DD158917A5

DD158917A5 - Verfahren zur herstellung einer ein amylase codierendes gen enthaltenden rekombinanten dns

Info

Publication number: DD158917A5
Application number: DD81227656A
Authority: DD
Inventors: Charles A Colson; Pierre E Cornelis; Colette S Digneffe; Raoul G P Walon; Corrine Walon
Original assignee: Cpc International Inc
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1981-02-16
Publication date: 1983-02-09
Also published as: GB2069503A; US4469791A; FI810425L; EP0034470A2; ES8202362A1; YU44739B; HU195533B; IL61982A0; IE810297L; DE3177286D1; YU37781A; KE3310A; DK62881A; ES499391A0; GR73678B; DK162776B; RU1838410C; CA1183090A; EP0034470B1; FI70424B

Abstract

Die Erfindung betrifft eine neue rekombinante DNS, die ein Amylase codierendes Gen enthaelt und durch ein in vitro Verfahren hergestellt wird, bei dem die von einem bakteriellen Donatormikroorganismus stammende DNS aufgespalten wird und die resultierenden DNS-Fragmente mit einem Vektor verbunden werden, der auf aehnliche Weise aufgespalten worden ist, gekennzeichnet dadurch, dass der Vektor ein Plasmid oder die DNS eines Derivates des Phagen Lambda ist. Die Erfindung betrifft weiterhin genetisch hergestellte Mikroorganismen, die die neue DNS enthalten, Verfahren zur Herstellung der neuen DNS und neue Amylaseenzyme, deren Herstellung aus der DNS und deren Anwendung zur Hydrolyse von Staerke. Der Donatormikroorganismus ist vorzugsweise ein Bacillus- oder ein Klebsiellastamm. Der Vektor kann ein Phage oder ein Plasmid sein. Der Wirtsmikroorganismus ist vorzugsweise E. coli oder B. subtilis. Das hergestellte Amylaseenzym ist vorzugsweise eine Alpha-Amylase, eine Beta-Amylase oder eine Pullulanase.

Description

Verfahren zur Herstellung einer ein Amyläse codierendes Gen enthaltenden rekombinanten DHS <heading>Anwendungsgebiet der Erfindung</heading> Die vorliegende Erfindung aus dein Bereich des genetic engineering betrifft, im besonderen auf die Herstellung von rekombinanter, ein Amylase codierendes Gen enthaltender DHS (Desoxyribonukleinsäure) sowie auf die Nutzung derselben zur Herstellung von Mikroorganismen mit dem Ziel der umfangreichen Produktion von amyIoIytischen Obwohl der Begriff "genetic engineering" bzw. genetisches Ingenieurwesen, häufig verwendet wird, um eine gro3e Anzahl von Techniken zur künstlichen Modifikation der genetischen Information eines Organismus zu beschreiben, wird er in der folgenden Beschreibung und im Erfindungsanspruch lediglich für die in-vitro-Technik der Bildung rekombinanter DHS aus einem Donator-Mikroorganismus und einem geeigneten Vektor, für das Selektieren auf Basis der erwünschten genetischen Information und für das Einführen der selektierten DNS in einen geeigneten' Mikroorganismus (iVirts-Mikroorganisrnus) benutzt, wobei die erwünschte (fremde) genetische Information Teil des genetischen Komplements des Wirtes wird. Der Begriff "genetisch modifizierter Mikroorganismus", wie er nachfolgend verwendet wird, bezieht sich auf einen mit Hilfe dieser 'Technik veränderten Mikroorganismus Die Begriffe "Amylase" und i;amylolytisches Enzym" sind 58 809 18 - 2 - Synonyma und beziehen sich, nachfolgend im weitesten Sinne auf jene zur Katalyse der Stärkehydrolyse fähigen Enzyme wie etwa Alpha-Amylase, Beta-Amyläse, Iso-Amylase (einschließlich der Alpha-1,6-glukosidasen wie etwa Pullulanase), Glukoamylase usw.. <heading>Bekannte technische Lösungen</heading> Selbstverständlich ist m den letzten Jahren bereits sehr viel über genetisches Ingenieurwesen geschrieben worden (zwei der vielen ausgezeichneten Arbeiten sind "DNS-Klonung und die Analyse der Plasmidstruktur und -funktion" von K. Έ. Timmis, S. N. Cohen und S. G Gabello, Prog. Molec. subcell 3iol. 6, 1978, Seiten 1...53 und "Lamboid-Phagen, die die Rückgewinnung von in-vitro-Rekorabinanten vereinfachen" von Noreen Ξ. Murray, 7/. J. Brammer und K. Murray, Molec. gen Genet. 150, 1977, Seiten 53...56), einschließlich vieler Berichte über neue, genetisch modifizierte Mikroorganismen mit wertvollen Eigenschaften. Die JA-PS SHO 52-70480 offenbart die Herstellung von Mikroorganismenstämmen hoher Amylaseproduktion mit Hilfe von in-vivo-Techniken der Mutagenese, Transduktion und Transformation zur Akkumulation verschiedener genetischer Merkmale zwecks Amylaseproduktion in einem Bacillus-Mikroorganismus. Diese Techniken, die mit der Gentechnik im hier definierten Sinne nichts gemein haben, sind auf einen einzelnen Mikroorganismus oder einige wenige (genetisch gesprochen) eng verwandte Mikroorganismen begrenzt. Auch sind diese Stämme für die in der vorliegenden Erfindung für die gesteigerte Enzymproduktion genutzte Gen-Verstärkung (z. B. durch Phage oder Plasmid) nicht zugänglich. In einem jüngst von Yuko Yoneda, Scott Graham und Frank E0 Young veröffentlichten Artikel "Klonierung eines Alpha-Amylase codierenden Fremdgens in Bacillus subtilis", Biochemical and Biophysical Research Communications 91, Nr. 4, 227656 7 58 809 18 - 3 - Seiten 1556..β 1564 (28. Dezember 1979) beschreiben die Autoren das Klonieren eines Alpha-Amylase codierenden Gens in einen Bacillus subtilis durch Verbinden gespaltener DHS von Bazillus amylolicuefacieris H mit -der DIiS des gemäßigten Fhagen phi 31 und anschließendes Transformieren von Amyläse-schwachen Bacillus-subtilis-Zellen. Die Autoren geben keinen Hinweis zur Verstärkung des Gens und eine damit verbundene verstärkte Produktion des Amylaseenzyms, worin der Häuptzweck der hier vorliegenden Erfindung besteht. <heading>Ziel der Erfindung</heading> Es ist das Ziel der Erfindung, Amylase-Enzym in großem Umfang herzustellen. <heading>Wesen der Erfindung</heading> Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das mit Hilfe genetisch modifizierter Mikroorganismen arbeitet, um dabei unter geeigneten Kultivierungsbedingungen erheblich größere Mengen an amylolytischen Enzymen als der Donor-MikroOrganismus produzieren zu können. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform verfügen die so erzeugten Amylasen über eines oder mehrere Merkmale, die sie insbesondere für industrielle enzymatische Stärke-Hydrolysen (z. 3. die enzymatische Verflüssigung und/oder Verzuckerung von Stärke zur Erzeugung von Bindemitteln, Leimen, Maltodextrinen, Stärkesirupe unterschiedlicher Zusammensetzungen, Maltose, Dextrose usw.) geeignet machen, wie beispielsweise Widerstandsfähigkeit gegen hohe Temperatur, Widerstandsfähigkeit gegen giftiges Schwermetall usw. Erfindungsgemäß wird zuerst DlS aus einem bakteriellen Mikroorganismus (dem Donor-Mikroorganismus), der zur Produktion mindestens eines amyloIytischen Enzyms fähig ist, extrahiert. Dann erfolgt das Spalten (mit einem geeigneten 227656 7 58 809 18 Restriktionsenzym) der DlTS sowie als Vektor der DlTS eines Phagen-Lambda-Derivates und schließlich werden die resultierenden Fragmente zwecks Bildung der rekombinanten DiTS, von denen einige ein Amyläse codierendes Gen enthalten werden, kombiniert und verbunden. Die rekombinanten DNS werden dann durch Insertion in geeignete Wirtszellen (z. B. B. coli) vermittels in-vitro-3nkapsidation oder Transfektion biologisch aktiviert. Die hieraus hervorgegangenen Klone v/erden nun hinsichtlich des Vorhandenseins eines Amylase codierenden Gens überprüft, ein oder mehrere positive Klone v/erden ausgewählt und vermehrt, womit neue genetisch modifizierte bakterielle Mikroorganismen entstehen, die unter geeigneten Kultivierungsbedingungen wesentlich größere Amy las einen ge n erzeugen, als sie von den Donor-Mikroorganismen produziert werden kennen. Die DlTS des neuen Phagen kann gegebenenfalls extrahiert, gespalten und in einen zweiten Vektor sub-kloniert werden, der seinerseits entweder ein Plasmid oder ein anderer Phage sein kann. Die neuen Klone können erneut im Hinblick auf das Vorhandensein eines Amylase codierenden Gens überprüft und selektiert werden. Desgleichen können v/eitere "Sub-sub-Klonierungen" vorgenommen werden. Zusätzlich zur Erstellung neuer, genetisch modifizierter Mikroorganismen mit der Eigenschaft von Amylase-nÜberpro-.duzenten'1 weist die Erfindung den weiteren Vorteil auf, daß der Transfer vorrangig jenes für die Produktion eines einzelnen amylolytischen Enzyms zuständigen Gens erfolgt, wodurch die bei Kulturen von nicht genetisch modifizierten Mikroorganismen notwendige Reinigung weitgehend eingeschränkt wird. Wenn der die erwünschte rekombinante DNS enthaltende genetisch modifizierte Mikroorganismus einmal hergestellt worden ist, dann wird er in einer Weise kultiviert, die den 227656 7 58 809 18 - 5 - Anteil an rekorabinanter DiIS verstärkt and somit Amylase in wesentlich größeren Mengen bereitgestellt, als dies durch den Donor-Mikroorganismus möglich ist. Wenn es sich bei dem Vektor um ein Derivat des Phagen Lambda handelt -* in diesem Fall muß der Wirts-Mikroorganismus S0 coli sein - kann Amplifikation und Enzymproduktion folgendermaßen' realisiert werden. Ist der Phage Iytisch, so wird der Wirts-Mikroorganismus, beispielsweise E. coli, zunächst zur Vermehrung der Zellen bis zur geeigneten Dichte kultiviert, die Zellen dann mit einer ausreichenden Menge des Bakteriophagen infiziert und schließlich das S3^stem bis zur Zerstörung der Zellwände kultiviert, Die Amylase dringt dann in das Kulturmedium ein. Handelt es sich bei dem Vektor-y/irt-Sj/stem um ein geeignetes Lainbda-lysogenes Ξ. coli, dann wird der infizierte Wirts-Mikroorganismus zunächst zwecks Vermehrung der bakteriellen Zellen bis zur geeigneten Dichte bei 32 C kultiviert. Danach wird die Temperatur auf 42 0G gesteigert und für eine bestimmte Zeit auf dieser Höhe gehalten, um den lytischen Zyklus zu induzieren. Anschließend wird die Temperatur auf 37 0C eingestellt, um die Amplifikation der fremden vorhandenen DNS mit der' sie begleitenden umfangreichen Amylaseproduktion in Gang zu setzen. Die Zellwände werden möglicherweise zerstört, abhängig von den jeweiligen Bedingungen, wobei es in einem solchen Pall zum übertritt von Amylase in das Kulturmedium kommt. Handelt es sich bei dem Vektor um ein Vielfachplasmid wie etwa pBR 322 oder pACYG 184, dann wird die Amplifikation der fremden DlS per se erreicht. Anderenfalls wird der die Plasmid-DITS enthaltende, genetisch modifizierte Mikroorganismus zunächst zwecks Vermehrung der bakteriellen Zellen bis zur gewünschten Dichte kultiviert, danach wird Chloramphenicol zugesetzt. Da das Antibiotikum die Proteinsynthe- 2276.56 7 58 809 18 - 6 - se inhibiert, verhindert es weitere Zellteilung und Amylaseproduktion, erlaubt aber die Amplifikation der Plasmid-D!TS in den Zellen. Abschließend v/erden die Zellen vom Kulturmedium getrennt und zur Entfernung des Chloramphenikols gewaschen. Zur Amylaseproduktion werden die Zellen dann selbstverständlich in Abwesenheit von Chloramphenikol rekultiviert. Selbstverständlich muß bei .jedweder genetischen Modifikationstätigkeit "markiert11 v/erden können, wodurch es gelingt, die Klone mit der gewünschten genetischen Information zu selektieren. Praktisch kann dies erfindungsgemäß leicht durch Anlegen einer Plattenkultur auf stärkehaltigem Medium -realisiert werden, wenn die Aktivität von Alpha-Amyläse, Beta-Amylase oder Glukoamylase zu ermitteln ist. Das Kulturmedium wird sodann mit Iod gefärbt. Klone, die auf einem stärkehaltigen Medium Am;/laseaktivität entfalten, sind von einer weißen Fläche umgeben. Bine spezifische, besser geeignete Färbemethode wird weiter unten beschrieben. Geht es um die Auffindung von Pullulanaseaktivität, dann werden die Klone nach dem Plattenverfahren auf einem Pullulan enthaltenden BBL-Tryptikase-Medium gebracht. Diese Technik wird weiter unten detaillierter beschrieben. Bs folgt nun eine detailliertere Beschreibung einschließlich der spezifischen Materialien und der angewendeten Techniken. Man wird bemerken, daß viele der genutzten Techniken "Standard" darstellen und dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind; zur Gewährleistung einer klaren Aussage sollen nichtsdestoweniger auch einige dieser Techniken im Detail beschrieben werden. Donator-Mikroorganismus. Der Donator-Mikroorganismus sollte ein bakterieller Mikroorganismus und in der Lage sein, mindestens eine Amyläse (einschließlich natürlich der gewünschten Amylase) zu produzieren; vorteilhafterweise soll- 227656 7 58 809 18 - 7 - ' te er zu einer Amylase mit den in der industriellen StarkehydroIyse erwünschten Eigenschaften wie beispielsweise Hitzeunempfindlichkeit oder Widerstandsfähigkeit gegen Metallgifte führen. Bei dem Donator könnte es sich auch um einen eukaryotischen amylaseproduzierenden Mikroorganismus (z. S. einen Pilz oder eine Hefe) handeln. Wegen der relativen Einfachheit des Arbeitens mit einer prokarjT-otischen DNS-Quelle im Vergleich zu den Sukaryoten, beschränkt sich diese Arbeit auf Bakterien und ist daher auf die Verwendung eines bakteriellen Donators begrenzt. Wie aus den Beispielen zu entnehmen, sind Kulturstämme von Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus und Klebsieila pneumoniae zur Erzeugung genetisch modifizierter Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Bildung großer Mengen von Alpha-Amylase, hitzebeständiger Alpha-Amylase, Beta-Am:/lase und Pullulanase erfolgreich eingesetzt worden. Ligasen und Restriktionsenzyme. Ss wurde durchweg T4-DNS-Ligase als verbindendes Enzym benutzt. Ss kann aber auch jedes andere DNS-verbindende Enzym verwendet werden. Die eingesetzten spezifischen Restriktionsenzyme werden in den Beispielen erläutert. Die Auswahl eines geeigneten Restriktionsenzyms kann vom Fachmann unter Nutzung bekannter Techniken natürlich selbst vorgenommen werden. Die hier verwendete Methode der Selektion eines Restriktionsenzyms zur weiteren Versuchsdurchführung bestand im Abspalten der vom Donator-Mikroorganismus extrahierten DNS (der Donator-DNS) durch verschiedene Restriktionsenzyme sowie im Auswählen des einen (oder auch mehr als einen) für die Weiterarbeit bestgeeigneten Enzyms, wobei von der Fähigkeit des Enzyms, die DlIS in zahlreiche Fragmente im Grö'Senbereich von 2...15 Kilobasen zu schneiden, ausgegangen wurde. Vektoren. Aus verschiedenen Gründen sind insbesondere Derivate des Phagen Lambda für die Klonierung der vom Donator 227 6 5 6 7 5s so9 is -1S - extrahierten DlS geeignet. (1) Mutanten des Phagen Lambda mit Verluststellen ermöglichen den Einbau von fremden DNS-Fragmenten verschiedener Gröi3en (in Abhängigkeit natürlich vom spezifischen Lambda-Derivat und ermöglichen weiterhin die einfache Identifikation jener Klone, die fremde DInFS enthalten. (2) Ss sind verschiedene Derivate des Phagen Lambda entwickelt worden, die den Einsatz von mehreren Restriktionsenzymen gestatten und somit die Chancen für ein erfolgreiches Klonieren steigern. (3) Bei Verwendung geeigneter Derivate des Phagen Lambda sind sehr gute Amplifikationen von Fremdgenen möglich. (4) lach der Ligation kann die Rückgewinnung der rekombinanten Klone unschwer durch Transfektion oder in-vitro-Zusammenschluß erfolgen. Auf Grund seiner Vielseitigkeit, die kein anderer gegenwärtig existierender Vektor vermittelt, werden erfindungsgemäß Derivate des Phagen Lambda sowie Ξ. coli als ϊ/irt zur Initialklonierung der vom Donator extrahierten DlTS eingesetzt. Weitere Vorteile der Verwendung eines Phagen anstelle eines Plasmids zur primären Klonierung sind: (1) Der Prozentsatz von Rekombinanten mit fremden DilS-Sinlagerungen ist höher,* (2) Die Bakterien liegen in gelöstem Zustand vor, wodurch die Zellinhalte und damit jegliche Amylase im Medium freigesetzt werden und damit die rlachweisführung mit Hilfe der Iod-Färbetechnik erleichtert wird; (3) Die Widerstandsfähigkeit eines Phagen gegenüber Iod ist größer als die Widerstandsfähigkeit irgendeines lebenden Bakteriums. Dem versierten Genetiker fällt die Auswahl eines geeigneten Plasmids als Vektor für eine Sub-Klonierung nicht schwer, ein Grund natürlich, das Vorhandensein eines einzelnen oder einer begrenzten Anzahl von Restriktionsstellen für das Restriktionsenzym auszunutzen. Die im größten Teil der vorliegenden Erfindung verwendeten ?27 58 809 18 Plasmide sind pBR 322 und pAGYG 184» Im intakten Zustand überträgt das Plasmid pBR 322 Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetrazyklin und enthält eine einzelne Restriktionsstelle jeweils für Pst I-, Eco RI-, Hind III-, Barn HI- und Sal I-Enzyme. Schneiden und Einbau an der Pst I-'Stelle zerstört die Fähigkeit zur übertragung von Resistenz gegenüber AmpicilliA, während Einbau in die Barn HI- und SaI I-Stellen die Widerstandsfähigkeit gegenüber 'Tetrazyklin aufhebt. Einbau in die Hind III-3telle zerstört mitunter die Resistenz gegenüber Tetrazyklin, vorausgesetzt, das klonierte Gen besitzt keinen eigenen Promotor. Im intakten Zustand überträgt das Plasmid pACYC 184 Resistenz gegenüber Tetrazyklin und Chloramphenikol und enthält einzelne Restriktionsstelien jeweils für Ecö RI-, Hind III-, Bam HI- und Sal I-Enzyme. Schneiden und Einbau an der Sco RI-Stelle zerstört die Fähigkeit zur übertragung von Resistenz gegenüber Chloramphenicol, während Sin-· bau an den drei anderen Stellen für Hind III, Bain HI und Sal I die gleichen Wirkungen wie beim Plasmid ρBR 322 hat, da diese Region beiden Plasmiden gemeinsam ist. Für die Sub-Klonung in Bacillus subtilis wurde das Plasmid pC 194 als Vektor verwendet. Dieses Plasmid hat eine einzelne Hind HI-Stelle und überträgt Resistenz gegenüber Chloramphenikol. Wirtsmikroorganismus. Da Abkömmlinge des Phagen Lambda nur in S. coli exprimiert werden können, kommt notwendigerweise auch nur E. coli als Wirt für die gemäß der Erfindung hergestellte rekombinante Phagen-DiiS in Frage. Liegt andererseits die rekombinante DiiS in Form eines Plasmids vor, dann kann jedweder zur Annahme und Replikation derartiger Plasmid-DilS fähige Mikroorganismus, wie beispielsweise andere bakterielle Mikroorganismen oder Hefen wie etwa Saccharomyces cerivisiae verwendet werden. Z 2 7 b t> b / 58 809 18 - 10 - Aus praktischen Gründen heraus wurden bei einem Großteil dieser Arbeit Ξ. coli-Kulturstämme (z. 3. HB 101) genutzt, da sie in genetischer Hinsicht wohlbekannt sind, von bekannten Phagen und Plasmiden infiziert werden und daraufhin eine gesteigerte Kapazität zur Enz?/m-Überproduktion zeigen. Wie in Beispiel II A beschrieben, kann die Subklonierung eines rekombinanten Plasmids in ein zur Replikation in 3. subtilis befähigtes Plasmid wie pG 194 vorgenommen werden . Verfahren. Das Verfahren wird ala zweistufiger Klonierungsversuch beschrieben, wobei in der ersten Phase ein Phage und im zweiten Stadium ein Plasmid verwendet wird. H ach dem Auswählen des Donator-Mikroorganismus, der Restriktionsenzyme und Ligasen sowie des spezifischen Derivats vom Phagen Lambda v/erden deren DiTS extrahiert, gespalten (restricted), gemischt und die übereinstimmenden Stücke verbunden - all dies mittels herkömmlicher Techniken, die hier keiner Beschreibung bedürfen. !Tun wird die DNS durch Transfektion oder in-vitro-Enkapsidation in 5. coli biologisch aktiviert. Bei der vorliegenden Arbeit mit Lambda-DUS wurde in Anwendung der Bnkapsi—. dation ein sehr guter Brfolg erzielt (B. Hohn und K. Murray, Proc. Katl. Acad. Sei. USA, 74, 3259 bis 3263, 1977). Die mit fremder DH8 versehenen Klone werden anschließend durch geeignete Methoden identifiziert. Wird ein Insertionsvektor wie etwa Lsmbda IM 590 oder Lambda HM b07 verwendet, dann bilden die Fremd-DHS enthaltenden Klone klare Plaques, während die Klone ohne Fremd-DHS trübe Plaques ergeben. Bei Verwendung eines Srsatz-Vekfcors wie etwa Lambda HM 761 oder Lambda HM 781 kann die Identifikation durch Plattenkultur auf einem E. coli Bernsteinlack- 227656 7 Rezipienten auf Laktose-Indikatormedium wie z. B. McConkey, SIvIB oder X gal vorgenommen werden. Viele (mehrere Tausend) jener "Klone, die fremde DHS aufgenommen haben, werden daraufhin im Plattenverfahren auf stärkehaltigen Medien angesetzt und mit Hilfe der bereits erwähnten Iod-Färbemethode hinsichtlich der Anwesenheit eines Amylase codierenden Gens durchgeprüft. Mit großer Sorgfalt muß selbstverständlich darauf geachtet werden, daß keine zu hohe, den Phagen tötende lod-Konzentration angewendet wird; dies kann sich als problematisch erweisen, da das Iod in Form einer Lösung zugesetzt wird. Die bevorzugte Färbetechnik bestand in einer kurzzeitigen Exposition der Platten gegenüber Iod-Dämpfen. Diese Technik wurde mit sehr gutem Erfolg angewendet. Im folgenden soll eine vorteilhafte Methode zur Auffindung von Klonen mit Pullulanase-Aktivität beschrieben werden, bei der keine lod-Färbung vorgenommen wird. Die Phagen werden im Plattenverfahren auf Petrischalen angesetzt, welche BBL-Tr3rptikase plus Pullulan in einer Konzentration von etwa 0,25 % enthalten. Das Pullulan im Medium um die '!!positiven'1 Plaques herum wird durch die Pullulanase zu Maltotriose hydrous ie rt, wobei die Maltotriose ihrerseits von den Bakterien verbraucht wird. Damit gedeihen die durch die Maltotriose ernährten Bakterien besser als die im Umfeld befindlichen; als Folge erscheinen die Pullulanase produzierenden Plaques von einem undurchsichtigen Ring wachsender Bakterien umgeben und können somit leicht nachgewiesen werden. Diese Technik wird in Beispiel IY detailliert beschrieben. Bin (oder mehrere) positiver Klon wird nun aufgenommen und vermehrt. Dabei kann es sich um den "endgültigen" genetisch modifizierten Mikroorganismus handeln, welcher nun zur Erzeugung großer Amylasemengen durch geeignete Kultivierung 22 7 6 5 6 7 1258 80918 in der bereits beschriebenen Weise verwendet werden kann. Andererseits kann der Klon als DiiS-Quelle für eine zweite Klonierung in ein Plasmid oder einen anderen, besser geeigneten Phagen herangezogen werden. Im folgenden soll das Verfahren der Subklonung in ein Plasmid beschrieben werden. Die DlTS der Klone wird ebenfalls unter Zuhilfenahme von Standard-Techniken extrahiert und mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Das Plasmid wird in ähnlicher Vieise geschnitten, die Fragmente werden vermischt und die rekombinierten Fragmente miteinander verbunden. Bei Verwendung des Plasmids pBR 322 erfolgt der Nachweis jener Klone, die DIiS mit einem Amyiase codierenden Gen aufgenommen haben, durch biologische Aktivierung in einem 7/irt -wie etwa B. coli. Dies erfolgt in Abhängigkeit vom verwendeten Restriktionsenzym durch 'Transformation in einem Ampicillin oder Tetraayklin enthaltenden Kulturmedium. Das Kulturmedium soll ebenfalls Stärke oder Pullulan enthalten, und die Identifikation der Klone mit einem Amyiase codierenden Gen erfolgt gemäß einer der bereits beschriebenen Techniken. Positive Klone werden anschließend kultiviert und die Plasmid-DNS kann dann mit Chloramphenikol in der bereits geschilderten Weise amplifiziert werden. Die Zeichnungen vermitteln die Struktur des Wildtyp-Bakteriophagen Lambda (Fig. 1 a) und aller verwendeten Vektoren sowie der nach den folgenden Beispielen gewonnenen neuen rekombinanten Plasmiden. Lm einzelnen enthält Fig. 1 darüber hinaus Darstellungen der Phagen Lambda NM 590 (b) und Lambda NM 781 (c), (Murray, Ii. Ξ., Brammar, W. J., Murray, K., (1977) Molec. gen. Genet. 150, 53 - 61). Fig. 2 enthält die Struktur der Plasmide pBR 322 (Bolivar, F., Rodriguez, R. I., Greene, P. J., Betlach, M, C, Heyneker, H. L., Boyer, K. Wo (1977), Gene 2, 95 - 113) und pAGYC 184 (Chang, A. C. Y., Cohen, S. N. (1978) J. Bact. 134, 1141 - 115β)ο 58 809 is Pig. 3 stellt die Struktur des neuen Plasmids pGP 1 dar und Pig. 4 die des neuen Plasmids pCP 2. Fig. 5 erläutert das Beispiel II A durch Darstellung der Plasmide pC 194, ρΟΡ 2,3 und des neuen "End"-Plasmids PCH 1. Pig. β und 7 aeigen die Plasmide pG? 3 bzw, pGP 4o In allen Darstellungen der neuen rekombinanten Piasaide ist die Donator-DUS durch eine stark gezogene Linie gekennzeichnet. Die Beispiele sollen die Praxis der Erfindung veranschaulichen. Sie dienen lediglich erläuternden Zwecken und sollten nicht im Sinne irgendeiner Begrenzung der Erfindung ausgelegt v/erden. Sofern nicht anders angegeben,, beziehen sich die mitgeteilten 'Prozentsätze auf Masse-Proζent. Alle Versuche wurden unter Einhaltung der IiIH (U.S.A.)-Richtlinien angestellt. <heading>Beispiel I</heading> Klonierung eines Alpha-Amylase-Gens Verwendet wurden die folgenden Materialien: Restriktions-Endonuklease Hind III. T4 DlTS Ligase. Phage Lambda IM 590. Die Phagen-DUS wurde durch Phenolextraktion aus hochreinen Phagenpartikeln gewonnen. Plasmid pBR 322. Plasmid-DlIS wurde aus Lysozym-lysierten Ξ. Coli-Zellen in Gaesiumchlorid-ethidiumbromid Dichtegradienten isoliert. Wirts-MikroOrganismus, E0 coli HB 101. Als Donor-MikroOrganismus diente ein Kulturstamm von 2ΛΠΛΓ Λ rj 27656 7 - 58 809 18 Bacillus megaterium mit nachstehenden mikrobiologischen Eigenschaften: ' (1) Morphologie: s tabellenförmig (0,5.».O,7^frx 2,0·..5, beweglich, grampositiv, terminale bis subterminale Sporen« (2) Nährbouillon: gutes Wachstum. (3) Hähragarbouillon: gutes Wachstum; die Kolonien sind in der Mitte dichtgelagert, im Randgebiet diffuser. (4) Milch: Peptonisation ohne Veränderung des pH-Wertes. (5) Gelatine: keine Verflüssigung. (6) Reduktion von !Titraten: negativ. (7) Katälasereaktion: negativ. (8) Oxidasereaktion: negativ. (9) Zytochrom-Oxidasereaktion: negativ. (10) Indolproduktion: negativ. (11) H2S-JBiIdUiIg: negativ. (12) Kohlenhydratausnutzung: verwertet Arabinose, Xylose, Galaktose, Glukose, Lävulose, Maltose, Raffinose, Saccharose sowie Stärke und produziert daraus Säure. Rham nose, Mannose, Melibiose, Inulin und Salizin werden nicht verwertet. (13) Verwertung von Polyolen: Sorbitol und Mannitol werden verwertet; Ädenitol, Dulcitol und Inositol werden nicht verwertet. (14) Dekarboxylasereaktion auf Lysin: negativ. (15) Ureolyse: schwach. (Ί6) Widerstandsfähigkeit gegenüber Schwermetallen: wächst direkt auf 500 ppm Cr+++. (17) Itfatriumchlorid-Bouillon: Wachstum bei HACl-Konzentration von 3,5 %· (18) Optimale Wachsturnstemperatur: 30...37 °C Maximale Wachstumstemperatur: 40..»50 0G Minimale Wachstumstemperatur: 5...2O 0G. (19) Sauerstoffbedarf aerobisch. 58 809 18 227655 7 -«- Der Mikroorganismus wurde auf der Grundlage seiner mikrobiologischen Eigenschaften unter Bezug auf Sergey's Manual of Determinative Bacteriology (S. Auflage), Mitherausgeber R. E. Buchanan und H. S. Gibbons, Williams und Wilkins Company, Baltimore, Maryland als Bacillus megaterium identifiziert. Der Mikroorganismus ist am 12. Februar 1980 bei der Nationalen Sammelstelle für industrielle Bakterien (SCIB), lorry Forschungsstation, Postfach ITr. 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Schottland hinterlegt und unter IC13 Nr. 11568 registriert worden. Im folgenden wird das angewendete "verfahren beschrieben. A. IH-YITRO-RSKOMBIImATIOW ZWISCHSH LAMBDA- IMD B.-MSGA- TSRIUM-DHS'η' Etwa 7i4t>g B.-megaterium-DNS wurden mittels 10 "Einheiten Hind III bei 37 0C eine Stunde lang in 25/fcl Tris-Puffer (pH 7,5) gespalten. Etwa 2*g Lambda HM 590 wurden in ähnlicher Weise mit dem gleichen Enzym gespalten. Die Reaktionen wurden durch 10-minütiges Erhitzen auf 75 0C gestoppt. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der Spaltung wurden zwei Tests vorgenommen: 1_^ Je eine Probe der zwei Reaktionsgemische wurde in einem Agarose-Gel über 20 Stunden hinweg bei 20 Volt elektrophoretisch behandelt. Nach Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid wurden die erwarteten Bandenverteilungen untersucht: .' 2 Lambda-DHS-Banden als Ergebnis der an der einzelnen Hind-III-Stelle aufgebrochenen Lambda-Di!S und eine sehr große Anzahl meist überlappender Bernden von der an einer Vielzahl von Stellen aufgespaltenen bakteriellen DHS. b 5 58 809 18 -6- 2. Die Transfektionsanalyse der Phagen-DIiS zeigte, dai3 die Aufspaltung mit 99 %iger 'Wirksamkeit erfolgte, wodurch die biologische Aktivität der Phagen-DNS nahezu vollständig zerstört -o Die aufgebrochenen DiTS'n wurden vermischt und 5stündiger Inkubation mit 0,15 Einheiten '14-DIfS-Ligase bei 10 G ausgesetzt, um sin zufallsweises Anordnen und kovaientes Verschmelzen der DHS-Fragmente zu erraö liehen. Am Ende dieser Inkubation wurde die DiTS mit einem in-vitro-3nkapsiaationspräparat vereinigt, das aus einer Mischung der von nichtsupp'ressiven Kulturstämmen induzierten Lysate zweier komplementärer defektiver Phagen (Lambda Dam und Lambda Earn) bestand. In dieser Mischung kann jegliches DNS-Molekül in das Phagen-Protein eingebunden werden, sofern es die cos-üL'ctremitäten der Lambda-DITS besitzt und die geeignete Größe aufweist. Auf diese ,'/eise rekonstituiert sich in vitro ein biologisch aktiver Phagen-Partikel, der Jj, coli infizieren und ein Infektionszentrum (Plaque) produzieren kann. Um die Wirksamkeit dieses Vorgehens abzuschätzen, wurden zwei Kontrollen vorgenommen: 1.Eine Probe der Mischung wurde im Plattenverfahren auf Ξ. coli kultiviert, Dro/*g der eingebrachten Lambda-DrlS wurden 3 x 10 Jiinzel-Plaques gefunden. Dies überstieg die in dem aufgespaltenen Präparat gefundene Menge etwa um das Hundertfache, womit auf eine gute Wirkung der Ligase-Behandlung geschlossen werden kann. 2. Die derart entstandenen Plaaues wurden visuell beurteilt, 58 809 18 22765 6 7 γ π- 70 % von ihnen zeigten keinerlei Trübung, was auf die Anwesenheit eines B. megaterium-PHS-Fragments hindeutet, .welches seinerseits das für die Plaque-Trübung verantwortliche Lambda-Gen Cl bindet und damit inaktiviert. Somit könnte man annehmen, daß das Präparat ein Zufalls-, muster aller mit dem Binbau. in den Phagen Lambda KM 590 verträglichen B. megateriuin-möglichen Hind IIT-DHS-Fragmente enthielt. B. ISOLATIOEi SIHES B. MBGATERIUM-AMTLASS 1IRAGBHDSH PHAGa-LAMBDA-DBRIVATES . Der Rückstand der Enkapsidations-Mischung wurde zur Inokulation von 3. coli auf eine groi3e Anzahl von stärkeenthaltenden Platten mit etwa 10^ lebensfähigen Partikeln pro Platte verwendet. Nach Anwachsen der infizierten 3, Coli und Bildung von Plaques wurden die Platten hinsichtlich der Anwesenheit von stärkeabbauenden Plaques überprüft. Dazu wurden die Platten kurzzeitig lod-Dämpfan ausgesetzt; es wurde erwartet, daß der von einem solchen Phagen hervorgerufene Belag (Plaque) von einer durchsichtigen Fläche umgeben sein würde, resultierend aus der Diffusion und Wirkung von Amyläse aus den lysierten Zellen. Ein derartiger Belag wurde gefunden, der ihn enthaltende Phage wurde zwecks Subkultivierung sofort herausgenommen (ein längeres Verweilen in lod-Dämpfen würde den Phagen getötet haben). Die Nachkommenschaft dieses Plaque vermehrte sich unverändert (Amylase erzeugend) und wird hier als "Lambda HM 590 Amy 1" bezeichnet. Phage Lambda HM 590 Amy T wurde am 12. Februar 1980 beim HCIB als HCIB Hr. 11569 hinterlegt. C. RB-KLOHIBRUHG DBS AHYLASB-GEHS IH DAS PLASHID PBR 322 Die Re-Klonierung erfolgte zwecks Erlangung eines Überpro- 227558 7-ls- Μ8091β . duaiei-enden Kulturstammes sov/ie zwecks unkomplizierter Herstellung einer großen Menge von DNS mit dem Amylase-Gen. 1 /xg DNS vom Phagen Lambda NM 590 Amy 1 und 0,3/ig DNS vom Plasmid pBR 322 wurden gespalten, vermischt und - wie in Abschnitt A beschrieben - mit Ligase behandelt. Dieses Präparat wurde (unter Anwendung herkömmlicher Methoden) sur Iransformation des Kulturstammes HB 101 herangezogen. Selektiert wurde auf Anpizillin (ap)-Resistenz;, .eine durch Anwesenheit dieses Plasmids auf die Zellen übertragene Eigenschaft. Dieses Plasmid überträgt normaler/reise auch V/iderstandsfähigkeit gegenüber Tetrazyklin (1Ic). Die Einführung von Fremd-DNS in dieses Plasmid spaltet jedoch· das tet-Gen, wodurch der Anteil an tetrazyklin-sensitiven transformierten Klonen den Anteil an klonierter DNS enthaltenden Pla.sm.iden widersp-ieselt. Im vorliegenden Fall enthielten 1δ % der Klone ein neues Plasmid, welches Amylaseaktivität auf ü. coli übertrug. (Entsprechend der gegenwärtigen internationalen Nomenklatur der Plasmide werden die hier zu beschreibenden neuen Plasmide mit !lpCP!T. und das spezifische Plasmid des vorliegenden Beispiels als ':pCP 1" bezeichnet) . Aus dem eben Gesagten wird deutlich, daß das Re-Klonieren eines Gens mit demselben Enzym (in diesem Fall Hind III) ein sehr wirksames Verfahren darstellt (16 % anstatt 1/1O^). Der plasmid-enthaltende Mikroorganismus wird als Ξ. coli CL 7001 (pCP 1) bezeichnet und wurde am 12. Februar 1980 beim NGIB als NGIB Nr. 11570 hinterlegt. <heading>D. AMPLIFIKATION UND BNZYMPRODUKTIQN</heading> Die 3nz3Tmproduktion in Plasmid (pGP 1) enthaltenden Zellen wurde auf zweierlei wegen folgendermaßen verbessert: 58 809 18 Σζ. Gesättigte Kulturen Die Kulturen wurden bei 37 0G über Nacht .auf einem Rotationsschüttler in 5-Liter-Brlenmeyerkolben (mit Einbauten versehen) mit 1 Liter Kulturmedium (LB; Hefeextrakt-Trypton) bebrütet. 2. Ghloramphenikol-Amplifikation Die Kulturen wurden bei 37 0C auf einem Rotationsschüttier in 5-Liter-Erlenmeyerkolben (mit Einbauten versehen) mit 1 Liter Kulturmedium (LB) bis zur Erreichung einer Dichte von 0,8 (650 nm) bebrütet; sodann wurden 150/*g/ml Ghloramphehikol zugesetzt. Dies verhütete die weitere Replikation der chroniosomalen DlJS, nicht aber die weitere Replikation des Plasmids (pGP 1), welches das Ainylase-Gen enthält. Nach Amplifikation des Plasmids (bis zu 3000 Kopien) gegenüber der chromesomalen DIiS wurde das Ghloramphenikol entfernt, um das Wiedereinsetzen der Proteinsynthese su ermöglichen. Im einzelnen wurden die Seilen nach der AmpIifikation mittels Zentrifugation vom Medium separiert, zur Sliminierung des Ghioramphenikols gewaschen und mit dem Ziel der Amylaseproduktion rekultiviert. 3. ENZYMRÜCKGSWTlIUiiG Zur Rückgewinnung der. Alphar-Amy läse in sehr reiner Porin nutzten wir die Methode des "osmotischen Schocks". Das von H. C. Neu und L. A. Heppel in J. 3iol. Chem. 240, 3685 - 3692 (1965) berichtete Verfahren wurde wie folgt sehandhabt. Die Zellen wurden zunächst über Nacht kultiviert, danach wurden sie in 0,5 Volumenanteilen (bezogen auf die Zellkultur) einer 25 %igen Saccharoselösung suspendiert und bei 24 0G 10 min geschüttelt. Dies führte zur Plasmolyse der Zeilen. Daran anschließend wurde EDTA bis zu 1 ixiM zugesetzt, um die Zellwände permeabel zu halten; danach wur- 58 809 18 227656 7. -*>- de das Material bei 24 °C für weitere 10 rain geschüttelt. Die Suspension wurde zentrifugiert, die Zellen wurden in kaltem Wasser (etwa 0 C) rasch, resuspendiert und bei dieser Temperatur 10 min geschüttelt. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert, aus der überstehenden Flüssigkeit konnten 96 % des Enzyms zurückgewonnen werden. Zu Vergleichszwecken wurde der Donor-Mikroorganismus (Bacillus megaterium) kultiviert und seine enzymatisch^ Aktivität bestimmt. Die Enzym-Menge pro ml Kulturmedium wurde mit Hilfe der DITS-Me t ho de gemessen. Dabei ist als eine enzymatisch^ Einheit jene Enzym-Menge definiert, die während einer zehnminütigen Inkubationszeit 1 mg reduzierenden Zucker (Bezugsbasis ist Maltose) pro Minute produziert. Als Substrat diente sehr reine Amylose. Der Donor-Mikroorganismus erzeugte 56,0 enzymatisch^ Einheiten pro Liter Kulturmedium. Mit E. coli CL 7001 (pC? 1) gesättigte Kulturen produzierten 116,6 Einheiten je Liter Kulturmedium, während E. coli CL 7001 (pCF 1) nach 5stündiger !-Cultivation (Amplifikation) mit Chloramphenikol und nach darauffolgender 15stündiger Kultivation ohne Chloramphenikol nur 84,5 Einheiten/Liter erbrachte. Dies läßt erkennen, daß die Methode der gesättigten Kultur eine gute Steigerung der Enzymproduktion zu erreichen vermag. Das von E. coli CL 7001 (pCP 1) produzierte und als eine Alpha-Amylase identifizierte Enzym besitzt folgende Merkmale. Es spaltet sowohl Amylose als auch Amylopektin in Glukose, Maltose und Maltotriose -. vornehmlich aber Maltose - , und es spaltet sowohl Zyklodextrin als auch Maltotriose in Glukose und Maltose. Es spaltet Pullulan in Panose und/oder Iso-Panose, eine Eigenschaft, in der es jenem Enzym ähnelt, das kürzlich von Mizucho Shimizu, Mutsuo Kanno, Masaki Tamura und Mikio Suekane in "Purification· and Some Proserties of a Novel Alpha-Amylase Pro- 58 809 18 227658 7 -»- duced by a Strain of Thermoactinomyces vulgaris", Agric. Biol. Ghsm. 42 (9), 1978, Seiten 1681 - 1688 beschrieben wurde. Wir hielten den im vorliegenden Text als Bacillus ine gat erium bezeichneten Mikroorganismus einmal für Bacillus cireulans. <heading>Beispiel Il</heading> Klonierung eines wärmebeständigen Alpha-Aniyiase-Gens Als Donator-Mikroorganismus fungierte ein Original-Kulturstamm eines von einem Kompost isolierten Bacillus, der als Bacillus coagulans identifiziert wurde. Der Bacillus erzeugt eine wärmebeständige Alpha-^anylase und besitzt nachstehende mikrobiologische Merkmale. (1) Morphologie: Stäbchen (0,6...1*4χ 2,5·.·5,0 >*), be weglich, grampositiv und -negativ. Zentrale oder endständige Sporen, nicht deformierend. (2) Nährbouillon: gutes Wachstum. (3) Schrägnähragarkultur: gutes Wachstum, fadenförmige Ausbreitung, creinig weiß, (4) Verwertung organischer Säure - Zitrat: positiv. - Malonat: negativ. ' (5) Gelatine: Verflüssigung. (6) Produktion von Azetyimethylkarbinol (Asetain): positiv, (7) Orthonitrophenylgalaktosid-Hydrolyse: positiv. (8) Nitratreduktion: positiv, Gas kann erzeugt werden. (9) Katalasereaktion: positiv. (10) Indolproduktion: negativ. (11) Dekarboxylasereaktion auf - Lysin : negativ - Ornithin : negativ - Arginin : negativ. 22765 6 7 _22_ 5880918 (12) H,-,S-Bildung: negativ. (13) Kohlenhydrate rwertung: verwertet Arabinose, Galaktose, Glukose, Lävulose, Mannose, Maltose, Saccharose, Stärke, Trehalose und produziert aus ihnen Säure. (14) Pullulan wird auf Minima!-Medium verwertet. (15) Verwertung von Polyolen: Glyzerol, Sorbitol, Mannitol und Inositol werden verwertet, Adonitol und Dulzitol werden nicht verwertet. (16) Ureolyse: negativ. (17) Lezithinverwertung: negativ. (18) Optimale Wachstumstemperatur: 50 G Maximale Wachstumstemperatur: 55·..60 G Minimale Wachs turns temp era tür: 15=>· .25 G. (19) Sauerstoffbedarf: aerob und anaerob. Der Kulturstamm ist am 12. Februar 1980 beim !TGIB als NGIB Nr. 11571 hinterlegt worden. Die DHS wurde extrahiert und der Wirkung von Eco RI; Hind III; Pst I; Sal I; 3am HI und BgI II ausgesetzte Lediglich BgI II vermochte eine Vielzahl von Fragmenten in einem weiten Bereich relativer Molekülmassen entstehen zu lassen. Mit Eco RI- konnten jedoch auch Fragmente hervorgerufen v/erden, nachdem die NaCl-Konzentration auf 50 mM vermindert worden war· Es wurde daher Eco RI zur Herstellung von Fragmenten für die Klonierung in einen Eco RI-Lambda DNS-Vektor (Lambda NM 781) eingesetzt. <heading>A. RESTRIKTION VOH B. GQAGULANS- UHD LAMBDA NM 781-DNS'N</heading> 1,25/*g Lambda NM 781-DNS wurden mittels einer Einheit Eco RI in 25/«*des nachstehenden Puffers gespalten: 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM 2-Merkaptoethanol, 10 mM MgSO4 und 100 mM HaCl. 2j*g B.· coagulans-DNS wurden mit Hilfe des gleichen Enzyms 227656 7 --- in einem ähnlichen Puffer gespalten, die NaGI-Konzentra-· tion war jedoch auf 50 mM reduziert worden. Die Inkubation erfolgte bei 37 0G über 2 Stunden hinweg, die Reaktion wurde dann durch 10-minütiges Erhitzen auf 75 0G gestoppt. Die "Vollständigkeit der Restriktion wurde durch Elektrophorese in 1 %igen Agarose-Gelen festgestellt. B. LIGAiION UHD RÜCKGEWINNUNG DBR REKOMBINANTEN FHAGSl Die restrigierten DlTS'η wurden vermischt und unter Einsatz von zwei Einheiten T4-DNS-Ligase in einem Gemisch mit mM Tris HGl (pH 8), 10 mM MgSO^, 10 mM 2-Merkaptoethanol und 0,1 mM AT? verknüpft. Die Reaktion erfolgte über 10 bis 15 Stunden bei 10 0G. Nach der Ligation wurden Aliquote von 0,2 yag DHS mit AT? vermischt, um eine Endkonzentration von 10~ IvI zu erhalten. Diese Aliquote wurden einer in-vitro-Enkapsidation ausgesetzt und sur Infektion des Kulturstammes HB 101 von S. coli verwendet* ?ro/*g Lambda-DNS wurden etwa 1,6 χ 10 PMJ (plaquebildende Einheiten) erzielt. Einige dieser Phagen zeigten Amylaseaktivität (hinsichtlich des Nachweises von Amylaseaktivität auf Petrischalen und hinsichtlich der Rückgewinnung und Reinigung des Phagen siehe Beispiel I). Es wurde ein ziemlich hoher Anteil von amylaseproduzierenden Phagen (.1 in 400) beobachtet. Einer von ihnen wurde selektiert und als "Lambda NH 781 Alpha Amy 1" bezeichnet. Er ist. am 12. Februar 1980 beim NGIB als NGIB Nr. 11572 hinterlegt worden. C. REKLONIERUIG DES AMYLASEGENS AUS LAMBDA NM 781 ALPHA AMT 1 IN PLASMID PBR 322 1i»g Lambda NM 781 Amy 1-DNS und eine gleiche Menge DNS vom Plasmid pBR 322 wurden unter Beibehaltung der übli- 227656 7- 58 809 18 24- - chen Bedingungen mit Eco RI gespalten. Die Ligation und Transformation erfolgte in der in Beispiel I erläuterten Weise. Kolonien von E. coli H3 101 mit rekombinantem. Plasmid wurden vermittels ihrer Amylaseaktivität nachgewiesen. Sine derartige Kolonie wurde selektiert und als E, coli GL 7002 (pCP 2) bezeichnet. Sie ist am 12. Februar 1980 beim HGIB als ITCJB Nr. 11573 hinterlegt worden. <heading>D. AIgLIgIKATIQg DES GEHPRODUKTS</heading> Die Amplifikation des amylasecodierenden Gens von Lambda ΉΜ 781 Alpha Amy 1 sowie die Amylaseproduktion wurden folgendermaßen bewerkstelligt. Das Wirtsbakterium (E. coli HB 101) ließ man bei 37 0G in LB-Medium mit 2 mM MgGl9 bis zur Erreichung einer optischen Dichte von 0,3 (bei 650 mn) wachsen. Dann erfolgte das Hinzufügen von Lambda ΈΙίί 781 Alpha Amy 1, wobei die Zahl der Phagen mit dem Ziel der Erlangung einer Infektionsrate von etwa 1...2 berechnet wurde, daß also ein bis zwei Phagen auf eine bakterielle Zelle entfielen. Die Kultur wurde nun bei 37 0C unter starkern Rühren (Schütteln) weiter kultiviert, die optische Dichte wurde bis zum Beginn des Absinkens beobachtet, iiach Absinken der optischen Dichte unter 0,5 wurde die Kultur geerntet und auf Eis gelegt. Die Kultur wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde auf Amylaseaktivität untersucht. .Amplifikation und Enzymproduktion mit E. coli CL 7002 (pGP 2) erfolgten unter Anwendung sowohl der Methode der gesättigten Kultur als auch unter Anwendung der Ghloramphenikol-Amplifikation, wie sie in Beispiel I beschrieben wurden· Die Amylaseaktivität wurde mit Hilfe der DKS-Methode sowohl im Phagenlysat als auch in jenen Kulturen von E. coli bestimmt, die das rekombinante Plasmid enthielten. Tabelle 227656 7 53 809 18 - 25 - I zeigt die Werte der Amylaseaktivität im Original-Kultur stamm von B. coagulans sowie die Aufteilung zwischen extrazellulärer und zellgebundener Aktivität. Die mit dem rekomMnanten Phagen (Lambda NM 781 Alpha Amy 1) und dem das rekombinante Plasmid S. coli CL 7002 (pGP 2) enthaltenden Kulturstamm erzielten Aktivitäten v/erden ebenfalls dargestellt. Mit dem rekombinanten Phagen wurde eine Steigerung der Snzymproduktion auf das etwa Dreifache erreicht, eine sehr viel stärkere Steigerung (auf etwa das 30Ofache) wurde beim Plasmid beobachtet. Im 3?alle des Phagen (Lambda ITM 781 Alpha Ainy 1) ist das gesamte Enzym durch Zell-Lysis freigesetzt und daher im Kulturmedium enthalten. Im Falle des Plasmids liegt der größte Teil des Enzyms (96 %) zellgebunden vor. 3. RSKLONISEÜHG IN EEJ DERIVAT DSS PKAGSI LAIvIBDA, DAS ZUR LYSOGMISISRlMG VON S. COLI PJHIG IST Zur Erläuterung der Herstellung eines Vektor-Wirt-Systems mit einem Lambda-lysogenen 3. coli wurde folgender Versuch durchgeführt. Verwendet wurde der Bakteriophage Lambda T4 lig. Cl 857 Warn Sam Sam (Lambda ITM 989). Sr ist in J. Mol. Biol.·, Band-132 (1979), "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4. I.. Characterization of the Recombinants" von G. G. Wilson und Iioreen S. Murray (Seiten 471 bis 491) und !'1IO. Amplification' and Separation of the Gene Product" von Moreen S. Murray, S. A, Bruce und K. Murray (Seiten 493 bis 505) beschrieben. Dieser Phage enthält das DHS-Ligasegen des Bakteriophagen T4 und vermag B. coli zu lyogenisieren. Sr hat darüber hinaus ein thermosensitives -Immunitätsgen und zwei Bernsteinmutationen im S- und im S-Gen. Die Mutation des S-Gens 227656 7- 58 809 18 26 - hebt die Auflösbarkeit des Bakteriums durch Infektion mit diesem Phagen auf. Der Zweck der Subklonierung bestand im Ersetzen des DNS-Ligasegens durch das Amylase codierende Gen. Die DNS des Phagen und des Plasmids (pC? 2) wurden mit Hilfe von Sco RI geschnitten, dann wurden die Fragmente verbunden. Die aus der Ligation resultierende Phagen-DU8 wurde danach in einen Organismus eingeschleust, die Plaques wurden im Plattenverfahren auf einem liulturstamm von S. coli Sup E Sup F sichtbar gemacht. Die Amylaseaktivität aufweisenden Plaques wurden ausgelesen und der Phage unter Anwendung der bereits beschriebenen 'Techniken gereinigt. Dieser Phage wurde dann mit herkömmlichen Techniken zur Lysogenisation eines Kulturstammes von ü. coli G 600 (CL 1205) verwendet. Mittels lod-Färbung wurden die lysogenen Kolonien auf einem stärkehaltigen Medium sichtbar gemacht. Dieser Kulturstamm ist von uns als S. coli GL 7003 (Lambda Alpha Amy 1) bezeichnet und am 6. Mars 1980 beim SGIB als HClB lir. 11586 hinterlegt worden. Die Amplifikation des Genproduktes erfolgte in der nachstehenden Weise. Das Lysogen ließ man bei 32 0C in LB-Medium wachsen, bis eine optische Dichte von 0,8 bei 650 iim erreicht war. Dann wurde zentrifugiert und die Zellen in frischem LB-Medium suspendiert, welches auf 45 G vorgewärmt worden war. Dann erfolgte eine 15niinütige Inkubation der Kultur in einem 45 0G warmen Bad, um den lytischen Zyklus in Gang zu setzen (da das Iminunitäts-Genprodukt wärmeempfindlich ist). Die Inkubation wurde dann unter kräftigem Schütteln bei 37 0G 3 Stunden lang fortgesetzt. Anschließend wurde die Amylaseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit und in den Zellen, gemessen. Die Meßergebnisse sind in 'Tabelle I enthalten. 58 809 18 227656 7-*- Dieses Sinze!experiment veranschaulicht die Technik einer "Sub-sub-Klonierung" vom Plasmiden in, einen neuen Lambda-Phagen. Ss sollte sich von selbst verstehen, daß die DlTS von Lambda NM 781 Alpha Amy 1 genauso leicht einer Sub-Klonierung in den Phagen Lambda"T4 lig. GI 857 Warn Bam Sam hätte unterzogen werden können. Andererseits hätte die Donator-DKS auch direkt in den letztgenannten Phagen kloniert werden können; eine Reihe von Variationen des als Beispiel dargestellten Verfahrens erscheint denkbar. P. RÜCKGBWHraimG UHD GHARAKTSRISIERUUG DSR VOiT LAMBDA IM 731 ALPHA AMY 1 , E. COLi GL 7002 (pCP 2) UiTD B. GOLI . GL 7003 (LAMBDA ALPHA AMY 1) PRODUZIERTEN AMYLASB Zur Enzym-Rückgewinnung wurde wie in Beispiel I die Methode des osmotischen Schocks eingesetzt. Da das Enzym aus diesem Beispiel wärmebeständig ist, könnte es darüberhinaus durch Hinzufügen von 10 niM Ga' ' zu der wäßrigen Lösung sowie Erwärmen der Lösung auf 80 C für 10 Minuten zusätzlich gereinigt werden. Diese Behandlung fallt die gesamten S. coli-Proteine aus und ermöglicht die Rückgewinnung der Alpha-Amylase in extrem reiner Form, es sind in der Tat keine Reste.oder andere Enzyme vorhanden. Die Besonderheit der Alpha-Amylase wurde ermittelt: sie ist auf Amylose und Stärke aktiv, Hydrolyseprodukte sind Glukose, Maltose und Maltotriose mit Spuren von Komponenten höherer relativer Molekülmassen. Auf Zyklodextrin ist dieses Enzym nicht aktiv. Ebenfalls bestimmt wurde die Wärmebeständigkeit des Enzyms, sie erwies sich als sehr hoch. Die Optimaltemperatur hinsichtlich der Aktivität mit 0,5 % Amylose liegt zwischen 80 0G und 90 0C. Mit 8 % löslicher Stärke befindet sich das Optimum um 100 G, 227656 7 53 809 18 - 28 - Es ist möglich, daß es sich bei dein hier als Bacillus coagulans bezeichneten Mikroorganismus in Wirklichkeit um Bacillus licheniformis handelt. <heading>Tabelle I</heading> Amylase aktivität - in Einheiten -/Liter - im Original-Kulturstamm von B. coagulans und in den rekombinanten Klonen von Beispiel II <table><tgroup cols="2"><tbody><row><entry>Überstehende Flüssigkeit</entry><entry>Periplasma</entry></row><row><entry>42</entry><entry>-</entry></row><row><entry>144</entry><entry>_</entry></row><row><entry>230</entry><entry></entry></row><row><entry>276,2</entry><entry>12960</entry></row><row><entry>23</entry><entry></entry></row></tbody></tgroup></table> Zellen Gesamt Steigerung der Snaymproduktion B. coagulans Lambda ΉΪΙ 781 Alpha Amy 1 E. coli CL 7002 (pCP 2) mit cm-Amplifikation E. coli GL 7002 (pCP 2) Üb e rn ac ht-Kult ure n E. coli CL 7003 (Lambda Alpha Amy. 1) 42 144 5930 13467 1185 3,43 χ 141,2 χ 320,6 χ 26,1 χ J1 Einheit ist diejenige Enzym-Menge, die 1 mg Maltose-Äquivalent pro ml pro Minute bei 50 0C ergibt, wobei 0,5 % Amylose als Substrat verwendet werden. •'Die Methode des oarnotischen Schocks wurde nicht angewendet, dafür wurde eine Lysis vorgenommen, so daß dieser Wert die Summe der /rmyläseaktivität im Periplasma und den Zellen repräsentiert. 227656 7. 53 809 18 30 - Beis-piel II A Subklonierung des Plasmids pC? 2 in Plasmid pC 194 und Darstellung des neuen Plasmids in Bacillus subtilis o Dieses Beispiel veranschaulicht eine Technik, bei der die gemäß der Erfindung hergestellte rekombinante DNS in einem von Ξ. coli verschiedenen Wirtsbakterium, nämlich in einem Kulturstamm von Bacillus subtilis exprirniert werden kann. Das Plasmid pCP 2 aus Beispiel II enthält ein 3,31-Kb-Fragment vom B. coagulans-Donator. Das Plasmid ist weiterhin durch das Übertragen von Ampizillin- und Tetrazyklin-Resistenz gekennzeichnet, und es enthält zwei Restriktionsstellen jeweils für Sco RI und Hind III. Das Plasmid pGP wurde in vier Fragmente sowohl mit 3cο RI als auch mit Kind III gespalten, mit Ligase behandelt und wie in den vorangegangenen Beispielen zur Transformierung von HB 101 verwendet. Die neugebildeten, als pGP 2,3 bezeichneten Plasmide besitzen ein 2,64-Kb-Fragment der 3. coagulans-DIiS, welches das Älpha-iünylase codierende Gen enthält. pG? 2,3 weist eine einzelne Stelle sowohl für Sco RI als auch für Hind III auf und überträgt sowohl Ampizillin- als auch Tetrazyklin-Resistenz. Für den nächsten Schritt wurde Plasmid pC 194 selektiert, welches dafür bekannt ist, daß es sich selbst in Bacillus subtilis replizieren kann. pG 194 überträgt Ghloramphenikol-Resistenz und weist eine einzelne Hind Ill-Stelle auf. Sowohl pCP 2,3 als auch pG 194 wurden mit Hind III geöffnet, vermischt und zwecks Bildung eines neuen, als pCH 1 bezeichneten Plasmids verbunden. Letzteres enthält das Älpha-Ämylase codierende Gen und besitzt sowohl Chloram- O O «7 C C C «7 58 309 18 227556 7-31 - phenikol- als auch Ainpizillin-Resistenz, obgleich das Niveau der Chloramphenikol-Resistenz in E. coli niedrig ist. V/ie vorher wurde das Produkt dazu verwendet, E. coli 101 zu transformieren. Daraufhin wurde der als QB 1133 bezeichnete Mutantenstamm, von B. subtilis,(Institut de Recherche en Biologie MoIecuiaire, ündversite Paris VII, Tour 43, 2 Place Jussieu, 75221 Paris Cedex 05), der keine Alpha-Amylase-Aktivität besitzt, entsprechend der von S. Chang und S. Cohen, Molec. Gen. Genet. 168, 111 bis 115 (1979) beschriebenen Technik zur Bildung von Protoplasten behandelt. Die Protoplasten wurden dann mit pCH 1 unter Verwendung des polyethylenglykol-vermittelten Transformationsverfahrens von Chang und Cohen (ibid.) transformiert. Die Protoplasten wurden nun in einem reichen Medium über 1,5 Stunden hinweg inkubiert, um dem Plasmid im Bakterium Gelegenheit zu geben, die Chloramphenikol-Resistenz zu expr linieren. Die Protoplasten wurden jetzt auf.einem Regenerationsmedium ausgebracht, dem Chloramphenikol in einer Menge von zugesetzt worden war. lach zweitägiger Inkubation bei 37 0C waren Kolonien von transformierten Zellen erschienen; mit Hilfe der loddampf-Färbetechnik wurden jene Kolonien ausfindig gemacht, die Alpha-Amylase-Aktivität aufwiesen. Sin als 3. subtilis Cl 8001 (pCH 1) bezeichneter Klon wurde am 13. Januar 1981 als NCIB Nr. 11629 hinterlegt. Der Originalstamm QB 1133 wurde ebenfalls am 13. Januar 1981 unter NCIB Nr. 11628 hinterlegt. B. subtilis CL 8001 (pCH 1) ist nur in Anwesenheit von Chloramphenikol stabil. Ss kann durch Kultivierung in einem Chloramphenikol enthaltenden Medium (20 Mg/ml) zur Erzeugung von Alpha-Amylase verwendet werden. Die Alpha- 227658 7-3,- Amylase kann in der Kulturflüssigkeit leicht zurückgewonnen werden. Hach einer Übernacht-Kultur in Anwesenheit von Chloramphenikol wurden folgende Liengen an produzierter Alpha-Amylase festgestellt: überstehende Zellen Gesamt Flüssigkeit (Einh./L) (Sinn./L) (Zinn./L) 136 14 150 Beisniel III Klonierung einer üeta-Amylase Ais Donor-Iviikroorganismus fungierte ein Kulturstamm des Bacillus cereus, der in der G3-P3 1 4o6 009 beschrieben ist. Er ist am Forschungsinstitut für Fermentation in Chiba-shi (Japan) am 20. Dezember 1973 als FSRH - P Nr* 2331 wie auch in der American Type Collection als ATCC ITr13 31.102 am 26. Dezember 1974 hinterlegt worden. Von dem Kulturstamm ist bekannt, daß er sowohl Beta-Ainylase als auch Alpha-1,6-glukosidase produziert ο <heading>A. KLOlISRUIiG DSS BSTA-AMYLASS-GSIiS EI LAlIBDA IM 781</heading> Die zur Restriktion, Ligation und Rückgewinnung der rekombinanten Phagen angewendeten Methoden entsprachen denen des Beispiels II. Die DES (2 Mg) von 3, cereus wurde unter den normalen Bedingungen mit dem Sco RI-Restriktbnsenzym behandelt. Die DlTS des Phagenvektors (1,25 Mg Lambda ΈΜ 731) wurde ebenfalls durch Sco RI zerschnitten Ligation und Einschleusung erfolgten in der bereits beschriebenen Weise. 3s wurden verschiedene rekombinante Phagen mit Amylase- 53 809 18 227656 7 -33 - Aktivität aufgefunden (etwa 1 auf 500). Einer dieser Phagen (als "Lambda NM 781 Beta Amy 1n bezeichnet) wurde selektiert; er ist am 12. Februar 1980 beim IiCIB als KCIB Hr. 11574 hinterlegt worden. B. RSKLOITIERUiJG DSS BSTA-AMYLASE-GSNS AUS LAMBDA NM 781 BSTA AMY 1 Il PLASMID PBR 322 Zur Steigerung der Snzymproduktion wurde dieser erste Beta-Affljläse-Klon als Quelle betaamylasecodierender DIS verwendet, urn diese durch Subklonierung in das Multikopie-Plasmid pBR 322 einzubringen. 2 Aig'Lambda· ITM 781 Beta Amy 1-DN3 und 1 ywg pBR 322 wurden mit Sco RI zerschnitten, gemischt und mit T4-Ligase behandelt. Ligation und Transformation wurden in der bereits beschriebenen weise realisiert. Eine unter 200 anipizillinresistenten Kolonien zeigte eine stärkeabbauende Aktivität. Sine dieser Kolonien wurde isoliert, als S. coii CL 7004 (p-CP 3) bezeichnet und am 15. September 1980 als NCIB Nr, 11602 hinterlegt. C. REKLOHISRUIiG DSS B3TA-AMYLASS-GSNS IH SINSN ZUR LYSO-G5NISATIQN VON S. COLI FÄHIGEN DSRIYAT DES PHAG^N LAIvSDA Als Vektor wurde der in Beispiel II beschriebene thermosensitive Phage Lambda T4 lig. Cl 857 Warn Sam Sam (Lambda NM 989) benutzt. Etwa 1yfcg DNS des Plasmids pC? 3 und °s5 /ig Phagen-DNS wurden gespalten, dann wurden die Fragmente miteinander verbunden, und die resultierenden DNS-Stücke wurden in vitro übertragen. Die Phagenpartikel mit Amylase-Aktivität wurden isoliert und mit Hilfe der bereits genannten Methode zur Erlangung von lysogenen Kolonien herangezogen. Der für diesen rekombinanten Phagen lysogene Kulturstamm E. coli C 600 wurde isoliert, mit der. 227656 7 58 809 18 - 34 - Bezeichnung 3. coli Cii 7005 (-Lambda Beta Amy 1) versehen und am 15. September 1980 als NCIB ISra11603 hinterlegt. <heading>D. AMPLlJ1IKAgIOIT DSS AHYLASB GSIJI PRO DUKTS 5</heading> In allen Klonen und Subklonen wurde die Amylase-Aktivität mit Hilfe der DHS-Hethode ermittelt. Die Beta-Amyläse-Aktivität wurde auf Dünnschicht-Chromatograrnmen durch das Vorhandensein eines einzelnen Haitoseflecks nach der Amylosedigestion bestätigt. Die Amplifikation des Beta-Amylase-Gens in unterschiedlichen Klonen wurde in der bereits beschriebenen Weise vorgenommen. Tabelle II enthält die Angaben zur enzymatischen Aktivität im Original-Kulturstamm im Vergleich zu .jener in den drei Klonen;. diese Aktivität wurde entweder vom Phagen-Lysat oder mit Hilfe der in Beispiel II beschriebenen Methode des osmotischen Schocks zurückgewonnen. <heading>Tabelle II</heading> Bxtrazelluläre und zellgebundene Beta-Amylase-Aktivität in B. cereus und in den rekombinanten Klonen Extrazelluläre Aktivität (Ί) Zellgebundene Gesamt-Aktivität Aktivität Einheit/Liter % Einheit/Liter % Einheit/Liter B. cereus (2) ATGG 31102 1420 Lambda NM 781 Beta Amy 1 80 E. coli GL 7004 (pGP 3) (3) 59 E. coli GL 7OO5 (Lambda Beta Amy 1) (4) 19 nicht ermittelt 1420 80 77,2 44,2 17,4 24 22,8 76,4 55,8 43 cn cn cn (1) Zellgebundene Aktivität: Behandlung mit Lysozym mit Lysis der Zellen (2) Die Kultur wurde bei 30 0G über Nacht angesetzt (Hefeextrakt, 1 %\ Baktotrypton, 1 %; NaGl, 0,5 %) (3) Übernacht-Kulturen bei 37 0G (gleiche Zusammensetzung des Kulturmediums) (4) Kultivierung bei 32 0C-MS 0G-»-37 0G, Messung der Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit und in den Zellen nach der Lysis wie bei E. coli Lambda Alpha Amy 1 in Beispiel II. 07CC C T58 809 18 27 6 5 6 / -36 - <heading>Beispiel IV</heading> Klonierung eines Pullulanase-Gens Als Donator-Mikroorganismus diente ein Klebsieila pneumoniae, beschrieben von H. Bender in Biochem. Z. 334, Seiten 79 bis 95 (1961) und am 6. Juni 1963 beim A1TCC unter 1"Ir0 15050 hinterlegt. Ss wird auch in der GB-PS 1 273 739 erwähnt. 2,25 /*g Donator-DNS wurden unter Standardbedingungen extrahiert und mit üco RI geschnitten; 1,25 Mg, Lambda NM 731-DNS wurden unter gleichen Bedingungen vom gleichen Enzym zertrennt. Die Inkubation erfolgte bei 37 C über drei Stunden hinweg, anschließend wurde die Reaktion durch lOminütiges 3rhitzen auf 75 0C gesteppt. Die Vollständigkeit der Restriktion wurde nach der in Beispiel II geschilderten Weise bestimmt. Die aufgespaltenen DxTS'n wurden verbunden, zurückgewonnen und - alles wie in Beispiel II - zur Infektion des Kulturstammes HB 101 von E. coli verwendet. Proy«*g Lambda-DlTS wurden etwa 2 χ 10 plaquebildende Einheiten erzielt. Nach zweitägiger Inkubation bei 37 C auf BBL Tryptikase plus 0,25 % Pullulan enthaltenden Platten zeigten einige Plaques Pullulanase-Aktivität dergestalt, daß sie von undurchsichtigen, für "überwuchernde" Bakterien charakteristischen Ringen umgeben waren. Der Anteil pullulanaseproduzierender Phagen lag im Bereich von 1 : 2500. Biner von ihnen wurde selektiert, von uns als "Lambda NM 731 Pul 1" bezeichnet und am 9. April 1930 .beim NCIB als NCIB Nr 11593 hinterlegt. Die Pullulanase-Aktivität wurde mit Hilfe der DNS-Methode ermittelt, das Produkt der Pullulan-Hydrolyse durch die Phagenlysate wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie 227 65 6 7 -*- als Maltotriose identifiziert. Lambda HM 78.1 PuI 1 enthält ein großes DlT3-Fragment (von Klebsiella pneumoniae) von 13,5 Kb; dieses Fragment wurde durch Eco RI erneut zertrennt,, was zu zwei Fragmenten von 6,1 Kb bzw. 7,4 Kb führte. Das Subfragment mit 6,1 Kb wurde dann in Lambda STM 781 rekloniert; es erwies sich als Träger des Pullulanase-Gens. Dieser neue rekombinante Phage erhielt die Bezeichnung !TM 781 Pul 2; er wurde am 15. September 1980 als ITC13 Hr. 11604 hinterlegt. Das 6,1-Kb-Subfragment wurde darüberhinaus einer Subklonierung in das Iv1IuIt ikopie-Plasmid ρ AC YC 184 '(einem Deri- TJ vat von p3R 322 mit dem Tc^-Gen des letzteren und einem Cm"-Gen mit einer Eco Rl-Stelle) unterzogen. Der so erhaltene neue Klon heißt E.-coli CL 700b (pCP 4); er wurde am 15. September 1980 als HC13 Ir. 11605 hinterlegt. Sin dritter Subklon wurde durch Einlagern des 6,1-Kb-Fragments in den Phagen Lambda ITM 989 nach der in Beispiel II beschriebenen vYeise hergestellt. Dieser Klon wird als Ξ. coli CL 7007 (Lambda PuI 2) bezeichnet; er wurde am 15. September 1980 als NCIB ITr. 116O6 hinterlegt. Der Grad der Expression und der Amplifikation der Pullulanase wurde in allen Klonen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. Wie aus den Ergebnissen ersichtlich -wird, wird die Pullulanase-Aktivität durch Maltose induziert, dem LB-Medium waren 0,04 % Maltose zugesetzt worden. .Darüber hinaus war eine Triton X 100 - Behandlung der Membränfraktion erforderlich, um die Pullulanase zurückzugewinnen; dies deutet darauf hin, daß die Aktivität in den Membranen lokalisiert ist. <heading>Tabelle 111</heading> Expression von Klebsiella-Pullulanase in E. coli-Klonen. Die Aktivität ist in Einheiten Maltose-Äquivalent für eine 1-Liter-Kultur ausgedrückt. überstehende Membranen Gesarat Steigerung der Flüssigkeit Enzymproduktion *__ Klebsie 11a pneumonia + Maltose 24 3,5 27,5 1 ' Lambda NM 781 Pul 1 0,76 2,6 3,86 0,14 Lambda NM 781 Pul 1 + Maltose 2,2 9,04 12,04 0,44 Lambda NM 781 Pul 2 9,6 23,8 32,9 1,19 σ Lambda NM 781 Pul 2 + Maltose 8,6 26,7 35,3 ' 1,28 χ ,. . ^ χ E, coli OL 7006 (pCP 4) nicht ermittelt 3,4 3,4 0,123 , χ E. coli OL 7006 (pOP 4) + Maltose nicht ermittelt 114 114 4,14 χ xx E. coli CL 7007 (Lambda Pul 2) + Maltose 47 93,5 140,5 5,13 χ χ Übernacht-Kulturen 1^ xx Kultivierung bei 32 0G 45 0G 37 0G, Messung der Aktivität in der überstehenden oo Flüssigkeit und in den Zellen nach der Lysis wie bei E._ coli Lambda Alpha Amy 1 ^ in Beispiel II. OD

Claims

Erfindungsanspruch

1. Yerfaliren zur Herstellung der rekoinbinanten DHo durch

Spalten und Verbindungen der DIiS's eines.bakteriellen : Donatormikroorganismus, der in der Lage ist, Amylase zu produzieren und eines Yektors, Einführen in einen geeigneten Wirt, Screening und Selektion der erhaltenen Klone auf der Basis eines Amylase codierenden C-ens, gekennzeichnet dadurch, daß als Vektor ein Plasmid oder die DrTS eines Derivates des Phagen Lambda verwendet wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt des Extrahierens und Schneidens der Dl¹IS eines selektierten Klons, Subklonierung in einen anderen Vektor und nochmaligem Durchprüfen und Selektieren auf der Basis eines Aniylase codierenden Gens, wobei der andere Vektor ein Plasraid oder die DrTS eines anderen Derivates des Phagen Lambda ist, und daß der Subklonierung gegebenenfalls eine oder mehrere v/eitere Subklonierungen Sigen können.

3· Verfahren nach den Punkten 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Durchprüfen (screening) durchgeführt wird, indem die Klone auf einem stärkehaltigen Kulturmedium ausplattiert werden und das Kulturmedium mit Jod eingefärbt wird, indem man die Kolonien Joddämpfen aussetzt.

4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, . daß das Amyläse codierende Gen ein Pullulanase codierendes Gen ist, und das Durchprüfen derart erfolgt, daß die Klone auf einem BBL Srypticasemedium plattiert werden, das Pullulan enthält, wobei die positiven Klone durch si.e umgebende, undurchsichtige Ringe erkennbar werden·

58 809 13

227656 7

5. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß der DonatorOrganismus Bacillus megaterium, Bacillu coagulans, Bacillus cereus oder Klebsiella pneumoniae

ist

6. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß der DonatorOrganismus Bacillus megaterium ITCIB Hr. 11568, Bacillus coagulans NCIB ITr. 11571, Bacillus cereus ATCC Hr. 31102 oder Klebsieila pneumoniae AITCC ITr. 15O5O ist.

7· Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Phage, an den der Donator gebunden ist, Lambda HIi 590 oder Lambda HM 781 ist.

8. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die DHS der selektierten Klone mit einem Plasmid verbunden ist und das Piasmid pBR 322, ρACYC 184 oder

pC 194 ist. , :

9. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die DHo der selektierten Klone mit der DHS eines anderen Derivates des Phagen Lambda verbunden ist und der Phage Lambda ITM 989 ist.

10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der bakterielle DonatormikroOrganismus ein Bacillus-Stamm ist.

11. Verfahren nach den Punkten 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um die Phagen Lambda HM 590 Amy 1, HCIB Hr. 11569; Lambda HH 781 alpha Amy 1, ITCIB Hr. 11572; LambdaKM 781 beta Amy 1, HCIB Hr. 11574; Lambda' Ml 781 PuI 1, HCIB Hr. 11593, Lambda MM 781 PuI 2, HCIB Hr· 11604 sowie Varianten und Mutanten davon behandelt ·