CN102477437A - 含重组基因的酸性α-淀粉酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种来源于芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.089的酸性α-淀粉酶编码基因amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1。利用基因amy089构建的重组微生物表达产生的重组酸性α-淀粉酶，其氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2。利用本发明获得的酸性α-淀粉酶编码基因构建重组微生物，可实现酸性α-淀粉酶的高效率生产，该酸性α-淀粉酶在淀粉加工过程中具有液化淀粉的功能。

Description

含重组基因的酸性α-淀粉酶及其用途

技术领域

本发明涉及一种含有重组基因的酸性α-淀粉酶及其用途，属于微生物、酶工程技术领域。

背景技术

淀粉是工业上制取葡萄糖和糊精的主要原料，目前工业上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法。酶法制糖工艺一般采用两步法，第一步用α-淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精，第二步用糖化酶将糊精水解成葡萄糖。淀粉颗粒在冷水中形成乳浊液，绝大部分淀粉分子包裹在淀粉酶不能到达的晶体内。当加热到60～70℃时，淀粉颗粒吸水膨胀，体积迅速增加，晶体结构被破坏，颗粒外膜裂开，形成一种糊状的粘稠液体，这一过程称为糊化。不同来源的淀粉的糊化温度不同，但一般都在55～80℃之间。淀粉糊化后，分子链直接暴露在酶分子的作用之下，分子链被迅速切断、变短，最终形成低分子量的糊精，液体粘度急剧下降，这一过程被称为液化。α-淀粉酶的作用特点是在淀粉分子链中间将α-1，4糖苷键切断，而对于已经形成的短链糊精一般并不能进一步分解，将糊精分解为葡萄糖需要由糖化酶来完成。糖化酶的最适作用温度、pH等均与淀粉酶不同，因此需调整pH后才能进入糖化过程。以上制糖工艺使用了两种酶：α-淀粉酶和糖化酶，因此常称之为双酶法制糖工艺。浓度较高的淀粉液糊化时，必须迅速液化，否则淀粉液的粘度急剧上升会使设备无法运行，因此用于淀粉液化的淀粉酶必须至少能耐受淀粉糊化所需温度。大部分的淀粉原料加水制成乳液时其pH一般在4.5左右，而目前双酶法制糖工艺中使用的糖化酶的最适pH也是4.5，因此淀粉液化工艺中淀粉酶的作用温度如果也是4.5左右则将为淀粉制糖工艺带来很大的方便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：利用基因重组技术从酸性淀粉酶产生菌基因组DNA中克隆淀粉酶编码基因并确认其功能，从而提供一种来源于芽孢杆菌的酸性α-淀粉酶编码基因，并且利用基因重组技术生产出含有该重组基因的酸性α-淀粉酶，使之用于淀粉高效加工。

本发明的技术解决方案是，一种含重组基因的酸性α-淀粉酶，其特征在于：该酸性α-淀粉酶包含来源于芽孢杆菌的酸性α-淀粉酶编码基因，所述芽孢杆菌是芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.089，所述酸性α-淀粉酶编码基因是amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1，所述酸性α-淀粉酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2。

进一步地，上述酸性α-淀粉酶编码基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子是JM109/pUC-amy089。

上述含重组基因的酸性α-淀粉酶的用途是，在淀粉加工过程中用于淀粉的液化，液化时pH为4.5，温度为65℃。

本发明的有益效果是：利用本发明获得的酸性α-淀粉酶编码基因构建重组微生物，可实现酸性α-淀粉酶的高效率生产，该酸性α-淀粉酶在淀粉加工过程中具有液化淀粉的功能，因此，应用本发明技术方案能够大幅度提高淀粉的加工效率。

具体实施方式

本发明从自然界中筛选到一株具有淀粉降解能力的芽孢杆菌，其编号为Bacillus sp.089，利用基因工程技术从Bacillus sp.089基因组DNA中克隆出一条α-淀粉酶编码基因，命名为amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ IDNO：1，其编码的酸性α-淀粉酶原酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2，基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子，分类命名为JM109/pUC-amy089。所述酸性α-淀粉酶已经经过功能鉴定证实，它在最适作用温度为65℃、最适作用pH为4.5环境下的性能，适合淀粉液化工艺的要求。

所述酸性α-淀粉酶编码基因amy089的获得方法如下：

(1)从自然界筛选产酸性α-淀粉酶的芽孢杆菌：从自然界采集土样，采用高温处理杀死营养体细胞，富集芽孢杆菌，然后在以淀粉为唯一碳源的培养基上富集产淀粉酶细菌，通过摇瓶培养和淀粉酶酶活检测筛选产淀粉酶的细菌。用16s rDNA基因序列分析确认所筛选微生物属于芽孢杆菌属，此轮工作选定芽孢杆菌Bacillus sp.089为淀粉酶基因克隆研究的出发菌。

(2)Bacillus sp.089淀粉酶基因的克隆：

第一步：Bacillus sp.089基因组文库的构建

提取Bacillus sp.089基因组DNA，用核酸内切酶EcoR I酶切所获得的基因组DNA，葡聚糖凝胶电泳分离酶切产物，回收其中2.0～5.0kb范围内的DNA片段。所回收片段与经EcoR I酶切并经碱性磷酸酶处理的大肠杆菌克隆载体pUC18连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，收集总计约10000个转化子，合并转化子获得Bacillus sp.089基因组文库。

第二步：酸性α-淀粉酶基因的克隆

将上述基因组文库适当稀释后涂布在含有2％淀粉的LB平板上，37℃培养24小时，总计在100块平板上约获得8,000个菌落。将上述平板上已经形成的菌落编号并点种到另一块添加2％可溶性淀粉的含氨苄青霉素的LB平板上，将原平板在4℃保藏，新点种获得的平板在37℃培养24小时，形成菌落后放入60℃水浴锅内，培养24小时。将上述平板从水浴锅中取出后室温放置1小时左右，将碘液倾倒在平板表面，放置5分钟后倒掉未被吸收的碘液，将平板放入4℃冰箱中放置1小时后取出观察，在总计约8,000个菌落中有一个菌落的周围形成无色透明圈。根据编号在原平板上找到对应的菌落。该菌落的编号为038-41，该菌落的转化子所含质粒命名为：pUC-amy089。

提取038-41转化子中所含质粒pUC-amy089，送上海生工生物工程公司测序。结果显示，该重组质粒含有一2067bp的插入片段，含有一1416bp的完整编码区，将编码区基因序列提交美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)用blast软件进行序列比对，结果显示，该序列与解淀粉芽孢杆菌淀粉酶基因相似性最高，相似性为73％。

(3)Bacillus sp.089α-淀粉酶基因的表达与重组酶的应用

根据SEQ ID NO：1设计一对引物以扩增Bacillus sp.089淀粉酶编码区基因。以pUC-amy089染色体DNA为模板，PCR扩增获得一1.4kb左右的DNA片段，扩增片段纯化后用EcoR I和Sal I酶切后与经同样酶切的大肠杆菌表达载体pEtac连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。任选4个转化子，提取质粒后用EcoR I和Sal I酶切质粒并电泳鉴定，结果显示，4个质粒酶切后均产生两条带，一条为5.3kb与pETac载体大小相当，另一条为1.4kb与PCR获得的Bacillus sp.089α-淀粉酶基因相当，可见均为pEtac与所获淀粉酶基因的重组质粒。重组质粒命名为pEtac-amy。

任取上述转化子一个，划线分离后任取一个单菌落，接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养至培养液浑浊度为OD600＝0.8时加IPTG至终浓度为0.5mg/mL，继续培养5小时。作为对照，空质粒pEtac的转化子也同样接种液体LB培养基并用IPTG诱导表达。诱导后的培养液用超声波破碎细胞，破碎液检测淀粉酶酶活。结果显示，含pEtac-amy的转化子破碎液有明显淀粉酶酶活。重组酶最适pH为4.5，最适作用温度为65℃。含pEtac空质粒的转化子破碎液没有淀粉酶酶活，可见上述克隆得到的基因确实为α-淀粉酶编码基因。基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子，其分类命名为JM109/pUC-amy089。

α-淀粉酶编码基因amy089能用于在不同宿主细胞中进行异源表达，表达产物用于淀粉液化。α-淀粉酶最适作用温度为65℃，最适作用pH为4.5，性能适合淀粉液化工艺的要求。

下面通过具体实例，对本发明技术内容作进一步的详细描述。

(一)产酸性α-淀粉酶芽孢杆菌Bacillus sp.089的获得

从自然界筛选产酸性α-淀粉酶的芽孢杆菌：从无锡市大浮茶场附近采集pH值为4左右的酸性土样。在实验室中，将上述土样放入烧杯中，加5倍双蒸水，混匀后在100℃保温1小时。取少量上述混合液涂布以淀粉为唯一碳源的固体培养基平板，37℃培养三天，共获得976个菌落，显微镜观察确定其中387株为杆状细菌。将上述杆状细菌的菌落分别划线分离后以单菌落接种发酵培养基，摇瓶培养2天后取上清液检测α-淀粉酶酶活，其中3株菌培养液中检测到明显的α-淀粉酶活性。分别进行细菌的16s rDNA基因序列分析，其中编号为089的细菌的16s rDNA基因部分序列为SEQ ID NO：3，利用BLAST软件将SEQ ID NO：3与美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov，简称NCBI)收录的基因序列进行比对，结果显示SEQ ID NO：3与Bacillus cereusSBD2-1的16s rDNA基因序列(NCBI登录号：HQ236041.1)最为接近，相似性为87％。根据以上实验结果，089细菌应属于芽孢杆菌属，命名为Bacillussp.089。Bacillus sp.089被用于下一步实验。

(二)Bacillus sp.089α-淀粉酶基因的克隆

第一步：Bacillus sp.089基因组文库的构建

提取Bacillus sp.089基因组DNA，用核酸内切酶EcoR I酶切所获得的基因组DNA，葡聚糖凝胶电泳分离酶切产物，回收其中2.0～5.0kb范围内的DNA片段。所回收片段与经EcoR I酶切并经碱性磷酸酶处理的大肠杆菌克隆载体pUC18连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，在所涂布的100块LB平板上，共计获得约10000个转化子菌落。在上述每个平板上倾倒约5mL LB液体培养基，用1mL移液器吸取LB液体培养基对准平板上的菌落进行吹洗，将菌落洗下。最后将从平板上洗下的含有重组大肠杆菌的菌液收集合并即获得Bacillus sp.089基因组文库。

第二步：酸性α-淀粉酶基因的克隆

将上述基因组文库适当稀释后涂布在含有2％淀粉的LB平板上，37℃培养24小时，总计在100块平板上约获得8,000个菌落。将上述平板上已经形成的菌落编号并点种到另一块含氨苄青霉素的LB平板上，将原平板在4℃保藏，新点种获得的平板在37℃培养24小时，形成菌落后放入60℃水浴锅内，培养24小时。将上述平板从水浴锅中取出后室温放置1小时左右，将碘液倾倒在平板表面，放置5分钟后倒掉未被吸收的碘液，将平板放入4℃冰箱中放置1小时后取出观察，在总计约8,000个菌落中有一个菌落的周围形成无色透明圈。根据编号在原平板上找到对应的菌落。该菌落的编号为038-41，该菌落的转化子所含质粒命名为：pUC-amy089。

提取038-41转化子中所含质粒pUC-amy089，送上海生工生物工程公司测序。结果显示，该重组质粒含有一2067bp的插入片段，含有一1416bp的完整编码区，将上述1416碱基片段的核苷酸序列提交美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)用blast软件进行序列比对，结果显示，该序列与Bacillus amyloliquefaciens DSM7淀粉酶基因相似性最高，为73％。上述1416bp的完整编码区序列为SEQ ID NO：1。Bacillus amyloliquefaciens DSM7淀粉酶基因在美国国家生物技术信息中心的序列登录号为：FN597644。

(三)Bacillus sp.089α-淀粉酶基因的表达与重组酶的应用

根据SEQ ID NO：1设计一对引物以扩增Bacillus sp.089淀粉酶编码区完整基因。引物序列如下：

5’-AATTGAATTCATGATGCAAAAACTAAAGCG-3’(SEQ ID NO：4)

5’-AATTGTCGACTTATTTGACA TAAATAGAG-3’(SEQ ID NO：5)

以pUC-amy089为模板，PCR扩增获得一1.4kb左右的DNA片段，扩增片段纯化后用EcoR I和Sal I酶切后与经同样酶切的大肠杆菌表达载体pEtac连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。任选4个转化子，提取质粒后用EcoR I和Sal I酶切质粒并电泳鉴定，结果显示，4个质粒酶切后均产生两条带，一条为5.3kb与pEtac载体大小相当，另一条为1.4kb与PCR获得的Bacillus sp.089α-淀粉酶基因相当，可见均为pEtac与所获淀粉酶基因的重组质粒。重组质粒命名为pEtac-amy。

任取上述转化子一个，划线分离后任取一个单菌落，接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养至培养液浑浊度为OD₆₀₀＝0.8时加入IPTG至终浓度为0.5mg/mL加入IPTG至终浓度为0.5mg/mL，继续培养5小时。作为对照，空质粒pETac的转化子也同样接种液体LB培养基并用IPTG诱导表达。诱导后的培养液用超声波破碎细胞，破碎液检测淀粉酶酶活。结果显示，含pEtac-amy的转化子破碎液有明显淀粉酶酶活。重组酶最适pH为4.5，最适作用温度为65℃。含pETac空质粒的转化子破碎液没有淀粉酶酶活，可见上述克隆得到的基因确实为酸性α-淀粉酶编码基因。基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC18-amy089的大肠杆菌转化子，其分类命名为JM109/pMD-PA。

(四)基因amy089的应用

α-淀粉酶编码基因amy089能用于在不同宿主细胞中进行异源表达，表达产物用于淀粉液化。α-淀粉酶最适作用温度为65℃，最适作用pH为4.5，性能适合淀粉液化工艺的要求。

材料和方法

普通分子生物学方法：

除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。

引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。

克隆载体pUC18为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号为D506A。

大肠杆菌JM109，大肠杆菌表达载体pEtac(沈微，王正祥，唐雪明等.古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达.中国酿造，2003，124(1)：12-14.)均由中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。

DNA操作使用的酶和试剂盒

除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品Ex Taq，产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时附赠，缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶中回收DNA片段的试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号分别为DV807A和DV805A，DNA纯化以及从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法均按上述试剂盒说明书操作。细菌基因组DNA小量提取试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品，细菌基因组DNA提取方法按上述试剂盒说明书进行。

其它试剂

可溶性淀粉为浙江菱湖淀粉厂产品，酵母氮基为Difco公司O/O型酵母氮基，该产品不含碳源和氨基酸。酶活检测用的淀粉溶液均采用10mM的磷酸缓冲液配制，磷酸缓冲液使用双蒸水配制，不同pH的磷酸缓冲液按文献(诸葛健王正祥编著：工业微生物实验技术手册.北京：中国轻工业出版社，1994：682～683.)介绍的方法配制。诱导大肠杆菌基因表达使用的IPTG为宝生物工程有限公司产品，产品编号为D9030A。

培养基

LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。以淀粉为唯一碳源的固体培养基：酵母氮基1g/L，淀粉2g/L，琼脂粉15g/L，用双蒸水配制；摇瓶发酵培养基：酵母氮基1g/L，淀粉2g/L，(NH3)2SO4 0.1g/L，用双蒸水配制。摇瓶培养均采用500mL三角瓶，在37℃条件下按220r/min条件在恒温摇瓶柜中进行。

碘溶液

按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京：轻工业出版社]中第398页“稀碘液”配制。

细菌的16s rDNA基因序列分析

按文献进行[陈源源，牛丹丹，王正祥.一种快速鉴定细菌的方法.食品与发酵工业，2007，33(5)：29-31]。

淀粉酶酶活力测定

按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京：轻工业出版社]介绍的方法进行。

Claims (3)

1.含重组基因的酸性α-淀粉酶，其特征在于：该酸性α-淀粉酶包含来源于芽孢杆菌的酸性α-淀粉酶编码基因，所述芽孢杆菌是芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.089，所述酸性α-淀粉酶编码基因是amy089，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1，所述酸性α-淀粉酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ IDNO：2。

2.根据权利要求1所述的含重组基因的酸性α-淀粉酶，其特征在于：所述酸性α-淀粉酶编码基因amy089与克隆载体pUC18组成的重组质粒pUC-amy089的大肠杆菌转化子是JM109/pUC-amy089。

3.权利要求1所述的含重组基因的酸性α-淀粉酶的用途，其特征在于：所述酸性α-淀粉酶在淀粉加工过程中用于淀粉的液化，液化时pH为4.5，温度为65℃。