FI91885C - -amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi - Google Patents
-amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI91885C FI91885C FI852084A FI852084A FI91885C FI 91885 C FI91885 C FI 91885C FI 852084 A FI852084 A FI 852084A FI 852084 A FI852084 A FI 852084A FI 91885 C FI91885 C FI 91885C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- microorganism
- amylase
- kanamycin
- bacillus subtilis
- recombinant dna
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title abstract description 26
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims abstract description 33
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims abstract description 33
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 22
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims abstract description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 3
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 11
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 11
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 11
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
91885 α-araylaasia koodaava yhdistelma-DNA ja menetelmia sita sisaitavien mikro-organismien valmistamiseksi
Keksinn6n kohteena on yhdistelma-DNA, joka sisaitaa 5 α-amylaasia koodaavan geenin, seka menetelmia mikro-organismien valmistamiseksi, jotka sisaltavat tata yhdistelma-DNA: ta.
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 81300578.2, on selostettu ja vaadittu uutta yhdistelmå-DNA:ta, joka 10 sisaitaa amylaasia koodaavan geenin ja joka on valmistettu in vitro-prosessilla, jossa bakteerisesta luovuttaja-mik-ro-organismista peraisin oleva DNA pilkotaan ja syntyneet DNA-osaset yhdistetaan vektorin kanssa, joka on samalla tavalla pilkottu, jolloin vektori on plasmidi tai lambda-15 fagin johdannaisen DNA. Tama yhdistelma-DNA insertoidaan bakteeri-isantaorganismiin ja jalkimmaista viljeliaan amy-laasin tuottamiseksi. Mainitussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa on selostettu joukko bakteeri-luovuttajaja bakteeri-isanta-organismeja samoin kuin lukuisia sopi-20 via plasmideja ja lambda-fagin johdannaisia.
Plasmidien kayttO geenin tuottamiseksi johonkin mikro-organismiin on laajalti kaytetty tekniikka. Viime-aikainen kirjallisuus sisaitaa selostuksia joukosta plasmideja, joita on ehdotettu tahan tarkoitukseen. Erityises-25 ti kaksi kirjoitusta "Gene"ssa, jota julkaisee Elsevier Biomedical Press, 15 (1981) 43-58, tekijOina Ilkka Palva et al ja 19 (1982) 81-87 tekijana Ilkka Palva yksinaan, selostetaan alfa-amylaasia koodaavan geenin eristamistå Bacillus amyloliquefaciens'ista suoralla shotgun-kloonauk-30 sella kayttaen Bacillus subtilis'ta isantana. Bacillus amyloliquefaciens'in genomia uutettiin osittain restrik-tioendonukleaasilla Mbo I ja 2-5 kb:n osasia eristettiin ja liitettiin plasmidiin pUB 110. Kelvollisia amylaasi-negatiivisia Bacillus subtilis-soluja transformoitiin 35 hybridiplasmideilla ja kanamysiini-resistentteja trans- formantteja seulottiin alfa-amylaasin tuottamista vårten.
2 91 885
Eras ongelmista kåytettåesså geneettisesti raken-nettua mikro-organismia teollisessa mittakaavassa on yhdistelmå-DNA: n, joka on tuotu tållå geneettisellå kåsitte-lymenetelmållå, pysyvyys. Jos pysyvyys puuttuu, yhdistel-5 må-DNA pyrkii håviåmåån tai siinå tapahtuu sarja uudel- leenjårjestelyjå, kun syntyy organismin peråkkåisiå suku-polvia kunnes lopulta jålkelåis-mikro-organismit eivåt enåå ekspressoi tai ekspressoivat vain heikosti amylaasia koodaavaa geeniå.
10 Nyt on kehitetty yhdistelmå-DNA, joka muun muassa sisåltåå tiettyja amylaasia koodaavia geenejå, joita on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 81300578.2 mutta joka on johdettu plasmidista, jota ei nimenomaisesti ole selostettu viimemainitussa asiakirjas-15 sa. Tåinå plasmidi on pUBHO, joka on selostettu myOs erååsså kirjoituksessa julkaisussa Journal of Bacteriology 1978, Vol. 134, sivut 318-329. Plasmidi pUBllO sisåltåå geenin, joka koodaa resistenssiå kanamysiinille tai analogisille antibiooteille, jotka on inaktivoitu nukleotidyyli 20 transferaasi-entsyymillå. On havaittu, ettå tåstå plasmi dista johdettu yhdistelmå-DNA ja tiettyjå amylaasia koodaavia geenejå voidaan viedå isåntå-mikro-organismiin ja ettå, erityisesti, kun isåntå on Bacillus subtilis, voidaan tuottaa ja viljellå mutanttikantoja, joilla on paran-25 tunut pysyvyys ja suuret kopioitumisluvut. Mutantti-mikro-organismeja, jotka sisåltåvåt tåtå uutta yhdistelmå-DNA: ta, voidaan sen tåhden kåyttåå teollisella pohjalla amylaasin tuottamiseksi ja erityisesti Bacillus megate-rium'in alfa-amylaasin tuottamiseen; amylaasin, jolla on 30 erityisen kåyttttkelpoiset kaupalliset ominaisuudet.
Si ten tåmå keksintd kåsittåå, uutena ainekoostumuk-sena, yhdistelmå-DNA:n, joka sisåltåå a-amylaasia koodaa-van geenin ja joka on valmistettu in vitro-menetelmållå, jossa luovuttaja mikro-organismista peråisin oleva DNA 35 pilkotaan ja syntyneet DNA-osaset, jotka sisåltåvåt a-amylaasia koodaavan geenin, yhdistetåån samalla tavalla pil- li 3 91885 kotun vektorin kanssa, joka on plasmidi, jolloin luovutta-ja-mikro-organismi on Bacillus megaterium ja plasmidi on pUBHO. KeksinnOn mukaiselle yhdistelmå-DNA: Ile on tunnus-omaista se, mi t a patenttivaatimuksessa 1 esitetåån ja kek-5 sinnOn mukaiselle menetelmålle B. subtilis-mikro-organis-min muokkaamiseile tålla yhdistelmå-DNA:11a on tunnus-omaista se, mitå patenttivaatimuksessa 2 esitetåån.
Mikro-organismi Bacillus megaterium NCIB no. 11568 sisåltåå geenejå, jotka koodaavat alfa-amylaasia ja vas-10 taavasti beta-amylaasia, ja keksinnOn mukainen yhdistelmå-DNA on se, jota syntyy Bacillus megaterium NCIB no.
11568:n DNA:n osasten, jotka sisåltåvåt alfa-amylaasia koodaavan geenin, ja pilkotun vektorin pUBHO yhdiståmi-sestå ja joka tåsså on nimetty pAMY100:ksi.
15 On huomautettava, ettå termi Bacillus megaterium kuten sitå tåsså selityksesså kåytetåån, on tarkoitettu kåsittåmåån Bacillus megaterium'in hyvåksytyt synonyymit, joita ovat erityisesti Bacillus carotarum, kuten on selos-tettu kåsikirjassa Bergey's "Manual of Determinative Bac-20 teriology", (8. painos), R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, rinnakkaistoimittajia, sivu 537.
KeksinnOn mukaisen yhdistelmå-DNA:n tuotantoon pååståån kåyttåmållå tavanomaisia ja hyvin tunnettuja me-netelmiå, kuten tåmån selityksen jålkeen seuraavissa esi-\ 25 merkeisså selostetaan.
Teollista kåyttOå vårten keksinnOn mukainen yhdis-telmå-DNA yhdistetåån ensin B. subtilis-isåntå-mikro-orga-nismiin. Siten tåmå Bacillus subtilis voi olla Bacillus subtilis BGSC 1A289, tai edullisemmin jålkimmåisen itiOtOn 30 mutantti, joka on talletettu Bacillus subtilis NCIB
11979:nå (jota tåmån jålkeen nimitetåån BAS8:ksi). Kun viimemainittu on isåntånå yhdistelmå-DNA:Ile pAMYlOO, saa-daan uusi mikro-organismi, talletusnumero Bacillus subtilis NCIB 11980 (jota tåmån jålkeen nimitetåån BAS35:ksi).
35 Parantuneen pysyvyyden ja suuren kopioitumisluvun saavuttamiseksi on havaittu, ettå kåyttåmållå seuraavaa • 4 91885 menetelmaa BAS35 voidaan saada mutatoitumaan antamaan organism! , jossa nåma halutut ominaisuudet ovat parantuneet. BAS35:ta viljeliaan ensin ravintoalustassa, joka sisaitaa 250 mikrogrammaa/ml kanamysiiniå. Jotkut pesåkkeet pysty-5 vSt kasvamaan talla alustalla, toiset eivat, ts. edelli-silia on suurempi kanamysiini-resistenssi. Pesåkkeet, joilla on kyky kasvaa taiia alustalla, valikoidaan ja nii-ta viljeliaan sitten erikseen. Valikoidun kannan on ha-vaittu olevan BAS35:n mutantti ja se on talletettu Bacil-10 lus subtilis NCIB 11984:na (nimitetaan tamån jalkeen BAS72:ksi).
Jos tamå uusi mutanttikanta nyt kuitenkin siirre-taan ravintoalustaan, joka sisaitaa 750 mikrogrammaa kana-mysiinia/ml, voidaan valikoida uudelleen mutantti, joka 15 pystyy kasvamaan tassa alustassa ja joka siten on mukau-tettu kestamaan kanamysiinin pitoisuus 750 mikrogrammaa/ml. Tåmå mutantti voidaan valikoida ja viljelia erikseen ja se on talletettu Bacillus subtilis NCIB 11985:na (nimitetaan taman jalkeen BAS73:ksi). Kummallakin mutant-20 tikannalla BAS72 ja BAS73 on sen ohella, etta niilia on hyv3 kanamysiini-resistenssi, parantunut pysyvyys ja kas-vanut kopioitumisluku. Siten, kun BAS35:n kopioitumisluku on n. 15, BAS72:n kopioitumisluku on vahintaan 25 ja BAS73:n vahintaan 35. Tata menettelytapaa voidaan kayttaa 25 tuottamaan mutanttikantoja, jotka ovat resistentteja vie-lakin suuremmille antibioottipitoisuuksille, esim. 5000 mikrogrammaan/ml asti ja vastaavasti suuremmin kopioitu-misluvuin. Keksinndn mukaisille menetelmille kanamysiini-resistenttien mutanttien valmistamiseksi on tunnusomaista 30 se, mita patenttivaatimuksissa 4 tai 6 esitetaan.
BAS72 ja BAS73 pysyvyyksineen ja suurine plasmidi-kopioitumislukuineen ovat houkuttelevia kaytettaviksi teollisesti Bacillus megaterium NCIB no. 11568:n alfa-amy-laasin tuottamiseksi, koska kumpikin sisaitaa yhdistelma-35 DNA:n pAMYlOO, joka sisaitaa tata amylaasia koodaavan gee-nin.
• *
II
5 91885
Suurten kopioitumislukujen mutanttikantojen teke-miseksi sopivammiksi teolliseen kayttddn on edullista poistaa yhdistelma-DNA:sta, jonka vastaava mikro-organismi sisaltaa, geeni, joka koodaa kanamysiini-resistenssiå.
5 Tama voidaan suorittaa tunnetuin geneettisin kasittelyme-netelmin, esimerkiksi menetelmaiia, jossa yhdistelma-DNA poistetaan mikro-organismista, pilkotaan in vitro ja kana-mysiini-resistenssia koodaava geeni jatetaan siita pois restriktioendonukleaasin avulla. Syntynyt DNA liitetaan 10 sitten ligaasilla ja insertoidaan uudelleen Bacillus sub-tilis-isantaan, esim. BAS8:aan tai "parannettuun" muotoon BAS72 tax BAS73.
Mikro-organismeilla, jotka sisaitavåt keksinndn mukaista yhdistelma-DNA:ta, on kayttda Bacillus megaterium 15 NCIB no. 11568:n alfa-amylaasin tuotannossa, joka on ent-syymi, joka on aktiivinen polysakkaridien, kuten tarkke-lys- ja osittaisten tarkkelyshydrolysaattien konversion katalysoinnissa, kuten on selostettu hakijan kasittelyn-alaisessa brittiiaisessa patenttihakemuksessa no. 8414272 20 (patent Case E-234).
Keksintca selostetaan nyt lahemmin viitaten seuraa-viin esimerkkeihin, joissa kaytettiin seuraavia talletet-tuja kantoja ja plasmideja:
Bacillus subtilis BGSC 1A289 25 Tama organismi on mutantti, josta puuttuu alfa-amy- laasia koodaava geeni. Sita saatiin kokoelmasta Bacillus Genetic Stock Centre of Ohio State University.
pUBHO
Kuten edelia selostettiin.
30 pAMYl (yhdistetty E. coll'in talletushumerona NCIB
11570) E. coli plasmidin pBR322 johdannainen, jossa on 2,2 Kb:n HindIII-insertio-osa, jossa on Bacillus megaterium NCIB 11568:n alfa-amylaasia koodaava geeni. Tama plasmidi 35 on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 81300578.2.
. * 6 91885
Esimerkki 1 ρΑΜΥΙΟΟ: yhdistelma-plasmidi, joka on johdettu pUBHOista ja jossa on DNA-segmentti, joka koodaa Bacillus megaterium NCIB 11568:n alfa-amylaasia (ks. plasmidikart-5 taa, joka on oheistettu tahan selitykseen kuvana 1).
Luovuttaja DNA oli pAMYl ja in vitro-yhdistaminen suoritettiin 1 pg:n pAMYl DNA:ta ja 2 pg:n pUBHO DNA:ta vaiilia, joka oli pilkottu 10 yksikdlia EcoRI-restriktio-endonukleaasia. LiittSminen suoritettiin suuressa pitoi-10 suudessa (75 pg DNA/ml) 1 yksikdn T4 DNA-ligaasia 13sna-ollessa ketjuuntumien kehittamiseksi.
Saatua tuotetta kaytettiin transformoimaan BGSC 1A289 menetelmaiia, joka on selostettu julkaisussa "Experiments in Microbial Genetics", toimittanut Clowes & 15 Highes, Blackwell 1968. Kanamysiini-resistentit ja amylaa-sia tuottavat kloonit tunnistettiin LB-alustassa, jota oli taydennetty 10 pg:lia/ml kanamysiinia ja 1 %:lla tarkke-lysta, jolloin amylaasia tuottavat kloonit tunnistettiin jodihOyrylia menetelmaiia, jota on selostettu eurooppa-20 laisessa patenttihakemuksessa 81300578.2, sivu 20, kappa-le B.
Positiivisista klooneista valittiin klooni, jolla on ρΑΜΥΙΟΟ, plasmidi, joka on sailyttanyt koko pUB110:n, AMY-osasen ja ainoastaan pienen osan pBR322:sta ja jota 25 rajoittavat Hindlll-kohdat, jotka rajaavat AMY-osasen.
ρΑΜΥΙΟΟ DNA uutettiin sitten tSstS kannasta ja kSy-tettiin transformoimaan BAS8, kuten esimerkissS 5 seloste-taan.
Esimerkki 2
30 Bacillus subtilis BAS8:n, Bacillus subtilis BGSC
lA289:n itiOttOrnSn mutantin valmistus Nåytettå BGSC lA289:n yhden y6n viljelysta valotet-tiin UV-valolla ja kåytettiin siirrostamaan perSkkSisilia jatkoviljelyillå seuraava alusta: 7 91885
Difco Yeast Extract 1 g
MgS04 · 7 H20 2 00 mg
FeS04 · 7 H20 10 mg
MnS04 · H20 7 mg 5 CaCl2 · 2H20 73 mg
P04-puskuria, pH 7,0 0,067 M
glutamaatti 0,1 M
metioniini 40 mg aromaattiset aminohapot 40 mg 10 H20 1 1
Tanrån alustan Bergere ja Hermier (Ann. Inst.
Pasteur 106, 214.235 1964) ovat selostaneet olevan ititti-den muodostumista aiheuttava alusta. Perakkaiset jatkovil-jelyt tSllaisessa alustassa antavat selektiivisen edun 15 kasvaville soluille (jotka eivat pysty itiftitymaan) itiiii-ta vastaan, joiden taytyy ensin itaa ennenkuin ne pystyvat lisaantymaan. Siten jokainen jatkoviljelyvaihe voi rikas-taa populaatiota itiOttOmien mutanttien suhteen. BAS8 eristettiin kuuden jatkoviljelyn jaikeen.
20 Bacillus subtilis BGSC lA289:lle ilmoitetut geneet- tiset merkit ovat: amy-E : mutaatio rakennegeenissa, joka koodaa B. subti- liksen alfa-amylaasia, josta mutaatiosta on tu-loksena alfa-amylaasin poissaolo.
25 aroI906 : mutaatio rakennegeenissa, joka koodaa "shikima- te"-kinaasia, josta mutaatiosta on tuloksena aromaattisten aminohappojen (fenyylialaniini, tyrosiini ja tryptofaani) tarve (auksotropia). metB5 : mutaatio rakennegeenissa, joka koodaa jotakin 30 metioniini-biosynteesitien entsyymeista, josta mutaatiosta on seurauksena metioniinin tarve. sacA321 : mutaatio rakennegeenissa, joka koodaa entsyymia, joka liittyy sakkaroosi-katabolismiin ja josta mutaatiosta on tuloksena kyvyttdmyys pilkkoa 35 sakkaroosia.
8 91885
Ultravioletti-kSsittelyn tarkoituksena oli aikaan-saada mutaatio tuntemattomassa geenissa, mista on tulok-sena kykenemåttdmyys itiiiitya. Mutantti-BAS8 tuottaa va-hemmån kuin yhden itidn 107 bakteeria kohti edelia kuvatus-5 sa itidmuodostusvaiiaineessa, kun taas Bacillus subtilis BGSC 1A289 tuottaa yhden itidn kahta bakteeria kohti sa-moissa olosuhteissa. Mutantti-organismi Bacillus subtilis BAS8 sisaltaa geneettisen merkin spo-8 mutta samanaikai-sesti se on menettanyt merkit arol906 ja sacA321 mutaatio-10 prosessin aikana.
Esimerkki 3 BAS35:n, joka sisaltaa yhdistelma-DNA:n pAMYlOO, valmistus pAMYlOO DNArta kaytettiin transformoimaan BAS8 esi-15 merkissa 1 esitetylia menetelmallå ja kuten on selostettu julkaisussa "Experiments in Microbial Genetics", johon edelia viitattiin.
BAS35:n plasmidi-pysyvyys mitattiin peråkkaisilia jatkoviljelyilia 37°C:ssa taydellisessa alustassa (Difco-20 tryptoni, 1 %; Difco-hiivauute, 1 %; NaCl, 0,5 %) ilman kanamysiinia, antibioottia, jolle plasmidi pUBHO antaa resistenssin.
Ensimmainen jatkoviljely siirrostettiin naytteelia yhden yOn viljelysta, jota kasvatettiin 20 pg/ml kanamy-25 siinia lasnaollessa. Jokaiselle jatkoviljelylle tehtiin elinvoimaisuuslaskenta vaiittOmasti siirrostamisen jaikeen ja kasvun jaikeen sukupolvien lukumaaran maarittamiseksi. BAS 35:n sukupolven ika eksponentiaalisessa vaiheessa taydellisessa alustassa 37°C:ssa on 30 minuuttia.
30 Jokaisen jatkoviljelyn jaikeen amylaasi-positiivis- ten kloonien (jotka ovat sailyttaneet plasmidin) prosentti mitattiin. Tulokset olivat seuraavat: 9 91885
Sukupolvien lukumåara % Amy*-klooneja 10 100 19 100 29 90,7 5 35 58,7 46 14,4 53 4,9
Esimerkki 4 BAS72:n, BAS35:n mutantin tuottaminen, joka kSsit-10 taa mutaation tuntemattomassa geenissa, joka koodaa kasva-nutta kanamysiini-resistenssia ja plasmidi-pysyvyytta.
BAS35:tS, joka sisaitaa plasmidin pAMYlOO, joka antaa kanamysiini-resistenssin maksimivakevyydessa n.
30 pg/ml, viljeltiin yli yfin taydellisessa alustassa. II-15 man mutageeni-kSsittelyS levitettiin 0,1 ml:n naytteitå maljoille, jotka sisSlsivSt tSydellista alustaa ja tSyden-nettiin 250 pg:lla/ml kanamysiinia. Kahden pSivSn inku-boinnin jfilkeen 37°C:ssa syntyi talle kanamysiinlvSkevyy-delle resistenttejS klooneja taajuudessa 10*6 siirrostettua 20 BAS-35-solua kohti. Yksi klooni, joka on nimetty BAS72:ksi, valikoitiin resistenteista klooneista ja mutaa-tio, joka antoi lisaantyneen resistenssin kanamysiinifeno-tyypille, nimettiin irk-72:ksi. T3ma fenotyyppi sailytti pysyvyytensa useiden alaviljelyjen jaikeen antibiootin 25 poissaollessa. BAS 72:n sukupolven ika eksponentiaalises-sa vaiheessa taydellisessa vaiiaineessa 37°C:ssa on 60 mi-nuuttia.
pAMYlOO:n pysyvyys BAS72:ssa
Pysyvyys mitattiin kuten BAS35:n tapauksessa ja on 30 esitetty seuraavassa. On selvaa, etta pAMYlOO on paljon pysyvampi BAS72:ssa kuin BAS35:ssa.
91685 10
Sukupolvien lukumåårå % Amy*-klooneja 11 100 17 100 29 100 5 34 100 45 100 50 100
Esimerkkl 5 BAS73:n tuottaminen, joka kåsittåå tuntemattoman 10 geenin mutaation, joka antaa suuremman resistenssin kana-mysiinille kuin edellisesså esimerkisså.
0,1 ml:n nåyte yhden yOn viljelystå BAS72:n tåydel-lisesså alustassa (joka BAS72 on resistentti kanamysiinil-le våkevyydesså 250 pg/ml) levitettiin maljalle, joka si-15 sålsi tåydellistå alustaa, johon oli lisåtty 750 pg/ml kanamysiiniå. Antibiootin tålle våkevyydelle spontaanisti resistenttejå klooneja syntyi taajuudessa 10'6 maljalle levitettyå solua kohti. Yksi tållainen klooni puhdistet-tiin ja nimettiin BAS73:ksi. Sen resistenssi 750 pg:lle/ml 20 kanamysiiniå såilyi pysyvyydesså useiden jatkoviljelyjen jålkeen antibiootin poissaollessa.
BAS73:n sukupolven ikå eksponentiaalisessa vaihees-sa tåydellisesså våliaineessa 37°C:ssa on 60 minuuttia. pAMY100:n pysyvyys BAS73:ssa 25 Plasmidi-pysyvyys mitattiin kuten BAS35:n tapauk- sessa ja on esitetty seuraavassa. On selvåå, ettå pAMYlOO on paljon pysyvåmpi BAS73:ssa kuin BAS35:sså.
Sukupolvien lukumåårå % Amy+-klooneja 10 100 30 18 100 28 100 34 100 45 100 50 100 ti 11 91885
Esimerkki 6
Alfa-amylaasin tuottaminen Bacillus subtilis BAS 35:11¾ 1a BAS 73:11a
Nelja 20 litran fermentointilaitetta, jotka sisai-5 sivåt 15 1 viljelyalustaa, jossa oli paino/tilavuuspohjal-ta, 1 % baktopeptonia, 3 % hiivauutetta, 0,5 % glukoosia ja 0,5 % NaCl, siirrostettiin 1 %:lla esiviljelya, joka oli samassa alustassa. Esiviljelyt valmistettiin tekemaiia useita jatkoviljelyja, niin etta lopullisessa vaiheessa 10 ennen fermentointilaitteita oli tuotettu n. 35 sukupolvea. Kaksi fermentointilaitetta siirrostettiin kannalla BAS 35 kanamysiinin (5 pg/ml) lSsnåollessa ja poissaollessa ja kaksi kannalla BAS73 kanamysiinin (5 pg/ml) låsnåollessa ja poissaollessa. Fermentointilaitteita sekoitettiin kier-15 rosluvulla 250 r/min, ilmastettiin 0,15 1:11a ilmaa/l/min ja pidettiin 40°C:ssa 55 tuntia. 6 tunnin ja vielé 48 tun-nin lisSjakson jSlkeen fermentointilaitteisiin syOtettiin jatkuvasti glukoosiliuosta niin, etta fermentointilaitteisiin lisatty kokOnaisglukoosimaara oli 1,5 % (paino/ti-20 lav.). Fermentoinnin loputtua alfa-amylaasi-aktiivisuus mitattiin viljelyliemessa. Tulokset on esitetty seuraavas-sa taulukossa:
Entsyymiaktiivisuus U/ml BAS 35_BAS 73 25 + kanamysiini 220 160 - kanamysiini 80 150
Claims (7)
1. Yhdistelma-DNA, joka sisaitaa α-amylaasia koo-daavan geenln ja joka on valmistettu in vitro pilkkomalla 5 luovuttaja-mikro-organismista saatua DNA:ta ja yhdista- maiia saadut α-amylaasia koodaavan geenin sisaitåvåt DNA-fragmentit samalla tavalla pilkotun plasmadivektorin pUBHO kanssa, tunnettu siita, etta luovuttaja-mikro-organismi on Bacillus megaterium NCIB 11568 ja a-10 amylaasia koodaavan geenin sisaitavå yhdistelma-DNA on plasmidi, jonka molekyylipaino on 6,7 kb ja jonka endonuk-leaasi-restriktiokartta on kuvion 1 mukainen.
2. Menetelma geneettisesti muokatun Bacillus subti-lis-mikro-organismin valmistamiseksi viemaiia yhdistelma-
15 DNA:ta Bacillus subtilis-isantamikro-organismiin, tun nettu siita, etta yhdistelma-DNA on patenttivaatimuk-sen 1 mukainen plasmidi ja isantamikro-organismi on Bacillus subtilis-kanta, jolla on puutteellinen a-amylaasia koodaava geeni ja joka on sateilytetty mikro-organismin 20 saamiseksi, joka ei tuota itiOita.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta geneettisesti muokattu Bacillus subtilis-mikro-organismi on Bacillus subtilis NCIB 11980.
4. Menetelma mikro-organismin valmistamiseksi, joka 25 pystyy kasvamaan ravintoalustassa, joka sisaitaa vahintaan 250 pg kanamysiinia ml kohti, tunnettu siita, etta (a) viljeliaan Bacillus subtilis NCIB 11980 ravin-toalustalla, joka sisaitaa 250 pg kanamysiinia ml kohti; 30 (b) valitaan yksi tai useampi pesake, joka kasvaa mainitulla alustalla; (c) siirretaan mainitut pesakkeet uudelle ravinto-alustalle; ja (d) viljeliaan valitut pesakkeet mainitulla uudella 35 alustalla. 13 91885
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelma, tunnet t u siita, etta mikro-organismi, joka pystyy kasva-maan ravintoalustassa, joka sisaitaa vahintaan 250 pg ka-namysiinia ml kohti, on NCIB 11984.
6. Menetelma mikro-organismin valmistamiseksi, joka pystyy kasvamaan ravintoalustassa, joka sisaitaa vahintaan 750 pg kanamysiinia ml kohti, tunnettu siita, etta (a) viljeliaan patenttivaatimuksen 4 mukaisesti 10 valmistettu kanamysiiniresistentti mutantti ravintoalus- talla, joka sisaitaa 750 pg kanamysiinia ml kohti; (b) valitaan yksi tai useampi pesake, joka kasvaa mainitulla alustalla; (c) siirretaan mainitut pesakkeet uudelle alus-15 talle; ja (d) viljeliaan valitut pesakkeet mainitulla uudella alustalla.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta mikro-organismi, joka pystyy kasva-20 maan ravintoalustassa, joka sisaitaa vahintaan 750 pg kanamysiinia ml kohti, on NCIB 11985. 14 91885
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848414271A GB8414271D0 (en) | 1984-06-05 | 1984-06-05 | Recombinant dna |
| GB8414271 | 1984-06-05 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI852084A0 FI852084A0 (fi) | 1985-05-24 |
| FI852084L FI852084L (fi) | 1985-12-06 |
| FI91885B FI91885B (fi) | 1994-05-13 |
| FI91885C true FI91885C (fi) | 1994-08-25 |
Family
ID=10561932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI852084A FI91885C (fi) | 1984-06-05 | 1985-05-24 | -amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4806426A (fi) |
| EP (1) | EP0165002B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0779683B2 (fi) |
| AT (1) | ATE76902T1 (fi) |
| AU (1) | AU4313285A (fi) |
| BR (1) | BR8502681A (fi) |
| CA (1) | CA1279590C (fi) |
| DE (1) | DE3586145T2 (fi) |
| DK (1) | DK170735B1 (fi) |
| ES (2) | ES8702947A1 (fi) |
| FI (1) | FI91885C (fi) |
| GB (1) | GB8414271D0 (fi) |
| IE (1) | IE58259B1 (fi) |
| MX (1) | MX7725E (fi) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
| US5209938A (en) * | 1989-09-13 | 1993-05-11 | Cpc International Inc. | Method for retarding staling of baked goods |
| US6300115B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-09 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
| ZA81424B (en) * | 1980-02-15 | 1982-02-24 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amylolytic enzymes and process for preparing same |
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
| DK135983D0 (da) * | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Novo Industri As | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
-
1984
- 1984-06-05 GB GB848414271A patent/GB8414271D0/en active Pending
-
1985
- 1985-05-22 IE IE128785A patent/IE58259B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-23 US US06/737,311 patent/US4806426A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 FI FI852084A patent/FI91885C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-30 AU AU43132/85A patent/AU4313285A/en not_active Abandoned
- 1985-06-03 MX MX85956U patent/MX7725E/es unknown
- 1985-06-04 EP EP85303947A patent/EP0165002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 DE DE8585303947T patent/DE3586145T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 ES ES543860A patent/ES8702947A1/es not_active Expired
- 1985-06-04 AT AT85303947T patent/ATE76902T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 BR BR8502681A patent/BR8502681A/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 DK DK251485A patent/DK170735B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-05 CA CA000483212A patent/CA1279590C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-05 JP JP60120735A patent/JPH0779683B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-28 ES ES551307A patent/ES8802536A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE76902T1 (de) | 1992-06-15 |
| FI852084A0 (fi) | 1985-05-24 |
| CA1279590C (en) | 1991-01-29 |
| ES8702947A1 (es) | 1987-01-16 |
| FI91885B (fi) | 1994-05-13 |
| DE3586145D1 (de) | 1992-07-09 |
| ES543860A0 (es) | 1987-01-16 |
| JPH0779683B2 (ja) | 1995-08-30 |
| DE3586145T2 (de) | 1992-12-03 |
| JPS6119491A (ja) | 1986-01-28 |
| FI852084L (fi) | 1985-12-06 |
| IE851287L (en) | 1985-12-05 |
| GB8414271D0 (en) | 1984-07-11 |
| EP0165002A2 (en) | 1985-12-18 |
| BR8502681A (pt) | 1986-02-12 |
| EP0165002B1 (en) | 1992-06-03 |
| DK251485A (da) | 1985-12-06 |
| MX7725E (es) | 1991-01-30 |
| EP0165002A3 (en) | 1987-09-02 |
| ES551307A0 (es) | 1988-07-16 |
| DK251485D0 (da) | 1985-06-04 |
| ES8802536A1 (es) | 1988-07-16 |
| US4806426A (en) | 1989-02-21 |
| IE58259B1 (en) | 1993-08-25 |
| DK170735B1 (da) | 1995-12-27 |
| AU4313285A (en) | 1985-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1838410C (ru) | Способ получени альфа-амилазы | |
| KR100267505B1 (ko) | 형질전환 대장균 ss373 및 이를 이용한 숙신산의생산방법 | |
| Bergquist et al. | Genetics and potential biotechnological applications of thermophilic and extremely thermophilic microorganisms | |
| Kawamura et al. | Catabolite-resistant sporulation (crsA) mutations in the Bacillus subtilis RNA polymerase sigma 43 gene (rpoD) can suppress and be suppressed by mutations in spo0 genes. | |
| Dhulster et al. | Culture and bioconversion use of plasmid-harboring strain of immobilized E. coli | |
| CZ100596A3 (en) | Dna fragment, vector and micro-organism containing genes for metabolic transformation of butyrobetaine/crotonobetaine-l-carnitine and process for preparing l-carnitine | |
| FI91885C (fi) | -amylaasia koodaava yhdistelmä-DNA ja menetelmiä sitä sisältävien mikro-organismien valmistamiseksi | |
| CA2083407C (en) | Microorganisms for the stabilization of plasmids | |
| JPS6246153B2 (fi) | ||
| US5985668A (en) | Sucrose metabolism mutants | |
| EP0064680A2 (en) | Novel lysozyme-sensitive microorganism | |
| CN114891806A (zh) | 一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用 | |
| Hall et al. | [44] Acquisition of new metabolic activities by microbial populations | |
| Tonkova | Effect of glucose and citrate on α‐amylase production in Bacillus licheniformis | |
| US5747310A (en) | Gene integration into chromosomes of lactobacillus delbrueckii species and integrants thereof | |
| US20040235120A1 (en) | Method for producing vitamin b12 | |
| RU2003689C1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК рВА1418, кодирующа альфа-амилазу BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS и штамм-бактерий BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - продуцент альфа-амилазы BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS | |
| JPH0829083B2 (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
| JPH04287686A (ja) | 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ | |
| JPS6243677B2 (fi) | ||
| JPS61502939A (ja) | 選択圧なしで完全培地において培養することができる、発現ベクタ−により形質転換された菌株、特に酵母、の製造法並びにこのようにして得た菌株 | |
| KR20000067653A (ko) | 대장균 변이주 및 형질전환 대장균 및 이를 이용한 ｄ형 또는 ｌ형 젖산의 순수 생산방법 | |
| JPH03180174A (ja) | バチルス・スフエリカスにおけるビオチンの発現の改良方法 | |
| JPS6253150B2 (fi) | ||
| WO2020113365A1 (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: CPC INTERNATIONAL INC. |