ES2263209T3 - Proceso de conversion del almidon usando isoamilasas termoestables de sulfolobus. - Google Patents
Proceso de conversion del almidon usando isoamilasas termoestables de sulfolobus.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un procedimiento de conversión de almidón del tipo que incluye una etapa de desrramificación en la que se utiliza una isoamilasa activa en las condiciones dominantes del procedimiento para desrramificar el almidón y al uso de isoamilasas termoestables para la conversión de almidón. La invención se refiere también a una isoamilasa aislada obtenida de una cepa del género Rhodothermus y a secuencias clonadas de ADN que codifican isoamilasas provenientes de una cepa Rhodothermus o Sulfolobus, a vectores de expresión que comprenden dicha secuencia de ADN, células huésped que comprenden dichos vectores de expresión y finalmente a procedimientos para producir dichas isoamilasas.
Description
Proceso de conversión del almidón usando
isoamilasas termoestables de sulfolobus.
La invención se refiere a una isoamilasa
aislada, a secuencias de ADN clonadas que codifican isoamilasas, a
vectores de expresión que comprenden dicha secuencia de ADN, a
células huéspedes que comprenden tales vectores de expresión, y
finalmente a métodos para producir dichas isoamilasas.
Almidones tales como maíz, patata, trigo,
mandioca y almidón de arroz son usados como el material precursor
en la producción a gran escala comercial de azúcares, tales como
jarabe rico en fructosa, jarabe rico en maltosa, maltodextrinas
amilosa, trehalosa, G2-G8 oligosacáridos (incluso
oligosacáridos funcionales) y otros productos glúcidos tales como
los sustituyentes de grasa.
El almidón normalmente consiste en
aproximadamente el 80% de amilopectina y el 20% de amilosa. La
amilopectina es un polisacárido ramificado donde cadenas lineales
de residuos de \alpha-1,4
D-glucosa son unidos por enlaces
\alpha-1,6-glucosídicos. La
amilopectina es parcialmente degradada por
\alpha-amilasa que hidroliza los enlaces
1,4-\alpha-glucosídicos en
oligosacáridos ramificados y lineales. La degradación prolongada de
amilopectina por \alpha-amilasa ocasiona la
formación de las llamadas dextrinas \alpha-límite
que no son susceptibles de hidrólisis adicional por la
\alpha-amilasa. Los oligosacáridos ramificados
pueden ser hidrolizados en oligosacáridos lineales por una enzima
desramificante. Los oligosacáridos ramificados restantes pueden ser
lentamente despolimerizados a D-glucosa por
glucoamilasa. La glucoamilasa hidroliza rápidamente los
oligosacáridos lineales en D-glucosa.
La amilosa es un polisacárido lineal formado por
unidades de D-glucopiranosa enlazadas entre sí por
enlaces \alpha-1,4 glucosídicos. La amilosa está
degradada en oligosacáridos lineales por la
\alpha-amilasa que son despolimerizados
rápidamente en D-glucosa por la glucoamilasa.
La \alpha-amilasa (E.C.
3.2.1.1) con el nombre sistemático de
1,4-\alpha-D-glucan
glucanohidrolasa es capaz de hidrolizar almidón y otros oligo y
polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y
ramificados. La \alpha-amilasa actúa en el
sustrato de una manera aleatoria. Los grupos de reducción están
liberados en la \alpha-configuración.
Las enzimas desramificantes, que pueden atacar
amilopectina están divididas en dos clases: Isoamilasas (E.C.
3.2.1.68) y pululanasas (E.C. 3.2.1.41), respectivamente. La
isoamilasa hidroliza enlaces ramificados
\alpha-1,-6-D-glucosídicos
en amilopectina y dextrinas \beta-límite y puede
ser distinguida de las pululanasas por la incapacidad de la
isoamilasa de atacar pululano, y por la acción limitada en
dextrinas \alpha-límite.
Glucoamilasa o glucan
1,4-\alpha-glucosidasa (E.C.
3.2.1.3) hidroliza los residuos terminales enlazados en 1,4 de
\alpha-D-glucosa sucesivamente de
las extremidades sin reducir de las cadenas con liberación de
\beta-D-glucosa. La enzima puede
también hidrolizar lentamente enlaces
1,6-\alpha-D-glucosídicos
en isomaltosa, panosa y oligosacáridos relacionados.
Un proceso de conversión de almidón
"tradicional" degradando almidón en componentes glúcidos de
peso molecular bajo tales como azúcares o sustituyentes de grasa
incluye una fase desramificante.
En el caso de convertir el almidón en un azúcar
el almidón será despolimerizado. Este proceso de despolimerización
consiste en una fase de pretratamiento y dos o tres fases de
proceso consecutivo, es decir, un proceso de licuefacción, un
proceso de sacarificación y, dependiendo del producto final
deseado, opcionalmente un proceso de isomerización.
El almidón natural consiste en gránulos
microscópicos que son insolubles a la temperatura ambiente del
agua. Cuando una pasta de almidón acuoso se calienta, los gránulos
se hinchan y con el tiempo estallan, dispersando las moléculas de
almidón en la solución. Durante este proceso de
"gelatinización" hay un aumento espectacular de la viscosidad.
Puesto que el nivel de sólidos es del 30-40% en un
proceso normalmente industrial, el almidón tiene que ser estrechado
o "licuado" de modo que pueda ser manipulado. Esta reducción
de la viscosidad es hoy principalmente obtenida por degradación
enzimática.
Durante la fase de licuefacción, el almidón de
cadena larga es degradado en unidades (maltodextrinas) ramificadas
y lineales más cortas por una \alpha-amilasa (p.
ej. Termamyl™). El proceso de licuefacción se realiza a
105-110ºC durante 5 a 10 minutos seguidos de
1-2 horas a 95ºC. El pH se extiende entre 5.5 y
6.2. Para asegurar una estabilidad enzimática óptima bajo estas
condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones calcio
libres). Después de este tratamiento el almidón licuado tendrá un
" equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15.
Después del proceso de licuefacción las
maltodextrinas son convertidas en dextrosa por adición de una
glucoamilasa (p. ej. AMG™) y una enzima desramificante, tal como
una isoamilasa (patente estadounidense 4.335.208) o una pululanasa
(p. ej. Promozyme(tm)) (patente estadounidense 4.560.651).
Antes de esta fase el pH es reducido a un valor inferior a 4.5,
manteniendo la temperatura alta (superior a 95ºC) para inactivar la
\alpha-amilasa liquefactante para reducir la
formación de oligosacáridos cortos llamados "precursores de
panosa" que no pueden ser hidrolizados adecuadamente por la
enzima desramificante.
La temperatura es reducida a 60ºC, y la
glucoamilasa y la enzima desramificante son agregadas. El proceso
de sacarificación procede durante 24-72 horas.
Normalmente, cuando se desnaturaliza la
\alpha-amilasa después de la fase de licuefacción
alrededor de un 0.2-0.5% del producto de
sacarificación es el trisacárido ramificado
6^{2}-\alpha-glucosil maltosa
(panosa) que no puede ser degradado por una pululanasa. Si la
amilasa activa de la fase de licuefacción está presente durante la
sacarificación (es decir sin desnaturalización), este nivel puede
ser de hasta un 1-2%, lo cual es muy indeseable
puesto que reduce el rendimiento de la sacarificación
significativamente.
Cuando el producto de azúcar final deseado es p.
ej. jarabe rico en fructosa, el jarabe de dextrosa puede ser
convertido en fructosa. Después del proceso de sacarificación, el
pH es aumentado hasta un valor en la gama de 6-8,
preferiblemente a pH 7.5, y el calcio es quitado por intercambio
fónico. El jarabe de dextrosa es luego convertido en jarabe rico en
fructosa usando, p. ej., una glucosaisomerasa inmovilizada (tal
como Sweetzyme™).
Un "sustituto de la grasa" es un
carbohidrato del tipo de la grasa que es usado como una sustitución
funcional de grasa en alimentos. Los sustituyentes de la grasa
normalmente consisten en amilosa de cadena corta de polímeros
lineales que contienen de aproximadamente 15 a 65 unidades de
anhidroglucosa enlazadas por enlaces
\alpha-1,4-D-glucosídicos.
Tales sustituyentes de grasa pueden ser producidos por
desramificación enzimática del almidón. Los métodos para degradar
los enlaces
\alpha-1,6-D-glucosídicos
del almidón para formar la amilosa de peso molecular bajo y de
cadena corta mediante el uso de enzimas desramificantes están
descritos en p. ej. patente estadounidense nº. 3.730.840
(Sugimoto), patente estadounidense nº. 3.881.991 (Kurimoto) y
patente estadounidense nº. 3.879.212 (Yoshida). Otro método para
producir amilosa de cadena corta para ser usada como un sustituto
de grasa está descrito en EP 0.486.936-A1 (National
Strach and Chemical Investment Holding Corporation).
La invención se refiere a una isoamilasa
termoestable nueva adecuada para el uso en el proceso de conversión
del almidón según la invención.
Con respecto a la invención la expresión
"conversión del proceso del almidón" incluye todos los
procesos en los que el almidón es degradado en componentes glúcidos
con un peso molecular inferior.
En el primer aspecto la invención se refiere a
una enzima aislada que muestra actividad de isoamilasa según la
reivindicación 2.
En un segundo aspecto la invención se refiere a
una secuencia de ADN clonada según la reivindicación 1.
En un tercer aspecto la invención se refiere al
uso de una isoamilasa en procesos de conversión del almidón.
\newpage
Figura 1 muestra el mapa de la enzima de
restricción de pRI5A, el plásmido que comprende la isoamilasa de
Rhodothermus marinus.
Figura 2 muestra la curva de pH de la isoamilasa
de R. marinus.
Figura 3 muestra la curva de temperatura de la
isoamilasa de R. marinus.
Figura 4 muestra el vector de expresión,
pFSl82.
Figura 5 muestra la curva de pH de la isoamilasa
de Sulfolobus acidocaldarius.
Figura 6 muestra la curva de temperatura de la
isoamilasa de S. acidocaldarus.
Figura 7 muestra el efecto de añadir la
isoamilasa de R. marinus durante la conversión de almidón en
los rendimientos de DP1, DP2, DP3 y DP4+.
Es el objetivo de la presente invención el hecho
de proporcionar una isoamilasa termoestable nueva adecuada para el
uso en el proceso de la invención de conversión del almidón.
Los presentes inventores han encontrado que el
logro del objeto de la invención mencionado arriba requiere una
enzima desramificante de isoamilasa que sea activa en la condición
predominante del proceso.
En el caso de un proceso de despolimerización
del almidón, la isoamilasa debería ser activa durante la
licuefacción. Esto significa que las isoamilasas son
sustancialmente activas a temperaturas de licuefacción, que se
extienden de 95-110ºC, especialmente alrededor de
105ºC, a un pH en la gama entre 4.5 y 6.5, especialmente alrededor
de
pH 5.5.
pH 5.5.
En el contexto de la invención
"sustancialmente activa" significa que la actividad enzimática
relativa de la isoamilasa es al menos del 50%, en particular al
menos el 60%, especialmente al menos el 70%, así como al menos el
90%, o al menos el 95%, así como al menos el 99%, a 100ºC a pH 5.5
en comparación con la actividad relativa en la temperatura
óptima.
Cuando la desramificación tiene lugar durante la
licuefacción con la acción de una \alpha-amilasa
la formación de los precursores de panosa es reducida. Reduciendo
la formación de precursores de panosa habrá menos panosa presente en
el producto final aumentando el rendimiento de sacarificación
global.
Una isoamilasa termoestable hace posible
desempeñar la licuefacción y la desramificación a la vez antes de
la fase de sacarificación.
Ejemplos específicos de enzimas desramificantes
termoestables son las isoamilasas termoestables derivadas de las
bacterias termofílicas tales como Sulfolobus acidocaldarius
ATCC 33909 (Maruta, K. et al., Biochimica et Biophysica Acta
1291, p. 177-181 (1996)), Sulfolobus
solfataricusATCC 35092 (número de acceso: Y08256) y
Rhodothermus marinus DSM 4252 como se describirá más
abajo.
En un aspecto la invención se refiere a un
proceso de conversión del almidón del tipo que incluye una fase
desramificante donde una isoamilasa que es activa en las
condiciones del proceso predominante se usa para la desramificación
del almidón.
En una forma de realización de la invención el
proceso de conversión del almidón es un proceso de
despolimerización de almidón donde la isoamilasa es activa durante
la fase de licuefacción junto con una
\alpha-amilasa.
En una forma de realización preferida la enzima
desramificante que es activa en las condiciones del proceso
predominante es una isoamilasa termoestable.
Con respecto a la invención el modelo de
degradación enzimática en el proceso de despolimerización del
almidón tradicional ha sido cambiado. Tal cambio de proceso
enzimático no ha sido posible antes puesto que todas las
isoamilasas conocidas han sido termolábiles y son inactivadas a
temperaturas superiores a 60ºC.
Con respecto a la invención la fase de
licuefacción se realiza a valores de pH ajustados entre 4.5 y 6.5,
preferiblemente entre 5.5 y 6.2, con p. ej. hidróxido sódico, a
temperaturas de 95-110ºC para un periodo de 1 a 3
horas, preferiblemente alrededor de 2 horas.
Opcionalmente, si la
\alpha-amilasa es calcio dependiente se podrá
añadir calcio en cantidades entre 30 y 50 ppm, así como alrededor
de 40 ppm (o 0.75 a 1.25 mM, así como alrededor de 1 mM), en la
fase de licuefacción para estabilizar la enzima.
Con respecto a la invención la
\alpha-amilasa no necesita ser inactivada después
de la fase de licuefacción para reducir la formación de panosa.
Ejemplos de \alpha-amilasas
específicas que pueden ser usadas en la fase de licuefacción
incluyen \alpha-amilasas de Bacillus
licheniformis, tales como los productos comercialmente
disponibles Termamyl®, Spezyme® AA, Spezyme® Delta AA, Maxamyl®,
Kleistase® y los mutantes de \alpha-amilasa
descritos en WO 96/23874 (Novo Nordisk) y PCT/DK97/
00197 (Novo Nordisk).
00197 (Novo Nordisk).
Las isoamilasas que pueden ser usadas según la
invención incluyen la isoamilasa termoestable derivada de la
arqueobacteria termofílica de Sulfolobus acidocaldarius,
Sulfolobus solfataricus y las eubacterias termofílicas de
Rhodothermus marinus (como se describirá con detalle más
abajo).
Con respecto a la invención la fase de
sacarificación se realiza a temperaturas de 55 a 65ºC
preferiblemente alrededor de 60ºC por una glucoamilasa durante
24-72 horas. Ejemplos de glucoamilasas adecuadas
incluyen glucoamilasas de Aspergillus Niger, tales como AMG™
de p. ej. Novo Nordisk.
En el caso del producto de azúcar final deseado
es p. ej. un jarabe rico en fructosa de aprox. el 50% de jarabe de
fructosa la D-glucosa formada está isomerizada por
una isomerasa a un pH alrededor de 6-8,
preferiblemente pH 7.5.
El calcio es eliminado si se añade antes la fase
de licuefacción.
Unos ejemplos de unas isomerasas adecuadas es
una glucosa isomerasa tal como la glucosa isomerasa derivada de
Streptomyces murinus. La isomerasa puede ser una glucosa
isomerasa inmovilizada, tal como Sweetzyme® (de Novo Nordisk).
En otro aspecto la invención se refiere al uso
de una isoamilasa termoestable en los procesos de conversión del
almidón, incluyendo procesos de conversión de jarabe de fructosa y
para producir sustituyentes de grasa.
En el caso del proceso de conversión del almidón
es un proceso de despolimerización del almidón la isoamilasa
termoestable se usa en combinación con una
\alpha-amilasa durante la fase de licuefacción. La
isoamilasa termoestable puede ser derivada de la arqueobacteria
termofílica de Sulfolobus acidocaldarius o Sulfolobus
solfataricuso de Rhodothermus marinus.
La isoamilasa termoestable puede ser usada
durante la fase de licuefacción de un almidón a jarabe de glucosa o
proceso de conversión de jarabe de fructosa. La isoamilasa
termoestable puede también ser usada en procesos para producir
sustituyentes de grasa de almidón.
En los procesos de conversión del almidón
tradicionales, tales como los procesos de despolimerización del
almidón, la formación del producto secundario indeseado, la panosa,
tiene una influencia significante en el rendimiento de
sacarificación global. Es en consecuencia deseable reducir la
formación de panosa para aumentar el rendimiento de la
sacarificación.
Se obtienen diferentes ventajas mediante la
adición de una isoamilasa termoestable.
Por ejemplo, cuando la desramificación del
almidón se desarrolla junto con una
\alpha-amilasa en la fase de licuefacción de la
despolimerización del almidón, es posible prolongar el tiempo del
proceso de licuefacción sin arriesgar la formación de una gran
cantidad de precursores de panosa.
Como la enzima desramificante es una isoamilasa
termoestable la desramificación por una pululanasa durante la
sacarificación puede ser omitida. Esto es ventajoso cuando la
pululanasa tiende a condensar la maltosa en un precursor de panosa,
la 6^{2}-\alpha-maltosilmaltosa
que es hidrolizada en panosa por la glucoamilasa.
Prolongando la fase de licuefacción el DE es
aumentado desde 10-15 hasta p. ej.
15-20 reduciendo la necesidad de glucoamilasa (p.
ej. AMG™). Este requisito de una glucoamilasa reducida es ventajoso
cuando la formación de isomaltosa es reducida. La isomaltosa está
formada por D-glucosa que resulta de la
despolimerización de oligosacáridos lineales por glucoamilasa que
elimina la D-glucosa de las extremidades de la
cadena que no se reducen. Todo ello junto con menos actividad de
glucoamilasa ocasiona un aumento del rendimiento de glucosa.
Además, el ahorro de glucoamilasa en el proceso
de la invención permite que la fase de sacarificación sea efectuada
a una concentración de sustrato más alta que es ventajoso cuando los
costes de evaporación pueden ser reducidos.
Además, cuando se usa el proceso de la invención
para la despolimerización la \alpha-amilasa usada
en el proceso de licuefacción no necesita ser
inactivada/desnaturalizada.
El tiempo de reacción de sacarificación puede
también resumirse significativamente aumentando de ese modo la
capacidad de producción.
Un objetivo de la presente invención es el de
reducir la formación de panosa.
En los procesos de despolimerización del almidón
esto aumenta el rendimiento de la sacarificación cuando la adición
de una isoamilasa que es activa durante la fase de licuefacción
reduce la cantidad de precursores de panosa formados.
Cuando se usa una isoamilasa termoestable de
forma anticipada en el proceso de licuefacción el proceso es menos
dependiente de la especificidad de la
\alpha-amilasa y la formación de los precursores
de panosa. Este cambio permite un tiempo de proceso aumentado para
la licuefacción y se obtiene un valor de DX más alto que el valor
normal de DX 10-12. Si se permite una licuefacción
más intensiva y se obtiene un valor de DX más alto usando una
enzima desramificante termoestable es posible aumentar la
concentración de Sustancia Seca (DS) desde el porcentaje normal de
30-35% hasta uno más alto. Este aumento del % de DS
es ventajoso cuando los costes de evaporación son reducidos
significativamente en el proceso del jarabe de maíz rico en
fructosa (HFCS).
Las isoamilasas termoestables adecuadas pueden
ser identificadas como se describe en el ejemplo 1 identificando en
primer lugar las regiones conservadas de la secuencia de
aminoácidos alineando las secuencias de isoamilasa disponibles. En
base a las regiones conservadas, se diseñan los cebadores para la
PCR. Unas reservas de ADN genómico de varias cepas bacterianas son
luego sometidas a PCR, y las cepas que producen un fragmento del
tamaño esperado son seleccionadas. Los fragmentos son purificados,
ordenados, y alineados para confirmar la homología con las
secuencias de isoamilasa publicadas. Entre las cepas identificadas,
aquellas con la máxima temperatura de crecimiento óptima son
también seleccionadas.
Usando este enfoque, las isoamilasas de
Rhodothermus marinus DSM 4252 y de Rhodothermus
obamensis JCM 9785 fueron seleccionadas, y la isoamilasa de
R. marinus fue además donada como se describe en el ejemplo
2.
Como también se ha indicado arriba los presentes
inventores han encontrado que una enzima que muestra actividad
isoamilasa puede ser obtenida a partir de una cepa del género
Rhodothermus, más específicamente Rhodothermus
marinus, especialmente Rhodothermus marinus DSM 4252, y
haber prosperado en la donación de una secuencia de ADN que codifica
dicha enzima.
Una búsqueda de homología con la isoamilasa de
la invención contra las bases de datos de nucleótidos y de
proteínas fue realizada.
| Orígenes de los genes de isoamilasa | identidad | |
| ADN | a.a. | |
| Pseudomonas amyloderamosa*1 | 50.4% | 33.0% |
| Pseudomonas sp. SMP1*2 | 50.4% | 33.0% |
| Flavobacterium sp.*3 | 54.0% | 34.1% |
| Flavobacterium odoratum*4 | 54.8% | 36.6% |
| Sulfolobus acidocaldarius*5 | 51.8% | 54.2% |
| Sulfolobus solfataricus*6 | 51.1% | 55.0% |
| *1: Tabla 1;1 | ||
| *2: Tabla 1;2 | ||
| *3: Tabla 1;3 | ||
| *4: Tabla 1;4 | ||
| *5: Tabla 1;5 | ||
| *6: GenBank: Número de acceso; Y08256 |
\newpage
La búsqueda de homología mostró que la(s)
secuencia(s) conocida(s) más relacionada(s)
fueron las isoamilasas de Sulfolobus acidocaldarius y
Sulfolobus solfataricus. La secuencia de ADN de la invención
(SEC ID NO: 3) que codifica una isoamilasa muestra aproximadamente
un 51-52% de homología del ADN a las secuencias de
isoamilasa conocidas de Sulfolobus acidocaldarius y
SSulfolobus solfataricus la secuencia de aminoácidos
correspondiente de la isoamilasa de la invención (SEC ID NO: 4)
muestra aproximadamente una homología del 54-55% a
una secuencia de aminoácidos deducida en base a la secuencia de ADN
conocida anterior.
Esto muestra que una secuencia de ADN y/o de
aminoácidos de una isoamilasa de la invención de hecho es distante
de cualquier secuencia(s) conocida(s) de ADN y/o de
aminoácidos que codifica una isoamilasa.
El cálculo de homología fue realizado como se
describe posteriormente en esta especificación.
Antes de discutir esta invención con más
detalle, los términos siguientes serán definidos en primer
lugar.
"Una secuencia de ADN clonada": La
expresión "Una secuencia de ADN clonada", se refiere a una
secuencia de ADN donada conforme a procedimientos de clonación
estándar usados en ingeniería genética para trasladar un segmento
de ADN desde su ubicación natural hasta un sitio diferente en el
que será reproducido. El proceso de clonación implica escisión y
aislamiento del segmento de ADN deseado, inserción de la pieza de
ADN en la molécula del vector e incorporación del vector
recombinante en una célula en la que múltiples copias o clones del
segmento de ADN serán replicadas. La "secuencia de ADN
clonada" de la invención puede de forma alternativa ser
denominada "constructo de ADN" o "secuencia de ADN
aislada".
"Obtenido a partir de": Para el
objetivo de la presente invención el término "obtenido a partir
de" como se utiliza en este caso en relación con una fuente
microbiana específica, significa que la enzima es producida por la
fuente específica, o por una célula donde se ha insertado un gen de
la fuente.
"Un polipéptido aislado": Tal y como
se define aquí el término, "un polipéptido aislado" o
"isoamilasa aislada", como se usa para la isoamilasa de la
invención, es una isoamilasa o parte de isoamilasa que tiene al
menos aproximadamente el 20% de pureza, preferiblemente al menos
aproximadamente el 40% de pureza, más preferiblemente
aproximadamente el 60% de pureza, incluso más preferiblemente
aproximadamente el 80% de pureza, más preferiblemente
aproximadamente el 90% de pureza, e incluso más preferiblemente
aproximadamente el 95% de pureza, según está determinado por
SDS-PAGE. El término "polipéptido aislado"
puede de forma alternativa ser denominado "polipéptido
purificado".
"Impurezas": Como se utiliza en este
caso el término "impurezas" significa cualquier impureza (p.
ej. otro polipéptido distinto de la enzima de la invención) que se
origina a partir de la célula homóloga a partir de la cual se
obtiene la enzima de la invención originalmente. En la presente
invención la célula homóloga puede p. ej. ser una cepa de
Rhodothermus.
"Parte de codificación de
isoamilasa": Según se utiliza en este caso los términos
"parte de codificación de isoamilasa" usados con respecto a una
secuencia de ADN significa la región de la secuencia de ADN que se
corresponde con la región que es traducida en una secuencia
polipeptídica.
En la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO:
3 es la región entre el primer codón de iniciación "ATG"
(codón "AUG" en ARNm) y el codón de detención siguiente
("TAA", "TAG" o "TGA"). En otras palabras éste es el
polipéptido traducido.
La "isoamilasa" en el presente contexto
está definida según la Clasificación Enzimática (EC), como teniendo
el número de EC: 3.2.1.68.
Una isoamilasa de la invención obtenida a partir
de un Rhodothermus sp. ha sido intensivamente
caracterizada.
En una forma de realización preferida, la enzima
según el primer aspecto de la invención es obtenida a partir de una
cepa de Rhodotermus marinus, especialmente Rhodothermus
marinus DSM 4252.
En una forma de realización preferida, la enzima
según el primer aspecto tiene la secuencia de aminoácidos madura
mostrada como la posición 1-726 en la SEC ID NO:
4.
En otro aspecto la invención se refiere a una
enzima aislada que muestra actividad isoamilasa seleccionada del
grupo que se compone de:
(a) un polipéptido codificado por la parte de
codificación de la enzima isoamilasa de la secuencia de ADN clonada
en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli DSM
11971;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en las posiciones
1-726 de la SEC ID NO: 4;
(c) un análogo del polipéptido definido en (a) o
(b) que es al menos un 70% homólogo a dicho polipéptido; y
(d) un fragmento de (a), (b) o (c).
La enzima según este aspecto de la invención
puede ser obtenida a partir de un microorganismo tal como una
bacteria, una levadura o un hongo filamentoso: Preferiblemente se
obtiene a partir de una bacteria-.
Ejemplos de aquellos que son adecuados están
proporcionados en la sección "Fuentes microbianas" (véase más
abajo).
En otro aspecto ulterior la invención se refiere
a una secuencia de ADN que codifica una enzima que muestra
actividad isoamilasa, secuencia de ADN que comprende:
(a) la parte de codificación de la isoamilasa de
la secuencia de ADN donada en el plásmido pUC19 presente en
Escherichia coli DSM 11971;
(b) la secuencia de ADN mostrada en las
posiciones 1-2178 en la SEC ID NO: 3 o su cadena
complementaria;
(c) un análogo de la secuencia de ADN definida
en (a) o (b) que es al menos un 70% homóloga a dicha secuencia de
ADN;
(d) una secuencia de ADN que hibrida con una
sonda de ADN bicatenario que comprende la secuencia mostrada en las
posiciones 1-2178 (que codifican la parte madura de
la enzima) en la SEC ID NO: 3 con una astringencia media;
(e) una secuencia de ADN que codifica una enzima
que tiene la secuencia de aminoácidos dispuesta como la parte
madura de la SEC ID NO: 4; o
(f) una secuencia de ADN que es un fragmento de
las secuencias de ADN especificadas en (a), (b), (c), (d), o
(e).
Actualmente se cree que la parte de codificación
de la isoamilasa de la secuencia de ADN donada en el plásmido pUC19
presente en la cepa DSM 11971 es idéntica a la parte de
codificación de la isoamilasa de la secuencia de ADN presentada en
la SEC ID NO: 3.
En consecuencia, los términos "la parte de
codificación de la isoamilasa de la secuencia de ADN clonada en el
plásmido pUC19 presente en DSM 11971" y "la parte de
codificación de la isoamilasa de la secuencia de ADN presentada en
la SEC ID NO: 3" pueden ser usados de forma intercambiable.
La secuencia de ADN puede ser de origen
genómico, o sintético o cualquier combinación de estos.
La presente invención también comprende una
secuencia de ADN clonada que codifica una enzima que muestra
actividad isoamilasa que tiene la secuencia de aminoácidos
dispuesta como la parte madura de la SEC ID NO: 4 (es decir
posición 1-726), secuencia de ADN que difiere de la
SEC ID NO: 3 en virtud de la degeneración del código genético.
La secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 3
y/o una secuencia de ADN análoga de la invención puede ser obtenida
a partir de un microorganismo tal como unas bacterias, una levadura
o un hongo filamentoso. Preferiblemente se obtiene a partir de un
hongo filamentoso y ejemplos de aquellos adecuados están
proporcionados en la sección "Fuentes microbianas" (véase más
abajo).
De forma alternativa, la secuencia análoga puede
ser construida en base a la secuencia de ADN presentada como la
parte de codificación de la isoamilasa de la SEC ID NO: 3, p. ej.
puede ser una subsecuencia suya y/o ser construida por introducción
de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia
de aminoácidos de la isoamilasa codificada por la secuencia de ADN,
pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped
destinado a la producción de la enzima, o por introducción de las
sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia
de aminoácidos diferente (es decir una variante de la isoamilasa de
la invención).
Cuando se llevan a cabo sustituciones de
nucleótidos, los cambios de aminoácidos son preferiblemente de una
naturaleza inferior, es decir las sustituciones de aminoácidos
conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento o a
la actividad de la proteína, pequeñas eliminaciones, normalmente de
uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o
carboxiloterminales, tales como un residuo de metionina
aminoterminal; un péptido de enlace pequeño de hasta aproximadamente
20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita
la purificación, tal como un tracto de polihistidina; un epítopo
antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están
dentro del grupo de aminoácidos básicos, tales como arginina,
lisina, histidina; aminoácidos acídicos, tales como el ácido
glutámico y el ácido aspártico; aminoácidos polares, tales como la
glutamina y asparraguina; aminoácidos hidrofóbicos, tales como
leucina, isoleucina, valina; aminoácidos aromáticos, tales como
fenilalanina, triptófano, tirosina; y aminoácidos pequeños, tales
como glicina, alanina, serina, treonina, metionina. Para una
descripción general de la sustitución de nucleótidos, ver p. ej.
Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2,
95-107.
Será evidente para los expertos en la técnica
que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones
fundamentales para la función de la molécula y además resultan en
un polipéptido activo. Los aminoácidos esenciales para la actividad
del polipéptido codificados por la secuencia de ADN clonada de la
invención, y en consecuencia preferiblemente no sometidos a
sustitución pueden ser identificados según los procedimientos
conocidos en la técnica, tales como mutagénesis sitio dirigida o
mutagénesis de barrido de alanina (véase p. ej. Cunningham and
Wells, (1989), Science 244, 1081-1085). En esta
técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo en la
molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas por su
actividad biológica (es decir isoamilasa) para identificar residuos
aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula.
Los sitios de interacción enzima-sustrato pueden
también ser determinados por análisis de estructura cristalina
según lo determinado por técnicas tales como análisis de resonancia
magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (véase
p. ej. de Vos et al., (1992), Science 255,
306-312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol.
224, 899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS
Lett. 309, 59-64).
Los polipéptidos de la presente invención
también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos divisibles
de fusión donde otro polipéptido está fusionado en el
N-terminal o el C-terminal del
polipéptido o del fragmento derivado. Un polipéptido fusionado es
producido fusionando una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte
de ésta) que codifica otro polipéptido hasta una secuencia de
ácidos nucleicos (o una parte de ésta) de la presente invención. Las
técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la
técnica, e incluyen la ligadura de las secuencias de codificación
que codifican los polipéptidos de modo que estén en el marco de
lectura y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo
control del(los) mismo(s) promotor(es) y
terminador.
La homología de la secuencia de ADN a la que se
hace referencia arriba está determinada como el grado de identidad
entre dos secuencias que indican una derivación de la primera
secuencia a partir de la segunda. La homología puede de manera
adecuada ser determinada mediante programas informáticos conocidos
en la técnica, tales como GAP proporcionado en el paquete de
programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8,
Agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970),
Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Usando
GAP con los ajustes siguientes para la comparación de secuencias de
ADN: penalización de creación de espacio de 5.0 y penalización de
extensión de espacio de 0.3, la zona de codificación de las
secuencias de ADN análogas a las que se hace referencia arriba
muestra un grado de identidad preferiblemente al menos un 70%, más
preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un
90%, más preferiblemente al menos un 95%, más preferiblemente al
menos un 97% con la parte de codificación de la isoamilasa de la
secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 3.
Las condiciones de hibridación a las que se hace
referencia arriba definen una secuencia de ADN análoga tal y como
se define en d) arriba que se hibrida en una sonda de ADN
bicatenario que comprende la secuencia mostrada en las posiciones
1-2178 en la SEC ID NO: 3 (es decir la parte de
codificación de la isoamilasa de la SEC ID NO: 4), bajo condiciones
de astringencia medias o altas son según se describe con detalle
más abajo.
Las condiciones experimentales adecuadas para
determinar la hibridación a media, o alta astringencia entre una
sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga implica
el prerremojo del filtro conteniendo los fragmentos de ADN o ARN
para hibridar en 5 X SSC (Cloruro de Sodio/Citrato de Sodio,
Sambrook et al. 1989) durante 10 min, y la prehibridación
del filtro en una solución de 5 X SSC, 5 X solución de Denhardt
(Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado y sometido a un baño de
ultrasonidos (Sambrook et al.. 1989), seguido de la
hibridación en la misma solución conteniendo una concentración de
10 ng/ml de una sonda cebada aleatoriamente (Feinberg, A. P. and
Vogelstein, B. (1.983) Anal. Biochem. 132: 6-13),
marcada en ^{32}P-dCTP (actividad específica >
1 X 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro
es luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 X SSC, 0.5% de SDS
al menos * 60ºC (astringencia media), más preferiblemente al menos
65ºC (astringencia media/alta), incluso más preferiblemente al
menos 70ºC (astringencia alta), e incluso más preferiblemente al
menos 75ºC (astringencia altísima).
Las moléculas a las que la sonda de
oligonucleótidos se hibrida bajo estas condiciones son detectadas
usando una película radiográfica.
Se ha descubierto que es posible predecir
teóricamente si dos secuencias de ADN hibridarán bajo ciertas
condiciones específicas o no.
En consecuencia, como alternativa al método
experimental descrito anteriormente la determinación de si una
secuencia de ADN análoga hibridará a la sonda de nucleótidos
anteriormente descrita o no, puede estar basada en un cálculo
teórico de la Tm (temperatura de fusión) en la que dos secuencias
de ADN heterólogas con secuencias conocidas hibridarán bajo
condiciones específicas (p. ej. con respecto a la concentración de
cationes y tempera-
tura).
tura).
Para determinar la temperatura de fusión para
las secuencias de ADN heterólogas (Tm(hetero)) es preciso
determinar primero la temperatura de fusión (Tm(homo)) para
las secuencias de ADN homólogas.
La temperatura de fusión Tm(homo) entre
dos cadenas completamente complementarias de ADN (formación de
homodúplex) puede ser determinada usando la fórmula siguiente,
Tm(homo)
= 81.5ºC + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) -
500/L
("Current protocols in Molecular
Biology". John Wiley and Sons, 1995),
donde
"M" se refiere a la concentración molar de
cationes en el tampón de lavado,
"%GC" % Guanina (G) y Citosina (C) de
número total de bases en la secuencia de ADN,
"% form" % formamida en el lavado tampón,
y
"L" la longitud de la secuencia de ADN.
Usando esta fórmula y las condiciones de lavado
experimentales dadas arriba, Tm(homo) para la formación de
homodúplex de la sonda de nucleótidos correspondiente a la
secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 3, es decir nucleótidos
1-2178 es:
Tm(homo)
= 81.5 + 16.6 (log 0.30) + 0.41 (65) - 0.61 (0) -
(500/2178)
Tm(homo) =
99.2ºC
"M": 2 X SSC corresponde a un conc.
catiónico de 0.3 M.
"%GC" El %GC en SEC ID NO: 3 es 65.
"% form": No hay ninguna formamida en el
tampón de lavado.
"L": la longitud de SEC ID NO: 3 es
2178.
La Tm determinada por la fórmula anterior es la
Tm de una formación de homodúplex (Tm(homo)) entre dos
secuencias completamente complementarias de ADN. Para adaptar el
valor de la Tm al de dos secuencias de ADN heterólogas, se asume
que una diferencia del 1% en la secuencia de nucleótidos entre las
dos secuencias heterólogas es igual a un 1ºC de reducción de la Tm
("Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and
Sons, 1995). En consecuencia, la Tm(hetero) para la formación
heterodúplex se halla restando la diferencia de homología entre la
secuencia análoga en cuestión y la sonda de nucleótidos
anteriormente descrita a la Tm(homo). El porcentaje de
homología de ADN que debe ser restado se calcula según se describe
en este caso (véase arriba).
Con las condiciones experimentales anteriores y
una temperatura de lavado de 65ºC astringencia media), una
secuencia análoga con una homología del 65.8% (100 - (99.2 - 65) =
55.8) será considerada para hibridar a la sonda de nucleótidos
anteriormente descrita.
La homología del polipéptido al que se hace
referencia arriba (propiedad (C)) del polipéptido de la invención
está determinada como el grado de identidad entre dos secuencias
que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la
segunda. La homología puede de manera adecuada ser determinada
mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como
GAP proporcionados en el paquete de programa GCG (Program Manual
for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer
Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)
(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular
Biology, 48, 443-453). Usando GAP con los ajustes
siguientes para comparación de la secuencia polipeptídica:
penalización de creación de espacio de 3.0 y penalización de
extensión de espacio de 0.1, la parte madura de un polipéptido
codificado por una secuencia de ADN análoga de la invención muestra
algo de identidad preferiblemente al menos del 70%, más
preferiblemente al menos del 80%, más preferiblemente al menos del
90%, más preferiblemente al menos del 95%, y especialmente al menos
del 97% con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC ID NO: 4, es decir posición 1-726 en la
SEC ID NO: 4.
La presente invención está también dirigida a
variantes de isoamilasa que tienen una secuencia de aminoácidos que
difiere de no más de tres aminoácidos, preferiblemente de no más de
dos aminoácidos, y más preferiblemente de no más de un aminoácido
desde la parte madura de la secuencia de aminoácidos dispuesta en
la SEC ID NO: 4.
Los anticuerpos para ser usados para determinar
la reacción cruzada inmunológica pueden ser preparados usando una
enzymX purificada. Más específicamente, el antisuero contra la
enzymX de la invención puede ser aumentado inmunizando conejos (u
otros roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen
et al. en A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, capítulo 23, o A.
Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell
Scientific Publications, 1982 (más específicamente p.
27-31). Se pueden obtener inmunoglobulinas
purificadas a partir del antisuero obtenido, por ejemplo por
precipitación de sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguida de
diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en
DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de
proteínas puede ser realizada bien por análisis de difusión doble
de Outcherlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental
Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications,
1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis
cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4),
o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al.,
Capítulo 2).
En la fecha de prioridad de la presente
invención, la taxonomía aplicada más abajo es conforme con el
navegador sobre la taxonomía del NCBI en el World Wide Web
(WWW).
Se espera que una secuencia de ADN que codifica
para una enzima homóloga, es decir una secuencia de ADN análoga, se
pueda obtener a partir de otros microorganismos. Por ejemplo, la
secuencia de ADN puede ser derivada seleccionando de forma similar
un banco de ADNc/ADN genómico de otro microorganismo, en particular
unas bacterias, tales como una cepa del género Cytophagales,
tal como una cepa de Rhodothermus sp., en particular una
cepa de R. marinus o R. obamensis, especialmente R.
marinus DSM 4252.
La secuencia de ADN de longitud total completa
que codifica la isoamilasa donada de Rhodothermus marinus
DSM 4252 ha sido transformada en una cepa de la bacteria E.
coli DH12S, comprendida en el plásmido pUC19. Dicho
transformante ha sido depositado por los inventores según el Tratado
de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de
patentes en el Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH., Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig República Federal de Alemania, (DSM).
- Fecha de depósito:
- 29.01.98
- Ref. del depositante:
- NN049374
- designación DSM:
- Escherichia coli DSM 11971
Siendo una Autoridad Depositaria Internacional
bajo el Tratado de Budapest, Deutshe Sammlung von Mikroorganismen
und Zell-kulturen GmbH., ofrece permanencia del
depósito de acuerdo con sus reglas y reglamentos de dicho tratado,
véase en particular la Regla 9. El acceso a los dos depósitos
estarán disponibles durante la pendencia de esta solicitud de
patente a una determinada por el Delegado de la Oficina de Patentes
y Marcas de Estados Unidos para ser titulada 37 C.F.R. Par. 1.14 y
35 U.S.C. Par. 122. También, los depósitos anteriormente
mencionados cumplen los requisitos de las solicitudes de patente
europea sobre microorganismos según la Regla 28 EPC.
El depósito anteriormente mencionado representa
un cultivo substancialmente puro de las bacterias aisladas. El
depósito está disponible según está requerido por las leyes de
patentes extranjeras en los países en los que las solicitudes
correspondientes a la solicitud en objeto, o su descendiente están
depositadas. No obstante, debe ser entendido que la disponibilidad
de la cepa depositada no constituye una licencia para poner en
práctica la invención en objeto para derogar los derechos de las
patentes concedidos por la acción gubernamental.
La secuencia de ADN de la invención, que tiene
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO: 3, puede ser
clonada a partir de la cepa anteriormente mencionada Escherichia
coli DSM 11971 usando técnicas de donación estándares p. ej.
como se describe por Sambrook et al., (1989), Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring
Harbor, NY.
La secuencia de ADN de la invención puede
también ser clonada por cualquier método general que implique
\bullet donación, en vectores adecuados, de
una genoteca de ADN de cualquier organismo que se espera que
produzca la isoamilasa en cuestión,
\bullet transformación de células huéspedes
adecuadas de E.coli con dichos vectores,
\bullet cultivo de las células huéspedes bajo
condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés
codificada por un clon en la genoteca de ADN, y
\bullet aislamiento de la enzima que codifica
el ADN de tales clones.
Una descripción más detallada del método de
selección está proporcionada en un ejemplo de funcionamiento de la
presente (véase abajo).
De forma alternativa, el ADN que codifica una
isoamilasa de la invención puede, conforme a unos procedimientos
bien conocidos, convenientemente ser donado a partir de una fuente
adecuada, tal como cualquiera de los organismos mencionados en la
sección "Fuentes microbianas", usando la hibridación a sondas
de oligonucleótidos sintéticas preparadas basándose en una
secuencia de ADN descrita aquí. Por ejemplo, una sonda de
oligonucleótidos adecuada puede ser preparada basándose en o
preferiblemente ser la parte de codificación de la isoamilasa de las
secuencias de nucleótidos presentadas como SEC ID NO: 3 o cualquier
subsecuencia adecuada suya, o la base de la SEC ID NO de la
secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 4.
De forma alternativa, la secuencia de ADN puede
ser clonada usando cebadores de la PCR preparados basándose en la
secuencia de ADN descrita aquí.
Un vector recombinante que comprende un
constructo de ADN que codifica la enzima de la invención puede ser
cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector a
menudo dependerá de la célula huésped en la que se deba introducir.
Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es
decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya
replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej.
un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al
introducirse en una célula huésped, se integre en el genoma de la
célula huésped o en su totalidad y se replique con el(los)
cromosoma(s) donde haya sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención está operativamente enlazada a segmentos adicionales
requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de
expresión está derivado de ADN plásmido o vírico, o puede contener
elementos de ambos. Los términos "enlazado operativamente"
indican que los segmentos están dispuestos de modo que funcionen en
concierto para sus objetivos previstos, p. ej. la transcripción se
inicia en un promotor y prosigue a través de la secuencia de ADN
que codifica para la enzima.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN
que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de
elección y puede derivar de genes que codifican proteínas bien
homólogas o heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes bacterianas incluyen el promotor del gen de
amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, el gen
de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el
gen de alfa-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens, el gen de proteasa alcalina de Bacillus
subtilis, o el gen de xilosidasa de Bacillus pumilus, o
los promotores PR o PL del fago Lambda o los promotores lac, trp o
tac de E. coli.
La secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención puede también, si fuera necesario, estar operativamente
conectada a un terminador adecuado.
El vector recombinante de la invención puede
además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se
replique en la célula huésped en cuestión.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto
en la célula huésped, o un gen que codifica la resistencia a p. ej.
antibióticos como canamicina, cloranfenicol, eritromicina,
tetraciclina, espectinomicina, o similar, o la resistencia a
metales pesados o herbicidas.
Para dirigir una enzima de la presente invención
en el vía secretora de las células huéspedes, una secuencia señal
secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia
prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en el vector
recombinante. La secuencia señal secretora está unida a la
secuencia de ADN que codifica la enzima en el marco de lectura
correcto. Las secuencias señal secretoras se posicionan de forma
común en 5' a la secuencia de ADN que codifica la enzima. La
secuencia señal secretora puede ser aquella asociada normalmente
con la enzima o puede provenir de un gen que codifica otra proteína
segregada.
Los procedimientos usados para ligar las
secuencias de ADN que codifican para la presente enzima, el
promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia señal
secretora, respectivamente, o para ensamblar estas secuencias
mediante esquemas de amplificación de PCR adecuados, y para
insertarlos en los vectores adecuados conteniendo la información
necesaria para la replicación o integración, son bien conocidos por
los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et
al., op.cit.).
La secuencia de ADN que codifica la presente
enzima introducida en la célula huésped puede ser bien homóloga o
heteróloga a la célula huésped en cuestión. Si fuera homóloga a la
célula huésped, es decir producida por la célula huésped en la
naturaleza, normalmente será operativamente conectada a otra
secuencia promotora o, si fuera aplicable, a otra secuencia señal
secretora y/o a una secuencia de terminación distinta de su entorno
natural. El término "homóloga" está destinado a incluir una
secuencia de ADN que codifica una enzima nativa a la del organismo
huésped en cuestión. El término "heteróloga" se destina a
incluir una secuencia de ADN no expresada por la célula huésped en
la naturaleza. Así, la secuencia de ADN puede provenir de otro
organismo, o puede ser una secuencia sintética.
La célula huésped en la que el constructo de ADN
o el vector recombinante de la invención está introducido puede ser
cualquier célula capaz de producir la presente enzima, incluyendo
bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas más grandes.
Ejemplos de células huéspedes bacterianas que,
durante el cultivo, son capaces de producir la enzima de la
invención son bacterias gram-positivas tales como
cepas de Bacillus, tales como cepas de B. subtilis,
B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B.
stearothermophilus, B. alkalophilus, B.
amyloliquefaciens, B. agulans, B. circulans, B.
lautus, B. megatherium o B. thuringiensis, o
cepas de Streptomyces, tales como S. lividans o S.
murinus, o bacterias gram-negativas tales como
Escherichia Coli. La transformación de las bacterias puede
ser efectuada por transformación, electroporación, conjugación de
protoplastos, o usando células competentes de una manera conocida
per se (ver Sambrook et al., supra).
Cuando se expresa la enzima en bacterias como
E. coli, la enzima puede ser retenida en el citoplasma,
normalmente como gránulos insolubles (conocidos como cuerpos de
inclusión), o pueden ser dirigidos al espacio periplásmico por una
secuencia de secreción bacteriana. En este caso, las células son
lisadas y los gránulos son recuperados y desnaturalizados tras lo
cual la enzima es replegada diluyendo el agente desnaturalizante. En
este caso, la enzima puede ser recuperada del espacio periplásmico
interrumpiendo las células, p. ej. por sonicación o choque
osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico y
recuperar la enzima.
Cuando se expresa la enzima en bacterias
gram-positivas tales como cepas de Bacillus
o Streptomyces, la enzima puede ser retenida en el
citoplasma, o puede ser dirigida al medio extracelular por una
secuencia de secreción bacteriana. En este caso, la enzima puede
ser recuperada del medio como se describe abajo.
Las células eucarióticas adecuadas son
particularmente células micóticas tales como levaduras. Ejemplos de
células de levadura adecuadas incluyen células de Saccharomyces
spp., en particular cepas de Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces kluyveri, Sacchromyces uvarum, o
Schizosacaromyces spp., tales como de Schizosaccharomyces
pombe.
Métodos para transformar células de levadura con
ADN heterólogo y producir polipéptidos heterólogos a partir de ello
están descritos, p. ej. en patente estadounidense nº. 4.599.311,
patente estadounidense nº. 4.931.373, patente estadounidense nº.
4.870.008, patente estadounidense nº. 5.037.743, y patente
estadounidense nº. 4.845.075, todas ellas están incorporadas en la
presente por referencia. Las células transformadas están
seleccionadas por un fenotipo determinado por un marcador
seleccionable, normalmente de la resistencia a los fármacos o de la
capacidad de crecer en ausencia de un nutriente particular, p. ej.
leucina. Un vector preferido para el uso en levadura es el vector
POT1 descrito en la patente estadounidense nº. 4.931.373. La
secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la invención puede
ser precedido por una secuencia señal y opcionalmente una secuencia
líder, p. ej. según el modo descrito anteriormente.
Ejemplos adicionales de células de levadura
adecuadas son cepas de Candida spp., tales como cepas de
Candida utilis, candida boidinii, o de
Kluyveremyces spp., tales como cepas de K. lactis, o
de Hansenula spp., p. ej. cepas de H. polimorfa, o
de Pichia spp., p. ej. Pichia methanolica, Pichia
angusta, Pichia pastoris o Pichia anomala,
Yarrowia spp., tales como Yarrowia lipolytica (ver
Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132;1986, págs.
3459-3465; patente estadounidense nº.
4.882.279).
La presente invención proporciona un método para
producir una enzima aislada según la invención, donde una célula
huésped adecuada, que ha sido transformada con una secuencia de ADN
que codifica la enzima, está cultivada bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es
recuperada del cultivo.
Cuando un vector de expresión que comprende una
secuencia de ADN que codifica la enzima es transformado en una
célula huésped heteróloga es posible permitir la producción
recombinante heteróloga de la enzima de la invención.
De ese modo es posible hacer una composición de
isoamilasa altamente purificada, caracterizada por estar libre de
impurezas homólogas.
Según la presente invención la célula huésped
heteróloga puede p. ej. ser una cepa de E. coli, Bacillus
spp., Saccharomyces, Candida, Pichia,
Hansenula.
El medio usado para cultivar las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para hacer crecer las células huéspedes en cuestión. La
isoamilasa expresada puede convenientemente ser segregada en el
medio de cultivo y puede ser recuperada de éste por procedimientos
bien conocidos que incluyen la separación de las células del medio
por centrifugado o filtración, precipitación de los componentes
proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio,
seguido de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.
La invención también se refiere a un cultivo
biológico substancialmente puro aislado de la cepa Escherichia
coli DSM 11971 que contiene una secuencia de ADN que codifica
la isoamilasa (la parte de codificación de la isoamilasa de la
secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en
Escherichia coli DSM 11971) obtenida a partir de una cepa de
las bacterias Rhodothermus (será entendido que cualquier mutante de
dicha cepa de E.coli que ha retenido la capacidad de
codificar la isoamilasa está considerado incluido en la presente
invención); y a un cultivo biológico substancialmente puro aislado
de Rhodothermus marinus DSM 4252 (será entendido que
cualquier mutante de dicha cepa de Rhodothermus marinus que
ha retenido la capacidad de codificación de la isoamilasa está
considerado incluido en la presente invención), a partir de lo cual
se ha obtenido la secuencia de ADN presentada como la SEC ID NO:
3.
La invención también se refiere a una secuencia
de ADN clonada que codifica una enzima con actividad isoamilasa
derivada de una cepa de Sulfolobus. La secuencia de ADN puede
ser derivada de una cepa de Sulfolobus acidocaldarius o
Sulfolobus solfataricus.
Las secuencias pueden ser las secuencias de ADN
que codifican una isoamilasa de Sulfolobus acidocaldarius
descrita en Biochem. Biophys. Acta, 1291, p.177-181
(1996), puede tratarse de la secuencia de ADN de Sulfolobus
solfataricus disponible en GeneBank bajo el número de Acceso
Y08256.
La invención además se refiere a un vector de
expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN clonada
derivada de Sulfolobus según el modo descrito anteriormente,
en particular la secuencia de ADN descrita en Biochem. Biophys.
Acta, 1291, p.177-181 (1996) y GeneBank, nº de
acceso Y08256.
Además la invención se refiere a una célula
huésped que comprende una secuencia de ADN clonada de
Sulfolobus de la invención o un vector de expresión
recombinante que comprende una secuencia de ADN de Sulfolobus
de la invención.
El huésped de la invención puede ser una célula
eucariótica, en particular una célula micótica, tal como una célula
de levadura o una célula micótica filamentosa. Específicamente, la
célula huésped puede ser seleccionada del grupo que comprende una
cepa de Saccharomyces, candida, Pichia, Hansenula, Fusarium,
Aspergillus, Trichoderma, en particular una cepa de
Saccharomyces cerevisiae, candida utilis, candida boidinii,
Pichia metanolica, Pichia angusta, Pichia pastoris, Pichia anomala,
Fusarium ATTC 20334, Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae,
Trichoderma Harzianum o Trichoderma reesei.
Finalmente la invención se refiere a un método
para producir una enzima que muestra actividad isoamilasa
codificada por una secuencia de ADN clonada de la invención, el
método comprendiendo el cultivo de una célula huésped de la
invención, bajo condiciones que permiten la producción de la
enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
La clonación de la secuencia de ADN de
Sulfolobus acidocaldarius descrita en Biochem. Biophys.
Acta, 1291, p.177-181 (1996) está descrita más
abajo.
Promozymee: Pululanasa (disponible por Novo
Nordisk) derivada de Bacillus acidopullulyticus (descrita en
EP 63.909).
AMG: glucoamilasa de Aspergillus Niger
(disponible por Novo Nordisk A/S)
\alpha-amilasa:
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis
con las mutaciones siguientes:
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+H156Y+A181T+N190F+A209V+
Q264S (véase WO 97/41213 de Novo Nordisk A/S).
Q264S (véase WO 97/41213 de Novo Nordisk A/S).
Una cepa DH12S de E. coli que comprende
la isoamilasa de longitud total clonada de Rhodothermus
marinus DSM 4252 ha sido depositada según el Tratado de
Budapest en el Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH., Mascheroder Weg lb, D-38124
Braunschweig República Federal de Alemania, (DSM).
- Fecha de depósito:
- 29.01.98
- Ref. del depositante:
- NN049374
- Designación DSM:
- Escherichia coli DSM 11971
E.coli Top 10 (Invitrogen)
\vskip1.000000\baselineskip
pBAD/Myc-His A,B,C
(Invitrogen)
pUC19 (Invitrogen)
\vskip1.000000\baselineskip
Medio LB: 1% bacto triptona, 0.5% extracto de
bacto-levadura, 1%
NaCl, pH 7.
Medio SOB: 2% bacto triptona, 0.5% extracto de
levadura, 0.05%
NaCl, 2.5 mM de KCl, 10 mM de MgSO_{4}, pH
7.
Solución de yodo: 2 ml de agua destilada, 40 ml
de 0.2% 12, 2.0% Kl y 0.2% H_{2}SO_{4}.
A menos que se mencione lo contrario, las
manipulaciones de ADN y transformaciones fueron realizadas usando
métodos estándares de biología molecular (Sambrook et al.
(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor
lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.)
"Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons,
1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular
Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons,
1990).
Las enzimas para las manipulaciones del ADN
fueron usadas según las especificaciones de los proveedores.
A menos que se mencione lo contrario todas las
enzimas para las manipulaciones del ADN, tales como p. ej.
endonucleasas de restricción, ligasas etc., están obtenidas por New
England Biolabs, Inc.
Ejemplo
1
Para proporcionar isoamilasas termoestables, se
realizo una alineación de cinco isoamilasas conocidas cuyos datos de
la secuencia proteínica están disponibles (ver Tabla 1).
| 1 | Pseudomonas amyloderammosa | Biochem. Biophys. Acta, 1087, pág. 309-315 (1990) |
| 2 | Pseudomonas sp. | Publicación de Patente Europea número: EP 0 302 838 A2 |
| 3 | Flavobacterium sp. | Publicación de Patente Europea Internacional número: WO 96/03513 |
| 4 | Flavobacterium odoratum | Publicación de Patente Japonesa número: JP08023981-A |
| 5 | Sulfolobus acidocaldarius | Biochem. Biophys. Acta, 1291, pág. 17-181 (1996) |
\vskip1.000000\baselineskip
Dos regiones conservadas (ver i6 y i7 abajo) sin
demasiada degeneración fueron identificadas.
- i6: RFNPNKL(V)L (residuos 136-143 de isoamilasa de Pseudomonas amyloderamosa)
- i7: NYWGYMT (residuos 272-278 de isoamilasa de Pseudomonas amyloderamosa)
Los cebadores de la PCR fueron diseñados en base
a dichas regiones conservadas.
cebador iso 6:
| 5'-gitt(tc)aa(tc)cciaa(tc)aa(ag)(tcg)ti(tc)t-3' | (SEC ID No: 1) |
\vskip1.000000\baselineskip
cebador iso 7:
| 5'-gtcat(ga)taicccca(ag)ta(ga)tt-3' | (SEC ID No: 2) |
Las reservas de ADN genómico de varias cepas
bacterianas fueron preparadas con el método descrito en "Current
Protocols in Molecular Biology, unit 2.4 Preparation of Genomic DNA
from Bacteria". Las condiciones de la PCR están mostradas como
sigue,
- ADN genómico
- 200 ng
- cebador iso 6
- 2 \mul de 100 pmol/\mul (200 pmol)
- cebador iso 7
- 2 \mul de 100 pmol/\mul (200 pmole)
- 2.5 mM de mezcla dNTP
- 2 \mul
- 10 x tampón Gen-Taq
- 10 \mul
ADN-polimerasa
Gen-Taq 2 unidades
se añadió H_{2}O hasta un total de 100
\mul
Los ciclos de la PCR fueron realizados en el
programa siguiente: 94ºC durante 5 min, 50ºC durante 1.5 min, 72ºC
durante 3 minutos, y 94ºC durante 1.5 min, 50ºC durante 1.5 min,
72ºC durante 3 min repetir 24 veces, y luego 94ºC durante 1.5 min,
50ºC durante 1.5 min, 72ºC durante 15 min.
Diez ml de partes alícuotas de cada PCR se
aplican en un 1.5% de gel de agarosa para visualizar el fragmento
previsto de 450 bp.
Los fragmentos purificados fueron ligados al
vector-T (Novagen) con el kit de ligadura de ADN
(Takara Ver2.).
Usando la mezcla ligada, la transformación de
JM109 de E. coli competente fue realizada por el método de
Hanahan. Los transformantes que soportan los fragmentos fueron
cultivados y los plásmidos fueron preparados con el kit de QlAgen
miniprep. Los plásmidos purificados se utilizan como molde de ADN
en la reacción de secuenciación por ciclos (PRISM Dyedeoxy
Terminator Cycle Sequencing Mix) de ambas cadenas usando cebadores
Universales. La secuencia fue determinada con ABI PRISM 310 Genetic
Analyzer (Perkin Elmer) y fueron alineados con el software MEgAlign
(ADN Star, Laser gene).
Cinco cepas produjeron fragmentos del tamaño
esperado de aproximadamente 450 bp, y estos fueron purificados,
secuenciados, y alineados. Los fragmentos tenían homología con las
secuencias de isoamilasa publicadas como en la Tabla 2. El cálculo
de homología fue realizado según se ha descrito previamente en esta
especificación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepas identificadas | % homología con* | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Flavobacterium sp. | FO 14590 | 37.2 | 37.2 | 35.8 | 34.3 | 45.0 |
| Flavobacterium vorans | ATCC 10829 | 38.7 | 38.7 | 37.2 | 38.0 | 44.8 |
| Xantomonas campestris | ATCC 31922 | 37.2 | 37.2 | 40.9 | 37.2 | 49.7 |
| Rhodothermus marinus | DSM 4252 | 38.0 | 38.0 | 36.5 | 35.0 | 52.4 |
| Rhodothermus obamensis | JCM 9785 | 38.0 | 38.0 | 36.5 | 35.0 | 52.4 |
| los números se refieren a la Tabla 1 |
Las secuencias de a.a. de las enzimas mostradas
en la tabla 2 están mostradas en el Listado de secuencias más
abajo:
- Flavobacterium sp. IFO 14590:
- SEC ID NO: 11
- Flavobacterium devorans ATCC 10829:
- SEC 10 No: 12
- Xanthomonas campestrys ATCC 31922:
- SEC ID NO: 13
- Rhodothermus marinus DSM 4252:
- SEC 10 NO: 4
- Rhodothermus obamensis JCM 9785:
- SEC ID NO: 14
De las cinco, se seleccionó Rhodothermus
marinus DSM 4252 (SEC ID NO: 4) y Rhodothermus obamensis
JCM 9785 (SEC ID NO: 14) con la máxima temperatura de crecimiento
óptimo (65-70ºC). Como las dos secuencias de
fragmento son casi idénticas, sólo una de éstas, Rhodothermus
marinus DSM 4252, fue además empleada para la donación y
expresión.
Ejemplo
2
Usando el método de selección por PCR para la
isoamilasa anteriormente descrita se descubrió que Rhodothermus
marinus, con una temperatura de crecimiento superior a 60ºC,
tiene un gen que codifica una isoamilasa. El gen de isoamilasa de
Rhodotermus marinus DSM 4252 fue clonado con la técnica de
hibridación de colonias como sigue:
El ADN genómico de Rhodothermus marinus
fue preparado según los métodos descritos en "Current Protocols
in Molecular Biology, unidad 2.4 Preparation of Genomic DNA from
Bacteria". Se efectuó el Southern blotting con los métodos
descritos en "Current protocols in Molecular Biology, unidad
2.9.1 Southern blotting". La membrana con fragmentos de ADN
genómico fue prehibridada en una solución de hibridación (5 X SSC,
0.5% agente reactivo de bloqueo (Boehringer Mannheim), 0.1%
N-lauroilsarcosina, y 0.02% SDS) a 68ºC durante 1
hora. Luego se hibridó en la solución de hibridación que incluía 10
ng/ml de la sonda que fue el fragmento obtenido mediante la
selección por PCR marcada por DIG DNA labeling Mix (Boehringer
Mannheim) a 68ºC durante 12 horas. Luego, se detectó la sonda por
DIG Nucleic Acid Detection Kit (Boehringer Mannheim).
La hibridación de Southern mostró que un
fragmento de aproximadamente 7 kbp de ADN genómico digerido con
EcoRl se hibridó con la sonda. El ADN genómico digerido con EcoRl
(6 a 8 kbp) fue extraído del 1% de gel de agarosa con Gel
extraction kit (QlAgne).
Los fragmentos digeridos por EcoRI fueron
ligados en pUC 19 para hacer una genoteca de ADN. Fueron
transformados en DH12S Electromax de E.coli (Gibco BRL) por
electroporación y colocados en placas sobre una placa de LB que
incluía 200 mg/ml de ampicilina. Después del cultivo durante toda la
noche a 37ºC estas colonias fueron replicadas en una membrana de
nilón. Se mojaron en una solución de desnaturalización (1.5 M de
NaCl y 0.5 M de NaOH) durante 7 min y luego en una solución de
neutralización (1.5 M de NaCl, 0.5 M de Tris-HCI pH
7.2), y 0.001 M de EDTA). Las condiciones de hibridación fueron las
mismas que las de la hibridación de Southern.
Entre 1000 transformantes que fueron
seleccionados por hibridación de colonias, 3 colonias hibridaron
con la sonda.
Los plásmidos fueron preparados a partir de 3
transformantes, y la hibridación de Southern mostró que estos 3
transformantes tenían la misma inserción de un fragmento de EcoRI
de 7 kbp que hibridó con la sonda.
El mapa de la enzima de restricción de uno de
los clones positivos denominado pRISA, fue determinado y está
mostrado en la figura 1.
La secuencia de nucleótidos del gen de
isoamilasa fue determinada usando ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer.
La reacción de secuenciación se efectuó usando el dye terminator
cycle sequencing FS ready reaction kit (P/N 402153). La reacción
fue seguida del protocolo mencionado por PE Applied Biosystems.
Los cebadores fueron diseñados a partir de la
secuencia determinada de la ubicación de la sonda. 2178 bp
determinadas de ORF y la secuencia de aminoácidos deducida están
mostradas en la SEC ID NO: 3. La secuencia de la sonda para
hibridación es nt.342-770 de la SEC ID NO: 3.
pBAD/Myc-His B fue usado para la
expresión.
El gen de isoamilasa de R. marinus fue
donado por PCR a partir de pRI5A. Los cebadores
| Cebador N: | gtcagtagcccatggcacattagcgc | (SEC ID No: 5) |
| Cebador BX2: | ctcggccggactagatctgtcttc | (SEC ID No: 6) |
El sitio Ncol fue diseñado en el cebador N. ATG
del sitio Ncol fue usado como el codón de iniciación. Debido al
sitio Ncol (ccatgg), la segunda Serina del aminoácido cambió a
Alanina. En el cebador BX2, el sitio XbaI fue diseñado detrás del
codón de detención.
Se efectuó la PCR el cebador con las siguientes
condiciones usando el cebador N y cebador BX2.
- ADN genómico
- 100 ng
- cebador sentido
- 1 ml de 100 pmol/ml (100 pmol)
- cebador antisentido
- 1 ml de 100 pmol/ml (100 pmol)
- 2.5 mM de mezcla de dNTP
- 2 ml
- 10x tampón
- 5 ml
- Taq DNA polimerasa
- 1 unidad
H_{2}O fue añadido al total hasta 50 ml
Los ciclos de la PCR fueron realizados en el
programa siguiente.
94ºC 5 min, 60ºC 1.5 min, 72ºC 3 min, luego 94ºC
1.5 min, 60ºC 1.5 min, 72ºC 3 min, repetición 24 veces, y 94ºC 1.5
min, 60ºC 1.5 min, 72ºC 15 min.
El fragmento obtenido (aproximadamente 2 kbp)
fue tratado con Ncol y XbaI, luego fue ligado con
pBAD/Myc-His B y se obtuvo el transformante
conteniendo el plásmido denominado pBX2. El huésped para la
expresión fue E.coli Top10.
El transformante con pBX2 fue cultivado en 100
ml de medio LB, incluyendo 200 mg/ml de ampicilina a 37ºC durante
toda la noche. Un ml de cultivo de semillas fue inoculado hasta 100
ml de medio SOB incluyendo 200 mg/ml de ampicilina y fue cultivado
a 37ºC durante 2.5 horas. Luego 100 ml de arabinosa al 20% fueron
añadidos para inducir las proteínas recombinantes. El cultivo fue
continuado a 37ºC durante toda la noche. Al día siguiente, las
células fueron recogidas por centrifugado. Las células fueron
lavadas con 50 mM de tampón de Citrato de sodio (pH 5.0). Luego las
células fueron suspendidas con el mismo tampón incluyendo 1 mg/ml
de lisozima y conservadas a 4ºC durante 1 hora. Después del
tratamiento con lisozima, las células fueron interrumpidas por
ultrasonidos. Se obtuvo el sobrenadante por centrifugado a 18.000
rpm durante 30 minutos. El detrito fue interrumpido por
ultrasonidos nuevamente. El tratamiento por ultrasonidos fue
repetido una vez más. Finalmente, el sobrenadante fue reunido y
calentado a 70ºC durante 1 hora para eliminar las proteínas de la
cepa huésped. Se efectuó el centrifugado a 18.000 rpm durante 30
minutos y el sobrenadante constituyó la muestra de isoamilasa
cruda.
Ejemplo
3
El carácter de la isoamilasa fue investigado por
el método de ensayo siguiente. 250 ml de 1% amilopectina de arroz
encerado y 50 ml de 50 mM de tampón citrato fueron preincubados
durante 5 minutos. La reacción fue comenzada añadiendo 50 ml de
solución enzimática. Después de 10 minutos de incubación, 40 ml de
mezcla reactiva fueron puestos en la solución de yodina (2 ml de
D.W. y 40 \mul de 0.2% l_{2}, 2.0% Kl y 0.2% H_{2}SO_{4}).
Luego su valor OD600 fue medido. Se añadió agua destilada en vez de
solución enzimática en el blanco.
El pH óptimo de la isoamilasa de
Rhodothermus fue determinado. La reacción se efectuó a 50ºC.
El pH óptimo fue determinado a pH 5.0. La curva de pH está mostrada
en la figura 2.
Se determinó la temperatura óptima de la
isoamilasa de Rhodothermus. La reacción se efectuó a pH 5 a
entre 30º-89ºC. Se determinó que la temperatura óptima estaba
alrededor de 85ºC. La curva de temperatura está mostrada en la
figura 3.
El P_{M} de Rhodothermus fue
determinado por SDS PAGE. SDS PAGE se efectuó usando el Sistema
Phast con gel de gradiente 10-15 (Pharmacia
Biotech). El P_{M} de la proteína recombinante fue calculado a 80
kDa.
La secuencia de aminoácidos
N-terminal de la proteína recombinante fue
determinada. El resultado fue idéntico a la secuencia de aminoácidos
deducida de la secuencia de nucleótidos (se cambió Serina por
Alanina debido al cebador N).
Ejemplo
4
Para probar el efecto de la isoamilasa de
Rhodothermus marinus en el rendimiento de glucosa en
procesos de conversión de almidón un proceso de conversión estándar
de almidón en dos fases fue realizado con/sin adición de isoamilasa
en las fases de licuefacción y de sacarificación.
Un 30% p/p de maltodextrina DE 10 obtenida a
partir de almidón de maíz común fue usado como el material
precursor.
La fase de licuefacción se efectuó a 80ºC, pH
5.5, durante 90 minutos ante una variante de
\alpha-amilasa (8 microgramos/gramo de Sólido
Seco).
La fase de sacarificación se efectuó a 60ºC, pH
4.5, durante un periodo de 48 horas en presencia de AMG (0.18
AGU/gramo de Sólido Seco) con/sin adición de una pululanasa
(Promozyme®) (0.06 PUN/gramo de Sólido Seco).
En la tabla 3 mostrada en la figura 7 las
pruebas realizadas y el efecto de la isoamilasa en los rendimientos
de DP1, DP2, DP3 y DP4+ están catalogados.
Como se puede observar en dicha Tabla 50 o 200
microgramos/gramo de isoamilasa de Rhodothermus marinus como
Sólido Seco fue añadido en la PRUEBA 3, 4, 8 y 9 durante la
licuefacción. En la PRUEBA 1, 5 y 7 la
\alpha-amilasa fue inactivada después de 90
minutos de licuefacción ajustando el pH a 3.0 durante 15 minutos a
80ºC.
En todas las pruebas cuando se añade isoamilasa
se obtiene un rendimiento de DP4+ inferior. Esto indica que el
sustrato ha sido más accesible para la
\alpha-amilasa y el AMG.
Comparando la prueba 2 (es decir sin añadir
isoamilasa) con 3 y 4 (es decir, adición de isoamilasa) se puede
observar que el rendimiento de DP3 (es decir panosa) se reduce de
1.2% a 1.0% y 0.9%, respectivamente, y que el rendimiento de DP1
(es decir glucosa) aumenta de 96.3% a 96.5% y 96.8%,
respectivamente.
En la prueba 7 la isoamilasa fue añadida durante
la fase de sacarificación. Comparando la prueba 7 con la prueba 5,
se puede observar que el rendimiento de DP3 (es decir panosa) se
reduce de 0.5% a 0.4%, y que el rendimiento de DP1 (es decir
glucosa) aumenta de 93.2% a 94.8a
La adición de la isoamilasa de Rhodothermus
marinus durante la conversión del almidón ocasiona un
rendimiento aumentado de glucosa.
Ejemplo
5
El gen de isoamilasa de Sulfolobus
acidocaldarius fue clonado por PCR. Los cebadores fueron diseñados
en base a la secuencia mostrada en el artículo de la Tabla 1.
cebador SINH:
| 5'-gtatatcaaagcttatgaaagatcgaccattaaagcctg-3' | (SEC ID No: 7) |
cebador SICX:
| 5'-ggttgtctagatcacctggaactctatcctcctgta-3' | (SEC ID No: 8) |
La PCR se efectuó por el procedimiento descrito
en el ejemplo 2-f.
Se obtuvo el fragmento derecho de tamaño
(aproximadamente 2kb) y fue purificado usando el kit de
purificación por PCR (QlAgen). El fragmento purificado fue tratado
con HindIII y Xba I.
El vector de expresión fue construido a partir
de pJS026 que tiene el promotor TPI (Annals New York Academy of
Sciences, vo1782, p202 J.S.Okkels). pJSOHX fue hecho a partir de
pJSO26 para eliminar el sitio BamHI y se añadió el sitio HindIII
usando los 2 oligonucleótidos siguientes como cassette,
gatcaagcttggaattcgctcgagct (SEC ID NO: 9) y
ctagagctcgagcgaattccaagctt (SEC ID NO: 10).
El gen donado de Sulfolobus
acidocaldarius fue insertado en el sitio Hind III y XbaI de
pJSOHX y se obtuvo el vector de expresión denominado pFSI82. pFSI
82 fue transformado en YNG318 de Saccharomyces
cerevisiae.
El mapa pFSI82 está mostrado en la figura 4.
El transformante que contiene pFSI82 fue
cultivado en 100 ml de YPD durante 2 días. Las células fueron
cosechadas por centrifugado a 5.000 rpm durante 5 min y se hizo el
esferoplasto con un protocolo básico (Bio manual series 10,
Yodosha). El esferoplasto fue interrumpido por ultrasonidos y el
extracto celular fue tratado con calor a 70ºC durante 30 min. El
detrito fue extraído por centrifugado a 14.000 rpm durante 30 min y
el sobrenadante constituyó la muestra de isoamilasa cruda.
Ejemplo
6
La isoamilasa recombinante fue caracterizada
usando el ensayo descrito en el ejemplo 3-a.
El pH óptimo de la isoamilasa de Sulfolobus
acidocaldarius fue determinado. La reacción se efectuó a 70ºC.
El pH comprobado estaba entre pH 3.5-7.5. El pH
óptimo fue determinado a pH 5.5. La curva del pH está mostrada en
la figura 5.
La temperatura óptima de la isoamilasa de
Sulfolobus fue determinada. La reacción se efectuó a pH5.5 a
entre 40º-90ºC. Se determinó que la temperatura óptima estaba
alrededor de 70ºC. La curva de temperatura está mostrada en la
figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Formulario pasa a página
siguiente)
1. (1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 4449 3256
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proceso de conversión del almidón
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patent In Release \alm{1}1.0, versión \alm{1}1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador iso 6"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador iso 7"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2181 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Rhodothermus marinus DSM 4252
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..2181
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 726 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador N"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcagtagcc catggcacat tagcgc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BX2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcggccgga ctagatctgt cttc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador SINH"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatatcaaa gcttatgaaa gatcgaccat taaagcctg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador SICX"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttgtctag atcactggaa ctctatcctc ctgta
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligo 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcaagott ggaattcgrt cgagct
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligo 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagagctcg agcgaattcc aagctt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 140 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Flavobacterium sp. FO 14590
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Flavobacterium devorans ATCC 10829
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Xanthomonas camperstris ATCC 31922
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Rhodothermus obamensis JCM 9785
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Secuencia de ADN donada que codifica una
enzima que muestra actividad isoamilasa, esta secuencia de ADN
comprendiendo:
(a) la parte de codificación de isoamilasa de la
secuencia de ADN donada en el plásmido pUC19 presente en
Escherichia coli DSM 11971;
(b) la secuencia de ADN mostrada en las
posiciones 1-2178 en la SEC ID NO: 3 o su cadena
complementaria;
(c) un análogo de la secuencia de ADN definida
en (a) o (b) que tiene al menos un 70% de homología con dicha
secuencia de ADN;
(d) una secuencia de ADN que se hibrida con una
sonda de ADN bicatenario que comprende la secuencia mostrada en
1-2178 en la SEC ID NO: 3 a astringencia media;
(e) una secuencia de ADN que codifica una enzima
que tiene la secuencia de aminoácidos dispuesta como la parte
madura de la SEC ID NO: 4; o
(f) una secuencia de ADN que es un fragmento de
las secuencias de ADN especificadas en (a), (b), (c), (d), o
(e).
2. Enzima aislada que muestra actividad
isoamilasa seleccionada del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido codificado por la parte de
codificación de la enzima isoamilasa de la secuencia de ADN donada
en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli DSM
11971;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en las posiciones
1-726 de la SEC ID NO: 4;
(c) un análogo del polipéptido definido en (a) o
(b) que tiene al menos un 70% de homología con dicho polipéptido;
y
(d) un fragmento de (a), (b) o (c).
3. Secuencia de ADN donada según la
reivindicación 1, donde la secuencia de ADN que codifica una enzima
que muestra actividad isoamilasa está obtenida a partir de un
microorganismo, preferiblemente un hongo filamentoso, una levadura,
o una bacteria.
4. Secuencia de ADN donada según la
reivindicación 3, donde la secuencia de ADN está obtenida a partir
de una cepa del género Cytophagales, tal como una cepa del
género Rhodothermus, en particular una cepa de
Rhodothermus marinus o Rhodothermus obamensis.
5. Secuencia de ADN donada según la
reivindicación 4, donde la secuencia de ADN está donada a partir de
o producida en base a un banco de ADN de la cepa Rhodothermus
marinus DSM 4252.
6. Secuencia de ADN donada según la
reivindicación 1, donde la secuencia de ADN está donada a partir de
Escherichia coli DSM 11971.
7. Enzima aislada según la reivindicación 2,
donde el polipéptido está obtenido a partir de un microorganismo,
preferiblemente un hongo filamentoso, una levadura, o una
bacteria.
8. Enzima aislada según la reivindicación 7,
donde la cepa de bacterias es una cepa del género
Rhodothermus, en particular una cepa de Rhodothermus
marinus.
9. Vector de expresión recombinante que
comprende una secuencia de ADN donada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-6.
10. Célula huésped que comprende un vector de
expresión recombinante según la reivindicación 9.
11. Célula huésped según la reivindicación 10,
que es una célula eucariótica, en particular una célula fúngica,
tal como una célula de levadura o una célula fúngica
filamentosa.
12. Célula huésped según la reivindicación 11,
que es una cepa de Fusarium, Aspergillus, Trichoderma,
Saccharomyces, Candida, Pichia, Hansenula, en particular una
cepa de Fusarium sp. que tiene la característica de
identificación de Fusarium ATCC 20334, Aspergillus Niger,
Aspergillus oryzae, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei,
Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida boidinii, Pichia
methanolica, Pichia angusta, Pichia pastoris o Pichia
anomala.
13. Célula huésped según la reivindicación 10,
que es una célula procariótica, en particular una célula
bacteriana.
14. La célula huésped según la reivindicación
13, que es una cepa de Bacillus, Lactobacillus, Brevibacillus,
Streptomyces, Escherichia en particular una cepa de Bacillus
subtilis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis,
Bacillus lentus o Escherichia coli.
15. Un método para producir una enzima que
expone actividad isoamilasa, el método comprendiendo el cultivo de
una célula según cualquiera de las reivindicaciones
10-14 bajo condiciones que permiten la producción
de la enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
16. Una enzima aislada que muestra actividad
isoamilasa, caracterizada por el hecho de (i) estar libre
de impurezas y (ii) que dicha enzima es producida por el método
según la reivindicación 15 y con una célula huésped según
cualquiera de las reivindicaciones 10-14.
17. Una composición que comprende la enzima
según la reivindicación 16.
18. Uso de una enzima según la reivindicación
16 o una composición enzimática según la reivindicación 17 para la
conversión del almidón.
19. Un cultivo biológico substancialmente puro
aislado de la cepa depositada Escherichia coli DSM 11971.
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