FI70424B - Foerfarande foer framstaellning av rekombinant-dna som innehaoller en amylaskodande gen - Google Patents

Description

1 70424

Menetelmä yhdistelmä-DNA:n valmistamiseksi, joka sisältää amylaasia koodaavan geenin

Keksintö on geneettisen insinööritaidon alueelta ja 5 sen kohteena on erityisesti rekombinantti-DNA:n (deoksi- ribonukleiinihapon), joka sisältää amylaasia koodaavan geenin, valmistus ja tämän hyväksikäyttö mikro-organismien tuottamiseksi amylolyyttisten entsyymien suurta tuotantoa varten.

10 Vaikka käsitettä "geneettinen insinööritaito" (gee nimanipulaatio) usein käytetään kuvaamaan suurta joukkoa menetelmiä jonkin organismin geneettisen informaation keinotekoista muuttamista varten, sitä tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa käytetään ainoastaan tarkoittamaan 15 yhdistelmä-DNA:n valmistusta jostakin luovuttaja-mikro- organismista ja sopivasta vektorista in vitro, valikointia halutun geneettisen informaation perusteella ja valitun DNA:n vientiä sopivaan mikro-organismiin (isäntä-mikro-organismiin), jolloin haluttu (vieras) geneettinen infor-20 maatio tulee isännän täyden geenistön osaksi. Käsite "kloonattu mikro-organismi", kuten sitä käytetään läpi tämän selityksen ja patenttivaatimusten, tarkoittaa tällä menetelmällä valmistettua mikro-organismia.

Käsitteet "amylaasi" ja "amylolyyttinen entsyymi" 25 ovat synonyymejä ja niitä käytetään kautta koko tämän selityksen ja patenttivaatimusten tarkoittamaan yleisesti niitä entsyymejä, jotka pystyvät katalysoimaan tärkkelyksen hydrolyysin, kuten alfa-amylaasi, beta-amylaasi, iso-amylaasi (alfa-1,6 - glukosidaasit, kuten pullulanaasi mu-30 kaan luettuina), glukoamylaasi jne.

Viime vuosien aikana on tietenkin kirjoitettu runsaasti geenimanipulaatiosta (joista monista erinomaisista katsauksista kaksi on "DNA Cloning and the Analysis of Plasmid Structure and Function", tekijöinä K.N. Timmis, 35 S.N. Cohen ja S.C. Cabello, Prog, Molec, subcell Biol. 6, 1978 sivut 1-58 ja "Lambdoid Phages that Simplify the 2 70424

Recovery of in vitro Recombinants", tekijöinä Noreen E. Murray, W.J. Brammar ja K. Murray, Molec. gen. Genet, 150, 1977 sivut 53-6), jotka sisältävät monia kuvauksia uusista, geneettisesti modifioiduista mikro-organismeista, joilla 5 on arvokkaita ominaisuuksia. Bunzi Maruo'n, Yoko Yoneda'n ja Gakuzo Tamura'n japanilaisessa patenttijulkaisussa nro SHQ 52-76480 (julkaistu 27.6.1977, jätetty 19.12.1975 SHO 50-150641:nä) esitetään runsaasti amylaasia tuottavien mikro-organismien kantojen valmistus in vivo mutageneesi-, 10 transduktio- ja transformointimenetelmin useiden geneettisten ominaisuuksien kokoamiseksi amylaasi-tuotannon edistämiseksi Bacillus-mikro-organismissa. Nämä menetelmät, jotka eivät käsitä geenimanipulointia, kuten se tässä määritellään, rajoittuvat yhteen ainoaan tai muutamaan lähi-15 sukuiseen (geneettisesti käsittäen) mikro-organismiin. Nämä kannat eivät myöskään ole sopivia geeniamplifikaatioon (esim. faagilla tai plasmidilla), jota tässä keksinnössä käytetään suurempaa entsyymituotantoa varten. Eräässä äskettäin otsikolla "Cloning of a Foreign Gene Coding for Alpha-amylase 20 in Bacillus subtilis", Biochemical and Biophysical Research Communications 91, nro 4, sivut 1556-1564 (joulukuu 28, 1979), Yoko Uoneda, Scott Graham ja Frank E. Young kuvaavat alfa-amylaasia koodaavan geenin kloonausta Bacillus subtilikseen sitomalla Bacillus amyloliquefaciensH:n pil-25 kottu DNA temperaatin faagin phi 3T DNA:hän ja transformoimalla sen jälkeen Bacillus subtilis-soluja, joista amy-laasi puuttuu. Tekijät eivät esitä mitään todistusta gee-niamplifikaatiosta, johon liittyy amylaasientsyymin yhtenäinen tuotanto, mikä on tämän keksinnön päätarkoitus.

30 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan geneettises ti manipuloituja mikro-organismeja, jotka pystyvät, sopivissa viljelyolosuhteissa, tuottamaan olennaisesti suurempia määriä amylolyyttisiä entsyymejä kuin luovuttaja-mikro-organismilla voidaan tuottaa. Eräässä edullisessa suoritus-35 muodossa näin tuotetuilla amylaaseilla on yksi tai useampi ominaisuus, joka tekee ne erityisen käyttökelpoisiksi teollisissa entsymaattisissa tärkkelys-hydrolyyseissä (esim.

3 70424 tärkkelyksen entsymaattisessa nesteyttämisessä ja/tai soke-riksimuuttamisessa liimojen, viimeistelyaineiden, maltodekstriinien, koostumukseltaan erilaisten tärkkelyssiirap-pien, maltoosin, dekstroosin jne. tuottamiseksi), kuten kes-5 tävyys korkeita lämpötiloja vastaan, kestävyys raskasme-tallimyrkytystä vastaan jne.

Keksintö toteutetaan uuttamalla ensin DNA baktee-ri-mikro-organismista (luovuttaja-mikro-organismista), joka pystyy tuottamaan ainakin yhtä amylolyyttistä entsyymiä, 10 pilkkomalla (sopivalla restriktioentsyymillä) DNA sekä, vektorina, faagin lambda johdannaisen DNA ja yhdistämällä ja liittämällä saadut osaset rekombinantti-DNA:iden muodostamiseksi, joista jotkut sisältävät amylaasia koodaavan geenin. Rekombinantti-DNA:t tehdään biologisesti aktiivisiksi 15 insertiolla sopiviin isäntäsoluihin (esim. E. coli:iin) in vitro -kapseloinnilla tai transfektiolla.

Syntyneet kloonit seulotaan sitten amylaasia koodaavan geenin suhteen ja yksi tai useampia positiivisia klooneja valitaan ja monistetaan saaden siten aikaan uusia, 20 geneettisesti manipuloituja bakteeri-n*ikro-0rganismeja, jotka pystyvät, sopivissa viljelyolosuhteissa, tuottamaan oleellisesti suurempia määriä amylaasia kuin luovuttaja-mikro-organismilla voidaan tuottaa. Valinnaisesti uuden faagin DNA uutetaan, pilkotaan ja subkloonataan toisen 25 vektorin, joka voi olla joko plasmidi tai toinen faagi, ja uudet kloonit seulotaan ja valikoidaan amylaasia koodaavan geenin läsnäolon perusteella. Voidaan suorittaa myös peräkkäisiä "sub-sub-kloonauksia".

Sen lisäksi, että keksintö tuottaa uusia, geneetti-30 sesti manipuloituja mikro-organismeja, jotka ovat amylaa-sin "ylituottajia", on sillä se lisäetu, että sen seurauksena siirtyy ensisijaisesti geeni yhden ainoan amylolyytti-sen entsyymin tuotantoa varten, vähentäen siten suuresti puhdistamista, joka on tarpeen ei-geneettisesti manipuloi-35 tujen mikro-organismien viljelmissä.

Kun kloonattu mikro-organismi, joka sisältää halutun rekombinantti-DNA:n, on tuotettu, mikro-organismia 4 70424 viljellään siten, että rekombinantti-DNA:ta vahvistetaan siten antamaan amylaasia olennaisesti suuremmissa määrissä kuin luovuttaja-mikro-organismilla voidaan tuottaa.

Kun vektori on faagin lambda johdannainen, jolloin 5 isäntä-mikro-organismi on välttämättä E. coli, voidaan vahvistaminen ja entsyymin tuotanto toteuttaa seuraavasti. Jos faagi on lysogeeninen, viljellään mikro-organismia, ts.

E. colia ensin solujen monistamiseksi sopivaan tiheyteen, ne infektoidaan sitten sopivalla määrällä bakteriofaagia 10 ja systeemiä viljellään, kunnes soluseinät ovat tuhoutuneet ja amylaasi leviää viljelyväliaineeseen.

Kun vektori-isäntä -systeemi on sopiva lambda-lyso-geeninen E. coli, viljellään infektoitua isäntä-mikro-or-ganismia ensin 32°C:ssa bakteerisolujen monistamiseksi so-15 pivaan tiheyteen, minkä jälkeen lämpötila nostetaan 42°C:seen ja pidetään siinä tietty aika lysogeenisen syklin indusoimiseksi ja tuodaan sitten 37°C:seen ja pidetään siinä vieraan läsnäolevan DNA:n amplifikaation aikaansaamiseksi mitä seuraa suurten amylaasimäärien tuotanto. Soluseinät 20 voivat mahdollisesti tuhoutua, riippuen olosuhteista, jossa tapauksessa amylaasi leviää viljelyväliaineeseen.

Kun vektori on monikopio-plasmidi, kuten pBR 322 tai paCYC 184, vieraan DNA:n amplifikaatio tapahtuu itsestään. Vaihtoehtoisesti geneettisesti manipuloi-25 tua mikro-organismia, joka sisältää plasmidi-DNA:n, viljellään ensin bakteerisolujen monistamiseksi haluttuun tiheyteen, minkä jälkeen lisätään klooriamfenikolia; koska antibiootti estää proteiinisynteesin, se estää solujen lisä-monistumisen ja amylaasin tuotannon, mutta sallii plasmi-30 di-DNA:n monistumisen (vahvistumisen) solujen sisällä. Lopuksi solut erotetaan viljelyväliaineesta ja pestään kloo-riamfenikolin poistamiseksi. Amylaasin tuotantoa varten soluja viljellään sitten uudelleen, tietenkin ilman klooriamfenikolia, suurten amylaasimäärien tuottamiseksi.

35 Kaikissa geenimanipuloinneissa on tietenkin olennais ta, että pystytään "merkitsemään" ja siten valikoimaan ne kloonit, jotka sisältävät halutun geneettisen informaation.

fl s 70424 Tämän keksinnön käytännössä tähän päästään helposti käyttä-tämällä väliainetta, joka sisältää tärkkelystä, jos halutaan alfa-amylaasi-, beta-amylaasi- tai glukoamylaasiak-tiivisuutta. Viljelyväliaine värjätään sitten jodilla; kloo-5 neja, joilla on amylaasiaktiivisuutta tärkkelystä sisältävällä väliaineella, ympäröi valkea alue. Eräs spesifinen, edullinen värjäysmenetelmä selostetaan tämän jälkeen. Jos halutaan pullulanaasiaktiivisuutta, viljellään klooneja BBL-tryptikaasi -väliaineessa, joka sisältää pullulaania. Myös 10 tätä menetelmää kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä.

Keksintöä kuvataan nyt tarkemmin yksityiskohtaisesti, kuten spesifisiä aineita ja menetelmiä, joita työssä on käytetty. On todettava, että monet käytetyistä menetelmistä ovat "standardi"-menetelmiä ja tämän alan asian-15 tuntijoiden hyvin tuntemia; tästä huolimatta joitakin näistä kuvataan yksityiskohtaisesti selvyyden vuoksi.

Luovuttaja-mikro-organismi

Luovuttaja-mikro-organismin tulisi olla bakteeri-mikro-organismi, joka pystyy tuottamaan ainakin yhtä amy-20 laasia (haluttu amylaasi tietenkin mukaan luettuna), ja edullisesti se tuottaa amylaasia, jolla on ominaisuuksia, jotka ovat haluttuja tärkkelyksen teollisessa hydrolyysis-sä, esim. kestävyys korkeita lämpötiloja tai metallimyr-kytystä vastaan. Todennäköisesti luovuttaja voi olla 25 myös eukaryoottinen amylaasia tuottava mikro-organismi (esim. sieni tai hiiva); suhteellisesta yksinkertaisuudesta johtuen työskenneltäessä DNA:n prokaryoottisen lähteen kanssa verrattuna eukaryootteihin, tämä työ on rajoitettu bakteereihin ja tämä keksintö rajoittuu sen tähden baktee-30 riluovuttajan käyttöön. Kuten esimerkeistä käy ilmi, on menestyksellisesti käytetty Bacillus megaterium, Bacillus coagulans-, Bacillus cereus- ja Klebsiella pneumoniae -kantoja kloonattujen mikro-organismien tuottamiseksi, jotka pystyvät tuottamaan suuria määriä alfa-amylaasia, kuumuut-35 ta kestävää alfa-amylaasia, beta-amylaasia ja pullulanaa-sia vastaavasti.

6 70424

Ligaatio- ja restriktioentsyymit Tässä työssä on yhdenmukaisesti käytetty liitäntä-entsyvminä T4 DNA-ligaasia, mutta on helposti ymmärrettävä, että voidaan käyttää mitä tahansa DNA:ta liittävää entsyy-5 miä. Tässä työssä käytetyt spesifiset restriktioentsyymit on esitetty esimerkeissä. Sopivan restriktioentsyymin valinnan voi tietenkin alaan perehtynyt asiantuntija tehdä käyttäen hyvin tunnettuja menetelmiä. Tässä on menetelmänä restriktioentsyymin valitsemiseksi jatkokäsittelyä 10 varten ollut pilkkoa luovuttaja-mikro-organismista uutettu DNA (luovuttaja-DNA) eri restriktioentsyymillä ja valita yksi (tai useampi kuin yksi), joka on sopivin lisäkokeita varten, entsyymin kyvyn perusteella pilkkoa DNA lukuisiksi osasiksi kooltaan väliltä 2-15 kiloemästä.

15 Vektorit

On useita syitä miksi faagin lambda johdannaiset ovat erityisen tehokkaita luovuttajasta uutetun DNA:n kloonausta varten. (1) Faagin lambda deleetio-mutantit sallivat erikokoisten (riippuen tietenkin kyseisestä lambda-joh-20 dannaisesta) vieraiden DNA-osasten insertion ja lisäksi tekevät mahdolliseksi vierasta DNA:ta sisältävien kloonien yksinkertaisen tunnistamisen. (2) On kehitetty faagin lambda eri johdannaisia, jotka sallivat useiden restriktioentsyy-mien käytön, lisäten siten menestyksellisen kloonauksen 25 toteutumismahdollisuuksia. (3) Vieraiden geenien erittäin hyvät vahvistukset ovat mahdollisia käytettäessä sopivia faagin lambda-johdannaisia. (4) Ligaation jälkeen rekombi- nantti-kloonien talteenotto tapahtuu helposti transfektiol-la tai in vitro -täytöllä. Monipuolisuutensa, jota mikään 30 muu olemassaoleva vektori ei voi antaa, ansiosta käytetään tässä keksinnössä faagin lambda-johdannaisia ja E. colia isäntänä luovuttajasta uutetun DNA:n alkukloonausta varten.

Muut edut faagin, mieluummin kuin plasmidin, käytös-35 tä primaarikloonausta varten ovat seuraavat: (1) Rekombi-nanttien, joissa on vieraita DNA-insertiojaksoja, prosentti on suurempi; (2) Bakteerit hajoavat vapauttaen siten ti 7 70424 solusisältönsä ja siten kaiken amylaasin väliaineeseen helpottaen siten havaitsemista jodivärjäysmenetelmällä; (3) Faagin resistenssi jodia vastaan on suurempi kuin millään muulla elävällä bakteerilla.

5 Alaan perehtynyt pätevä geneetikko pystyy helposti valitsemaan plasmidin vektoriksi subkloonausta varten, jolloin yhtenä kriteeriona on tietenkin yhden ainoan tai rajoitetun määrän pilkontakohtia olemassaolo käytettävää res-triktioentsyymiä varten.

10 Eniten tässä käytettyjä plasmideja ovat pBR 322 ja paCYC 184. Koskemattomassa tilassaan plasmidi pBR 322 antaa resistenssin sekä ampisilliinille että tetrasyklii-nille ja sisältää yhden ainoan pilkontakohdan jokaiselle Pst I-, EcoRI-, Hind III-, Bam HI- ja Sal I entsyymeistä.

15 Pilkkominen ja insertio Pst I-kohdassa tuhoaa resistenssin ampisilliinille, kun taas insertio Bam HI- ja Sal I-kohtiin tuhoaa resistenssin tetrasykliinille. Insertio Hind ΙΙΙ-kohtaan tuhoaa joskus resistenssin tetrasykliinille, edellyttäen, että kloonatussa geenissä ei ole omaa 20 promoottoria.

Koskemattomassa tilassaan plasmidi paCYC 184 antaa resistenssin sekä tetrasykliinille että klooriamfenikolille, ja sisältää yhden ainoan restriktiokohdan kullekin entsyymeistä Eco Rl, Hind III, Bam HI ja Sal I. Pilkkominen ja 25 insertio Eco RI-kohdassa tuhoaa resistenssin klooriamfenikolille, kun taas insertiolla kolmeen muuhun kohtaan Hind Ulille, Bam Hiille ja Sai li lie on samat vaikutukset kuin plasmidissa pBR 322, koska tämä alue on yhteinen kummallekin plasmidille.

30 Subkloonausta varten Bacillus subtilikseen käytet tiin tässä plasmidia pC 194 vektorina. Tällä plasmidilla on yksi ainoa Hind ΙΙΙ-kohta ja se antaa resistenssin klooriamfenikolille.

Isäntä-organismi 35 Koska faagin lambda-johdannaisia voidaan ekspressoi- da ainoastaan E. colissa, täytyy tämän ilmeisesti olla isäntä rekombinanttifaagi-DNA:lie, joka on valmistettu 8 70424 tämän keksinnön mukaisesti. Kun rekombinantti-DNA toisaalta on plasmidin muodossa, voidaan käyttää mitä tahansa mikro-organismia, joka pystyy ottamaan vastaan ja kopioimaan tällaisen plasmidi-DNA:n, esim. muita bakteeri-mikro-organis-5 meja tai hiivoja, kuten Saccharomyces cerevisiaeta.

Käytännön syistä on tässä käytetty E. coli -kantoja (esim. HB 101) suurimmaksi osaksi, koska ne ovat hyvin tunnettuja kantoja geneettiseltä kannalta ja ovat herkkiä infektiolle tunnetuilla faageilla ja plasmideilla, mistä 10 on seurauksena lisääntynyt entsyymin ylituotantokyky.

Kuten esimerkissä IIA on selostettu, voidaan rekom-binanttiplasmidi subkloonata plasmidiksi, kuten pC 194:ksi, joka pystyy monistumaan B sub tiliksessa.

Menetelmä 15 Menetelmää kuvataan kaksivaiheisen kloonauskokeen avulla, jolloin ensimmäisessä vaiheessa (shotgun) käytetään faagia ja toisessa vaiheessa plasmidia.

Kun luovuttaja-mikro-organismi, restriktio- ja ligaa-tioentsyymit ja faagin lambda spedifinen johdannainen on 20 valittu, DNA:t uutetaan, pilkotaan, sekoitetaan ja yhtyneet osaset liitetään, kaikki tavanomaisin menetelmin, jotka eivät tässä selitystä kaipaa.

DNA tehdään sitten biologisesti aktiiviseksi E. colissa transfektiolla tai in vitro kapseloinnilla.

25 Tässä työssä lambda-DNA:11a on päästy hyvään tulokseen kap-selointimenetelmällä (B. Hohn ja K. Murray, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 74, 3259-3263, 1977). Ne kloonit, jotka ovat saaneet vieraan DNA:n, tunnistetaan sitten sopivin menetelmin. Jos käytetään insertio-vektoria, kuten lambda 30 NM590 tai lambda NM607, antavat ne kloonit, jotka sisältä vät vierasta DNA:ta, kirkkaita plakkeja,kun taas ne, jotka eivät sisällä vierasta DNA:ta, antavat sameita plakkeja. Kun käytetään korvausvektoria, kuten lambda NM761 tai lambda NM781, voidaan identifiointi tehdä viljelemällä E. coli 35 lac amber -resipientilla laktoosi-indikaattori -väliaineella, esim. McConkey, EMB tai X gal.

Il 9 70424

Lukuisia (useita tuhansia) klooneista,jotka ovat ottaneet vastaan vieraan DNA:n, levitetään sitten väliaineelle, joka sisältää tärkkelystä, ja seulotaan amylaasia koodaa-van geenin läsnäolon suhteen edellä mainitulla jodi-vär-5 jäysmenetelmällä. Tällöin on tietenkin pidettävä huoli siitä, että ei käytetä niin suuria jodiväkevyyksiä, että faa-gi tapetaan, ja tämä voi olla ongelma, jos jodi lisätään liuoksen muodossa. Tässä käytetty erittäin edullinen värjäysmenetelmä käsittää levyjen altistamisen jodihöyrylle 10 lyhyeksi ajaksi; tätä menetelmää on tässä käytetty erittäin hyvällä menestyksellä.

Eräs edullinen menetelmä kloonien löytämiseksi,joilla on on pullulanaasiaktiivisuus, jossa menetelmässä ei käytetä jodivärjäystä, selostetaan seuraavassa. Faageja viljellään 15 petrimaljoilla, jotka sisältävät BBL tryptikaasia ja pullu-laania väkevyydessä n. 0,25 %. Pullulaani väliaineessa "positiivisten" plakkien ympärillä hydrolysoituu pullulanaasin vaikutuksesta maltotrioosiksi, jota bakteerit käyttävät.

Siten ne bakteerit, joita ravitaan maltotrioosilla, kasva-20 vat paremmin kuin muut kasvualustalla, sillä seurauksella, että plakkeja,jotka tuottavat pullulanaasia, ympäröi läpi-kuultamaton rengas kasvavia bakteereja ja ne voidaan helposti havaita. Tätä menetelmää on selitetty yksityiskohtaisesti esimerkissä IV.

25 Yksi (tai useampi) positiivinen klooni poimitaan sitten ja monistetaan. Tämä voi tietenkin olla "lopullinen" geneettisesti manipuloitu mikro-organismi ja sitä voidaan käyttää tuottamaan suuria määriä amylaasia sopivalla viljelyllä, kuten edellä selostettiin. Vaihtoehtoisesti tätä 30 kloonia voidaan käyttää DNA:n lähteenä toista kloonausta varten plasmidiin tai muuhun, sopivampaan faagiin. Seuraavassa selostetaan subkloonausmenetelmää plasmidiin.

Jälleen kloonien DNA standardimenetelmiä käyttäen uutetaan ja pilkotaan restriktioentsyymillä, plasmidi pil-35 kotaan samoin, osaset sekoitetaan ja yhdistyneet osaset liitetään. Käytettäessä plasmidia pBR 322 kloonien, jotka ovat ottaneet vastaan amylaasia koodaavan geenin sisältävän 10 70424 DNA:n, tunnistaminen tapahtuu tekemällä DNA biologisesti aktiiviseksi isännässä, kuten E. colissa transformoimalla, viljelyväliaineessa, joka sisältää ampisilliiniä tai tetrasykliiniä, riippuen käytetystä restriktioentsyymistä. Vil-5 jelyväliaine sisältää myös tärkkelystä tai pullulaania ja kloonien, jotka sisältävät amylaasia koodaavan geenin, tunnistaminen tapahtuu jollakin edellä kuvatuista menetelmistä. Positiivisia klooneja viljellään sitten ja plasmidi-DNA:ta voidaan sitten vahvistaa klooriamfenikolin avulla, kuten 10 edellä selostettiin.

Piirrokset esittävät karttoja villintyyppisestä bak-teriofaagi lambdasta (kuvio 1a) ja kaikista käytetyistä vektoreista sekä seuraavien esimerkkien mukaisesti tuotetuista uusista rekombinantti-plasmideista. Erityisesti 15 kuviossa 1 esitetään myös karttoja faageista lambda NM 590 (b) ja lambda NM 781 (c), /Murray, N.E.,Brammar, W.J.,

Murray, K., (1977)./ Molec. Gen. Genet, 150, 53-61. Kuvio 2 käsittää karttoja plasmideista pBR 322 /Bolivar, F., Rodriquez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., 20 Boyer, H.W., (1977), Gene 2, 95-113/ ja pACYC 184 /Chang, A.C.Y., Cohen, S.N. (1978) J. Bact. 132, 1141-1156/. Kuvio 3 on kartta uudesta plasmidista pCP 1 ja kuvio 4 on uusi plas-midi pCP 2. Kuvio 5 valaisee esimerkkiä IIA, esittäen plas-mideja pC 194, pCP 2,3 ja lopullista uutta plasmidia pCH 1.

25 Kuviot 6 ja 7 esittävät plasmideja pCP 3 ja pCP 4, vastaavasti. Kaikkien uusien rekombinantti-plasmidien kartoissa luovuttaja-DNA on osoitettu paksulla viivalla.

Esimerkit valaisevat keksinnön käytäntöä. Prosentit on laskettu painosta ellei toisin ole esitetty. Kaikki ko-30 keet suoritettiin seuraten NIHsin (USA) antamia oheita.

11 70424

Esimerkki I

Alfa-amylaasi-geenin kloonaus Käytettiin seuraavia aineita: restriktioendonukleaasi Hind III 5 T4 DNA-ligaasi

Faagi lambda NM 590. Faagi-DNA valmistettiin fenoli-uutolla erittäin pitkälle puhdistetuista faagiosasista.

Plasmidi pBR 322. Plasmidi-DNA puhdistettiin lysot-syymillä hajotetuista E. coli -soluista cesiumkloridi- 10 etidiumbromidi-tiheysgradienteilla.

Isäntä-mikro-organismi, E. coli HB 101.

Luovuttaja-mikro-organismi oli Bacillus megaterium -kanta, jolla on seuraavat mikrobiologiset tunnusmerkit: (1) Morfologia: sauvoja (0,5 - 0,7 ju x 2,0 - 5,0 ^u) , 15 liikkuvia, grampositiivinen, itiöt ovat terminaalisia tai subterminaalisia.

(2) Ravintoliemi: hyvä kasvu.

(3) Ravinto-agar-liemi: hyvä kasvu; pesäkkeet ovat tiiviitä keskeltä ja hajanaisempia ympärillä.

20 (4) Maito: peptonisaatio ilman pH-arvon muutosta.

(5) Gelatiini: ei nesteydy (6) Nitraattien pelkistys: negatiivinen.

(7) Katalaasi-reaktio: negatiivinen.

(8) Oksidaasireaktio: negatiivinen.

25 (9) Sytokromi-oksidaasireaktio: negatiivinen.

(10) Indolin tuotanto: negatiivinen.

(11) H2S:n muodostus: negatiivinen.

(12) hiilihydraattien hyväksikäyttö: käyttää arabi-noosia, ksyloosia, galaktoosia, glukoosia, levuloosia, mal- 30 toosia, raffinoosia, sakkaroosia, tärkkelystä ja niistä tuotettua happoa. Ei käytä hyväksi ramnoosia, mannoosia, melibioosia, inuliinia ja salisiinia.

(13) Polyolien hyväksikäyttö: käyttää hyväksi sorbitolia ja mannitolia; ei käytä hyväksi adenitolia, dulsito- 35 lia ja inositolia.

(14) Dekarboksylaasireaktio lysiinillä: negatiivinen.

(15) Ureolyysi: heikko.

i2 70424 (16) Kestävyys raskaita metalleja vastaan: kasvaa suoraan 500 ppm:lla Cr+++.

(17) Natriumkloridiliemi: kasvua NaCl-pitoisuudessa 3,5 %.

5 (18) Optimilämpötila kasvua varten: 30-37°C

Maksimilämpötila kasvulle: 40-50°C

Minimilämpötila kasvulle: 5-20°C

(19) Hapen tarve: aerobinen.

Mikro-organismi tunnistettiin Bacillus megateriumiksi 10 mikrobiologisten tunnusmerkkiensä perusteella viitaten käsikirjaan Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. painos), R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, aputoimittajia; julkaissut Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. Tämä mikro-organismi on talletettu kokoelmaan National 15 Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, PO Box No. 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Skotlanti, 12.2.1980, ja sille on annettu NCIB nro 11568.

Seuraavassa selostus käytetystä menetelmästä.

A. In vitro -rekombinaatio lambdan ja B megaterium-20 DNA:iden välillä N. 7 ,ug B. megaterium-DNA:ta pilkottiin 10 yksiköi-

O

lä Hind III 37 C:ssa yksi tunti 25 ^,ul:ssa Tris-puskuria pH 7,5:ssä. N. 2 ^ug lambda NM 590 pilkottiin samalla tavalla samalla entsyymillä. Reaktiot pysäytettiin kuumen-25 tamalla 75°C:ssa 10 minuuttia.

Suoritettiin kaksi testiä pilkonnan tehokkuuden määrittämiseksi : 1. Näiden kahden reaktioseoksen näytettä elektrofo-resoitiin agaroosigeelillä 20 tuntia 20 voltilla. Geelin 50 värjäämisen jälkeen etidiumbromidilla havaittiin nauhojen odotettu malli: lambda DNA:n kaksi nauhaa, jotka ovat peräisin ainoan Hind III -kohdan pilkonnasta lambda-DNA:11a, ja hyvin suuri luku miltei limittäisiä nauhoja bakteeri-DNA:sta, joka on pilkottu lukuisissa kohdissa.

55 2. Faagi-DNA:n transfektiomääritys osoitti, että pilkonta oli ollut yli 99 %:isen tehokas, hävittäen siten miltei täysin faagi-DNA:n biologisen aktiivisuuden.

i3 70424

Pilkotut DNA:t sekoitettiin ja niitä inkuboitiin viisi tuntia 10°C:ssa 0,15 yksikön kanssa T4 DNA-ligaasia DNA-osasten mielivaltaisen uudelleen temperoitumisen ja ko-valenttisen sitoutumisen sallimiseksi.

5 Tämän inkuboinnin päätyttyä DNA sekoitettiin in vitro kapseloidun preparaatin kanssa, joka käsitti kahden komple-mentaarisesti vajaan faagilysaatin seoksen (lambda Dam ja lambda Eam), jotka oli indusoitu ei-supressiivisista kannoista. Tässä seoksessa jokainen DNA-molekyyli, jolla oli lambda 10 DNA:n cos-äärimmäiset hännät ja joka on sopivaa kokoa, voi yhdistyä faagiproteiiniin, muodostaen siten in vitro biologisesti aktiivisen faagiosasen, joka pystyy infektoimaan E. colin ja tuottamaan infektiokeskuksen (palkin).

Tämän prosessin tehokkuuden määrittämiseksi suori-15 tettiin kaksi tarkistusta: 1. Näyte seoksesta levitettiin E. colille, löydettiin 5 3 x 10 plakkia ug:aa kohti käytetystä lambda DNAssta. Tämä oli n. 100 kertaa enemmän kuin pilkotusta preparaatista löytyi, mikä osoittaa ligaasikäsittelyn hyvän tehokkuuden.

20 2. Näin muodostuneita plakkeja tutkittiin visuaali sesti, 70 % niistä oli kirkkaita samean asemesta, mikä osoittaa B. megaterium-DNA:n osasen läsnäolon, joka liittyy lambdageeniin Cl, ja siten inaktivoi sen aiheuttaen plakin sameuden.

25 Siten voitiin todeta, että preparaatti sisälsi umpi mähkäisen näytteen kaikista B. megateriumille mahdollisista Hind III-DNA-osasista, jotka pystytään insertoimaan faagiin lambda NM 590.

B. Faagin lambda-johdannaisen, jossa on B. megaterium-30 amylaasi, eristäminen

Loput kapseloimisseoksesta käytettiin E. colin ymp-päämiseen suureen määrään tärkkelystä sisältäviä levyjä, 3 joissa oli n. 10 elinvoimaista osasta levyä kohti. Infektoidun E. colin kasvun ja plakkien muodostumisen jäl-35 keen levyt seulottiin tärkkelystä hajottavien plakkien läsnäolon suhteen. Tämä tehtiin altistamalla levyt jodi- 14 70424 höyryille lyhyeksi ajaksi; odotettiin, että tällaisen faa-gin muodostama plakki olisi kirkkaan alueen ympäröimä tuloksena hajonneista soluista vapautuneen amylaasin diffuusiota ja toiminnasta. Yksi tällainen plakki löydettiin, ja 5 faagi, jonka se sisälsi, poimittiin välittömästi alavilje-lyä varten (pitempi altistus jodihöyryille olisi tappanut faagin). Tämä plakki lisääntyi todella runsaasti (amylaa-sia tuottaen) ja se on tässä nimetty "lambda NM 590 Amy l":ksi. Faagi lambda NM 590 Amy 1 on talletetty kokoelmaan 10 NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11569:nä.

C. Amylaasigeenin uudelleenkloonaus plasmidiin pBR 322 Tämä suoritettiin ylituotantokannan saamiseksi, tarkoitus oli myös valmistaa helposti suuri määrä amylaasigee-niä sisältävää DNA:ta.

15 1 /ug DNA:ta lambda NM 590 Amy l:stä ja 0,3 yug plasmi- din pBR 322 DNA:ta pilkottiin, sekoitettiin ja käsiteltiin ligaasilla, kuten osassa A selostettiin. Tätä preparaattia käytettiin transformoimaan (käyttäen tavallisia menetelmiä) E. colin kanta HB 101. Valikointi oli ampisilliini (ap)-20 resistenssiä varten (ominaisuus, jonka solut saavat tämän plasmidin läsnäolosta). Tämä plasmidi antaa normaalisti myös resistenssin tetrasykliinille (Te). Vieraan DNA:n tuominen tähän plasmidiin pilkkoo kuitenkin tet-geenin, siten tetrasykliiniherkkien transformoitujen kloonien osuus 25 heijastuu kloonattua DNA:ta sisältävien plasmidien osuuteen. Tässä tapauksessa 16 % klooneista sisälsi uutta plas-midia, joka antoi amylaasiaktiivisuuden E. colille. /Plasmidien yleisen kansainvälisen nimistön mukaisesti tässä kuvattavat plasmidit on nimetty (pCP):ksi ja tämän esi-30 merkin plasmidi nimetään (pCP l):ksi./ Tämä osoittaa, että geenin uudelleenkloonaus samalla entsyymillä (tässä tapauksessa Hind III) on hyvin teho-kas menetelmä (16 % 1/10 :n asemesta).

Tämän plasmidin sisältävä mikro-organismi nimettiin 35 E. coli CL 7001 (pCP 1):ksi ja se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11570:nä.

is 70424 D. Amplifikaatio ja entsyymi-tuotanto

Entsyymituotantoa plasmidia (pCP 1) sisältävissä soluissa parannettiin kahdella tavalla seuraavasti: 1. Kyllästetyt viljelmät 5 Viljelmiä inkuboitiin yli yön 37°C:ssa pyörivällä tä- ryttimellä 5 l:n väliseinillä varustetuissa erlenmeyer-pul-loissa, jotka sisälsivät 1 litran viljelyväliainetta (LB; hiivauute-tryptoni).

2. Amplifikaatio kloramfenikolilla 10 Viljelmiä inkuboitiin 37°C:ssa pyörivällä tärytti- mellä 5 l:n väliseinillä varustetuissa erlenmeyer-pullois-sa, jotka sisälsivät 1 litran viljelyväliainetta (LB), kunnes saavutettiin tiheys 0,8 (650 nm), jossa vaiheessa lisättiin 150 yUg/ml klooriamfenikolia. Tämä esti kromoso-15 maalisen DNA:n 1isämonistumisen, mutta ei amylaasigeeniä sisältävän plasmidin (pCP 1) monistumista. Plasmidin amplifikaation jälkeen (3 000 kopioon asti), verrattuna kromosomaaliseen DNA:han klooriamfenikoli poistettiin proteiinisynteesin uudelleenalkamisen sallimiseksi. Eri-20 tyisesti vahvistuksen jälkeen solut erotettiin väliaineesta linkoamalla, pestiin klooriamfenikolin poistamiseksi ja viljeltiin uudelleen amylaasituotantoa varten.

E. Entsyymin talteenotto Tässä käytettiin "osmoottinen shokki" -menetelmää 25 alfa-amylaasin talteenottamiseksi erittäin puhtaassa muodossa. Menetelmä, jonka ovat esittäneet H.C. Neu ja L.A. Heppel julkaisussa J. Biol. Chem. 240, 3685-3692 (1965), oli seuraava.

Soluja viljeltiin ensin yli yön, minkä jälkeen ne 30 suspendoitiin 25 %:iseen sakkaroosiliuokseen, jonka tilavuus oli puolet viljelmästä, ja ravisteltiin 10 minuuttia 24°C:ssa, mikä käsittely plasmolysoi solut. Sitten lisättiin EDTA lopullisesti 1 mM:ksi (soluseinien tekemiseksi läpäiseviksi), ja ainetta ravisteltiin toiset 10 minuut-35 tia 24°C:ssa. Suspensiota lingottiin ja solut suspendoitiin nopeasti uudelleen kylmään (n. 0°C) veteen ja ravisteltiin tässä lämpötilassa 10 minuuttia. Suspensio 16 70424 lingottiin uudelleen ja 96 % entsyymistä voitiin ottaa talteen päällä olevasta nesteestä (supernatantista).

Vertailua varten viljeltiin luovuttaja-mikro-organismia (Bacillus megaterium) ja määritettiin entsymaatti-5 nen aktiivisuus. Entsyymin määrä millilitraa kohti viljely-väliainetta mitattiin DNS-menetelmällä, jolloin yksi entsy-maattinen yksikkö määriteltiin määräksi entsyymiä, joka tuottaa yhden mg:n pelkistävää sokeria (käyttäen maltoosia vertailuna) minuutissa 10 minuutin inkubointiaikana. Sub-10 straatti oli hyvin puhdas amyloosi.

Luovuttaja-mikro-organismi tuotti 66,0 entsymaattista yksikköä/1 viljelmää. E. coli CL 7001 (pCP 1) kyllästetyt viljelyt tuottivat 116,6 yksikköä/1 viljelmää, kun taas viljelyn jälkeen (vahvistus) viiden tunnin ajan kloori-15 amfenikolin kanssa, mitä seurasi 15 tuntia ilman kloori-amfenikolia , E. coli CL 7001 (pCP 1) tuotti 84,5 yksikköä/ litra. Tämä osoittaa, että kyllästetty viljelymenetelmä on riittävä antamaan hyvän lisäyksen entsyymituotantoon.

E. coli CL 7001 (pCP 1):n tuottamalla entsyymillä, 20 joka on identifioitu erääksi alfa-amylaasiksi, on seuraa-vat tunnusmerkit. Se pilkkoo sekä amyloosin että amylopep-tidin glukoosiksi, maltoosiksi ja maltotrioosik^i, pääasiallisesti maltoosiksi, ja se pilkkoo sekä syklodekstriinin että maltotrioosin glukoosiksi ja maltoosiksi. Se pilkkoo 25 pullulaanin panoosiksi ja/tai iso-panoosiksi, mikä on samanlainen ominaisuus kuin entsyymillä, jota äskettäin ovat kuvanneet Mizucho Shimizy, Mutsuo Kanno, Masaki Tamura ja Mikio Suekane "Purification and Some properties of a Novel Alpha-Amylase Produced by a Strain of Thermoactinomyces 30 vulgaris", Agric. Biol. Chem. 42 (9), 1978, sivut 1681-1688.

17 70424

Esimerkki II

Lämpöä kestävän alfa-amylaasigeenin kloonaus

Luovuttaja-mikro-organismi oli alkuperäinen Bacillus-kanta, joka oli eristetty kompostista ja identifioitu 5 Bacillus coagulansiksi. Se tuottaa lämpöä kestävää alfa-amylaasia ja sillä on seuraavat mikrobiologiset tunnusmerkit: (1) Morfologia: sauvoja (0,6 - 1 yU x 2,5 - 5,0 ^u), liikkuvia gram-positiivisia ja -negatiivisia. Itiöt ovat 10 keskeisiä tai terminaalisia, eivät muuta muotoaan.

(2) Ravintoliemi: hyvä kasvu.

(3) Ravinto-agar-viillos: hyvä kasvu, lankamainen, leviävä, kermanvalkoinen.

(4) Orgaanisen hapon hyväksikäyttö 15 - sitraatti: positiivinen - malonaatti: negatiivinen.

(5) Gelatiini: nesteytyvä.

(6) Asetyylimetyylikarbinolin (acetain) tuotanto: positiivinen.

20 (7) Ortonitrofenyyli-galaktosidi-hydrolyysi: posi tiivinen .

(8) Nitraattien pelkistys: positiivinen, saattaa syntyä kaasua.

(9) Katalaasireaktio: positiivinen.

25 (10) Indolin tuotanto: negatiivinen.

(11) Dekarboksylaasireaktio - lysiinillä : negatiivinen - ornitiinillä : negatiivinen - arginiinilla : negatiivinen.

30 (12) H2S :n muodostus: negatiivinen.

(13) Hiilihydraattien hyväksikäyttö: käyttää hyväksi arabinoosia, galaktoosia, glukoosia, levuloosia, mannoosia, maltoosia, sakkaroosia, tärkkelystä, trehaloosia ja tuotti niistä happoa.

35 (14) Pullulaania käytetään hyväksi minimiväliaineel la .

18 70424 (15) Polyolien hyväksikäyttö: käyttää hyväksi glyserolia, sorbitolia, mannitolia, inositolia. Ei käytä adoni-tolia, dulsitolia.

(16) Ureolyysi: negatiivinen.

5 (17) Lesitiinin hyväksikäyttö: negatiivinen.

(18) Optimilämpötila kasvulle: 50°C

Maksimilämpötila kasvulle: 55-60°C Minimilämpötila kasvulle: 15-25°C

(19) Hapen tarve: aerobinen ja anaerobinen.

10 Kanta on talletettu kokoelmaan NCIB 21.2.1980 NCIB

nro 11571:nä.

DNA uutettiin ja altistettiin Eco RI:n; Hind III:n;

Pst I:n; Sal I:n; Bam HI:n ja Bgl II:n vaikutukselle. Ainoastaan Bgl II pystyi kehittämään useita osasia laajalta 15 molekyylipainoalueelta. Eco Rl:11a oli kuitenkin mahdollista kehittää osasia, kun NaCl-väkevyys alennettiin 50 mM:ksi. Sen tähden päätettiin käyttää Eco Rl:a osasten muodostamiseksi kloonausta varten Eco RI-lambda-DNA-vektoriin (lambda NM 781).

20 a. B. coagulansin ja lambda NM 781:n DNA:iden pil- konta 1,25 ^,ug lambda NM 781: n DNA: ta pilkottiin yhdellä yksiköllä Eco RI:a 25 ^,u:ssä seuraavaa puskuria: 10 mM Tris HC1 (pH 7,5), 10 mM 2-merkaptoetanoli, 10 mM MgSO^ ja 25 100 mM NaCl.

2 ^ug B. coagulansin DNA:ta pilkottiin samalla entsyymillä samanlaisessa puskurissa, paitsi että NaCl-väkevyys oli alennettu 50 mM:ksi. Inkubointiaika oli kaksi tuntia 37°C:ssa ja reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuut-50 tia 75°C:ssa. Pilkonnan täydellisyys tarkistettiin elektroforeesilla 1 %:isissä agaroosigeeleissä.

B. Rekombinanttifaagien ligaatio ja talteenotto

Pilkotut DNA:t sekoitettiin ja liitettiin käyttäen kahta yksikköä T4 DNA -ligaasia seoksessa, joka sisälsi 35 60 mM Tris HC1 (pH 8), 10 mM MgS04, 10 mM 2-merkaptoetanolia ja 0,1 mM ATP. Reaktio saatettiin tapahtumaan 10-15 tunnin aikana 10°C:ssa. Ligaation jälkeen sekoitettiin 0,2 y,ug:n

II

19 70424 -2 DNA- ena ATP:n kanssa antamaan loppuväkevyys 10 M. Nä mä näytteet saatettiin in vitro -kapselointiin ja käytettiin infektoimaan E. colin kanta HB 101. Saatiin n. 1,6 x 4 10 PFU (Plaque Forming Units, hitusia muodostavia yksi-5 köitä)/^ug lambda DNA:ta. Näiden faagien joukosta jotkut osoittivat amylaasiaktiivisuutta (amylaasikatiivisuuden havaitsemiseksi petrimaljoilla ja faagin talteenottoa ja puhdistusta varten ks. esimerkki I).

Havaittiin melko suuri amylaasia tuottavien faagien 10 osuus (yksi 400:ssa).

Valittiin yksi ja nimettiin "lambda NM 781 alfa Amy l":ksi. Se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11572:na.

C. Amylaasigeenin uudelleenkloonaus lambda NM 781 15 alfa Amy l:sta plasmidiin pBR 322 1 ^,ug lambda NM 781 alfa Amy 1 DNA:ta ja sama määrä DNA:ta plasmidista pBR 322 pilkottiin Eco Rl:11a käyttäen tavanomaisia olosuhteita. Ligaatio ja transformointi suoritettiin, kuten esimerkissä I selostettiin. E. coli HB 101:n 20 pesäkkeet, jotka sisälsivät rekombinanttiplasmidin, havaittiin niiden amylaasiaktiivisuudesta. Valittiin yksi tällainen pesäke ja nimettiin E. coli CL 7002 (pCP 2):ksi. Se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11573:na.

D. Geenituotteen amplifikaatio 25 Lambda NM 781 alfa Amy l:n amylaasia koodaavan gee nin ja amylaasin tuotannon vahvistaminen suoritettiin seuraavasti. Isäntäbakteereita (E. coli HB 101) kasvatettiin LB-väliaineessa 2 mM MgC^^n kanssa 37°C:ssa, kunnes saavutettiin optinen tiheys 0,3 (650 nm:ssä). Lambda NM 781 30 alfa Amy 1 lisättiin sitten, faagien lukumäärä laskettiin infektion moninkertaisuuden n. 1-2 saamiseksi, ts. yksi tai kaksi faagia bakteerisolua kohti. Viljelyä jatkettiin sitten voimakkaasti sekoittaen 37°C:ssa ja optista tiheyttä seurattiin, kunnes se alkoi alentua. Kun se oli alentu-35 nut alle 0,5, viljelmä korjattiin talteen ja pantiin jäihin. Viljelmä lingottiin ja päällä oleva neste testattiin amy-laasiaktiivisuuden suhteen.

20 70424

Vahvistaminen ja entsyymituotanto E. coli Cl 7002 (pCP 2):11a suoritettiin käyttäen sekä kyllästettyä viljelymenetelmää että klooriamfenikolivahvistusta, kuten esimerkissä I.

5 Amylaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen DNS-mene- telmää sekä faagilysaatista että E. colin, joka sisälsi re-kombinanttiplasmidin, viljelmistä. Taulukossa I esitetään arvot, jotka on saatu amylaasiaktiivisuudelle B. coagulansin alkuperäiskannassa, ja jakautuminen solun ulkopuolisen ja so-10 luun sidotun aktiivisuuden välillä. Aktiivisuudet, jotka on saatu rekombinanttifaagi11a (lambda NM 781 alfa Amy 1) ja kannalla, joka sisältää rekombinanttiplasmidin E. coli CL 7002 (pCP 2), on myös annettu. Entsyymituotannossa havaittiin n. kolminkertainen lisäys rekombinanttifaagilla javie-15 lä paljon parempi lisäys havaittiin plasmidilla (n. 300-kertainen).

Faagin (lambda NM 781 alfa Amy 1) tapauksessa kaikki entsyymi vapautuu solun hajotuksessa ja on niin muodoin läsnä viljelyväliaineessa. Plasmidin tapauksessa suurin 20 osa entsyymistä on soluun sidottua (96 %).

E. Uudelleenkloonaus faagin lambda-johdannaiseen, joka pystyy lysogenisoimaan E. colin

Vektori/isäntäsysteemin, joka käsittää lambda lyso-geenisen E. colin, valmistuksen valaisemiseksi tehtiin seu-25 raava koe.

Käytettiin bakteriofaagia lambda T4 lig. CI 857 Warn Earn Sam (lambda NM 989). Se on kuvattu julkaisussa J.Mol.Biol. Voi. 132 (1979), "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4. 1.. Characterization of the 30 Rekombinants" G.G. Wilson ja Noreen E. Murray (sivut 471-491) ja "II.. Amplification and Separation of the Gene Product" Noreen E. Murray, S.A. Bruce ja K. Murray (sivut 493-505).

Tämä faagi sisältää bakteriofaagin T4 DNA-ligaasi-35 geenin ja pystyy lysogenisoimaan E. colin. sillä on lisäksi lämpöherkkä immuniteetti ja kaksi amber-mutaatiota E-geenissa ja S-geenissa vastaavasti. S-geenin mutaatio

II

2i 70424 tekee bakteerit sellaisiksi, että ne eivät enää hajoa tämän faagin infektiolla. Subkloonauksen tarkoituksena oli korvata DNA-ligaasigeeni amylaasia koodaavalla geenillä.

Faagin ja plasmidin (pCP 2) DNA leikattiin Eco 5 RI:lla ja osaset liitettiin. Ligaatiosta saatu faagi-DNA pakattiin sitten in vitro ja plakit tehtiin näkyviksi levittämällä kannalle E. coli Sup E Sup F. Plakit, joilla oli amylaasiaktiivisuus, poimittiin ja faagi puhdistettiin käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä.

10 Tätä faagia käytettiin sitten lysogenoimaan kanta E. coli C 600 (CL 1205) käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Lysogeenipesäkkeet tehtiin näkyviksi tärkkelystä sisältävällä väliaineella käyttäen jodivärjäystä. Tämä kanta on nimetty tässä E. coli CL 7003 (lambda alfa Amy 1):ksi ja 15 se on talletettu kokoelmaan NCIB 6.3.1980 NCIB nro 11586:na.

Geenituotteen amplifikaatio suoritettiin seuraaval-la tavalla. Lysogeenia viljeltiin 32°C:ssa LB-väliainees-sa, kunnes saavutettiin tiheys 0,8 650 nm:ssä, lingottiin sitten ja solut suspendoitiin tuoreeseen LB-väliaineeseen, 20 jota oli esilämmitetty 45°C:ssa. Viljelyä inkuboitiin sitten 45°C:ssa 15 minuuttia hajotussyklin indusoimiseksi (koska immuniteettigeenituote on lämpöherkkä).

Inkubointia jatkettiin sitten voimakkaasti ravistaen 37°C:ssa kolme tuntia. Amylaasiaktiivisuus mitattiin 25 sitten päällä olevassa nesteessä ja soluissa. Arvot on esitetty taulukossa I.

Tämä erikoiskoe valaisee "sub-sub,kloonaus"-mene-telmää plasmidista uuteen lambda-faagiin. On helposti ymmärrettävissä, että DNA lambda NM 781 alfa Amy l:sta oli-30 si aivan yhtä helposti voitu sub-kloonata faagiin lambda T4 lig. CI 857 Warn Earn Sam. Vaihtoehtoisesti luovuttaja-DNA olisi voitu kloonata suoraan viimeksi mainittuun faagiin, jolloin mikä tahansa määrä muunnoksia esimerkki-prosessista on toteutettavissa.

22 70424 F. Lambda NM 781 alfa Amy l:n E. coli CL 7002 (pCP 2):n ja E, coli CL 7003 (lambda alfa Amy 1):n tuottaman amylaasin talteenotto ja luonnehtiminen

Kuten esimerkissä I käytettiin osmoottista shokkia 5 entsyymin talteenottoon. Lisäksi, koska tämän esimerkin entsyymi on lämpöä kestävä, voitiin sitä puhdistaa edelleen lisäämällä vesipitoiseen liuokseen 10 mM Ca++ ja lämmittämällä liuos 80°C:seen ja pitämällä siinä 10 minuuttia; tämä käsittely saostaa kaikki E. coli -proteiinit ja sal-10 lii alfa-amylaasin talteenoton äärimmäisen puhtaassa muodossa, jolloin yleensä mitään orgaanista jätettä tai muita entsyymejä ei ole läsnä.

Alfa-amylaasin spesifisyys määritettiin: se on aktiivinen amyloosin ja tärkkelyksen suhteen, hydrolyysi-15 tuotteet ovat glukoosi, maltoosi ja maltotrioosi sekä pieniä määriä suurempimolekyylipainoisia komponentteja. Tämä entsyymi ei ole aktiivinen syklodekstriinille. Myös entsyymin lämmönkestävyys tutkittiin ja sen osoitettiin olevan hyvin suuri. Optimilämpötila aktiivisuudelle 0,5 %:isella 20 amyloosilla on välillä 80-90°C. 8 %:lla liukoista tärkkelystä optimi on n. 100°C:n paikkeilla.

On mahdollista, että mikro-organismi, jota tässä nimitetään Bacillus coagulansiksi, on todellisuudessa Bacillus licheniformis.

23 70424 \ I—! £ :id I \

mc (ΰ O

cn fd -H > φ -p -PS-i tn O -P 03 -h g tn c :id -P >i Φ :id

P -H tfd X X X <-H E

φ g U) X CN VO rH fd tld

a, >-, -H ro - - - > -P

P >, rH I—1 O VO -H

Λί tn - H1 (N <Ν > G

rH Jj C rl n rH CO ,Χ Φ

m G O Φ -P

W G -HO

C en τι

•h O

en :id O

G tn -P G

(0 C o r- tn h · -H

rH φ ro vo oo <d fd -H · 3(0<D σ H- rH g G -P fd &> tn -P cm -h Λ tn id tn .e ^ ί1 tn to ή G-Ptutn

O -H >f -Η ιΗ ·· -P -P -H

O Φ tji fd P

e E Λ tn Η

• O X X P P O

cao-p x XrH-p-ptn rH p o fN cm tn o h * ,χ ή ti o ro LO m ΰ π m (d -H O n- CM rH td 3 <d -n

O P -P co -P tn X

M -P -P tel rH e fd x -h e td td td en p rH <d -h -P tn rH\C(d (dtn+Jfd G X -h g rX O G g id »d λ h o o O £ -h

EH tn g rH VO -1—lrHrH

tn O G I I I σ I >1 - G

-H ,Χ rH * S >1 Ή

:0 Φ O cm -H td -P O

λ; p in ή tn -P tn •h Ai fd Φ tn h :id -p -p id λ: h i p tn >i id >, φ :id ·Η :id g e rH :cd ·· x g

- -H O Φ CM B <*° G

mx -P - -h -h tn G P Λ tn n o vo n g tn φ

G Φ Ή φ *ι< ·*τ ro r~ cm >, G

tn g rH e rH cm cm >ιθ:ιΰΦ -h -h *fd tn -fd d

> tn :fd fd -P G g G

-H Φ Ot > G φ Ή 2 •H G φ :fd Φ tn

-P fd -Η :θ -P -P -H

X *n >1 G -P Φ >

<d >1 I ifd >1 G H

•H fd g fd Ή :rd :td Φ *H

tn tn < id ή rHx;g-P

Id tn X >1 r-N rH -h ,χ fd (d (d-H rH φ rd ,χ fd h e <pt+H -p hj en ,χ -h >i G ή -h >1 >, -h tn o tn gfd fd CM rH CM rH ΓΟ g P ·· Ä (d < ,χ o cu o φ o < tidOmid

h o g o -ro o :tdO rH

tn to r» id r^Ht^fd goid>i C i" I -nm tn -p g id GlE P > G h :0 cnid rHSOU a U id Λ -H -h G z - -X -P -P fd

Ui -H — -H —- -H Id -H 4J 4J fd

(dfdrHfMrlrHtNrHO tnGO-P

0*GO i-i O ΟΛ -X G O en O^UOtr-iOl^Og >1 G 6 G

g o o u id -HtnO

•fd · D< -H · Pt · H rH g O <1)

CQ Ή W — 4J Cp M X X

X

24 70424

Esimerkki IIA

Plasmidin pCP 2 subkloonaus plasmidiin pC 194 ja uuden plasmidin ekspressoiminen Bacillus subtiliksessa Tämä esimerkki kuvaa menetelmää, jolla keksinnön mu-5 kaisesti valmistettu rekombinantti-DNA voidaan ekspressoi-da isäntäbakteerissa, muussa kuin E. colissa, nimittäin Bacillus subtilis -kannassa.

Plasmidi pCP 2, esimerkistä II, sisältää 3,31 Kb:n osasen B. coagulans -luovuttajasta; plasmidia luonnehdi-10 taan lisäksi sillä, että se antaa ampisilliini- ja tetra-sykliiniresistenssin ja sisältää kaksi pilkkomiskohtaa sekä Eco Rl:lie että Hind III:lie. Plasmidi pCP 2 pilkottiin neljäksi osaseksi sekä Eco Rl:11a että Hind III:11a, käsiteltiin ligaasilla ja käytettiin transformoimaan HB 101, 15 kuten edellisissä esimerkeissä.

Muodostettiin uusia plasmideja, jotka tässä nimettiin pCP 2,3:ksi ja joissa oli 2,64 Kb:n osanen B. coagulans-DNA:ta, jolloin tämä osanen sisälsi alfa-amylaasia koodaa-van geenin. pCP 2,3:11a on yksi ainoa kohta sekä Eco Rl 20 että Hind III varten ja antaa sekä ampisilliini- että tet-rasykliiniresistenssin.

Seuraavaa vaihetta varten valittiin plasmidi pC 194, jonka tiedetään olevan plasmidi, joka pystyy monistumaan Bacillus subtiliksessa. pC 194 antaa klooriamfenikoli-re-25 sistenssin ja sillä on yksi ainoa Hind III -kohta.

Sekä pCP 2,3 että pC 194 avattiin Hind III:11a, sekoitettiin ja liitettiin muodostamaan uusi plasmidi, joka nimettiin pCH l:ksi, ja joka sisälsi alfa-amylaasia koodaa-van geenin ja jolla oli sekä klooriamfenikoli-resistenssi 30 että ampisilliini-resistenssi, joskin klooriamfenikoli-resistenssin taso oli alhainen E. colissa. Kuten edellä preparaattia käytettiin transformoimaan E. coli HB 101.

B. subtiliksen mutanttikantaa, joka on nimetty QB 1133:ksi (saatu Cr Michael Steinmetz1 ilta, Institut de 35 Recherche en Biologia Moleculaire, Universite Paris VII,

Tour 43, 2 Place Jussieu, 75221 Paris Cedex 05), ja jolla ei ole alfa-amylaasiaktiivisuutta, käsiteltiin sitten il 25 70424 S. Chamg'in ja S. Cohen'in, Molec. Gen. Genet. 168, 111-115 (1979) menetelmän mukaisesti protoplastien muodostamiseksi. Protoplastit transformoitiin sitten pCH l:llä käyttäen Chang'in ja Cohen'in (Ibid) polyetyleeniglykolivälit-5 teistä transformointimenetelmää.

Protoplasteja inkuboitiin sitten runsassisältöises-sä väliaineessa 1,5 tuntia bakteereissa olevan plasmidin sallimiseksi ekspressoida resistenssi klooriamfenikolille.

Protoplastit levitettiin sitten regeneroimisväliai-10 neelle, johon oli lisätty klooriamfenikolia määrässä 20 yug/ml. Kahden päivän inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa oli ilmestynyt transformoitujen solujen pesäkkeitä; pesäkkeet, joilla oli alfa-amylaasiaktiivisuus, havaittiin jodihöyry-värjäysmenetelmällä. Yksi klooni, joka nimettiin B. subtilis 15 CL 8001 (pCH l):ksi, talletettiin 13.1.1981 NCIB nro 11629:nä. Alkuperäinen kanta QB 1133 talletettiin myös 13.1.1981 NCIB nro 11628:na.

B. subtilis CL 8001 (pCH 1) on pysyvä ainoastaan klooriamfenikolin läsnäollessa. Sitä voidaan käyttää tuot-20 tamaan alfa-amylaasia viljelemällä väliaineessa, joka sisältää klooriamfenikolia (20 ^,ug/ml) . Alfa-amylaasi voidaan helposti ottaa talteen viljelynesteestä.

Yli yön kestävän viljelyn jälkeen klooriamfenikolin läsnäollessa määritettiin tuotetun alfa-amylaasin määrä 25 seuraavasti: Päällä oleva neste Solut Yhteensä (U/L) (U/L) (U/L) 136 14 150

Esimerkki III

20 Beta-amylaasin kloonaus

Luovuttaja-mikro-organismi oli Bacillus cereus -kanta, jota on kuvattu Agency of Industrial Science &

Technology'n (Japani) brittiläisessä patentissa nro 1 466 009. Se on talletettu kokoelmaan Fermentation 35 Research Institute of Chiba-shi, Japani 20.12.1973 FERM -P nro 2391:nä ja talletettu myös kokoelmaan American Type Culture Collection ATCC nro 31102:nä 26.12.1974. Sen 26 70424 tiedetään tuottavan sekä beta-amylaasia että alfa-1,6-glu-kosidaasia.

A. Beta-amylaasigeenin kloonaus lambda NM 781:ssä

Menetelmät, joita käytettiin pilkontaan, liittämiseen 5 ja rekombinanttifaagien talteenottoon, olivat samat kuin esimerkissä II. B. cereuksen DNA (2 ^,ug) pilkottiin normaaliolosuhteissa Eco Rl -restriktioentsyymillä. Faagivektori-DNA (1,25 yUg, lambda NM 781) leikattiin myös Eco Rl:11a. Ligaatio ja pakkaaminen suoritettiin, kuten edellä selos-10 tettiin.

Löydettiin useita rekombinanttifaageja, joilla oli amylaasiaktiivisuus (n. 1-500). Yksi näistä faageista (nimetty "lambda NM 781 beta Amy l:ksi) valittiin; se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11574:nä.

15 B. Beta-amylaasigeenin lambda NM 781 beta Amy l:stä uudelleenkloonaaminen plasmidiin pBR 322

Entsyymituotannon lisäämiseksi tätä ensimmäistä beta-amylaasikloonia käytettiin beta-amylaasia koodaavan DNA:n lähteenä sen subkloonaamiseksi monikopioplasmidiin 20 pBR 322.

2 ^ug lambda NM 781 beta Amy 1 DNA:ta ja 1 y.ug pBR 322 leikattiin Eco Rl:11a, sekoitettiin ja käsiteltiin T4-ligaasilla. Ligaatio ja transformointi toteutettiin, kuten edellä selostettiin.

25 Yhdellä pesäkkeellä 200:sta ampisilliini-resisten- tistä pesäkkeestä oli tärkkelystä hajottava aktiivisuus.

Yksi eristettiin ja nimettiin E. coli CL 7004 (pCP 3):ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11602:na.

C. Beta-amylaasigeenin uudelleenkloonaus faagin 30 lambda-johdannaiseen, joka pystyy lysogenisoimaan E. colin Käytetty vektori oli lämpöherkkä lambda T4 lig faagi CI 857 Warn Earn Sam (lambda NM 989), jota kuvattiin esimerkissä II. N. 1 ^,ug plasmidin pCP 3 DNA:ta ja 0,5 ^.ug faagi-DNA:ta pilkottiin, sitten osaset liitettiin yhteen ja syn-35 tyneet DNA-osaset pakattiin in vitro. Faagiosaset, joilla oli amylaasiaktiivisuus, eristettiin ja käytettiin antamaan lysogeenisiä pesäkkeitä samalla menetelmällä kuin edellä.

Il 70424 27 E. coli C 600 -kanta, joka on lysogeeninen tälle rekombi-nanttifaagille, eristettiin ja nimettiin E. coli CL 7005:ksi (lambda beta Amy 1); tämä talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11603:na 5 D. Amylaasi-geenituotteen amplifikaatio

Kaikissa klooneissa ja subklooneissa amylaasiaktii-visuus havaittiin DNS-menetelmällä. Beta-amylaasiaktiivi-suus varmistettiin TLC-kromatogrammeilla maltoosin yhden ainoan täplän läsnäololla amyloosi-digeroinnin jälkeen.

10 Beta-amylaasigeenin amplifikaatio eri klooneissa suoritettiin, kuten edellä selostettiin. Taulukossa II on esitetty entsymaattinen aktiivisuus alkuperäisessä kannassa verrattuna tähän aktiivisuuteen kolmessa kloonissa; tämä aktiivisuus saatiin joko faagilysaatista tai esimer- 15 kissä II kuvatulla osmoottisella shokkimenetelmällä.

70424 28

UI dP I

3 3 3 (0 LO 0) tn M * a>

m p O P

> M CO H

MM * ·* Q) M

M \ O O LO CO M C

P ;3 cm co t— ^ CJ :<0 X :0 'S* (0 (0 (0 to 3 a: tn 2 to to to λ; f—i tn to -h •h -h c ·- (0 Ai 3 tn 3 ctp > 3 G X 34 <U <L> tn O >1 -H M g

0 X G O -H

3 0 <D " t/1

3 X 3 -H :3 <U

•3 x c f—I

> 00 CO 3 O M Ή •H 3 dP - .. +J p :3 •H P (N IO o Dj :3 >1

P P (N LO -n >1 (i E

Ai O 3D <3 3 T3 3 p P 3 •H -H u >1 O -P 3 3 tn-p-p cp pm

3 3 M P Q> 34 -— fÖ t—I

3 G 3 M 0) u-i3:3-P3

M 3 3 \ -P rr 3 P g M

£>i 3 3 :3 -H M H ε 3 £ M ·Η :θ D I 'S' O ··“ Q) Ό

3 O > AC :3 Ή CM CO dP P CO P

1 CO -H X :3 3 3 e M3 -H M g :3 M M 3 3 H P 3 P 3 M 3331-1 tu 3 m a: ac m m «· p m

O P 3 3 >J Cd M 0) >i > M

ac m ε P 0) Ή M

AC 3 0) CM cm >1 3 G -h O

3PG dP *· » >i 3 ·Η P U

i—I P O t" *J> 3 3 3 AC

3001 Γ" «s* p > m 3 ·

3 Ό M M tn O Ή M W

E-1 M AC r-H 3 3 3 -H :3

3 M O 3 D >i P > 3 G

P 3 3 P M ^ >t 3 0)

G P Pj *H -H M 3 P

3 G O > M >1 G <D ·· 3

33 X M \ O o en (Π M :0 ti CJ AC

MG m-p:3cmoolo m 0) >i m o O -P 3 P :0 ^ P M t *

3 p ac ac p-p>roG

g G 3 AC M -PM ». tl)

303 -P 3 >i 3 I QJ

•m X M G 3 :3 ε | X

0) O <1) AC AC 3 3 M

G P CO G >i 333 :3 tl) t) ^ tn ti G 3 3 ·· 3

P -r-i 3 U 3 ·· G

M 3 O 3 U 0) 03 —- 30303

3 3 co M ro ·· LO AC

Pj 3 — > C_> m· 3

OQ) cm M M G O Λ P

AC 3 O — —. M M Γ" I O

MAC M >i ro (f p rl n I -n 33 Pg - CC P 3

tl) (0(¾¾ 3 P G 3 P

CD U 0) :θ 3 3d) U 3 Dj M3PN33 MO U P — PM ·· 3 O E-iO) >iPDMU3

CO OQ <C P M· LO E O O M o M

o o <C Ό 3 >i cm 3

.—. M O O M3 (OM

(M 00 Γ" M 3 3 P O

^ [- P >i >i >1 3

p p 0) G M M M

3 S O U P 30)0)0)3

3 2 3 *M "M *1 l -M

0) MM3 ’—I M M i—I

D 3 i—1 i—1 *0 O M M M c3 0) Ό O O P CO > > > 3 υ p υ υ ε ε 3 -—^ ^ • 3 · · M M CM ro TJ< CQMWW'-' — il 29 70424

Esimerkki IV

Pullulanaasigeenin kloonaus

Luovuttaja-mikro-organismi oli Klebsiella pneumoniae, jonka on kuvannut H. Bender julkaisussa Biochem. Z. 334, 5 sivut 79-95 (1961) ja joka on talletettu kokoelmaan ATCC 6.6.1963 nro 15050:na. Se on mainittu myös A.E. Staley'n brittiläisessä patentissa nro 1 273 789.

2,25 ^ug luovuttaja-DNA:ta uutettiin ja fragmentoi-tiin Eco Rl:11a käyttäen standardiolosuhteita, ja 1,25 ^,ug 10 lambda NM 781 DNA:ta leikattiin samalla entsyymillä samoissa olosuhteissa. Inkubointi kesti kolme tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen reaktio lopetettiin kuumentamalla 10 minuuttia 75°C:ssa. Pilkonnan täydellisyys määritettiin, kuten esimerkissä II.

15 Pilkotut DNA:t liitettiin, otettiin talteen ja käy tettiin E. colin kannan HB 101 infektoimiseen, kaikki, kuten esimerkissä II. Saatiin n. 2 x 10~* PFU/^ug lambda-DNA:ta.

Kahden päivän inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa levyillä, jotka sisälsivät BBL-tryptikaasia + 0,25 % pullulaania, 20 jotkut plakit osoittivat pullulanaasiaktiivisuutta, ts. niitä ympäröivät sameat renkaat, jotka ovat luonteenomaisia "ylikasvaneille" bakteereille. Pullulanaasia tuottavien faagien osuus oli suuruusluokkaa 1/2500.

Yksi valittiin ja se nimettiin tässä lambda NM 781 25 Pui l:ksi; se talletettiin kokoelmaan NCIB 9.4.1980 NCIB nro 11593:na.

Pullulanaasiaktiivisuus havaittiin DNS-menetelmällä ja tuote pullulaanin hydrolyysistä faagi-lysaateilla tunnistettiin maltotrioosiksi ohutlevykromatografiällä.

50 Lambda NM 781 Pul 1 sisältää suuren DNA-osasen (Klebsiella pneumoniaesta) pituudeltaan 13,5 Kb; tämä osanen pilkottiin uudelleen Eco Rl :11a, mikä johti kahteen osaseen, pituudeltaan 6,1 Kb ja vastaavasti 7,4 Kb. 6,1 Kb:n alaosanen kloonattiin sitten uudelleen lambda NM 781:ssä 55 ja sen osoitettiin sisältävän pullulaasigeenin. Tätä uutta rekombinanttifaagia nimitetään lambda NM 781 Pui 2:ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11604:nä.

30 70424 6,1 Kb:n alaryhmää subkloonattiin edelleen moniko-

pioplasmidissa pACYC 184 (pBR 322:n johdannainen, jossa on R R

jälkimmäinen Te -geeni ja Cm -geeni, jossa on yksi Eco Rl -kohta). Tätä uutta kloonia nimitetään E. coli CL 7006 5 (pCP 4):ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11605:nä.

Kolmas subklooni rakennettiin kytkemällä 6,1 Kb:n osanen faagiin lambda NM 989, kuten esimerkissä II kuvattiin. Tätä kloonia nimitetään E. coli CL 7007 (lambda Pui 2):ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11606:na.

10 Pullulanaasin ekspressio- ja amplifikaatiotaso tutkittiin kaikissa klooneissa. Tulokset on koottu taulukkoon III.

Kuten tuloksista voidaan nähdä, indusoi maltoosi pullulanaasiaktiivisuutta, kun 0,04 % maltoosia on lisätty 15 LB-väliaineeseen. Lisäksi membraanijakeen Triton X 100 -käsittely oli tarpeen pullulanaasin talteenottamiseksi, mikä osoittaa, että aktiivisuus sijaitsee membraaneissa.

31 70424 :(0 tn en cc ω O O Q> ·

C -PH

en · c tn h c :(d ro ω C >1 -P C :(0 CO i—I O en (Λ •H CU C >1 CO (0 «

> -i—> -j_> :c0 ^ m co n ^ m en -H

-H r—\ H W »—1 *3* H CN '—I r—\ p—1 U) pX

Ή ·Η g H *p ~ (OP

H > >ιΗ H O O H i—I O 'T LO >d>

pX >1 Φ E

< <D en Ή -H

i—i -p O tn

• Ή C (U

(0 (0 w :(0 en ρ «πω

m -p H H

•H H :(0 :(0 <—t 0) μ in vo -sr :ra C e m oo o σν m en C h 0 CD CU - OHO) Γ'ΓΟΟΜίΝιΠΓΟ h o C >i I—I r—! 4-* (N H ΓΟ ΓΟ i-H -P g a; Φ X! H H -P < 1 T3 iH (0

pC -PC

-H >, -H ‘w

rH -P 6 H

H O :(0 H (0 H ϋ e C m H -H 10 TT C (0

• :0 (0 lo >-o oo oo r-p ^ m CO

O W -X P ' - ' ' rp ^ - CO ,Q

pV ,χ ,q n oi m m φ oi rr n -H £ ,X O H g (N (N i—I OV >(0

C -H m d) H Ή H

h m pii s h C m >, -ph

(0 0) I pX H

E-( P -H (0 (0 O

ft -p > cp o en -p <d vo *p -p A! C H <D C" (N VO VO -P -P (0·

ΦΦΟ-Ρ ·.»»> h h en M

h m o (n o to e (0 en C C :C <1) CN > > ^ ·· e •H > H C (0(0 U dl en -h h pC λ oh

rO > :(0 C

(0 pii :C -H H n pi^

C CD ft W W A

(0 1 I

r—I *H |C

C en h ei) h o en (0 <u h o O en Ai C -P O en h ft H -P + · :r0 I (0 H O ΤΊ

(0 g (0 (ö O

H g ^ T3 in C

H C -H -H pp <D

0) -P + en en ft ft g aw •h en oouueo | a:

en -h (0 o o ft ft h |C

X3 C -H -P -P ^ ^ ^ H · +J

0)g C h h cnCeOO

>h rH O (0 (ö io vo r- o =0 en -ro X h g g goo o o >ί en e

C o o o -P ·· pC

<D + + r·* r" e—- i—e hu C (0 h o m ft h h (N (N pj d ft g >i (N n u U U ro en

(OHHHr—l Η + -P H

r-HCCCCHHen-H >i >i C

H ft ft ft ft H H OH r~p *—I H i—I

<u oooofNoeuo

Hr—li—li—IH U Ο-P O -ro -n en en oo oo oo co h hhh .Q r- · · (0 · C H H (0 0) W W g W ft >>·η

H s s s s X X

X! Z Z Z Z X X X XX

Claims (10)

32 7 0 424

1. Menetelmä yhdistelmä-DNA:n valmistamiseksi, joka sisältää amylaasia koodaavan geenin, jossa menetelmäs- 5 sä pilkotaan ja yhdistetään amylaasia tuottavan bakteeriperäisen luovuttaja-mikro-organismin ja vektorin DNA:t, viedään ne sopivaan isäntään ja seulotaan ja valitaan näin muodostuneet kloonit amylaasia koodaavan geenin läsnäolon perusteella, tunnettu siitä, että vektori on plasmi-10 di tai lambda-faagin johdannaisen DNA.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää lisävaiheen, jossa valitun kloonin DNA uutetaan ja pilkotaan, subkloonataan toiseen vektoriin ja valikoidaan jälleen amylaasia koodaavan 15 geenin läsnäolon perusteella, jolloin toinen vektori on plasmidi tai lambda-faagin jonkin toisen johdannaisen DNA; ja jolloin tätä subkloonausta valinnaisesti seuraa yksi tai useampia myöhempiä subkloonauksia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että seulonta suoritetaan viljelemällä klooneja tärkkelystä sisältävässä viljelyväliainees-sa ja värjäämällä väliaine jodilla saattamalla se kosketukseen jodihöyryn kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että amylaasia koodaava geeni on pullulanaasia koodaava geeni ja seulonta suoritetaan viljelemällä klooneja BBL-tryptikaasi-väliaineessa, joka sisältää pullulaania, jolloin positiiviset kloonit tunnistetaan niitä ympäröivistä läpikuultamattomista renkaista.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luovuttaja-mikro-organismi on Bacillus-suvun kanta.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luovuttaja-mikro-organismi 35 on Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus tai Klebsiella pneumoniae. Il 33 70424

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luovuttaja-mikro-organismi on Bacillus megaterium NCIB n:o 11568, Bacillus coagulans NCIB n:o 11571, Bacillus cereus ATCC n:o 31102 tai Klebsiella 5 pneumoniae ATCC n:o 15050.

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että faagi, johon luovuttaja-DNA liitetään, on lambda NM 590, lambda NM 781 tai lambda NM 989.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa valittujen kloonien DNA liitetään plasmidiin, tunnet-t u siitä, että plasmidi on pBR 322, pACYC 184 tai pC 194.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -15 n e t t u siitä, että yhdistelmä-DNA käsittää faagit lambda NM 590 Amy 1, NCIB n:o 11569, lambda NM 781 alfa Amy 1, NCIB n:o 11572, lambda NM 781 beta Amy 1, NCIB n:o 11574, lambda NM 781 Pul 1, NCIB n:o 11593 ja lambda NM 781 Pui 2, NCIB n:o 11604. 70424 34