EP1727897A1 - VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON REKOMBINANTER RNase A - Google Patents

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON REKOMBINANTER RNase A

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Publication number
EP1727897A1
EP1727897A1 EP05716308A EP05716308A EP1727897A1 EP 1727897 A1 EP1727897 A1 EP 1727897A1 EP 05716308 A EP05716308 A EP 05716308A EP 05716308 A EP05716308 A EP 05716308A EP 1727897 A1 EP1727897 A1 EP 1727897A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
rnase
dna sequence
coli
nucleic acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05716308A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank Gindullis
Bert Behnke
Alexander Caliebe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Richter-Helm Biologics & Co KG GmbH
Original Assignee
Strathmann Biotec & Co KG GmbH
Strathmann Biotech GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Strathmann Biotec & Co KG GmbH, Strathmann Biotech GmbH and Co KG filed Critical Strathmann Biotec & Co KG GmbH
Publication of EP1727897A1 publication Critical patent/EP1727897A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing recombinant RNase A in E. coli, which is characterized in that a DNA sequence is used which codes for an RNase A of bovine origin and which has been adapted to the codon use in E. coli. Furthermore, the invention relates to nucleic acid molecules which contain a nucleic acid sequence which has been adapted to the codon use in E. coli and to recombinant nucleic acid molecules which contain one of these nucleic acid molecules and which allow the expression of the recombinant RNase A in E. coli.
  • RNase A is an endoribonuclease that hydrolyzes RNA strands on internal phosphodiester bridges. It is specific for single-stranded RNA and cleaves 3 'bonds of pyrimidines. Therefore, form after the split
  • RNase A pyrimidine 3 'phosphates and oligonucleotides with terminal pyrimidine 3' phosphates.
  • RNase A consists of a chain of 124 amino acids intramolecularly cross-linked by four disulfide bridges. RNase A is enzymatically active even in the absence of co-factors and divalent cations. It is inhibited by heavy metal ions as well as by DNA in a competitive way.
  • RNase A is used in various molecular biological techniques. When isolating either plasmid DNA from bacterial cells or genomic DNA from eukaryotic cells, for example, RNA is also purified in addition to DNA, which in large quantities leads to an increased viscosity of the sample and a reduction in the yield. Therefore, the RNA must be degraded by adding RNase A to increase the quality and quantity of the sample. The same applies to the preparation of recombinant proteins.
  • RNase A is also used for the detection of single-base mutations in RNA or DNA. In this case, RNase A cleaves on mismatches, for example in RNA-RNA heteroduplexes, which were formed between a reference wild-type RNA and a possibly mutated RNA. The size of the split strand can then be estimated by gel electrophoresis.
  • RNase A is also used in RNase protection assays with which the expression of different genes can be examined simultaneously.
  • This method is based on the hybridization of sample RNAs to complementary, radioactively labeled RNA probes (ribo samples) and the subsequent digestion of non-hybridized sequences with one or more single-stranded ribonucleases. After the digestion has taken place, the ribonucleases are inactivated and the protected fragments of the radioactively labeled RNA are analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography.
  • RNase A The variety of molecular biological applications for RNase A requires the isolation of large amounts of the enzyme in high purity.
  • BSE problem of recent years has resulted in animal raw materials, especially those derived from cattle, no longer being accepted by the authorities in pharmaceutical production for reasons of biological safety.
  • the use of RNases has been completely dispensed with in recent years and the RNA in many biotechnological-pharmaceutical processes has instead been separated off using alternative, usually very expensive, processes such as chromatography. Therefore, there is a need for a method that enables the production of large amounts of RNase A without the use of animal material. This can be achieved primarily by the recombinant production of RNase A.
  • RNase A is unstable when expressed alone in E. coli; (2) In order to reconstitute RNase A into an active protein, four disulfide bridges must be correctly formed; (3) RNase A expression within a cell may be cytotoxic, and (4) RNase A may break down its own transcript, causing expression performance to decrease accordingly.
  • RNase A was expressed under the control of a heat-inducible promoter. This resulted in the formation of inclusion bodies and a yield of about 2 mg / l (McGeehan and Brenner (1989) FEBS Letters 247 (1): 55-56).
  • RNase A was also expressed together with a signal peptide which brings about the efficient translocation of RNase into the periplasm under the control of an IPTG-inducible promoter.
  • RNase A was released from the periplasm by spheroplast / osmotic Schoc-lc and purified. With this strategy, a yield of 0.1 nxg / l was achieved (Tarragona-Fiol et al. (1992) Gene 118: 239-245).
  • Host cells other than E. coli e.g. Bacillus subtilis and Pichia pastoris were used to express RNase A. With these host cells, yields of the order of 1-5 mg / l could also be achieved (Vasantha and Filpula (1989) Oene 76: 53-60; Chatani et al. (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem. 64 (11) : 2437-2444).
  • the object of the invention is therefore to provide a method by means of which recombinant RNase A can be produced in large quantities in E.co cells.
  • a method for the production of recombinant RNase A in E. coli which is characterized in that a DNA sequence is used which codes for an RNase A of bovine origin and which has been adapted to the codon use in E. coli.
  • the genetic code is redundant because 20 amino acids from 61 triplet codons are specified. Therefore, most of the 20 proteinogenic amino acids are encoded by several base triplets (codons).
  • the synonymous codons that specify a single amino acid are not used with the same frequency in a particular organism, but there are preferred codons that are used frequently and codons that are used less frequently. These differences in codon usage are attributed to selective evolutionary pressures and, above all, the efficiency of translation.
  • One reason for the lower translation efficiency of rarely occurring codons could be that the corresponding aminoacyl tRNA pools are exhausted and are therefore no longer available for protein synthesis.
  • different organisms prefer different codons. For example, the expression of a recombinant DNA that originates from a mammalian cell in E. co / t cells is often only suboptimal. Therefore, replacing rarely used codons for commonly used codons can increase expression in some cases.
  • Tables for codon usage can include can be found at the following Internet addresses: http: //www.kazusa.or.ip/Kodon/E.html; http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EIVlBOSS/Apps/cai.html; http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EIV-BOSS/Apps/chips.html; or http: // www. Entelechon. com / eng / cutanalysis .html.
  • Programs are also available for the reverse translation of a protein sequence, for example the protein sequence of RNase A, into a degenerate DNA sequence, such as at http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html; or http: //w ⁇ vw.hgmp.mrc.ac.uk/Software.EMBOSS/Apps/backtranseq.html.
  • the DNA sequence used to express the recombinant RNase A was adapted to the codon use of the E.co/t strain Kl 2.
  • the sequences can be adapted to the codon use in a particular organism with the aid of various criteria.
  • the codon most frequently occurring in the selected organism can always be used for a certain amino acid
  • the natural frequency of the different codons in the selected organism can also be taken into account, so that all codons for a certain amino acid according to their natural frequency in the genome of the selected organism in the optimized sequence.
  • the choice of the position at which base triplet is used can be random. Both strategies for optimizing the DNA sequence with regard to the use of codons have proven equally suitable for the method according to the invention.
  • the DNA sequence coding for the bovine RNase A is in at least 30 positions, preferably in at least 40 positions, particularly preferably in at least 50 positions and most preferably in at least 60 positions with respect to the codon use in the E. coli sta m Kl - 2 optimized.
  • the optimized DNA sequences are those in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 DNA sequences shown or DNA sequences that correspond to those in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 DNA sequences shown are at least 90, preferably at least 92 or 94%, particularly preferably at least 96 or 98% and most " preferably at least 99% identical over the entire coding sequence.
  • Sequence identity is determined by a number of programs based on different algorithms.
  • the algorithms from Needleman and Wunsch or Smith and Waterman deliver particularly reliable results.
  • the program PileUp (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25: 351-360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153) or the Gap and Best Fit programs (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453 and Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489) used, which are included in the GCG software package (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA).
  • sequence identity values given above in percent were determined with the GAP program over the entire sequence range with the following settings: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10000 and Average Mismatch: 0.000.
  • codon-optimized DNA sequences enable more efficient translation and the mRNAs formed therefrom may have a higher half-life in the cell and are therefore more frequently available for translation.
  • Amino acid sequence like the native protein occurring in bovine cells, but is not encoded by the DNA occurring in the bovine cells.
  • the RNase A is expressed in fusion with a signal peptide that controls the transport into the periplasmic space. Localization in the periplasmic space prevents possible cytotoxic effects that could arise from the expression of RNase A.
  • signal peptides include stll and phoA (Denefle et al. (1989) Gene 85: 499-510), ompF and LamB (Hoffman and Wright (1985) Proc. Natl. Aca-d. Sei. USA 82: 5107-5111), pelB (Lei et al. (1987) J. Bacteriol. 169 (9) : 4379-4383), OmpT (Johnson et al. (1996) Protein Expression Purif.
  • Beta-lactamase Kadonaga et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 2149-2154
  • Enterotoxins Lr-A Enterotoxins Lr-A
  • LT-B Transtioka-Fujimoto et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 1728-1732
  • Protein A from S. aureus Abrahmsen et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14 : 7487-7500.
  • the phoA signal peptide is preferably used.
  • RNase A is preferably under the control of an incusible promoter.
  • a heat-inducible promoter is particularly preferably used, in which the expression of the gene under its control is induced by increasing the cultivation temperature to 42 ° C.
  • the invention also relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising the following constituents in 5 '-3' order: - a promoter active in E. coli, - optionally a sequence coding for a signal peptide, - one for the codon use in E. coli-matched DNA sequence encoding an RNase A of bovine origin.
  • the promoter is preferably an inducible proinotor, particularly preferably a heat-inducible promoter.
  • the signal peptide is preferably a signal sequence which is responsible for the transport of the protein in controls the periplasmic space, and particularly preferably around the phoA signal peptide.
  • the methods for producing a nucleic acid molecule which comprises the components listed above belong to the molecular biological
  • the induction of the promoter takes place preferably in the middle to the end of the exponential growth phase. At this point in time, the cells have reached a bio-moist mass of approximately 35 to 50 g / l culture medium. Protein expression is induced for at least 14, usually for 14 to 20 hours, preferably for at least 16, usually for 16 to 18 hours, and most preferably for about 17 hours.
  • E.co/z ' strains are suitable as host cells for the expression of the recombinant RNase A, including BL21, BNN93, MM294, ATCC 23226 and ATCC 23851.
  • co t cell culture in a suitable culture medium contains at least 0.2 g RNase A per liter of culture medium, preferably at least 0.5 g / 1, particularly preferably at least 1 g / 1, during the harvest after cultivation and, if appropriate, induction most preferably about 1.2 g RNase A per liter of culture medium.
  • RNase A forms inclusion bodies in the host cells. These inclusion bodies are insoluble intracellular aggregates of the expressed protein. They can be isolated by centrifugation at low speed and usually consist of almost pure ones
  • Cell lysis can be accomplished e.g. by mechanical shear stress, enzymatic digestion, e.g. with lysozyme, ultrasound treatment, homogenization, glass ball vortexing, treatment with detergents or organic solvents, by freezing and thawing or by treatment with a
  • Denaturant (Bollag et al. (1996) Protein Methods, 415 pages, Wiley-Liss, NY, NY).
  • the cells can be lysed in the presence of a denaturing agent or a disulfide reducing agent.
  • Insoluble or aggregated material can be separated from soluble proteins by various methods, such as centrifugation, filtration (including ultrafiltration) or precipitation.
  • the insoluble or aggregated material must be made soluble or monomeric by treating it with a denaturing agent.
  • Suitable denaturing agents include: urea, guanidine, arginine, sodium thiocyanate, pH extremes (dilute acids or bases), detergents (eg SDS, sarcosyl), salts (chlorides, nitrates, thiocyanates, trichloroacetates), chemical derivatization (sulfitolysis, reaction with citraconanhydride ), Solvents (2-amino-2-methyl-l-propanol or other alcohols, DMSO, DMF) or strong anion exchange resins such as Q-Sepharose.
  • Suitable concentrations of urea are 1 to 8 M, preferably 5 to 8 M.
  • Suitable concentrations of guanidine are 1 to 8 M, preferably 4 to 8 M. Guanidine is particularly preferably used in a concentration of 5 M.
  • the solubilization buffer particularly preferably additionally contains a redox mixture of an oxidizing agent and a reducing agent in order to promote the reduction of intra- and intermolecular disulfide bridges.
  • a redox mixture of an oxidizing agent and a reducing agent in order to promote the reduction of intra- and intermolecular disulfide bridges.
  • Redox mixtures include cysteine oxygen, cysteine / cystine, cysteine / cystamine, cysteamine / cystamine and reduced glutathione / oxidized glutathione.
  • the solubilization buffer contains reduced and oxidized glutathione.
  • the reduced glutathione is present in the solubilization buffer in a concentration of 1 to 10 mM, preferably 2 to 5 mM.
  • the concentration of the oxidized glutathione is 1/10 to 1/1, preferably 1/10, of the concentration of the reduced glutathione.
  • the pH of the solubilization mixture is preferably between pH 6 and pH 10, particularly preferably between 7.5 and 9.5, most preferably around pH 9.
  • the protein After solubilizing the inclusion bodies, the protein must be folded back into its active form. To do this, the protein must adopt its native conformation and form its native disulfide bridges. Refolding is accomplished by reducing the concentration of the denaturant so that the protein can renaturate into its soluble, biologically active form.
  • the concentration of the denaturant can be reduced by dialysis, dilution, gel filtration, precipitation of the protein or by immobilization on a resin, followed by washing with a buffer.
  • the concentration of the denaturing agent is preferably reduced by dilution in a native buffer.
  • an oxidizing agent or a redox mixture of an oxidizing agent and a reducing agent is added which catalyze the disulfide exchange reaction.
  • Suitable oxidizing agents include oxygen, cystine, oxidized glutathione, cystamine and dithioglycolic acid.
  • suitable redox mixtures include cysteine / oxygen, cysteine / cystine, cysteine / cystamine, cysteamine / cystamine, reduced glutathione / oxidized glutathione, sodium sulfite / sodium tetrathionate, etc.
  • a reducing agent such as DTT or 2-mercaptoethanol can be added to the refolding mixture To request disulfide exchanges.
  • a metal ion such as copper can be added to the refolding mixture to promote oxidation of the protein. Suitable concentrations of metal ions in the refolding mixture are 1 ⁇ M to 1 mM.
  • the refolding mixture preferably contains reduced and oxidized glutathione.
  • the reduced glutathione is present in a concentration of 1 to 10 mM, preferably 2 to 5 mM, in the refolding mixture.
  • the concentration of the oxidized glutathione is 1/10 to 1/1, preferably 1/10, of the concentration of the reduced glutathione.
  • the pH of the refolding mixture is preferably between pH 6 and pH 10, particularly preferably the pH is between 7.5 and 9.5 and most preferably the pH of the refolding mixture is approximately pH 9.
  • Chromatography is particularly preferably a cation exchange chromatography, in which the RNase A at a specific pH of the buffer, which should be at least 0.5 to 1.5 pH units below the pI value of the RNase A of 9.45 , binds to the matrix of the cation exchange column with its positive total charge, while most contaminating proteins do not bind and can be removed by washing.
  • Suitable cation exchange matrices include carboxymethyl (CM) cellulose, AG 50 W, Bio-Rex 70, carboxymethyl (CM) -Sephadex, sulfopropyl (SP) -Sephadex, carboxymethyl (CM) -Sepharose CL-6B and sulfonate (S) -Sepharose ,
  • Suitable buffers for cation exchange chromatography include maleate, malonate, citrate, lactate, acetate, phosphate, HEPES and bicin buffers.
  • the concentration of the buffer is preferably between 20 mM and 50 mM.
  • the pH of the buffer should preferably not be higher than 8.0, preferably not higher than 7.0.
  • 20 mM sodium acetate pH 5.0 or 50 mM Tris-HCl pH 6.8 is particularly preferably used for the cation exchange chromatography.
  • the RNase A can be eluted from the column by a change, in the case of cation exchange chromatography, an increase in the pH or an increase in the ionic strength.
  • Elution is preferably effected by increasing the ionic strength. If 20 mM sodium acetate pH 5.0 is used as a buffer, a mixture of 20 mM sodium acetate pH 5.0 and 350 mM NaCl is used for elution. If 50 mM Tris-HCl pH 6.8 is used as a buffer, Tris-HCl pH 6.8 is used for the elution in a concentration of 250 mM.
  • the RNase A can then be further purified by additional chromatographic steps as well as filtration, precipitation and diafiltration.
  • DNases purified with RNase A may have to be inactivated by heat-treating the product-containing chromatography fractions at 95 ° C in a water bath.
  • the heat treatment is preferably carried out for 20 to 35 minutes, particularly preferably for about 20 minutes. Alternatively, the heat treatment can also be carried out at 80 ° C over a correspondingly extended period.
  • the RNase A can be analyzed for its amount and its activity.
  • the quantity of the purified RNase A can be analyzed qualitatively on the one hand by means of an SDS-PAGE analysis and subsequent Coomassie Brilliant Blue staining.
  • a colorimetric assay such as the Bradford assay or a chemical reaction such as the Lowry or Biuret reaction can be used to quantify RNase A.
  • a non-recombinant, commercially available bovine RNase A with a known combination can be used as the standard for the analyzes.
  • the concentration of the protein solution can also be below the absorbance at 278 nm
  • the activity of RNase A can be determined by digestion of defined RNA molecules.
  • RNase A activity is expressed in Kunitz units.
  • a Kunitz unit causes an absorbance decrease at 300 nm of 100% in one minute at a temperature of 25 ° C and a pH of 5.0 when total RNA from yeast is used as the substrate.
  • the commercially available RNase A preparations can be used as standard.
  • the RNase A purified by the process according to the invention has an activity of at least 40 Kunitz units and preferably of at least 50 Kunitz units. This activity is comparable to the values given by the manufacturers for non-recombinant RNase A.
  • the activity test can also be carried out with other RNAs at different temperatures and over different time periods.
  • the purified RNase A can either be stored as a lyophilisate or in liquid form.
  • Suitable buffers for liquid storage are e.g. Tris-HCl at pH 6.8 to 7.4, a phosphate buffer or sodium acetate.
  • the buffers can contain other components such as glycerin, Triton X-100, sodium chloride or EDTA. If Tris-HCl is used as a buffer, it is used in a concentration of 10 mM to 250 mM. It is preferably used in a concentration of 250 mM.
  • RNase A is present in the solution in a concentration of 1 to 100 mg / ml, preferably 100 mg / ml.
  • the RNase A produced by the method according to the invention is suitable for all applications in which RNase A is usually used, for example for the isolation of plasmid or genomic DNA and recombinant proteins, the detection of single-base mutations or the ribonuclease protection assay.
  • the present invention is illustrated by the following examples, which are not to be understood as a limitation.
  • the protein sequence of the mature RNase A which can be found under the accession number AAB35594 in the NCBI protein database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez), was reverse-translated. This resulted in a degenerate DNA sequence, which was subsequently optimized for E.coli K12 cells with the help of publicly available codon usage tables (http://www.kazusa.or.Jp/Kodon/E.html).
  • the DNA sequence for RNase A was adapted to the codon use in the E. co / t strain K12 by always using the codon most frequently used in these cells for a certain amino acid.
  • the phoA signal peptide comes from the alkaline phosphatase from Lysobacter enzymogenes (Accession No. Q05205).
  • the sequence of the putative signal peptide (29 amino acids) was determined using an Entelechon applet (http://www.entelechon.coin/) on their homepage, taking into account the Codon usage in E. coli Kl 2 reverse translated. Derived from this reversely translated nucleic acid sequence, two single-stranded DNA oligonucleotides (phoA for, phoA rev) were produced and linked to the coding cDNA mRAopt via recombinant PCR.
  • the reaction product of the primary PCR reaction was carried out together with the plasmid which contains the optimized DNA sequence (pmRAopt, supplied by Geneart) and a primer which carried out the amplification from the 3 'end of the
  • RNase A-opt cDNA enables (5 * GTC GAC TAT TAG ACG CTC GCA TC 3 '), used in a so-called recombinant PCR reaction with the following conditions:
  • the DNA sequence for the signal peptide was at the 5 'end of the RNase A opt cDNA.
  • the PCR product was purified on an agarose gel and ligated into the vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Düsseldorf, Germany). The correct sequence was verified by sequencing.
  • the cloned PCR product was then cut out of the vector using an N- / S ⁇ / I double digest and purified using an agarose gel.
  • This vector was also cleaned on an agarose gel.
  • the NdellSall-digested pho A-R ⁇ ase A-opt fragment was ligated into the linearized vector and transformed into E.
  • the map of the expression vector pHIP is shown in Fig. 1, the sequence of the expression vector is shown in SEQ ID No. 5 specified.
  • This nector already contains the heat-inducible promoter sequence and a multiple cloning site into which corresponding cD ⁇ As can be cloned via the restriction sites of the enzymes Ndel and Sau.
  • the bacteria were in complete medium (soy peptone (27 g / 1), yeast extract (14 g / 1), ⁇ aCl (5 g / 1), K 2 HPO 4 (6 g / 1), KH 2 PO 4 ( 3 g / 1), MgSO 4 (0.5 g / 1), glycerin (30 g / 1)) cultured at 30 ° C.
  • complete medium sodium g / 1
  • yeast extract 14 g / 1
  • ⁇ aCl 5 g / 1
  • K 2 HPO 4 (6 g / 1)
  • KH 2 PO 4 3 g / 1)
  • MgSO 4 0.5 g / 1
  • glycerin 30 g / 1
  • the bio-moist mass can be determined [mg / ml or g / 1] determine. The determination was carried out as a double determination. After reaching a bio-moist mass of 35 to 50 g / 1, the cultivation temperature was raised to 42 ° C increased, which induced the expression of the recombinant protein. The induction phase lasted 17 hours.
  • the cells were harvested by centrifugation and resuspended in 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, which was used in an amount of 3.75 ml / g of bio-moist mass.
  • the cells were then physically disrupted through two passages in the high-pressure homogenizer (Niro Soavi, Lübeck, Germany) at a pressure of 800 ⁇ 50 bar.
  • the inclusion body fraction was harvested by centrifugation (11000 xg for 30 minutes at 4 ° C.), resuspended in 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, the buffer being used in an amount of 5 g / 1 inclusion bodies, and again Centrifugation pelleted.
  • the inclusion body fraction was adjusted in a denaturing redox buffer (5 M guanidine HCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2 mM glutathione (reduced), 0.2 mM glutathione (oxidized), pH 9) NaOH or HCl) solubilized.
  • a denaturing redox buffer 5 M guanidine HCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2 mM glutathione (reduced), 0.2 mM glutathione (oxidized), pH 9) NaOH or HCl
  • Insoluble constituents of the inclusion body fraction were removed from the mixture by centrifugation or filtration.
  • the optical density of the clarified solution was then determined at 280 nm (OD 280mn ).
  • the denatured proteins were refolded by dilution in a native dilution buffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2 mM Glutathione (reduced), 0.2 mM glutathione (oxidized), adjusted to pH 9 with NaOH or HCl).
  • the volume of the dilution buffer was chosen such that an OD280 mn of 5 resulted in the refolding batch after adding the solubilized inclusion body fraction. This batch was gently stirred for at least 15 hours (150 to 180 revolutions per minute).
  • the refolding batch was clarified by filtration and then concentrated and buffered by ultrafiltration, so that the batch was in a buffer suitable for the subsequent chromatography (50 mM Tris-HCl pH 6.8).
  • the batch obtained from the ultrafiltration was purified by chromatography using a cation exchanger (SP-Sepharose, company Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany). Non-specific proteins were removed by washing with approximately three column volumes of 100 mM Tris-HCl pH 6.8. Elution was carried out by increasing the salt concentration to 250 mM Tris-HCl pH 6.8.
  • the product-containing chromatography fractions were identified by measuring the absorbance at 280 nm in the chromatography system, combined and heat-treated in a water bath at 95 ° C. for 20 minutes. Precipitate was removed after the heat treatment by filtration or centrifugation. The sample was concentrated by ultrafiltration and the RNase A solution was adjusted to a final concentration of 10O mg / ml by adding 250 mM Tris-HCl pH 6.8. The solution was filtered and filled sterile. 7. Analysis of the purified RNase A
  • the recombinant, purified RNase A was qualitatively analyzed by SDS-PAGE analysis with subsequent Coomassie brilliant blue staining as described in Sambrook and Russell (2001), vide supra.
  • Figure 2 shows the analysis of protein expression at different times of cultivation or induction.
  • the expression of the recombinant RNase A is detectable as early as 1.5 hours after induction and increases up to 18 hours after induction.
  • FIG. 3 shows the SDS-PAGE analysis of RNase A after the individual purification steps. Only the RNase A is purified using the sequence of purification steps described above.
  • the concentration of the purified RNase A was determined colorimetrically according to Bradford, M.M. ((1976) Anal. Biochem. 72: 248-254).
  • both the RNase A which had been prepared by the process according to the invention, and two different commercially available RNase A preparations were used to purify two different plasmids.
  • the corresponding cultures were incubated overnight in dYT medium with kanamycin (50 ⁇ g / ml) at 37 ° C. and 180 revolutions per minute. 1.5 ml of each culture were transferred to an Eppendorf reaction vessel per batch and pelleted in a table centrifuge for 3 min at 13,000 revolutions per minute.
  • the pellets were resuspended in 200 ⁇ l buffer 1 (Qiagen, Hilden, Germany; 50 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA, 100 ⁇ g / ml RNase A), with 200 ⁇ l buffer 2 (Qiagen; 0.2 M NaOH, 1% (w / v) SDS) mixed and incubated for 3-5 min at room temperature. 200 ⁇ l of buffer 3 (from Qiagen; 3 M potassium acetate pH 5.5) were then added, the samples were mixed by inverting and centrifuged for 5 min in a table centrifuge at 13,000 revolutions per minute. The supernatant (500 ⁇ l) was transferred to a new reaction vessel.
  • buffer 1 Qiagen, Hilden, Germany; 50 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA, 100 ⁇ g / ml RNase A
  • 200 ⁇ l buffer 2 Qiagen; 0.2 M NaOH,
  • M 1 kb size marker, 1: without RNase A, 2: bovine RNase A (company A), 3: bovine RNase A (company B), 4: recombinant RNase A

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A in E.coli, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die an die Kodonverwendung in E.coli angepasst wurde. Des Weiteren betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die an die Kodonverwendung in E.coli angepasst wurde sowie rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die eines dieser Nukleinsäuremoleküle enthalten und die Expression der rekombinanten RNase A in E.coli erlauben.

Description

Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A in E.coli, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die an die Kodonverwendung in E.coli angepasst wurde. Des Weiteren betrifft die Erfindung Nukleinsauremolekule, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die an die Kodonverwendung in E.coli angepasst wurde sowie rekombinante Nukleinsauremolekule, die eines dieser Nukleinsauremolekule enthalten und die Expression der rekombinanten RNase A in E.coli erlauben.
Die RNase A ist eine Endoribonuklease, die RNA-Stränge an innenständigen Phosphodiesterbrücken hydrolysiert. Sie ist spezifisch für einzelsträngige RNA und spaltet Bindungen 3 ' von Pyrimidinen. Daher bilden sich nach der Spaltung mit
RNase A Pyrimidin-3' -Phosphate und Oligonukleotide mit terminalen Pyrimidin-3'- Phosphaten. Die RNase A besteht aus einer durch vier Disulfidbrücken intramolekular vernetzten Kette aus 124 Aminosäuren. Die RNase A ist auch in Abwesenheit von Co-Faktoren und zweiwertigen Kationen enzymatisch aktiv. Sie wird gehemmt durch Schwermetallionen sowie durch DNA in einer kompetitiven Weise.
Die RNase A wird in verschiedenen molekularbiologischen Techniken eingesetzt. Bei der Isolierung entweder von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen oder von genomischer DNA aus eukaryontischen Zellen beispielsweise wird neben der DNA auch RNA aufgereinigt, die in großen Mengen zu einer erhöhten Viskosität der Probe und zu einer Verringerung der Ausbeute führt. Daher muss die RNA durch Zugabe von RNase A abgebaut werden, um die Qualität und Quantität der Probe zu erhöhen. Ähnliches gilt auch für die Präparation rekombinanter Proteine. Eine weitere Anwendung findet die RNase A beim Nachweis von Einzelbasenmutationen in RNA oder DNA. In diesem Fall spaltet die RNase A an Fehlpaarungen beispielsweise in RNA-RNA-Heteroduplexen, die zwischen einer Referenz- Wildtyp-RNA und einer möglicherweise mutierten RNA gebildet wurden. Die Größe des gespaltenen Stranges kann anschließend durch Gelelektrophorese abgeschätzt werden.
Schließlich wird die RNase A auch in RNase-Protection-Assays verwendet, mit denen die Expression verschiedener Gene gleichzeitig untersucht werden kann. Diese Methode beruht auf der Hybridisierung von Proben-RNAs an komplementäre, radioaktiv markierte RNA-Sonden (Riboproben) und dem nachfolgenden Verdau von nicht hybridisierten Sequenzen mit einer oder mehreren einzelstrangspezifischen Ribonukleasen. Nach dem erfolgten Verdau werden die Ribonukleasen inaktiviert und die geschützten Fragmente der radioaktiv markierten RNA durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Autoradiographie analysiert.
Die Vielzahl der molekularbiologischen Anwendungsmöglichkeiten für die RNase A erfordert die Isolierung großer Mengen des Enzyms in hoher Reinheit. Der klassische Weg zur Herstellung der RNase A umfasst die Isolierung aus dem Rinderpankreas. Allerdings führte die BSE-Problematik der vergangenen Jahre dazu, dass tierische Rohstoffe, insbesondere solche, die aus Rindern stammen, aus Gründen der biologischen Sicherheit von den Behörden in der pharmazeutischen Produktion nicht mehr akzeptiert werden. Deshalb wurde in den vergangenen Jahren ganz auf die Verwendung von RNasen verzichtet und die RNA in vielen biotechnologisch- pharmazeutischen Verfahren stattdessen durch alternative, meist sehr kostspielige Verfahren wie die Chromatographie abgetrennt. Daher besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das die Herstellung von großen Mengen an RNase A ermöglicht, ohne dass dazu tierisches Material verwendet werden muss. Dies kann vor allem durch die rekombinante Herstellung der RNase A erreicht werden.
Die rekombinante Herstellung der RNase A wird allerdings durch vier Faktoren verkompliziert: (1) die RNase A ist instabil, wenn sie alleine in E.coli exprimiert wird; (2) um die RNase A zu einem aktiven Protein zu rekonstituieren, müssen vier Disulfidbrücken korrekt gebildet werden; (3) die Expression der RNase A innerhalb einer Zelle ist möglicherweise zytotoxisch und (4) die RNase A baut möglicherweise ihr eigenes Transkript ab, wodurch die Expressionsleistung entsprechend sinkt.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Möglichkeiten zur rekombinanten Expression der RNase A erprobt, die diese Schwierigkeiten überwinden sollten, die aber alle zu einer eher geringen RNase A- Ausbeute führten.
In einem Ansatz wurde die RNase A unter der Kontrolle eines hitzeinduzierbaren Promotors exprimiert. Dies führte zur Bildung von Inclusion Bodies und zu einer Ausbeute von etwa 2 mg/1 (McGeehan und Brenner (1989) FEBS Letters 247 (1): 55-56).
Die Expression eines Fusionsproteins von RNase A mit einem Gen-10-Protein aus dem Bakteriophagen T7 unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors führte ebenfalls zur Bildung von Inclusion Bodies. Nach enzymatischer Spaltung des Fusionsproteins mit der Protease Faktor Xa und Aufreinigung wurde eine Ausbeute von 4-8 mg/1 Protein erzielt (Laity et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 615- 619). Auch ein Fusionsprotein aus ß-Galaktosidase und RNase A wurde unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren ß-Galaktosidase-Promotors in E.coli exprimiert. Mit dieser Strategie wurde nach der Aufreinigung eine Ausbeute von 0,2 mg/1 erzielt (Nambiar et al. (1987) Eur. J. Biochem. 163: 67-71).
Ebenso wurde die RNase A zusammen mit einem Signalpeptid, das die effiziente Translokation der RNase in das Periplasma bewirkt, unter der Kontrolle eines IPTG- induzierbaren Promotors exprimiert. Die RNase A wurde aus dem Periplasma durch Sphäroplast/osmotischen Schoc-lc freigesetzt und aufgereinigt. Mit dieser Strategie wurde eine Ausbeute von 0,1 nxg/l erzielt (Tarragona-Fiol et al. (1992) Gene 118: 239-245).
Schließlich wurde in E.coli- Zellen auch eine Kombination aus Hitze-induzierbarem Promotor und einem Signalpeptid, das den Transport der RNase A in das Periplasma steuert, getestet. Auch hier wurden die periplasmatischen Proteine durch
Sphäroplast/osmotischen Schoc-k freigesetzt und aufgereinigt. Mit dieser Methode konnte eine Ausbeute von 45-5O mg/1 erreicht werden (Okorokov et al. (1995) Protein Expression and Purification 6: 472-480).
Auch andere Wirtszellen als E.coli, wie z.B. Bacillus subtilis und Pichia pastoris, wurden zur Expression der RNase A verwendet. Mit diesen Wirtszellen konnten ebenfalls nur Ausbeuten in der Größenordnung von 1-5 mg/1 erreicht werden (Vasantha und Filpula (1989) Oene 76: 53-60; Chatani et al. (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(11): 2437-2444).
Somit besteht trotz der mehrfachen Versuche zur Optimierung der rekombinanten RNase A-Expression ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das die Herstellung von rekombinanter RNase A in E.coli mit einer höheren Ausbeute als im Stand der Technik ermöglicht.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem rekombinante RNase A in großen Mengen in E.co -Zellen hergestellt werden kann.
Diese und weitere Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Merkmale des Hauptanspruchs gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen definiert.
Εrfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter RNase A in E.coli bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die an die Kodonverwendung in E. coli angepasst wurde.
Der genetische Code ist redundant, da 20 Aminosäuren von 61 Triplett-Kodons spezifiziert werden. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminosäuren von mehreren Basentripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosäure spezifizieren, werden in einem bestimmten Organismus jedoch nicht mit gleicher Häufigkeit verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die häufig verwendet werden, und Kodons, die seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonverwendung werden zurückgeführt auf selektive evolutionäre Drücke und vor allem die Effizienz der Translation. Ein Grund für die geringere Translationseffizienz von selten auftretenden Kodons könnte darin liegen, dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschöpft werden und damit nicht mehr zur Proteinsynthese zur Verfügung stehen. Außerdem bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher läuft beispielsweise die Expression einer rekombinanten DNA, die aus einer Säugerzelle stammt, in E. co/t-Zellen häufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten verwendeter Kodons gegen häufig verwendete Kodons in manchen Fällen die Expression erhöhen.
Für viele Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer größeren Zahl von Genen bekannt ist, gibt es Tabellen, denen man die Häufigkeit der Verwendung bestimmter Kodons in dem jeweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen sich Proteinsequenzen mit relativ großer Genauigkeit in eine DNA-Sequenz zurückübersetzen, die die im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodons für die verschiedenen Aminosäuren des Proteins enthält. Tabellen zur Kodonverwendung können u.a. unter den folgenden Internet- Adressen aufgefunden werden: http://www.kazusa.or.ip/Kodon/E.html; http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EIVlBOSS/Apps/cai.html; http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EIV-BOSS/Apps/chips.html; oder http ://www. entelechon. com/eng/cutanalysis .html. Auch zur reversen Translation einer Proteinsequenz, beispielsweise der Proteinsequenz der RNase A, in eine degenerierte DNA-Sequenz sind Programme erhältlich, wie etwa unter http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html; oder http://wΛvw.hgmp.mrc.ac.uk/Software.EMBOSS/Apps/backtranseq.html.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wurde die zur Expression der rekombinanten RNase A verwendete DNA-Sequenz an die Kodonverwendung des E.co/t-Stamms Kl 2 angepasst.
Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendung in einem bestimmten Organismus kann unter Zuhilfenahme verschiedener Kriterien erfolgen. Zum einen kann für eine bestimmte Aminosäure immer das am hänfigsten im ausgewählten Organismus vorkommende Kodon verwendet werden, -zum anderen kann aber auch die natürliche Frequenz der verschiedenen Kodons im ausgewählten Organismus berücksichtigt werden, so dass alle Kodons für eine bestimmte Aminosäure entsprechend ihrer natürlichen Häufigkeit im Genom des ausgewählten Organismus in die optimierte Sequenz eingebaut werden. Dabei kann die Auswahl, an welcher Position welches Basen-Triplett verwendet wird, zufallig stattfinden. Beide Strategien zur Optimierung der DNA-Sequenz im Hinblick auf die Kodonverwendung haben sich für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen als geeignet erwiesen.
Die für die bovine RNase A kodierende DNA-Sequenz ist an mindestens 30 Positionen, bevorzugt an mindestens 40 Positionen, besonders bevorzugt an mindestens 50 Positionen und am meisten bevorzugt an mindestens 60 Positionen in Bezug auf die Kodonverwendung im E. coli-Sta m Kl -2 optimiert.
Am meisten bevorzugt handelt es sich bei den optimierten DNA-Sequenzen um die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2 dargestellten DNA-Sequenzen oder um DNA- Sequenzen, die zu den in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2 dargestellten DNA- Sequenzen zu mindestens 90, bevorzugt zu mindestens 92 oder 94%, besonders bevorzugt zu mindestens 96 oder 98% und am meisten "bevorzugt zu mindestens 99% über die gesamte kodierende Sequenz identisch sind.
Die Sequenzidentität wird über eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen, bestimmt. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp (Feng und Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25: 351 - 360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151 - 153) oder die Programme Gap und Best Fit (Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 und Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 - 489) verwendet, die im GCG-Software-Paket (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA) enthalten sind.
Die oben in Prozent angegebenen Sequenzidentitätswerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10000 und Average Mismatch: 0,000.
Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders angegeben, als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet.
Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die kodonoptimierten DNA-Sequenzen eine effizientere Translation ermöglichen und die daraus gebildeten mRNAs möglicherweise eine höhere Halbwertszeit in der Zelle besitzen und daher häufiger für die Translation zur Verfügung stehen.
Eine "RNase A bovinen Ursprungs" weist die im Wesentlichen gleiche
Aminosäuresequenz wie das in bovinen Zellen auftretende native Protein auf, wird aber nicht durch die in den bovinen Zellen auftretende DNA kodiert.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird die RNase A in Fusion mit einem Signalpeptid exprimiert, das den Transport in den periplasmatischen Raum steuert. Die Lokalisation im periplasmatischen Raum verhindert mögliche zytotoxische Effekte, die durch die Expression der RNase A auftreten könnten. Beispiele für solche Signalpeptide schließen ein stll und phoA (Denefle et al. (1989) Gene 85: 499-510), ompF und LamB (Hoffman und Wright (1985) Proc. Natl. Aca-d. Sei. USA 82: 5107-5111), pelB (Lei et al. (1987) J. Bacteriol. 169 (9): 4379-4383), OmpT (Johnson et al. (1996) Protein Expression Purif. 7: 104-113), Beta-lactamase (Kadonaga et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 2149-2154), Enterotoxine Lr-A, LT-B (Morioka-Fujimoto et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 1728-1732) und Protein A aus S. aureus (Abrahmsen et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 7487-7500).
Auch verschiedene nicht-natürliche, synthetische Signalsequenzen, die die Sekretion bestimmter Proteine ermöglichen, sind dem Fachmann wohl bekannt.
Bevorzugt wird das phoA-Signalpeptid verwendet.
Die Expression der RNase A steht bevorzugt unter der Kontrolle eines inciuzierbaren Promotors. Besonders bevorzugt wird ein hitzeinduzierbarer Promotor veirwendet, bei dem die Expression des unter seiner Kontrolle stehenden Gens durch Erhöhimg der Kultivierungstemperatur auf 42°C induziert wird.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinantes Nukleinsäureii-iolekül, umfassend die folgenden Bestandteile in 5 '-3 '-Reihenfolge: - einen in E. coli aktiven Promoter, - ggf. eine für ein Signalpeptid kodierende Sequenz, - eine an die Kodonverwendung in E. coli angepasste DNA-Sequenz, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um einen induzierbaren Proinotor, besonders bevorzugt um einen hitzeinduzierbaren Promotor. Bei dem Signalpeptid handelt es sich bevorzugt um eine Signalsequenz, die den Transport des Proteins in den periplasmatischen Raum steuert, und besonders bevorzugt um das phoA- Signalpeptid.
Die Methoden zur Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls, das die oben aufgeführten Komponenten umfasst, gehören zu den molekularbiologischen
Standardmethoden und können der Literatur wie z.B. Sambrook und Russell (2001) Molecular Cloning - A laboratory manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, entnommen werden.
Die Induktion des Promotors findet bevorzugt Mitte bis Ende der exponentiellen Wachstumsphase statt. Zu diesem Zeitpunkt haben die Zellen eine Biofeuchtmasse von etwa 35 bis 50 g/1 Kulturmedium erreicht. Die Induktion der Proteinexpression erfolgt für mindestens 14, in der Regel für 14 bis 20 Stunden, bevorzugt für mindestens 16, in der Regel für 16 bis 18 Stunden, und am meisten bevorzugt für etwa 17 Stunden.
Als Wirtszellen für die Expression der rekombinanten RNase A eignen sich verschiedene E.co/z'-Stämme, u.a. BL21, BNN93, MM294, ATCC 23226 und ATCC 23851.
Dem Fachmann sind Methoden bekannt, mit denen er die DNA für die rekombinante Expression der RNase A in die Wirtszellen einbringen kann. Zu diesen Methoden gehören sowohl chemische Methoden als auch physikalische Methoden wie die Elektroporation. Ebenso sind dem Fachmann geeignete Kulturmedien und Kulturbedingungen für die E. eo/z-Zellen bekannt. Diese können auch der Literatur, wie z.B. Sambrook und Russell (2001) Molecular Cloning - A laboratory manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, entnommen werden. Die E. co t-Zellkultur in einem geeigneten Kulturmedium enthält bei der Ernte nach der Kultivierung und ggf. Induktion mindestens 0,2 g RNase A pro Liter Kulturmedium, bevorzugt mindestens 0,5 g/1, besonders bevorzugt mindestens 1 g/1 und am meisten bevorzugt etwa 1 ,2 g RNase A pro Liter Kulturmedium.
In einer bevorzugten Ausführungsform bildet die RNase A in den Wirtszellen Inclusion Bodies. Diese Inclusion Bodies stellen unlösliche intrazelluläre Aggregate des exprimierten Proteins dar. Sie können durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit isoliert werden und bestehen üblicherweise aus fast reinen
Ablagerungen von denaturierten Formen des rekombinant exprimierten Proteins. Im Falle der RNase A trägt die Bildung der Inclusion Bodies möglicherweise zu der hohen Ausbeute bei, da das Produkt in einer inaktiven Form vorliegt und somit keine zytotoxischen Wirkungen zeigen kann.
Um die Inclusion Bodies freizusetzen, muss die Wirtszelle lysiert werden. Die Lyse der Zelle kann erreicht werden z.B. durch mechanischen Scherstress, enzymatischen Verdau, z.B. mit Lysozym, Ultraschallbehandlung, Homogenisierung, Glaskugelvortexen, Behandlung mit Detergenzien oder organischen Lösungsmitteln, durch Einfrieren und Auftauen oder durch Behandlung mit einem
Denaturierungsmittel (Bollag et al. (1996) Protein Methods, 415 Seiten, Wiley-Liss, NY, NY). Gegebenenfalls können die Zellen in Gegenwart eines Denaturierungsmittels oder eines Disulfid-reduzierenden Mittels lysiert werden. Unlösliches oder aggregiertes Material kann von löslichen Proteinen durch verschiedene Verfahren, z.B. Zentrifugation, Filtration (einschließlich Ultrafiltration) oder Präzipitation abgetrennt werden. Im nächsten Schritt muss das unlösliche bzw. aggregierte Material löslich oder monomer gemacht werden, indem es mit einem Denaturierungsmittel behandelt wird. Geeignete Denaturierungsmittel schließen ein: Harnstoff, Guanidin, Arginin, Natriumthiocyanat, pH-Extreme (verdünnte Säuren oder Basen), Detergenzien (z.B. SDS, Sarkosyl), Salze (Chloride, Nitrate, Thiocyanate, Trichloroacetate), chemische Derivatisierung (Sulfitolyse, Reaktion mit Citraconanhydrid), Lösungsmittel (2- Amino-2-methyl-l-propanol oder andere Alkohole, DMSO, DMF) oder starke Anionenaustauschharze wie etwa Q-Sepharose. Geeignete Konzentrationen von Harnstoff sind 1 bis 8 M, bevorzugt 5 bis 8 M. Geeignete Konzentrationen von Guanidin sind 1 bis 8 M, bevorzugt 4 bis 8 M. Besonders bevorzugt wird Guanidin in einer Konzentration von 5 M verwendet.
Besonders bevorzugt enthält der Solubilisierungspuffer zusätzlich ein Redoxgemisch aus einem Oxidationsmittel und einem Reduktionsmittel, um die Reduktion intra- und intermolekularer Disulfidbrücken zu fördern. Beispiele für geeignete
Redoxgemische schließen ein Cystein Sauerstoff, Cystein/Cystin, Cystein/Cystamin, Cysteamin/Cystamin und reduziertes Glutathion/oxidiertes Glutathion. Am meisten bevorzugt enthält der Solubilisierungspuffer reduziertes und oxidiertes Glutathion. Dabei liegt das reduzierte Glutathion in einer Konzentration von 1 bis 10 mM, bevorzugt 2 bis 5 mM, im Solubilisierungspuffer vor. Die Konzentration des oxidierten Glutathions beträgt 1/10 bis 1/1, bevorzugt 1/10, der Konzentration des reduzierten Glutathions.
Der pH- Wert des Solubilisierungsgemisches liegt bevorzugt zwischen pH 6 und pH 10, besonders bevorzugt liegt er zwischen 7,5 und 9,5, am meisten bevorzugt bei etwa pH 9. Nach dem Solubilisieren der Inclusion Bodies muss das Protein in seine aktive Form zurückgefaltet werden. Dazu muss das Protein seine native Konformation annehmen und seine nativen Disulfidbrücken ausbilden. Die Rückfaltung wird erreicht, indem die Konzentration des Denaturierungsmittels reduziert wird, so dass das Protein in seine lösliche, biologisch aktive Form renaturieren kann. Die Konzentration des Denaturierungsmittels kann reduziert werden durch Dialyse, Verdünnung, Gelfiltration, Präzipitation des Proteins oder durch Immobilisierung an einem Harz, gefolgt von Waschen mit einem Puffer. Bevorzugt wird die Konzentration des Denaturierungsmittels durch Verdünnung in einem nativen Puffer reduziert.
Um die nativen Disulfidbrücken des Proteins zurückzubilden, wird ein Oxidationsmittel oder ein Redoxgemisch aus einem Oxidationsmittel und einem Reduktionsmittel zugegeben, die die Disulfidaustauschreaktion katalysieren. Geeignete Oxidationsmittel schließen ein Sauerstoff, Cystin, oxidiertes Glutathion, Cystamin und Dithioglykolsäure. Beispiele für geeignete Redoxgemische schließen ein Cystein/Sauerstoff, Cystein/Cystin, Cystein/ Cystamin, Cysteamin/Cystamin, reduziertes Glutathion/oxidiertes Glutathion, Natriumsulfit/Natriumtetrathionat usw. Gegebenenfalls kann dem Rückfaltungsgemisch ein Reduktionsmittel wie DTT oder 2-Mercaptoethanol zugegeben werden, um den Disulfidaustauscli zu fordern. Gegebenenfalls kann ein Metallion wie Kupfer dem Rückfaltungsgemisch zugegeben werden, um die Oxidation des Proteins zu fördern. Geeignete Konzentrationen von Metallionen im Rückfaltungsgemisch sind 1 μM bis 1 mM.
Bevorzugt enthält das Rückfaltungsgemisch reduziertes und oxidiertes Glutathion. Dabei liegt das reduzierte Glutathion in einer Konzentration von 1 bis 10 mM, bevorzugt 2 bis 5 mM, im Rückfaltungsgemisch vor. Die Konzentration des oxidierten Glutathions beträgt 1/10 bis 1/1, bevorzugt 1/10, der Konzentration des reduzierten Glutathions. Bevorzugt beträgt der pH des Rückfaltungsgemisches zwischen pH 6 und pH 10, besonders bevorzugt liegt der pH zwischen 7,5 und 9,5 und am meisten bevorzugt liegt der pH des Rückfaltungsgemisches bei etwa pH 9.
Nach der Solubilisierung und Rückfaltung der RNase A wird diese bevorzugt durch chromatographische Schritte weiter aufgereinigt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Chromatographie um eine Kationaustauschchromatographie, bei der die RNase A bei einem bestimmten pH des Puffers, der mindestens 0,5 bis 1,5 pH- Einheiten unterhalb des pl- Wertes der RNase A von 9,45 liegen sollte, durch ihre positive Gesamtladung an die Matrix der Kationaustauschsäule bindet, während die meisten kontaminierenden Proteine nicht binden und durch Waschen entfernt werden können.
Geeignete Kationaustauschmatrizes schließen ein Carboxymethyl (CM)-Cellulose, AG 50 W, Bio-Rex 70, Carboxymethyl (CM)-Sephadex, Sulfopropyl (SP)-Sephadex, Carboxymethyl (CM)-Sepharose CL-6B und Sulfonat (S)-Sepharose.
Geeignete Matrizes und Protokolle zur Durchführung der Kationenaustauschchro- matographie kann der Fachmann den Produktinformationen von Anbietern wie Amersham Biosciences (http://www.amershambiosciences.com) oder Bio-Rad (http://www.bio-rad.com) entnehmen.
Geeignete Puffer für die Kationenaustauschchromatographie schließen ein Maleat-, Malonat-, Citrat-, Lactat-, Acetat-, Phosphat-, HEPES- und Bicin-Puffer. Die
Konzentration des Puffers liegt bevorzugt zwischen 20 mM und 50 mM. Der pH des Puffers sollte für die Aufreinigung der RNase A möglichst nicht höher als 8,0, bevorzugt nicht höher als 7,0 sein. Besonders bevorzugt wird für die Kationenaustauschchromatographie 20 mM Natriumacetat pH 5,0 oder 50 mM Tris-HCl pH 6,8 verwendet.
Die RNase A kann nach dem Waschen durch eine Veränderung, im Falle der Kationenaustauschchromatographie eine Erhöhung, des pH- Wertes oder eine Erhöhung der Ionenstärke von der Säule eluiert werden.
Bevorzugt wird die Elution durch Erhöhung der Ionenstärke bewirkt. Wenn 20 mM Natriumacetat pH 5,0 als Puffer verwendet wird, wird zur Elution ein Gemisch von 20 mM Natriumacetat pH 5,0 und 350 mM NaCl eingesetzt. Wenn 50 mM Tris-HCl pH 6,8 als Puffer verwendet wird, wird zur Elution Tris-HCl pH 6,8 in einer Konzentration von 250 mM eingesetzt.
Weitere geeignete Bedingungen für die Kationenaustauschchromatographie können der einschlägigen Literatur, wie etwa dem Handbuch "Ion Exchange Chromatography-Principles and Methods" von Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland, entnommen werden.
Die RNase A kann anschließend durch zusätzliche chromatographische Schritte sowie Filtration, Präzipitation und Diafiltration weiter aufgereinigt werden.
Nach der Aufreinigung müssen eventuell mit der RNase A aufgereinigte DNasen inaktiviert werden, indem die produkthaltigen Chromatographiefraktionen bei 95 °C im Wasserbad hitzebehandelt werden. Bevorzugt erfolgt die Hitzebehandlung für 20 bis 35 Minuten, besonders bevorzugt für etwa 20 Minuten. Alternativ kann die Hitzebehandlung auch bei 80 °C über einen entsprechend verlängerten Zeitraum erfolgen. Nach der Aufreinigung kann die RNase A hinsichtlich der Menge und ihrer Aktivität analysiert werden. Die Analyse der Menge der aufgereinigten RNase A kann zum einen qualitativ über eine SDS-PAGE- Analyse und anschließende Coomassie- Brilliant-Blue-Färbung erfolgen. Zur Quantifizierung der RNase A kann ein kolorimetrischer Assay wie etwa der Bradford-Assay oder eine chemische Reaktion wie die Lowry- oder die Biuret-Reaktion verwendet werden. Als Standard für die Analysen kann eine nicht-rekombinante, kommerziell erhältliche bovine RNase A mit einer bekannten Kombination verwendet werden. Außerdem kann die Konzentration der Proteinlösung auch über die Extinktion bei 278 nm unter
Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten der RNase A berechnet werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nach der Aufreinigung eine Ausbeute an RNase A von mehr als 100 mg/1 Kulturmedium, bevorzugt von mehr als 200 mg/1 Kulturmedium, besonders bevorzugt von mehr als 250 mg/1 Kulturmedium und am meisten bevorzugt von etwa 300 mg/1 Kulturmedium erreicht.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nach der Aufreinigung eine Ausbeute an RNase A von mehr als 3 mg/g Biofeuchtmasse, bevorzugt von mehr als 4 mg/g Biofeuchtmasse, besonders bevorzugt von mehr als 6 mg/g Biofeuchtmasse und am meisten bevorzugt von mehr als 8 mg/g Biofeuchtmasse erreicht.
Die Aktivität der RNase A kann durch Verdau von definierten RNA-Molekülen bestimmt werden. Die RNase A- Aktivität wird in Kunitz-Einheiten wiedergegeben. Eine Kunitz-Einheit verursacht eine Extinktionsabnahme bei 300 nm von 100 % in einer Minute bei einer Temperatur von 25 °C und einem pH von 5,0, wenn Gesamt- RNA aus Hefe als Substrat verwendet wird. Zum Vergleich der Aktivität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigten RNase A mit kommerziell erhältlichen, nicht rekombinanten RNase A-Präparationen können die kommerziell erhältlichen RNase A-Präparationen als Standard verwendet werden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigte RNase A weist eine Aktivität von mindestens 40 Kunitz-Einheiten und bevorzugt von mindestens 50 Kunitz-Einheiten auf. Diese Aktivität ist vergleichbar mit den von den Herstellern angegebenen Werten für nicht-rekombinante RNase A.
Alternativ kann der Aktivitätstest auch mit anderen RNAs bei anderen Temperaturen und über andere Zeiträume hinweg durchgeführt werden. Außerdem ist es natürlich möglich, die Aktivität der RNase A im Rahmen der gewünschten Endanwendung zu testen, z.B. in Form einer Plasmidisolierung.
Die aufgereinigte RNase A kann entweder als Lyophilisat oder in flüssiger Form aufbewahrt werden. Als Puffer für die flüssige Aufbewahrung eignen sich z.B. Tris- HCl bei einem pH- Wert von 6,8 bis 7,4, ein Phosphatpuffer oder Natriumacetat. Zusätzlich können die Puffer weitere Bestandteile wie Glycerin, Triton X-100, Natriumchlorid oder EDTA enthalten. Wenn Tris-HCl als Puffer verwendet wird, wird dieses in einer Konzentration von 10 mM bis 250 mM eingesetzt. Bevorzugt wird es in einer Konzentration von 250 mM verwendet. Die RNase A liegt in der Lösung in einer Konzentration von 1 bis 100 mg/ml, bevorzugt lOOmg/ml vor.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte RNase A eignet sich für alle Anwendungen, in denen üblicherweise RNase A eingesetzt wird, also z.B. für die Isolierung von Plasmid- oder genomischer DNA und rekombinanten Proteinen, den Nachweis von Einzelbasenmutationen oder den Ribonuclease Protection Assay. Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele dargestellt, die nicht als Einschränkung zu verstehen sind.
Beispiele:
1. Optimierung der für die RNase A kodierenden DNA
Zur Optimierung der Kodonverwendung wurde zunächst die Proteinsequenz der reifen RNase A, die unter der Accessionnumber AAB35594 in der NCBI- Proteindatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) zu finden ist, revers translatiert. Dadurch wurde eine degenerierte DNA-Sequenz erhalten, die anschließend unter Zuhilfenahme öffentlich zugänglicher Kodonverwendungstabellen (http://www.kazusa.or.Jp/Kodon/E.html) für E.coli K12 Zellen optimiert wurde. Die DNA-Sequenz für die RNase A wurde an die Kodonverwendung im E. co/t-Stamm K12 angepasst, indem immer das am häufigsten in diesen Zellen verwendete zur Auswahl stehende Kodon für eine bestimmte Aminosäure verwendet wurde. Bei der Optimierung wurde berücksichtigt, dass keine zusätzlichen Ndel- oder Sall - Restriktionsstellen generiert wurden, da diese die spätere Klonierung in den Expressionsvektor erschwert hätten. Die so erhaltene cDNA-Sequenz, die als mRAopt bezeichnet wurde und in SEQ ID No. 1 dargestellt ist, wurde bei der Firma Geneart (Regensburg, Deutschland) synthetisiert.
Das phoA-Signalpeptid stammt von der alkalischen Phosphatase aus Lysobacter enzymogenes (Accession No. Q05205). Die Sequenz des mutmaßlichen Signalpeptids (29 Aminosäuren) wurde mit einem Applet der Firma Entelechon (http://www.entelechon.coin/) auf deren Homepage unter Berücksichtigung der Kodonverwendung in E. coli Kl 2 revers translatiert. Abgeleitet von dieser revers translatierten Nukleinsäuresequenz wurden zwei einzelsträngige DNA- Oligonukleotide (phoA for, phoA rev) hergestellt und über rekombinante PCR mit der kodierenden cDNA mRAopt verbunden.
2. Klonierung der optimierten DNA in einen Expressionsvektor und Transformation der E. co //-Zellen
In einer so genannten primären PCR-Reaktion wurden die beiden für das
Signalpeptid kodierenden Oligonukleotide phoA for (SEQ ID No. 3) und phoA rev (SEQ ID No. 4) zu einem Doppelstrang hybridisiert und unter den folgenden Bedingungen amplifiziert:
Reaktionsansatz :
10 μl phoA for (10 pmol/μl) 10 μl pho A rev (10 pmol/μl)
10 μl lOx PCR-Puffer mit MgCl2 (15mM) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Röche, Mannheim, Deutschland)
4 μl dNTP-Mix (je 2 mM) (Fa. Gibco Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) 1 μl Polymerase (3,5 Einheiten/μl) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Röche, Mannheim, Deutschland) 65 μl H2O PCR-Bedingungen:
1. Schritt: 1 min 95°C
2. Schritt: 1 min 95°C 30 sek 50°C 30 sek 72°C 25 Zyklen
3. Schritt: 4 min 72°C
4. Schritt: 4°C
Das Reaktionsprodukt der primären PCR-Reaktion wurde zusammen mit dem Plasmid, das die optimierte DNA-Sequenz enthält (pmRAopt, geliefert von der Firma Geneart), und einem Primer, der die Amplifikation vom 3 '-Ende von der
RNase A-opt cDNA ermöglicht (5* GTC GAC TAT TAG ACG CTC GCA TC 3'), in einer so genannten rekombinanten PCR-Reaktion mit den folgenden Bedingungen eingesetzt:
Reaktionsansatz:
10 μl pmRAopt (10 ng/μl)
10 μl RNase opt 3' Primer für Amplifikation (10 pmol/μl) 10 μl primäres PCR-Produkt 10 μl 1 Ox PCR-Puffer mit MgCl2 (15 mM) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Röche, Mannheim, Deutschland) 8 μl dNTP-Mix (je 2 mM) (Fa. Gibco Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) 1 μl Polymerase (3,5 Einheiten μl) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Röche, Mannheim, Deutschland)
PCR-Bedingungen:
1. Schritt: 1 min 95°C
2. Schritt: 1 min 95°C 30 sek 55°C 45 sek 72°C 30 Zyklen
3. Schritt: 4 min 72°C
4. Schritt: 4°C
Im PCR-Produkt, das durch diese Reaktion erhalten wurde, lag die DNA-Sequenz für das Signalpeptid am 5'-Ende der RNase A-opt cDNA.
Das PCR-Produkt wurde über ein Agarosegel aufgereinigt und in den Vektor pCR2.1-TOPO (Firma Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) ligiert. Die korrekte Sequenz wurde mittels Sequenzierung verifiziert. Das Monierte PCR-Produkt wurde anschließend über einen N- /Sα/I-Doppelverdau aus dem Vektor herausgeschnitten und über ein Agarosegel gereinigt. Parallel hierzu wurde der Vektor pHIP-pelB- RΝase-opt mit NdeVSaU. verdaut, wodurch der linearisierte Vektor pHIP mit Ndel- und S /I-Enden erhalten wurde. Dieser Vektor wurde ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt. Das NdellSall- verdaute pho A-RΝase A-opt-Fragment wurde in den linearisierten Vektor ligiert und in E. coli TOPIOF'-Zellen transformiert und amplifiziert. Aus diesem Stamm wurde anschließend die Plasmid-DNA isoliert und für die Kalziumchlorid-vermittelte Transformation des E. co/z'-Stammes ATCC 23226 (vgl. Sambrook und Russell, vide suprd) eingesetzt.
Die hier verwendeten Methoden zur Klonierung der optimierten cDNA sind dem Fachmann wohl bekannt und können zum Beispiel in Sambrook und Russell (2001), vide supra, nachgelesen werden.
Die Karte des Expressionsvektors pHIP ist in Abb. 1 dargestellt, die Sequenz des Expressionsvektors ist in SEQ ID No. 5 angegeben. Dieser Nektor enthält bereits die hitzeinduzierbare Promotorsequenz und eine multiple Klonierungsstelle, in die über die Restriktionsschnittstellen der Enzyme Ndel und Sau, entsprechende cDΝAs kloniert werden können.
Fermentation und Induktion der Bakterien
Die Bakterien wurden in Komplettmedium (Soja-Pepton (27 g/1), Hefe-Extrakt (14 g/1), ΝaCl (5 g/1), K2HPO4 (6 g/1), KH2PO4 (3 g/1), MgSO4 (0,5 g/1), Glycerin (30 g/1)) bei 30°C kultiviert. In bestimmten Zeitintervallen wurde 1 ml Kulturbrühe in ein zuvor gewogenes Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und die Zellen durch Zentrifugation bei 13000 x g für 3 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt und das Gefäß erneut gewogen. Aus der Differenz zwischen dem Gewicht des Reaktionsgefäßes mit Zellpellet [mg] und dem Gewicht des leeren Reaktionsgefäßes [mg] dividiert durch das Volumen der Kulturbrühe, aus dem die Zellen pelletiert wurden, lässt sich die Biofeuchtmasse [mg/ml bzw. g/1] bestimmen. Die Bestimmung wurde als Doppelbestimmung durchgeführt. Nach Erreichen einer Biofeuchtmasse von 35 bis 50 g/1 wurde die Kultivierungstemperatur auf 42°C erhöht, wodurch die Expression des rekombinanten Proteins induziert wurde. Die Induktionsphase dauerte 17 Stunden.
4. Ernte der Bakterien und Gewinnung der nativen RNase A aus den Inclusion Bodies
Die Zellen wurden nach der Induktionsphase durch Zentrifugation geerntet und in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 resuspendiert, der in einer Menge von 3,75 ml/g Biofeuchtmasse eingesetzt wurde. Anschließend wurden die Zellen durch zwei Passagen im Hochdruckhomogenisator (Fa. Niro Soavi, Lübeck, Deutschland) bei einem Druck von 800 ± 50 bar physikalisch aufgeschlossen. Die Inclusion Body- Fraktion wurde durch Zentrifugation (11000 x g für 30 Minuten bei 4°C) geerntet, in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 resuspendiert, wobei der Puffer in einer Menge von 5 g/1 Inclusion Bodies eingesetzt wurde, und erneut durch Zentrifugation pelletiert.
Die Inclusion Body-Fraktion wurde in einem denaturierenden Redoxpuffer (5 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2 mM Glutathion (reduziert), 0,2 mM Glutathion (oxidiert), pH 9, eingestellt mit NaOH bzw. HCl) solubilisiert.
Unlösliche Bestandteile der Inclusion Body-Fraktion wurden durch Zentrifugation bzw. Filtration aus dem Ansatz entfernt. Anschließend wurde die optische Dichte der geklärten Lösung bei 280 nm (OD280mn) bestimmt.
Die Rückfaltung der denaturierten Proteine erfolgte durch Verdünnung in einem nativen Verdünnungspuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2 mM Glutathion (reduziert), 0,2 mM Glutathion (oxidiert), mit NaOH bzw. HCl auf pH 9 eingestellt). Das Volumen des Verdünnungspuffers wurde so gewählt, dass sich nach Zugabe der solubilisierten Inclusion Body-Fraktion eine OD280mn von 5 in dem Rückfaltungsansatz ergab. Dieser Ansatz wurde für mindestens 15 Stunden leicht gerührt (150 bis 180 Umdrehungen pro Minute).
5. Ionenaustauschchromatographie
Der Rückfaltungsansatz wurde durch Filtration geklärt und anschließend durch Ultrafiltration eingeengt und umgepuffert, so dass sich der Ansatz in einem für die nachfolgende Chromatographie geeigneten Puffer (50 mM Tris-HCl pH 6,8) befand. Der aus der Ultrafiltration erhaltene Ansatz wurde über einen Kationenaustauscher (SP-Sepharose, Firma Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) chromatographisch aufgereinigt. Unspezifische Proteine wurden durch Waschen mit etwa drei Säulenvolumen 100 mM Tris-HCl pH 6,8 entfernt. Die Elution erfolgte durch Erhöhung der Salzkonzentration auf 250 mM Tris-HCl pH 6,8.
6. Hitzeinaktivierung und Abfüllung der RNase A
Die produkthaltigen Chromatographie-Fraktionen wurden durch Messung der Extinktion bei 280 nm in der Chromatographieanlage identifiziert, vereinigt und für 20 Minuten bei 95 °C im Wasserbad hitzebehandelt. Auftretendes Präzipitat wurde nach der Hitzebehandlung durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Die Probe wurde durch Ultrafiltration eingeengt und die RNase A-Lösung durch Zugabe von 250 mM Tris-HCl pH 6,8 auf eine Endkonzentration von 10O mg/ml eingestellt. Die Lösung wurde steril filtriert und abgefüllt. 7. Analyse der aufgereinigten RNase A
Die rekombinante, aufgereinigte RNase A wurde qualitativ durch SDS-PAGE- Analyse mit anschließender Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung, wie sie in Sambrook und Russell (2001), vide supra, beschrieben ist, analysiert.
In Abbildung 2 ist die Analyse der Protein-Expression zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultivierung bzw. Induktion gezeigt. Die Expression der rekombinanten RNase A ist bereits 1,5 Stunden nach der Induktion nachweisbar und steigt bis 18 Stunden nach der Induktion an.
Abbildung 3 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der RNase A nach den einzelnen Aufreinigungsschritten. Mit der oben beschriebenen Abfolge der Aufreinigungsschritte wird ausschließlich die RNase A aufgereinigt.
Die Konzentration der aufgereinigten RNase A wurde kolorimetrisch nach Bradford, M.M. ((1976) Anal. Biochem. 72: 248-254) bestimmt.
Zur Analyse der RNase- Aktivität wurden unterschiedliche Mengen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten RNase A mit 10 μl Hefe-Gesamt-RNA (10 μg/μl in 100 mM Natriumacetat pH 5,0) in einem Gesamtvolumen von 20 μl für 5 Minuten bei Raumtemperatur (20°C) inkubiert. Zum Vergleich wurde eine kommerziell erhältliche RNase A parallel analysiert. Die behandelten Proben wurden mit 4 μl Beladungspuffer gemischt, auf einem 1% Agarosegel in lx TAE elektrophoretisch aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zwischen den beiden RNase A-Präparationen war kein signifikanter Unterschied erkennbar (vgl. Abb. 4a). Außerdem wurde sowohl die RNase A, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden war, als auch zwei verschiedene kommerziell erhältliche RNase A-Präparationen zur Aufreinigung zweier unterschiedlicher Plasmide verwendet. Dazu wurden die entsprechenden Kulturen über Nacht in dYT-Medium mit Kanamycin (50μg/ml) bei 37°C und 180 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Von jeder Kultur wurden pro Ansatz 1,5 ml in ein Eppendorfreaktionsgefäß überfuhrt und in einer Tischzentrifuge für 3 min bei 13.000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Die Pellets wurden in je 200 μl Puffer 1 (Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland; 50 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA, lOOμg/ml RNase A) resuspendiert, mit 200 μl Puffer 2 (Fa. Qiagen; 0,2 M NaOH, 1% (w/v) SDS) gemischt und für 3-5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 200 μl Puffer 3 (Fa. Qiagen; 3 M Kaliumacetat pH 5,5) zugegeben, die Proben durch Invertieren gemischt und für 5 min in einer Tischzentrifuge bei 13.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand (500 μl) wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Von jedem Ansatz wurden 10 μl auf ein 1,2 % Agarosegel in lx TAE aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt. Dabei konnte kein Unterschied hinsichtlich der RNase A- Aktivität oder der DNA-Konformation in den Ansätzen mit der erfindungsgemäßen RNase A und den kommerziellen RNase A- Präparationen festgestellt werden (vgl. Abb. 4b).
Abbildungen
1. Karte des pHIP -Expressionsvektors
Die Komponenten des Expressionsvektors sowie die Schnittstellen der Restriktionsenzyme sind markiert.
2. Untersuchung der Kinetik der Expression der rekombinanten RNase A in den verwendeten E. co/z-Zellen durch SDS-PAGE- Analyse
1 : Prestained marker (Firma NEB Beverly, MA, USA), 2: lh vor Induktion, 3: 0,5h vor Induktion, 4: Induktion, 5: 0,5 h nach Induktion, 6: 1,5 h nach Induktion, 7: 2,5 h nach Induktion, 8 : 18h nach Induktion
SDS-PAGE-Analyse der RNase A nach den verschiedenen Aufreinigungsschritten
1: Prestained marker (Firma NEB, Beverly, MA, USA), 2: Zellernte, 3: lösliche Proteine, 4: Überstand nach Waschen der Inclusion Body-Fraktion, 5: solubilisierte Inclusion Body-Fraktion, 6: nach Rückfaltung, 7: nach Diafiltration, 8: Durchfluß bei Chromatographie (= ungebundenes Material), 9: Eluat 1, 10: Eluat 2, 11 : Eluat 3, 12: kommerzielle, bovine RNase A 4. Aktivitätstests der aufgereinigten RNase A a) Verdau von RNA
1, 15: 1 kb Größenmarker, 2-7; unterschiedliche Mengen kommerzieller, boviner RNase A (von lμg bis 0,025 μg), 8: Kontrolle ohne RNase A, 9-14: unterschiedliche Mengen rekombinanter, boviner RNase A (von 1 μg bis 0,025 μg) b) RNase- A- Aktivität während der Plasmid-Isolierung
M: 1 kb Größenmarker, 1 : ohne RNase A, 2: bovine RNase A (Fa. A), 3: bovine RNase A (Fa. B), 4: rekombinante RNase A

Claims

P A T E N T A N S P RÜ C H E
1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A in E. coli, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die an die Kodonverwendung in E. coli angepasst wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die DNA-Sequenz an die
Kodonverwendung in E. coli K12 angepasst ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz an das am häufigsten in E. coli verwendete Kodon angepasst ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA- Sequenz der in SEQ ID. No. 1 angegebenen DNA-Sequenz oder einer zu der in SEQ ID. No. 1 angegebenen DNA-Sequenz zu mindestens 90 % identischen Sequenz entspricht.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz unter Berücksichtigung der natürlichen Häufigkeit einzelner Kodons angepasst ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 5, wobei die DNA- Sequenz der in SEQ ID. No. 2 angegebenen DNA-Sequenz oder einer zu der in SEQ ID. No. 2 angegebenen DNA-Sequenz zu mindestens 90 % identischen Sequenz entspricht.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die RNase A in Fusion mit einem Signalpeptid exprimiert wird, das den Transport in den periplasmatischen Raum steuert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sic-h bei dem Signalpeptid um das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase (phoA) h-undelt.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Expression der RNase A unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sic-h bei dem Promotor um einen hitzeinduzierbaren Promotor handelt.
11. Verfahren nach Ansprach 9 oder 10, wob ei die Induktion der Genexpression am Ende der exponentiellen Wachstumsphase erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Induktion der Genexpression für einen Zeitraum von 14 bis 20 Stunden erfolgt.
13. Verfahren nach einem der vorangehendem Ansprüche, wobei die
RNase A Inclusion Bodies bildet.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden-. Ansprüche, wobei das Verfahren weiter umfasst die Gewinnung der RNase A atus den E. coli-Zellen bzw. dem Kulturmedium, ggf. unter Solubilisierung und Rüclcfaltung der RNase A.
15. Verfahren nach Ansprach 14, wobei zur Solubilisierung Guanidin- HC1 als Denaturierungsmittel verwendet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei zur Rückfaltung reduziertes und oxidiertes Glutathion verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das
Verfahren weiter umfasst eine chromatographische Aufreinigung der RNase A.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei eine Kationenaustauschchro- matographie durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ausbeute an RNase A mehr als 100 mg RNase A pro Liter Kulturmedium beträgt.
20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ausbeute an RNase A mehr als 3 mg RNase A pro Gramm Biofeuchtmasse beträgt.
21. Rekombinante RNase A, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20.
22. E. co/z'-Zellkultur, enthaltend mindestens 0,2 g RNase A pro Liter
Kulturmedium.
23. Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1.
24. Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2.
25. Nukleinsäuremolekül, umfassend die folgenden Bestandteile in 5 -3'- Reihenfolge:
- einen in E. coli aktiven Promotor,
- ggf. eine für ein Signalpeptid im Sinne von Anspruch 7 oder 8 kodierende Sequenz, - eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder No. 2.
26. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder No. 2 zur Herstellung von rekombinanter RNase A.
27. Verwendung der RNase A nach Anspruch 21 in der Reinigimg von
DNA und Proteinen.
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