JPH08289788A - 耐酸・耐熱性α−アミラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 〔配列表〕配列番号１の、耐酸・耐熱性のα
−アミラーゼの遺伝子。 【効果】 バシルス・リケニフォルミスαの生産するα
−アミラーゼをコードする遺伝子の解明により、 同酵素
のもつ耐酸・耐熱の性質と構造の関係が明らかにするこ
とができた。 この遺伝子を用いタンパク質工学的手法に
よって耐酸・耐熱性α−アミラーゼを産生することがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、pH 4〜5.5 の酸性下、
かつ 100〜110 ℃の高温でトウモロコシ澱粉を液化でき
る耐酸性と耐熱性に優れたα−アミラーゼをコードする
遺伝子に関する。本発明の遺伝子をもつα−アミラーゼ
は、澱粉をpH 5以下の酸性下で効率的かつ経済的に液化
（デキストリン化）するのに使用される。

【０００２】

【従来の技術とその問題点】澱粉からブドウ糖やマルト
ースなどのオリゴ糖の糖の製造において、澱粉は、先
ず、バシルス属細菌の生産する液化酵素（α−アミラー
ゼ）により液化され、次いで、 アスペルギルス属又はリ
ゾープス属糸状菌の生産するグルコアミラーゼ、麦芽の
β−アミラーゼなどの糖化型アミラーゼにより糖化する
ことにより製造されている。澱粉の中でも、馬鈴薯澱粉
や甘薯澱粉などの地下澱粉は、比較的容易に液化するこ
とができるが、現在、主要な原料であるトウモトコシ澱
粉は液化が困難であり、Bacillus licheniformis〔F.J.
Morganら, J.Applied Bacteriology, 50,107〜114(198
1), R.L.Antrim ら, Starch, 43,355(1991)〕あるいはB
acillus subtilis (特公昭58-34117) などのバシルス
属細菌の生産する耐熱性α−アミラーゼを用い、 ジェッ
ト・クッカー(Jet cooker)と呼ばれる装置で、pH 6〜6.
5 、103 〜110 ℃の温度に一気に加熱し、約５分間滞留
後、残存している酵素活性を用いて、90〜95℃で1.5 〜
2 時間反応を継続する方法により行われている。

【０００３】しかるに、これまで知られている耐熱性α
−アミラーゼの殆どは最適pHが 6〜9 にあり、 耐酸性に
劣るため、 澱粉液化時のpHは、 これまで、 6〜6.5 で行
われてきた。一方、 グルコースの製造において、液化澱
粉の糖化に使用されるアスペルギルス・ニガーのグルコ
アミラーゼの最適pHは4.5 付近にあるため、澱粉を、pH
6〜6.5 で液化した後、酸を添加して、 pHを4.5 付近ま
で低下させ、糖化反応を行うという非能率的な方法によ
り行なわれているのが現状である。

【０００４】また、pH 6以上の液化では、生成したデキ
ストリンの還元性末端がフラクトースに異性化され、こ
のため、グルコアミラーゼで糖化したとき、還元性末端
側のグルコース２残基がマルチュロース（グルコースと
フラクトースがα-1,4- 結合したもの）として残存する
ことになり、グルコース収量の低下をもたらすという問
題もあった〔J.K.Shetty, W.G.Allen, Cereal Foods Wo
rld,33,929(1988)〕。

【０００５】このため、 pH6 以下の酸性下で澱粉を液化
する研究が多くの研究者により行われてきた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、 このよ
うな現状に基づいて耐熱性があり、かつpH６以下の酸性
下で澱粉を液化できる酵素を得るべく探索したところ、
バシルス・リケニフォルミスの１菌株から、pH 4.5〜5
の酸性下、 かつ 103〜110 ℃の高温で、 トウモロコシ澱
粉を液化できる耐酸・耐熱性α−アミラーゼを得ること
ができた。そして、さらにこの耐酸・耐熱性α−アミラ
ーゼの遺伝子配列を解明して本発明をなすに至った。す
なわち、本発明の課題は、このような耐酸・耐熱性α−
アミラーゼをコードするα−アミラーゼ遺伝子（アミノ
酸配列）を提供することに関する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、pH 5以下の
酸性下でトウモロコシ澱粉を液化できる耐酸性と耐熱性
に優れたα−アミラーゼを、広く自然界から探索してき
た結果、バシルス・リケニフォルミスα(Bacillus lich
eniformis α）と同定した１菌株（ＦＥＲＭＢＰ−４４
８０）が最適pH約5(1 ％の可溶性澱粉の下、 80℃で30分
反応のときpH4.7〜5.3)、 最適温度90℃(1％可溶性澱粉
の下で10分反応。 5mM の塩化カルシュウムの存在下で
は、最適温度は約100 ℃) にあり、 30〜35％のトウモロ
コシ澱粉の下、 pH 4.5〜5 の酸性下、 かつ 105〜110 ℃
の高温でトウモロコシ澱粉を液化できる耐酸性と耐熱性
に優れたα−アミラーゼを菌体外に生産することを認
め、特許出願した（特願平4/329108，WO 94/13792)。

【０００８】本酵素の理化学的性質は下記に示す通りで
ある。 a) 作用及び基質特異性：澱粉のα-1,4- グルコシド結
合をエンド型で分解し、デキストリン化する。このた
め、澱粉の粘度は急激に低下し液化する。反応初期には
G₅ (グルコース５個からなるマルトペンタオース) とG₆
(グルコース６個からなるマルトヘキサオース) などを
生成するが、 最終的には、 グルコース、 マルトース、 マ
ルトトリオース、 マルトテトラオース、 マルトペンタオ
ース、 マルトヘキサオースなど一連の還元性オリゴ糖を
生成する。 本酵素はアミロペクチン又はその派生物のα
-1,6- グルコシド結合を加水分解することはできない。 b) 作用pH及び最適pH：本酵素はpH 3.5〜10の広い範囲
に作用する。 5mM 酢酸緩衝液、 1 ％可溶性澱粉の下で、
80℃で30分間反応したとき、最適作用pHは4.7 〜5.3 に
ある。 c) 作用温度及び最適温度: 本酵素は約 120℃まで作用
する。 １％可溶性澱粉を基質とし、5mM 酢酸緩衝液(pH
5.5) で10分間反応させたとき最適温度は約90℃に認め
られるが、 5mM のCaCl₂ の存在下では約100 ℃に認めら
れる。実用的な澱粉液化条件である30％の澱粉下、 かつ
カルシウムイオンの存在下では、 pH 4.3〜5、90〜105 ℃
で澱粉を液化することができる。 c) pH 安定性: 50 ℃、1 時間の処理で、pH約5 〜約10
において安定である。 pH約4.5 〜約11で80％以上の活性
が保持される。 e) 熱安定性: 5mM酢酸緩衝液(pH5.5) の下、 各温度で
10分間加熱したとき、 90℃まで失活が認められない。 10
0 ℃、 10分の加熱で約50％の失活が認められるが、 基質
及びCaCl₂ の存在下で安定化される。 例えば、 5mM のCa
Cl₂ の存在下では100 ℃で10分加熱しても失活が認めら
れず、 また30分加熱後も殆ど失活が認められない。 f) 分子量: セファデックスG-75を用いたゲル濾過法
により測定した分子量は約9,000 である。 g) 安定化: Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Na⁺ などの存在下で熱
失活から保護される。

【０００９】h) 阻害剤: Zn²⁺、 Hg²⁺、 Ag²⁺、 Cu²⁺、 Fe
²⁺、 Al³⁺などにより阻害される。 i)精製法: 培養液上澄から、トウモロコシ澱粉吸着、炭
酸ナトリウムによる溶出、DEAE−セルロールカラムクロ
マトグラフィーとセファデックスG-100 カラムクロマト
グラフィーなどの精製手段により電気泳動的に均一まで
精製することができる。

【００１０】i) 活性測定法 (a) ヨウ素法（糊精化力); 0.1M酢酸緩衝液に溶解した
1 ％可溶性澱粉液(pH5.0)0.5mlに該酵素溶液の適量加
え、蒸溜水で全量1.0ml とし、90℃で反応させる。15分
間反応後、ヨウ素溶液〔ヨウ素液(0.2ｇI₂＋2g KI) 2.5
mlと0.1M HCl 10mlを100ml としたもの〕5ml を加えて
反応を停止させると共に、ヨウ素呈色し、15分放置後、
660nm で比色する。この条件で、 1 分間に1 ％の青色を
褪色する酵素量を1 単位とする。 (b) 粘度法 (糊精化力); JIS K 7001_-1990 に準じて行
った。 すなわち、 ポテト澱粉1gを含む0.1M酢酸緩衝液(p
H5.0)10ml に、 酵素液を1ml 加え、 65℃で反応する。 粘
度比較液として、 シリコーン油( ジメチルポリシロキサ
ン) を用い、 15分間で同じ粘度とする酵素量を1 単位と
する。 (c) 還元糖定量法( 糖化力); 0.1M 酢酸緩衝液に溶解し
た1 ％可溶性澱粉液(pH5.0) 0.5ml に該酵素水溶液の適
量加え、蒸溜水で全量1.0ml とし、90℃で反応させ、 生
成した還元糖をソモギー・ネルソン法により定量する。
この条件で1 分間に1 マイクロモルのグルコースに相当
する還元糖を生成する酵素量を1 単位とする。

【００１１】その後、この酵素の耐酸性と耐熱性の性質
について、酵素の構造との関係を知るべく、更に、検討
を行った。すなわち、該バシルス・リケニフォルミスα
株から耐酸・耐熱性α−アミラーゼをコードする遺伝子
を単離し、構造を決定し、そして、公知のバシルス・リ
ケニフォルミス等の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子と比較
検討した結果、本発明のα−アミラーゼ遺伝子には異な
ったアミノ酸をコードする塩基配列のあることがわか
り、本発明を完成するに至った。

【００１２】すなわち、本発明は、バシルス・リケニフ
ォルミスのアミラーゼのアミノ酸配列においてＮ末端よ
り134 位がＬ−アルギニンに、310 位がグリシンに、32
0 位がＬ−アラニンに変異されたアミノ酸配列をコード
する塩基配列をもつバシルス・リケニフォルミスα−ア
ミラーゼ遺伝子に関する。さらに、具体的には、本発明
は図１及び図２に連続して示される塩基（アミノ酸）配
列をコードするバシルス・リケニフォルミスα−耐酸・
耐熱性α−アミラーゼ遺伝子に関するものである。この
遺伝子の塩基配列は〔配列表〕配列番号１に表されてい
る。

【００１３】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の遺伝子の単離に使用されたバシルス・リケニフォ
ルミスαは、以下の菌学的性質を有し、工業技術院生命
工学工業技術研究所（元微生物工業技術研究所）に微工
研菌寄第13286 号（FERM P-13286）として寄託され、後
にブタペスト条約による同所国際受託番号FERM BP-4480
として寄託されている。

【００１４】(1) 形態： 桿菌 (2) グラム染色性：＋ (3) 運動性：＋ (4) 芽胞： 胞子嚢: 非膨出 形: 楕円形 位置: 中立〜亜端立 (5) カタラーゼ：＋ (6) 嫌気下での生育: ＋ (7) V-P 反応: ＋ (8) V-P ブロスのpH: 5.3 (9) グルコースからの酸の産生: ＋ (10) グルコースよりガスの生成：− (11) ゼラチンの液化：＋ (12) 澱粉の分解：＋ (13) クエン酸の利用： ＋ (14) プロピオン酸塩の利用: ＋ (15) 卵黄反応: − (16) 硝酸塩の還元：＋ (17) pH6.8 での生育（ニュートリエントブロス): ＋ (18) pH5.7 での生育: ＋ (19) ５％NaCl存在下での生育: ＋ (20) ７％NaCl存在下での生育: ＋ (21) 10℃での生育: − (22) 30℃での生育: ＋ (23) 55℃での生育: ＋ (24) 65℃での生育: −

【００１５】以上の菌学的性質について、 Bergey's Man
nual of Determinative Bactgeriology,第７版及び第８
版を参照し、本菌をバシルス・リケニフォルミス（Baci
lluslicheniformis)に近縁の微生物と同定し、 本菌をバ
シルス・リケニフォルミスα(Bacillus licheniformis
α) と命名した。

【００１６】バシルス・リケニフォルミスα〔微工研菌
寄第13286 号（FERM BP-4480）〕の培養は、特開平4/32
9108）記載の方法により行い、また、同細胞からのゲノ
ムDNA の調製、制限酵素処理、プラスミドベクターとの
連結、大腸菌（Escherichiacoli）への形質転換は、松
村正実編ラボマニュアル遺伝子工学 第19〜133 頁（丸
善株式会社 1990年）により行った。

【００１７】すなわち、該菌株の培養液を8000 rpmで 5
分間遠心分離して集菌し湿細胞を得る。該湿細胞を10mM
トリス-HCl緩衝液（１mM EDTA と100mM NaClを含む、pH
8.0）に懸濁し、リゾチーム処理してDNA を抽出する。
プロティナーゼ Kとリボヌクレアーゼにより処理し、次
いで、フェノール抽出、クロロホルム抽出などの方法で
精製し、エタノール沈殿法により濃縮し、純化したDNA
を得た。

【００１８】該DNA を、10mMトリス-HCl緩衝液(1mMEDTA
を含む）に溶解し、制限酵素 EcoRIにより切断し、染色
体断片を得た。

【００１９】別にプラスミド pUC19を制限酵素EcoRI で
切断した。

【００２０】これらDNA 断片を、ATP 、MgCl₂ とジチオ
スレイトールの存在下、T4 DNAリガーゼにより連結し
た。

【００２１】得られた組換え体DNA を、常法により、塩
化カルシウムの存在下、大腸菌（Escherichia coli）に
形質転換した。

【００２２】組換え体DNA を保持する大腸菌を、バクト
トリプトン１％、酵母エキス 0.5％、食塩１％、可溶性
澱粉１％、アンピシリン30μg/mlを含む寒天培地に塗布
し、37℃で1 〜2 夜インキュベートし、コロニー周辺に
生ずるハローを沃度ー澱粉反応により検索した。

【００２３】以上の操作により、耐酸・耐熱性α−アミ
ラーゼ遺伝子生産能を有する大腸菌株を得ることができ
た。

【００２４】大腸菌形質転換体からの組換え体プラスミ
ドの抽出、精製は、前述の松村正実編ラボマニュアル遺
伝子工学（丸善株式会社、 1990年）51〜55頁により行
い、また、DNA のシークエンシングはA.L.F.ＴＭ型自動
DNAシークエンサー（ファルマシア社製品）及びオート
サイクルシークエンスキット（ファルマシア社製品）を
用いて行った。

【００２５】バシルス・リケニフォルミスαから抽出、
精製した染色体DNA には制限酵素SacI、XbalI 、HindII
I 、PstIサイトが少なくとも１個所存在した。しかし、
制限酵素SalIとKpnII は耐酸・耐熱性α−アミラーゼ遺
伝子を切断した。

【００２６】組換え体DNA を含む大腸菌を培養して耐酸
・耐熱性α−アミラーゼを生産するには、窒素源とし
て、ポリペプトン、ポリペプトンＳ、バクトペプトン。
酵母エキスなどが、炭素源として、乳糖、可溶性澱粉な
どが使用され、その他、必要に応じ、食塩、リン酸塩、
マグネシウム塩などが添加された液体培地が使用され
る。大腸菌に、組換え体プラスミドを安定に保持させる
ため、例えば、pUC19 ベクターの場合、アンピシリン
を、培地に対し、30μg/ml程度添加される。該α−アミ
ラーゼは菌体内に生産されるため、培養後、超音波処
理、リゾチーム処理などにより抽出される。

【００２７】なお、耐酸・耐熱性α−アミラーゼ遺伝子
を組み込んだ組み換え体DNA を含む大腸菌を培養して得
られた耐酸・耐熱性α−アミラーゼの酵素的性質は特願
平4/329108に記載の耐酸・耐熱性α−アミラーゼの酵素
的性質と同じであった。

【００２８】以下、 実施例により本発明の内容を更に具
体的に説明するが、 本発明の範囲はこれら実施例に限定
されるものでない。

【００２９】

【実施例１】 １）バシルス・リケニフォルミスα染色体DNA の調製 バクトトリプトン１％、 可溶性澱粉１％、 酵母エキス0.
1 ％、MgSO₄ ・7H₂O0.1 ％、 K₂HPO₄ 0.2％からなる培地
3mlを径18mmの試験管に入れ、 121 ℃で10分間殺菌後、
バシルス・リケニフォルミスα (微工研菌寄第 13286号
(ブタペスト条約による国際寄託番号 FERM BP-4480)を
接種し、30℃で２日間振盪培養した。培養液を8000rpm
で５分間遠心し、菌体を、10m Ｍトリス-HCl緩衝液（1m
M EDTAと100mM NaClを含む、pH8.0) 250μl に懸濁し、
50mg/ml リゾチーム液50μl を加え，37℃で30分間処理
した。10％ N- ラウロイルサルコシン酸ナトリウム80μ
l 、20mg/ml プロティナーゼK 1μl 、10mg/ml リボヌ
クレアーゼA 1μl を加え、42℃で２時間処理して、そ
れぞれ、タンパク質とRNA を分解除去した後、フェノー
ル抽出、クロロホルム抽出を行った。該抽出液に、99.5
％エタノール 1mlを加えてDNA を沈殿させ、70％エタノ
ールで洗滌後、減圧乾燥した。

【００３０】２）染色体DNA の制限酵素処理 １）により調製した染色体DNA を、10mM トリス-HCl緩
衝液（1mM EDTAを含む、pH8.0 ）に溶解した液 5μl
に、10mMトリス緩衝液（500mM NaCl，100mM MgCl₂ と1m
M ジチオスレイトールを含む）4 μl 、滅菌水30μl と
制限酵素Eco RI（和光純薬工業販売）を、DNA 1 μg 当
たり5 単位を加え、37℃で8 〜12時間処理した。該処理
液にエタノールを加え、DNA 断片の沈殿物を得た。

【００３１】３）組換え体プラスミドの作成 プラスミドpUC19 （宝酒造販売)2μg に、制限酵素EcoR
I 20単位、50mM NaCl、100mM トリス-HCl(pH7.5）、10m
M MgCl₂、1mM ジチオスレイトールを加え、37℃で１時
間処理した。消化液から、常法によりフェノール抽出、
クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、制限酵素Ec
o RIで処理されたプラスミドpUC19 を得た。EcoRI 処理
したプラスミドpUC19 1 μg に、上記２）により調製し
たバシルス・リケニフォルミスαの染色体断片約1 μg
、T4 DNAリガーゼ（和光純薬工業（株）販売）5 単
位、66mM トリス-HCl（pH7.9)、66mM MgCl₂、10mM ジチ
オスレイトールと66mM ATPを加え、16℃で連結反応を行
った。

【００３２】４）大腸菌JM109 株への形質転換 ３）により得られた組換え体DNA を、Hanahan 法〔J.Mo
lecular Biology,166,557(1983) 〕に従って、大腸菌
（ Escherichia coli )JM109株に形質転換し、アンピシ
リン 30 μg/mlを含む寒天培地（バクトトリプトン 1
％、酵母エキス0.5％、食塩1 ％、可溶性澱粉１％、ア
ンピシリン30μg/mlを含む）に塗布し、37℃で１夜培養
した。生育したコロニーについて、ヨウ素ー澱粉反応に
より、コロニー周辺にハローを形成した菌株数株を分離
した。これらの菌株はいずれも耐酸・耐熱性α−アミラ
ーゼを菌体内に生産する形質転換株であることを確認し
た。

【００３３】５）組換え体プラスミドの単離 ４）により得られた形質転換株を、バクトトリプトン 2
％、酵母エキス0.5 ％、食塩 1％、アンピシリン30μg/
ml含む培地 4mlに接種し、30℃で１夜振盪培養し、これ
を種母として、同培地100ml を入れた500ml 容肩付きフ
ラスコに添加し、37℃で１夜振盪培養した。培養液から
遠心分離（8000rpm で5 分）により集菌し、湿菌体を得
た。該湿菌体からのプラスミド DNAの抽出は、松村正実
編ラボマニュアル遺伝子工学（丸善株式会社53〜54頁、
1990年）に記載の「 アルカリ法」 により行った。組み換
え体プラスミドを制限酵素EcoRI で処理した結果、 3.4k
b(キロベース)の異種DNA 断片が確認された。

【００３４】６） DNAシークエンシング 耐酸・耐熱性α−アミラーゼをコードするDNA 断片の塩
基配列の決定は、A.L.F.TM型自動DNA シークエンサー
（ファルマシア社製品）及びオートサイクルシークエン
シング キット（ファルマシア製品）を用いて行った。

【００３５】図１及び図２（〔配列表〕配列番号１）は
公知のバシルス・リケニフォルミスの遺伝子と対比し、
解析した本発明の耐酸・耐熱性α−アミラーゼ遺伝子の
塩基（アミノ酸）配列を示している。

【００３６】図１及び図２のバシルス・リケニフォルミ
スαの耐酸・耐熱性α−アミラーゼの塩基（アミノ酸）
配列を、公表されている次の文献記載のバシルス・リケ
ニフォルミスの２種の耐熱性α−アミラーゼの塩基（ア
ミノ酸）配列と比較検討した結果、表１に示す差異が認
められた。

【００３７】

【表１】

【００３８】[文献] 1) Yuuki,T.,Nomura,T.,Tezyka,H.,Tsuboi,A.,Yamagat
a,H.,Tsukagoshi,N., Udaka,S., J.Biochem.,98,1147-1
156(1985) 2) Gray,G.L.,Mainzer,S.E.,Rey,M.W.,Lamsa,M.H., J.B
acteriol.,166, 635-643(1986)

【００３９】すなわち、本発明の耐酸・耐熱性α−アミ
ラーゼ、文献1)記載のB.licheniformis ATCC 27811のα
−アミラーゼ及び文献2)記載のB.licheniformis NCIB 8
061のα−アミラーゼの遺伝子は、いずれも 483個のア
ミノ酸残基からなり、シグナル配列も同じく29個のアミ
ノ酸配列からなるが、成熟α−アミラーゼのＮ末端よ
り、 134位、 310位と 320位のアミノ酸残基が、本発明
の酵素の場合、それぞれＬ−アルギニン、グリシン、Ｌ
−アラニンであるのに対して、B.licheniformisATCC 27
811のα−アミラーゼの場合、それぞれＬ−アルギニ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニンであり、B.licheniformi
s NCIB 8061 のα−アミラーゼの場合、それぞれＬ−ロ
イシン、グリシンとＬ−セリンである。

【００４０】表２は、B.licheniformis ATCC 27811とB.
licheniformis NCIB 8061 のα−アミラーゼの性質の概
要を示している。

【００４１】

【表２】

【００４２】すなわち、B.licheniformis ATCC 27811の
α−アミラーゼの最適pHは５−８にあるが、最適温度は
76℃である。一方、B.licheniformis NCIB 8061 のα−
アミラーゼは最適温度は90℃にあるが、最適pHは７−９
である。従って、少なくともこの３つ位置（Ｎ末端よ
り、 134位、 310位と 320位) のアミノ酸の差異が、本
酵素の耐酸性と耐熱性の発現に寄与しているものと推定
された。

【００４３】

【実施例２】実施例１で得られた組換え体プラスミドを
含む大腸菌（E.coli）による耐酸・耐熱性α−アミラー
ゼの生産と性質の検討を行った結果について記載する。
該E.coliを、バクトトリプトン 1％、酵母エキス0.5
％、食塩 1％、乳糖１％、アンピシリン30μg/ml含む培
地 4mlに接種し、30℃24時間振盪培養し、これを種母と
して、同組成の培地100ml を入れた 500ml容肩付きフラ
スコに添加し、37℃で24時間振盪培養した。培養液から
遠心分離（8000rpm で5 分）により集菌し、蒸溜水で洗
滌後、蒸溜水に懸濁し、20KCの超音波細胞破砕機で破砕
して菌体抽出液を得た。その結果、生産されたα−アミ
ラーゼは培養液１ml当たり、19.5単位（還元糖定量法）
であった。 該抽出液中のα−アミラーゼを100 ｇのトウモロコシ澱
粉に吸着させ、0.2M炭酸ナトリウム溶液で溶出し、酢酸
でpH5.5 に中和後、限外濾過膜（アミコン社製YM-3）を
用いて脱塩、濃縮した。該酵素標品を用いて、特願平4/
329108記載の方法と同様にして、最適pH、最適温度、温
度安定性、pH安定性、金属イオンの影響などについて試
験した結果、親株（B.licheniformis α FRRM P-13286)
のそれと同じであった。また、105 ℃、5 分の一次液
化、95℃で90〜120 分間の二次液化によるトウモロコシ
澱粉の液化を行った結果、親株の酵素と同様に液化する
ことができた。

【００４４】

【発明の効果】バシルス・リケニフォルミスαの生産す
るα−アミラーゼをコードする遺伝子の解明により、 同
酵素のもつ耐酸・耐熱の性質と構造の関係が明らかにす
ることができた。 その結果、この遺伝子を使用すること
によってタンパク質工学的手法により耐酸・耐熱性のα
−アミラーゼを産生することができる。

【００４５】

【配列表】

配列番号： 1 配列の長さ： 1539 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： genomic DNA 起源 生物名：バチルス・リケニホルミス（Bacillus lichen
iformis) 種名：リケニホルミス 配列 -80 -70 -60 ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCC MetLysGlnGlnLysArgLeuTyrAla -50 -40 -30 -20 -10 -1 CGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCAGCGGCG ArgLeuLeuThrLeuLeuPheAlaLeuIlePheLeuLeuProHisSerAlaAlaAlaAla +1 10 20 30 40 50 60 GCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACATGCCCAATGACGGCCAA AlaAsnLeuAsnGlyThrLeuMetGlnTyrPheGluTrpTyrMetProAsnAspGlyGln 70 80 90 100 110 120 CATTGGAAGCGCTTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTC HisTrpLysArgLeuGlnAsnAspSerAlaTyrLeuAlaGluHisGlyIleThrAlaVal 130 140 150 160 170 180 TGGATTCCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGAC TrpIleProProAlaTyrLysGlyThrSerGlnAlaAspValGlyTyrGlyAlaTyrAsp 190 200 210 220 230 240 CTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTACGGCACAAAA LeuTyrAspLeuGlyGluPheHisGlnLysGlyThrValArgThrLysTyrGlyThrLys 250 260 270 280 290 300 GGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGAT GlyGluLeuGlnSerAlaIleLysSerLeuHisSerArgAspIleAsnValTyrGlyAsp 310 320 330 340 350 360 GTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGCTGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTC ValValIleAsnHisLysGlyGlyAlaAspAlaThrGluAspValThrAlaValGluVal 370 380 390 400 410 420 GATCCCGCTGACCGCAACCGCGTAATTTCAGGAGAACACCGAATTAAAGCCTGGACACAT AspProAlaAspArgAsnArgValIleSerGlyGluHisArgIleLysAlaTrpThrHis 430 440 450 460 470 480 TTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTGGTACCATTTT PheHisPheProGlyArgGlySerThrTyrSerAspPheLysTrpHisTrpTyrHisPhe 490 500 510 520 530 540 GACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAG AspGlyThrAspTrpAspGluSerArgLysLeuAsnArgIleTyrLysPheGlnGlyLys 550 560 570 580 590 600 GCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGAC AlaTrpAspTrpGluValSerAsnGluAsnGlyAsnTyrAspTyrLeuMetTyrAlaAsp 610 620 630 640 650 660 ATCGATTATGACCATCCTGATGTCGCAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCC IleAspTyrAspHisProAspValAlaAlaGluIleLysArgTrpGlyThrTrpTyrAla 670 680 690 700 710 720 AATGAACTGCAATTGGACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAAATTTTCTTTT AsnGluLeuGlnLeuAspGlyPheArgLeuAspAlaValLysHisIleLysPheSerPhe 730 740 750 760 770 780 TTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCT LeuArgAspTrpValAsnHisValArgGluLysThrGlyLysGluMetPheThrValAla 790 800 810 820 830 840 GAATATTGGCAGAATGACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAAT GluTyrTrpGlnAsnAspLeuGlyAlaLeuGluAsnTyrLeuAsnLysThrAsnPheAsn 850 860 870 880 890 900 CATTCAGTGTTTGACGTGCCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGC HisSerValPheAspValProLeuHisTyrGlnPheHisAlaAlaSerThrGlnGlyGly 910 920 930 940 950 960 GGCTATGATATGAGGAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCCGTTGAAAGCG GlyTyrAspMetArgLysLeuLeuAsnGlyThrValValSerLysHisProLeuLysAla 970 980 990 1000 1010 1020 GTTACATTTGTCGATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTCGACTGTCCAA ValThrPheValAspAsnHisAspThrGlnProGlyGlnSerLeuGluSerThrValGln 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ACATGGTTTAAGCCGCTTGCTTACGCTTTCATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAG ThrTrpPheLysProLeuAlaTyrAlaPheIleLeuThrArgGluSerGlyTyrProGln 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GTTTTCTACGGGGATATGTACGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTG ValPheTyrGlyAspMetTyrGlyThrLysGlyAspSerGlnArgGluIleProAlaLeu 1150 1160 1170 1180 1190 1200 AAACACAAAATTGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGGAGCACAGCAT LysHisLysIleGluProIleLeuLysAlaArgLysGlnTyrAlaTyrGlyAlaGlnHis 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GATTATTTCGACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCA AspTyrPheAspHisHisAspIleValGlyTrpThrArgGluGlyAspSerSerValAla 1270 1280 1290 1300 1310 1320 AATTCAGGTTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTC AsnSerGlyLeuAlaAlaLeuIleThrAspGlyProGlyGlyAlaLysArgMetTyrVal 1330 1340 1350 1360 1370 1380 GGCCGGCAAAACGCCGGTGAGACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTT GlyArgGlnAsnAlaGlyGluThrTrpHisAspIleThrGlyAsnArgSerGluProVal 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GTCATCAATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACGGCGGGTCGGTTTCAATTTAT ValIleAsnSerGluGlyTrpGlyGluPheHisValAsnGlyGlySerValSerIleTyr 1450 GTTCAAAGATAG ValGlnArg***

【図面の簡単な説明】

【図１】バシルス・リケニフォルミスαの耐酸・耐熱性
α−アミラーゼの塩基配列とこれに基づくアミノ酸配列
を連続して示す。

【図２】バシルス・リケニフォルミスαの耐酸・耐熱性
α−アミラーゼの塩基配列とこれに基づくアミノ酸配列
を連続して示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バシルス・リケニフォルミスのアミラー
   ゼのアミノ酸配列においてＮ末端より134 位がL-アルギ
   ニンに、310 位がグリシンに、320 位がL-アラニンに変
   異されたアミノ酸配列をコードする塩基配列をもつバシ
   ルス・リケニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 遺伝子が下記に示されるアミノ酸配列を
   コードするものである請求項１記載のバシルス・リケニ
   フォルミスα−アミラーゼ遺伝子。ただし、アミノ酸は
   一文字表記で表す。 10 20 30 40 50 60 ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYD 70 80 90 100 110 120 LYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVEV 130 140 150 160 170 180 DPADRNRVISGEHRIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFQGK 190 200 210 220 230 240 AWDWEVSNENGNYDYLMYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSF 250 260 270 280 290 300 LRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGG 310 320 330 340 350 360 GYDMRKLLNGTVVSKHPLKAVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQ 370 380 390 400 410 420 VFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVA 430 440 450 460 470 480 NSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIY VQR
3. 【請求項３】 〔配列表〕配列番号１で示される塩基配
   列をもつ請求項１記載のバシルス・リケニフォルミスα
   −アミラーゼ遺伝子。