JPS5811998B2 - シンキナアミラ−ゼノセイゾウホウホウ - Google Patents
シンキナアミラ−ゼノセイゾウホウホウInfo
- Publication number
- JPS5811998B2 JPS5811998B2 JP50150641A JP15064175A JPS5811998B2 JP S5811998 B2 JPS5811998 B2 JP S5811998B2 JP 50150641 A JP50150641 A JP 50150641A JP 15064175 A JP15064175 A JP 15064175A JP S5811998 B2 JPS5811998 B2 JP S5811998B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amylase
- strain
- production
- gene
- introducing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
）又はその他のバチルス属の微生物によってアミラー
ゼを生産せしめるに当り、原菌株に同種あるいは異種の
微生物（細菌）より抽出したところの複数個のアミラー
ゼ生産調節遺伝子を導入することによって得られる新規
な多重形質導入（変換）株を用いることによりなるアミ
ラーゼ高力価生産方法に関するものである。
）又はその他のバチルス属の微生物によってアミラー
ゼを生産せしめるに当り、原菌株に同種あるいは異種の
微生物（細菌）より抽出したところの複数個のアミラー
ゼ生産調節遺伝子を導入することによって得られる新規
な多重形質導入（変換）株を用いることによりなるアミ
ラーゼ高力価生産方法に関するものである。
さらに詳しく説明すれば微生物のアミラーゼ生産は当該
微生物の保有するアミラーゼ生産構造遺伝子と、同じく
調節遺伝子によって夫々その生産するアミラーゼの性質
と量が支配されているが、本発明の特徴とする所はバチ
ルス属の微生物に同種あるいは異種の微生物から得られ
たアミラーゼ生産調節遺伝子の複数個を導入して飛躍的
に高いアミラーゼ産生能を有する新規な多重形質転換株
を造成し、これを用いてアミラーゼの生産量を飛躍的に
増大せしめんとするものである。
微生物の保有するアミラーゼ生産構造遺伝子と、同じく
調節遺伝子によって夫々その生産するアミラーゼの性質
と量が支配されているが、本発明の特徴とする所はバチ
ルス属の微生物に同種あるいは異種の微生物から得られ
たアミラーゼ生産調節遺伝子の複数個を導入して飛躍的
に高いアミラーゼ産生能を有する新規な多重形質転換株
を造成し、これを用いてアミラーゼの生産量を飛躍的に
増大せしめんとするものである。
尚形質の導入に用いられる手段、方法はＤＮＡを用いる
形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ）及びバク
テリオファージを経由する形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃ
ｔｉｏｎ）が用いられる。
形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ）及びバク
テリオファージを経由する形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃ
ｔｉｏｎ）が用いられる。
更に具体的には本発明は枯草菌（Ｂａｃｉｒｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）その他のバチルス属の微生物に対して後
述の第１表の如くアミラーゼの産生を４〜５倍、２〜３
倍、２〜３倍、２〜３倍、４〜７倍に増産させるａｍｙ
Ｒ２（又はＲ３）、ｐａｐ 、 ａｍｙ Ｓ 。
ｂｔｉｌｉｓ）その他のバチルス属の微生物に対して後
述の第１表の如くアミラーゼの産生を４〜５倍、２〜３
倍、２〜３倍、２〜３倍、４〜７倍に増産させるａｍｙ
Ｒ２（又はＲ３）、ｐａｐ 、 ａｍｙ Ｓ 。
ｐａｐ’、ｔｍｒという調節遺伝子を発見し、更にこれ
らの調節遺伝子を枯草菌その他のバチルス属の微生物に
複数個導入することによりアミラーゼの増産が各調節遺
伝子の相乗的効果を見出し、この相乗的なアミラーゼ増
産効果を利用してアミラーゼ産生菌の改良を行うことを
特徴としたものである。
らの調節遺伝子を枯草菌その他のバチルス属の微生物に
複数個導入することによりアミラーゼの増産が各調節遺
伝子の相乗的効果を見出し、この相乗的なアミラーゼ増
産効果を利用してアミラーゼ産生菌の改良を行うことを
特徴としたものである。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明がこの実施例に
限定されるものではないことは言うまでもない。
限定されるものではないことは言うまでもない。
実施例 １
０基本菌株 Ｂａｃｉｌｉｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ
ａｒｂｕｒｇ６１６０（注１） （注１） （受託番号） 微工研菌寄 第６５６９ （ＦＥＲＭ Ｐ−６５６９） Ｏ導入された調節遺伝子 （Ｉ） ａｍｙ Ｒ２：アミラーゼ構造遺伝子ａｍ
ｙ Ｅに近い位置に存在する調節遺伝子Ｂ、 ｎａｔｔ
ｄＩＡＭ１２１２より得られた。
ａｒｂｕｒｇ６１６０（注１） （注１） （受託番号） 微工研菌寄 第６５６９ （ＦＥＲＭ Ｐ−６５６９） Ｏ導入された調節遺伝子 （Ｉ） ａｍｙ Ｒ２：アミラーゼ構造遺伝子ａｍ
ｙ Ｅに近い位置に存在する調節遺伝子Ｂ、 ｎａｔｔ
ｄＩＡＭ１２１２より得られた。
ａｍｙ Ｒ３： ａｍｙ Ｒ２と同種の調節遺伝子
で、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ、 ａｍｙｌｏｓ
ａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ（注２）より得られた。
で、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ、 ａｍｙｌｏｓ
ａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ（注２）より得られた。
（注２） （受託番号）
微工研菌寄 第６５７１号
（ＦＥＢＭ Ｐ−６５７１）
（ＩＩ）ｐａｐ：アミラーゼ、プロテアーゼ両者の生成
を同時に調節する遺伝子、特徴として鞭毛の消失を伴う
、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ ６１６０
の変異株から得られた。
を同時に調節する遺伝子、特徴として鞭毛の消失を伴う
、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ ６１６０
の変異株から得られた。
（ＩＩＩ） ａｒｈｙＳ ： Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ｖａｒ、 ａｍｙｌｏｓａｃｃ−ｈａｒ ｉｔ ｉ
ｃｓのＤＮＡを用Ｌ−てＢ、 ｓｕｂｔｉｌｉｓＭａｒ
ｂｕｒｇ ６１６０に形質転換をさせた際、新たに生じ
たアミラーゼ生産調節遺伝子。
ｓ ｖａｒ、 ａｍｙｌｏｓａｃｃ−ｈａｒ ｉｔ ｉ
ｃｓのＤＮＡを用Ｌ−てＢ、 ｓｕｂｔｉｌｉｓＭａｒ
ｂｕｒｇ ６１６０に形質転換をさせた際、新たに生じ
たアミラーゼ生産調節遺伝子。
（５）ｐａｐ’ ：上記ｐａｐに類似の遺伝子で鞭毛
の消失を伴わない、Ｅ）、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ
、 ａｍｖｌｏｓａｒｉｔｉｃｓから得られた。
の消失を伴わない、Ｅ）、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ
、 ａｍｖｌｏｓａｒｉｔｉｃｓから得られた。
（Ｖ） ｔｍｒ：抗生物質ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ抵
抗性遺伝子で同時にアミラーゼ生産調節遺伝子であるＢ
。
抗性遺伝子で同時にアミラーゼ生産調節遺伝子であるＢ
。
５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ ＮＡ ６４ （注
３ ） （Ｂ。
３ ） （Ｂ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ ６１６０の形質転
換株）のｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ抵抗性変異株から得ら
れた。
換株）のｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ抵抗性変異株から得ら
れた。
（注３） （受託番号）
微工研菌寄 第６５７０号
（ＦＥＢＭ Ｐ−６５７０）
調節遺伝子を含むＤＮＡの調製法
Ｈ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉｕｒａ ： Ｂｉｏ
ｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２６１９−１
９６３菌をＢＹ培地（肉エキス０．５％、酵母エキス０
．２％、ヘプトン１％、ＮａＣ１Ｏ，２％）で３０℃、
２４時間培養後遠心で菌を集める。
ｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２６１９−１
９６３菌をＢＹ培地（肉エキス０．５％、酵母エキス０
．２％、ヘプトン１％、ＮａＣ１Ｏ，２％）で３０℃、
２４時間培養後遠心で菌を集める。
湿重量１１当り２ｍｌの５ａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡを加え
更に２ｒ１１／Ｉのリゾチームを加えよくかくはんする
。
更に２ｒ１１／Ｉのリゾチームを加えよくかくはんする
。
３７℃で約３０分加温し菌体がとりもち状になったらた
だちに凍結する。
だちに凍結する。
凍結した菌体に約５倍量のＴｒｉｓ−８ＤＳ緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）を加えかくはん融解し菌体を潰す。
Ｈ９，０）を加えかくはん融解し菌体を潰す。
次に等量の緩衝液飽和フェノールを加え１０〜２０分か
くはん。
くはん。
懸濁液を低速遠心し上の水層をピペットで集める。
２容の冷エタノールでＤＮＡを沈澱後５ａｌｉｎｅ−ｃ
ｉｔ、ｒａｔｅ緩衝液にとかしたものを形質転換に使用
した。
ｉｔ、ｒａｔｅ緩衝液にとかしたものを形質転換に使用
した。
上記調節遺伝子の構造はＤＮＡのレベルにおいては明ら
かではないが、遺伝子地図上の位置はａｍｙ Ｒ，ａｍ
ｙ Ｓ、 ｔｍｒは起点から約７．５％の地点に存在し
、ｐａｐ Ｍ及びｐａｐ Ｓは８６．５％付近に存在し
ている。
かではないが、遺伝子地図上の位置はａｍｙ Ｒ，ａｍ
ｙ Ｓ、 ｔｍｒは起点から約７．５％の地点に存在し
、ｐａｐ Ｍ及びｐａｐ Ｓは８６．５％付近に存在し
ている。
このことはＢａｃｉ ｌ １ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの遺
伝子全体の長さのどの付近に存在するということを意味
する。
伝子全体の長さのどの付近に存在するということを意味
する。
又、大きさについてもよく判っていないが遺伝子全体の
重さく ２．１７Ｘ １０９ダルトン）の中、アミラー
ゼ遺伝子（ａｍｙ Ｒとアミラーゼの構造遺伝子の合計
）が約１．３Ｘ１０６ダルトン程度の重さと考えられる
。
重さく ２．１７Ｘ １０９ダルトン）の中、アミラー
ゼ遺伝子（ａｍｙ Ｒとアミラーゼの構造遺伝子の合計
）が約１．３Ｘ１０６ダルトン程度の重さと考えられる
。
尚、上記調節遺伝子はこれだけを精製して形質転換する
のではなく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓがも
つ遺伝子全体を取出し、それを形質転換の受容菌に与え
てやり、色々の形質転換株の中からアミラーゼの調節遺
伝子を受は取った株を選び出すという方法によっている
。
のではなく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓがも
つ遺伝子全体を取出し、それを形質転換の受容菌に与え
てやり、色々の形質転換株の中からアミラーゼの調節遺
伝子を受は取った株を選び出すという方法によっている
。
この方法は各種の形質転換株を１％可溶性デンプンを含
んだＢＹ培地（肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％
、ペプトン１％、ＮａＣ１０，２％）のプレート上に生
育させ、適当な大きさになったときにＩｚ−ＫＩ溶液（
Ｍ／６００）をスプレーしテヤリ、菌のコロニーの周り
にできるヨード澱粉反応のクリアゾーン（Ｈａｌｏ）の
大きさで調節遺伝子の形質転換株を選択する。
んだＢＹ培地（肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％
、ペプトン１％、ＮａＣ１０，２％）のプレート上に生
育させ、適当な大きさになったときにＩｚ−ＫＩ溶液（
Ｍ／６００）をスプレーしテヤリ、菌のコロニーの周り
にできるヨード澱粉反応のクリアゾーン（Ｈａｌｏ）の
大きさで調節遺伝子の形質転換株を選択する。
形質転換法
Ｃ，Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｊ、
５ｐｉｚｉｚｅｎ ： Ｊ。
５ｐｉｚｉｚｅｎ ： Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｅｌ ８１７４１−１９６１ＴＢＡＢ
プレートに一晩培養した受容菌を培地Ｉにうえる。
プレートに一晩培養した受容菌を培地Ｉにうえる。
３７℃、約４時間の振と５培養で対数増殖期を過ぎ静止
期に入る。
期に入る。
この時期に達した菌を培地■に１０倍に薄め培養を更に
９０分続けると、ＤＮＡを取り込みやすい” ｃｏｍｐ
ｅｔｅｎｔ ”な状態になる。
９０分続けると、ＤＮＡを取り込みやすい” ｃｏｍｐ
ｅｔｅｎｔ ”な状態になる。
この時導入してやりたい調節遺伝子をもったＤＮＡを与
えてから約６０分後、選択培地にブレーティングした。
えてから約６０分後、選択培地にブレーティングした。
定量方法及び単位の表示
０．５％の可溶性澱粉溶液（Ｍ／２５リン酸緩衝液ｐＨ
６，０）２ｍｌに試料酵素液１ ｒｕｌを加え４０℃、
５分間反応せしめた後、その０．２ ｍｌを５ｍｌのＭ
／６０００ １２−ＫＩ浴液溶液加、生じたヨード澱粉
反応の色調を７００ｍμで測定する。
６，０）２ｍｌに試料酵素液１ ｒｕｌを加え４０℃、
５分間反応せしめた後、その０．２ ｍｌを５ｍｌのＭ
／６０００ １２−ＫＩ浴液溶液加、生じたヨード澱粉
反応の色調を７００ｍμで測定する。
０．１１ｎ９の可溶性澱粉を１分間に加水分解する酵素
量を１単位とする。
量を１単位とする。
又Ｂ、 ｓｕｂ Ｍａｒｂｕｒｇ ６１６０及びＢ、
ｓｕｂ ｖａｒ。
ｓｕｂ ｖａｒ。
ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓはいずれも糖化
型α−アミラーゼを菌体外に産生じ以下の様な性質をも
っている。
型α−アミラーゼを菌体外に産生じ以下の様な性質をも
っている。
次にＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ ６１６
０に、上記の調節遺伝子を導入した株について、アミラ
ーゼの生産性を調べて次表の結果を得た。
０に、上記の調節遺伝子を導入した株について、アミラ
ーゼの生産性を調べて次表の結果を得た。
即ち枯草菌６１６０株にａｍｙＲ２（４〜５倍増産）
ｐａｐ （２〜３倍増産）を導入するとアミラーゼ産生
が１１．４μから１４０μに増産され約１３倍になって
おり、これはａｍｙＲ２とｐａｐの相乗的増産効果を示
している。
ｐａｐ （２〜３倍増産）を導入するとアミラーゼ産生
が１１．４μから１４０μに増産され約１３倍になって
おり、これはａｍｙＲ２とｐａｐの相乗的増産効果を示
している。
又ａｍｙＲ２（４〜５倍増産）とｔｍｒ（４〜７倍増産
）を導入すると１１．４μが１７５μに相乗的に増産さ
れる。
）を導入すると１１．４μが１７５μに相乗的に増産さ
れる。
更にまたａｍｙＲ’２、ａｍｙ Ｓ、 ｐａｐ’、及び
ｔｍｒの４個の遺伝子を導入した菌株■（ＴＭ２３）及
びａｍｙＲ２、ａｍｙ、Ｓ、 ｐａｐ’、 ｔｍｒ及び
ｐａｐの５個の遺伝子を導入した菌株Ｋ（ｐｐ１３）で
は夫夫アミラーゼ産生能が１１．４μから１４７５μと
２５３Ｑμに増産され、その相乗増産効果が極めて顕著
である。
ｔｍｒの４個の遺伝子を導入した菌株■（ＴＭ２３）及
びａｍｙＲ２、ａｍｙ、Ｓ、 ｐａｐ’、 ｔｍｒ及び
ｐａｐの５個の遺伝子を導入した菌株Ｋ（ｐｐ１３）で
は夫夫アミラーゼ産生能が１１．４μから１４７５μと
２５３Ｑμに増産され、その相乗増産効果が極めて顕著
である。
以上のごとく単数側の調節遺伝子の導入でもアミラーゼ
産生能に著しい向上は認められないが、本発明法による
複数個の導入では相乗的に著しい向上が認められ、その
向上は一般的に予想されるごとき相加的なも゛ので１よ
に火、それをはるかに凌ぐ飛躍的なものであることが見
出された。
産生能に著しい向上は認められないが、本発明法による
複数個の導入では相乗的に著しい向上が認められ、その
向上は一般的に予想されるごとき相加的なも゛ので１よ
に火、それをはるかに凌ぐ飛躍的なものであることが見
出された。
Claims (1)
- １ アミラーゼ生産能を有しかつ形質の導入可能なバチ
ルス属の原菌株にこれと同種あるいは異種の微生物から
なるアミラーゼ生産調節遺伝子を導入することによって
形質転換株を造成しこれを培養してアミラーゼを製造す
る方法において、上記の原菌株に複数個のアミラーゼ生
産調節遺伝子を導入してアミラーゼ生産能の高い多重形
質転換株とすることを特徴とする新規な多重形質転換株
を用いるアミラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP50150641A JPS5811998B2 (ja) | 1975-12-19 | 1975-12-19 | シンキナアミラ−ゼノセイゾウホウホウ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP50150641A JPS5811998B2 (ja) | 1975-12-19 | 1975-12-19 | シンキナアミラ−ゼノセイゾウホウホウ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5276480A JPS5276480A (en) | 1977-06-27 |
| JPS5811998B2 true JPS5811998B2 (ja) | 1983-03-05 |
Family
ID=15501278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50150641A Expired JPS5811998B2 (ja) | 1975-12-19 | 1975-12-19 | シンキナアミラ−ゼノセイゾウホウホウ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5811998B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4944342A (ja) * | 1972-09-04 | 1974-04-26 |
-
1975
- 1975-12-19 JP JP50150641A patent/JPS5811998B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4944342A (ja) * | 1972-09-04 | 1974-04-26 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5276480A (en) | 1977-06-27 |
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