DD207553A5 - Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von staerke unter verwendung von amylase - Google Patents

Abstract

Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Staerke aus Amylase, die aus einem rekombinate DNS enthaltenden, genetisch erzeugten Mikroorganismus hergestellt wurde. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Staerke unter Einsatz einer Amylase, die durch Kultivieren eines auf genetischem Wege erzeugten Mikroorganismus gewonnen wurde, der rekombinante DNS enthaelt. die rekombinante DNS enthaelt ein Amylase codierendes Gen und wird durch ein in vitro Verfahren, bei dem die von einem bakteriellen Donatormikroorganismus stammende DNS aufgespalten wird. Die resultierenden DNS-Fragmente werden mit einem Vektor verbunden, der auf aehnliche Weise aufgespalten worden ist. Das Verfahren ist gekennzeichnet dadurch, dass der Vektor ein Plasmid oder die DNS eines Derivates des Phagen Lambda ist. Der Donatormikroorganismus ist vorzugsweise ein Bacillus- oder ein Klebsiella-Stamm. Der Vektor kann eine Phage oder ein Plasmid sein. Der Wirtsmikroorganismus ist vorzugsweise E.coli oder B.subtilis. Das hergestellte Amylaseenzym ist vorzugsweise eine Alpha-Amylase, eine Beta-Amylase oder eine Pullulanase.

Description

Ausscheidung II au AP С 12 N/2 (58 809/13)

AP С 12 N/227 656/7

Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Stärke unter Verwendung von Amylase

Anwendungsgebiet der Erfindung . ' -

Die vorliegende Erfindung aus dem Bereich des genetic _л engineering betrifft, im besonderen auf die Herstellung von rekombinanter, ein Amylase codierendes Gen enthaltender DNS (Desoxyribonukleinsäure) sowie auf die Mutzung derselben zur Herstellung von Mikroorganismen mit dem Ziel der umfangreichen Produktion von amylolytischen Enzymen.

Obwohl der Begriff "genetic engineering" bzw. genetisches ' Ingenieurvvesen häufig verwendet wird, um eine große Anzahl von Techniken zur künstlichen Modifikation der genetischen Information eines Organismus zu beschreiben., wird ar in der'folgenden Beschreibung und im Erfindungsanspruch lediglich für die in-vitro-Technik der Bildung rekombinanter DNS aus einem Donator-Mikroorganismus und einem geeigneten Vektor, für das Selektieren auf Basis der envü.nsch- ' ten genetischen Information und für das Einführen der selektierten DNS in einen geeigneten Mikroorganismus (Wirts-Mikroorganismus) benutzt, wobei die erwünschte (fremde) genetische information Teil des genetischen Komplements des Wirtes wird. Der Begriff "genetisch modifi-

• zierter Mikroorganismus", wie er nachfolgend verwendet wird, bezieht sich auf einen mit Hilfe dieser Technik veränderten Mikroorganismus, Die Begriffe "Amylase" und "amylolytisches Enzym" sind

-1,QE1198 2* 051603

24 5 45 2

-Synonyma und beziehen sich nachfolgend im weitesten Sinne auf jene zur Katalyse der Stärkehydrolyse fähigen Enzyme wie'etwa' Alpha-Amylase, Seta-Amylase, Iso-Amylase (einschließlich der Alpha-l,6-glukosidasen wie etwa Puilulanase), Glukoamylase usw._;

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

γ ·. . ' . Selbstverständlich ist in den-letzten Oahren bereits sehr viel über genetisches Ingenieurwesen geschrieben worden (zwei der vielen ausgezeichneten Arbeiten sind "DNS-Klonung und die Analyse der Plasmidstruktur und -funktion" von K. N, Timrais, S. N. Cohen und S, C. Cabello, Prop. Holec. ' subceir ЗіоІ« 6, 1978, Seiten 1 bis 58 und "Lamboid-Phagen, die die Rückgewinnung von in-vitro-Rekombinanten vereinfachen" von Noreen E. Murray, W, 0. Bramraer und K. Murray» Holec. gen. Genet. 150, 1977, Seiten 53 bis 56), einschließlich vieler Berichte über neue, genetisch modifizierte Mikroorganismen mit wertvollen Eigenschaften. Die OA-PS'SHQ 52-75480 offenbart die Herstellung von Mikroorganismenstämmen hoher Amylaseproduktion mit Hilfe von _;/ in-vivo-Techniken der-Mutagenese, Transduktion und Transformation zur Akkumulation verschiedener genetischer Merkmale zwecks Amylaseproduktion in einem Bacillus-Mikroorganismus. Diese Techniken, die mit der-Gentechnik im hier definierten Sinne nichts gemein haben, sind auf einen einzelnen Mikroorganismus oder einige wenige (genetisch gesprochen) eng verwandte Mikroorganismen begrenzt. Auch sind diese Stämme für die in der vorliegenden Erfindung für dia gesteigerte Enzymproduktion genutzte Gen-Verstärkung (z, B. durch Phage oder Plasmid) nicht zugänglich. In einem jüngst von Yuко Yoneda, Scott Graham und Frank E. Young veröffentlichten Artikel "Klonierung eines Alpha-Amylase codieren-den Fremdgens in Bacillus subtilis",. Biochemical and' Biophysical Research Communications 91, Nr. 4,

A ,νς і.Г Л Λ 2.9.1982

L 4 D 4 Э Z Ö - 3 - -6.1 353/13

Seiten 1556 bis 1564 (23. Dezember 1979) beschreiben die Autoren das Klonieren eines Alpha-Amylase codierenden Gens in einen Bacillus subtilis durch Verbinden gespaltener : DNS von Bacillus amylolicuefaciens H mit der DNS des gemäßigten Phagen phi 3T und anschließendes Transformieren von Amylase-schwachen Bacillus subtilis-Zellen. Die Autoren geben keinen Hinweis zur Verstärkung des Gens und eine damit verbundene verstärkte Produktion des Amylaseenzyms, worin der Hauptzweck der hier vorliegenden Erfindung besteht. .

Ziel der Erfindung »

Es .ist das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur enzymatischa-i Hydrolyse von. Stärke aus Amylase, die aus einem rekombinante DNS enthaltenden, genetisch erzeugten Mikroorganismus hergestellt wurde, zur Verfugung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das mit Hilfe genetisch modifizierter Mikroorganismen arbeitet, um dabei unter geeigneten Kultivierungsbedingungen erheblich größere Mengen an amylolytischen Enzymen als der Donor-Mikroorganismus produzieren zu können.

In einer bevorzugten Ausführungsform verfugen die so erzeugten Amylasen über eines oder mehrere Merkmale, die sie insbesondere für industrielle en'zymatische Stärke-Hydrolysen (s. B. die enzymatische Verflüssigung und/oder Verzuckerung von Stärke zur Erzagung von Bindemitteln, Leimen, Maltodextrinen, Stärkesirupe unterschiedlicher Zusammensetzungen, Maltose, ''Dextrose usw.) geeignet machen, wie beispielsweise Widerstandsfähigkeit gegen hohe Temperatur,

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Widerstandsfähigkeit gegen giftiges Schwermetall usw.

Erf inciungsgemäß wird zuerst DNS aus einem bakteriellen Mikroorganismus (dem Donor-Mikroorganismus) _t der zur Produktion mindestens eines amylolytischen Enzyms fähig ist, extrahiert. Dann erfolgt das Spalten (mit einem geeigneten Restriktionsehzym) der DNS sowie als Vektor der DNS eines Phagen-Lambda-Derivates, und schließlich werden die resultierenden Fragmente zwecks Bildung der rekombinanten DNS, von denen einige ein Amylase codierendes Gen enthalten werden, kombiniert und verbunden. Die rekombinanten DNS werden dann durch Insertion¹ in geeignete 'sV'irtszellen (z. B. E. coli) vermittels in-vitro-Enkapsidation oder Transfek-? tion biologisch 'aktiviert. ' '

Die hieraus hervorgegangenen Klone werden nun hinsichtlich des Vorhandenseins eines Amylase codierenden Gens überprüft, ein oder mehrere positive Klone werden ausgewählt und vermehrt, womit neue genetisch modifizierte bakterielle Mikro-Organismen entstehen, die unter-geeigneten Kultivierungsbedingungen wesentlich größere Araylasemengen erzeugen, als sie von den Donor-Mikroorganismen produziert werden können. Die DNS des neuen Phagen kann gegebenenfalls extrahiert, gespalten und in einen zweiten Vektor subkloniert werden, der seinerseits entweder ein Plasmid oder ein anderer Phage sein kann> Die neuen Klone können erneut im Hinblick auf das Vorhandensein eines Amylase codierenden Gens überprüft und selektiert werden. Desgleichen können weitere "Sub-sub-Klonierungen" vorgenommen werden.

Zusätzlich zur Erstellung neuer, genetisch modifizierter Mikroorganismen mit der Eigenschaft von Amylase-"Gberproduzenten" weist die Erfindung den weiteren Vorteil auf,

4 5 4 5 2 8.

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daß der Transfer·vorrangig Series für die Produktion eines einzelnen amylolytischen Enzyms zuständigen Gens erfolgt, wodurch die bei Kulturen von nicht genetisch modifizierten, , Mikroorganismen notwendige Reinigung weitgehend eingeschränkt wird.

Wenn der die erwünschte rekombinante DNS enthaltende genetisch modifizierte Mikroorganismus einmal hergestellt worden ,ist, dann wird er in einer Weise kultiviert, die den Anteil an rekombinanter DNS verstärkt und somit Amylase in .wesentlich größeren Mengen bereitstellt, als dies durch den Donor-Mikroorganismus möglich ist.

Wenn es sich bei dem Vektor um ein Derivat des Phagen Lambda handelt - in diesem Fall muß der Wirts-Mikroorganis^mus £« coli sein - kann Amplifikation und Enzymproduktion folgendermaßen realisiert werden. Ist der Phage lytisch, so wird der vVirts-Mikroorganismus, beispielsweise E, coli, zunächst zur Vermehrung der Zellen bis zur geeigneten Dichte kultiviert, die Zellen dann mit einer ausreichenden Menge des Bakteriophagen infiziert und schließlich das System bis zur Zerstörung der Zellwände kultiviert. Die Äraylase dringt dann in das Kulturmedium ein.

Handelt es sich bei dem Vektor-Wirt-System um ein geeignetes Lambda-lysogenes E. coli, dann wird der infizierte Wirts-f-likroorganismus zunächst zwecks Vermehrung der bakteriellen Zellen bis zur geeigneten Dichte bei 32 ⁰C kultiviert, ., Danach wird die Temperatur auf 42 C gesteigert und für eine bestimmte Zeit auf dieser Höhe gehalten, um den lytischen Zyklus zu induzieren. Anschließend wird die Temperatur auf 37 C eingestellt, um die Amplifikation der fremden vorhandenen DNS mit der sie begleitenden umfangreichen Ämylaseproduktion in Gang zu setzen. Die Zeil-

. , . 2..9.1982 _i

2Д 5 Д5 2 8 -⁶- , ' ^61353/1S

wände werden möglicherweise zerstört, abhängig von den jeweiligen Bedingungen, wobei es in einem solchen Fall ,zum .. übertritt von'Amylase in das' Kulturmedium kommt.

Handelt es sich bei dem Vektor um ein Vielfachplasmid wie etwa pBR 322 oder pACYC 184, dann wird die Amplifikation der fremden DNS per se erreicht. Anderenfalls wird der , die Plasmid-DNS enthaltende, genetisch modifizierte Mikro-, - % Organismus zunächst zwecks Vermehrung der¹ bakteriellen Zellen bis zur gewünschten Dichte kultiviert, danach wird Chloramphenicol, zugesetzt, Da das Antibiotikum die Protein· synthese inhibiert, verhindert es weitere Zellteilung und Amylaseproduktion, erlaubt aber die Amplifikation der Plasmid-DNS in den Zellen. Abschließend werden diö Zellen vom Kulturmedium getrennt und zur Entfernung des Chloramphehikols gewaschen. Zur Amylaseproduktion werden die Zellen dann - selbstverständlich in Abwesenheit von Chloramphenikol - rekultiviert.

Selbstverständlich muß bei jedweder genetischen Modifikationstätigkeit "markiert" werden können, wodurch es'ge-

'""~\ lingt, die Klone mit der gewünschten genetischen Informa-

^ч j ' ...

tion zu selektieren. Praktisch kann dies erfindungsgemäß leicht durch Anlegen einer Plattenkultur auf stärkehaltigem Medium realisiert werden, wenn die Aktivität von \ Alpha-Amylase., Beta-Amylase oder Glukoamylase zu ermitteln ist. Das Kulturmedium-wird sodann mit 3od gefärbt. Klone, die auf einem stärkehaltigen Medium Amylaseaktivität entfalten, sind von einer weißen Fläche umgeben. Eine spezifische, besser geeignete Färbamethode wird weiter unten ... beschrieben. Geht es um die Auffindung von Pullulanaseaktivität, dannvverden die Klone nach dem Plattenverfahren auf Einern Pullulan enthaltenden SBL-Tryptikase-Medium gebracht. Diese Technik wird weiter unten detaillierter beschrieben. . ' ·. '

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⁷ - ⁵¹

Es folgt nun eine detailliertere Beschreibung sins.chlieSlich der spezifischen Materialien und der angewendeten Techniken. Man wird bemerken, daß viele der genutzten Techniken "Standard" darstellen und dem Fachmann auf diesem Gebiet ' wohlbekannt sind; zur Gewährleistung einer klaren Aussage sollen nichtsdestoweniger auch einige dieser Techniken im Detail beschrieben werden, ·

Donator-Mikroorganismus. Der Donator-Mikroorganismus sollte ein bakterieller Mikroorganismus und in der Lage sein, mindestens eine Amylase (einschließlich natürlich der gewünschten Amylase) zu produzieren; vprteilhafterweise sollte er zu einer Amylase mit den in der industriellen Stärkehydrolyse erwünschten Eigenschaften wie beispielsweise Hitzeunempfindlichkeit oder Widerstandsfähigkeit gegen Metallgifte führen. Bei dem Donator könnte es sich auch um einen eukaryotischen amylaseproduzierenden Mikroorganismus (z. 8. einen Pilz oder eine Hefe) handeln. Wegen der relativen Einfachheit des Arbeitens mit einer prokaryo*· tischen DNS-Quelle im Vergleich zu den Eukaryoten, beschränkt sich diese Arbeit auf Bakterien und ist daher auf die Verwendung eines bakteriellen Donators begrenzt. Wie aus den Beispielen zu entnehmen.* sind Kulturstämme von Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae zur Erzeugung genetisch modifizierter Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Bildung großer'Mengen von Alpha-Amylase, hitzebeständiger Alpha-Amylase, 3eta-Amylase und Pullulanase erfolgreich eingesetzt worden.

Ligasen und Restriktionsenzyme. Es wurde durchweg T4-0MS-Ligase als verbindendes Enzym benutzt. Es kann aber auch jedes andere DNS-verbindende Enzym verwendet werden. Die

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eingesetzten spezifischen _rRestriktionsenzyrae werden in den Beispielen erläutert. Die Auswahl eines geeigneten ,Restriktionsenzyms kann-vom Fachmann unter Mutzung bekannter Techniken natürlich selbst vorgenommen werden. Dia hier verwendete Methode der Selektion eines Restriktionsenzyms zur weiteren Versuchsdurchführung bestand im Abspalten der vom Donator-Mikroorganismus extrahierten DNS (der Donator-DNS) durch verschiedene Restriktionsenzyme sowie im Auswählen des einen (oder auch mehr als einen) für die Weiterarbeit bestgeeigneten Enzyms, wobei von der Fähigkeit des Enzyms, die DNS in zahlreiche Fragmente im GröBenbereich von 2 bis 15 Kilobasen zu schneiden, ausgegangen wurde.

Vektoren. Aus verschiedenen Gründen'sind insbesondere Derivate des Phagen Lambda für die Klonierung der vom Donator extrahierten DNS geeignet, (1) Mut'ä_nten des Phagen Lambda mit Verluststellen ermöglichen den Einbau von fremden DNS-Fragmenten verschiedener Größe (in Abhängigkeit natürlich vom spezifischen Lambda-Derivat) und ermöglichen weiterhin die einfache Identifikation jener Klone, die fremde DNS enthalten. (2) Es sind verschiedene Derivate des Phagen Lambda entwickelt worden, die den Einsatz von mehreren Restriktionsenzymen gestatten und somit die Chancen für ein erfolgreiches Klonieren steigern. (3) Bei Verwendung geeigneter Derivate des Phagen Lambda sind sehr gute Amplifikationen von Fremdgehen möglich. (4) Nach der Ligation kann die Rückgewinnung der rekombinanten Klone unschwer durch Transfektion oder in-vitro-Zusammenschluß erfolgen. Auf Gru,nd seiner Vielseitigkeit, die kein anderer gegenwärtig existierender Vektor vermittelt, werden erfin-.dungsgemäß Derivate des Phagen Lambda sowie S. coli als Vi/irt zur Initialklonierung der vom Donator extrahierten DN3 eingesetzt. . . .

,* ψ- Γ" f\ 2.9.1982

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Weitere Vorteile der Verwendung eines Phagen anstelle eines Plasmids zur primären Klonierung sind: (i) Der Prozentsatz von Rekombinanten mit fremden DNS-Einlagerungen ist höher; (2) die Bakterien liegen in gelöstem Zustand vor, wodurch die Zellinhalte und damit jegliche Amylase im Medium freigesetzt werden und damit die Nachweisführung mit Hilfe der Sod-Färbetechnik erleichtert wird; (3) die Widerstandsfähigkeit- eines Phagen gegenüber Ood ist größer als die Widerstandsfähigkeit irgendeines lebenden Bakteriums,

Dem versierten Genetiker fällt die Auswahl eines geeigneten Plasmids als Vektor für eine Sub-Klonierung nicht schwer, ein Grund natürlich, das Vorhandensein eines einzelnen oder einerj begrenzten Anzahl von Restriktionsstellen für das Restriktionsenzym auszunutzen»

Die im größten Teil der vorliegenden Erfindung verwendeten^ Plasmide sind pBR 322 und pACYC 184. Im intakten Zustand überträgt das Plasmid p8R 322 Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetrazyklin und enthält eine einzelne Restriktionsstelle jeweils für Pst I-, Eco RI-, Hind III-, Bam HI- und Sal I-Enzyme. Schneiden und Einbau an ,der Pst I-Stelle zerstört die Fähigkeit zur übertragung von Resistenz gegenüber Ampicillin, während Einbau in die Barn HI- und SaI I-Stellen die Widerstandsfähigkeit gegenüber Tetrazyklin aufhebt. Einbau in die Hind HI-Stelle zerstört mitunter die Resistenz gegenüber Tetrazyklin, vorausgesetzt, das klonierte Gen besitzt keinen eigenen Proraotor,

Im intakten Zustand überträgt das Plasmid pACYC 184 Resistenz gegenüber Tet ra'zyklin und Chloramphenikol und enthält^ einzelne Restriktionsstellen jeweils für Eco RI-, Hind III-, 3am HI- und Sal I-Enzyme. Schneiden und Einbau

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an der Eco Rl-Stelle zerstqrt die Fähigkeit-zur übertragung von Resistenz gegenüber Chloramphenikol, während Einbau \ ' ' an den drei anderen Stellen für Hind III, Bam HI und Sal I

die gleichen Wirkungen wie beim Pläsmid pBR 322 hat, da ' diese Region beiden Plasmiden gemeinsam ist.

Für die Sub-Klonung in Bacillus subtilis Wurde · das Plasmid pC 194 als Vektor verwendet. Dieses Plasmid hat eine' einzelne Hind III-Stel!e und'überträgt Resistenz gegenüber Chloramphenikol.

Wirtsmikroorganismus. Da Abkömmlinge des Phagen Lambda nur ⁱⁿ -* ⁰⁰^-J- expriraiert werden können, kommt notwendigerweise auch nur Ei coli als Wirt für die gemäß der Erfindung hergestellte rekombinante Phagen~DNS in Frage. Liegt andererseits die rekombinante DNS in Form eines Plasmids vor, dann kann jedweder zur Annahme und Replikation derartiger Plasmid-QNS fähige Mikroorganismus, wie beispielsweise andere bakterielle Mikroorganismen oder Hefen щ etwa Saccharorayces cerivisiae verwendet werden.

Г^\ ' Aus praktischen Gründen heraus wurden bei einem Großteil dieser Arbeit E-acoli-Kulturstämme (z. B. HB 101) genutzt, da sie in genetischer Hinsicht wohlbekannt sind, von bekannten Phagen und Plasmiden infiziert werden und daraufhin eine gesteigerte Kapazität zur Enzym-Oberproduktion zeigen.

Wie in Beispiel II A beschrieben, kann,die Subklonierung eines rekombinanten Plasmids in ein zur Raplikation in 3. subtilis befähigtes Plasmid wie pC 194 vorgenommen werden . .. ' ,

Verfahren. Das Verfahren vyird als zweistufiger Klonierungsversuch beschrieben,wobei in der ersten Phase ein Phage und im "zweiten Stadium ein Piasmid verwendet Wird.

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Nach dem Auswählen des Donator-Mikroorganismus, der Restriktionsenzyme und Ligasen sowie'des spezifischen Derivats -vom ' Phagen Lambda werden deren DNS extrahiert, gespalten (restricted), gemischt und die übereinstimmenden Stücke verbunden - all dies mittels herkömmlicher Techniken, die hier keiner Beschreibung bedürfen.

Nun wird die DNS durch Transfektion oder in-vitro-Hnkapsidation in E,- coli biologisch aktiviert. Bei der vorliegenden Arbeit mit Lambda-DNS wurde in Anwendung der Enkapsidation ein sehr guter Erfolg erzielt (B. Hohn und K. Murray, Proc. Natl. Acad. Sei, 'USA ₁ 74, 3259 bis 3263, 1977). Die mit fremder DNS versehenen Klone werden anschließend dreh geeignete Methoden identifiziert. Wird ein Insertionsvektor wie etwa Lambda NM 590 oder Lambda MM 607 verwendet, dann bilden die Fremd-DNS enthaltenden Klone klare Plaques, während die Klone ohne Fremd-DNS trübe Plaques ergeben. Bei Verwendung eines Ersatz-Vektors wie etwa Lambda NM oder Lambda NM 781 kann die Identifikation durch Plattenkultur auf einem E. coli Bernsteinlack-Rezipienten auf Laktqse-Indikatormedium wie z. B, McConkey, EMB oder X gal vorgenommen werden.

Viele (mehrere Tausend) jener Klone, die fremde DNS aufgenommen haben, werden daraufhin im Plattenverfahren af stärkehaltigen Medien angesetzt und mit Hilfe der bereits erwähnten Ood-Färbemethode hinsichtlich der Anwesenheil: eines Araylase codierenden Gens durchgeprüft. Mit großer Sorgfalt muß selbstverständlich darauf geachtet werden, daß keine zu hohe, den Phagen tötende dod-Konzentration angewendet wird; dies kann sich als problematisch erweisen, da das Ood in Form einer Lösung zugesetzt wird. Die bevor-

4 b Z

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zugte Färbetechnik bestand in einer kurzzeitigen Exposition der Platten gegenüber Ood-Dämpfen. Diese Technik wurde mit sehr gutem Erfolg angewendet. , -

Im folgenden soll eine vorteilhafte" Methode zur Auffindung von Klonen mit Pullulanase-Aktivität beschrieben herden, bei der keine Ood-Färbung vorgenommen wird. Die Phagen werden im Plattenverfahren auf Petrischalen angesetzt, welche BBL- T ryp ti käse plus Pullulan in einer Konzentration von etwa 0,25 % enthalten. Das Pullulan im Medium um die ' "positiven" Plaques herum wird'durch' die Pullulanase zu Maltotriose hydrolysiert, wobei die Maltotriose ihrerseits von den Bakterien verbraucht wird. Damit gedeihen die 'durch die Maltotriose ernährten Bakterien besser als die im Umfeld. befindlichen; als Folge erscheinen die Pullulanase produzierenden Plaques von einem undurchsichtigen Ring wachsender Bakterien umgeben und können somit leicht nachgewiesen werden. Diese Technik wird in Beispiel IV detailliert beschrieben. , ·

Ein (oder mehrere) positiver Klon wird nun aufgenommen und vermehrt. Dabei kann es sich ura den "endgültigen" genetisch modifizierten Mikroorganismus handeln, welcher nun zur Erzeugung großer Ämylasemengen durch'geeignete Kultivierung in der bereits beschriebenen Weise verwendet werden kann. Andererseits kann der Klon als DNS-Quelle für eine zweite Klonierung in ein Plasmid oder einen anderen, besser geeigneten Phagen herangezogen werden. Im folgenden soll das Verfahren der Subklonung in ein P/lasmid beschrieben werden.

Die DNS der Klone wird ebenfalls unter Zuhilfenahme von Standard-Techniken extrahiert und'mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Das Plasmid, wird in ähnlicher 'Weise' ge-

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schnitten, die i-ragmente v/erden vermischt und die rekotnbinierten Fragmente miteinander verbunden. Bei Verwendung des Plasmids pB^vR 322 erfolgt der Nachweis jener Klone, die DNS mit einem Amylase codierenden Gen aufgenommen haben, durch biologische Aktivierung in einem Ш.rt .wie etwa E. coli« Dies'erfolgt in Abhängigkeit vom verwendeten Restriktidnsenzym durch Transformation in einem Ampicillin oder Tetrazyklin enthaltenden Kulturmedium. Das Kulturmedium soll ebenfalls Stärke oder Pullulan enthalten, und die Identifikation der Klone mit einem Amylase codierenden Gen erfolgt gemäß einer der bereits beschriebenen Techniken. Positive Klone.werden anschließend kultiviert, und die Piasmid-DNS kann dann mit Chloramphenikol in der bereits geschilderten Weisen arnplif iziert werden.

Die Zeichnungen vermitteln, die Struktur des V/ildtyp-Bakteriophagen .Lambda (Fig,' 1 a) und aller verwendeten Vektoren sowie der nach den folgenden Beispielen gewonnenen neuen rekombinanten Plasmide. Im einzelnen enthält Fig. 1 darüber hinaus Darstellungen der Phagen Lambda NM 590 (b) und Lambda NM 7Sl (с), (Murray; N. E., Brammar, W. 0., Murray, K., (1977) Molec. gen. Genet. 150, 53 bis Sl). Fig. 2 enthält die Struktur der Plasmide pBR 322 (Зоііѵаг/ F., Rodriguez, R. I«, Greene, P. 0., Betlach, M. С«, Heyneker, H. L., Зоуег, H. W. (1977), Gene 2, 95 bis 113) und pACYC 184 (Chang, A. C. Y., Cohen, S. N. (1973) α. Bact. 134, 1141 bis 1156).

Fig. 3 stellt die Struktur des neuen Plasmids pCP 1 dar und Fig. 4 die des neuen Plasmids pCP 2.

.« .«' ." - ' · , 2.9..1982

5 452 .8 - І4 - . . 61353/18.

Fig. 5 erläutert das Beispiel II A.durch Darstellung der Plasmide pC 194, pCP 2,3 und des. neuen "End"-Plasmids PCH 1. ^r ,

Fig. 6 und 7 zeigen die Plasmide pQP 3 bzw. pCP 4.

In allen Darstellungen dar neuen rekombinanten Plasmide ist die Donator-DNS durch eine stark gezogene Linie, gekennzeichnet. .

Die Beispiele sollen die Praxis der Erfindung veranschaulichen. Sie dienen lediglich erläuternden Zwecken und sollten nicht im Sinne irgendeiner Begrenzung der Erfindung asgelegt werden. . . .

Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die mitgeteilten Prozentsätze auf Masse-Prozent. Alle Versuche wurden unter Einhaltung der NIH (U.S.A.)-Richtlinien angestellt.. -

Beispiel I '

Klonierung eines Alpha-Amylase-Gens

Verwendet wurden die folgenden Materialien: _'

Restriktions-Sndonuklease Hind III.

T4 DNS Ligase.

Phage -Lambda NM 590, Die Phagen-DNS wurde durch Phenolextraktion aus hochreinen Phagenpartikeln gevionnen.

Plasmid p3R 322. Plasmid-DNS wurde as Lysozym-lysierten E, coli-Zellen in Caesiumchlorid-ethidiumbromid Dichtegradienten isoliert. . . .

y/i^rts-Mikroorganismus , E₄'.coil.HB 3,01. _t

Als Donor-Mikroorganismus diente ein Kulturstarnm von Bacillus megaterium mit nachstehenden mikrobiologischen Eioenschaften: . . ' ·

2.9.1982 . ,

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(1) Morphologie: -st.äbchenförmig (0,5 bis 0,7 μ χ 2,0 bis

, · · . 5,0 ^), beweglich, grampositiv, terrainale bis ..subterminals. Sporen.

(2) Nährbouillon: gutes Wachstum.

(3) Nähragarbouillon: gutes Wachstum; die Kolonien sind is der Mitte dichtgelagert, im Randgebiet diffuser.'

(4) Milch: Peptonisation ohne Veränderung des pH-Wertes.

(5) Gelatine: keine Verflüssigung. "(6) Reduktion von Nitraten: negativ.

(7) Katalasereaktion: negativ. ,

(8) Oxydasereaktion: negativ.

(9) Zytochrom-Oxydasereaktion: negativ. .

(10) Indolproduktion: negativ.

(11) HpS-Bildun-g: negativ.

(12) Kohlenhydratasnutzung: verwertet Arabinose, Xylose,, (Laktose, Glukose, Lävulose, Maltose, Raffinose, Saccharose sowie Stärke und produziert daraus Säure. Rhamnose, Mannose, Melibiose, Inulin und Salizin werden nicht verwertet. ,

(13) Verwertung von Polyolen: Sorbitol, und Mannitol werden verwertet; Adenitol, Dulcitol und Inositol werden nicht verwertet.. ·

(14) Dekarboxylasereaktion auf Lysin: negativ.

(15) Ureolyse: schwach;

(16) Vi/iderstandsfähigkeit gegenüber Schwermetallen: wächst

direkt auf 500 ppm Cr⁺⁺⁺.

(17) Natriumchlorid-Bouillon: Wachstum bei NaCl-Konzentration

von .3,5 %..

(18) Optimale IVachstumstemperatur: 30 bis 37 ⁰C ' Maximale iVachstumstemperatur: 40 bis 50 C Minimale Wachstumstemperatur: 5 bis 20 C.

(19) Sauerstoffbedarf aerobisch. .

*-i r r η ·' ·' ²·⁹·¹⁹⁸²

5 4.0 2 8 -'is-' · 61353/13

Der Mikroorganismus wurde auf der Grundlage seiner mikrobiologischen Eigenschaften unter Bezug auf Sergey's Manual of Determinative Bacteriology (S, Auflage}, Mitherausgeber R. Ξ. ,Buchanan und M. E. Gibbons, Williams und VVilkins Company, Baltimore,,Maryland als Bacillus megaterium identifiziert . Der Mikroorganismus ist am 12. Februar 1980 bei der Nationalen Sammelstelle für industrielle Bakterien '(WCIS), Torry Forschungsstation, Postfach Nr. 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Schottland hinterlegt und ^: . unter NCIB Nr. 11563 registriert worden. . Im folgenden wird das angewendete Verfahren beschrieben.

A, In-vitro-Rekombination zwischen Lambda- und 3. megaterium-DNS'n , '-

Etwa 7 jjg B. megaterium-DNS' wurden mittels 10 Einheiten Hind III bei 37 ⁰C eine Stunde lang in 25 >j1 Tris-Puffer (pH 7,5) gespalten. Etwa 2/Jg Lambda NM 590 wurden in ähnlicher Weise mit dem gleichen Enzym gespalten. Die Reaktionen wurden durch lOminütiges Erhitzen auf 75 ⁰C gestoppt, . .-..':..:

Zur Bestimmung der Wirksamkeit der Spaltung wurden zwei Tests vorgenommen: , .

1. De eine Probe der, zwei Reaktionsgemische wurde in einem Agarose-Gel über_: 20 Stunden hinweg bei 20 Volt elektrophoretisch behandelt. Nach Anfärben des Gels mit Ethidiurabromic! wurden die erwarteten Bandenvertsilungen untersucht: ·

2 Lainbda-DMS-Banden als Ergebnis der an der einzelnen Hind-III-Stelle; aufgebrochenen Lambda-DMS und eine sehr große Anzahl meist überlappender Banden von der an einer ¹ Vielzahl von Stellen aufgespalteten· bakteriellen DNS.

5-4

2.9.1982

- ¹⁷ - ^{51 з5з/і8}

Zj^ Die Transfektionsanalyse der Phagen-ONS zeigte, daß die Aufspaltung mit 99%iger Wirksamkeit erfolgte, wodurch dia biologische Aktivität der Phagen-QMS nahezu vollständig zerstört wurde. . ,

Die aufgebrochenen DNS¹η wurden vermischt und Sstündiger Inkubation mit 0,15 Einheiten T4-DNS~Ligase bei 10 ⁰C ausgesetzt, um ein zufallsweises Anordnen und kovalentes Verschmelzen der DNS-Fragmente zu ermöglichen»

Am Ende dieser Inkubation wurde die DNS mit einem invitTO-Enkapsidationspräparat vereinigt, das aus einer Mischung der von nichtsuppressiven Kulturstämmen in-t duzierten Lysate zweier komplementärer defektiver Phagen (Lambda Dam und Lambda Earn) bestand. In dieser Mischung kann jegliches DNS-Molekül in das Phagen-Protein eingebunden werden, sofern es die cos-Extremitäten der Lambda-DNS besitzt und die geeignete Größe aufweist. Auf diese Waise rekonstituiert sich in vitro ein biologisch aktiver Phagen-Partikel, der E. coli infizieren und ein Infektionszentrum (Plaque) produzieren kann.

Um die Wirksamkeit dieses Vorgehens abzuschätzen, wurden zwei Kontrollen vorgenommen:

1. Eine Probe der Mischung wurde im Plattenverfahren auf . E. coli kultiviert, pro pg der eingebrachten Lambda-DNS wurden 3 χ 10" Einzel-Plaques gefunden. Dies überstieg die in dem aufgespalteten Präparat gefundene Menge etwa um das Hundertfache, womit auf eine gute Wirkung der .Ligase-Sehandlung geschlossen werden kann.

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- 2.9.1982

-^1S- ⁶¹

2^ Die derart entstandenen Plaques wurden visuell beurteilt, 70 % von ihnen zeigten keinerlei Trübung, was auf die Anvvesenheit eines , 3. megaterium-DNS-Fragments hinda-tet, welches seinerseits das für die Plaque-Trübung verantwortliche Lambda-Gen Cl bindet und damit inaktiviert. '

Somit konnte man annehmen, daß das Präparat ein Zufallsmuster aller mit dem Einbau in den Phagen Lambda NM' 590 verträglichen B, megaterium-möglichen Hind III-DNS-Frag-

mente enthielt.,

B. Isolation eines B. megaterium-Analyse tragenden Phage-Lambda-Derivates '.' _i ''-·'·.. '

Der Rückstand der Enkapsidations-Mischung wurde zur Inokulation von E. coli auf eine große Anzahl von stärkeenthaltenden Platten mit etwalO lebensfähigen Partikeln pro Platte verwendet« Nach Anwachsen der infizierten E. coii und Bildung von Plaques wurden die Platten hinsichtlich der Anwesenheit von*stärkeabbauenden Plaques überprüft. Dazu wurden die Platten kurzzeitig Ood-Dämpfen abgesetzt; es wurde erwartet/ daß der von einem solchen Pinagen hervorgerufene Belag (Plaque) von einer durchsichtigen Fläche . ,umgeben sein würde, resultierend "aus der Diffusion und Wirkung von Amylase aus den lysierten Zellen. Ein derartiger Belag wurde gefunden, der ihn enthaltende Phage wurde zwecks Subkultivierung sofort herausgenommen (ein längeres Verweilen in Ood-Dämpfen würde den Phagen getötet haben). Die Nachkommenschaft dieses Plaque vermehrte sich unverändert (Amylase erzeugend) und wird hier als "Lambda NM 590 Amy 1" bezeichnet. Phage Lambda NM 590 Amy I wurde am 12. Februar 1980 beim NCIB als NCIB Mr. Iise9 hinterlegt.

- 19 - 61 353/13

C Re-Klonierunq des Amylase-Gens in das Plasmid ρ BR 522

Die Re-Klonierung erfolgte zwecks Erlangung eines überproduzierenden Kulturstammes sowie zwecks unkomplizierter Herstellung einer großen Menge von DNS mit dem Amylase-Gen«

1 pg DNS vom Phagen Lambda BM 590 Amy 1 und 0,3 pg DNS vom Plasmid p8R 322 wurden gespalten, vermischt und - wie in Abschnitt A beschrieben - mit Ligase behandelt. Dieses Präparat wurde (unter Anwendung herkömmlicher Methoden) zur Transformation des Kulturstammes ИЗ 101 herangezogen. Selektiert wurde auf Ampicillin (ap)-Resistenz, eine durch Anwesenheit dieses Plasmids auf de Zellen übertragene Eigenschaft. Dieses Plasmid überträgt normalerweise auch Widerstandsfähigkeit gegenüber Tetrazyklin (Tc). Die Einführung von Fremd-DNS in dieses Plasmid spaltet jedoch das tet-Gen, wodurch der Anteil an tetrazyklin-sensitiven transformierten Klonen den Anteil an klonierter DMS enthaltenden Plasmiden widerspiegelt. Im vorliegenden Fall enthielten 16 % der Klone ein neues. Plasmid,, welches Amylaseaktivität auf E. coil übertrug. (Entsprechend der gegenwärtigen internationalen Nomenklatur der Plasmide werden die hier zu beschreibenden neuen Plasmide mit "pCP" und das spezifische Plasmid des vorliegenden Beispiels als "pCP 1" bezeichnet).

Aus dem eben Gesagten wird deutlich, daß das Re-Klonieren eines Gens mit demselben Enzym "(in diesem Fall Hind III), ein sehr wirksames Verfahren darstellt (16 % anstatt 1/10°)

Oer plasmid-enthaltende Mikroorganismus wird als 'E« coli GL 7001 (pCP 1) bezeichnet und. ш-de am 12. Februar 1980 beim NCI3 als NCI3 Mr. 11570 hinterlegt..

24545 2 8

2.9.1982 - 21 - 61 353/13

Die Zellen wurden .zunächst über Macht kultiviert,, danach wurden sie in 0,5 Volumenanteilen (bezogen auf die Zeil- _v kultu.r) einer 25','aigen Saccharoselösung suspendiert und bei 24. G 10 min geschüttelt. Dies führte zur Plasmolyse der Zellen. Daran .anschließend wurde EDTA bis zu 1 mi^vi zugesetzt, um die Zellwände permeabel zu halten; danach wurde das Material bei 24 ⁰C- für weitere 10 min geschüttelt. Die Suspension wurde zentrifugiert, die Zellen wurden in ^ kaltem Wasser (etwa O C) rasch resuspendiert und bei dieser Temperatur 10 min geschüttelt. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert, aus der überstehenden Flüssigkeit konnten 96 % des Enzyms zurückgewonnen,werden.

Zu Vergleichszwecken wurde der Donor-Mikroorganismus (Bacillus megaterium) kultiviert und seine enzymatische Aktivität bestimmt. Die Enzym-Menge pro ml Kulturmedium wurde mit Hilfe der DNS-'Methode gemessen. Dabei ist als. eine enzymatische Einheit jene Enzym-Menge definiert, die während einer zehnminütigen Inkubationszeit 1'mg reduzierenden Zucker (Bezugsbasis ist Maltose) pro Minute produziert. Als Substrat diente sehr reine Amylose.

Der Donor-Mikroorganismus erzeugte 66,0 enzymatische Einheiten pro Liter Kulturmedium, Mit E. coli CL 7001 (pCP 1) gesättigte Kulturen produzierten 116,6 Einheiten je Liter Kulturmedium, nährend, E. coli CL 7001 (pCP 1) nach.'Sstündiger Kultivation (Amplifikation) mit Chloramphenikol und nach darauffolgender 15stündiger Kultivation ohne Chloramphenikol nur 84,5 Einheiten/Liter erbrachte. Dies läßt erkennen, daß die Methode der gesättigten Kultur eine guts .Steigerung dar Enzymproduktion zu erreichen vermag.

- . 2.9,1982

245 45 2 8 ' -'²ⁱ- 6!353/18

Das von Ξ. coli GL 7001 (pCP 1) produzierte und als eine AIpha-Amylase identifizierte Enzym besitzt folgende Merkmale. Es spaltet sowohl Amylose als auch Amylopektin in Glukose, Maltose und Maltotriose - vornehmlich aber Maltose - ,und es spaltet sowohl Zyklodextrin als auch MaI-totriose in Glukose und Maltose. Es spaltet Pullulan in Panose und/oder Iso-Panose, eine Eigenschaft, in der es jenem Enzym ähnelt, das kürzlich von Mizucho Shimizu, Mutsuo Kanno, Masaki Tamura und Mikio Suekane in "Purification and Some Properties of a Novel Älpha-Amylase Produced by a Strain of Thermoactinomyces vulgaris", Agric. Biol. Chem. 42 (9), 1978, Seiten 1681 bis 1688 beschrieben wurde, . .

Wir hielten den im vorliegenden Text als Bacillus megaterium bezeichneten Mikroorganismus einmal für Bacillus circulans,

. 3eisp.iel II . -

Klonierung eines wärmebeständigen Alpha-Amylase-?Gens

Als Donator-Mikroorganismus fungierte ein Original-Kultursnmm eines von einem Kompost isolierten Bacillus, der als Bacillus coagulans identifiziert wurde. Der Bacillus erzeugt eine wärmebeständige Alpha-Amylase und besitzt nachstehende; mikrobiologische Merkmale.

(1) Morphologie: Stäbchen (0,6 bis 1 μ χ 2,5 bis 5,0^u),

beweglich, grampositiv und -negativ. Zentrale oder endständige Sporen, nicht . deformierend. л

(2) Nährbouillon: gutes Wachstum.

(3) Schrägnähfagarkultur: gutes Wachstum, fadenförmige

Ausbreitung, cremig weiß. _ч ,

245452 8

2.9.1982 - 23 - Sl 353/18

. (4) Verwertung organischer Säure - Zitrat: positiv

- Malonat: negativ. (5,) Gelatine: Verflüssigung,

(6) Produktion von Azetylmethy.lkarbinol (Azetain): positiv,

(7) Orthonitrophenylgalaktosid-Hydrolyse: positiv;

(3) Mit rat reduktion: positiv, Gas kann erzeugt werden, (9) Katalasereäktion: positiv.

(10) Indolproduktion: negativ.

(11) Pekarboxylasereaktion auf - Lysin : negativ

*· Ornithin : negativ - Arginin .: negativ,

(12) H₀ S-Bildung: negativ.

(13) Kohlenhydratverwertung: verwertet Arabinose, Galaktose, Glukose, Lävulose, Mannose, Maltose, Saccharose, Stärke, Trehalose und produziert aus ihnen Säure. ₍

(14.) Pullulan wird auf Minimal-Medium verwertet,

(15) Verwertung von Polyolen: Glyzerol, Sorbitol, Mannitol und Inositol werden verwertet, Adonitol und Dulzitol

werden nicht verwertet« (16). Ureolyse: negativ.

(17) Lezithinverv/ertuhg: negativ.

(18) Optimale vVachstumstemperatur: 50 C Maximale Wachstumstemperatur: 55 bis 60 C Minimale Wachstumstemperatur: 15 bis 25 C,

(19) Sauerstoffbedarf: aerob und anaerob.

Der Kulturstamm ist am 12. Februar 1980 beim NCIB als NCIB Mr, 11571 hinterlegt worden.

Die DMS wurde extrahiert und der Wirkung von Eco RI; Hind III; Pst I; Sal I; 3am HI und 3gl II ausgesetzt. Lediglich BgІ II vermochte eine Vielzahl von Fragmenten in einem

2.9.1932

4 5 4 5 2 8 ·**- , ei ass/«

weiten Bereich relativer Molekülmassen entstehen zu lassen. Mit Eco RI konnten jedoch auch Fragmente hervorgerufen werden, nachdem die NaCl-Konzentration auf 50 mii vermindert worden war. Es wurde daher ,Eco.RI zur Herstellung von Fragmenten für die Klonierung in einen Eco RI-Lambda DNS-Vektor (Lambda NM 781) eingesetzt.

A. Restriktion von ^. coaqulans und Lambda MM 781-DNS'n

1,25 yug Lambda NM 781-DNS wurden mittels einer Einheit Eco RI in 25 μ des nachstehenden Puffers gespalten:

10 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM 2-Merkaptoethanol, 10 mM

und ICG mM NaCl. · '

2 ид 3. coaguläns-DNS wurden mit.Hilfe des gleichen Enzyms in einem ähnlichen Puffer gespalten, die NaCl-Konzentration war jedoch auf 50 mM reduziert worden. Die Inkubation erfolgte bei 37 C über 2 Stunden hinweg, die Reaktion wurde dann durch lCminütiges Erhitzen auf 75 ⁰C gestoppt. Die Vollständigkeit der. Restriktion" wurde durch Elektro- ·

phorese in l^igen Agarose-Gelen festgestellt.

B. Ligation und Rückgewinnung der rekombinanten Phagen

Die restrigierten DNS'η wurden vermischt und unter Einsatz von zwei Einheiten T4-DNS-Ligase in einem Gemisch mit 60 mM Tris HCl (pH 8), 10 HiM¹MgSO₄, 10 mM 2-Merkapto- , ethanol und 0,1 MM ATP verknüpft. Die Reaktion erfolgte über 10 bis 15 Stunden bei 10 C. Nach der Ligation'wurden Aliquote von 0,2 pa DNS mit ATP vermischt, um eine End-,

' —2 ' ' ·

konzentration von 10 M zu erhalten. Diese Aliquote wurden einer in-vitro-Snkapsidation ausgesetzt und' zur Infektion

24 5 4 5 2

2.9.1982 - 25 - Sl 353/18

des Kuliurstammas HB 101 von Ξ. cöli verwendet. Pro Lambda-DNS wurden etwa 1,6 χ 10· PFU (plaquebildende ,Einheiten) erzielt.« Einige dieser Phagen zeigten Amylaseaktivität (hinsichtlich des Nachweises von^NAmylaseaktivität auf Petrischalen und hinsichtlich der Rückgewinnung und Reinigung des Phagen siehe Beispiel I).

Es wurde ein ziemlich hoher Anteil von amylaseproduzierenden Phagen (1 in 400) beobachtet.

Einer von ihnen wurde selektiert und als "Lambda NM 781 Alpha Äraу 1" bezeichnet. Er ist.am 12. Februar 1980 beim NCIB als'-NCIB Nr. 11572 hinterlegt worden.'

C. Reklonierung des Amylasegens aus Lambda NM 781 Alpha Amy 1 in Plasmid PSR 322 '

1 ^g Lambda NM 781 Amy 1-DNS und eine gleiche Menge DNS vom Plasmid p8R 322 wurden unter Beibehältung der üblichen Bedingungen,, mit Eco RI gespalten. Die Ligation und Transformation erfolgte in der in Beispiel I erläuterten Weise. Kolonien von E, coli HB 101 mit rekombinantem Plasmid wurden vermittels ihrer Amylaseaktivität.nachgewiesen

Eine derartige Kolonie wurde selektiert und als E. coli

CL 7002 (pCP' 2) bezeichnet. Sie ist am 12. Februar J980 beim NCIB.als NCIB Nr. 11573 hinterlegt worden.

O. Amplifikation des Genprodukts .

Die Amplifikation des amylasecodierenden Gens von Lambda 'NM 781 Alpha Amy 1 sowie, die Amylaseproduktion rirden folgendermaßen bewerkstelligt. Das Wirtsbakterium (E.. coli

245452

2.9.1982

~^2б ~ siss

ИЗ.101) ließ man bei 37 ⁰C in La-Medium mit 2 гаи MgCl₉ bis zur Erreichung einer optischen Dichte von 0,3, (bei 650 nm) wachsen. Dann erfolgte das Hinzufügen von Lambda. NM 731 •Alpha Amy 1, wobei die Zahl der Phagen,mit dem Ziel der Erlangung einer Infektionsrate von etwa 1 bis 2 berechnet wurde, daß also ein bis zwei Phagen auf eine bakterielle Zelle entfielen. Die Kultur wurde nun bei 37 ⁰G unter starkem Rühren (Schütteln) weiter kultiviert, die optische Dichte wurde bis zum Beginn des Absinkens beobachtet. Nach Absinken der optischen Dichte unter 0,5 wurde die Kultur geerntet und auf Eis gelegt. Die Kultur wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde auf Amylaseaktivität .untersucht.

Ämplifikation und En.zymproduktion rait E. coli CL 7002

(pCP. 2), erfolgten unter Anwendung sowohl der Methode der

gesättigten Kultur als auch unter Anwendung der Chlor-'

amphenikol-Amplifikation, wie sie in Seispiel I beschrieben wurden*

Die Amylaseaktivität wurde mit Hilfe der DNS-Methode sowohl im Phagenlysat als auch in jenen Kulturen von E. coli bestimmt, die das rekombinante Plasmid enthielten. Tabelle I zeigt die Werte der Amylaseaktivität im Original-Kulturstamm von B. coagulans sowie die Aufteilung zwischen extrazellulärer und zeHgebundener Aktivität. Die mit dem rekombinanten Phagen (Lambda NM 781 Alpha Amy 1) .und dem das rekombinante Plasmid E. coli CL 7002 (pCP 2) enthaltenden Kulturstamm erzielten Aktivitäten werden ebenfalls dargestellt♦ Mit dem rekombinantsn Phagen wurde eine St эі-gerung der'Enzymproduktion auf das etwa Dreifache erreicht, eine sehr viel stärkere Steigerung (auf etwa das 30Cfaehe) wurde beim Plasmid beobachtet. ·

^ . ' . 2.9.1932

45452 8 "·²⁷ - 61.353/18

Im Falle des Phagen (Lambda NM 781 Alpha Amy 1) ist das gesamte Enzym durch Zell-Lysis freigesetzt und daher im Kulturmedium enthalten» Im Falle des· Plasmids liegt der größte Teil des Enzyms (96 %) zellgebunden vor.

E. Re klonie rung in ein Derivat des Phagen Lambda, das zur Lysocjenisierunc; von E. coli fähig ist , '

Zur Erläuterung der Herstellung eines Vektor-Wirt-Systems mit einem Lambda-lysogenen E. coli wurde folgender Versuch durchgeführt.

Verwendet wurde der-Sakteriophage Lambda T4 lig. CI 857 Wan Sam Sam (Lambda NM 989)« Er ist in 0. Mol. Bio!., Band 132 (1979), "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4. I. Characterization of the Recombinants" von G. G, Wilson und Noreen E. Murray (Seiten 471 bis 491) und "II» Amplification and Separation of the Gene Product" von Noreen E. Murray, S, A, Bruce und K. Murray (Seiten 493 bis 505) beschrieben.

DieserPhage enthält das DNS-Ligasegen des Bakteriophagen T4 und vermag E...coli zu lyogenisieren. Er hat darüber hinaus ein therraosensitives Immunitätsgen und zwei 3ernsteinmutationen im E- und im S-Gen. Die Mutation des S-Gens hebt die Auflösbarkeit des. Bakteriums durch Infektion mit diesem Phagen auf. Der Zweck der Subklonierung bestand im Ersetzen des DNS-Ligasegens durch das Amylase codierende Gen. ,

Die DNS des Phagen und des Plasmids (pCP 2) wurden mit Hilfe von Eco RI geschnitten, dann wurden die Fragmente

" '. 2.9.1982

4 5 4 5 2 8 "²³" ^б1355/ls

verbunden. Die aus der Ligation resultierende; Phagen-DNS wurde danach in einen Organismus eingeschleust, die Plaques wurden im .Plattenverfahren auf einem Kulturstamm'*von Ξ. coli Sup H Sup F sichtbar gemacht. Die Amylaseaktivität anweisenden Plaques wurden ausgelesen und der Phage unter Anwendung der bereits beschriebenen Techniken gereinigt.

Dieser Phäge. wurde dann mit herkömmlichen Techniken zur Lysogenisation eines Kulturstammes von· E. coli C 600 (CL 1205) verwendet. Mittels ood-Färbung wurden die lysogenen Kolonien auf einem stärkehaltigen Medium sichtbar gemacht. Dieser Kulturstamm ist von uns als E. coli-CL 7C03 (Lambda Alpha Amy 1) bezethnet und am 5. März 1980

beim NCI3. als' NCI3 Mr. 115S6 hinterlegt vvorden.

Oie Amplifikation des Genproduktes erfolgte in der nachstehenden iVeise. Das Lysogen ließ man bei 32 С Дп L3- Medium wachsen, bis eine optische Dichte von 0,8 bei 550 nm erreicht war. Dann wurde zentrifugiert und die Zellen in frischem LB-Medium suspendiert, welches auf 45- C vorgeviärmt worden v^ar. Dann erfolgte eine lSminütige Inkubation der Kultur in einem 45 C warmen 3ad, um den lytischen-Zyklus in Gang zu setzen (da das Imnsunitäts-Genprodukt wärmeempfindlich ist),

Die Inkubation wurde dann unter kräftigem Schütteln bei 37 ⁰C 3 Stunden lang fortgesetzt. Anschließend wurde die Amylaseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit und in den Zellen gemessen. Die Meßergebnisse sind in Tabelle I enthalten. . ' ^r

24 5 4 5 2

2.9.1982

-29- .si

Dieses. Einzelexperimen.t ,veranschaulicht die. Technik einer "Sub-sub-KIonierung" vom Plasmiden in einen neuen Lämbda-Phagen.

Es sollte sich von selbst Verstehen, daß die DNS von Lambda NM 781 Alpha Amy 1 genauso leicht einer Sub-Klonierung in den Phagen Lambda T4 lig.. CI 857 V/ara Earn Sam hätte unterzogen werden 'lönnen. Andererseits hätte die Doriator-DNS auch direkt in den letztgenannten Phagen kloniert werden können; eine Reihe von Variationen des als Beispiel dargestellten Verfahrens erscheint denkbar,

F, Rückgewinnung und Charakterisierung der von Lambda MM. 781 Alpha Amy 1, E. coli CL 7002 (pCP 2) und £. coli CL 7003 (Lambda Alpha Amy 1) produzierten Amylase

Zur Enzymrückgewinnung wurde Wie in Beispiel I die Methode des osmotischen Schocks eingesetzt. Da das Enzym aus diesem Beispiel wärmebeständig ist, könnte es darüber hinaus durch Hinzufügen von 10 шМ Ca⁺⁺ zu der wäßrigen Lösung sowie

Erwärmen derLösungauf 80 C für 10 Minuten zusätzlich gereinigt werden. Diese Behandlung fällt die gesamten

E. coli-Proteine aus und ermöglicht die Rückgewinnung der Alpha-Amylase in extrem reiner Form, es sind in der Tat keine Reste oder andere Enzyme vorhanden.

Die Besonderheit der Alpha-Amylass wurde ermittelt: sie ist auf Amylose und Stärke aktiv, Hydrolyseprodukte sind Glukose, Maltose und Maltotriose mit Spuren von Komponenten höherer relativer Molekülmassen. Auf Zyklodextrin ist dieses Enzym nicht aktiv. Ebenfalls bestimmt wurde die Wärmebeständigkeit des Enzyms,, sie erwies sich als

2.9.1982 - '

4 5 45 2 8 -³⁰- ' ^61353ЛЗ

sehr hoch. D,is Cptimaltemperatur hinsichtlich der .Aktivität ~ 'mit 0,5 ^ Amylose liegt zwischen 30 ⁰C und 90 ⁰C. Mit S ^ löslicher Stärke befindet sich das Optimum um 100 C, Es ist möglich, daß es sich bei.dam hier als Bacillus coagulans bezeichneten Mikroorganismus in Wirklichkeit um Bacillus licheniformis handelt.

>o

Tabelle I

2.9,1982 61 353/18

Amylaseaktivität - in Einheiten' '/Liter""- im Original—Kulturstamm von B, coagulans- und in den rekombinanten Klonen von Beispiel II

Überstehende Flüssigkeit	Periplasma
42.	-
144	-
230
276,2	12960
23

Zellen Gesarat Steigerung dor

Enzymproduкtion

B, coagulans

Lambda MH 781 Alpha Amy 1

E. coil CL 7002 (pCP 2) mit cm-Amp1ifikation

E, coli CL 7002 (pCP 2) Übe mach t-KuI t u гѳп

E-. coli CL 7003 (Lambda Alpha Amy 1)

χ*)

XX )

42

144

5930

13467

1185

3,43 χ 141,2 χ 320,6 X 26,-1 X

1 Einheit ist diejenige Enzymmenge, die 1 mg Maltose-Äquivalent pro ml pro Minute bei 50 C ergibt, wobei 0,5 % Amylose als Substrat verwendet werden,.

Die Methode des osmotischen Schocks wurde nicht angewendet, dafür wurde eine Lysis vorgenommen, so daß dieser Wert die Summe der Amylaseaktivität im Periplasma und don Zellen repräsentiert, .

/ с/

Ц D 4

²·⁹·¹⁹⁸²

- 32 - 51 353/18

Beispiel II А

Subklonierung das Plasmids ρ'GP 2 in Plasmid pc 194 und Darstellung des neuen. Plasmids in Bacillus subtilis

Dieses Beispiel veranschaulicht eine Technik, bei der die gemäß der'Erfindung hergestellte rekombinante DNS in einem von E. coli verschiedenen Wirtsbakterium, nämlich in-einem Kulturstamm von Bacillus subtilis exprimiert werden -kann.'

Das Plasmid pCP 2 aus Beispiel II enthält ein 3,31-Kb-Fr.agment vom 8. coagulans-Oonator. Das Plasmid ist weiterhin dreh das übertragen von Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz gekennzeichnet, und es 'enthält .zwei Restriktions-.stellen jeweils, für,Eco.RI und Hind III« Das Plasmid pCP 2 wurde in vier Fragmente sowohl mit Eco RI als auch mit Hind III gespalten', mit Ligase behandelt und wie 'in den

vorangegangenen Beispielen zur Tränsforralerung von HB ICI verwendet, . . ·

Die neugebildeten, als pCP 2,3 bezeichneten Plasmide besitzen ein 2,54-Kb-Fragment der B« coagulans-DNS, welches das Alpha-Amylase codierende Gen enthält. pCP 2,3 weist eine einzelne Stelle sowohl für Eco RI als auch für Hind III auf und überträgt sowohl Ampicillin- als auch Tetrazyklin-Resistenz. . ·

Für den nächsten Schritt wurde Plasmid pC 194 selektiert,-welches dafür 'bekannt ist, daß es sich selbst in Bacillus, subtilis replizieren kann, pC "194 überträgt Chloramphenikol-Resistenz. und weist eine einzelne Hind HI-Stelle auf.

Sowohl pCP 2,3 als auch pC 194 wurden mit Hind III geöffnet, vermischt und zwecks Bildung eines neuen, als pCH 1 be-

• · 2.9.1982

24545 2 8 -³³- .^S1353/18 -

zeichneten Plasmids verbunden. 'Letzteres enthält das Alpha-Amylase codierende Gen und .besitzt^;sowohl Chloramphenikol- als auch' Ampicillin-Resistenz, obgleich das Niveau der Chloramphenikol-Resistenz in E. coli niedrig ist'. Wie- vorher wurde das Produkt dazu verwendet, E. coli HB 101 zu transformieren.

Daraufhin wurde der als QB 1133 bezeichnete Mutantenstamm von B. subtilis (Institut de Recherche en Biologie MoIeculaire, Universite Paris VII, Tour 43, 2 Place öussieu, 75221 Paris Cedex 05), der keine Alpha-Amylase-Aktivität besitzt, entsprechend der von S. Chang und S. Cohen, Molec. Gen. Genet. 168, 111 bis 115 (1979) beschriebenen Technik zur Bildung von Protoplasten behandelt. Die Protoplasten wurden dann mit pCH 1 unter Verwendung des polyethylenglykol-verraittelten Transformationsverfahrens von Chang und Cohen (ibid.) transformiert.

Die Protoplasten wurden nun in einem reichen Medium über 1,5 Stunden hinweg inkubiert, um dem Plasmid im Bakterium

Gelegenheit zu geben, die Chloramphenikol-Resistenz zu exprimieren.

Die Protoplasten wurden jetzt auf einem Reganerationsmedium ausgebracht, dem Chloramphenikol in einer Menge von 20 jjg/ml zugesetzt worden war. Nach zweitägiger Inkubation bei 37 C waren Kolonien von transformierten Zellen erschienen; mit Hilfe der Ooddampf-Färbetechnik wurden -jene Kolonien ausfindig gemacht, die Alpha-Amylase-Aktivität . aufwiesen. Ein als B. subtilis CL 8001 (pCH 1) bezeichneter Klon wurde am'13. danuar 1981 als NCI3 Mr.,11629 hinterlegt. Der Originalstamm-03 1133. wurde ebenfalls am 13. Ganuar 1931 unter MCI3 Mr. 11523 hinterlegt. ',...'

).'' ' 2.9,1932

4 5 45 2 8-³⁴- ^v «353/X8.

. ' ' - ·

B. subtilis CL SOOI (pCHl) ist nur in Anwesenheit.von Chloramphenicol· stabil. Es kann durch Kultivierung in einem Ch'loramphenikol enthaltenden Medium (20 ^jg/ml) zur Erzeu-•gung von Alpha-Amylase verwendet werden. Die Alpha-Amylase kann in der Kulturflüssigkeit leicht zurückgewonnen werden. Nach einer Gbernacht-Kültur in Anwesenheit von Chlor- amphenikol wurden folgende Mengen an produzierter Alpha-Amylase festgestellt: ^

".' überstehende Zellen Gesamt ¹ Flüssigkeit _...'

(Einh./L) ' (Sinh./L)' (Sinh./L)

V 136 14 . 150

Seispiel III ' ' . '....-Klonierung·einer Beta-Amylase

Als Donor-Mikroorganismus fungierte ein Kulturstamm des Bacillus cereus, der in der GB-PS 1 466 009 beschrieben ist.-Er ist am Forschungsinstitut für Fermentation in Chiba-shi (Dapan) am 20. Dezember 1973 als FERM - P Hr.

2391 wie auch in der American Type Collection als ATCC - ^l

Nr. 31102 am 26. Dezember 1974 hinterlegt worden. Von dem Kulturstamm ist bekannt, daß er sowohl· Beta-Amylase als auch Alpha-l,6-glukosidase produziert.

- · . ' ·'

A. Klonierung des Beta-Amylase-Gens in Lambda''NM 781

Die zur Restriktion, Ligation und Rückgewinnung d^er rekombinänten Phagen angewendeten Methoden entsprachen denen des Seispiels II. Die DNS (2 pg) von B. cereus wurde unter den normalen Bedingungen mit dem Eco RI-Restriktionsenzym behandelt. Die DNS des 'Phagenvektors (1,25 /ig Lambda MM. 781) wurde ebenfalls durch ccc Rl zerschnitten. Ligation und''Einschleusung erfolgten in der bereits" beschriebenen Weise. · ' '

24 5 4 5 2 8 -^зз - ^{бі 35}ViS

Es wurden verschiedene rekornbinante Phagen mi* Amylase-Aktiyität aufgefunden"(etwa 1 auf 500). Еіпізг dieser Phagen (als "Lambda NM 781 Beta Amy 1" bezeichnet) wurde selek-' tiert; er ist am 12. Februar 1980 beim NCIB als NCIB Mr. 11574 hinterlegt worden.

B. Reklonierung des Beta-Amylase-Gens aus Lambda NM 781 Beta Amy 1 in Plasmid pBR 322 _: . ^

Zur Steigerung der Enzymproduktion wurde dieser erste Beta-Amylase-Klon als Quelle betaamylasecodierender DNS verwendet, um diese durch Subklonierung in das Multikopie-

Plasmid pBR '322 einzubringen. ' ' "·

2/ig Lambda HM 781 Beta Amy 1-DNS und 1 /ig ρBR "322 wurden mit Eco RI zerschnitten, gemischt und mit T4-Ligase behandelt. Ligation und Transformation wurden in der bereits beschriebenen Weise realisiert. . '

eine unter 200 ampicillinresistenten Kolonien zeigte eine .stärkeabbauende Aktivität. Eine dieser Kolonien wurde isoliert, als £. coli CL 7004 (pCP 3) bezeichnet und am 15*September 1980 als NCIB Mr. 11602 hinterlegt.

C. Reklonierung des Beta-Amylase-Gens in einen zur Lysoqenisation von E. coli fähigen Derivat des Phagen Lambda

Als Vektor wurde der in Beispiel II beschriebene thermosensitive Phage Lambda T4 13g. CI 857 V/am Earn Sam (Lambda NM 989) benutzt. Etwa 1 /ig DNS des Plasmids pCP 3 und 0,5 /ig Phagen-üNS wurden gespalten, dann wurden die Frag- ' mente miteinander verbunden, und die resultierenden.DMS-

.. · -'. '' " ^! 2.9.1982

4 54 5 2 8 -^Зб - ·' · ^б1з5з/18

Stücke wurden in vitro übertragen. Dia Phage'npartilol mit Amylase-Aktivität wurden isoliert und. mit Hilfe der be-' reits genannten Methode zur Erlangung von l'ysogenen Kolonien herangezogen. Der für diesen rekombinantsn Phagen lysogene Kulturstämm E. coli C 6OQ würde isoliert, mit der Bezeichnung E* coli CL 7005 (Lambda Beta Amy i) versehen und am 15. September 1980 als NCIB Nr. 11603 hinterlegt.

D. Amplification des Amylasegenproduktes

In allen Klonen und Subklonen v^urde die Amylase-Aktivität mit Hilfe der DNS-Methode ermittelt. Die Beta-Afnylase-Aktivität wurde- auf Dünnschicht-Chrömatogrammpn durch das Vorhandensein eines einzelnen Maltoseflecks nach der Amylosedigestion bestätigt.

Die Atnplifikation des Beta-Amylase-Gens in unterschiedlichen Klonen wurde in der bereits beschriebenen Weise» vorgenommen. Tabelle II enthält die Angaben zur enzyma- : tischen Aktivität ,im Original-Kulturstamm im Vergleich zu jener in den drei Klonen; diese Aktivität wurde entweder vom Phagen-Lysat oder mit_tHilfe der in Beispiel II beschriebenen Methode des osmotischen Schocks zurückgewonnen.

2.9,1982

61 353/18

Tabelle Il *

Extrazelluläre und zellgebundene Beta-Amylase-Aktivität in B, cereus und in den rekombinanten Klonen

Extrazelluläre Aktivität

Einheit/Liter

0.'

(1) Zellgebundene Aktivität

Einheit/Liter

(V

/о

Gesamt-Aktivität

Einheit/Liter

B, cereue (2)

ATCC 31102 1420

Lambda NM 781

Beta Arn у 1 80

E, coli CL 7004

(pCP 3) (3) 59

E. coli CL 7005

(Lambda Beta Arny 1) (4) 19

nicht ermittelt

1420

80

77,2

44,2

17,4

24

22,8

55,8

76,4 43

(1) Zellgebundene Aktivität: Behandlung mit Lysozym mit Lysis der Zellen-

(2) Die Kultur wurde bei 30 ⁰C über Nacht angesetzt (Hefeextrakt, 1 %; ßaktotrypton, 1 %; _CN| NaCl, 0,5 %) '

ιV"\ (^ Übernacht-Kulturen'bei 37 ⁰C (gleiche Zusammensetzung dea Kulturmediums)

(4). Kultivierung - bei 32 ⁰C-И5 °C —*^37 ⁰C, Messung der Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit und in den Zellen nach der Lyais wie bei E. coli Lambda Alpha Amy 1 in Beispiel II.

2.9.1982 5 45 2 8- -³³V , Υ ^{б1 ЗИ/1Ѳ}

Beispiel' IV , , · . ..

Klonierur.g eines Pullulanaso-Gens

Als Donator-Mikroorganismus diente ein Klebsieila pneumoniae, beschrieben von H. Bender in Siochem« Z.,-534,-Seiten,79 bis 9.5 (1961) und am S. öuni 1963 beim ATCC ,unter Nr. 15050 hinterlegt. Es wird auch in der G3-PS 1 273 789 erwähnt.· . ·

t.

2,25 yug Donator-DNS wurden unter Standardbedingungen, extrahiert und mit Eco RI geschnitten; 1,25 ^g Lambda NM 731-DNS wurden unter gleichen Bedingungen vom gleichen enzym zertrennt. Die Inkubation erfolgte bei 37 ⁰C über drsi Stunden hinweg, anschließend wurde die Reaktion durch lOminütigss Erhitzen auf 75 ⁰C gestoppt. Die Vollständigkeit der Restriktion wurde nach der in Beispiel II geschilderten Weise bestimmt, ., '

Die aufgespaltenen DNS'n wurden verbunden, zurückgewonnen und - alles.wie in Beispiel II - zur Infektion des Kulturstammes HB 101 von E. coli verwendet. Pro ^Jg Lambda-ONS wurden etwa' 2 χ 10 plaquebildende Einheiten erzielt.

Nach zweitägiger Inkubation bei 37 ⁰C auf BBL.Tryptikase plus 0,25 % Pullulan enthaltenden Platten -zeigten einige Plaques Pullulanase-Aktivität dergestalt, daß sis von undurchsichtigen, für "überwuchernde" Bakterien charakteristischen Ringen umgeben waren. Der Anteil pullulanaseproduzieren.der Phageh lag im Bereich von 1 : 2500, Einer von ihnen wurde selektiert, von uns als "Lambda MM 7Sl Pul 1" bezeichnet und am' 9.· April 1980 beim NCI8 als MCI3 Nr.' 11593 hinterlegt. . .

245452 8

2.9.1982

-^зэ -

Die Pullulanase-Akt'ivität wurde mit MlIfe dar DNS-Methode ermittelt, das Produkt der,Pullulan-Hydrolyse durch die Phagenlysate wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie als Maltotriose identifiziert.

Lambda NM 781 Pul 1 enthält ein großes DNS-Fragment (von Klebsiella pneumoniae) von 13,5 Kb; dieses, Fragment ,^v wurde durch Eco RI erneut zertrennt, was zu zwei Fragmenten von 6,1 Kb bzw. 7,4 Kb führte. Das Subfragment mit 6,1 Kb würde dann in-Lambda NM 781 r.ekloniert; es erwies sich als Träger des Pullulanase-Gens. Dieser neue rekombinante Phage erhielt die Bezeichnung NM 78Г Pul 2; er·, wurde am 15. September 1980 als NCIB Mr. 11604 hinterlegt.

Das 6,1-Kb-Subfragment wurde darüber hinaus einer Subklonierung in das Multikopie-Plasmid pACYC 184 (einem

R Derivat von pBR 322 mit dem Tc -Gen des letzteren und einem

о · . ·

Cm'-Gen mit einer Eco Rl-Stelle) unterzogen. Der so erhaltene neue Klon'heißt E. coli CL 70C6 (pCP 4); er wurde am 15. September 1980 als NCIB Nr. 11605 hinterlegt.

Ein dritter Subklon wurde durch Einlagern des 6,1-Kb-Fragments in den Phagen Lambda NM 989 nach der in Beispiel II beschriebenen Weise hergestellt. Dieser Klon wird als E. coli CL 7007 (Lambda Pul 2) bezeichnet; er wurde am 15. September 19S0 als NCI3. Nr. 11606 hinterlegt.

Der Grad der Expression und der Amplifikation der Pullulanase wurde in allen Klonen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

'.-Vie. aus den Ergebnissen ersichtlich ,wird, wird die Pullulanase-Aktivität durch Maltose induziert, dem L3-Mediurn

4 5 452

· 2.9.1982

"⁴⁰" ' «35

•лагзп 0,04 % Maltose zugesetzt worden. Darüber' hinaus па г sine Triton-X 100-Behandlung der Membranfraktion erforderlich, ura dia Pulliilana.se zurückzugav/innen; dies deutet darauf hin, daß eis Aktivität in den Membranen lokalisiert

is t... . '

2.9.1982 61 353/18 Tabelle III

Expression von Klebexe 11 a~ Pull u'lanase in E. col Α.- Klone η. Die Aktivität ist in Einheiten Maltose-Äquivalent für eine 1-Liter-Kultur ausgedrückt.

überstehende Flüssigkeit-

Membranen

Gesamt

Steigerung Enzymproduк	der tion
1
0,14
1,19	χ
- 1,28	\^
0,123

Klebsieila pneumoniae * Maltose Lambda NM 7Ö1 Pul 1 Lambda NM 781 Pul 1 + Maltose Lambda NM 781 Pul 2 Lambda.NN .701 Pul 2 + Maltose χ E. coli CL 7006 (pCP 4)

χ E, coli CL 7006 (pCP 4) + Maltose

xx E. coli CL 7007 (Lambda PuI 2) + Maltose

24	3,5	27,5
0,76	2,6	3,86
2,2	9,84	12,04
9,6	23,8	32,9
8,6	26,7	35,3
nicht ermittelt	3,4	• 3,4
nicht ermittelt	114	114
47	93,5	140,5

4,14 κ

5,13 x

χ Übernacht-Kulturen

xx Kultivierung bei 32 C, 45 C, 37 C, Messung der Aktivität in der überstellenden Flüssigkeit und in den Zollen nach der Lysis nie bei E_# coil Lambda Alpha Amy 1 in Beispiel II.

Claims (12)

1. Ξrfindunqsansp ruch

   1. Verfahren zur enzymatischem Hydrolyse von Stärke unter, Verwendung von Amylase, die durch Kultivieren eines auf genetischem Wege erzeugten Mikroorganismus ,gewonnen wird, der rskombinartte DMS mit einem Amylase codieren- - den Gen enthält, und der in vitro hergestellt wird durch Spalten einer DMS aus einem bakteriellen Donatormikroorganismus und Kombinieren der daraus hervorgehenden DNS Fragmente mit einem Vektor, der in ähnlicher "/eise gespalten worden ist, gekennzeichnet dadurch, daS der Vektor ein Plasmid oder die DNS'eines Derivates des Bakteriophagen Lambda ist.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daS der bakterielle Donatormikroorganismus, ein Bacillus-Stamm ist ♦ '.' . · ' ' . '..·
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der bakterielle Donätormikroorganismus Bacillus rnegaterium, Sacillus coagulans, Bacillus cereus oder Klebsiella pneumoniae ist, . . . ·
4. 4. Verfahren nach den Punkten,1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß der bakterielle Donatormikroorganismus Bacillus, megaterium NCI3 Mr, 11563, Bacillus coagulans NCI3 Nr. 11571, Bacillus cereus ATCC Nr. 31102 ".oder-Klebsiella pneumonias· ATCC Nr,- 15050 ist. ., '
5. 5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor das. Plasmid p3R 322, pACYC 184'·"

   oder pC 194 ist. . . . .
6. 2.9.1982

   24 5 4 5 2 8 "⁴³" ⁵¹

   δ. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daS der Vektor einer der Phagen Lambda NM 590, Lambda MM 781 oder Lambda HM 989 ist.
7. 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4 oder 6, gekennzeichnet dadurch, daß die rekombinante DNS die Phagen Lambda-HM'590 Amy I, NCIB Nr. 11569; Lambda NM 781 alpha Amy 1, NCI3 Nr. 11572; Lambda NM 781 beta Aray 1, ¹NCIB 'Nr. 11574; Lambda NM 731 PuI 1, NCIS Nr, 11593; Lambda NM 781 PuI 2, NCIB Nr, 11604 sowie Varianten und Mutanten davon enthält.

   3·» Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch,daß der auf genetischem Wege erzeugte Microorganisms in der Lage ist, unter geeigneten Kultivierungsbedingungen Amylase in einer wesentlich größeren Menge zu produzieren, als der ursprüngliche Donator-Mikroorganismus.
8. 9. Verfahren nach, einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß der auf genetischem V/ege erzeugte Mikroorganismus E. coli oder B, subtilis ist.

   10, Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß der auf genetischem Wege erzeugte Mikroorganismus S. coli CL 7001 (pCP 1), NCIB Nr. 11570; E.-coli CL 7002 (ρCP 2), HCIB Nr. 11573; E,-coli CL 7003 (Lambda alpha Amy 1), NCIB Mr. 11585; Ξ. coli CL 7004 (pCP 3), NCIS-Nr.. 11602; E. coli CL 7005 (Lambda beta Amy 1), 'NCIB Mr. 11503; E. coil CL 7006 (pCP 4), MCI3 Nr. 11605; S. coli CL 7007 (Lambda PuI 2), NCI3 Mr. 11606; 3," subtilis CL 8001 (pCH. 1), NCI3 Mr.¹ · 11629 sowie Varianten oder Mutanten davon darstellt.

   51 353/13
9. 11. .Verfahren.nach einen dar Punkte 1 bis 1С, gekennzeichnet

   dadurch, da S die verwendete Amylase eine,Aloha-Araylase ist und die rekombinante DN.3 des genetisch erzeugten Mikroorganismus ein Atnylase codierendes Gen enthält,

   i .

   ,das aus Bacillus megaterium erhalten ivurde. ' <
10. 12. Verfahren nach einem .der Punkte 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß die verwendete Amylase eine wärmebeständige Alpha-Amylase ist und ,die rekombinante DNS aus dem genetisch^erzeugten Mikroorganismus ein Araylase codierendes Gen enthält, das aus Bacillus coagulans erhalten wird. *
11. 13. Verfahren nach einem der Punkts 1 bis 10, gekennzeichnet ".. dadurch, daß die verwendete Amylase eine 3eta-Amylase ist und die rekombinante DNS-des genetisch erzeugten Mikroorganismus, die ein Amylase codierendes Gen enthält, aus SaeilIus cereus erhalten wird. "
12. 14. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis IQ₁ gekennzeichnet dadurch, daS. die /verwendete Amylase eine Pullulanase ist und die rekombinante DNS des genetisch erzeugten Mikroorganismus, die ein Amylase codierendes Gen enthält, aus Klebsieila pneumoniae erhalten wird.