DE102004013955B4

DE102004013955B4 - Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A

Info

Publication number: DE102004013955B4
Application number: DE102004013955A
Authority: DE
Inventors: Frank Dr. Gindullis; Alexander Dr. Caliebe; Bert Dr. Behnke
Original assignee: Strathmann Biotech GmbH and Co KG
Current assignee: Richter-Helm Biologics & Cokg 24796 Bov De GmbH
Priority date: 2004-03-22
Filing date: 2004-03-22
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2024-03-23
Also published as: WO2005095595A1; DE102004013955A1; US20090259035A1; EP1727897A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A in E. coli, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die entweder an das am häufigsten in E. coli verwendete Kodon angepasst ist oder unter Berücksichtigung der natürlichen Häufigkeit einzelner Kodons angepasst ist, wobei die RNase A Inclusion Bodies bildet und unter Solubilisierung und Rückfaltung aus den E. coli-Zellen bzw. dem Kulturmedium gewonnen wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A in E. coli, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die an die Kodonverwendung in E. coli angepasst wurde. Des Weiteren betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die an die Kodonverwendung in E. coli angepasst wurde sowie rekombinante Nukleinsäuremolekule, die eines dieser Nukleinsäuremolekule enthalten und die Expression der rekombinanten RNase A in E. coli erlauben.

Die RNase A ist eine Endoribonuklease, die RNA-Stränge an innenständigen Phosphodiesterbrücken hydrolysiert. Sie ist spezifisch für einzelsträngige RNA und spaltet Bindungen 3' von Pyrimidinen. Daher bilden sich nach der Spaltung mit RNase A Pyrimidin-3'-Phosphate und Oligonukleotide mit terminalen Pyrimidin-3'-Phosphaten. Die RNase A besteht aus einer durch vier Disulfidbrücken intramolekular vernetzten Kette aus 124 Aminosäuren. Die RNase A ist auch in Abwesenheit von Co-Faktoren und zweiwertigen Kationen enzymatisch aktiv. Sie wird gehemmt durch Schwermetallionen sowie durch DNA in einer kompetitiven Weise.

Die RNase A wird in verschiedenen molekularbiologischen Techniken eingesetzt. Bei der Isolierung entweder von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen oder von genomischer DNA aus eukaryontischen Zellen beispielsweise wird neben der DNA auch RNA aufgereinigt, die in großen Mengen zu einer erhöhten Viskosität der Probe und zu einer Verringerung der Ausbeute führt. Daher muss die RNA durch Zugabe von RNase A abgebaut werden, um die Qualität und Quantität der Probe zu erhöhen. Ähnliches gilt auch für die Präparation rekombinanter Proteine.

Eine weitere Anwendung findet die RNase A beim Nachweis von Einzelbasenmutationen in RNA oder DNA. In diesem Fall spaltet die RNase A an Fehlpaarungen beispielsweise in RNA-RNA-Heteroduplexen, die zwischen einer Referenz-Wildtyp-RNA und einer möglicherweise mutierten RNA gebildet wurden. Die Größe des gespaltenen Stranges kann anschließend durch Gelelektrophorese abgeschätzt werden.

Schließlich wird die RNase A auch in RNase-Protection-Assays verwendet, mit denen die Expression verschiedener Gene gleichzeitig untersucht werden kann. Diese Methode beruht auf der Hybridisierung von Proben-RNAs an komplementäre, radioaktiv markierte RNA-Sonden (Riboproben) und dem nachfolgenden Verdau von nicht hybridisierten Sequenzen mit einer oder mehreren einzelstrangspezifischen Ribonukleasen. Nach dem erfolgten Verdau werden die Ribonukleasen inaktiviert und die geschützten Fragmente der radioaktiv markierten RNA durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Autoradiographie analysiert.

Die Vielzahl der molekularbiologischen Anwendungsmöglichkeiten für die RNase A erfordert die Isolierung großer Mengen des Enzyms in hoher Reinheit. Der klassische Weg zur Herstellung der RNase A umfasst die Isolierung aus dem Rinderpankreas. Allerdings führte die BSE-Problematik der vergangenen Jahre dazu, dass tierische Rohstoffe, insbesondere solche, die aus Rindern stammen, aus Gründen der biologischen Sicherheit von den Behörden in der pharmazeutischen Produktion nicht mehr akzeptiert werden. Deshalb wurde die RNA in den vergangenen Jahren in vielen biotechnologisch-pharmazeutischen Verfahren durch alternative, meist sehr kostspielige Verfahren wie die Chromatographie abgetrennt.

Daher besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das die Herstellung von großen Mengen an RNase A ermöglicht, ohne dass dazu tierisches Material verwendet werden muss. Dies kann vor allem durch die rekombinante Herstellung der RNase A erreicht werden.

Die rekombinante Herstellung der RNase A wird allerdings durch vier Faktoren verkompliziert: (1) die RNase A ist instabil, wenn sie alleine in E. coli exprimiert wird; (2) um die RNase A zu einem aktiven Protein zu rekonstituieren, müssen vier Disulfidbrücken korrekt gebildet werden; (3) die Expression der RNase A innerhalb einer Zelle ist möglicherweise zytotoxisch und (4) die RNase A baut möglicherweise ihr eigenes Transkript ab, wodurch die Expressionsleistung entsprechend sinkt.

In der Vergangenheit wurden verschiedene Möglichkeiten zur rekombinanten Expression der RNase A erprobt, die diese Schwierigkeiten überwinden sollten, die aber alle zu einer eher geringen RNase A-Ausbeute führten.

In einem Ansatz wurde die RNase A unter der Kontrolle eines hitzeinduzierbaren Promotors exprimiert. Dies führte zur Bildung von Inclusion Bodies und zu einer Ausbeute von etwa 2 mg/l(McGeehan und Brenner (1989) FEBS Letters 247 (1) 55-56).

Die Expression eines Fusionsproteins von RNase A mit einem Gen-10-Protein aus dem Bakteriophagen T7 unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors führte ebenfalls zur Bildung von Inclusion Bodies. Nach enzymatischer Spaltung des Fusionsproteins mit der Protease Faktor Xa und Aufreinigung wurde eine Ausbeute von 4-8 mg/l Protein erreicht (Laity et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:615-619).

Auch ein Fusionsprotein aus β-Galaktosidase und RNase A wurde unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren β-Galaktosidase-Promotors in E. coli exprimiert. Mit dieser Strategie wurde nach der Aufreinigung eine Ausbeute von 0,2 mg/l erzielt (Nambiar et al, (1987) Eur. J. Biochem. 163:67-71).

Ebenso wurde die RNase A zusammen mit einem Signalpeptid, das die effiziente Translokation der RNase in das Periplasma bewirkt, unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors exprimiert. Die RNase A wurde aus dem Periplasma durch Sphäroplast/osmotischen Schock freigesetzt und aufgereinigt. Mit dieser Strategie wurde eine Ausbeute von 0,1 mg/l erzielt (Tarragona-Fiol et al(1992) Gene 118:239-245).

Schließlich wurde in E. coli-Zellen auch eine Kombination aus Hitze-induzierbarem Promotor und einem Signalpeptid, das den Transport des Proteins in das Periplasma steuert, getestet. Auch hier wurden die periplasmatischen Proteine durch Sphäroplast/osmotischen Schock freigesetzt und aufgereinigt. Mit dieser Methode konnte eine Ausbeute von 45-50 mg/l erreicht werden (Okorokov et al. (1995) Protein Expression and Purification 6:472-480).

Auch andere Wirtszellen als E. coli, wie z.B. Bacillus subtilis und Pichia pastoris, wurden zur Expression der RNase A verwendet. Mit diesen Wirtszellen konnten ebenfalls nur Ausbeuten in der Größenordnung von 1-5 mg/l erreicht werden (Vasantha und Filpula (1989) Gene 76:53-60; Chatani et al(2000) Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(11):2437-2444).

Somit besteht trotz der mehrfachen Versuche zur Optimierung der rekombinanten RNase A-Expression ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das die Herstellung von rekombinanter RNase A in E. coli mit einer höheren Ausbeute als im Stand der Technik ermöglicht.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem rekombinante RNase A in großen Mengen in E. coli-Zellen hergestellt werden kann.

Diese und weitere Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Merkmale des Hauptanspruchs gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen definiert.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter RNase A in E. coli bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die an die Kodonverwendung in E. coli angepasst wurde.

Der genetische Code ist redundant, da er 61 Kodons verwendet, um 20 Aminosäuren zu spezifizieren. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminosäuren von mehreren Tripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosäure spezifizieren, werden in einem bestimmten Organismus jedoch nicht mit gleicher Häufigkeit verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die häufig verwendet werden und Kodons, die seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonverwendung werden zurück geführt auf selektive evolutionäre Drücke und vor allem die Effizienz der Translation. Ein Grund für die geringere Translationseffizienz von selten auftretenden Kodons könnte darin liegen, dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschöpft werden und damit nicht mehr zur Proteinsynthese zur Verfügung stehen.

Außerdem bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher läuft beispielsweise die Expression einer rekombinanten DNA, die aus einer Säugerzelle stammt, in E. coli-Zellen häufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten verwendeter Kodons gegen häufig verwendete Kodons in manchen Fällen die Expression erhöhen.

Für viele Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer größeren Zahl von Genen bekannt ist, gibt es Tabellen, denen man die Häufigkeit der Verwendung bestimmter Kodons in dem jeweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen sich Proteinsequenzen mit relativ großer Genauigkeit in eine DNA-Sequenz zurückübersetzen, die die im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodons für die verschiedenen Aminosäuren des Proteins enthält. Tabellen zur Kodonverwendung können u.a. unter den folgenden Internet-Adressen aufgefunden werden: http://www.kazusa.or.jp/Kodon/E.html; http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/Apps/cai.html; http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/Apps/chips.html; oder http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html. Auch zur reversen Translation der Proteinsequenz der RNase A in eine degenerierte DNA-Sequenz sind Programme erhältlich, wie etwa unter http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html; oder http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software.EMBOSS/Apps/backtranseg.html.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wurde die zur Expression der rekombinanten RNase A verwendete DNA-Sequenz an die Kodonverwendung des E. coli-Stamms K12 angepasst.

Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendung in einem bestimmten Organismus kann unter Zuhilfenahme verschiedener Kriterien erfolgen. Zum einen kann für eine bestimmte Aminosäure immer das am häufigsten im ausgewählten Organismus vorkommende Kodon verwendet werden, zum anderen kann aber auch die natürliche Frequenz der verschiedenen Kodons berücksichtigt werden, so dass alle Kodons für eine bestimmte Aminosäure entsprechend ihrer natürlichen Häufigkeit in die optimierte Sequenz eingebaut werden. Dabei kann die Auswahl, an welcher Position welches Basen-Triplett verwendet wird, zufällig stattfinden. Beide Strategien zur Optimierung der DNA-Sequenz im Hinblick auf die Kodonverwendung haben sich für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen als geeignet erwiesen.

Die für die bovine RNase A kodierende DNA-Sequenz ist an mindestens 30 Positionen, bevorzugt an mindestens 40 Positionen, besonders bevorzugt an mindestens 50 Positionen und am meisten bevorzugt an mindestens 60 Positionen in Bezug auf die Kodonverwendung in E. coli optimiert.

Am meisten bevorzugt handelt es sich bei den optimierten DNA-Sequenzen um die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2 dargestellten DNA-Sequenzen.

Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die kodonoptimierten DNA-Sequenzen eine effizientere Translation ermöglichen und die daraus gebildeten mRNAs möglicherweise eine höhere Halbwertszeit in der Zelle besitzen und daher häufiger für die Translation zur Verfügung stehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die RNase A in Fusion mit einem Signalpeptid exprimiert, das den Transport in den periplasmatischen Raum steuert. Die Lokalisation im periplasmatischen Raum verhindert mögliche zytotoxische Effekte, die durch die Expression der RNase A auftreten könnten. Beispiele für solche Signalpeptide schließen ein stII und phoA (Denefle et al. (1989) Gene 85: 499-510), ompF und LamB (Hoffman und Wright (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5107-5111), pelB (Lei et al. (1987) J. Bacteriol. 169 (9): 4379-4383), OmpT (Johnson et al. (1996) Protein Expression Purif. 7:104-113), Betalactamase (Kadonaga et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 2149-2154), Enterotoxine LT-A, LT-B (Morioka-Fujimoto et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 1728-1732) und Protein A aus S. aureus (Abrahmsen et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 7487-7500).

Auch verschiedene nicht-natürliche, synthetische Signalsequenzen, die die Sekretion bestimmter Proteine ermöglichen, sind dem Fachmann wohl bekannt.

Bevorzugt wird das phoA-Signalpeptid verwendet.

Die Expression der RNase A steht bevorzugt unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Besonders bevorzugt wird ein hitzeinduzierbarer Promotor verwendet, bei dem die Expression des unter seiner Kontrolle stehenden Gens durch Erhöhung der Kultivierungstemperatur auf 42°C induziert wird.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend die folgenden Bestandteile in 5'-3'-Reihenfolge:

– einen in E. coli aktiven Promotor,
– ggf. eine für ein Signalpeptid kodierende Sequenz,
– eine an die Kodonverwendung in E. coli angepasste DNA-Sequenz, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um einen induzierbaren Promotor, besonders bevorzugt um einen hitzeinduzierbaren Promotor. Bei dem Signalpeptid handelt es sich bevorzugt um eine Signalsequenz, die den Transport des Proteins in den periplasmatischen Raum steuert, und besonders bevorzugt um das phoA-Signalpeptid.

Die Methoden zur Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls, das die oben aufgeführten Komponenten umfasst, gehören zu den molekularbiologischen Standardmethoden und können der Literatur wie z.B. Sambrook und Russell (2001) Molecular Cloning – A laboratory manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, entnommen werden.

Die Induktion des Promotors findet bevorzugt Mitte bis Ende der exponentiellen Wachstumsphase statt. Zu diesem Zeitpunkt haben die Zellen eine Biofeuchtmasse von etwa 35 bis 50 g/l Kulturmedium erreicht. Die Induktion der Proteinexpression erfolgt für mindestens 14, in der Regel für 14 bis 20 Stunden, bevorzugt für mindestens 16, in der Regel für 16 bis 18 Stunden, und am meisten bevorzugt für etwa 17 Stunden.

Als Wirtszellen für die Expression der rekombinanten RNase A eignen sich verschiedene E. coli-Stämme, u.a. BL21, BNN93, MM294, ATCC 23226 und ATCC 23851.

Dem Fachmann sind Methoden bekannt, mit denen er die DNA für die rekombinante Expression der RNase A in die Wirtszellen einbringen kann. Zu diesen Methoden gehören sowohl chemische Methoden als auch physikalische Methoden wie die Elektroporation. Ebenso sind dem Fachmann geeignete Kulturmedien und Kulturbedingungen für die E. coli-Zellen bekannt. Diese können auch der Literatur, wie z.B. Sambrook und Russell (2001) Molecular Cloning – A laboratory manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, entnommen werden.

Die E. coli-Zellkultur in einem geeigneten Kulturmedium enthält bei der Ernte nach der Kultivierung und ggf. Induktion mindestens 0,2 g RNase A pro Liter Kulturmedium, bevorzugt mindestens 0,5 g/l, besonders bevorzugt mindestens 1 g/l und am meisten bevorzugt etwa 1,2 g RNase A pro Liter Kulturmedium.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Vwerfahren bildet die RNase A in den Wirtszellen Inclusion Bodies. Diese Inclusion Bodies stellen unlösliche intrazelluläre Aggregate des exprimierten Proteins dar. Sie können durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit isoliert werden und bestehen üblicherweise aus fast reinen Ablagerungen von denaturierten Formen des rekombinant exprimierten Proteins. Im Falle der RNase A trägt die Bildung der Inclusion Bodies möglicherweise zu der hohen Ausbeute bei, da das Produkt in einer inaktiven Form vorliegt und somit keine zytotoxischen Wirkungen zeigen kann.

Um die Inclusion Bodies freizusetzen, muss die Wirtszelle lysiert werden. Die Lyse der Zelle kann erreicht werden z.B. durch mechanischen Scherstress, enzymatischen Verdau, z.B. mit Lysozym, Ultraschallbehandlung, Homogenisierung, Glaskugelvortexen, Behandlung mit Detergenzien oder organischen Lösungsmitteln, durch Einfrieren und Auftauen oder durch Behandlung mit einem Denaturierungsmittel (Bollag et al. (1996) Protein Methods, 415 Seiten, Wiley-Liss, NY, NY). Gegebenenfalls können die Zellen in Gegenwart eines Denaturierungsmittels oder eines Disulfid-reduzierenden Mittels lysiert werden. Unlösliches oder aggregiertes Material kann von löslichen Proteinen durch verschiedene Verfahren, z.B. Zentrifugation, Filtration (einschließlich Ultrafiltration) oder Präzipitation abgetrennt werden.

Im nächsten Schritt muss das unlösliche bzw. aggregierte Material löslich oder monomerisch gemacht werden, indem es mit einem Denaturierungsmittel behandelt wird. Geeignete Denaturierungsmittel schließen ein: Harnstoff, Guanidin, Arginin, Natriumthiocyanat, pH-Extreme (verdünnte Säuren oder Basen), Detergenzien (z.B. SDS, Sarkosyl), Salze (Chloride, Nitrate, Thiocyanate, Trichloroacetate), chemische Derivatisierung (Sulfitolyse, Reaktion mit Citraconanhydrid), Lösungsmittel (2-Amino-2-methyl-1-propanol oder andere Alkohole, DMSO, DMF) oder starke Anionenaustauschresine wie etwa Q-Sepharose. Geeignete Konzentrationen von Harnstoff sind 1 bis 8 M, bevorzugt 5 bis 8 M. Geeignete Konzen trationen von Guanidin sind 1 bis 8 M, bevorzugt 4 bis 8 M. Besonders bevorzugt wird Guanidin in einer Konzentration von 5 M verwendet.

Besonders bevorzugt enthält der Solubilisierungspuffer zusätzlich ein Redoxgemisch aus einem Oxidationsmittel und einem Reduktionsmittel, um die Reduktion intra- und intermolekularer Disulfidbrücken zu fördern. Beispiele für geeignete Redoxgemische schließen ein Cystein/Sauerstoff, Cystein/Cystin, Cystein/Cystamin, Cysteamin/Cystamin und reduziertes Glutathion/oxidiertes Glutathion. Am meisten bevorzugt enthält der Solubilisierungspuffer reduziertes und oxidiertes Glutathion. Dabei liegt das reduzierte Glutathion in einer Konzentration von 1 bis 10 mM, bevorzugt 2 bis 5 mM, im Solubilisierungspuffer vor. Die Konzentration des oxidierten Glutathions beträgt 1/10 bis 1/1, bevorzugt 1/10, der Konzentration des reduzierten Glutathions.

Der pH-Wert des Solubilisierungsgemisches liegt bevorzugt zwischen pH 6 und pH 10, besonders bevorzugt liegt er zwischen 7,5 und 9,5, am meisten bevorzugt bei etwa pH 9.

Nach dem Solubilisieren der Inclusion Bodies muss das Protein in seine aktive Form zurückgefaltet werden. Dazu muss das Protein seine native Konformation annehmen und seine nativen Disulfidbrücken ausbilden. Die Rückfaltung wird erreicht, indem die Konzentration des Denaturierungsmittels reduziert wird, so dass das Protein in seine lösliche, biologisch aktive Form renaturieren kann. Die Konzentration des Denaturierungsmittels kann reduziert werden durch Dialyse, Verdünnung, Gelfiltration, Präzipitation des Proteins oder durch Immobilisierung an einem Resin, gefolgt von Waschen mit einem Puffer. Bevorzugt wird die Konzentration des Denaturierungsmittels durch Verdünnung in einem nativen Puffer reduziert.

Um die nativen Disulfidbrücken des Proteins zurückzubilden, wird ein Oxidationsmittel oder ein Redoxgemisch aus einem Oxidationsmittel und einem Reduktionsmittel zugegeben, die die Disulfidaustauschreaktion katalysieren. Geeignete Oxidationsmittel schließen ein Sauerstoff, Cystin, oxidiertes Glutathion, Cystamin und Dithioglykolsäure. Beispiele für geeignete Redoxgemische schließen ein Cystein/Sauerstoff, Cystein/Cystin, Cystein/Cystamin, Cysteamin/Cystamin, reduziertes Glutathion/oxidiertes Glutathion, Natriumsulfit/Natriumtetrathionat usw. Gegebenenfalls kann dem Rückfaltungsgemisch ein Reduktionsmittel wie DTT oder 2-Mercaptoethanol zugegeben werden, um den Disulfidaustausch zu fördern. Gegebenenfalls kann ein Metallion wie Kupfer dem Rückfaltungsgemisch zugegeben werden, um die Oxidation des Proteins zu fördern. Geeignete Konzentrationen von Metallionen im Rückfaltungsgemisch sind 1 μM bis 1 mM.

Bevorzugt enthält das Rückfaltungsgemisch reduziertes und oxidiertes Glutathion. Dabei liegt das reduzierte Glutathion in einer Konzentration von 1 bis 10 mM, bevorzugt 2 bis 5 mM, im Rückfaltungsgemisch vor. Die Konzentration des oxidierten Glutathions beträgt 1/10 bis 1/1, bevorzugt 1/10, der Konzentration des reduzierten Glutathions.

Bevorzugt beträgt der pH des Rückfaltungsgemisches zwischen pH 6 und pH 10, besonders bevorzugt liegt der pH zwischen 7,5 und 9,5 und am meisten bevorzugt liegt der pH des Rückfaltungsgemisches bei etwa pH 9.

Nach der Solubilisierung und Rückfaltung der RNase A wird diese bevorzugt durch chromatographische Schritte weiter aufgereinigt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Chromatographie um eine Kationaustauschchromatographie, bei der die RNase A bei einem bestimmten pH des Puffers, der mindestens 0,5 bis 1,5 pH-Einheiten unterhalb des pI-Wertes der RNase A von 9,45 liegen sollte, durch ihre positive Gesamtladung an die Matrix der Kationaustauschsäule bindet, während die meisten kontaminierenden Proteine nicht binden und durch Waschen entfernt werden können.

Geeignete Kationaustauschmatrizes schließen ein Carboxymethyl (CM)-Cellulose, AG 50 W, Bio-Rex 70, Carboxymethyl (CM)-Sephadex, Sulfopropyl (SP)-Sephadex, Carboxymethyl (CM)-Sepharose CL-6B und Sulfonat (S)-Sepharose.

Geeignete Matrizes und Protokolle zur Durchführung der Kationenaustauschchromatographie kann der Fachmann den Produktinformationen von Anbietern wie Amersham Biosciences (http://www.amershambiosciences.com) oder Bio-Rad (http://www.bio-rad.com) entnehmen.

Geeignete Puffer für die Kationenaustauschchromatographie schließen ein Maleat-, Malonat-, Citrat-, Lactat-, Acetat-, Phosphat-, HEPES- und Bicin-Puffer. Die Konzentration des Puffers liegt bevorzugt zwischen 20 mM und 50 mM. Der pH des Puffers sollte für die Aufreinigung der RNase A möglichst nicht höher als 8,0, bevorzugt nicht höher als 7,0 sein.

Besonders bevorzugt wird für die Kationenaustauschchromatographie 20 mM Natriumacetat pH 5,0 oder 50 mM Tris-HCl pH 6,8 verwendet.

Die RNase A kann nach dem Waschen durch eine Veränderung, im Falle der Kationenaustauschchromatographie eine Erhöhung, des pH-Wertes oder eine Erhöhung der Ionenstärke von der Säule eluiert werden.

Bevorzugt wird die Elution durch Erhöhung der Ionenstärke bewirkt. Wenn 20 mM Natriumacetat pH 5,0 als Puffer verwendet wird, wird zur Elution ein Gemisch von 20 mM Natriumacetat pH 5,0 und 350 mM NaCl eingesetzt. Wenn 50 mM Tris-HCl pH 6,8 als Puffer verwendet wird, wird zur Elution Tris-HCl pH 6,8 in einer Konzentration von 250 mM eingesetzt.

Weitere geeignete Bedingungen für die Kationenaustauschchromatographie können der einschlägigen Literatur, wie etwa dem Handbuch "Ion Exchange Chromatography-Principles and Methods" von Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland, entnommen werden.

Die RNase A kann anschließend durch zusätzliche chromatographische Schritte sowie Filtration, Präzipitation und Diafiltration weiter aufgereinigt werden.

Nach der Aufreinigung müssen eventuell mit der RNase A aufgereinigte DNasen inaktiviert werden, indem die produkthaltigen Chromatographiefraktionen bei 95 °C im Wasserbad hitzebehandelt werden. Bevorzugt erfolgt die Hitzebehandlung für 20 bis 35 Minuten, besonders bevorzugt für etwa 20 Minuten. Alternativ kann die Hitzebehandlung auch bei 80 °C über einen entsprechend verlängerten Zeitraum erfolgen.

Nach der Aufreinigung kann die RNase A hinsichtlich der Menge und ihrer Aktivität analysiert werden. Die Analyse der Menge der aufgereinigten RNase A kann zum einen qualitativ über eine SDS-PAGE-Analyse und anschließende Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung erfolgen. Zur Quantifizierung der RNase A kann ein kolorimetrischer Assay wie etwa der Bradford-Assay oder eine chemische Reaktion wie die Lowry- oder die Biuret-Reaktion verwendet werden. Als Standard für die Analysen kann eine nicht-rekombinante, kommerziell erhältliche bovine RNase A mit einer bekannten Kombination verwendet werden. Außerdem kann die Konzentration der Proteinlösung auch über die Extinktion bei 278 nm unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten der RNase A berechnet werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nach der Aufreinigung eine Ausbeute an RNase A von mehr als 100 mg/l Kulturmedium, bevorzugt von mehr als 200 mg/l Kulturmedium, besonders bevorzugt von mehr als 250 mg/l Kulturmedium und am meisten bevorzugt von etwa 300 mg/l Kulturmedium erreicht.

Die Aktivität der RNase A kann durch Verdau von definierten RNA-Molekülen bestimmt werden. Die RNase A-Aktivität wird in Kunitz-Einheiten wiedergegeben. Eine Kunitz-Einheit verursacht eine Extinktionsabnahme bei 300 nm von 100 % in einer Minute bei einer Temperatur von 25 °C und einem pH von 5,0, wenn Gesamt-RNA aus Hefe als Substrat verwendet wird. Zum Vergleich der Aktivität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigten RNase A mit kommerziell erhältlichen, nicht rekombinanten RNase A-Präparationen können die kommerziell erhältlichen RNase A-Präparationen als Standard verwendet werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigte RNase A weist eine Aktivität von mindestens 40 Kunitz-Einheiten und bevorzugt von mindestens 50 Kunitz-Einheiten auf. Diese Aktivität ist vergleichbar mit den von den Herstellern angegebenen Werten für nicht-rekombinante RNase A.

Alternativ kann der Aktivitätstest auch mit anderen RNAs bei anderen Temperaturen und über andere Zeiträume hinweg durchgeführt werden. Außerdem ist es natürlich möglich, die Aktivität der RNase A im Rahmen der gewünschten Endanwendung zu testen, z.B. in Form einer Plasmidisolierung.

Die aufgereinigte RNase A kann entweder als Lyophilisat oder in flüssiger Form aufbewahrt werden. Als Puffer für die flüssige Aufbewahrung eignen sich z.B. Tris-HCl bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,4, ein Phosphatpuffer oder Natriumacetat. Zusätzlich können die Puffer weitere Bestandteile wie Glycerin, Triton X-100, Natriumchlorid oder EDTA enthalten. Wenn Tris-HCl als Puffer verwendet wird, wird dieses in einer Konzentration von 10 mM bis 250 mM eingesetzt. Bevorzugt wird es in einer Konzentration von 250 mM verwendet. Die RNase A liegt in der Lösung in einer Konzentration von 1 bis 100 mg/ml, bevorzugt 100mg/ml vor.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte RNase A eignet sich für alle Anwendungen, in denen üblicherweise RNase A eingesetzt wird, also z.B. für die Isolierung von Plasmid- oder genomischer DNA und rekombinanten Proteinen, den Nachweis von Einzelbasenmutationen oder den Ribonuclease Protection Assay.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele dargestellt, die nicht als Einschränkung zu verstehen sind.

Beispiele:
1. Optimierung der für die RNase A kodierenden DNA
Zur Optimierung der Kodonverwendung wurde zunächst die Proteinsequenz der reifen RNase A, die unter der Accessionnumber 580747 zu finden ist, revers translatiert. Dadurch wurde eine degenerierte DNA-Sequenz erhalten, die anschließend unter Zuhilfenahme öffentlich zugänglicher Kodonverwendungstabellen (http://www.kazusa.or.jp/Kodon/E.html) für E. coli K12 Zellen optimiert wurde. Die DNA-Sequenz für die RNase A wurde an die Kodonverwendung im E. coli-Stamm K12 angepasst, indem immer das am häufigsten in diesen Zellen verwendete zur Auswahl stehende Kodon für eine bestimmte Aminosäure verwendet wurde. Bei der Optimierung wurde berücksichtigt, dass keine zusätzlichen NdeI- oder SalI-Restriktionsstellen generiert wurden, da diese die spätere Klonierung in den Expressionsvektor erschwert hätten. Die so erhaltene cDNA-Sequenz, die als mRAopt bezeichnet wurde und in SEQ ID No. 1 dargestellt ist, wurde bei der Firma Geneart (Regensburg, Deutschland) synthetisiert.
Das phoA-Signalpeptid stammt von der alkalischen Phosphatase aus Lysobacter enrymogenes (Accession No. Q05205). Die Sequenz des mutmaßlichen Signalpeptids (29 Aminosäuren) wurde mit einem Applet der Firma Entelechon (http://www.entelechon.com/) auf deren Homepage revers translatiert unter Berücksichtigung der Kodonverwendung in E. coli K12. Abgeleitet von dieser revers translatierten Nukleinsäuresequenz wurden zwei einzelsträngige DNA-Oligonukleotide (phoA for, phoA rev) hergestellt und über rekombinante PCR mit der kodierenden cDNA mRAopt verbunden.
2. Klonierung der optimierten DNA in einen Expressionsvektor und Transformation der E. coli-Zellen
In einer so genannten primären PCR-Reaktion wurden die beiden für das Signalpeptid kodierenden Oligonukleotide phoA for (SEQ ID No. 3) und phoA rev (SEQ ID No. 4) zu einem Doppelstrang hybridisiert und unter den folgenden Bedingungen amplifiziert:
Reaktionsansatz:

10 μl phoA for (10 pmol/μl)
10 μl phoA rev (10 pmol/μl)
10 μl 10 × PCR-Puffer mit MgCl₂ (15 mmol/l) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Roche, Mannheim, Deutschland)
4 μl dNTP-Mix (je 2 mmol/l) (Fa. Gibco Life Technologies, Eggenstein, Deutschland)
1 μl Polymerase (3,5 Einheiten/μl) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Roche, Mannheim, Deutschland)
65 μl H₂O

PCR-Bedingungen:
Das Reaktionsprodukt der primären PCR-Reaktion wurde zusammen mit dem Plasmid, das die optimierte DNA-Sequenz enthält (pmRAopt, geliefert von der Firma Geneart), und einem Primer, der die Amplifikation vom 3'-Ende von der RNase A-opt cDNA ermöglicht (5' GTC GAC TAT TAG ACG CTC GCA TC 3'), in einer so genannten rekombinanten PCR-Reaktion mit den folgenden Bedingungen eingesetzt:
Reaktionsansatz:

10 μl pmRAopt (10 ng/μl)
10 μl RNase opt 3' Primer für Amplifikation (10 pmol/μl)
10 μl primäres PCR-Produkt
10 μl 10 × PCR-Puffer mit MgCl₂ (15 mM) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Roche, Mannheim, Deutschland)
8 μl dNTP-Mix (je 2 mmol/l) (Fa. Gibco Life Technologies, Eggenstein, Deutschland)
1 μl Polymerase (3,5 Einheiten/μl) (Expand High Fidelity PCR System, Fa. Roche, Mannheim, Deutschland)

PCR-Bedingungen:
Im PCR-Produkt, das durch diese Reaktion erhalten wurde, lag die DNA-Sequenz für das Signalpeptid am 5'-Ende der RNase A-opt cDNA.
Das PCR-Produkt wurde über ein Agarosegel aufgereinigt und in den Vektor pCR2.1-TOPO (Firma Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) ligiert. Die korrekte Sequenz wurde mittels Sequenzierung verifiziert. Das klonierte PCR-Produkt wurde anschließend über einen NdeI/SalI-Doppelverdau aus dem Vektor herausgeschnitten und über ein Agarosegel gereinigt. Parallel hierzu wurde der Vektor pHIP-pelB-RNase-opt mit NdeI/SalI verdaut, wodurch der linearisierte Vektor pHIP mit NdeI- und SalI-Enden erhalten wurde. Dieser Vektor wurde ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt. Das NdeI/SalI-verdaute phoA-RNase A-opt-Fragment wurde in den linearisierten Vektor ligiert und in E. coli TOP 1 OF'-Zellen transformiert und amplifiziert. Aus diesem Stamm wurde anschließend die Plasmid-DNA isoliert und für die Kalziumchlorid-vermittelte Transformation des E. coli-Stammes ATCC 23226 (vgl. Sambrook und Russell, vide supra) eingesetzt.
Die hier verwendeten Methoden zur Klonierung der optimierten cDNA sind dem Fachmann wohl bekannt und können zum Beispiel in Sambrook und Russell (2001), vide supra, nachgelesen werden.
Die Karte des Expressionsvektors pHIP ist in 1 dargestellt, die Sequenz des Expressionsvektors ist in SEQ ID No. 5 angegeben. Dieser Vektor enthält bereits die hitzeinduzierbare Promotorsequenz und eine multiple Klonierungsstelle, in die über die Restriktionsschnittstellen der Enzyme NdeI und SalI entsprechende cDNAs kloniert werden können.
3. Fermentation und Induktion der Bakterien
Die Bakterien wurden in Komplettmedium (Soja-Pepton (27 g/l), Hefe-Extrakt (14 g/l), NaCl (5 g/l), K₂HPO₄ (6 g/l), KH₂PO₄ (3 g/l), MgSO₄ (0,5 g/l), Glycerin (30 g/l)) bei 30°C kultiviert. In bestimmten Zeitintervallen wurde 1 ml Kulturbrühe in ein zuvor gewogenes Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und die Zellen durch Zentrifugation bei 13000 × g für 3 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt und das Gefäß erneut gewogen. Aus der Differenz zwischen Endgewicht [mg] und Anfangsgewicht [mg] lässt sich die Biofeuchtmasse [mg/ml bzw. g/l] bestimmen. Die Bestimmung wurde als Doppelbestimmung durchgeführt. Nach Erreichen einer Biofeuchtmasse von 35 bis 50 g/l wurde die Kultivierungstemperatur auf 42°C erhöht, wodurch die Expression des rekombinanten Proteins induziert wurde. Die Induktionsphase dauerte 17 Stunden.
4. Ernte der Bakterien und Gewinnung der nativen RNase A aus den Inclusion Bodies
Die Zellen wurden nach der Induktionsphase durch Zentrifugation geerntet und in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 resuspendiert, der in einer Menge von 3,75 ml/g Biofeuchtmasse eingesetzt wurde. Anschließend wurden die Zellen durch zwei Passagen im Hochdruckhomogenisator (Fa. Niro Soavi, Lübeck, Deutschland) bei einem Druck von 800 ± 50 bar physikalisch aufgeschlossen. Die Inclusion Body-Fraktion wurde durch Zentrifugation (11000 × g für 30 Minuten bei 4°C) geerntet, in 20 mmol/l Natriumphosphatpuffer pH 7,4 resuspendiert, wobei der Puffer in einer Menge von 5 g/l Inclusion Bodies eingesetzt wurde, und erneut durch Zentrifugation pelletiert.
Die Inclusion Body-Fraktion wurde in einem denaturierenden Redoxpuffer (5 M Guanidin-HCl, 50 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, 50 mmol/l NaCl, 2 mmol/l Glutathion (reduziert), 0,2 mmol/l Glutathion (oxidiert), pH 9, eingestellt mit NaOH bzw. HCl) solubilisiert.
Unlösliche Bestandteile der Inclusion Body-Fraktion wurden durch Zentrifugation bzw. Filtration aus dem Ansatz entfernt. Anschließend wurde die optische Dichte der geklärten Lösung bei 280 nm (OD_280mn) bestimmt.
Die Rückfaltung der denaturierten Proteine erfolgte durch Verdünnung in einem nativen Verdünnungspuffer (50 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, 50 mmol/l NaCl, 2 mmol/l Glutathion (reduziert), 0,2 mmol/l Glutathion (oxidiert), mit NaOH bzw. HCl auf pH 9 eingestellt). Das Volumen des Verdünnungspuffers wurde so gewählt, dass sich nach Zugabe der solubilisierten Inclusion Body-Fraktion eine OD_280mn von 5 in dem Rückfaltungsansatz ergab. Dieser Ansatz wurde für mindestens 15 Stunden leicht gerührt (150 bis 180 Umdrehungen pro Minute).
5. Ionenaustauschchromatographie
Der Rückfaltungsansatz wurde durch Filtration geklärt und anschließend durch Ultrafiltration eingeengt und umgepuffert, so dass sich der Ansatz in einem für die nachfolgende Chromatographie geeigneten Puffer (50 mmol/l Tris-HCl pH 6,8) befand. Der aus der Ultrafiltration erhaltene Ansatz wurde über einen Kationenaustauscher (SP-Sepharose, Firma Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) chromatographisch aufgereinigt. Unspezifische Proteine wurden durch Waschen mit etwa drei Säulenvolumen 100 mmol/l Tris-HCl pH 6,8 entfernt. Die Elution erfolgte durch Erhöhung der Salzkonzentration auf 250 mmol/l Tris-HCl pH 6,8.
6. Hitzeinaktivierung und Abfüllung der RNase A
Die produkthaltigen Chromatographie-Fraktionen wurden durch Messung der Extinktion bei 280 nm in der Chromatographieanlage identifiziert, vereinigt und für 20 Minuten bei 95°C im Wasserbad hitzebehandelt. Auftretendes Präzipitat wurde nach der Hitzebehandlung durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Die Probe wurde durch Ultrafiltration eingeengt und die RNase A-Lösung auf eine Endkonzentration von 100 mg/ml durch Zugabe von 250 mmol/l Tris-HCl pH 6,8 eingestellt. Die Lösung wurde steril filtriert und abgefüllt.
7. Analyse der aufgereinigten RNase A
Die rekombinante, aufgereinigte RNase A wurde qualitativ durch SDS-PAGE-Analyse mit anschließender Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung, wie sie in Sambrook und Russell (2001), vide supra, beschrieben ist, analysiert.
In 2 ist die Analyse der RNase A-Expression zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultivierung bzw. Induktion gezeigt. Die Expression ist bereits 1,5 Stunden nach der Induktion nachweisbar und steigt bis 18 Stunden nach der Induktion an.
3 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der RNase A nach den verschiedenen Aufreinigungsschritten. Mit der oben beschriebenen Abfolge der Aufreinigungsschritte wird ausschließlich die RNase A aufgereinigt.
Die Konzentration der aufgereinigten RNase A wurde kolorimetrisch nach Bradford, M.M. (1976), Anal. Biochem. 72: 248, bestimmt.
Zur Analyse der RNase-Aktivität wurden unterschiedliche Mengen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten RNase A mit 10 μl Hefe-Gesamt-RNA (10 μg/μl in 100 mmol/l Natriumacetat pH 5,0) in einem Gesamtvolumen von 20 μl für 5 Minuten bei Raumtemperatur (20°C) inkubiert. Zum Vergleich wurde eine kommerziell erhältliche RNase A parallel analysiert. Die behandelten Proben wurden mit 4 μl Beladungspuffer gemischt, auf einem 1 % Agarosegel in 1 × TAE elektrophoretisch aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zwischen den beiden RNase A-Präparationen war kein signifikanter Unterschied erkennbar (vgl. 4a).
Außerdem wurde sowohl die RNase A, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden war, als auch zwei verschiedene kommerziell erhältliche RNase A-Präparationen zur Aufreinigung zweier unterschiedlicher Plasmide verwendet. Dazu wurden die entsprechenden Kulturen über Nacht in dYT-Medium mit Kanamycin (50μg/ml) bei 37°C und 180 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Von jeder Kultur wurden pro Ansatz 1,5 ml in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt und in einer Tischzentrifuge für 3 min bei 13.000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Die Pellets wurden in je 200 μl Puffer 1 (Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland; 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8), 10 mmol/l EDTA, 100 μg/ml RNase A) resuspendiert, mit 200 μl Puffer 2 (Fa. Qiagen; 0,2 mmol/l NaOH, 1 % (w/v) SDS) gemischt und für 3-5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 200 μl Puffer 3 (Fa. Qiagen; 3 mmol/l aliumacetat pH 5,5) zugegeben, die Proben durch Invertieren gemischt und für 5 min in einer Tischzentrifuge bei 13.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand (500 μl) wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Von jedem Ansatz wurden 10 μl auf ein 1,2 % Agarosegel in 1 × TAE aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt. Dabei konnte kein Unterschied hinsichtlich der RNase A-Aktivität oder der DNA-Konformation in den Ansätzen mit der erfindungsgemäßen RNase A und den kommerziellen RNase A-Präparationen festgestellt werden (vgl. 4b).
Abbildungen
1. Karte des pHIP-Expressionsvektors
Die Komponenten des Expressionsvektors sowie die Schnittstellen der Restriktionsenzyme sind markiert.
2. Untersuchung der Kinetik der Expression der rekombinanten RNase A in den verwendeten E. coli-Zellen durch SDS-PAGE-Analyse
1: Prestained marker (Firma NEB Beverly, MA, USA), 2: 1h vor Induktion, 3: 0,5h vor Induktion, 4: Induktion, 5: 0,5 h nach Induktion, 6: 1,5 h nach Induktion, 7: 2,5 h nach Induktion, 8: 18h nach Induktion
3. SDS-PAGE-Analyse der RNase A nach den verschiedenen Aufreinigungsschritten
1: Prestained marker (Firma NEB, Beverly, MA, USA), 2: Zellernte, 3: lösliche Proteine, 4: Überstand nach Waschen der Inclusion Body-Fraktion, 5: solubilisierte Inclusion Body-Fraktion, 6: nach Rückfaltung, 7: nach Diafiltration, 8: Durchfluß bei Chromatographie (= ungebundenes Material), 9: Eluat 1, 10: Eluat 2, 11: Eluat 3, 12: kommerzielle, bovine RNase A
4. Aktivitätstests der aufgereinigten RNase A

a) Verdau von RNA 1, 15: 1 kb Größenmarker, 2-7; unterschiedliche Mengen kommerzieller, boviner RNase A (von 1 μg bis 0,025 μg), 8: Kontrolle ohne RNase A, 9-14: unterschiedliche Mengen rekombinanter, boviner RNase A (von 1 μg bis 0,025 μg)
b) RNase-A-Aktivität während der Plasmid-Isolierung M: 1 kb Größenmarker, 1: ohne RNase A, 2: bovine RNase A (Fa. A), 3: bovine RNase A (Fa. B), 4: rekombinante RNase A

Claims

Verfahren zur Herstellung von rekombinanter RNase A in E. coli, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz verwendet wird, die für eine RNase A bovinen Ursprungs kodiert und die entweder an das am häufigsten in E. coli verwendete Kodon angepasst ist oder unter Berücksichtigung der natürlichen Häufigkeit einzelner Kodons angepasst ist, wobei die RNase A Inclusion Bodies bildet und unter Solubilisierung und Rückfaltung aus den E. coli-Zellen bzw. dem Kulturmedium gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz an die Kodonverwendung in E. coli K12 angepasst ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz der in SEQ ID. No. 1 angegebenen DNA-Sequenz entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz der in SEQ ID. No. 2 angegebenen DNA-Sequenz entspricht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die RNase A in Fusion mit einem Signalpeptid exprimiert, wird, das den Transport in den periplasmatischen Raum steuert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Signalpeptid um das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase (phoA) handelt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Expression der RNase A unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Promotor um einen hitzeinduzierbaren Promotor handelt.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Induktion der Genexpression am Ende der exponentiellen Wachstumsphase erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Induktion der Genexpression für einen Zeitraum von 14 bis 20 Stunden erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zur Solubilisierung Guanidin-HCl als Denaturierungsmittel verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zur Rückfaltung reduziertes und oxidiertes Glutathion verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren weiter umfasst eine chromatographische Aufreinigung der RNase A.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei eine Kationenaustauschchromatographie durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ausbeute an RNase A mindestens 100 mg RNase A pro Liter Kulturmedium beträgt.
E. coli-Zellkultur, enthaltend mindestens 0,2 g rekombinante RNase A pro Liter Kulturmedium.
Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1.
Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2.
Nukleinsäuremolekül, umfassend die folgenden Bestandteile in 5'-3'-Reihenfolge: – einen in E. coli aktiven Promotor, – ggf. eine für ein Signalpeptid im Sinne von Anspruch 5 oder 6 kodierende Sequenz, – eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder No. 2.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder No. 2 zur Herstellung von rekombinanter RNase A.
Verwendung der RNase A hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in der Reinigung von DNA und Proteinen.