FI91885B - -amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi - Google Patents
-amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI91885B FI91885B FI852084A FI852084A FI91885B FI 91885 B FI91885 B FI 91885B FI 852084 A FI852084 A FI 852084A FI 852084 A FI852084 A FI 852084A FI 91885 B FI91885 B FI 91885B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- microorganism
- amylase
- bacillus subtilis
- kanamycin
- dna
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 34
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 title description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims abstract description 34
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims abstract description 34
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 16
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 3
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 11
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 11
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
91885 α-araylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi
Keksinnön kohteena on yhdistelmä-DNA, joka sisältää 5 a-amylaasia koodaavan geenin, sekä menetelmiä mikro-organismien valmistamiseksi, jotka sisältävät tätä yhdistelmä-DNA: ta.
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 81300578.2, on selostettu ja vaadittu uutta yhdistelmä-DNA:ta, joka 10 sisältää amylaasia koodaavan geenin ja joka on valmistettu in vitro-prosessilla, jossa bakteerisesta luovuttaja-mik-ro-organismista peräisin oleva DNA pilkotaan ja syntyneet DNA-osaset yhdistetään vektorin kanssa, joka on samalla tavalla pilkottu, jolloin vektori on plasmidi tai lambda-15 fagin johdannaisen DNA. Tämä yhdistelmä-DNA insertoidaan bakteeri-isäntäorganismiin ja jälkimmäistä viljellään amy-laasin tuottamiseksi. Mainitussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa on selostettu joukko bakteeri-luovuttaja-ja bakteeri-isäntä-organismeja samoin kuin lukuisia sopi-20 via plasmideja ja lambda-fagin johdannaisia.
Plasmidien käyttö geenin tuottamiseksi johonkin mikro-organismiin on laajalti käytetty tekniikka. Viimeaikainen kirjallisuus sisältää selostuksia joukosta plasmideja, joita on ehdotettu tähän tarkoitukseen. Erityises-25 ti kaksi kirjoitusta "Gene"ssä, jota julkaisee Elsevier Biomedical Press, 15 (1981) 43-58, tekijöinä Ilkka Palva et ai ja 19 (1982) 81-87 tekijänä Ilkka Palva yksinään, selostetaan alfa-amylaasia koodaavan geenin eristämistä Bacillus amyloliquefaciens'ista suoralla shotgun-kloonauk-30 sella käyttäen Bacillus subtilis'ta isäntänä. Bacillus amyloliquefaciens'in genomia uutettiin osittain restrik-tioendonukleaasilla Mbo I ja 2-5 kb:n osasia eristettiin ja liitettiin plasmidiin pUB 110. Kelvollisia amylaasi-negatiivisia Bacillus subtilis-soluja transformoitiin 35 hybridiplasmideilla ja kanamysiini-resistenttejä trans- formantteja seulottiin alfa-amylaasin tuottamista varten.
2 91 885
Eräs ongelmista käytettäessä geneettisesti rakennettua mikro-organismia teollisessa mittakaavassa on yhdistelmä-DNA: n, joka on tuotu tällä geneettisellä käsittelymenetelmällä, pysyvyys. Jos pysyvyys puuttuu, yhdistel-5 mä-DNA pyrkii häviämään tai siinä tapahtuu sarja uudelleenjärjestelyjä, kun syntyy organismin peräkkäisiä sukupolvia kunnes lopulta jälkeläis-mikro-organismit eivät enää ekspressoi tai ekspressoivat vain heikosti amylaasia koodaavaa geeniä.
10 Nyt on kehitetty yhdistelmä-DNA, joka muun muassa sisältää tiettyjä amylaasia koodaavia geenejä, joita on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 81300578.2 mutta joka on johdettu plasmidista, jota ei nimenomaisesti ole selostettu viimemainitussa asiakirjas-15 sa. Tämä plasmidi on pUBHO, joka on selostettu myös eräässä kirjoituksessa julkaisussa Journal of Bacteriology 1978, Voi. 134, sivut 318-329. Plasmidi pUBllO sisältää geenin, joka koodaa resistenssiä kanamysiinille tai analogisille antibiooteille, jotka on inaktivoitu nukleotidyyli 20 transferaasi-entsyymillä. On havaittu, että tästä plasmidista johdettu yhdistelmä-DNA ja tiettyjä amylaasia koodaavia geenejä voidaan viedä isäntä-mikro-organismiin ja että, erityisesti, kun isäntä on Bacillus subtilis, voidaan tuottaa ja viljellä mutanttikantoja, joilla on paran-25 tunut pysyvyys ja suuret kopioitumisluvut. Mutantti-mikro-organismeja, jotka sisältävät tätä uutta yhdistelmä-DNA: ta, voidaan sen tähden käyttää teollisella pohjalla amylaasin tuottamiseksi ja erityisesti Bacillus megate-rium'in alfa-amylaasin tuottamiseen; amylaasin, jolla on 30 erityisen käyttökelpoiset kaupalliset ominaisuudet.
Siten tämä keksintö käsittää, uutena ainekoostumuksena, yhdistelmä-DNA:n, joka sisältää a-amylaasia koodaa-van geenin ja joka on valmistettu in vitro-menetelmällä, jossa luovuttaja mikro-organismista peräisin oleva DNA 35 pilkotaan ja syntyneet DNA-osaset, jotka sisältävät a-amylaasia koodaavan geenin, yhdistetään samalla tavalla pii- li 3 91885 kotun vektorin kanssa, joka on plasmidi, jolloin luovutta-ja-mikro-organismi on Bacillus megaterium ja plasmidi on pUBHO. Keksinnön mukaiselle yhdistelmä-DNA: lie on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään ja kek-5 sinnön mukaiselle menetelmälle B. subtilis-mikro-organis-min muokkaamiselle tällä yhdistelmä-DNA:11a on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 2 esitetään.
Mikro-organismi Bacillus megaterium NCIB no. 11568 sisältää geenejä, jotka koodaavat alfa-amylaasia ja vas-10 taavasti beta-amylaasia, ja keksinnön mukainen yhdistelmä-DNA on se, jota syntyy Bacillus megaterium NCIB no.
11568:n DNA:n osasten, jotka sisältävät alfa-amylaasia koodaavan geenin, ja pilkotun vektorin pUBHO yhdistämisestä ja joka tässä on nimetty pAMY100:ksi.
15 On huomautettava, että termi Bacillus megaterium kuten sitä tässä selityksessä käytetään, on tarkoitettu käsittämään Bacillus megaterium'in hyväksytyt synonyymit, joita ovat erityisesti Bacillus carotarum, kuten on selostettu käsikirjassa Bergey's "Manual of Determinative Bac-20 teriology", (8. painos), R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, rinnakkaistoimittajia, sivu 537.
Keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA:n tuotantoon päästään käyttämällä tavanomaisia ja hyvin tunnettuja menetelmiä, kuten tämän selityksen jälkeen seuraavissa esi-\ 25 merkeissä selostetaan.
Teollista käyttöä varten keksinnön mukainen yhdistelmä-DNA yhdistetään ensin B. subtilis-isäntä-mikro-orga-nismiin. Siten tämä Bacillus subtilis voi olla Bacillus subtilis BGSC 1A289, tai edullisemmin jälkimmäisen itiötön 30 mutantti, joka on talletettu Bacillus subtilis NCIB
11979:nä (jota tämän jälkeen nimitetään BAS8:ksi). Kun viimemainittu on isäntänä yhdistelmä-DNA:lie pAMYlOO, saadaan uusi mikro-organismi, talletusnumero Bacillus subtilis NCIB 11980 (jota tämän jälkeen nimitetään BAS35:ksi).
35 Parantuneen pysyvyyden ja suuren kopioitumisluvun saavuttamiseksi on havaittu, että käyttämällä seuraavaa • 4 91885 menetelmää BAS35 voidaan saada mutatoitumaan antamaan organismi, jossa nämä halutut ominaisuudet ovat parantuneet. BAS35:tä viljellään ensin ravintoalustassa, joka sisältää 250 mikrogrammaa/ml kanamysiiniä. Jotkut pesäkkeet pysty-5 vät kasvamaan tällä alustalla, toiset eivät, ts. edellisillä on suurempi kanamysiini-resistenssi. Pesäkkeet, joilla on kyky kasvaa tällä alustalla, valikoidaan ja niitä viljellään sitten erikseen. Valikoidun kannan on havaittu olevan BAS35:n mutantti ja se on talletettu Bacil-10 lus subtilis NCIB 11984:nä (nimitetään tämän jälkeen BAS72:ksi).
Jos tämä uusi mutanttikanta nyt kuitenkin siirretään ravintoalustaan, joka sisältää 750 mikrogrammaa kana-mysiiniä/ml, voidaan valikoida uudelleen mutantti, joka 15 pystyy kasvamaan tässä alustassa ja joka siten on mukautettu kestämään kanamysiinin pitoisuus 750 mikrogrammaa/ml. Tämä mutantti voidaan valikoida ja viljellä erikseen ja se on talletettu Bacillus subtilis NCIB 11985:nä (nimitetään tämän jälkeen BAS73:ksi). Kummallakin mutant-20 tikannalla BAS72 ja BAS73 on sen ohella, että niillä on hyvä kanamysiini-resistenssi, parantunut pysyvyys ja kasvanut kopioitumisluku. Siten, kun BAS35:n kopioitumisluku on n. 15, BAS72:n kopioitumisluku on vähintään 25 ja BAS73:n vähintään 35. Tätä menettelytapaa voidaan käyttää 25 tuottamaan mutanttikantoja, jotka ovat resistenttejä vieläkin suuremmille antibioottipitoisuuksille, esim. 5000 mikrogrammaan/ml asti ja vastaavasti suuremmin kopioitu-misluvuin. Keksinnön mukaisille menetelmille kanamysiini-resistenttien mutanttien valmistamiseksi on tunnusomaista 30 se, mitä patenttivaatimuksissa 4 tai 6 esitetään.
BAS72 ja BAS73 pysyvyyksineen ja suurine plasmidi-kopioitumislukuineen ovat houkuttelevia käytettäviksi teollisesti Bacillus megaterium NCIB no. 11568:n alfa-amy-laasin tuottamiseksi, koska kumpikin sisältää yhdistelmä-35 DNA:n pAMYlOO, joka sisältää tätä amylaasia koodaavan geenin.
• * m
II
5 91885
Suurten kopioitumislukujen mutanttikantojen tekemiseksi sopivammiksi teolliseen käyttöön on edullista poistaa yhdistelmä-DNA:sta, jonka vastaava mikro-organismi sisältää, geeni, joka koodaa kanamysiini-resistenssiä.
5 Tämä voidaan suorittaa tunnetuin geneettisin käsittelymenetelmin, esimerkiksi menetelmällä, jossa yhdistelmä-DNA poistetaan mikro-organismista, pilkotaan in vitro ja kanamysiini-resistenssiä koodaava geeni jätetään siitä pois restriktioendonukleaasin avulla. Syntynyt DNA liitetään 10 sitten ligaasilla ja insertoidaan uudelleen Bacillus sub-tilis-isäntään, esim. BAS8:aan tai "parannettuun" muotoon BAS72 tai BAS73.
Mikro-organismeilla, jotka sisältävät keksinnön mukaista yhdistelmä-DNA:ta, on käyttöä Bacillus megaterium 15 NCIB no. 11568:n alfa-amylaasin tuotannossa, joka on entsyymi, joka on aktiivinen polysakkaridien, kuten tärkkelys- ja osittaisten tärkkelyshydrolysaattien konversion katalysoinnissa, kuten on selostettu hakijan käsittelyn-alaisessa brittiläisessä patenttihakemuksessa no. 8414272 20 (patent Case E-234).
Keksintöä selostetaan nyt lähemmin viitaten seuraa-viin esimerkkeihin, joissa käytettiin seuraavia talletettuja kantoja ja plasmideja:
Bacillus subtilis BGSC 1A289 25 Tämä organismi on mutantti, josta puuttuu alfa-amy- laasia koodaava geeni. Sitä saatiin kokoelmasta Bacillus Genetic Stock Centre of Ohio State University.
pUBHO
Kuten edellä selostettiin.
30 pAMYl (yhdistetty E. coll'in talletushumerona NCIB
11570) E. coli plasmidin pBR322 johdannainen, jossa on 2,2 Kb:n HindIII-insertio-osa, jossa on Bacillus megaterium NCIB 11568:n alfa-amylaasia koodaava geeni. Tämä plasmidi 35 on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 81300578.2.
. * 6 91885
Esimerkki 1 ρΑΜΥΙΟΟ: yhdistelmä-plasmidi, joka on johdettu pUBHOistä ja jossa on DNA-segmentti, joka koodaa Bacillus megaterium NCIB 11568:n alfa-amylaasia (ks. plasmidikart-5 taa, joka on oheistettu tähän selitykseen kuvana 1).
Luovuttaja DNA oli pAMYl ja in vitro-yhdistäminen suoritettiin 1 pg:n pAMYl DNA:ta ja 2 pg:n pUBHO DNA:ta välillä, joka oli pilkottu 10 yksiköllä EcoRI-restriktio-endonukleaasia. Liittäminen suoritettiin suuressa pitoi-10 suudessa (75 pg DNA/ml) 1 yksikön T4 DNA-ligaasia läsnäollessa ketjuuntumien kehittämiseksi.
Saatua tuotetta käytettiin transformoimaan BGSC 1A289 menetelmällä, jokä on selostettu julkaisussa "Experiments in Microbial Genetics", toimittanut Clowes & 15 Highes, Blackwell 1968. Kanamysiini-resistentit ja amylaa-sia tuottavat kloonit tunnistettiin LB-alustassa, jota oli täydennetty 10 pg:llä/ml kanamysiiniä ja 1 %:lla tärkkelystä, jolloin amylaasia tuottavat kloonit tunnistettiin jodihöyryllä menetelmällä, jota on selostettu eurooppa-20 laisessa patenttihakemuksessa 81300578.2, sivu 20, kappale B.
Positiivisista klooneista valittiin klooni, jolla on ρΑΜΥΙΟΟ, plasmidi, joka on säilyttänyt koko pUB110:n, AMY-osasen ja ainoastaan pienen osan pBR322:sta ja jota 25 rajoittavat Hindlll-kohdat, jotka rajaavat AMY-osasen.
ρΑΜΥΙΟΟ DNA uutettiin sitten tästä kannasta ja käytettiin transformoimaan BAS8, kuten esimerkissä 5 selostetaan.
Esimerkki 2
30 Bacillus subtilis BAS8:n, Bacillus subtilis BGSC
lA289:n itiöttömän mutantin valmistus Näytettä BGSC lA289:n yhden yön viljelystä valotettiin UV-valolla ja käytettiin siirrostamaan peräkkäisillä jatkoviljelyillä seuraava alusta: 7 91885
Difco Yeast Extract 1 g
MgS04 · 7 H20 2 00 mg
FeS04 · 7 H20 10 mg
MnS04 · H20 7 mg 5 CaCl2 · 2H20 73 mg
P04-puskuria, pH 7,0 0,067 M
glutamaatti 0,1 M
metioniini 40 mg aromaattiset aminohapot 40 mg 10 H20 1 1 Tämän alustan Bergere ja Hermier (Ann. Inst.
Pasteur 106, 214.235 1964) ovat selostaneet olevan itiöiden muodostumista aiheuttava alusta. Peräkkäiset jatkoviljelyt tällaisessa alustassa antavat selektiivisen edun 15 kasvaville soluille (jotka eivät pysty itiöitymään) itiöitä vastaan, joiden täytyy ensin itää ennenkuin ne pystyvät lisääntymään. Siten jokainen jatkoviljelyvaihe voi rikastaa populaatiota itiöttömien mutanttien suhteen. BAS8 eristettiin kuuden jatkoviljelyn jälkeen.
20 Bacillus subtilis BGSC lA289:lle ilmoitetut geneet tiset merkit ovat: amy-E : mutaatio rakennegeenissä, joka koodaa B. subti- liksen alfa-amylaasia, josta mutaatiosta on tuloksena alfa-amylaasin poissaolo.
25 aroI906 : mutaatio rakennegeenissä, joka koodaa "shikima- te"-kinaasia, josta mutaatiosta on tuloksena aromaattisten aminohappojen (fenyylialaniini, tyrosiini ja tryptofaani) tarve (auksotropia). metB5 : mutaatio rakennegeenissä, joka koodaa jotakin 30 metioniini-biosynteesitien entsyymeistä, josta mutaatiosta on seurauksena metioniinin tarve. sacA321 : mutaatio rakennegeenissä, joka koodaa entsyymiä, joka liittyy sakkaroosi-katabolismiin ja josta mutaatiosta on tuloksena kyvyttömyys pilkkoa 35 sakkaroosia.
91 885 8
Ultravioletti-käsittelyn tarkoituksena oli aikaansaada mutaatio tuntemattomassa geenissä, mistä on tuloksena kykenemättömyys itiöityä. Mutantti-BAS8 tuottaa vähemmän kuin yhden itiön 107 bakteeria kohti edellä kuvatus-5 sa itiömuodostusväliaineessa, kun taas Bacillus subtilis BGSC 1A289 tuottaa yhden itiön kahta bakteeria kohti samoissa olosuhteissa. Mutantti-organismi Bacillus subtilis BAS8 sisältää geneettisen merkin spo-8 mutta samanaikaisesti se on menettänyt merkit arol906 ja sacA321 mutaatio-10 prosessin aikana.
Esimerkki 3 BAS35:n, joka sisältää yhdistelmä-DNA:n pAMYlOO, valmistus pAMYlOO DNA:ta käytettiin transformoimaan BAS8 esi-15 merkissä 1 esitetyllä menetelmällä ja kuten on selostettu julkaisussa "Experiments in Microbial Genetics", johon edellä viitattiin.
BAS35:n plasmidi-pysyvyys mitattiin peräkkäisillä jatkoviljelyillä 37°C:ssa täydellisessä alustassa (Difco-20 tryptoni, 1 %; Difco-hiivauute, 1 %; NaCl, 0,5 %) ilman kanamysiiniä, antibioottia, jolle plasmidi pUBHO antaa resistenssin.
Ensimmäinen jatkoviljely siirrostettiin näytteellä yhden yön viljelystä, jota kasvatettiin 20 pg/ml kanamy-25 siiniä läsnäollessa. Jokaiselle jatkoviljelylle tehtiin elinvoimaisuuslaskenta välittömästi siirrostamisen jälkeen ja kasvun jälkeen sukupolvien lukumäärän määrittämiseksi. BAS 35:n sukupolven ikä eksponentiaalisessa vaiheessa täydellisessä alustassa 37°C:ssa on 30 minuuttia.
30 Jokaisen jatkoviljelyn jälkeen amylaasi-positiivis- ten kloonien (jotka ovat säilyttäneet plasmidin) prosentti mitattiin. Tulokset olivat seuraavat: 9 91885
Sukupolvien lukumäärä % Amy*-klooneja 10 100 19 100 29 90,7 5 35 58,7 46 14,4 53 4,9
Esimerkki 4 BAS72:n, BAS35:n mutantin tuottaminen, joka käsit-10 tää mutaation tuntemattomassa geenissä, joka koodaa kasvanutta kanamysiini-resistenssiä ja plasmidi-pysyvyyttä.
BAS35:tä, joka sisältää plasmidin pAMYlOO, joka antaa kanamysiini-resistenssin maksimiväkevyydessä n.
30 pg/ml, viljeltiin yli yön täydellisessä alustassa. II-15 man mutageeni-käsittelyä levitettiin 0,1 ml:n näytteitä maljoille, jotka sisälsivät täydellistä alustaa ja täydennettiin 250 pg:lla/ml kanamysiiniä. Kahden päivän inku-boinnin jälkeen 37°C:ssa syntyi tälle kanamysiiniväkevyydelle resistenttejä klooneja taajuudessa 10*6 siirrostettua 20 BAS-35-solua kohti. Yksi klooni, joka on nimetty BAS72:ksi, valikoitiin resistenteistä klooneista ja mutaatio, joka antoi lisääntyneen resistenssin kanamysiinifeno-tyypille, nimettiin irk-72:ksi. Tämä fenotyyppi säilytti pysyvyytensä useiden alaviljelyjen jälkeen antibiootin 25 poissaollessa. BAS 72:n sukupolven ikä eksponentiaalisessa vaiheessa täydellisessä väliaineessa 37°C:ssa on 60 minuuttia.
pAMY100:n pysyvyys BAS72:ssa
Pysyvyys mitattiin kuten BAS35:n tapauksessa ja on 30 esitetty seuraavassa. On selvää, että pAMYlOO on paljon pysyvämpi BAS72:ssa kuin BAS35:ssä.
10 91885
Sukupolvien lukumäärä % Amy*-klooneja 11 100 17 100 29 100 5 34 100 45 100 50 100
Esimerkki 5 BAS73:n tuottaminen, joka käsittää tuntemattoman 10 geenin mutaation, joka antaa suuremman resistenssin kana-mysiinille kuin edellisessä esimerkissä.
0,1 ml:n näyte yhden yön viljelystä BAS72:n täydellisessä alustassa (joka BAS72 on resistentti kanamysiinil-le väkevyydessä 250 pg/ml) levitettiin maljalle, joka si-15 sälsi täydellistä alustaa, johon oli lisätty 750 pg/ml kanamysiiniä. Antibiootin tälle väkevyydelle spontaanisti resistenttejä klooneja syntyi taajuudessa 10'6 maljalle levitettyä solua kohti. Yksi tällainen klooni puhdistettiin ja nimettiin BAS73:ksi. Sen resistenssi 750 pg:lle/ml 20 kanamysiiniä säilyi pysyvyydessä useiden jatkoviljelyjen jälkeen antibiootin poissaollessa.
BAS73:n sukupolven ikä eksponentiaalisessa vaiheessa täydellisessä väliaineessa 37°C:ssa on 60 minuuttia. pAMY100:n pysyvyys BAS73:ssa 25 Plasmidi-pysyvyys mitattiin kuten BAS35:n tapauk sessa ja on esitetty seuraavassa. On selvää, että pAMYlOO on paljon pysyvämpi BAS73:ssa kuin BAS35:ssä.
Sukupolvien lukumäärä % Amy+-klooneja 10 100 30 18 100 28 100 34 100 45 100 50 100 ti 11 91885
Esimerkki 6
Alfa-amylaasin tuottaminen Bacillus subtilis BAS 35:llä ja BAS 73:11a
Neljä 20 litran fermentointilaitetta, jotka sisäl-5 sivät 15 1 viljelyalustaa, jossa oli paino/tilavuuspohjalta, 1 % baktopeptonia, 3 % hiivauutetta, 0,5 % glukoosia ja 0,5 % NaCl, siirrostettiin 1 %:lla esiviljelyä, joka oli samassa alustassa. Esiviljelyt valmistettiin tekemällä useita jatkoviljelyjä, niin että lopullisessa vaiheessa 10 ennen fermentointilaitteita oli tuotettu n. 35 sukupolvea. Kaksi fermentointilaitetta siirrostettiin kannalla BAS 35 kanamysiinin (5 pg/ml) läsnäollessa ja poissaollessa ja kaksi kannalla BAS73 kanamysiinin (5 pg/ml) läsnäollessa ja poissaollessa. Fermentointilaitteita sekoitettiin kier-15 rosluvulla 250 r/min, ilmastettiin 0,15 1:11a ilmaa/l/min ja pidettiin 40°C:ssa 55 tuntia. 6 tunnin ja vielä 48 tunnin lisäjakson jälkeen fermentointilaitteisiin syötettiin jatkuvasti glukoosiliuosta niin, että fermentointilaitteisiin lisätty kokönaisglukoosimäärä oli 1,5 % (paino/ti-20 lav.). Fermentoinnin loputtua alfa-amylaasi-aktiivisuus mitattiin viljelyliemessä. Tulokset on esitetty seuraavas-sa taulukossa:
Entsyymiaktiivisuus U/ml BAS 35_BAS 73 25 + kanamysiini 220 160 - kanamysiini 80 150
Claims (7)
1. Yhdistelmä-DNA, joka sisältää α-amylaasia koo-daavan geenin ja joka on valmistettu in vitro pilkkomalla 5 luovuttaja-mikro-organismista saatua DNA:ta ja yhdistämällä saadut α-amylaasia koodaavan geenin sisältävät DNA-fragmentit samalla tavalla pilkotun plasmadivektorin pUBHO kanssa, tunnettu siitä, että luovuttaja-mikro-organismi on Bacillus megaterium NCIB 11568 ja a-10 amylaasia koodaavan geenin sisältävä yhdistelmä-DNA on plasmidi, jonka molekyylipaino on 6,7 kb ja jonka endonuk-leaasi-restriktiokartta on kuvion 1 mukainen.
2. Menetelmä geneettisesti muokatun Bacillus subti-lis-mikro-organismin valmistamiseksi viemällä yhdistelmä-
15 DNA:ta Bacillus subtilis-isäntämikro-organismiin, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA on patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi ja isäntämikro-organismi on Bacillus subtilis-kanta, jolla on puutteellinen a-amylaasia koodaava geeni ja joka on säteilytetty mikro-organismin 20 saamiseksi, joka ei tuota itiöitä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettisesti muokattu Bacillus subtilis-mikro-organismi on Bacillus subtilis NCIB 11980.
4. Menetelmä mikro-organismin valmistamiseksi, joka 25 pystyy kasvamaan ravintoalustassa, joka sisältää vähintään 250 pg kanamysiiniä ml kohti, tunnettu siitä, että (a) viljellään Bacillus subtilis NCIB 11980 ravintoalustalla, joka sisältää 250 pg kanamysiiniä ml kohti; 30 (b) valitaan yksi tai useampi pesäke, joka kasvaa mainitulla alustalla; (c) siirretään mainitut pesäkkeet uudelle ravinto-alustalle; ja (d) viljellään valitut pesäkkeet mainitulla uudella 35 alustalla. 13 91885
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi, joka pystyy kasvamaan ravintoalustassa, joka sisältää vähintään 250 pg ka-namysiiniä ml kohti, on NCIB 11984.
6. Menetelmä mikro-organismin valmistamiseksi, joka pystyy kasvamaan ravintoalustassa, joka sisältää vähintään 750 pg kanamysiiniä ml kohti, tunnettu siitä, että (a) viljellään patenttivaatimuksen 4 mukaisesti 10 valmistettu kanamysiiniresistentti mutantti ravintoalustalla, joka sisältää 750 pg kanamysiiniä ml kohti; (b) valitaan yksi tai useampi pesäke, joka kasvaa mainitulla alustalla; (c) siirretään mainitut pesäkkeet uudelle alus-15 talle; ja (d) viljellään valitut pesäkkeet mainitulla uudella alustalla.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi, joka pystyy kasva-20 maan ravintoalustassa, joka sisältää vähintään 750 pg kanamysiiniä ml kohti, on NCIB 11985. 14 91885
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848414271A GB8414271D0 (en) | 1984-06-05 | 1984-06-05 | Recombinant dna |
| GB8414271 | 1984-06-05 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI852084A0 FI852084A0 (fi) | 1985-05-24 |
| FI852084L FI852084L (fi) | 1985-12-06 |
| FI91885B true FI91885B (fi) | 1994-05-13 |
| FI91885C FI91885C (fi) | 1994-08-25 |
Family
ID=10561932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI852084A FI91885C (fi) | 1984-06-05 | 1985-05-24 | -amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4806426A (fi) |
| EP (1) | EP0165002B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0779683B2 (fi) |
| AT (1) | ATE76902T1 (fi) |
| AU (1) | AU4313285A (fi) |
| BR (1) | BR8502681A (fi) |
| CA (1) | CA1279590C (fi) |
| DE (1) | DE3586145T2 (fi) |
| DK (1) | DK170735B1 (fi) |
| ES (2) | ES8702947A1 (fi) |
| FI (1) | FI91885C (fi) |
| GB (1) | GB8414271D0 (fi) |
| IE (1) | IE58259B1 (fi) |
| MX (1) | MX7725E (fi) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
| US5209938A (en) * | 1989-09-13 | 1993-05-11 | Cpc International Inc. | Method for retarding staling of baked goods |
| US6300115B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-09 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
| ZA81424B (en) * | 1980-02-15 | 1982-02-24 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amylolytic enzymes and process for preparing same |
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
| DK135983D0 (da) * | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Novo Industri As | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
-
1984
- 1984-06-05 GB GB848414271A patent/GB8414271D0/en active Pending
-
1985
- 1985-05-22 IE IE128785A patent/IE58259B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-23 US US06/737,311 patent/US4806426A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 FI FI852084A patent/FI91885C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-30 AU AU43132/85A patent/AU4313285A/en not_active Abandoned
- 1985-06-03 MX MX85956U patent/MX7725E/es unknown
- 1985-06-04 BR BR8502681A patent/BR8502681A/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 EP EP85303947A patent/EP0165002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 DE DE8585303947T patent/DE3586145T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 ES ES543860A patent/ES8702947A1/es not_active Expired
- 1985-06-04 AT AT85303947T patent/ATE76902T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 DK DK251485A patent/DK170735B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-05 CA CA000483212A patent/CA1279590C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-05 JP JP60120735A patent/JPH0779683B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-28 ES ES551307A patent/ES8802536A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI852084L (fi) | 1985-12-06 |
| CA1279590C (en) | 1991-01-29 |
| ES8702947A1 (es) | 1987-01-16 |
| EP0165002B1 (en) | 1992-06-03 |
| GB8414271D0 (en) | 1984-07-11 |
| JPH0779683B2 (ja) | 1995-08-30 |
| ES543860A0 (es) | 1987-01-16 |
| JPS6119491A (ja) | 1986-01-28 |
| FI852084A0 (fi) | 1985-05-24 |
| ES551307A0 (es) | 1988-07-16 |
| EP0165002A3 (en) | 1987-09-02 |
| DE3586145D1 (de) | 1992-07-09 |
| DK170735B1 (da) | 1995-12-27 |
| BR8502681A (pt) | 1986-02-12 |
| ATE76902T1 (de) | 1992-06-15 |
| DK251485A (da) | 1985-12-06 |
| ES8802536A1 (es) | 1988-07-16 |
| IE851287L (en) | 1985-12-05 |
| MX7725E (es) | 1991-01-30 |
| IE58259B1 (en) | 1993-08-25 |
| FI91885C (fi) | 1994-08-25 |
| DE3586145T2 (de) | 1992-12-03 |
| DK251485D0 (da) | 1985-06-04 |
| AU4313285A (en) | 1985-12-12 |
| EP0165002A2 (en) | 1985-12-18 |
| US4806426A (en) | 1989-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1838410C (ru) | Способ получени альфа-амилазы | |
| USRE34851E (en) | Biosynthesis of 2 keto-L-gulonic acid | |
| JPH028714B2 (fi) | ||
| Kawamura et al. | Catabolite-resistant sporulation (crsA) mutations in the Bacillus subtilis RNA polymerase sigma 43 gene (rpoD) can suppress and be suppressed by mutations in spo0 genes. | |
| JP2612583B2 (ja) | キサンタンガムの組換ｄｎａによる製造 | |
| EP0286303B1 (en) | Dna and its use | |
| CA2083407C (en) | Microorganisms for the stabilization of plasmids | |
| FI91885B (fi) | -amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi | |
| CZ100596A3 (en) | Dna fragment, vector and micro-organism containing genes for metabolic transformation of butyrobetaine/crotonobetaine-l-carnitine and process for preparing l-carnitine | |
| Lacks et al. | Transfer of recombinant plasmids containing the gene for DpnII DNA methylase into strains of Streptococcus pneumoniae that produce DpnI or DpnII restriction endonucleases | |
| US5985668A (en) | Sucrose metabolism mutants | |
| CA1339011C (en) | Dna fragment having the cyclodextrin glycosyltransferase structural gene, an expression vector and microorganims for the expression of said gene, and a process for the preparation of same | |
| EP0787800A2 (en) | Plasmid and plasmid vector from Lactobacillus helveticus | |
| EP0124076A2 (en) | Method for preparation of recombinant plasmids, microorganisms transformed by said plasmids and thermo-stable alpha-amylase | |
| EP0240105B1 (en) | A gene coding for biotin synthetase and utilization thereof | |
| JPH0829083B2 (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
| US20040235120A1 (en) | Method for producing vitamin b12 | |
| JPH04287686A (ja) | 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ | |
| JPS6253150B2 (fi) | ||
| JP2681634B2 (ja) | 耐熱性液化型アミラーゼ生産能力の増強された細菌新菌株 | |
| EP0400931A1 (en) | Plasmid pTY1 | |
| JPS6243677B2 (fi) | ||
| FI75367B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en genetiskt manipulerad mikroorganism innehaollande en foer amylas kodande rekombinant-dna, och ett foerfarande foer framstaellning av amylas. | |
| CS217313B1 (cs) | Nový bakteriální kmen Bacillus amylolíquefaciens CCM 3502 | |
| JPH0113358B2 (fi) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: CPC INTERNATIONAL INC. |