FI75367C - Foerfarande foer framstaellning av en genetiskt manipulerad mikroorganism innehaollande en foer amylas kodande rekombinant-dna, och ett foerfarande foer framstaellning av amylas. - Google Patents

Description

1 75367

Menetelmä geneettisesti manipuloidun mikro-organismin valmistamiseksi, joka sisältää amylaasia koodaavan yhdistelmä-DNA:n, sekä menetelmä amylaasin valmistamiseksi 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 810425.

Keksintö koskee menetelmää geneettisesti manipuloidun mikro-organismin valmistamiseksi, joka sisältää amylaasia koodaavan geenin, sekä menetelmää amylaasin tuottamiseksi, jossa käytetään tätä geneettisesti manipuloitua mik-10 ro-organismia.

Vaikka käsitettä geenimanipulaatio usein käytetään kuvamaan suurta joukkoa menetelmiä jonkin organismin geneettisen informaation keinotekoista muuttamista varten, sitä tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa käytetään ai-15 noastaan tarkoittamaan yhdistelmä-DNA:n valmistusta jostakin luovuttaja-mikro-organismista ja sopivasta vektorista in vitro, valikointia halutun geneettisen informaation perusteella ja valitun DNA:n vientiä sopivaan mikro-organismiin (isäntä-mikro-organismiin), jolloin haluttu (vieras) 20 geneettinen informaatio tulee isännän täyden geenistön osaksi. Käsite "kloonattu mikro-organismi", kuten sitä käytetään läpi tämän selityksen ja patenttivaatimusten, tarkoittaa tällä menetelmällä valmistettua mikro-organismia.

Käsitteet "amylaasi" ja "amylolyyttinen entsyymi" 25 ovat synonyymejä ja niitä käytetään kautta koko tämän selityksen ja patenttivaatimusten tarkoittamaan yleisesti niitä entsyymejä, jotka pystyvät katalysoimaan tärkkelyksen hydrolyysin, kuten alfa-amylaasi, beta-amylaasi, isoamylaa-si (alfa-1,6, glukosidaasit, kuten pullulanaasi, mukaan 30 luettuina), gluko-amylaasi jne.

Viime vuosien aikana on tietenkin kirjoitettu runsaasti geenimanipulaatiosta (joista monista erinomaisista katsauksista kaksi on "DNA Cloning and the Analysis of Plasmid Structure and Function", tekijöinä K.N. Timmis, S.N.

35 Cohen ja S.C. Cabello, Prog. Molec. subcell Biol. 6, (1978) 1-58 ja "Lambdoid Phages that Simplify the Recovery of in 2 75367 vitro Recombinants", tekijöinä Noreen E. Murray, W.J. Bram-mar ja K. Murray, Molec. gen. Genet. 150 (1977) 53-6), jotka sisältävät monia kuvauksia uusista, geneettisesti modifioiduista mikro-organismeista, joilla on arvokkaita ominai-5 suuksia. Bunzi Maruo'n, Yuko Yoneda'n ja Gakuzo Tamura'n JP-patentti julkaisussa nro SHQ 52-76480 (julkaistu 27.6.1 977 , jätetty 19.12.1975 SHO 50-150641:nä) esitetään runsaasti amylaasia tuottavien mikro-organismikantojen valmistus in vivo rautageneesi-, transduktio- ja transformointimene-10 telmin useiden geneettisten ominaisuuksien kokoamiseksi amy-laasi-tuotannon edistämiseksi Bacillus-mikro-organismissa. Nämä menetelmät, jotka eivät käsitä geenimanipulointia, kuten se tässä määritellään, rajoittuvat yhteen ainoaan tai muutamaan lähisukuiseen (geneettisesti käsittäen) mikro-15 organismiin. Nämä kannat eivät myöskään ole sopivia geeni-amplifikaatioon (esim. faagilla tai plasmidilla), jota tässä keksinnössä käytetään suurempaa entsyymituotantoa varten. Artikkelissa "Cloning of a Foreign Gene Coding for Alpha-amylase in Bacillus subtilis", Biochemical and Bio-20 physical Research Communications 91, nro 4 , sivut 1556-1564 (joulukuu 28, 1979), Yuko Yoneda, Scott Graham ja Frank E. Young kuvaavat alfa-amylaasia koodaavan geenin kloonausta Bacillus subtilikseen sitomalla Bacillus amyloliquefaciens-H:n pilkottu DNA temperantin faagin phi 3T DNA:han ja trans-25 formoimalla sen jälkeen Bacillus subtilis -soluja, joista amylaasi puuttuu. Kirjoittajat eivät esitä mitään todistusta geeniamplifikaatiosta, johon liittyy amylaasientsyymin yhtenäinen tuotanto, mikä on tämän keksinnön päätarkoitus.

Keksinnön kohteena on menetelmä geneettisesti mani-30 puloidun mikro-organismin valmistamiseksi, jolloin isäntä-mikro-organismiin lisätään yhdistelmä -DNA, joka sisältää amylaasia koodaavan geenin, ja on valmistettu in vitro-mene-telmällä pilkkomalla luovuttajabakteerista peräisin oleva DNA ja yhdistämällä syntyneet DNA-fragmentit vektoriin, joka 35 on samalla tavalla pilkottu. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että tämä vektori on plasmidi tai

II

75367 lamda-faagin johdannaisen DNA ja geneettisesti manipuloitu mikro-organismi on bakteeri, joka sopivissa viljelyolosuhteissa pystyy tuottamaan amylaasia oleellisesti puhtaammassa muodossa tai oleellisesti suuremman määrän kuin alku-5 peräinen luovuttaja-mikro-organismi tuottaa. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa näin tuotetuilla amylaaseilla on yksi tai useampi ominaisuus, joka tekee ne erityisen käyttökelpoisiksi teollisissa entsymaattisissa tärkkelys-hydro-lyyseissä (esim. tärkkelyksen entsymaattisessa nesteyttä-10 misessä ja/tai sokeriksimuuttamisessa liimojen, viimeiste-lyaineiden, maltodekstriinien, koostumukseltaan erilaisten tärkkelyssiirappien, maltoosin, dekstroosin jne. tuottamiseksi) , kuten kestävyys korkeissa lämpötiloissa, raskas-metallikestävyys jne.

15 Keksintö toteutetaan uuttamalla ensin DNA bakteeri- mikro-organismista (luovuttaja-mikro-organismista), joka pystyy tuottamaan ainakin yhtä amylolyyttista entsyymiä, pilkkomalla (sopivalla restriktioentsyymillä) DNA sekä, vektorina, lambda-faagin tai sen johdannaisen DNA ja yhdis-20 tämällä ja liittämällä saadut fragmentit yhdistelmä-DNA:iden muodostamiseksi, joista jotkut sisältävät amylaasia koodaa-van geenin. Yhdistelmä-DNA:t tehdään biologisesti aktiivisiksi siirtämällä ne sopiviin isäntäsoluihin (esim. E. coliriin) in vitro-kapseloinnilla tai transfektiolla.

25 Syntyneet kloonit seulotaan sitten amylaasia koodaa- van geenin suhteen ja yksi tai useampia positiivisia klooneja valitaan ja monistetaan saaden siten aikaan uusia, geneettisesti manipuloituja mikro-organismeja, jotka pystyvät, sopivissa viljelyolosuhteissa, tuottamaan oleellisesti 30 suurempia määriä amylaasia kuin luovuttaja-mikro-organis- milla voidaan tuottaa. Valinnaisesti uuden faagin DNA uutetaan, pilkotaan ja subkloonataan toiseksi vektoriksi, joka voi olla joko plasmidi tai toinen faagi, ja uudet kloonit seulotaan ja valikoidaan amylaasia koodaavan geenin läsnä-35 olon perusteella. Voidaan suorittaa myös peräkkäisiä "sub-sub-kloonauksia".

4 75367

Sen lisäksi, että keksinnön mukaisesti saadaan uusia, geneettisesti manipuloituja mikro-organismeja, jotka ovat amylaasin "ylituottajia", on keksinnöllä se etu, että sen seurauksena siirtyy ensisijaisesti geeni yhden ainoan amylo-5 lyttisen entsyymin tuotantoa varten, vähentäen siten suuresti puhdistamista, joka on tarpeen ei-geneettisesti manipuloitujen mikro-organismien viljelmissä.

Kun kloonattu mikro-organismi, joka sisältää halutun yhdistelmä-DNA:n, on tuotettu, mikro-organismia viljellään 10 siten, että yhdistelmä-DNA:ta vahvistetaan siten antamaan amylaasia olennaisesti suuremmissa määrissä kuin luovuttaja-mikro-organismilla voidaan tuottaa.

Kun vektori on lambda-faagin johdannainen, jolloin isäntä-mikro-organismi on välttämättä E. coli, voidaan vah-15 vistaminen ja entsyymin tuotanto toteuttaa seuraavasti.

Jos faagi on lysogeeninen, viljellään mikro-organismia, ts. E, colia, ensin solujen monistamiseksi sopivaan tiheyteen, ne infektoidaan sitten sopivalla määrällä bakteriofaagia ja systeemiä viljellään, kunnes soluseinät ovat tuhoutuneet 20 ja amylaasi leviää viljelyväliaineeseen.

Kun vektori-isäntä-systeemi on sopiva lambda-lyso-geeninen E. coli, viljellään infektoitua isäntä-mikro-orga-nismia ensin 32°C:ssa bakteerisolujen monistamiseksi sopivaan tiheyteen, minkä jälkeen lämpötila nostetaan 42°C:seen 25 ja pidetään siinä tietty aika lysogeenisen syklin indusoi-miseksi ja tuodaan sitten 37°C:seen ja pidetään siinä vieraan läsnäolevan DNA:n amplifikaation aikaansaamiseksi, mitä seuraa suurten amylaasimäärien tuotanto. Soluseinät voivat mahdollisesti tuhoutua, riippuen olosuhteista, jos-30 sa tapauksessa amylaasi leviää viljelyväliaineeseen.

Kun vektori on monikopio-plasmidi, kuten pBR 322 tai pACYC 184, vieraan DNA:n amplifikaatio tapahtuu itsestään. Vaihtoehtoisesti geneettisesti manipuloitua mikro-organismia, joka sisältää plasmidi-DNA:n, viljellään ensin 35 bakteerisolujen monistamiseksi haluttuun tiheyteen, minkä jälkeen lisätään kloramfenikolia, koska antibiootti estää

II

7 5 3 6 7 solujen lisämonistumisen ja amylaasin tuotannon, mutta sallii plasmidi-DNA:n monistumisen (vahvistumisen) solujen sisällä. Lopuksi solut erotetaan viljelyväliaineesta ja pestään kloramfenikolin poistamiseksi. Amylaasin tuotantoa 5 varten soluja viljellään sitten uudelleen, tietenkin ilman kloramfenikolia, suurien amylaasimäärien tuottamiseksi.

Kaikissa geenimanipuloinneissa on tietenkin olennaista, että pystytään "merkitsemään" ja siten valikoimaan ne kloonit, jotka sisältävät halutun geneettisen informaation.

10 Sovellettaessa tätä keksintöä tähän päästään helposti käyttämällä väliainetta, joka sisältää tärkkelystä, jos halutaan alfa-amylaasi-, beta-amylaasi- tai glukoamylaasiaktiivisuut-ta. Viljelyväliaine värjätään sitten jodilla; klooneja, joilla on amylaasiaktiivisuus tärkkelystä sisältävällä vä-15 liaineella, ympäröi valkea alue. Eräs spesifinen, edullinen värjäysmenetelmä selostetaan tämän jälkeen. Jos halutaan pullulanaasiaktiivisuutta, viljellään klooneja BBL-trypii_ kaasi-väliaineessa, joka sisältää pullulaania. Myös tätä menetelmää kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä.

20 Keksintöä kuvataan nyt tarkemmin yksityiskohtaises ti, kuten spesifisiä aineita ja menetelmiä, joita työssä on käytetty. On todettava, että monet käytetyistä menetelmistä ovat vakiomenetelmiä ja tämän alan ammattimiesten hyvin tuntemia; tästä huolimatta joitakin näistä kuvataan 25 yksityiskohtaisesti selvyyden vuoksi.

Luovuttaja-mikro-organismi

Luovuttaja-mikro-organismin tulisi olla bakteeri-mikro-organismi, joka pystyy tuottamaan ainakin yhtä amy-laasia (haluttu amylaasi tietenkin mukaan luettuna), ja 30 edullisesti se tuottaa amylaasia, jolla on ominaisuuksia, jotka ovat haluttuja tärkkelyksen teollisessa hydrolyysis-sä, esim. kestävyys korkeissa lämpötiloissa tai metallin myrkyttämistä vastaan. Todennäköisesti luovuttaja voi olla myös eukaryoöttinen amylaasia tuottava mikro-organismi (esim.

55 sieni tai hiiva). Kuten esimerkeistä käy ilmi, on menestyksellisesti käytetty Bacillus megaterium-, Bacillus coagulans-, 6 75367

Bacillus cereus- ja Klebsiella pneumoniae -kantoja kloonattujen mikro-organismien tuottamiseksi, jotka pystyvät tuottamaan suuria määriä alfa-amylaasia, kuumuutta kestävää alfa-amylaasia, beta-amylaasia ja pullulanaasia vastaavasti.

5 Liitäntä- ja restriktioentsyymit Tässä työssä on yhdenmukaisesti käytetty liitäntä-entsyyminä T4 DNA-ligaasia, mutta on helposti ymmärrettävä, että voidaan käyttää mitä tahansa DNA:ta liittävää entsyymiä. Tässä työssä käytetyt spesifiset restriktioentsyymit 10 on esitetty esimerkeissä. Sopivan restriktioentsyymin valinnan voi tietenkin alaan perehtynyt asiantuntija tehdä käyttäen hyvin tunnettuja menetelmiä. Tässä on menetelmänä restriktioentsyymin valitsemiseksi jatkokäsittelyä varten ollut pilkkoa luovuttaja-mikro-organismista uutettu DNA 15 (luovuttaja-DNA) eri restriktioentsyymillä ja valita yksi (tai useampi kuin yksi), joka on sopivin lisäkokeita varten, entsyymin kyvyn perusteella pilkkoa DNA lukuisiksi fragmenteiksi kooltaan väliltä 2-15 kiloemästä.

Vektorit 20 On useita syitä miksi faagin lambda johdannaiset ovat erityisen tehokkaita luovuttajasta uutetun DNA:n kloonausta varten. (1) Faagin lambda deleetio-mutantit sallivat erikokoisten (riippuen tietenkin nimenomaisesta lambda-johdannaisesta) vieraiden DNA-fragmenttien insertion ja lisäksi 25 tekevät mahdolliseksi vierasta DNA:ta sisältävien kloonien yksinkertaisen tunnistamisen. (2) On kehitetty faagin lambda eri johdannaisia, jotka sallivat useiden restriktioentsyymien käytön, lisäten siten menestyksellisen kloonauksen toteutumismahdollisuuksia. (3) Vieraiden geenien erittäin hyvät vahvis-30 tukset ovat mahdollisia käytettäessä sopivia faagin lambda johdannaisia. (4) Ligaation jälkeen rekombinantti-kloonien talteenotto tapahtuu helposti transfektiolla tai in vitro-täy-töllä. Monipuolisuutensa, jota mikään muu olemassaoleva vektori ei voi antaa, ansiosta käytetään tätä keksintöä sovellet-35 taessa faagin lambda johdannaisia ja E. colia isäntänä luovuttajasta uutetun DNA:n alkukloonausta varten.

il 75367

Muut edut faagin, mieluummin kuin plasmidin, käytöstä primaarikloonausta varten ovat seuraavat: (1) Rekombi-nanttien, joissa on vieraita DNA-insertiojaksoja, prosentti on suurempi; (2) Bakteerit hajoavat vapauttaen siten solu-5 sisältönsä ja siten kaiken amylaasin väliaineeseen helpottaen siten havaitsemista jodivärjäysmenetelmällä; (3) Faagin resistenssi jodia vastaan on suurempi kuin millään muulla elävällä bakteerilla.

Alaan perehtynyt pätevä geneetikko pystyy helposti 10 valitsemaan sopivan plasmidin vektoriksi subkloonausta varten, jolloin yhtenä kriteeriona on tietenkin yhden ainoan tai rajoitetun määrän pilkontakohtia olemassaolo käytettävää restriktioentsyymiä varten.

Eniten tässä käytettyjä plasmideja ovat pBR 322 ja 15 pACYC 184. Koskemattomassa tilassaan plasmidi pBR 322 antaa resistenssin sekä ampisilliinille että tetrasykliinille ja sisältää yhden ainoan pilkontakohdan jokaiselle Pst I-, EcoRI-, Hind III-, Bam HI- ja Sal I -entsyymeistä. Leikkaaminen ja insertio Pst I-kohdassa tuhoaa resistenssin 20 ampisilliinille, kun taas insertio Bam HI- ja Sai I-kohtiin tuhoaa resistenssin tetrasykliinille. Insertio Hind Hikoiltaan tuhoaa joskus resistenssin tetrasykliinille, edellyttäen, että kloonatussa geenissä ei ole omaa promoottoria.

Koskemattomassa tilassaan plasmidi pACYC 184 antaa 25 resistenssin sekä tetrasykliinille että kloramfenikolille, ja sisältää yhden ainoan restriktiokohdan kullekin entsyymille Eco Rl, Hind III, Bam HI ja Sal I. Leikkaaminen ja insertio Eco RI-kohdassa tuhoaa resistenssin kloramfenikolille, kun taas insertiolla kolmeen muuhun kohtaan 30 Hind III:lle, Bam Hiille ja Sai li lie on samat vaikutukset kuin plasmidissa pBR 322, koska tämä alue on yhteinen kummallekin plasmidille.

Subkloonausta varten Bacillus subtilikseen käytettiin tässä plasmidia pC 194 vektorina. Tällä plasmidilla 35 on yksi ainoa Hind III-kohta ja se antaa resistenssin kloramfenikolille.

8 „ 75367

Isäntä-mikro-organismi

Koska faagin lambda johdannaisia voidaan ekspres-soida ainoastaan E. colissa, täytyy tämän ilmeisesti olla isäntä rekombinanttifaagi-DNA:lie, joka on valmistettu 5 tämän keksinnön mukaisesti. Kun yhdistelmä-DNA toisaalta on plasmidin muodossa, voidaan käyttää mitä tahansa mikro-organismia, joka pystyy hyväksymään ja kopioimaan tällaisen plasmidi-DNA:n, esim. muita bakteeri-mikro-organismeja tai hiivoja, kuten Saccharomyces cerivisiaeta.

10 Käytännön syistä on tässä käytetty E. coli-kantoja (esim. HB 101) suurimmaksi osaksi, koska ne ovat hyvin tunnettuja kantoja geneettiseltä kannalta ja ovat herkkiä infektiolle tunnetuilla faageilla ja plasmideilla, mistä on seurauksena lisääntynyt entsyymin ylituotantokyky.

15 Kuten esimerkissä Ha on selostettu, voidaan rekom- binanttiplasmidi subkloonata plasmidiksi, kuten pC 194:ksi, joka pystyy monistumaan B substiliksessa.

Menetelmä

Menetelmää kuvataan kaksivaiheisen kloonauskokeen 20 avulla, jolloin ensimmäisessä vaiheessa (panos) käytetään faagia ja toisessa vaiheessa plasmidia.

Kun luovuttaja-mikro-organismi, restriktio- ja ligaa-tioentsyymit ja faagin lambda spesifinen johdannainen on valittu, DNA:t uutetaan, pilkotaan, sekoitetaan ja yhtyneet 25 fragmentit liitetään, kaikki tavanomaisin menetelmin, jotka eivät tässä selitystä kaipaa.

DNA tehdään sitten biologisesti aktiiviseksi E. colissa transfektiolla tai in vitro kapseloinnilla. Tässä työssä lambda-DNA:11a on päästy hyvään tulokseen kapseloin-30 timenetelmällä (B. Hohn ja K. Murray, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 74 (1977) 3259-3263). Ne kloonit, jotka ovat saaneet vieraan DNA:n, tunnistetaan sitten sopivin menetelmin. Jos käytetään insertio-vektoria, kuten lambda NM590 tai lambda NM607, antavat ne kloonit, jotka sisältävät vierasta 35 DNA:ta, kirkkaita plakkeja, kun taas ne, jotka eivät sisällä vierasta DNA:ta, antavat sameita plakkeja. Kun käytetään 11 75367 korvausvektoria, kuten lambda NM761 tai lambda NM781, voidaan identifiointi tehdä viljelmällä E. coli lac amber-resipientilla laktoosi-indikaattori-väliaineella, esim. McConkey, EMB tai X gal.

5 Lukuisia (useita tuhansia) klooneista, jotka ovat ottaneet vastaan vieraan DNA:n, levitetään sitten väliaineelle, joka sisältää tärkkelystä, ja seulotaan amylaasia koodaavan geenin läsnäolon suhteen edellä mainitulla jodi-värjäysmenetelmällä. Tällöin on tietenkin pidettävä huoli 10 siitä, että ei käytetä niin suuria jodiväkevyyksiä, että faagi tapetaan, ja tämä voi olla ongelma, jos jodi lisätään liuoksen muodossa. Tässä käytetty erittäin edullinen värjäys-menetelmä käsittää levyjen altistamisen jodihöyrylle lyhyeksi ajaksi; tätä menetelmää on tässä käytetty erittäin 15 hyvällä menestyksellä.

Eräs edullinen menetelmä kloonien löytämiseksi, joilla on pullulanaasiaktiivisuus, jossa menetelmässä ei käytetä jodivärjäystä, selostetaan seuraavassa. Faageja viljellään petrimaljoilla, jotka sisältävät BBL-tryptikaasia ja 20 pullulaania väkevyydessä n. 0,25 %. Väliaineessa oleva pullulaani hydrolysoituu "positiivisten" plakkien ympärillä pullulanaasin vaikutuksesta maltotrioosiksi, jota bakteerit käyttävät. Siten ne bakteerit, jotka käyttävät maltotrioo-sia, kasvavat paremmin kuin muut kasvualustalla, sillä seu-25 rauksella, että plakkeja, jotka tuottavat pullulanaasia, ympäröi läpikuultamaton rengas kasvavia bakteereja ja ne voidaan helposti havaita. Tätä menetelmää on selitetty yksityiskohtaisesti esimerkissä IV.

Yksi (tai useampi) positiivinen klooni poimitaan sit-30 ten ja monistetaan. Tämä voi tietenkin olla "lopullinen" geneettisesti manipuloitu mikro-organismi ja sitä voidaan käyttää tuottamaan suuria määriä amylaasia sopivalla viljelyllä, kuten edellä selostettiin. Vaihtoehtoisesti tätä kloonia voidaan käyttää DNA:n lähteenä toista kloonausta 35 varten plasmidiin tai muuhun, sopivampaan faagiin. Seuraavassa selostetaan menetelmää subkloonaamiseksi plasmidiin.

10 75367 Jälleen kloonien DNA standardimenetelmiä käyttäen uutetaan ja pilkotaan restriktioentsyymillä, plasmidi pilkotaan samoin, fragmentit sekoitetaan ja uudelleenyhdisty-neet osaset liitetään. Käytettäessä plasmidia pBR 322 kloo-5 nien, jotka ovat ottaneet vastaa amylaasia koodaa.van geenin sisältävän DNA:n, tunnistaminen tapahtuu tekemällä DNA biologisesti aktiiviseksi isännässä, kuten E. colissa transformoimalla, viljelyväliaineessa, joka sisältää ampisilliiniä tai tetrasykliiniä, riippuen käytetystä restriktioentsyy-10 mistä. Viljelyväliaine sisältää myös tärkkelystä tai pullu-laania ja kloonien, jotka sisältävät amylaasia koodaavan geenin, tunnistaminen tapahtuu jollakin edellä kuvatuista menetelmistä. Positiivisia klooneja viljellään sitten ja plasmidi-DNA:ta voidaan sitten vahvistaa kloramfenikolin 15 avulla, kuten edellä selostettiin.

Piirrokset esittävät karttoja villintyyppisestä bakteriofagi lambdasta (kuvioa la) ja kaikista käytetyistä vektoreista sekä seuraavien esimerkkien mukaisesti tuotetuista uusista rekombinantti-plasmideista. Erityisesti 20 kuviossa 1 esitetään myös karttoja faageista lambda NM 590 (b) ja lambda 781 (c), /Murray, N.E., Brammar, W.J.,

Murray, K. Molec. gen. Genet. 150 (1977) 53-6Γ/. Kuvio 2 käsittää karttoja plasmideista pBR 322 /Bolivar, F., Rodriquez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., 25 Boyer, H.W. Gene 2 (1977) 95-113.7 ja pACYC 184 /Chang, A.C.Y., Cohen, S.N. J. Bact. 132 (1978) 1141-1156,7. Kuvio 3 on kartta uudesta plasmidista pCP 1 ja kuvio 4 on uusi plasmidi pCP 2. Kuvio 5 valaisee esimerkkiä IIA, esittäen plas-mideja pC 194, pCP 2,3 ja lopullista uutta plasmidia pCH 1.

30 Kuviot 6 ja 7 esittävät plasmideja pCP 3 ja pCP 4, vastaavasti. Kaikkien uusien rekombinanttiplasmidien kartoissa luovuttaja-DNA on osoitettu paksulla viivalla.

Esimerkit valaisevat keksintöä. Prosentit on laskettu painosta ellei toisin ole esitetty. Kaikki kokeet 35 suoritettiin seuraten NIH (USA) ohjeita suojarakenteita varten.

Il 11 75367

Esimerkki I

Alfa-amylaasi-geenin kloonaus Käytettiin seuraavia aineita: restriktioendonukleaasi Hind III 5 T4 DNA-ligaasi

Faagi lambda NM 590. Faagi-DNA valmistettiin fenoli— uutolla erittäin pitkälle puhdistetuista faagifragmenteista.

Plasmidi pBR 322. Plasmidi-DNA puhdistettiin lysot-syymillä hajotetuista E. coli -soluista keesiumkloridi- 10 etidiumbromidi-tiheysgradienteilla.

Isäntä-mikro-organismi, E. coli HB 101.

Luovuttaja-mikro-organismi oli Bacillus megaterium -kanta, jolla on seuraavat mikrobiologiset tunnusmerkit: (1) Morfologia: sauvoja (0,5 - 0,7 ^u x 2,0 - 5,0 ^u), 15 liikkuvia, grampositiivinen, itiöt ovat terminaalisia tai subterniinaalisia.

(2) Ravintoliemi: hyvä kasvu.

(3) Ravinto-agar-liemi: hyvä kasvu; pesäkkeet ovat tiiviitä keskeltä ja hajanaisempia ympärillä.

20 (4) Maito: peptonisaatio ilman pH-arvon muutosta.

(5) Gelatiini: ei nesteytetty.

(6) Nitraattien pelkistys: negatiivinen.

(7) Katalaasireaktio: negatiivinen.

(8) Oksidaasireaktio: negatiivinen.

25 (9) Sytokromioksidaasireaktio: negatiivinen.

(10) Indolin tuotanto: negatiivinen.

(11) H2S:n muodostus: negatiivinen.

(12) hiilihydraattien hyväksikäyttö: käyttää arabi-noosia, ksyloosia, galaktoosia, glukoosia, levuloosia, mal- 30 toosia, raffinoosia, sakkaroosia, tärkkelystä ja niistä tuotettua happoa. Ei käytä hyväksi ramnoosia, mannoosia, melibioosia, inuliinia ja salisiinia.

(13) Polyolien hyväksikäyttö: käyttää hyväksi sorbitolia ja mannitolia; ei käytä hyväksi adenitolia, dulsito- 35 Ha ja inositolia.

(14) Dekarboksylaasireaktio lysiinillä: negatiivinen.

(15) Ureolyysi: heikko.

12 75367 (16) Kestävyys raskametalleja vastaan: kasvaa + + + suoraan 500 ppm:11a Cr (17) Natriumkloridiliemi: kasvua NaCl-pitoisuudessa 3,5 %.

5 (18) Optimilämpötila kasvua varten: 30-37°C

Maksimilämpötila kasvulle: 40-50°C

Minimilämpötila kasvulle: 5-20°C

(19) Hapen tarve: aerobinen.

Mikro-organismi tunnistettiin Bacillus megateriumiksi 10 mikrobiologisten tunnusmerkkiensä perusteella viitaten käsikirjaan Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. painos), R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, aputoimittajia; julkaissut Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. Tämä mikro-organismi on talletettu kokoelmaan National 15 Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research

Station,. PO Box No. 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Skotlanti, 12.2.1980, ja sille on annettu NCIB nro 11568.

Seuraavassa selostus käytetystä menetelmästä.

A. In vitro -rekombinaatio lambdan ja B megaterium-20 DNA:iden välillä N. 7 yug B. megaterium-DNA:ta pilkottiin 10 yksiköllä Hind III 37°C:ssa yksi tunti 25 yUl:ssa Tris-puskuria pH 7,5:ssä. N. 2 ^,ug lambda NM 590 pilkottiin samalla tavalla samalla entsyymillä. Reaktiot pysäytettiin kuumen-25 tamalla 75°C:ssa 10 minuuttia.

Suoritettiin kaksi testiä pilkonnan tehokkuuden määrittämiseksi : 1. Näiden kahden reaktioseoksen näytettä elektrofo-resoitiin agaroosigeelillä 20 tuntia 20 voltilla. Geelin 30 värjäämisen jälkeen etidiumbromidilla havaittiin nauhojen odotettu malli: lambda DNA:n kaksi nauhaa, jotka ovat peräisin ainoan Hind III -kohdan pilkonnasta lambda-DNA:Lla, ja hyvin suuri luku miltei limittäisiä nauhoja bakteeri-DNA:sta, joka on pilkottu lukuisissa kohdissa.

35 2. Faagi-DNA:n transfektiomääritys osoitti, että pilkonta oli ollut yli 99-%:isen tehokas, hävittäen siten miltei täysin faagi-DNA:n biologisen aktiivisuuden.

13 75367

Pilkotut DNA:t sekoitettiin ja niitä inkuboitiin viisi tuntia 10°C:ssa 0,15 yksikön kanssa T4 DNA-ligaasia DNA-fragmenttien mielivaltaisen uudelleen temperoitumisen ja kovalenttisen sitoutumisen sallimiseksi.

5 Tämän inkuboinnin päätyttyä DNA sekoitettiin in vitro kapseloidun preparaatin kanssa, joka käsitti kahden komple-mentaatisesti vajaan faagilysaatin (lambda Dam ja lambda Earn), jotka oli indusoitu ei-supressiivisista kannoista, seoksen. Tässä seoksessa jokainen DNA-molekyyli, jolla on lambda 10 DNA:n cos-äärimmäiset hännät ja joka on sopivaa kokoa, voi yhdistyä faagiproteiiniin muodostaen siten in vitro biologisesti aktiivisen faagipartikkelin, joka pystyy infektoimaan E. colin ja tuottamaan infektiokeskuksen (plakin).

Tämän prosessin tehokkuuden määrittämiseksi suori-15 tettiin kaksi tarkistusta: 1. Näyte seoksesta levitettiin E. colille, löydet- 5 tiin 3 x 10 plakkia ^ig:aa kohti käytetystä lambda DNA:sta. Tämä oli n. 100 kertaa enemmän kuin pilkotusta preparaatista löytyi, mikä osoittaa ligaasikäsittelyn hyvän tehokkuuden. 20 2. Näin muodostuneita plakkeja tutkittiin visuaali sesti. 70 % niistä oli kirkkaita samean asemesta, mikä osoittaa B. megaterium-DNA:n fragmentin läsnäolon, joka liittyy lambdageeniin Cl, ja siten inaktivoi sen aiheuttaen plakin sameuden.

25 Siten voitiin todeta, että preparaatti sisälsi umpi mähkäisen näytteen kaikista B. megateriumille mahdollisista Hind III-DNA-fragmenteista, jotka pystytään insertoimaan faagiin lambda NM 590.

B. Faagin lambda johdannaisen, jossa on B. megaterium 30 amylaasi, eristäminen

Loput kapseloimisseoksesta käytettiin E. colin ymp- päämiseen suureen määrään tärkkelystä sisältäviä levyjä, 3 joissa oli n. 10 elinvoimaista partikkelia levyä kohti. Infektoidun E. colin kasvun ja plakkien muodostumisen jäl-35 keen levyt seulottiin tärkkelystä hajottavien plakkien läsnäolon suhteen. Tämä tehtiin altistamalla levyt jodi- 75367 höyryille lyhyeksi ajaksi; odotettiin, että tällaisen faa-gin muodostama plakki olisi kirkkaan alueen ympäröimä tuloksena hajonneista soluista vapautuneen amylaasin diffuusiosta ja toiminnasta. Yksi tällainen plakki löydettiin ja faagi, 5 jonka se sisälsi, poimittiin välittömästi alaviljelyä varten (pitempi altistus jodihöyryille olisi tappanut faagin). Tämä plakki lisääntyi todella runsaasti (amylaasia tuottaen) ja se on tässä nimetty "lambda NM 509 Amy l":ksi. Faagi lambda NM 590 Amy 1 on tallennettu kokoelmaan 12.12.1980 NCIB 10 nro 11569:nä.

C. Amylaasigeenin uudelleenkloonaus plasmidiin pBR 322 Tämä suoritettiin ylituottavan kannan saamiseksi, tarkoitus oli myös valmistaa suuri määrä amylaasigeeniä sisältävää DNA:ta.

15 1 ^ag DNA: ta lambda NM 590 Amy 1: stä ja 0,3 ji g plas- midin pBR 322 DNA:ta pilkottiin, sekoitettiin ja käsiteltiin ligaasilla, kuten osassa A selostettiin. Tätä preparaattia käytettiin transformoimaan (käyttäen tavallisia menetelmiä) kanta HB 101. Valikointi oli ampisilliini (ap)-20 resistenssiä varten (ominaisuus, jonka solut saavat tämän plasmidin läsnäolosta). Tämä plasmidi antaa normaalisti myös resistenssin tetrasykliinille (Te). Vieraan DNA:n tuominen tähän plasmidiin pilkkoo kuitenkin tet-geenin, siten tetrasykliiniherkkien transformoitujen kloonien osuus 25 heijastuu kloonattua DNA:ta sisältävien plasmidien osuuteen. Tässä tapauksessa 16 % klooneista sisälsi uutta plas-midia, joka antoi amylaasiaktiivisuuden E. colille. ^Plas-midien yleisen kansainvälisen nimistön mukaisesti tässä kuvattavat plasmidit on nimetty (pCP):ksi ja tämän esimer-30 kin nimenomainen plasmidi nimetään (pCP l):ksi.J7 Tämä osoittaa, että geenin uudelleenkloonaus samalla entsyymillä (tässä tapauksessa Hind III) on hyvin tehokas menetelmä (16 % 10^:n asemesta).

Tämän plasmidin sisältävä mikro-organismi nimetään 35 E. coli Cl 7001 (pCP 1):ksi ja se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11570:nä.

Il 15 75367 D. Amplifikaatio ja entsyymi-tuotanto

Entsyymituotantoa plasmidia (pCP 1) sisältävissä soluissa parannettiin kahdella tavalla seuraavasti: 1. Kyllästetyt viljelmät 5 Viljelmä inkuboitiin yli yön 37°C:ssa pyörivällä täryttimellä 5 l:n väliseinillä varustetuissa erlenmeyer-pulloissa, jotka sisälsivät 1 litran viljelyväliainetta (LB; hiivauute-tryptoni).

2. Amplifikaatio kloramfenikolilla 10 Viljelmä inkuboitiin 37°C:ssa pyörivällä tärytti mellä 5 l:n väliseinillä varustetuissa erlenmeyer-pullois-sa, jotka sisälsivät 1 litran viljelyväliainetta (LB) , kunnes saavutettiin tiheys 0,8 (650 nm), jossa vaiheessa lisättiin 150 ^ig/ml kloramfenikolia. Tämä esti kromo-15 somaalisen DNA:n lisämonistumisen, mutta ei amylaasigee-niä sisältävän plasmidin (pCP 1) monistumista. Plasmidin amplifikaation jälkeen (3 000 kopioon asti) verrattuna kromosomaaliseen DNA:aan, kloramfenikoli poistettiin proteiinisynteesin uudelleenalkamisen sallimiseksi. Eri-20 tyisesti vahvistuksen jälkeen solut erotettiin väliaineesta linkoamalla, pestiin kloramfenikolin poistamiseksi ja viljeltiin uudelleen amylaasituotantoa varten.

E. Entsyymin talteenotto Tässä käytettiin "osmoottista shokki"-menetelmää 25 alfa-amylaasin talteenottamiseksi erittäin puhtaassa muodossa. Menetelmä, jonka ovat esittäneet H.C. Neu ja L.A. Heppel julkaisussa J. Biol. Chem. 240 (1965) 3685-3692 oli seuraava:

Soluja viljeltiin ensin yli yön, minkä jälkeen ne 30 suspendoitiin 25-%:iseen sakkaroosiliuokseen, jonka tilavuus oli puolet viljelmästä, ja ravisteltiin 10 minuuttia 24°C:ssa, mikä käsittely plasmolysoi solut. Sitten lisättiin EDTA lopullisesti 1 mM:ksi (soluseinien tekemiseksi läpäiseviksi), ja ainetta ravisteltiin toiset 10 minuut-35 tia 24°C:ssa, Suspensio, lingottiin ja solut suspendoi- 16 75367 tiin nopeasti uudelleen kylmään (n. 0°C) veteen ja ravisteltiin tässä lämpötilassa 10 minuuttia. Suspensio lin-gottiin uudelleen ja 96 % entsyymistä voitiin ottaa talteen päällä olevasta nesteestä (supernatantista).

5 Vertailua varten viljeltiin luovuttaja-mikro-orga- nismia (Bacillus megaterium) ja määritettiin entsymaatti-nen aktiivisuus. Entsyymin määrä millilitraa kohti vilje-lyväliainetta mitattiin DNS-menetelmällä, jolloin yksi entsymaattinen yksikkö määriteltiin määräksi entsyymiä, joka tuottaa yhden mg:n pelkistävää sokeria (käyttäen mal-toosia vertailuna) minuuttissa 10 minuutin inkubointiaika-na. Substraatti oli hyvin puhdas amyloosi.

Luovuttaja-mikro-organismi tuotti 66,0 entsymaattista yksikköä/1 viljelmästä. E. coli CL 7001 (pCP 1) kyl-15 lästetyt viljelyt tuottivat 116,6 yksikköä/1 viljelmää, kun taas viljelyn jälkeen (vahvistus) viiden tunnin aikana kloramfenikolin kanssa, mitä seurasi 15 tuntia ilman kloramfenikolia, E. coli CL 7001 (pCP 1) tuotti 84,5 yksikköä/litra. Tämä osoittaa, että kyllästetty vil-20 jelymenetelmä on riittävä antamaan hyvän lisäyksen entsyy-mituotantoon.

E. coli CL 7001 (pCP 1):n tuottamalla entsyymillä, joka on identifioitu erääksi alfa-amylaasiksi, on seuraa-vat tunnusmerkit. Se pilkkoo sekä amyloosin että amylo-25 pektiinin glukoosiksi, maltoosiksi ja maltotrioosiksi, pääasiallisesti maltoosiksi, ja se pilkkoo sekä syklodekstrii-nin että maltotrioosin glukoosiksi ja maltoosiksi. Se pilkkoo pullulaanin panoosiksi ja/tai iso-panoosiksi, mikä on samanlainen ominaisuus kuin entsyymillä, jota äskettäin 30 ovat kuvanneet Mizucho Shimizy, Mutsuo Kanno, Masaki Tamura ja Mikio Suekane "Purification and Some properties of a Novel Alpha-Amylase Produced by a Strain of Thermoactino-myces vulgaris", Agric. Biol. Chem. 42 (1978) 9, 1681-1688.

II

17 75367

Esimerkki II

Lämpöä kestävän alfa-amylaasigeenin kloonaus

Luovuttaja-mikro-organismi oli alkuperäinen Bacillus-kanta, joka oli eristetty kompostista ja identifioitu 5 Bacillus coagulansiksi. Se tuottaa lämpöä kestävää alfa-amylaasia ja sillä on seuraavat mikrobiologiset tunnusmerkit: (1) Morfologia: sauvoja (0,6 - 1 ^u x 2,5 - 5,0 ^u), liikkuvia gram-positiivisia ja -negatiivisia. Itiöt ovat 10 keskeisiä tai terminaalisia, eivät muuta muotoaan.

(2) Ravintoliemi: hyvä kasvu.

(3) Ravinto-agar-viillös: hyvä kasvu, lankamainen, leviävä, kermanvalkoinen.

(4) Orgaanisen hapon hyväksikäyttö 15 - sitraatti: positiivinen - malonaatti: negatiivinen.

(5) Gelatiini: nesteytyy (6) Asetyylimetyylikarbinolin (acetain) tuotanto: positiivinen.

20 (7) Ortonitrofenyyli-galaktosidi-hydrolyysi: posi tiivinen .

(8) Nitraattien pelkistys: positiivinen, saattaa syntyä kaasua.

(9) Katalaasireaktio: positiivinen.

25 (10) Indolin tuotanto: negatiivinen.

(11) Dekarboksylaasireaktio - lysiinillä : negatiivinen - ornitiinillä : negatiivinen - arginiinilla : negatiivinen.

30 (12) H2S:n muodostus: negatiivinen.

(13) Hiilihydraattien hyväksikäyttö: käyttää hyväksi arabinoosia, galaktoosia, glukoosia, levuloosia, mannoosia, maltoosia, sakkaroosia, tärkkelystä, trehaloosia ja tuottaa niistä happoa.

35 (14) Pullulaania käytetään hyväksi minimiväliaineel- la.

18 75367 (15) Polyolien hyväksikäyttö: käyttää hyväksi glyserolia, sorbitolia, mannitolia, inositolia. Ei käytä adoni-tolia, dulsitolia.

(16) Ureolyysi: negatiivinen.

5 (17) Lesitiinin hyväksikäyttö: negatiivinen.

(18) Optimilämpötila kasvulle: 50°C

Maksimilämpötila kasvulle: 55-60°C Minimilämpötila kasvulle: 15-25°C

(19) Hapen tarve: aerobinen ja anaerobinen.

10 Kanta on talletettu kokoelmaan NCIB 21.2.1980 NCIB

nro 11571:nä.

DNA uutettiin ja altistettiin Eco RI:n; Hind III:n;

Pst I:n; Sal I:n; Bam HI:n ja Bgl II:n vaikutukselle. Ainoastaan Bgl II pystyi kehittämään useita fragmentteja laajalta 15 molekyylipainoalueelta. Eco Rl:11a oli kuitenkin mahdollista kehittää fragmentteja, kun NaCl-väkevyys alennettiin 50 mM:ksi. Sen tähden päätettiin käyttää Eco Rl:a fragmenttien muodostamiseksi kloonausta varten Eco RI-lambda-vekto-riin (lambda NM 781).

20 A. B. coagulansin ja lambda NM 781:n DNA:iden pil- konta 1,25 yug lambda NM 781:n DNA:ta leikattiin yhdellä yksiköllä Eco Rl:a 25 ^,u:ssä seuraavaa puskuria: 10 mM Tris HC1 (pH 7,5), 10 mM 2-merkaptoetanoli, 10 mM MgSO^ ja 25 100 mM NaCl.

2 ^.ug B. coagulansin DNA: ta leikattiin samalla entsyymillä samanlaisessa puskurissa, paitsi että NaCl-väkevyys oli alennettu 50 mM:ksi. Inkubointiaika oli kaksi tuntia 37°C:ssa ja reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuut-30 tia 75°C:ssa. Pilkonnan täydellisyys tarkistettiin elektroforeesilla l-%:isissä agaroosigeeleissä.

Bi Rekombinanttifagien ligaatip ja talteenotto

Pilkotut DNA:t sekoitettiin ja liitettiin käyttäen kahta yksikköä T4 DNA -ligaasia seoksessa, joka sisälsi 35 60 mM Tris HC1 (pH 8), 10 mM MgSO^, 10 mM 2-merkaptoetanoLia ja 0,1 mM ATP. Reaktio saatettiin tapahtumaan 10-15 tunnin aikana 10°C:ssa. Ligaation jälkeen sekoitettiin 0,2 ^ug:n

II

19 75367 -2 DNA-eriä ATP:n kanssa antamaan loppuväkevyys 10 M. Nämä näytteet saatettiin in vitro-kapselointiin ja käytettiin 4 infektoimaan E. colin kanta HB 101. Saatiin n. 1,6 x 10 PFU (Plaque Forming Units, plakkeja muodostavia yksiköi-5 tä)/yug lambda DNA:ta. Näiden faagien joukosta jotkut osoittivat amylaasiaktiivisuutta (amylaasiaktiivisuuden havaitsemiseksi petrimaljoilla ja faagin talteenottoa ja puhdistusta varten ks. esimerkki I).

Havaittiin melko suuri amylaasia tuottavien faagien 10 osuus (yksi 400:ssa).

Valittiin yksi ja nimettiin se "lambda NM 781 alfa Amy l":ksi. Se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11572:na.

C. Amylaasigeenin uudelleenkloonaus lambda NM 781 15 alfa Amy l:sta plasmidiin pBR 322 1 yag lambda NM 781 alfa Amy 1 DNA:ta ja sama määrä DNA:ta plasmidista pBR 322 leikattiin Eco Rl:11a käyttäen tavanomaisia olosuhteita. Ligaatio ja transformointi suoritettiin, kuten esimerkissä I selostettiin. E. coli HB 101:n 20 pesäkkeet, jotka sisälsivät rekombinanttiplasmidin, havait tiin niiden amylaasiaktiivisuudesta. Valittiin yksi tällainen pesäke ja nimettiin se E. coli CL 7002 (pCP 2):ksi. Se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 nro 11573:na.

D. Geenituotteen amplifikaatio 25 Lambda NM 781 alfa Amy l:n amylaasia koodaavan gee nin ja amylaasin tuotannon vahvistaminen suoritettiin seuraavasti. Isäntäbakteereita (E. coli HB 101) kasvatettiin LB-väliaineessa 2 mM MgC^sn kanssa 37°C:ssa, kunnes saavutettiin optinen tiheys 0,3 (650 nm:ssä). Lambda NM 781 30 alfa Amy 1 lisättiin sitten, faagien lukumäärä laskettiin infektion moninkertaisuuden n. 1-2 saamiseksi, ts. yksi tai kaksi faagia bakteerisolua kohti. Viljelyä jatkettiin sitten voimakkaasti sekoittaen 37°C:ssa ja optista tiheyttä seurattiin, kunnes se alkoi alentua. Kun se oli alentu-35 nut alle 0,5, viljelmä korjattiin talteen ja pantiin jäihin. Viljelmä lingottiin ja sakan päällä oleva neste testattiin amylaasiaktiivisuuden suhteen.

------ .. .. I.

20 75367

Vahvistaminen ja entsyymituotanto E. coli Cl 7002 (pCP 2):11a suoritettiin käyttäen sekä kyllästettyä viljelymenetelmää että kloramfenikolivahvistusta, kuten esimerkissä I.

5 Amylaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen DNS-mene- telmää sekä faagilysaatista että E. colin, joka sisälsi re-kombinanttiplasmidin, viljelmistä. Taulukossa I esitetään arvot, jotka on saatu amylaasiaktiivisuudelle B. coagulansin alkuperäiskannassa, ja jakautuminen solun ulkopuolisen ja so-10 luun sidotun aktiivisuuden välillä. Aktiivisuudet, jotka on saatu rekombinanttifagilla (lambda NM 781 alfa Amy 1) ja kannalla, joka sisältää rekombinanttiplasmidin E. coli CL 7002 (pCP 2), on myös annettu. Entsyymituotannossa havaittiin n. kolminkertainen lisäys rekombinanttifagilla ja vie-15 lä paljon parempi lisäys havaittiin plasmidilla (n. 300-kertainen).

Faagin (lambda NM 781 alfa Amy 1) tapauksessa kaikki entsyymi vapautuu solun hajotuksessa ja on niin muodoin läsnä viljelyväliaineessa. Plasmidin tapauksessa suurin 20 osa entsyymistä on soluun sidottua (96 %).

E. Uudelleenkloonaus faagin lambda johdannaiseen, joka pystyy lysogenisoimaan E. colin

Vektori/isäntäsysteemin, joka käsittää lambda lyso-geenisen E. colin, valmistuksen valaisemiseksi tehtiin seu-25 raava koe.

Käytettiin bakteriofagia lambda T4 liq. CI 857 Warn Ean Sam (lambda NM 989). Se on kuvattu julkaisussa J. Mol. Biol.

Voi. 132 (1979), "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4. 1.. Characterization of the 30 Recombinants" G.G. Wilson ja Noreen E. Murray (sivut 471-491) ja "II.. Amplification and Separation of the Gene Product" Noreen E. Murray, S.A. Bruce ja K. Murray (sivut 493-505).

Tämä faagi sisältää bakteriofaagin T4 DNA-ligaasi-35 qeenin ja pystyy lysogenisoimaan E. colin. Sillä on lisäksi lämpöherkkä immuniteettigeeni ja kaksi amber-mutaatiota E-geenissä ja S-geenissä vastaavasti. S-geenin mutaatio 21 75367 tekee bakteerit sellaisiksi, että ne eivät enää hajoa tämän faagin infektiolla. Subkloonauksen tarkoituksena oli korvata DNA-ligaasigeeni amylaasiaa koodaavalla geenillä.

Faagin ja plasmidin (pCP 2) DNA leikattiin Eco Rl:11a 5 ja fragmentit liitettiin. Ligaatiossa saatu faagi-DNA pakattiin sitten in vitro ja plakit tehtiin näkyviksi levittämällä kannalle E. coli Sup E Sup F. Plakit, joilla oli amylaa-siaktiivisuus, poimittiin ja faagit puhdistettiin käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä.

Tätä faagia käytettiin sitten lysogenoimaan kanta E. coli C 600 (CL 1205) käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Lysogeenipesäkkeet tehtiin näkyviksi tärkkelystä sisältävällä väliaineella käyttäen jodivärjäystä. Tämä kanta on nimetty tässä E. coli CL 7003 (lambda alfa Amy 1):ksi ja se on talletettu kokoelmaan NCIB 6.3.1980 NCIB nro 11586:na.

Geenituotteen airplifikaatio suoritettiin seuraaval-la tavalla. Lysogeenia viljeltiin 32°C:ssa LB-väliaineessa, kunnes saavutettiin tiheys 0,8 650 nm:ssä, lingottiin sit-20 ten ja solut suspendoitiin tuoreeseen LB-väliaineeseen, jota oli esilämmitetty 45°C:ssa. Viljelyä inkuboitiin sitten 45°C:n kylvyssä 15 minuuttia hajotussyklin indusoimiseksi (koska immuniteettigeenituote on lämpöherkkä).

Inkubointia jatkettiin sitten voimakkaasti ravistaen 25 37°C:ssa kolme tuntia. Amylaasiaktiivisuus mitattiin sitten päällä olevassa nesteessä ja soluissa. Arvot on esitetty taulukossa I.

Tämä erikoiskoe valaisee "sub-sub-kloonaus"-menetel-mää plasmidista uuteen lambda-faagiin. On helposti ymmär-30 rettävissä, että DNA lambda NM 781 alfa Amy l:stä olisi aivan yhtä helposti voitu sub-kloonata faagiin lambda T4 lig. CI 857 Warn Earn Sam. Vaihtoehtoisesti luovuttaja-DNA olisi voitu kloonata suoraan viimeksi mainittuun faagiin, jolloin mikä tahansa määrä muunnoksia esimerkkiprosessista on 35 toteuttavissa.

22 7 5 3 6 7 F. Lambda NM 781 alfa Amy l:n E. coli CL 7002 (pCP 2);n ja E. coli CL 7003 (lambda alfa Amy 1):n tuottaman amylaasin talteenotto ja luonnehtiminen

Kuten esimerkissä I käytettiin osmoottista shokkia 5 entsyymin talteenottoon. Lisäksi, koska tämän esimerkin entsyymi on lämpöä kestävä, voitiin sitä puhdistaa edelleen lisäämällä vesipitoiseen liuokseen 10 mM Ca++ ja lämmittämällä liuos 80°C:seen ja pitämällä se siinä 10minuuttia; tämä käsittely saostaa kaikki E. coli -proteiinit ja sal-10 lii alfa-amylaasin talteenoton äärimmäisen puhtaassa muodossa, jolloin yleensä mitään orgaanista jätettä tai muita entsyymejä ei ole läsnä.

Alfa-amylaasin spesifisyys määritettiin: se on aktiivinen amyloosin ja tärkkelyksen suhteen, hydrolyysi-15 tuotteet ovat glukoosi, maltoosi ja maltötrioosi sekä pieniä määriä suurempimolekyylipainoisia komponentteja. Tämä entsyymi ei ole aktiivinen syklodekstriinille. Myös entsyymin lämmönkestävyys tutkittiin ja sen osoitettiin olevan hyvin suuri. Optimilämpötila aktiivisuudelle 0,5-%:isella 20 amyloosilla on välillä 80-90°C. 8 %:lla liukoista tärkkelystä optimi on n. 100°C:n paikkeilla.

On mahdollista, että mikro-organismi, jota tässä nimitetään Bacillus coagulansiksi, on todellisuudessa Bacillus licheniformis.

Il 23 —i 75367 - ε :rO I \ WC rfl 0 W to H >

Q) -P 4-J M

WO 4-1 rO

H 3 W C

:rO -P >i a> :rO

M H :r0 X X X H g

CL) £ tn X (N vo H rO :rO

CL, >i H ro - - - > 4>

3 >1H *J< H O VO H

Λ! W - rfCM<N>C

h +) C h n h ro ,χ O) (O β o Φ 4->

WC -HO

C W -r~i

H O

tn :tO O

C W 4-1 C

tÖ β O Γ— ID H · H

H (1) ro VO CO fö f0 H · 3(00) σ N* H £ β -P tÖ &i w -μ csj h x; tn ro tn x; n* -3- tn n h β 4-> <u tn

O H >H r-H r-H ·· 4J 4J -H

O O) en to P

C E to tn r—i

• O X X UPO

mo .HJ x XrH-p-ptn H- P o oj ro tn o M - .X Ή II O ro LO m J3 ·π fl ftJ-HO O' (N r-H (0 β (0 n O M -P en 4-i tn x: M 4-· 4-> tn r-H β 3 M -h β ro ro ro tn P H (0 -H 4-1 tn H \ β m fXj tn 4J rö P X -M £ M O P £ tö :tö .Ω h o o O £ h

Eh tn £ r-H VO 'ΓΉ »-H t-H

tn o P i i i σ> i >i-3

H ,Χ H - £ >1 .-H

:0 <P O (N -H ttJ 4) O

.X M tn h tn 4J tn •H -X ro (1) tn H :r0 x 4_i ro .X H I M tn >ι Π3 >i (1) :rö H :rd £

β r-H !(0 · »X E

*“ -H o <U tN £ <*> 3 tn M 4-i - h h tn 3 >H :r0 tn <N ^ O vo ro £ m tl) 3 (D H ¢) <i ro r~~ ro >1- β tn £ Ή β r-H (N tN >, o :® 0) H -H :ro tn :rd ^3 > tn :rö r0 4-1 β £ 3 rH d) Oi > β 0) H 3 •H β Q) :r0 0) tn

-P (0 rH :0 4-> 4-1 H

X ·η >ι β 4) O) > (0 >i | :r0 >1 β h

•H (0 £ (0 H :rö :nj o> -H

tn tn << ro h ΗΓχΕ4-> njtn ,χ >ι— h η λ: t0 tö rö -H H 0) r0 -X to

Ηβ HU4 4-1 4-> tn -X H

>ιβ H -rH >i >i-HinOin E (0 (OrvIrH 04 H ro £ Cl · X! 3 < X O o, O0)O<:rtJUtn3

H O £ O -n O :rflO H

tn 03 n m o h n m £ o to >, β o- i -H uh vr> 4-> £ tö Jn J > J h :0 tn 3 h s u u u u m x h h 3 2 - ,Χ 4-) 4-> to σ -H —» -H — -H ro -H 44 44 3 fÖtÖHCNflJHCNHTO tn 3 O 4-1 O Ό O HO O ,0 .X 3 O tn U -Q U CU H O Pj U £ >i β £ 3 £ U O U 3 H tn T3

• ro · CL, H · CL, · —I H E O <D

CQ ·—I W " 4J CU CP "— X X

X

24 75367

Esimerkki IIA

Plasmidin pCP 2 subkloonaus plasmidiksi pc 194 ja uuden plasmidin ekspressoiminen Bacillus subtiliksessa.

Tämä esimerkki kuvaa menetelmää, jolla keksinnön mu-5 kaisesti valmistettu rekombinantti-DNA voidaan ekspressoida isäntäbakteerissa, muussa kuin E. colissa, nimittäin eräässä Bacillus subtilis-kannassa*

Plasmidi pCP 2, esimerkistä II, sisältää 3,31 Kb:n fragmentit B. coagulans-luovuttajasta; plasmidia luonnehdi-10 taan lisäksi sillä, että se antaa ampisilliini- ja tetrasyk-liiniresistenssin ja sisältää kaksi pilkkomiskohtaa sekä Eco Rl:lie että Hind III:lie. Plasmidi pCP 2 pilkottiin neljäksi fragmentiksi sekä Eco Rl:11a että Hind III:11a, käsiteltiin ligaasilla ja käytettiin transformoimaan HB 101, 15 kuten edellisissä esimerkeissä.

Muodostettiin uusia plasmideja, jotka tässä nimettiin pCP 2,3:ksi ja joissa oli 2,64 Kb:n fragmentit B. coagulans-DNA:ta, jolloin tämä fragmentti sisälsi alfa-amylaasia koo-daavan geenin. pCP 2,3:11a on yksi ainoa kohta sekä Eco Rl 20 että Hind III varten ja antaa sekä ampisilliini- että tetra-syki iiniresistenssin.

Seuraavaa vaihetta varten valittiin plasmidi pC 194, jonka tiedetään olevan plasmidi, joka pystyy monistumaan Bacillus subtiliksessa. pC 194 antaa kloramfenikoliresis-25 tenssin ja sillä on yksi ainoa Hind III-kohta.

Sekä pCP 2,3 että pC 194 avattiin Hind III:11a, sekoitettiin ja liitettiin muodostamaan uusi plasmidi, joka nimettiin pCH l:ksi, ja joka sisälsi alfa-amylaasia koodaa-van geenin ja jolla oli sekä kloramfenikoliresistenssi 30 että ampilliiniresistenssi, joskin kloramfenikoliresis- tenssin taso oli alhainen E. colissa. Kuten edellä preparaattia käytettiin transformoimaan E. coli HB 101.

B. subtiliksen mutanttikantaa, joka on nimetty QB 1133:ksi (saatu Cr Michael Steinmetz'ilta, Institut de 35 Recherche en Biologia Moleculaire, Universite Paris VII,

Tour 43, 2 Place Jussieu, 75221 Paris Cedex 05), ja jolla ei ole alfa-amylaasiaktiivisuutta, käsiteltiin sitten il 25 75367 S. Chamg'in ja S. Cohen’in, Molec. Gen. Genet. 168 (1979)

Hl - 115 menetelmän mukaisesti protoplastien muodostamiseksi. Protoplastit transformoitiin sitten pCH l:llä käyttäen Chang'in ja Cohen'in (Ibid) polyetyleeniglykolivälit-5 teistä transformointimenetelmää.

Protoplasteja inkuboitiin sitten runsassisältöises-sä väliaineessa 1,5 tuntia bakteereissa olevan plasmidin sallimiseksi ekspressoida resistenssi kloramfenikolille.

Protoplastit levitettiin sitten regeneroimisväliai-10 neelle, johon oli lisätty kloramfenikolia määrässä 20 ^ug/ml. Kahden päivän inkuboinnin jälkeen 37uC:ssa oli ilmestynyt transformoitujen solujen pesäkkeitä; pesäkkeet, joilla oli alfa-amylaasiaktiivisuus, havaittiin jodihöyry-värjäysmenetelmällä. Yksi klooni, joka nimettiin B. subtilis 15 CL 8001 (pCH l):ksi, talletettiin 13.1.1931 NCIB nro 11629:nä. Alkuperäinen kanta QB 1133 talletettiin myös 13.1.1981 NCIB nro 11628:na.

B, subtilis CL 8001 (pCH 1) on pysyvä ainoastaan kloramfenikolin läsnäollessa. Sitä voidaan käyttää tuot-20 tamaan alfa-amylaasia viljelemällä väliaineessa, joka sisältää kloramfenikolia (20/Ug/ml). Alfa-amylaasi voidaan helposti ottaa talteen viljelynesteestä.

Yli yön kestävän viljelyn jälkeen kloramfenikolin läsnäollessa määritettiin tuotetun alfa-amylaasin määrä 25 seuraavasti: Päällä oleva neste Solut Yhteensä (U/L) (U/L) (U/L) 136 14 150

Esimerkki III

30 Beta-amylaasin kloonaus

Luovuttaja-mikro-organismi oli Bacillus cereus kanta, jota on kuvattu Agency of Industrial Science & Technology'n (Japani) brittiläisessä patentissa nro 1 466 009. Se on talletettu kokoelmaan Fermentation 35 Research Institute of Chiba-shi, Japani 20.12.1973 FERM -P nro 2391:nä ja talletettu myös kokoelmaan American Type Culture Collection ATCC nro 31102:nä 26.12.1974. Sen 26 7 5 3 6 7 tiedetään tuottavan sekä beta-amylaasia että alfa-1,6-glu-kosidaasia.

A. Beta-amylaasigeenin kloonaus lambda NM 781:ssä

Menetelmät, joita käytettiin pilkontaan, liittämiseen 5 ja rekombinanttifaagien talteenottoon, olivat samat kuin esimerkissä II. B. cereuksen DNA (2 ^ug) pilkottiin normaaliolosuhteissa Eco Rl -restriktioentsyymillä. Faagivektori-DNA (1,25 yug, lambda NM 781) leikattiin myös Eco Rl:11a. Ligaatio ja pakkaaminen suoritettiin, kuten edellä selos-10 tettiin.

Löydettiin useita rekombinanttifageja, joilla oli amylaasiaktiivisuus (n. 1 500:sta). Yksi näistä faageista (nimetty "lambda NM 781 beta Amy l:ksi) valittiin; se on talletettu kokoelmaan NCIB 12.2.1980 NCIB nro 11574:nä.

15 B. Beta-amylaasigeenin lambda NM 781 beta Amy l:stä uudelleenkloonaaminen plasmidiin pBR 322

Entsyymituotannon lisäämiseksi tätä ensimmäistä beta-amylaasikloonia käytettiin beta-amylaasia koodaavan DNA:n lähteenä sen subkloonaamiseksi monikopioplasmidiin 20 pBR 322.

2 yUg lambda NM 781 beta Amy 1 DNA: ta ja 1 ^,ug pBR 322 leikattiin Eco Rl:11a, sekoitettiin ja käsiteltiin T4-ligaasilla. Ligaatio ja transformointi toteutettiin, kuten edellä selostettiin.

25 Yhdellä pesäkkeellä 200:sta ampisilliiniresisten- tistä pesäkkeestä oli tärkkelystä hajottava aktiivisuus.

Yksi eristettiin ja nimettiin E. coli CL 7004 (pCP 3):ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11602:na.

C. Beta-amylaasigeenin uudelleenkloonaus faagin 30 lambda-johdannaiseen, joka pystyy lysogenisoimaan E. colin Käytetty vektori oli lämpöherkkä lambda T4 lig faagi CI 857 Warn Earn Sam (lambda NM 989) , jota kuvattiin esimerkissä II. N. 1 yug plasmidin pCP 3 DNA:ta ja 0,5 ^ug faagi-DNA:ta pilkottiin, sitten fragmentit liitettiin yhteen ja syn-35 tyneet DNA-fragmentit pakattiin in vitro. Faagipartikkelit, joilla oli amylaasiaktiivisuus, eristettiin ja käytettiin antamaan lysogeenisiä pesäkkeitä samalla menetelmällä kuin edellä.

Il 27 75 3 67 E. coli C 600-kanta, joka on lysogeeninen tälle rekombi-nanttifaagille, eristettiin ja nimitettiin E. coli CL 7005:ksi (lambda beta Amy 1); tämä talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11603:na.

5 D. Amylaasi-geenituotteen amplifikaatio

Kaikissa klooneissa ja subklooneissa amylaasiaktii-visuus havaittiin DNS-menetelmällä. Beta-amylaasiaktiivi-suus varmistettiin TLC-kromatogrammeilla maltoosin yhden 10 ainoan täplän läsnäololla amyloosi-digestoinnin jälkeen.

Beta-amylaasigeenin amplifikaatio eri klooneissa suoritettiin, kuten edellä selostettiin. Taulukossa II on esitetty entsymaattinen aktiivisuus alkuperäisessä kannas-15 sa verrattuna tähän aktiivisuuteen kolmessa kloonissa; tämä aktiivisuus saatiin joko faagilysaatista tai esimerkissä II kuvatulla osmoottisella shokkimenetelmällä.

28 75367 1 « * i 3 ro tn qj MM’ '0

•H -U O -P

> -H M tn H

-HM ' (1) H

•H \ o o vd m h c -P :i0 <N co t" ^ tj :nj ;o ^ g to to tn Ό -* tn z tn tn ω ή tn tn -h •h -h G ·- ro to tn to <#> > ρ ^ ^ a> q> 2 o >t M M g 3 ·£ ö o -h 3 0 qj *. m tn « tn -h :ro qj

•p M G M

> _ 00 00 3 O M M

•H 3 o>p ·. ·. 4J 4J ;rg •H -p cm tn o a :t0 >1 -3 -P ^ιη-πίχ,αε rO p rfj flj Π3 „C A-> 2 •H -H M >, O -P 03 W V) 4J jj

2 ‘P -P ¢) - li H

fö CD*—Id) -m dj :rd .p n3

-H 3 3 \ +J ^ 3 .Q E M

3 tn .(0 -H » (—1 M E tä c i—l M :θ P c- *3· O ··· QJ Ό <0 O > Λ! :r0 M (N B) # U m n I CO -H M :ttJ tn 3 ε

H 3 -H -H E trO ·—I -H 3 rO

h +j to —+j tn μ Ό tn h

Q) tn M ir! Λί -H M * ,3 M

O X> M >— (0 >H w M Q) >, > M

·* _, ·Ρ E -P 0) M M

^30J (N CM >i 3 G M O

3 +> G <#> - ^ 3 M -P U

'p -p o f» ^ tn ro ro λ; 3001 r- ^ -P > m ro · <0 Ό M M M O -H rH Cl] E-· -h x r-π 3 to tn -h :ro «*

« -p 2 3 H >i -G > ro C

P 3 tn -P h ^ >, tn oi

G -P Oi -h -h m tn -P

3 C o > M >i C (D ·' 3 3 ϋ M \ o o m tn μιΟτ-ιΟλ!

rH 3 rl H lii (Ί CO in rH Q)>lrHO

O -H 3 -P :0 *5r +J -h r- -

tn^ ΛίΛ! -P M > m G

G G tO ^ rH -rl rH t QJ

•tl O 3 -h tn >i rO I 0) •m λ: m c tn :to e λ;

tuotua ^(OtO rH

CP to G >1 U) tn fO :i0 QJ M IB - tn ·η c to tn ·· tn

•H Tl 3 tj (O ·· G

m 3 o tn u <u oto . tnotnotn 3 tn m -h n ·· tn x di tn — >0^3 o a) n h m g o A -p r^tn O r-v m m n- f o 'H x. H >1 n Tf-Ρ-ΗΓΟ -Γ-Ι 33 ME —' λ; -P 3

rftu rO -P G (0 .G

G P U — QJ :0 tn 30) U rO CL, M 3 -P >, tn <0 MO U -P ^ 4JM .. tn o HO) >1 +j P M u tn

to CQ < Λ T tn fi O O M O M

o o < Ό 3 >, cn 3 —* m o o m tn m f—i

cm oo to tn -P O

r- 4J >1 >i >i tn r3 ,3 QJ G M M i—l

tnSUUX) 3 0) QJ QJ rO

3 2 3 t-ι τι -r-ι τι

0) -H -H 3 Mi—I M i—I

P <0 M M T3 O M M M :r0 0) Ό O O -Q CO>>>tn υ .ο υ o e E ro ^

• (0 · · M i—I CM M

CQ M W W —· — — — —

II

75367 29

Esimerkki IV

Pullulanaasigeenin kloonaus

Luovuttaja-mikro-organismi oli Klebsiella pneumoniae, jonka on kuvattu H. Bender julkaisussa Biochem. Z. 334 (1961) 5 79-95 ja joka on talletettu kokoelmaan ATCC 6.6.1983 nro 15050:na. Se on mainittu myös A.E. Staley'n brittiläisessä patentissa nro 1 273 789.

2,25 ug luovuttaja-DNA:ta uutettiin ja fragmentoitiin Eco RI:lla käyttäen standardiolosuhteita, ja 1,25 ug lambda 10 NM 781 DNA:ta leikattiin samalla entsyymillä samoissa olosuhteissa. Inkubointi kesti kolme tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen reaktio lopetettiin kuumentamalla 10 minuuttia 75°C:ssa. Pilkonnan täydellisyys määritettiin, kuten esimerkissä lii

Pilkotut DNA:t liitettiin, otettiin talteen ja käy-15 tettiin E. colin kannan HB 101 infektoimiseen, kaikki, kuten esimerkissä II. Saatiin n. 2 x 10^ PFU/yug lambda-DNA:ta.

Kahden päivän inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa levyillä, jotka sisälsivät BBL-tryptikaasia + 0,25 % pullulaania, jotkut plakit osoittivat pullulanaasiaktiivisuutta, ts.

20 niitä ympäröivät sameat renkaat, jotka ovat luonteenomaisia "ylikasvaneille” bakteereille. Pullulanaasia tuottavien faagien osuus oli suuruusluokkaa 1/2500.

Yksi valittiin ja se nimettiin tässä lambda NM 781 Pui l:ksi; se talletettiin kokoelmaan NCIB 9.4.1980 NCIB 25 nro 11592:na.

Pullulanaasiaktiivisuus havaittiin DNS-menetelmällä ja tuote pullulaanin hydrolyysistä faagilysaateilla tunnistettiin maltotrioosiksi ohutlevykromatografiällä.

Lambda NM 781 Pul 1 sisältää suuren DNA-fragmentin 30 (Klebsiella pneumoniaesta) pituudeltaan 13,5 Kb; tämä fragmentti pilkottiin uudelleen Eco Rl:11a, mikä johti kahteen fragmenttiin, pituudeltaan 6,1 Kb ja vastaavasti 7,4 Kb.

6,1 Kb:n subfragmentti kloonattiin sitten uudelleen lambda NM 781:ssä ja sen osoitettiin sisältävän pullulanaasigeenin. 35 Tätä uutta rekombinanttifaagia nimitetään lambda 781 Pui 2:ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11604:nä.

30 7 5 3 6 7 6,1 Kb:n alaryhmää subkloonattiin edelleen moniko-

pioplasmidissa pACYC 184 (pBR 322:n johdannainen, jossa on R R

jälkimmäisen Te -geeni ja Cm -geeni, jossa on yksi Eco RI-kohta). Tätä uutta kloonia nimitetään E. coli CL 7006 5 (pCP 4):ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11605:nä.

Kolmas subklooni rakennettiin kytkemällä 6,1 Kb:n fragmentti faagiin lambda NM 898, kuten esimerkissä II kuvattiin. Tätä kloonia nimitetään E. coli CL 7007 (lambda Pui 2):ksi; se talletettiin 15.9.1980 NCIB nro 11606:na.

10 Pullulanaasin ekspressio- ja amplifikaatiotaso tut kittiin kaikissa klooneissa. Tulokset on koottu taulukkoon III.

Kuten tuloksista voidaan nähdä, indusoi maltoosi pullulanaasiaktiivisuutta, kun 0,04 % maltoosia on lisätty 15 LB-väliaineeseen. Lisäksi membraanijakeen Triton X 100-kä- sittely oli tarpeen pullulanaasin talteenottamiseksi, mikä osoittaa, että aktiivisuus sijaitsee membraaneissa.

Il 75367 31 :α3 cn - cn DC φ 0 0 φ C 4-1 Η <0 · c C0 Η C :π3 3 Φ C >ι -Ρ C :3

Ifl H O CO CO

Η <D 3 >ι Π φ CO

> ·Γ0 4J :3 Ί1 m (Ο Μ Ν4 ro (Ο -Η •Η ι—I ·Η C0 Ή ^4 ι—I CN f—I rH .H CO>i Ή Ή S -Η ^ ν ν » (ΟΜ 4-1 > >ι Ή ι-ΙΟΟΗγΗΟ τι· m > φ

X >1 φ E

<! Φ CO rH -H

Ή 4-1 O CO

• Ή G φ

3 3 W :cO

CO c H φ CO -P f—I i—t •H -H :3 :n3 r—| Φ r-1 cn co TT :rö ··

C 3 UI 00 O CTi CO H4 LO Dl H

ΟΦΦ - 0 Ή φ r~ ro cn cn in ro ττ o 3 >,

Ή Ή 4-· CN rH CO CO rH TT 4JS

-X Φ -C rH r-4 -p 1¾ 1 Ό >-< 3 -D 4J m

•H >1 -H CM

Ή 4J 6 ι—I

H O ‘-3 -H (0

H Φ (3 c CO

H -H Cd Tt 3 Π3 • :0 3 m cd oo oo Γ' Tr m 3 Ό O W -X P ^ - - en n X ,X .g ro cn σι co co ro h· ro -h ε ΛΪΟ-Η6 cn cn f—ι σ> >3

C -H CO Φ rH -Γ-l rH

H CO Λ! 2 -H

C CO >1 4J -H

3 Φ I λ; rH

E-i >4 -H rö rfl O

Di 4> > 3 3 O

CO 4-1 Φ CO 4-1 4J

.X 3 Ή φ CN CO CD -P 4-) 3·

ΦΦ04-· - - - - -H -H (O H

rH CO H1 O CN ΟΊ 00 3 3 Γ" CO

C 3 :3 Φ CN > > >· c •H > rH 3 33 ΟΦ

CO "H rH .3 x! O 4J

3 > :3 r- 3 3 X :3 -H -H ro A! C Φ di « W Λ 3 1 |

H -H C

3 CO -H φ rH o CO 3 Φ

rH O O CO -M

3 4J o CO Ή

Di Ή 4J + ·· :3 I 3 rH U -n

3 G 3 — -—- f3 O

Ή g H4 H1 T5 in 3 Ή 3 -H -H JD rr φ

Φ-D + CO CO di di g ACO

h co 00UU3 T .x CO -H 3 o O Di Di Ή 3 -Q 3 -H 4J -P ^ _μ Φ E CrHiH CO 3 3 0 r-CH 0 3 3covo Γ' o O cd ·π XS *h E E E o o oo>i(03 3 o o o -p ·· x;

Φ + + e— r^iH-HU

C 3 Ή O 3

QiiHiHCNCNi3i3 »3 ε >4 CN CO

O U U ro CO

3 Ή rH rH -H -H + 4J -H

iH 3 3 3 3 -H -H CO -H >-,>, 3

rH di di di di ^ Ή O1—1 -— 1—I —1 iH

Φ ΟΟΟΟΙΝΦΦΟ

•H Ή iH rH rH U Ö-P CJ T^l ·ι I CO

C0 CD 03 00 00 ιΗ >Η H Ή D Is Is h Γ4· ·3 ·3 ·Η -H 3 Φ ωωεΗ&ι>>·ι-> ή s s S S x x

ΪΧ Z Z Z Z X X X XX

Claims (18)

32 Patenttivaatimukset 7 5 3 6 7

1. Menetelmä geneettisesti manipuloidun mikro-organismin valmistamiseksi, jolloin isäntämikro-organismiin li-5 sätään yhdistelmä -DNA, joka sisältää amylaasia koodaavan geenin ja on valmistettu in vitro-menetelmällä pilkkomalla luovuttajabakteerista peräisin oleva DNA ja yhdistämällä syntyneet DNA-fragmentit vektoriin, joka on samalla tavalla pilkottu, tunnettu siitä, että vektori on plas- 10 midi tai lamdba-faagin johdannaisen DNA ja geneettisesti manipuloitu mikro-organismi on bakteeri, joka sopivissa viljelyolosuhteissa pystyy tuottamaan amylaasia oleellisesti puhtaammassa muodossa tai oleellisesti suuremman määrän kuin alkuperäinen luovuttajamikro-organismi tuottaa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että luovuttajabakteeri on Bacillus-suvun kanta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luovuttajabakteeri on Bacillus mega- 20 terium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus tai Klebsiella pneumoniae.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luovuttajabakteeri on Bacillus megaterium NCIB n:o 11568, Bacillus coagulans NCIB n:o 25 11571, Bacillus cereus ATCC n:o 31102 tai Klebsiella pneu moniae ATCC n:o 15050.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on plasmidi pBR 322, pACYC 184 tai pC 194.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on faagi lambda NM 590, lambda NM 781 tai lambda NM 989.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA käsittää 35 faagit lambda NM 590 Amy 1, NCIB n:o 11569; lambda NM 781 alfa Amy 1, NCIB n:o 11572; lambda NM 781 beta Amy 1, NCIB 33 7 5 3 6 7 n:o 11574; lambda NM 781 Pul 1, NCIB n:o 11593 ja lambda NM 781 Pul 2, NCIB n:o 11604.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettisesti manipuloitu mikro- 5 organismi on E. coli tai B. subtilis.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettisesti manipuloitu mikro-organismi on E. coli CL 7001 (pCP 1), NCIB n:o 11570; E. coli CL 7002 (pCP 2), NCIB n:o 11573; E. coli CL 7003 (lambda alfa

10. Menetelmä amylaasin valmistamiseksi, tunnet- t u siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukaisesti valmistettua geneettisesti manipuloitua mikro-organismia viljellään amylaasia tuottavissa olosuhteissa.

10 Amy 1), NCIB n:o 11586; E. coli CL 7004 (pCP 3), NCIB n:o 11602; E. coli CL 7005 (lambda beta Amy 1), NCIB n:o 11603; E. coli CL 7006 (pCP 4), NCIB n:o 11605, E. coli CL 7007 (lambda Pui 2), NCIB n:o 11606 tai B. subtilis CL 8001 (pCH 1), NCIB n:o 11629.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, t u n - 20. e t t u siitä, että yhdistelmä-DNA on läsnä hajottavan faagin muodossa ja viljely suoritetaan infektoidussa bakteeri-isännässä .

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA on läsnä faagin muodos- 25 sa lysogeenisessä E. colissa ja viljely suoritetaan niin, että faagin monistuminen indusoidaan lämpökäsittelyllä.

13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA on läsnä geneettisesti manipuloidussa mikro-organismissa plasmidin muodossa ja vil- 30 jely suoritetaan stationäärifaasiin saakka.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmidi on pBR 322:n tai pACYC 184:n johdannainen ja monistumista tehostetaan viljelemällä mikro-organismia kloramfenikolin läsnäollessa ennen sen viljelyä 35 stationäärifaasiin saakka. 34 75367

15. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näin valmistettu amylaasi on alfa-amy-laasi ja mikro-organismin yhdistelmä-DNA sisältää amylaasia koodaavan geenin, joka on saatu Bacillus megateriumista.

16. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että näin valmistettu amylaasi on lämpöä kestävä alfa-amylaasi ja mikro-organismin yhdistelmä-DNA sisältää amylaasia koodaavan geenin, joka on saatu Bacillus coagulansista.

17. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että näin valmistettu amylaasi on beta-amylaasi ja mikro-organismin yhdistelmä-DNA sisältää amylaasia koodaavan geenin, joka on saatu Bacillus cereuksesta.

18. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, t u n -15 n e t t u siitä, että näin valmistettu amylaasi on pullula-naasi ja mikro-organismin yhdistelmä-DNA sisältää amylaasia koodaavan geenin, joka on saatu Klebsiella pneumoniaesta. Il 35 Patentkrav 7 5 3 6 7