｐＨ６，５）ｉｏｏ−
を、５００ＷＬｔ容三角フラスコに分注し、１２０℃、
２０分間オートクレイプ滅菌したものに接種し、３０℃
、４日間振盪培養し、これ全種母とした。この種母を予
め滅菌しておい九グルコース２％、ペプトン１％、Ｃ３
Ｌ１％、リン酸第−カリウム０．２％、硫酸マグネシウ
ム０．１％を含む培地（ｐＨ６，５）　２０　Ｊを入れ
た３０１容ジヤーフアメンターに移植接種し、毎分通気
量２０１１毎分回転数２００回転、内圧０．８気圧の柴
件下３０℃、５日間培養した。この様にして得た培養物
２０１（ｉ？濾過して、培＠ろ液］８ノを得喪。

実施例２ 実施例１で得られた培養う戸液１８１は、６Ｉ止Ｃノで
ｐＨ６，５Ｋ調整し、予めカラムに詰めたカーボン１．
５１に吸着させ、約１０ノの水で充分カラムを洗浄後、
７０％アセトン水溶液にて溶出し、５０〇−ずつ分画を
行なうと、フラクション＆３〜＆１０にエスタチンＡ及
びＢを含む抗パパイン活性の大部分が認められた。分画
ノぢ３〜Ａ　１０　’ｆｆｆｆ下濃縮し、約５００ｍ！
とじ、強酸性陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ−１
２０Ｂ（ｌ（＋型）５００カラムに吸着させた。約３ノ
の水で充分カラムを洗浄後、ＩＮアンモニア水で溶出を
行ない２００　ｍｊずつ分［１−行った。抗パパイン活
性を示す大部分のエスタテンＡ及びＢは、７ラクシヨン
Ａ７〜ｌ＆１８に含まれていた。この両分を減圧濃縮し
、約５０ｍ１とし、ｐＨ６，５に調整した。この濃縮液
を強塩°基性“陥イオン交換樹脂ダウエックス３ＡＣＣ
１−型）の４００ゴカラムにかけ、水にて溶出を行ない
２０りずつ分画した。抗パパイン活性を含む應１１〜屋
６５両分を減圧濃縮し粗物質６２０〜を得た。

実施例３ 実施例２において得られた粗物質６２０　ｍｙを２０−
の３０％メタノール溶液に溶解し、２０りのシリカゲル
粉末を加え良く攪拌混合し７、減圧下メタノール及び水
分′！ｉ−除去後予め、酢酸エチル：メタノール：水（
１０：１０：１）の溶媒にて作製したシリカゲルカラム
３０〇−上に注入し、同展開溶媒にて溶出を行ない、１
６９ずつ分画を行った。

７ラクシヨン、ぢ５７〜Ａｌ２Ｏ及びフラクション、４
５１５１〜屋１９９に拉パパイン活性が認められた。７
ラクシヨン＆５７〜４１．２０を減圧下ｍ縮するとエス
タチン人の粗結晶４４．１　ｍｙが得られた。

またフラクションＡ１５１〜應１９９を減圧濃縮すると
エスタチンＢの粗結晶２６．７〜が得られた。

実施例４ 実施例３で得られたエスクチンＡの粗結晶４４．１９を
１０ｍＡの熱水に溶解しセファデックスｑ−１５の１３
００−力、ラムに注入し水で溶ｔＨヲ行い１０ノずつ分
画を行うとフラクション４７９〜Ａ８７にエスタチン人
の大部分は溶出されていた。このフラクションを減圧濃
縮すると、エスタチンＡの白色針状結晶が生じ、この結
晶をグラスフィルター上に集め、減圧乾燥し純粋なエス
タチンＡの白色針状結晶３３■を得た。

同様に実施例３で得られたエスタチンＢの粗結晶２６．
７〜ｆｔ１０−の熱水に溶解し、セファデックスＧ−１
５の１３００ｍ／のカラムに注入し、水で溶出を行ない
１０ｇづつ分画を行うと、フラクション忍９０〜Ａ１０
１にエスタチンＢの大部分は溶出された。このフラクシ
ョンを減圧濃縮するとエスタチンＢの白色・針状結晶が
生じ次。この結晶をグラスフィルター上に集め減圧乾燥
し、純粋なエスタチンＢの白色針状結晶１８．３即をｍ
た。

実施例５ １−二トログアニル−３，５−ジメチルピラゾール（２
）の合成 ニトロアミノグアニジン４．８７　ｇ？沸騰水９３−に
溶かし、酢酸０．９４−を加え、次いでアセチルアセト
ン４．８７ｄｔ−滴下し、１００℃にて２時間攪拌し、
放冷した。水冷後析出した結晶（２）全濾取し、エタノ
ール−水より再結晶した。

４．７８り（収率６４％） Ｍａｓｓ（ＣＩ−７ｇｏＢｕ）　１８４（ＭＷ”）融点
１２５−１２６℃ ＮＭＲ（６０ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ、）　Ｚ２（ａ、　３
Ｈ，ＣＨ，）、　２．６（、ｃ、　３Ｈ，ＣＨ，）、　
６．１（ｂｒ、　ｌ）（、−ＣＨ）１８〜９　（ｂｒ、
　２Ｈ。

甜×２） 実施例６ （３）の合成 市販の化合物ＣＢＺ−ジアミノブタン塩酸（１）２５９
ｍｙと実施例５で得られた化合物（２）　２０１〜（１
，１等量）をエタノールｚ６−に溶かし、トリエチルア
ミン１４０μｉ１等ｉｔ）を加え、３時間攪拌還流した
。放冷後、−夜冷蔵置に放置し、白色結晶を濾取し、冷
エタノールで洗浄した。エタノールよシ再結晶し、化合
物（＋）　１４４１ｎ９を得た（収率４７％）。

融点１２３−１２４５℃ Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　３１０（ＭＨ”）ＮＭＲ（１００
ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ、＋’ＤＭ８０　　ｄ６．）　１．
５７（ｒｎ、　４Ｈ。

ＣＨ２Ｘ　２）、　３．０〜３．３　（ｍ、　４Ｈ，Ｃ
Ｈ，Ｘ　２）、　５．０７（ｓ、　２Ｈ。

ＣＨ２ｐｈ）、　６．５２（ｂｒ、　ＩＨ，ＮＨ）、　
７．３３（ｓ、　５Ｈ，ｐｈ）、７．６５（ｂｒ＃　２
Ｈ，ＭＨ２） 実施例７ 成 実施例６で得られた化合物（８）１１２１Ｗｔ−２５％
ＨＢ、／酢酸溶液１−に溶かし、室温にて３０分間攪拌
した。エーテルをＢΩえ沈澱させ、上清を２回デカンテ
ーションした。残渣をメタノール−エタノールよシ再結
晶し濾取した。冷メタノール−エタノールで洗浄し白色
固体を得た。

８１ダ（収率８８％） 融点１７３−１７５℃ Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　１７６（■ｒ） ＮＭＲ（Ｚｏｏ　ＭＨｚ、　　ＤＭＳＯ−ｄ６）　　１
．５３（ｍ、　４に４．　ＣＨ２Ｘ　２）２．６〜３．
０（ｍ、　２Ｈ，ＣＨ，）、　３．ＯＮ３．３（ｍ＋　
２Ｈ，ＣＨ２）＋７．７２（ｂｒ、　ＭＨ２）　、　７
．８５（ｂｒ、　ＭＨ２）　、　　７．０〜＆０（ｂｒ
、　ＮＨ）実施例８ Ｂ　ＯＣ−Ｌ　−ｐｈｅ−Ｏ８ｕ（５ａ）　７０７　ｍ
ｙｋ　１，２、−ジメトキシエタン６−に溶かし、水冷
下実施例７で得られた化合物（４）　５００〜、トリエ
チルアミン２７２μｌｋ水１−に溶かしたものを加えた
。

室温にて６時間攪拌した。小容量まで減圧濃縮し、残渣
に２５％Ｎａ、Ｃｏ、水溶液を加え、酢酸エチルで抽出
を３回行なった。酢酸エチル層をＩＭ−り−１−ン酸、
次いで食塩水で洗浄した。ワットマン１ルｓ濾紙を通し
減圧濃縮し、残渣をシリカゲル力５　Ａ　（ＣＩ（、Ｃ
Ａ！、　：　ｃＨ，ＯＨ−４０：　１−）　２０　：　
１　）にて精製した。減圧濃縮し白色泡状物質を得た。

７１０〜（収率８６％） Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　４２３（ＭＨ”）境但（６０■ｚ
　ＣＩＸ：Ｉｓ）　１．３〜１．６（ｒｎ、　１３Ｈ−
ｃ（Ｃ）（、）、。

ＣＨ２ｘ　２）、　２．８〜３．５（ｍ、　６Ｈ，ｐｈ
ＣＨ２，（ＣＨ２）　Ｘ　２）。

４．５（ｍ、　　ＩＨ，、ＣＨ）、　　５．６（ｂｒ　
ＩＨ，ＮＨ）、　　７．２（ｓ、　　５Ｈ。

ｐｈ）　６．８〜７．１，７．５〜＆５（それぞれｂ１
３Ｈ，ＮＨＸ実施例９ Ｂ　ＯＣ−０−ｂｚｌ　　Ｔｙｒ−Ｏ８ｕ　９１５　ｍ
ｙｋ　１，２−ジメトキシエタン９−にとかし、氷冷下
品トロアグマチン・Ｈ８ｒ５００＃９、トリエチルアミ
ン２７２μＪｔ−水１−に溶かしたものを加え室温にて
終夜（１５時間）攪拌した。小容量まで減圧濃縮し、残
渣に２５％Ｎａ、Ｃｏ、水溶液を加え酢酸エチルにて３
回抽出した。酢酸エチル層をＩＭ−クエン酸、次いで食
塩水で洗い、ワットマン１　ｐｓ橿紙を通し減圧濃縮し
、残渣をシリカゲルカラム（ＣＨＣｌ　　：　ＣＨ，０
Ｈ−４０：　１→２０　：　１　）にて精製し、減圧濃
縮して白色泡状物質を得た。

９２２叩（収率８９％） 、　Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　５２９（１１ｉ［（”）ＮＰ
ｄＦＬ（１００ｂｌｋｌｚ　ＣＩ）ＣＡｓ）　、１．３
８（ｓ、　　９Ｈ２（ＣＨｓ）　ｓ）　。

１．４９．１．７９（それぞれｍ、　２Ｈ，２Ｈ，（Ｃ
Ｈ，）　Ｘ　２）−２，９５（ｄ、　２Ｈ，ｐｈＣＨ２
）、　Ｚ１〜２２−４（、４Ｈ，ＣＨ，Ｘ　２）４．２
８（ｓｅｘｔｅｔ、　ＩＨ，Ｇ（）　５．０２（ｓ、　
２Ｈ，Ｏ−ベンジルのＣＨ２）、　５．２ｏ（ｃｔ、　
１）（、ＮＨ）、　６．４３（ｔ、　ｔＨ，ＮＨ）。

６．９２（ＡＢｑ、　４Ｈ，ＣＨ，ｐｈＯＨ）、　７．
３８（ｍ、　　５Ｈ，ｐｈ）、　７．５６（ｂｒ、　２
Ｈ，ＮＨ，）　８．０〜８．５（ｂｒ、　ＩＨ，ＮＨ）
実施例１Ｏ Ｎ　−Ｌ−ｙ　ｘニルアラニル−ＮＧニトロアクマ実施
例８で得られた化合物（６ａ）２００〜を９９％＠酸２
−に溶かし、室温くて４時間攪拌し九。水浴の温度を３
０℃以下に保ちつつ減圧濃縮し、残渣をダウエックス５
０（Ｈ”）に充填した。水で洗浄し、次いでＮＨ４ＯＨ
／エタノールで溶出、減圧濃縮してガラス状物質を得た
。

１５４雫（定量的） Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　３２３（Ｍ）（”）ＮＭＲ（１０
１町ｚ　ｌ侶ｏ　　ａ６）　、１．３８（ｍ、４Ｈ，Ｃ
Ｈ，Ｘ　２）２．６〜３．４（ｍ、　７Ｈ＋　ＣＨ２Ｘ
　２．　ＣＨ２，ＣＨ）　７．２１（ｓ、　５Ｈ。

ｐｈ）、　　７．８（ｂｒ、　５Ｈ，ＮＨ，ＮＨ，）実
施例１１ 実施例９で得られた化合物（６ｂ）９００ｍ９を９９％
蟻酸１５−に溶かし、室温にて２時間攪拌した。水浴の
温度を３０℃以下に保ちつつ減圧濃縮Ｌ、ｆｉ渣にエタ
ノール−メタノールを加え再度減圧濃縮した。残渣を水
（Ｃ溶かしＮ　−ＮａＯＨでアルカリ性とし、クロロホ
ルムにて２．３回抽出した。水洗後ワットマン１ｐｓｅ
通し減圧濃縮し、ガラス状物質を得た。

０．６１ｇ（収率８４％） Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　４２９（ＭＨ”）ＮＭＥＬ（１０
０ＭＨｚ　ＣＤＣ）ｓ）　１．５２（ｍ、　４Ｈ，ＣＨ
２Ｘ　２）　２．５５（ｄｄ、　ＩＨ，ＣＭ）、　３．
０〜３．７　（ｍ、　６Ｈ，ＣＨ，Ｘ　２．　ｐｈｉ（
、）５．０３（ｓ、　２Ｈ，０ＣＨ２ｐｈ）　６．９０
（ＡＢｑ、　４Ｈ，０ｂｚｙｌ）。

７．９０（ｒｎ、　　５Ｈ，ｐｈ）＋　　７．６（ｂｒ
、ＭＨ２，ＮＨ）、　　８．４（ｂｒ、ＮＨ）実施例１
２ ジカルボニルオキシラン−２−カルボニル）−Ｌａ）の
合成 実施例１０で得られ゛た化合物（７ａ）３２０〜、ＤＬ
−エチル水素トランス−エポキシ−コハク酸１８０〜ｔ
−ジメチルホルムアミド４−に溶かし、水冷下、ジエチ
ルホスホロシア９デート２００μ！、トリエチルアミン
１８０μｌを加え室温にて４時間攪拌した。酢酸エチル
を加えて希釈しＮ　−ＭＣＩ　。

飽和ＮａＨＣＣ）、　、食塩水で順次洗浄ｊ７酢酸エチ
ル層ｔ−ＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧濃縮して結晶を得
、濾取しエーテルで洗浄した。

３１０９（収率６７％） Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　４６５（ＭＨ”）ＮＭＲ（１００
ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ、　　ＤＭＳＯ−ｄ、）、　１．２
〜１．６（ｍ。

（ｑＸ２．２Ｈ，Ｃ（Ｘす五ＣＨ，）、　４．６０（ｄ
ｄ、　ＩＨ，ＣＨ）、７．２４（ｓ＋　５Ｈ＋　ｐｈ）
　７．２〜７．６（ｂｒ、ＮＩ（、ＭＨ２）実施例１３ Ｎ　　（Ｎ　　（Ｄ　　　　　’　　３．ト５ンスーカ
にボキシオキシランー２−カルボニル）−Ｌ−フエの合
成 実施例１２で得られた化合物（９ａ）５１〜をメタノ−
／Ｉ／　１　＠ｌ　ＩＩＣ溶かし、水冷下、２　Ｎ　−
ＫＯＨ水溶液５３μ！（１等量）加え７１：。室温で３
時間攪拌し、水で希釈してダウエックス５０（Ｈ”）に
充填し、Ｈ２Ｏ−エタノールで溶出した。ｐＨ試験紙で
酸性を示し、紫外線吸収のある部分を集め減圧濃縮し残
渣にエーテルを加え渭取し無色粉末を辱た。

４７１１ｔｇ（定量的） Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　４３７（ｈｌ）ｒ’）ＮＭＲ（１
００ＭＨｚ、　画ｓｏ　　ｄ６）、　　１．２〜１．５
（ｍ、　４Ｈ，ＣＨ２Ｘ　　２）、　　２．．８〜３．
２（ｍ、　　６ｉ（、Ｃ［（２Ｘ　　２．　　ｐｈ−Ｃ
Ｈ２ン、　　３．３２（ｂｒ、　ｑ、　ＩＨ，Ｃ）ｌ）
、　７．２４（ｓ、　５ＨＩ　ｐｈ）、　７．５〜８．
６（ｂｒ。

Ｎｉｌ、　Ｎｌ（、） 実施例１４ Ｎ−Ｎ−（Ｔｈ及１Ｌ山−−３−トランスーカル実施例
１３で得られた化合物（１０ａ）１．０９を酢酸４　ｉ
、　Ｎ２０３　ｆｄに溶かし、炭素担体パラジウム（１
０％、エンゲル／％ルト製）全触媒量加え、さらてメタ
ノール４０艷を加え、室温水素雰囲気下Ｖよげしく攪拌
した。６時間後、触媒を濾去し、濾液化威圧濃縮し、残
渣全水に溶かし、活性炭カラム（２５〜３０　ｔｈｔ　
）に充填し水洗した。中性の溶出液を確認してから５０
％アセトン水溶液で溶出しン’Ｃ０坂口反応（→の部分
を集め、減圧濃縮して結晶を寿だ。エタノール−水より
再結晶した。

２７４・ダ（収率３１％） 回置大正合成全行い約６ｖを得た。

ＩＲ，第５図（臭化カリ錠剤法）に示す通シ、ＮＭｉ３
．　（１００ＭＨｚ、　Ｄ２０−　ＤＣＩ）　１．１〜
１．４　（ｍ、　４Ｈ，、ＣＨ２ＩＨ，Ｃ１１）　、　
７．２５　（ｓ　、　５１−１．　ｐｈ）実施例１５ Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−３−）ランス−エトキシカルの合成 実施例１０で得られた化合物（７ａ　）　１３．９７　
’ｉ、Ｌ−エチル水素）ランス−エポキシコハク１１２
７．６４りをジメチルホルムアミド１５０ｄに溶かし、
次いでジエチルホスホロシアニデート＆５５ｄｉ加え九
。この溶液を氷冷し、トリエチルアミン７．８６　ｍを
滴下した。次いで室温にて４時間攪拌し比。反応混合液
を酢酸エチルで希釈しＮ　−ＨＣノ、飽和ＮａＨＣＯ３
、食塩水で順次洗浄し念。有機層はＭｇ８０゜で乾燥後
、減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルよシ結晶化した。

１５．２８２（収率７６％） 〔α）”　＋　４ａ００°（Ｃ’　０．５０２．メタノ
ール）Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　ｍ／ｅ　４６５（ＭＨ”）
α）ＯＧ（、ｃ）Ｉ、）、　１．２〜１．６（ｍ、　４
Ｈ，Ｑ（２Ｘ２）、　ＺＪ〜３．３（ｍ、６Ｈ９ＣＨ２
Ｘ　２．ｐｈＣＨｚ）、３．３２（ｄ、ＩＨｌＪ−１，
７１′・蛎、）・＆６５（ｄ・１Ｈ・Ｊ−１，７Ｈｚ・
さ７）・４．２１（ｑ、　　２．Ｈ，Ｃ００ＣＦ（２Ｃ
Ｈ，）、　　４．６０（ｂｒ、　ｄｄ、　　ＩＨ，ＣＨ
）７．２２（ｓ、　５Ｈ，ｐｈ）、　７．６〜８．４（
ｂｒ、　５Ｈ，ＮＨ，ＭＨ２）実施例１６ ｂ）の合成 実施例１工で得られた化合物（７ｂ）７．０ｇ、Ｌ−エ
チル水素トランス−エポキシコハク酸２．８７り、ジエ
チルホスホロシアニデート３．０３ｄｉジメチルホルム
アミド７０　ｒｄに溶かし、トリエチルアミン２．５０
ｍ／を滴下した。実施例１５同様の後処理ヲシ、サラＫ
　ＣＨＣｅ、　：　Ｃ１１−Ｉ、ＯＨ−５０：　１　テ
ｇ出し、シリカゲルカラム精製を行った。

７、６０９　（泡状）（収率８２％） 〔α〕、、’　＋　４５．４４°（Ｃ：１．１２．メタ
ノール）Ｍａｓｓ’（ＦＡＢ）　ｍ／ｅ　５７１　（Ｒ
４Ｅ（”）□ Ｎ１ａ（ＣＩＸＪ、）　ａ　　　、　１．２６（ｔ、　
３Ｈ，Ｃ００ＣＨ，Ｃ）４．、）。

ｐ　ｐｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−１，２−１，６（ｍ、　４Ｈ，ＣＨ２Ｘ２）、　
　２．９−３．３（ｍ、　　７Ｈ，ｐｈｃｉ４゜Ｃ）Ｉ
、Ｘ２．　習Ａ（）、　ａ°６６（ｄ、　ＬＨ，１と７
）、　４．１６（ｑ、　２Ｉ４．　Ｃ００ＣＨ，Ｃｌ−
１，）、　４．６６（ｂｒ、　ｑ、　ＩＨ，ＣＦＩ）、
　５．００（ｓ、　２Ｈ，０ＣＥ（、ｐｈ）　６．９２
（ＡＢｑ、　４Ｈ，芳香族）　７．３６（ｓ、　　５Ｈ
，ｐｈ）　７．０　８．５（ｂｒ、ＮＨ，ＭＨ２）実施
例１７ 実施例１５で得られた化合物（９ａ）１４０９をメタノ
ール２８０ｍに溶かし、水冷下２Ｎ−ＫＯＦ（１５，２
−を滴下した。室温で３時間攪拌した後、水８０ゴを加
え希釈した。この溶液をダウエックス５０（Ｈ”）　Ｋ
チャージし、Ｈ２Ｏ−エタノール（約５０％）で溶出し
た。溶出液を減圧濃、ｆｄ　Ｌ、残渣をエタノール−酢
酸エチルより結晶化した。

１２．１１り（収率９２％） Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　ｎ１／ｃ　４３７ＱＪ”）’Ｉ’
ＭＳ Ｎｌｕ［Ｒ，（［０−ｄ　６）δ　　、　１．２−１５
　（ｍ、　４Ｈ，ＣＨ，Ｘｐｎ１ ２）２．８−３．２（ｍ、　６Ｈ，ｐｈＣＨ２，ＣＨ，
Ｘ　２）　３．３２（ｄ、　ＩＩ−Ｉ。

ＣＨ）　７．２４（Ｓ、　　５Ｈ，ｐｈ）　７．５−８
．６　（ｂｒ、　ＮＨ，ＭＨ２）夕旅例１８ の合成 実施例１６で得られた化合物（９ｂ　）　０．６８７　
ｇをメタノール１２ゴに溶かし、水冷下に２Ｎ−ＫＯ８
０，６−を滴下する。室温で３時間攪拌後５０％酢酸で
酸性にＬ７沈澱ざぜた。濾取後水洗し２、ゲル状物質を
得た。

０．４５り（収率７０％） Ｍａｓｓ（［ｉ’ＡＢ）　ｍ／ｅ　４９８（へｌ”−４
５）□ ＮＭＲ■に／１８０−ｄ、）δ　　、　１．２−１．６
　（ｍ、　４Ｈ，ＣＨ２Ｘ　ｐｔｎ ＣＨ）、　５．０５（ｓ、　２Ｈ，０ＣＦ（、ｐｈ）、
　７．００（ＡＢ（１，４Ｈ，芳香族）　、　７．４０
（ｍ、　５Ｈ，ｐｈ）　７．８−８．６（ｂｒ、、ＮＩ
（、ＮＩ（２）実施例１９ Ｎ　−（Ｎ−（Ｌ−３−トランスーカルボキシオ実施例
１７で得られ良化合物（１０ａ　）　１１．２８りをメ
タノール１６００　ｄ、酢酸１６０−１水１２０ゴの混
液に溶かし、１０％炭素担体パラジウムを加え、水素雰
囲気下室温で終夜攪拌した。触媒を濾去し、濾液を減圧
濃縮した。残渣を水に溶かし、クロマト用活性炭（ｗａ
ｋｏ　）約２５０ｔｎｔにチャージし、中性になるまで
水洗し、次いで５０％アセトン水溶液で溶出した。溶出
液を減圧濃縮して結晶を得た。

６．２２９Ｃ収率６２％） 〔α）２４＋　４７．３７°（Ｃ：０．６１．　Ｈ２Ｏ
）ＩＢＪ第３図に示す吸収ピークと一致した。

Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　ｍ／ｅ　３９２（ＭＨ”）ＭＳ ＮＭＲ（Ｄ、０−　ＤＣＩ＞　、δ　　、　１．１１．
３　（ｍ、　４Ｈ，ＣＨ２，Ｘ９９ｍ １、Ｈ，ＣＨ）　　７．０−７．３（ｍ、　　５Ｈ，ｐ
ｈ）実施例２Ｏ Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−３−１ランス一カルボキシオ実施例１
８で得られた化合物（１０ｂ）５．２８ｇを酢酸：水：
メタノール（２：１．５：２０）７００　ｍｌに溶かし
、１０％炭素担体パラジウムで水素添加し、１５時間攪
拌した。触媒を濾去し、熱水−エタノールで抽出をくり
返した。

１、２１　ｇ（収率３１％） 〔α〕ｆｉ　＋　４５．２５°（Ｃ：０．１３７．０．
ＩＮ）ＩＯＡりＩＲ第４図に示す吸収ピークと一致した
。

Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）　ｍ／ｅ　４０８（ＭＨ”）ＮＭＲ
（Ｄ、Ｏ−ＤＣＪ）δ藺、　１．２１．４（ｍ、　４Ｈ
，ＣＨ，Ｘ９９ｍ ２）、　２．９−３．２（ｍ、　６Ｈ，ＣＨ２Ｘ　２．
　ＨＯｐｈＣＨ，）、　３．４８ＩＬＴ、　ＣＨ）　６
．９６（ＡＩ’３ｑ、　／＋８．　芳香族）発明のＩｆ
Ｊ果 エスタチ′ンはチオール基がその生理活性発現に関与”
ｒ−ルバパイン、フィシン、プロメライン等のチオール
プロテアーホ、筋肉カルシウム依存性中性チオールプロ
テアーゼの活性を強く阻害する。

従って、エスタチンＡおよびエスタチンＢは炎症、筋ジ
ストロフィー等の治療に有効である可能性がある。また
、Ｉｇｇ抗体産生は抑制するが、Ｉｇ（３抗体産生は抑
制しない。従ってエスタチンＡ’ｌｉ３よびエスタチン
Ｂは抗アレルギー作用を有する可能性が考えられる。

このように、チオールプロテアーゼ阻害剤であるエスタ
チンＡおよびエスタチンＢは医薬あるいは研究用試薬等
としての利用が期待できる。

本発明により合成法で天然物と同じ光学活性なエスタチ
ンＡ、Ｂが多量に得られるようになシ、今後の生理活性
評価に大いに役立ち、かつ工業的生産に結びつくものと
期待される。又、本工程を用いることによりエスクチン
類縁化合物の合成が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第一１図はエスタチンＡの水中における紫外部吸収スペ
クトル図、 第２図はエスタチンＢの水中における紫外部吸収スペク
トル図、 第３図はエスタチン人の赤外部吸収スペクトル図、 第４図はエスタチンＢの赤外部吸収スペクトル図、 ８Ｊ５図はエポキシ１ｔ）Ｌ体のエスタテンＡの赤外部
吸収スペクトル図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中Ｒは水素原子または水酸基を意味する）で表わさ
   れる物質またはその薬学的に許容できる塩もしくはその
   水和物。