CS217313B1 - Nový bakteriální kmen Bacillus amylolíquefaciens CCM 3502 - Google Patents

Abstract

Nový bakteriální kmen Bacillus amyloliquefaciens CCM 3502 vyznačující ee vysokou produkcí alfa-amylázy. Pracuje se buď vsádkovým či kontinuálním způsobem při pH 5,5 a teplotě 25 - 35 °C. Tvorba uvedeného enzymu bývá doprovázena tvorbou proteazy.

Description

Vynález se týká nového produkčního průmyslového bakteriálního kmene Bacillua amylo liquefaciens, který je význačný vysokou produkcí exocelulámího enzymu tt- -amylázy.

Charakteristickým znakem tohoto nového kmene je schopnost růstu na Skrobnatých substrátech doplněných organickým a anorganickým dusíkem za současné produkce enzymu & -amylázy. Produkční vlastnosti (schopnosti) kmene zůstávají plně zachovány jak při submersní vsádkové, tak kontinuální kultivaci, kde dochází k maximální expresi jeho geno typu.

Kaen BaciHus amyloliquefaciens byl získán řízenou selekcí výchozího kmene Bacillus amyloliquefaciens (který byl vyizolován z půdy) v podmínkách kontinuální kultivace. Možnost genetická nestabilnoeti kultury za podmínek kontinuální kultivace je známá. Teorie přerůstání mutant je rozvíjena prakticky souběžně s rozvíjením teorie kontinu álních kultivací. Kultura výchozího kmene, z kterého byl získán nový kmen dle vynálezu, ee v chemostatu rozpadala na nízko a vysokoprodukční motanty.

Kmen podle vynálezu byl získán v podmínkách kontinuální kultivace na mediích, jejich složení umožnilo potlačení neprodukční mutanty z výchozí populace. Syntetická půda (zdroj uhlíku glukóza, zdroj dusíku NHÍ nebo N03) stimulovala vznik nízkoprodukčních mutant, a naopak selkční tlak přirozeného media (zdroj uhlíku škrob, zdroj dusíku com - steep liquor) působil na pomnožení vysokoprodukční mutanty. Kromě složení media byla důležitým faktorem řízené selekce zřeáovací rychlost D (h~^) užitá při kultivaci v chemostatu. Při nízkých zřeáovacích rychlostech (do D = 0,15 h“·*·) docházelo k limitaci živin i v přirozeném mediu, a složení populace se nezlepšovalo ve prospěch vysokopro dukčních mutant.

K získáni vysokoprodukčních mutant byly nutné tyto podmínky : přirozená půda a zřeáovací rychlost v rozmezí od 0,18 do 0,30 h”\ Analýza vysokoprodukčních mutant i buněk výahoziho kmene ukázala, že během selekce v chemostatu došlo k získání dodatečné genetické informace, uložené mimo bakteriální ohromozom na speciálním plasmidu. Tato plasmidová DNA nebyla u buněk výchozího kontrolního kmene nikdy zjištěna. Zvýšení pro dukce at - amylázy je současně řízeno jak chromosomální, tak nově získanou plasmidovou DNA. Závislost selekce na růstové rychlosti (v podmínkách chemostatu růstová rychlost zřeáovací rychlost) byla potvrzena studiem růstových rychlostí vysokoprodukčních a neprodukčních mutant za definovaných podmínek. Bylo zjištěno, že mají různé maximální růstové rychlosti (/^umax), což je zřejmě výsledkem různých nároků těchto dvou mutant na aminokyseliny. Nižší růstové rychlost z produkční mutanty je způsobena tím, že vedle vlastni reprodukce ještě navíc syntetizuje exocelulární protein, a proto má vyšší po třebu substrátu. Z uvedeného vyplývá, že bez použití přesně definovaných zřeáovacích rychlostí určitého složené media a současné genetické analýzy, by nebylo možné získat vysokoprodukční mutantu a charakterizovat její fyziologické a genetické odlišnosti.

Dále je uvedena charakteristika vlastností nového bakteriálního kmene Bacillus amyloliquefaciens, jehož vzorec kultury je zařazen v československé sbírce mikroorganismů na Přírodovědecké fakultě J. E. Purkyně, Brno pod číslem CCU 3502.

217 313

a) Morfologická pozorování

1. Vegetativní buňky kmene Bacillua amyloliquefaciene jsou Gram- pozitivní pohyblivá tyčinky, elektrického až cylindrického tvaru.

2. Na tekutých půdách roste převážně jako jednotlivé tyčinky a jejich dvojice, zřídka v řetízcích.

3. Tvorba apor : jedna buňka netvoří více než jednu centrálně umístěnou endosporu. Spory jsou /termoresistentní.

4. Růst na pevných půdách : kolonie na agaru jsou okrouhlé až nepravidelné, většinou průsvitné až bělavé. Profil kolonií je pravidelný a plochý. Povrch je většinou hladký, ale může být na eušších agarech až drsný. U starších kolonií jsou pozorovány náznaky pigmentace, která zbarvuje kolonie slabě do zelena.

b) Fysiologické charakteristiky

1. Kmen kultivovaný aerobně na glukóze tvoří kyselinu a katalázu.

2. Teplotní, optimum kmene je mezi 25 - 35 °C. Teplotní maximum je mezi 45 - 55 °C.

3. Aktivní růst probíhá při pH 5,5 - 8,5·

4. Kmen redukuje NO^ ” na NC^^-·

5. Na škrobnatých substrátech tvoří kmen značné množství extracelulárního enzymu cí. -amylázy. Tvorba tohoto enzymu bývá doprovázena tvorbou dalšího extracelulár ního enzymu a to proteázy.

6. Kmen produkuje bakteriocin inhibující růst kmenů Bacillus aubtilis 168 a z něj odvozených derivátů.

c) Genetická charakteristika

1. Kmen produkuje restrikční .endonukleázu, která byla identifikována jako restrikční endonukleáza shodná co do velikosti a množství restrikčních fragmentů DNA s restrik Sní endonukleázou BamHI, která byla nalezena pouze u kmenů Bacillus amyloliquefaciene .

2. Bakteriální kmen Bacillus amyloliquefaciens CCM 3502 se odlišuje od druhu Bacillus amyloliquefaciens (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Eight Edition, R.E. Buchanan and Wilkins Company, Baltimore 1974) tím, 2e nese plazmiďovou DNA o molekulové hmotnosti 3,4 Udal., která se charakteristickým způsobem štěpí.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Bakteriální kmen Bacillus aayloliquefaciens CCM 3502 pro výrobu enzymuoC -amylázy vsádkovým i kontinuálním způsobem.

   Vytiskly Moravské tiskařské závody, provoz 12, Leninova 21, Olomouc