DD253641A1 - Verfahren zur synthese von chymosin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, durch welches das fuer die Kaeseherstellung benoetigte Chymosin nicht mehr aus dem Labmagen vo Kaelbern gewonnen, sondern in beliebiger Menge synthetisch produziert werden kann; dabei soll sich aber das synthetisierte vom natuerlichen Chymosin in seiner chemischen Struktur nicht unterscheiden. Dazu wird ein isoliertes Chymosin-Gen in ein Promotorplasmid eingebaut, dass in mehreren Stufen ein transformierbares Plasmid entsteht, welches in einen passenden Bazillus-Stamm transformiert wird. Nach submerser und aerober Vermehrung der Wirtszellen und Lyse der gewonnenen Zellmasse kann ein aktivierbares Prochymosin gewonnen werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Chymosin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das als Milchgerinnungsenzym unentbehrliche Chymosin wird aus dem proteolytisch unwirksamen Prochymosin gewonnen, das seinerseits^ie allgemein bekannt und gebräuchlich₍aus dem Labmagen junger Wiederkäuer isoliert wird. Es steht deshalb nur im begrenzten Umfang zur Verfügung, und seine Herstellung auf diese Weise ist umständlich und teuer. Man hat deshalb seit langem versucht, das Prochymosin (oder ein gleichwertiges Pseudochymosin, dem einige N-terminale Aminosäuren fehlen, ohne daß sich dieser Mangel negativ äußern würde) auf anderem Wege zu gewinnen. Es ist naheliegend, das Enzym in einem natürlichen, aber gentechnisch entsprechend veränderten Mikroorganismus zu synthetisieren, wie dies in der PCT-Anmeldung 8500382 bzw. den EP-Patentanmeldungen 133756 und 154351 bereits beispielsweise vorgeschlagen worden ist, die sich aber auf die Darlegung einer entsprechenden Aufgabenstellung beschränken und das zugehörige neue Verfahren nur in seinen Grundzügen beschreiben. Dies ist für die Durchführung der Synthese nicht ausreichend, weil eine produktive Sekretion bzw. der proteolytische Abbau chimärer, in dem betreffenden Wirts-Mikroorganismus fremder Proteine durch dessen Proteasen nicht ohne weiteres erfolgt, worauf bereits in „Proceedings of the National Academy of Sciences of USA" 79 (1982), S. 5582-5586 hingewiesen worden ist:Es ist zwar entsprechend den PCT-Anmeldungen 8503949 und 8601 825 auch schon versucht worden, die Proteolyse von Fremdproteinen in den verwendeten Mikroorganismen zu vermeiden; für die Synthese von Prochymosin sind die vorgeschlagenen Verfahren aber nicht geeignet und auch nicht vorgesehen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Chymosin nach einem wirtschaftlichen, weitgehend synthetischen Verfahren in beliebiger Menge so herzustellen, daß seine Eigenschaften mit dem natürlichen Enzym übereinstimmen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung.hat sich demzufolge die Aufgabe gestellt, die dargelegten Nachteile der bekannten vorgeschlagenen Methoden zu beseitigen und ein Prochymosin zu synthetisieren, das in seiner chemischen Struktur und seinen enzymatischen Eigenschaften dem aus dem Labmagen gewonnenen Enzym genau gleich ist. Durch Sekretion des von einem passenden Mikroorganismus gebildeten Prochymosins in eine Kulturlösung oder durch Fraktionierung des Zellextraktes soll das Enzym als filtriertes Konzentrat erzeugt werden. Im einzelnen ist eine geeignete Sekretions-Signal-Sequenz auszuwählen und die Primärstruktur in deren Bereich und im Bereich der Prochymosinsequenz der kodierenden DNS zu modifizieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die N-terminale cDNS-Sequenz der isolierten Donor-DNS durch Einwirkung von Ligase so (auf einem 475-Bp-Bam HI-Fragment aus einem Vektorplasmid p10c10) in ein Promoterplasmid pAp8 eingebaut wird, daß ein Plasmid pCHY3 entsteht, daß die C-terminale cDNS-Sequenz der gleichen Donor-DNS durch Einwirkung von Ligase so (auf einem Smal-Hind HI-Fragment aus einem Vektorplasmid p8G8) in das Plasmid pCHY 3 eingebaut wird, daß ein Plasmid pCHYA 7 entsteht und daß das Plasmid pCHYA7 in bekannter Weise in Bacillus transformiert wird, zweckmäßigerweise in geeignete Bacillus-subtilis-Stämme. Die dabei transformierten Wirtszellen von Bacillus werden in geeigneter Weise submers und aerob vermehrt, wobei die gewonnene Zellmasse lysiert und daraus aktivierbares Prochymosin gewonnen wird. Es ist vorteilhaft, wenn zur Herstellung von Produktionsstämmen Plasmid pCHYA 7 in geeignete Bacillus-Stämme oder andere geeignete Mikroorganismen eingeführt und auf genetische Stabilität und die Bildung von Prochymosin mit säureaktivierbarer Chymosinaktivität hin überprüft werden.

Ausführungsbeispiel

Die weiteren Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden nachstehend an Hand der Zeichnung aη einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1: die Herstellung von Promotorplasmid pAp8 durch in-vitro-Rekombination von EcoRI-verdautem Vectorplasmid pL603

und EcoRI-verdauter chromosomaler DNS von Bacillus amyloliquefaciens, Fig.2: die Restriktionskarte dercDNS eines natürlichen Gens für Prochymosin vom Rind, Fig.3: die Bildung von Plasmid pCHY 3 mit dem N-terminalen Teil des Prochymosingens und Fig.4: die Bildung des Plasmids pCHYA7 mitdervom N-terminalen BamHI-Ort vollständigen Sequenz des Prochymosingens.

1. Herstellung von Promotorplasmid pAp8

Chromosomale DNS von B. amyloliquefaciens ATCC15841, isoliert nach der Methode von SAITO und MIURA (SAITO H., MIURA, K.-l.: Biochim. Biophys. Acta 72, 619-629.1963), und Plasmid-DNS des Vectors pPL603 (WILLIAMS, D.M.; DUVALL, E. J. und LOVOETT, P. S.: J. Bacteriol. 146,1162-1165,1981) werden mittels EcoRI in getrennten Ansätzen in bekannter Weise verdaut, anschließend in bekannter Weise deproteinisiert, Ethanol-gefällt, gewaschen (MANIATIS, T., FRITSCH, E. F. und SAMBROOK, J.; Molecular Cloning A. Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982) und mitTE-Puffer (1OmM Tris-HCI, 1mM EDTA pH7,5) gelöst, so daß eine Konzentration von je ca. 1 μg pro 20μΙ TE-Puffer erzielt wird. Die EcoRI-verdaute chromosomale DNS (ca. 2Mg) und EcoRI-verdaute chromosomale DNS (ca. 2jug) und EcoRI-verdaute Plasmid-DNS (0,5/Ag) werden in einem Ansatz zu 20/xl in einer für T4-DNS-Ligase üblichen Reaktion unter Einsatz von etwa 2 Enzymeinheiten (s. MANIATIS₁T. et al. 1982, Handbuch s.o.) ligiert.

Das Ligationsgemisch wird nach der Methode von S. CHANG und S.N.COHEN (Molec. Gen. Genet. 168,111-115,1979) in Protoplasten des B. subtilis-Stammes BD170 (trpC2, thr5) transformiert. Die Selektion derTransformanten erfolgt auf DM3-Regenerationsmedium mit Zusatz von 20^g Cm/ml, 5Mg Km/ml, 1 % unlöslicher Stärke. DieTransformantenkolonien werden anschließend auf üblichen Nährbodenplatten vereinzelt und bezüglich ihres CrrHChloramphenicol-iResistenzgrades überprüft. Von beispielsweise acht Kolonien wurde bei einer noch Wachstum auf Nähragarplatten mit 200 Mg/ml festgestellt. Das aus dieserTransformante mit üblichen Methoden (z.B. J. Bacteriol. 134, 318-329,1978) nachgewiesene und isolierte rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pAp8 (Fig. 1). Dieses Plasmid unterscheidet sich vom Vector pPL603 durch ein ca. 270 Bp-Insert im EcoRI-Ort und wird als Promotorplasmid pAp8 bezeichnet.

2. Herstellung von Plasmid pCHY3

Benötigt wird mit üblichen Methoden gereinigte DNS von Promotorplasmid pAp8 und ein BamHI-DNA-Fragment über 474 Bp mit dem N-terminalen Teil des Gens für Kälber-Prochymosin. Das 474-Bp-Fragment wird aus dem Vektorplasmid p10c10 (DD-Patentschrift 236345 und Folia biologica 31,71-85,1985) gewonnen. Dazu werden ca. 10Mg piOdODNS im ersten Schritt unter Standardbedingungen mittels Hindlll und Sail verdaut (um von den im folgenden Schritt resultierenden drei BamHI-Fragmenten die für die weitere Klonierung unerwünschten Fragmente über 1 600 bzw. 3300Bp zu zerstören). Nach üblicher Deproteinisierung der Hindlll/Sall-verdauten DNS werden im zweiten Schritt ca. 2μg DNS unter Standardbedingungen mittels BamHI verdaut. Durch übliche Agarosegelelektrophorese wird gezeigt, daß die für die nachfolgende Ligation unerwünschten BamHI-Fragmente (s.o.) tatsächlich durch die im ersten Schritt ausgeführte Hindlll/Sall-Verdauung zerstört worden sind. Die so dreifach (Hindlll, Sail, BamHI) verdaute pi Od 0-DNS wird nach üblichem Verfahren gereinigt und steht im TE-Puffer (ca. 8Mg pro 10/xl) gelöst zur Verfugung. Zur Ligation werden ca. 1 /Ag DNS des Promotorplasmids pAp8 unter Standardbedingungen Ball verdaut, anschließend deproteinisiert und im TE-Puffer (zu ca. 1 Mg/10;u.l) gelöst. Zur Ligation werden 0,1 Mg/Bcll-verdaute pAp8-DNS und 1 /xg Hindlll-Sall-BamHI-verdaute DNS von p10c10 unter Standardbedingungen ligiert. Nach Ligation (4Std. bei 21⁰C) wird diese durch Erhitzen auf 65°C (für 5Minj beendet und

zur Transformation in den B. subtilis-Stamm GSB26 (metB5, SacA321, arol106, amyE, Str^R6) verwendet. Zur Transformation wird die bereits oben erwähnte Methode nach CHANG und COHEN (1979) benutzt. DieTransformanten werden auf geeigneten DM3-Platten und Zusatz von 750^g Km/ml selektiert. Die erhaltenen Transformanten werden durch Ausstrich-Wachstum auf Nähragar hinsichtlich ihrer C_m-Resistenz überprüft und 52 Cm-sensible Transformanten ermittelt. Sie werden mittels üblicher Koloniehybridisierung (MANIATIS et al. 1982, Handbuch s.o.) gegen ein P³²-markiertes Prochymosin-DNS-spezifisches Oligonukleotid Z3 GGGTACCCAGAAGTC hybridisiert und nach Exposition der Hybridisierungsfilter auf Röntgenfilm als Klone vorselektiert, die den N-terminalen Teil der Prochymosinsequenz enthalten. Von den so vorselektierten Cm^s-Transformanten wird mit üblichen Methoden (z.B. J. Bacteriol. 134,318-329,1978) Plasmid-DNS isoliert und mit den Restriktasen EcoRI und Pstl mittels Standardmethoden verdaut, um die Lage des in den Bcll-Ort des Vectors klonierten BamHI-DNS-Fragments zu ermitteln. Bei gewünschter Orientierung sollte das kleine von zwei zu erwartenden Fragmenten 301 gegenüber 631 Bp-Länge (im umgekehrten Falle) aufweisen. Das Plasmid einiger Transformanten weist dabei meist die gewünschte Orientierung des BamHI-DNS-Fragmentes (zum Promotor p8 in Fig.3) auf. Davon wird Plasmid pCHY3fürdie weiteren Arbeitsschritte ausgewählt, in geeigneter Weise vermehrt, isoliert und als gereinigte DNA-Probe bereitgestellt.

3. Herstellung von Plasmid pCHYA 7

Der zur Vervollständigung des Prochymosingens (Fig. 2) erforderliche zweite Schritt beinhaltet unter Einsatz der unter 2. beschriebenen Verfahren die in Fig.4 veranschaulichten Schritte. Sie beinhalten a) die Behandlung von DNS von Plasmid pCHY3 nach Standardmethode mit den Enzymen Smal und Hindlll, b) die Isolierung eines geeigneten Smal-Hindlll-DNA-Fragmentes mittels Agarosegelelektrophorese und Elektroelution (S. 124-124 in R. F.Schleif und P.C.Wensink, Practical methods in molecular biology, Springer-Verlag, 1981) mit ca. 1 640Bp, welcher außerdem gesamten C-terminalen Prochymosingen über 779 Bp aus dem Vektorplasmid p8G6 (DD-Patentschrift 236345) enthält, c) die Ligation von Smai-Hindlll-verdauter DNS des Vektors pCHY 3 und Smal-Hindlll-DNS-Fragment über ca. 1 640Bp mittels Standard-Ligationsmethode (bei etwa 10fach erhöhter T4-DNA-Ligasekonzentration zur Verbesserung der „blunf'-Endenligation im Vergleich zur „sticky/'-Endenligation im Abschnitt 2) und d) die Transformation der ligierten DNS unter Einsatz der Protoplasten-Transformation nach CHANG und COHEN (s. Abschnitt 1) in den B. subtilis-Stamm GSB-26 (siehe Abschnitt 2), so daß Transformantenkolonien erhalten werden, unter denen durch Anwendung der üblichen Koloniehybridisierungsmethode (s. Abschnitt 2) durch Hybridisierung mit P³²-markierten synthetischen Oligonukleotiden Z1 homolog zu der Sequenz TGATCAGATCGCTTT im C-terminalen Teil der Prochymosinsequenz (Fig. 2) bzw. Z3 (homolog zu der Sequenz GGGTAGCCAGAAGTC im N-terminalen Teil der Prochymosinsequenz (Fig. 2) die Transformantenkolonien 7 und 9 ermittelt werden, die sowohl für das Oligonukleotid ZI als auch Z3 eine positive Hybridisierungsantwort ergeben. Aus diesen z. B. zwei Transformanten wird mit einer üblichen Methode (z.B. J. Bacteriol 134,318-329,1978) Plasmid-DNS isoliert und nach Standard-Reinigung der DNS mittels Restriktaseverdauungen (vorzugsweise Smal, Smal-Hindlll, Bcll-Hindlll, Bell, Hpal und BgIII) und üblicher elektrophoretischer Trennung in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert und mit den aus Fig.4 bei Übereinstimmung der erwarteten Restriktionskarte für Plasmide mit der vollständigen Prochymosin-DNS verglichen. Das Plasmid einer Transformantenkolonie entsprach im Versuch der erwarteten Restriktionskarte und erhält die Bezeichnung pCHYA7.

4. Transformation in geeignete Wirtsstämme und Nachweis der Prochymosinsynthese in B. subtilis

Das so erhaltene Plasmid pCHYA 7 wird in den proteasedefekten B. subtilis-Stamm GB500 (Patentschrift DD 245444) mit der Protoplasten-Transformationsmethode nach CHANG und COHEN (s. Abschnitt 1) transformiert. Plasmid pAp8 dient nach gleichartigerTransformation in GB500als Kontrolle. Nach Überprüfung der Anwesenheit von Plasmid pCHYA7 bzw. pAp8in den Wirtszellen des Stammes GB500 (mittels üblicher Plasmidisolierungsmethoden) werden Reinkulturen der Transformanten GB500-pCHYA7 und GB500-pAp8 über 12,24 und 36 Std. bei 37°Cin einem für die Fermenter-Kultur von B. subtilis geeigneten Nährmedium (z. B. Na-Succinat-LGS nach Biochem. Biophys. Res. Commun. 128, 601-606,1985 oder Glutamat-Casein-Mediumnach Appl.Env. Microbiol. 50, 503-507,1985) durchgeführt. Wenn die Zellen aus diesen Kulturen in geeigneterWeise geerntet und zur Lyse gebracht werden, kann im Zellextrakt mittels SDS-PAGE nach LAEMMLI (Nature 227, 680-685,1970) unter Verwendung der von FOLTMANN-et al. (in FEBS Advanced Course on aspartic proteinases and theire inhibitors, Prag 20—24.10.1984, published by Walter de Gruyter Berlin-New York) vorgeschlagenen Casein-Enzymogrammtechnikoder nach üblichen Protein-Blotting (z.B. Proc. Nat. Acad. Sei. USA76, 4350-4354,1979) unter Verwendung von Chymosin-spezifischen Antikörpern oder durch Bestimmung der Milch-Clotting-Aktivität (z. B. nach GOFF et al. Gene 27, 35—46,1984) nachgewiesen und bestimmt werden kann.

Claims (5)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Synthese von Chymosin, bei dem

   — ein genetischer Stoff, der zur Synthese von Prochymosin fähig ist, aus einem natürlichen tierischen Organ, beispielsweise einem Kälbermagen, isoliert wird,

   — aus dem genetischen Stoff ein DNS-Fragment hergestellt wird, das als Donor-DNS verwendbar ist,

   — die Donor-DNS in einem geeigneten genetischen Vektor, beispielsweise ein Plasmid, eingebaut und mit einer Vektor-DNS zu einem DNS-Chimärenmolekül fusioniert wird,

   — das DNS-Chimärenmolekül zum Zwecke seiner Vermehrung in geeignete Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen der Gattung Bacillus, transformiert wird und

   — ausdem von den Wirtszellen intrazellulärerzeugten Enzym durch Fraktionierung der Zellextrakte schließlich Prochymosin gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß

   — die N-terminale cDNS-Sequenz der isolierten Donor-DNS durch Einwirkung von Ligase so (auf einem 475-Bp-Bam HI-Fragment aus einem Vektorplasmid p10c10) in ein Promoterplasmid pAp 8 eingebaut wird, daß ein Plasmid pCHY 3 entsteht,

   — die C-terminale cDNS-Sequenz der gleichen Donor-DNS durch Einwirkung von Ligase so (auf einem Sma!-Hind Ill-Fragment aus einem Vektorplasmid p8G8) in das Plasmid pCHY3 eingebaut wird, daß ein Plasmid pCHYA 7 entsteht und

   — das Plasmid pCHYA 7 in bekannter Weise in Bacillus transformiert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pCHYA7 in geeignete Bacillus-subtilis-Stämme transformiert wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem Plasmid pCHYA7 transformierten Wirtszellen von Bacillus in geeigneter Weise submers und aerob vermehrt werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene Zellmasse in geeigneter Weise zur Fraktionierung des gebildeten Prochymosins lysiert und daraus aktivierbares Prochymosin gewonnen wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Produktionsstämmen Plasmid pCHYA 7 in geeignete Bacillus-Stämme oder anderen geeigneten Mikroorganismen eingeführt und auf genetische Stabilität und die Bildung von Prochymosin mit säureaktivierbarer Chymosinaktivität hin überprüft werden.

   Hierzu 4 Seiten Zeichnungen