JPH0223872A - 組換えプラスミド，それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　産業上の利用分野 この発明は、多糖体を構成しているグルコースのα−１
，６結合を加水分解する能力を有するプルラナーゼのう
ち耐熱性が良好であるもの（以下、耐熱性プルラナーゼ
という）を製造する方法と、かかる酵素遺伝子を含むプ
ラスミド並びにそのプラスミドを存する枯草菌にかかわ
るものである。

■　従来の技術及び本発明が解決しようとする課題 プルラナーゼはプルランやでん粉中のα−１，６結合を
分解する酵素であるが、分岐オリゴ塘や多糖類の構造決
定に多用されている。

またプルラナーゼはでん粉より異性化糖を生産する工程
のうち、グルコースを生産する段階において、グルコア
ミラーゼとともに使用すれば、ブドウ糖の収率が向上し
て有利である。この作用条件は６０℃〜６５℃であるの
で耐熱性プルラナーゼとはこの温度に耐える耐熱性をも
った酵素である。従来この温度で耐熱性を示すプルラナ
ーゼはほとんどなく、バチルス　ステアロサーモフィル
スＴＲＳ１２８株の場合は酵素は安定であるが生産量が
少い、このためＷａｓ縮して産業用酵素とすると付属す
る酵素による副反応がいちぢるしく、実用的でない。

この発明ではかかる現状に鑑み、耐熱性プルラナーゼの
遺伝子を常温菌である枯草菌に遺伝子工学的手法により
組み込むことにより、純度の高い耐熱性プルラナーゼを
容易に調製できるようにしたものである。

耐熱性プルラナーゼ又はその関連酵素の遺伝子をクロー
ン化した例としては、サーモアネロビウム　ブロッキー
　（Ｔ　ｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕ＋ｍ　　ｂｒｏ
ｃｋ日）のデプランチング　エンザイム（ｄｅｂｒａｎ
ｃｈｉｎｇｅｎｚｙｍｅ　）遺伝子の大腸菌と枯草菌中
でのクローン化（ジャーナル　オブ　バクテリオロジ−
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
　）第１６９巻、第４３０２〜４３０７貝、１９８７年
）とサーマス　スペシーズ（Ｔ　ｈｅｒｍｕｓ　ｓｐ、
　）のプルラナーゼの大腸菌中でのクローン化（エフ　
イー　エム　ニスマイクロバイオロジー　レターズ（Ｆ
ＥＭＳ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ
）第４９巻、第３８５〜３ｓｓＨ１９８８年）とが知ら
れているのみである。

一方、本発明の特色は安全性がもっとも高いと考えられ
る枯草菌を宿主としており、更にＢ　、５ｕｂｔｉｌｉ
ｓに菌学的に類似したＢ　、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓより遺伝子を得た点である。すなわち本発
明によって作成した酵素製剤はこれまで公知のものに比
べて安全性が高（、食品加工に使用できる点である。

■　課題解決のための手段及び作用 本発明の耐熱性プルラナーゼを生産するバチルス　ステ
アロサーモフィルスＴＲＳ１２８は、本発明者等により
大阪市域東区の土壌より分離された好熱菌であるが、次
のような菌学的性質を有している。

、形態学的性質（肉汁寒天培地中） １）細胞の形及び大きさ・・・・・・（０，６〜０．８
）Ｘ（１，５〜３．０）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は少
い、加糖肉汁寒天培地では肉汁寒天培地と同一の桿菌の
形態を示す。

２）運動性・・・・・・あり。

３）胞子・・・・・・（０，４〜０．５）Ｘ（０，５〜
０．６）μの長円形で末端付近に存在し膜壁はうすい、
６０℃・１６時間で形成するものが多い。胞子のうのふ
くらみは認められる。

４）ダラム染色性・・・・・・陽性。

二、生育状態 ｌ）肉汁寒天平板培養・・・・・・生育良好０表面はや
や乾き白色に近い。

２）肉汁寒天斜面培養・・・・・・拡布状となり表面の
光沢なし。

３）肉汁液体培養・・・・・・生育良好、液は混濁する
。

４）ゼラチン穿刺培養・・・・・・ゼラチンを液化する
。

５）食塩肉汁液内培養・・・・・・７％の食塩水濃度で
は生育しない。

６）グルコース・アスパラギン寒天培地・・・・・・生
育不良。

７）グルコース・ナイトレイト寒天培地・・・・・・僅
かに生育。

８）肉汁液体培養・・・・・・Ｐ　Ｈ６，８で生育、Ｐ
　Ｈ５゜７で生育せず。

三、生理学的性質 １）硝酸塩の還元・・・・・・陽性。

２）でん粉の加水分解・・・・・・陽性。

３）クエン酸の醗酵性・・・・・・陽性。

４）カタラーゼの生成・・・・・・陽性。

５）生育の範囲・・・・・・トリプトン、酵母エキス、
食塩を含む培地で７０℃まで生育、最適生育温度は６５
℃ ６）糖の醗酵性・・・・・・グルコース、ラクトース、
しょ塘から酸を形成、ただし、ガス発生を伴わない。

７）アセチルメチルカルビノールの生成・・・・・・陽
性。

８）ゼラチンの分解・・・・・・陽性。

以上の結果をバージニーのマニアル・オブ・システマテ
イノク・バクテリオロジー第２１（Ｂｅ−ｒｇｅｙ　　
ｓ　　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　　Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ−ｏｇｙ　Ｖｏｌ、２　（
１９８６）　）と照合して、本菌はバチルス　ステアロ
サーモフィルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　ｓ−ｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）と同定した。

つぎに本菌株の生産する酵素を詳細に説明する。

、作用及び基質特異性 本酵素はプルランのα−１，６グルコシド結合を切断し
て最終的にはマルトトリオースを生成する。

アミロペクチンやグリコーゲンに作用させてもヨード呈
色反応の増加は認められないが、β−アミラーゼと併用
するとマルトースの生産量が増加する。

イソマルトース、パノース、イソマルトトリオースには
作用しない。

これらの結果から、プルラン並びに側鎖が短（なったア
ミロペクチンやグリコーゲンに作用し、そのα−１，６
グルコシド結合を切断するプルラナーゼであると考えら
れる。

二、作用ＰＨ Ｐ　Ｈ４，５〜８．０（０，０５Ｍ酢酸ナトリウム−酢
酸緩衝液（ＰＨ４〜６）又はリンＭ２ナトリウムリン酸
１カリウム緩衝液（ＰＨ６〜８））’ｔ’０゜５％プル
ラン中で６０℃・１５分間反応させる。

生成還元糖はＤＮＳ法で測定。

三、作用最適ＰＨ 前記二の条件下でおよそＰ　Ｈ５，５゜四、作用温度 ０、１　Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，０）、０．５％プル
ラン中で各種温度下１５分間反応させたところ、７５℃
まで反応した。

五、最適作用温度 前記四の条件下、６５℃である。

六、熱安定性 ０、２　Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ　Ｈ６，０）中で各種温度で
６０分間加熱し、残存活性を測定したところ、６５℃に
おいても９０％以上の活性が残存していた。

七、Ｐ　Ｈ安定性 はぼＰ　Ｈ６，０〜９．０で安定であり、酸性側よりア
ルカリ側で比較的安定（各種緩衝液を用い６０℃・６０
分間放置後、ＰＨを７．０に調整し、残存活性を測定し
た）。

八、精製方法 培養上澄液を硫安分画（３５〜５５％飽和）した後、沈
でん物を少量の水に溶解、純水に対して透析後、ＤＥＡ
Ｅ−セルロース、ゲルｔハ過、アフィニティクロマトグ
ラフィーにより、５ＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示す
酵素を得た。

九、分子量 ８３．０００　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。

士、生産物 プルランからは最終的にはすべてマルトトリオースが得
られた。

十−１力価測定法 プルランを基質とする下記の方法・条件により測定した
。

１％プルラン（０，２Ｍ酢酸緩衝液Ｐ　１１５．６　）
０、２５　ｍ　ｌに酵素液０．２５　ｍ　ｌを加え、６
０℃１５分間反応させ、生ずる還元力の増加をＤＮＳ法
により定量した。

上記反応で１分間当り１６μｍ・ｌのマルトトリオース
に相当する還元力を生成する酵素ｌを１単位とした。

以上の理化学的性質から、本酵素は従来知られていない
耐熱性を有する新規なプルラナーゼであると考えられる
。

本発明では、かかる耐熱性の高いプルラナーゼの遺伝子
をバチルス　ステアロサーモフィルス、特にバチルス　
ステアロサーモフィルスＴＲＳＩ２８の染色体ＤＮＡを
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断することにより調
製する。　Ｈ４ｎｄ　ｍを使用するのは、酵素の分子量
や生成蛋白質の細胞外への分泌に必要なキャリアー蛋白
質に相当する遺伝情報などを有効に保持した遺伝子の断
片が得られるからである。切断処理の方法は常法による
。

切断した染色体ＤＮＡ断片をショットガン方式でベクタ
ープラスミドたとえばｐＴＢ５２２　（ジャーナル　オ
ブ　ジェネラル　マイクロバイオロジー（Ｊ　ｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｇ　ｅｎｅｒａｌ　　Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　＞第１３１巻　第１７５７頁、（１９８５年
））に組換え、枯草望を宿主として復製維持できる組換
えプラスミドを作成する。目的とするプラスミド中の耐
熱性プルラナーゼ生産能をもつＨｉｎｄｌｌ＋によるＤ
ＮＡ断片は、分子量約２．７　Ｍ　Ｄ　ａであり、各種
の制限酵素に対する切断個所及び切断により生じたＤＮ
Ａ断片の分子量が夫々 ｆａ）　　バムエイチＩ（ＢａｍＨＩ）で２ケ所、断片
は夫々０．４０．０．８５及び１．４５　Ｍ　Ｄ　ａ（
ｂｌ工：］アールＩ（ＥｃｏＲｌ）で２ケ所、断片は夫
々０．２０．１．１０及び１．４０　Ｍ　Ｄ　ａｆｃｌ
　　ビーヴイユーＩＩ（Ｐｖｕ■）で１ケ所、断片は夫
々０．９０．　１．８０ＭＤａ である。さらに具体的には、１ｇ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を前
記のｐＴＢ５２２に組込み、本発明者等によってｐＴＰ
Ｉと命名された＆Ｉｌ換えプラスミドは、遺伝子工学的
な手法により、目的物質生産を可能とするための所望性
質（たとえばコピー数、薬剤耐性の種類、各種制限酵素
の切断箇所など）を有する。

このプラスミドｐＴＰ１の制限酵素地図は添付の第１図
の通りである。

本発明ではベクターとしてｐＴＢ５２２を使用したが、
市販のベクターであるｐ　ＵＢ　１１０．Ｊ。

Ｂａｃｔ、１９８１Ｖｏ１．１４６　　ｐ１０９１に記
載されているＩ）ＴＢ　５３．　　Ｊ、　　Ｂａｃｔ、
１９８２　Ｖｏｌ。

１４９ｐ８２４に記載のあるｐＴＢ９０と命名されたプ
ラスミドなども同様に使用できる０本発明に使用するプ
ラスミドはｐＴＢ５２２に限られるものではない。

本願の第２発明（特許請求の範囲の■記載のものを第２
発明、同■に記載のものを第３発明という、以下おなし
）は、前述の組換えプラスミドで形質転換された新規の
微生物である。この場合、宿主枯草菌はプルラナーゼ生
産能をもたない通常の枯草菌であれば１株の如何を問わ
ず利用できるが、望ましくは、アミラーゼ及び中性プロ
テアーゼ欠填株であるバチルス　ズブチリスＮＡ−１（
ジャーナル　オブ　バクテリオロジ、−第１７０巻、第
１５５４頁、１９８８年）を用いれば耐熱性プルラナー
ゼの生産及び精製を著しく容易にする点で好ましい。

なおり、ｓｕｂ口１ｉｓＮＡ　　１は通常入手できるＢ
。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　　Ｍａｒｂｕｒｇ株を起源として通
常の変異処理によりａｍｙｌａｓｅ、　ｐｒｏｔｅａｓ
ｅ活性を消失せしめた菌株である。　ａｍｙｌａｓｅの
欠損はプルラナーゼを導入したときの判定を容易にする
ためであり、又ｐｒｏｔｅａｓｅは集積したｐｕｌｌｕ
ｌａｎａｓｅの分解を防ぐ目的である。Ｂ、　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓＮ　Ａ　−１株はａｍｙｌａｓｅｐｒｏｔｅａ
ｓｅ活性を示さない点を除いて、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ株の菌学的性質を保有している。

第３発明は、第２発明の枯草菌を使用した耐熱性プルラ
ナーゼの製造法に関するものである。即ち、第２発明に
なる宿主菌を栄養培地に接種し、Ｐ　Ｈ６，５〜７．３
．３７℃で２４〜７２時間通気撹拌培養するなどの常法
により、耐熱性プルラナーゼを生成蓄積せしめる。更に
この培養物から耐熱性プ２．ラナーゼを硫安分画、沈で
ん、アルコール沈でん、膜淵縮法などの常法に従って回
収・精製する。

■　実施例 実施例１　　（Ｍｉ換えプラスミドの作成と枯草菌の形
質転換及びクローン株の選択） まず、バチルス　ステアロサーモフィルスＴＲＳ１２Ｂ
の染色体ＤＮＡを以下により調製する。

バチルス　ステアロサーモフィルスＴＲＳ１２８を１０
０ｍｌ　Ｌ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ中で一夜、
６０℃で培養した。これを遠心集菌し、２０ｍｌのＴＥ
１１街液（１０ｍＭ）リス、１ｍ　Ｍ−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ
　、　Ｐ　Ｈ８，５）で洗浄し、３ｍｌの１５％しョｔ
ＪＩ！、−５０ｍＭトリス　（ＰＨ８，５）−５０Ｍ−
ＥＤＴＡ−１ｍｇ／ｍ１リゾチームに懸濁し、水中で３
０分間静置した。これに３ｍｌの１％ザルコシルー５０
ｍＭトリス（ＰＨ８，５）−５０ｍＭ・ＥＤＴＡを添加
し、混合した。ついで５゜４ｇＣｓＣｆを加え０．３　
ｍ　ｌのエチジウムブロマイド液（Ｉ　Ｏｍ　ｇ　／　
ｍ　１　）を加え、ＲＰ６５Ｔローター（日立製作所型
）で超遠心基で分離した。

超遠心終了後、ＤＮＡ区分を注射針で抜き取り、ｎ−ブ
タノールで３回抽出を繰り返してエチジウムブロマイド
を除去した。このＤＮＡ試料を１０ｍＭ）　　リ　ス　
　（ＰＨ７，５）　　　−０，１ｍＭ　　−ＥＤＴＡ　
　中で透析し４℃で保存した。

方では枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラ
スミドｐＴＢ５２２（テトラサイクリン耐性）を常法に
より調製し、ついでバチルス　ステアロサーモフィルス
ＴＲＳ１２８の染色体ＤＮＡ及びｐＴＢ５２２を制限酵
素１１ｉｎｄｌｌ＋で切断する、その反応条件は次の通
りである。

表中、ｌ　ＯＸ　Ｈｉｎｄ　１ＩＩｌｌｉ衝液とは、１
００ｍＭト　リ　ス　　（Ｐ　　Ｈ７，４）　　　　　
１　０　０　　ｍ　　Ｍ　　Ｍ　　ｇ　　Ｃ１ｔ　　　
　　５００ｍＭＮａＣｊ！、１０ｍＭジチオスｌｚイト
ールを含む。

上記溶液で３７℃・１．５〜２時間反応させる。

上記で得られるＡ、Ｂ、２種類のＤＮＡを混合し、３Ｍ
酢酸カリウム溶液２０μｌ加え、その後エタノール０．
４５　ｍ　ｌを加えて遠心し、上澄を除いた。

沈でんはエタノールで洗浄し、脱水・脱塩し、デシケー
タ−で乾燥した。この乾燥物に２×リガー溶液とした。

第３段階としては、上述の組換えプラスミドを枯草菌に
導入してクローニングする段階である。

バチルス　ズブチリスＮＡ−１は、プルラナーゼ非生産
性の通常の枯草菌をＮＴＧ変異処理等により得られるア
ミラーゼ・中性プロテアーゼ欠損変異株の１つであるが
、これをＬ培地で一夜培養した後、その１ｍｌを１００
ｍｊ！容フラスコ内のＴＦＩ培地２０ｍｌに植菌する。

これを３７℃で培養し、対数増殖期を外れてから１時間
後、５００ｍｌ容フラスコ内のＴＦ［Ｉ培地３６ｍ１に
４ｍｌ植菌し、１．５時間培養してコンピテント　セル
を得る。

ＴＦＩ、ＴＦｎ培地は夫々以下の通りである。

（以下余白） オスレイトール２０ｐｌ、５ｍＭ−ＡＴＰ２０μｌ、水
６０μｌを加え混合した後、ＤＮＡリガーゼ１μｌを加
え、８℃・１６時間保ち、ＤＮＡこのコンピテント　セ
ル１ｍｊに前述により得られたＤＮＡ溶液を混合し、３
７℃・３０分間激しく振盪培養後、遠心集菌し、Ｌ培地
１五ｌを加えて３７℃・１．５時間１１ｉ盪培養する。

その培養液を１００ｐｌづつテトラサイクリン２５μｇ
／ｍｅを含む寒天平板に塗抹し、３７℃１夜培養し、形
質転換体を得た： この形質転換体をＰＬＬ寒天平板（１％プルラン、０．
２％トリプトン、０．２％イーストエキス、０、２％Ｎ
ａＣ１，１，５％寒天（ＰＨ７，３））にレプリカし、
３７℃１夜培養後、平板上にエタノールを注ぎ、数時間
放置し、ハローを形成するコロニーを取得した。この耐
熱性プルラナーゼのクローン株の保持する組換えプラス
ミドをｐＴＰｌと命名した。

実施例２（耐熱性プルラナーゼの製造）実施例１により
得られたｐＴＰｌを保持するバチルス　ズブチリスＮＡ
−１を３％可溶性でん粉を含むし培地（２５μｇ　／　
ｍ　１テトラサイクリン含有）にて３７℃、２４時間培
養した。培養液を遠心分離して上澄を採り、６０℃・１
５分間加熱処理をした。この段階で耐熱性プルラナーゼ
以外の蛋白質は殆んど変性・沈でんし、非常に純度の高
い耐熱性プルラナーゼが容易に得られた。

■　本発明の効果 本発明では、安全性が高く、かつ酵素を菌体外に分泌す
るシステムを持つ枯草菌を宿主として用いたから、工業
的観点から応用価値が高い。

−ａに自然界よりスクリーニングした菌株は、アミラー
ゼその他のＩｉ賞関連酵素に較ベプルラナーゼの生産量
が低く、精製が困難である。また、プルラナーゼのうち
でも耐熱性の高いものは一層その傾向が強い０本発明で
は、中温菌であり、かつアミラーゼを生産しない枯草菌
に耐熱性プルラナーゼ遺伝子を組込みクローン化するこ
とにより、たとえば培養上澄を６０℃・１５分間加熱処
理をする程度のことで簡単に耐熱性プルラナーゼを精製
することを可能としたものである。因みに、耐熱性プル
ラナーゼ遺伝子をクローン化できたことにより遺伝子増
幅効果やプロモーター活性の増強等を利用して本酵素の
大量生産化も可能ならしめることとなる。

【図面の簡単な説明】

第１図・・・・・・ベクタープラスミドｐＴＢ５２２を
用いて調製した組換えプラスミドｐ”ｒｐ　１の制限酵
素地図０図中太線で示した２、７ＭＤａのＨｉｎｄｌ［
ｌ断片に相当する部分は、バチルス　ステアロサーモフ
ィルスＴＲＳＩ２８染色体由来の耐熱性プルラナーゼ遺
伝子を含む部分である。ただし、円内の数字は分子サイ
ズをＭＤａで表わしたものである。 Ｅ　・・・ Ｐｖ・・・ Ｈ・・・ Ｂ　・・・ Ｐｓ・・・ ｃｏＲＩ Ｐｖａ　　　　ＩＩ ｌ１ｄ［Ｉ［ ａｍＨＩ Ｐｓｔ　　　　Ｉ 特許出願人　江崎グリコ株式会社

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルスステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉ−ｌ
   ｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の染色
   体ＤＮＡを制限酵素ヒンドIII（ＨｉｎｄIII）により処
   理して得られる耐熱性プルラナーゼ生産能をもつＤＮＡ
   断片とＨｉｎｄIIIで処理して得られたベクター断片と
   を結合させた組換えＤＮＡであって、かつ、枯草菌を宿
   主として複製維持されたことを特徴とする組換えプラス
   ミド。
2. （２）バチルスステアロサーモフィルス菌がバチルスス
   テアロサーモフィルスＴＲＳ１２８（微工研菌寄託第９
   ６１０号）であることを特徴とする特許請求の範囲の１
   記載の組換えプラスミド。
3. （３）バチルスステアロサーモフィルス又はバチルスス
   テアロサーモフィルスＴＲＳ１２８をＨ−ｉｎｄIII処
   理して得られるＤＮＡ断片が分子量約２．７ＭＤａであ
   り、かつ各種制限酵素による切断地図が第１図に示すも
   のであることを特徴とする特許請求の範囲の１記載の組
   換えプラスミド。
4. （４）バチルスステアロサーモフィルスの染色体ＤＮＡ
   を制限酵素ＨｉｎｄIIIにより処理して得られる耐熱性
   プルラナーゼ生産能をもつＤＮＡ断片を有するプラスミ
   ドを複製維持した宿主であることを特徴とする形質転換
   された枯草菌。
5. （５）バチルスステアロサーモフィルス菌がバチルスス
   テアロサーモフィルスＴＲＳ１２８であることを特徴と
   する特許請求の範囲の４記載の形質転換された枯草菌。
6. （６）バチルスステアロサーモフィルスの染色体ＤＮＡ
   を制限酵素ＨｉｎｄIIIにより処理して得られる耐熱性
   プルラナーゼ生産能をもつＤＮＡ断片を有するプラスミ
   ドを複製維持した枯草菌を栄養培地で培養し、その培養
   物から耐熱性プルラナーゼを回収することを特徴とする
   形質転換された枯草菌による耐熱性プルラナーゼの製造
   法。
7. （７）バチルスステアロサーモフィルス菌がバチルスス
   テアロサーモフィルスＴＲＳ１２８であることを特徴と
   する特許請求の範囲の（６）記載の形質転換された枯草
   菌による耐熱性プルラナーゼの製造法。