DE69924924T2

DE69924924T2 - Verfahren zum Spalten von DNS

Info

Publication number: DE69924924T2
Application number: DE69924924T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Wako-shi Morishima; Takehiko Wako-shi Shibata; Hikaru Fujimi-shi Mizumura
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-05-22
Also published as: DE69924924D1; US6528296B1; EP0972836B1; US6280942B1; EP0972836A3; EP0972836A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Spalten von DNA, umfassend das Reagieren der DNA mit einer ortsspezifischen Endonuclease, die eine spezifische Nucleotidsequenz erkennt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Endonuclease ist eine Nuclease (Nucleinsäure abbauendes Enzym), das die Phosphodiesterbindung einer Polynucleotidkette hydrolysiert. Die Endonuclease erkennt und bindet an eine spezifische Nucleotidsequenz entlang von DNA-Molekülen, wobei die Moleküle innerhalb der Erkennungssequenz gespalten werden.
Die Endonuclease ist ein notwendiges Enzym für die heutigen fortschrittlichen gentechnischen Verfahren zur Clonierung und Analyse von Genen.
Von einer ortsspezifischen Endonuclease Endo. SceI (hier nachstehend auch als „Scel" bezeichnet) aus einem eukaryontischen Mikroorganismus (z.B. Hefe) ist bekannt, dass sie ein Heterodimer ist, die Untereinheiten mit 75 kDa und 50 kDa besitzt. Die Untereinheiten von Scel sowie Gene, die die Untereinheiten codieren, wurden cloniert, und deren Nucleotidsequenzen wurden bestimmt (für die 75 kDa-Untereinheit vgl. Morishima, N. et al., J. Biol. Chem. 265, 15189–15197 (1990) und für die 50 kDA-Untereinheit vgl. JP-B-7-77556).
Um die vorstehend beschriebene Endonuclease zur künstlichen Modifikation eines biochemischen Mittels, eines Gens oder dergleichen in großem Maßstab zu nutzen, muss eine Massenproduktion der Endonuclease mit einem Genexpressionssystem erfolgen. Die Endonuclease funktioniert erst, wenn sie eine spezifische Nucleotidsequenz erkennt, d.h. die Endonuclease muss für die zu erkennende Nucleotidsequenz spezifisch sein.
Die 50 kDa-Untereinheit der vorstehend beschriebenen Endonuclease Scel wird von den Mitochondriumgenomen der Hefe (Saccharomyces cerevisiae) codiert. Ein Gen eines Hefe-Mitochondriumgenoms enthält für Mitochondrien einzigartige Codons, die sich von den Aminosäurecodons (Universalcodons) unterscheiden, die in Genexpressionssystemen aus Organismen verwendet werden, die im Allgemeinen zur Proteinexpression (E. coli, Baculovirus, Hefe etc.) im großem Maßstab verwendet werden. Falls dieses Gen des Mitochondriumgenoms direkt verwendet wird, produziert das Proteinexpressionssystem kaum ein Protein einer ursprünglichen Aminosäuresequenz. Während beispielsweise TGA als Universalcodon ein Stoppcodon ist, ist es in Mitochondrien ein unterschiedliches Codon, das eine andere Aminosäure (Trp) codiert. Ein Gen kann in Mitochondrien normal exprimiert werden, aber die Expression desselben Gens kann aufgrund einer vom Stoppcodon verursachten unvollständigen Übersetzung in einem allgemeinen Expressionssystem wie E. coli zu einem unvollständigen Protein führen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung zielt auf die Bereitstellung eines Verfahrens zum Spalten von DNA ab, umfassend das Reagieren der DNA mit einer ortsspezifischen Endonuclease, die eine spezifische Nucleotidsequenz erkennt.
Die hier genannten Erfinder haben intensive Studien betrieben, um die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen. Sie waren folglich bei der Bereitstellung eines Verfahrens zum Spalten von DNA erfolgreich, das das Reagieren der DNA mit einer ortsspezifischen Endonuclease umfasst, die eine spezifische Nucleotidsequenz erkennt, wobei die vorliegende Erfindung vollendet wurde.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Spalten von DNA, die die Sequenz aus 26 Nucleotiden: GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC umfasst, umfassend das Reagieren der DNA mit:

(i) einem Endonucleaseprotein, das die in SEQ ID NR: 3 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; oder
(ii) einem Endonucleaseprotein, das eine von SEQ ID NR: 3 durch Substitution von Gly mit Lys bei Aminosäure 217 und Asn mit Asp bei Aminosäure 346 abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst,

Ferner wird in der Beschreibung auch ein rekombinantes Protein von entweder (a) oder (b) beschrieben:

(a) ein Protein, das die in SEQ ID NR: 3 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; oder
(b) ein Protein mit einer Endonucleaseaktivität zur Erkennung der Nucleotidsequenz: GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC, wobei das Protein mindestens eine Deletion, Substitution oder Addition der Aminosäure in der in SEQ ID NR: 3 dargestellten Aminosäuresequenz umfasst.

Außerdem wird in der Beschreibung auch ein Gen beschrieben, das das rekombinante Protein von entweder a oder b codiert:

Zudem wird in der Beschreibung ein Gen beschrieben, das DNA von entweder (c) oder (d) enthält:

(c) DNA, das eine in SEQ ID NR: 2 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst; oder
(d) DNA, die ein Protein mit einer Endonucleaseaktivität zur Erkennung der Nucleotidsequenz: GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC codiert, wobei die DNA unter stringenten Bedingungen mit DNA hybridisieren kann, die die in SEQ ID NR: 2 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst.

Außerdem wird in der Beschreibung ein rekombinanter Vektor beschrieben, der das vorstehend beschriebene Gen umfasst.
Zusätzlich wird in der Beschreibung eine Transformante beschrieben, die den vorstehend beschriebenen rekombinanten Vektor umfasst.
Außerdem wird in der Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung der Endonuclease beschrieben, umfassend die Schritte der Züchtung der vorstehend beschriebenen Transformante; und das Gewinnen einer Endonuclease aus einer Kultur, die die Nucleotidsequenz: GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC erkennen kann.
In der Beschreibung wird auch eine Endonuclease beschrieben, die durch das Verfahren hergestellt wird.
Schließlich wird in der Beschreibung ein Kit beschrieben, der die Endonuclease und/oder das rekombinante Protein und/oder das Gen und/oder den rekombinanten Vektor und/oder die vorstehend erwähnte Transformante umfasst.
Die Bestandteile des Kits können in Behältern wie Phiolen, fakultativ in Puffern und/oder Lösungen, verpackt werden. Gegebenenfalls können ein oder mehrere Bestandteile in ein und denselben Behälter verpackt werden.
Es sollte angemerkt werden, dass ausschließlich das Verfahren, wie in Patentanspruch 1 definiert, Teil der Erfindung ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Aminosäuresequenz einer Endonuclease vor und nach der Modifikation dar;
2 stellt die Schritte zur Konstruktion von Plasmid pY673L dar;
3 stellt die Schritte zur Konstruktion der Plasmide pEN1.7 und pEN0.5 dar;
4 stellt die Nucleotidsequenz des Gens der 50 kDa-Untereinheit von Scel dar, das modifiziert wurde, so dass sie mit dem Universalcode übereinstimmt;
5A und 5B sind Photos der Elektrophorese, die die sequenzspezifischen Endonucleaseaktivitäten der 50 kDa-Untereinheit der modifizierten Scel zeigen;
6A und 6B stellen den Substitutionsort der 50 kDa-Untereinheit aus Saccharomyces uvarum und die für die Substitution verwendeten Oligonucleotide dar; und
7A und 7B sind Photos der Elektrophorese, die die sequenzspezifischen Endonucleaseaktivitäten der 50 kDa-Untereinheit aus Saccharomyces uvarum zeigen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die DNA des Mitochondriumgenoms, das die kleinere Untereinheit (50 kDa) einer Endonuclease aus Hefe codiert, kann in großem Maßstab exprimiert werden, indem ein Proteinexpressionssytem wie E. coli oder Hefe verwendet wird. Bei der Vollendung dieses Ziels können die für Mitochondrien einzigartigen Codons in Universalcodons in einem Gen, das eine Aminosäuresequenz der kleineren Untereinheit codiert, modifiziert werden. In der Beschreibung wird eine derartige modifizierte, kleinere Untereinheit erwähnt, die 26 Basenpaare der spezifischen Nucleotidsequenz erkennen und spalten kann.
Eine Endonuclease, wie hier beschrieben (d.h. die 50 kDa-Untereinheit einer Endonuclease aus Hefe, hier nachstehend auch als „Endo. SceI-50 kDa" bezeichnet), wird wie folgt hergestellt.
(1) Konstruktion der mutierten Aminosäure und Einführung der Mutation
Die kleinere Untereinheit der Endonuclease Scel aus Saccharomyces cerevisiae oder die kleinere Untereinheit der Endonuclease SuvI aus Saccharomyces uvarum wird als Ziel zur Einführung einer Mutation verwendet. Die kleineren Untereinheiten sowohl von Scel als auch von SuvI besitzen ein Molekulargewicht von 50 kDa. Jedoch unterscheiden sie sich dadurch voneinander, dass sie zwei unterschiedliche Aminosäuren besitzen (6A).
Das Gen, das die Untereinheit (50 kDa) von Scel (hier nachstehend als „ENS2" bezeichnet) codiert, wird von einem Mitochondriumgenom codiert und enthält daher genetische Codes, die für Mitochondrien einzigartig sind (Tabelle 1).
Tabelle 1 Unterschied zwischen dem Mitochondriumcode und Universalcode
Die Nucleotidsequenz von ENS2 ist bekannt (JP-B-7-77556; Nakagawa, K., Morishima, N. und Shibata, T., J. Biol. Chem. 266, 1977–1984 (1991)). Wenn ENS2 in einem allgemeinen Expressionssystem wie E. coli nach dem Universalcode exprimiert wird, wird die Translation bei TGA unterbrochen, das als Stoppcodon gelesen wird, wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist (beispielsweise schließt die in JP-B-7-77556 beschriebene ENS2 ein TGA-Stoppcodon an den Nucleotiden 97–99 ein). Während ATA nach dem Universalcode als Ile gelesen wird, wird es nach dem Mitochondriumcode als Met gelesen.
Um ein Expressionssystem im normalen Maßstab für ENS2 zu konstruieren, ist es notwendig, den genetischen Code von ENS2 zu modifizieren, so dass die Aminosäuresequenz, die bei der Expression in einem allgemeinen Expressionssystem (z.B. E. coli) erhalten wird, mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, wie sie in einem Mitochondrium-Expressionssystem exprimiert wird. Daher wird ein Codon für Trp (TGA) nach dem Mitochondriumcode (Tabelle 1) durch ein Codon (TGG) substituiert, das nach dem Universalcode in Trp translatiert wird. Eine derartige Substitution wird auch bei ATA sowie CTA und CTT angewandt, die nach dem Universalcode in Ile bzw. Leu translatiert werden (Tabelle 1). Es gibt keinen Bedarf, andere degenerierende Codons zu substituieren, die nach dem Universalcode Ile oder Leu codieren.
Grundsätzlich gibt es innerhalb der Aminosäuresequenz der kleineren Untereinheit von Scel (476 Aminosäuren) 37 Aminosäuren als Kandidaten für Modifikationen. Ihre Positionen sind in 1 und Tabelle 2 dargestellt. Was die Endonuclease aus Saccharomyces uvarum (SuvI) anbelangt, sind Gly bei 217 und Asn bei 346 (1) zusätzlich durch Lys bzw. Asp substituiert, so dass insgesamt 39 Aminosäuren modifiziert sind. Es ist nicht notwendig, alle der vorstehenden 37 oder 39 Aminosäuren zu substituieren. Die Anzahl der Substitutionen kann 36 oder 35 oder weniger betragen. Translationen in Codons, die für Mitochondrien einzigartig sind, können unvollständig sein, solange die nachstehend erwähnten 26 Nucleotide (SEQ ID NR: 1) von der Nuclease erkannt werden. Die Positionen der Substitution sind nachstehend in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Die Substitution der Aminosäuren erfolgt durch Substitution der Nucleotidsequenz des Gens, das die Aminosäuren codiert, durch eine andere Nucleotidsequenz (ortsgerichtete Mutagenese). Beispiele der Mutagenese schließen ein, sind aber nicht eingeschränkt auf das Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese von T. Kunkel (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488–492 (1985)) und das Gapped-Duplex-Verfahren. Es gibt auch eine modifizierte Version des Kunkel-Verfahrens, bei dem gleichzeitig maximal 16 Oligonucleotide zur Modifikation verwendet werden (anstatt der Verwendung von 1 oder 2 Oligonucleotiden wie beim herkömmlichen Kunkel-Verfahren), um eine Vielzahl von Positionen effizient zu substituieren. Eine Mutation kann unter Verwendung eines Kits zur Einführung von Mutationen (beispielsweise Mutant-K (Takara Shuzo, Co., Ltd.) oder Mutant-G (Takara Shuzo, Co., Ltd.)), der die ortsgerichtete Mutagenese nutzt, oder unter Verwendung eines in vitro-LA-PCR-Mutagenesereihen-Kits (Takara Shuzo, Co., Ltd.) eingeführt werden.
Die Oligonucleotide werden unter Verwendung der Nucleotidsequenz von ENS2 als Matrize (1431 Basenpaare: Nakagawa, K. et al., J. Biol. Chem. 266, 1977–1984 (1991); JP-B-7-77556) konstruiert und synthetisiert, so dass mindestens eine Base, die mit der Mutation eingeführt werden soll, von etwa 8 bis 30 Basen flankiert wird (wobei jedes Oligonucleotid insgesamt etwa 18 bis 60 Basen besitzt). Die Oligonucleotide können durch chemische Synthese unter Verwendung eines herkömmlichen Synthesegeräts erhalten werden.
(2) Herstellung des Endonucleasegens, das mit der Mutation eingeführt wurde
Jedes der, wie vorstehend in (1) beschrieben, erhaltenen Oligonucleotide ist am 5'-Ende phosphoryliert, wird unter Verwendung von ENS2 als Matrize synthetisiert und Ligierungsreaktionen unterzogen. Diese Reaktionen können unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo, Co., Ltd.), T4 DNA-Polymerase (Takara Shuzo, Co., Ltd.), T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo, Co., Ltd.) oder dergleichen erfolgen.
Die Nucleotidsequenz der so erhaltenen DNA wird bestimmt. Die Bestimmung der Nucleotidsequenz kann nach einem bekannten Verfahren wie dem chemischen Maxam-Gilbert-Modifikationsverfahren oder einem Didesoxykettenabbruchverfahren unter Verwendung des M13-Phagen durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die Sequenz unter Verwendung eines automatischen Nucleotidsequenziergeräts (z.B. ALF (Pharmacia), 373A-DNA-Sequenziergerät (Perkin-Elmer) etc.) bestimmt.
Die SEQ ID NR: 2 und 3 geben die Nucleotidsequenz eines Gens, das eine Endonuclease codiert, und die Aminosäuresequenz einer Endonuclease beispielhaft an, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Endonuclease erlangt die wesentliche Funktion der Endonuclease Scel oder SuvI, d.h. die Funktion, die Consensussequenz „CANRYNNANNCYYGTTW" und eine dazu ähnliche Sequenz zu erkennen, indem sie an die größere Untereinheit der natürlichen Endonuclease bindet. Die Endonuclease übt die Funktion der kleineren Einheit der natürlichen Endonuclease aus und kann die 26 Basen spezifisch erkennen, die durch GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC (SEQ ID NR: 1) dargestellt werden.
Die Endonuclease kann die Mutationen Gly217Lys und Asn346Asp einschließen und immer noch die vorstehenden 26 Basen (SEQ ID NR: 1) erkennen.
Der Ausdruck „kann erkennen", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Funktion der Endonuclease, an eine Stelle der 26 Basen innerhalb des Gens zu binden und das Gen zu spalten, so dass die 26 Basenpaare in zwei Fragmente mit gestuften Enden getrennt werden.
Die DNA, die mit dem vorstehenden Gen (SEQ ID NR: 2) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, kann auch in das Gen eingeschlossen werden, das die Endonuclease codiert. Die stringenten Bedingungen sind beispielsweise eine Natriumkonzentration von 15 bis 900 mM und eine Temperatur von 37 bis 70°C, vorzugsweise 68°C.
(3) Herstellung und Transformation des rekombinanten Vektors
(i) Herstellung des rekombinanten Vektors
Ein rekombinanter Vektor kann erhalten werden, indem das Gen, das die Endonuclease codiert, in einen geeigneten Vektor ligiert (eingebaut) wird. Der Vektor zum Einbau des Gens ist nicht auf einen Spezifischen begrenzt, solange er in einer Wirtszelle replizierbar ist. Beispiele eines derartigen Vektors schließen ein, sind aber nicht auf Plasmid-DNA und Phagen-DNA begrenzt.
Die Plasmid-DNA ist beispielsweise ein Plasmid aus E. coli (z.B. pRSET, pTZ19R, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119 etc.), ein Plasmid aus Bacillus (z.B. pUB110, pTP5 etc.) oder ein Plasmid aus Hefe (z.B. YEp13, YEp24, YCp50 etc.). Die Phagen-DNA ist beispielsweise der λ-Phage oder dergleichen. Auf ähnliche Weise kann ebenfalls ein tierischer Virusvektor wie ein Retrovirus- oder Vacciniavirus-Vektor oder ein Insektenvirusvektor wie ein Baculovirusvektor verwendet werden.
Um das die Endonuclease codierende Gen in den Vektor einzubauen, wird die gereinigte DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten. Dann wird das gespaltene Fragment in die Restriktionsstelle oder eine Multiclonierungsstelle der geeigneten Vektor-DNA eingebaut.
Das Gen sollte in den Vektor eingebaut werden, so dass das Gen funktionieren kann. Falls gewünscht, kann der Vektor andere Gene als das Gen und den Promotor einschließen, beispielsweise ein cis-Element (z.B. ein Enhancerelement), ein Spleiß-Signal, ein Poly(A)-Schwanz-Signal, einen Selektionsmarker und eine Ribosomen-bindende Sequenz (SD-Sequenz). Beispiele des Selektionsmarkers schließen das Dihydrofolatreduktasegen, das Ampicillin-Resistenzgen und das Neomycin-Resistenzgen ein.
(ii) Herstellung der Transformante
Eine Transformante kann erhalten werden, indem der rekombinante Vektor in eine Wirtszelle so eingeführt wird, dass das Gen von Interesse exprimiert werden kann. Die Wirtszelle ist nicht auf eine Spezifische eingeschränkt, solange sie die Endonuclease codierende DNA exprimieren kann. Als Beispiele sind Bakterien wie die Gattung Escherichia (z.B. Escherichia coli), die Gattung Bacillus (z.B. Bacillus subtilis), die Gattung Pseudomonas (z.B. Pseudomonas putida), die Gattung Rhizobium (z.B. Rhizobium meliloti), Hefe wie Schizosaccharomyces pombe, tierische Zellen (z.B. COS- und CHO-Zellen) und Insektenzellen (z.B. Sf9 und Sf21) angegeben.
Wenn ein Bakterium wie E. coli als Wirt verwendet wird, wird bevorzugt, dass sich der rekombinante Vektor autonom replizieren kann und einen Promotor, eine ribosomale Bindungsstelle, das Gen und eine Transkriptionsterminationssequenz einschließt. Der rekombinante Vektor kann auch ein Gen zur Kontrolle des Promotors einschließen.
Für E. coli sind E. coli K12 und DH1 als Beispiele angegeben und für Bacillus sind Bacillus subtilis MI 114 und 207-21 als Beispiele angegeben.
Als Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, solange er in der Wirtszelle wie E. coli exprimiert werden kann. Beispielsweise kann ein Promotor, der von E. coli oder einem Phagen stammt, z.B. der trp-Promotor, lac-Promotor, p_L-Promotor oder p_R-Promotor, verwendet werden. Künstlich konstruierte und modifizierte Promotoren wie der tac-Promotor können ebenfalls verwendet werden.
Der rekombinante Vektor kann in das Bakterium nach jedem Verfahren zur Einführung von DNA in ein Bakterium eingeführt werden. Beispielsweise können das Calciumionen-Verfahren (Cohen, S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110–2114 (1972)) und ein Elektroporationsverfahren verwendet werden.
Eine Hefe wie Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces pombe oder Pichia pastoris kann ebenfalls als Wirt verwendet werden. In diesem Fall kann der Promotor jeder Promotor sein, der in der Hefe exprimiert werden kann. Beispiele eines derartigen Promotors schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, den gal1-Promotor, gal10-Promotor, Hitzeschockprotein-Promotor, MF 1-Promotor, PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH-Promotor und AOX1-Promotor.
Der rekombinante Vektor kann in die Hefe durch jedes Verfahren zur Einführung von DNA in eine Hefe eingeführt werden. Beispielsweise können das Elektroporationsverfahren (Becker, D. M. et al., Methods Enzymol., 194, 182–187 (1990)), das Sphäroblastenverfahren (Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929–1933 (1978)) oder das Lithiumacetatverfahren (Itoh, N., J. Bacteriol., 153, 163–168 (1983)) verwendet werden.
Eine tierische Zelle wie die Affenzelle COS-7, Vero, die chinesische Hamsterovarienzelle (CHO-Zelle), die Maus-L-Zelle, die Ratten-GH3- oder menschliche FL-Zelle können ebenfalls als Wirt verwendet werden. Als Promotor kann beispielsweise der SR-Promotor, SV40-Promotor, LTR-Promotor oder CMV-Promotor verwendet werden. Andere Promotoren als diese, beispielsweise ein früher Gen-Promotor des menschlichen Cytomegalievirus können ebenfalls verwendet werden.
Der rekombinante Vektor kann in die tierische Zelle beispielsweise durch ein Elektroporationsverfahren, ein Calciumphosphatverfahren oder ein Lipofektionsverfahren eingeführt werden.
Eine Insektenzelle wie die Sf9-Zelle, Sf21-Zelle oder dergleichen kann ebenfalls als Wirt verwendet werden. Der rekombinante Vektor kann in die Insektenzelle beispielsweise durch ein Calciumphosphatverfahren, ein Lipofektionsverfahren oder ein Elektroporationsverfahren eingeführt werden.
(5) Herstellung der Endonuclease
Die Endonuclease kann durch Züchtung der vorstehend beschriebenen Transformante und durch Gewinnen der Endonuclease aus der Kultur davon erhalten werden. Der Begriff „Kultur", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Kulturüberstand, eine gezüchtete Zelle oder mikrobielle Zelle oder eine Zelle oder mikrobielle Zelltrümmer.
Die Transformante wird nach einem allgemeinen Verfahren gezüchtet, das zur Züchtung des Wirts verwendet wird.
Ein Medium zur Züchtung der Transformante, die von einem Wirtsmikroorganismus wie E. coli oder Hefe erhalten wird, kann entweder ein natürliches oder ein synthetisches Medium sein, solange es Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und dergleichen enthält, die vom Mikroorganismus assimilierbar sind, und solange damit eine effiziente Züchtung der Transformante erfolgen kann.
Als Kohlenstoffquellen können Kohlenwasserstoffe wie Glucose, Fructose, Saccharose, Stärke; organische Säuren wie Essigsäure, Propionsäure; und Alkohole wie Ethanol und Propanol verwendet werden.
Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsalze anorganischer oder organischer Säuren wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, andere stickstoffhaltige Verbindungen; Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser und dergleichen verwendet werden.
Als anorganische Substanzen können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natrium chlorid, Eisen(II)-Sulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat und dergleichen verwendet werden.
Die Züchtung erfolgt im Allgemeinen 12 bis 18 Stunden bei 37°C unter aeroben Bedingungen wie Schütteln oder Rühren mit Belüftung. Während der Züchtung wird der pH-Wert bei 6,5 bis 7,5, vorzugsweise bei 7,0, gehalten. Der pH-Wert wird mit anorganischer oder organischer Säure, einer alkalischen Lösung oder dergleichen reguliert.
Während der Züchtung können dem Medium gegebenenfalls Antibiotika wie Ampicillin, Tertacyclin oder dergleichen zugegeben werden.
Bei der Züchtung eines Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor unter Verwendung eines induzierbaren Promotors transformiert wurde, kann dem Medium bei Bedarf ein Induktor zugesetzt werden. Wenn beispielsweise ein Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor unter Verwendung des lac-Promotors oder trp-Promotors transformiert wurde, gezüchtet wird, kann dem Medium Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG) bzw. Indolessigsäure (IES) zugegeben werden.
Eine Transformante, die unter Verwendung von tierischen Wirtszellen erhalten wurde, kann in einem allgemein verwendeten Medium wie RPM11640-Medium oder DMEM-Medium oder einem Medium gezüchtet werden, das durch Ergänzen des allgemein verwendeten Mediums mit fötalem Rinderserum und dergleichen erhalten wird.
Die Züchtung erfolgt im Allgemeinen 1 bis 3 Tage bei 37°C unter 5% CO₂. Während der Züchtung kann dem Medium ein Antibiotikum wie Kanamycin, Penicillin oder dergleichen zugegeben werden.
Nach der Züchtung, bei der eine mikrobielle Zelle oder eine andere Zelle intrazellulär Endonuclease produziert, wird die Endonuclease durch Aufschluss der mikrobiellen Zelle oder der anderen Zelle extrahiert. Wenn eine mikrobielle Zelle oder eine andere Zelle Endonuclease extrazellulär produziert, wird die Kulturlösung direkt verwendet. Alternativ wird die mikrobielle Zelle oder die andere Zelle über Zentrifugation oder dergleichen entfernt, bevor die Endonuclease aus der Kultur über ein allgemeines biochemisches Verfahren zur Proteinisolierung und -reinigung wie Ammoniumsulfatpräzipitation, Gelchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder eine Kombination davon isoliert und gereinigt wird.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung der einzelsträngigen Matrizen-DNA, die die Untereinheit von Scel codiert und Desoxyuracil enthält
Das Gen der Endo. SceI-50 kDa-Untereinheit ENS2 (1431 Basenpaare; Nakagawa, K., Morishima, N. und Shibata, T., J. Biol. Chem. 266, 1977–1984 (1991)) wurde gleichzeitig in zwei Genbereichen modifiziert, d.h. innerhalb der stromaufwärtsliegenden Einheit mit 1,0 Kilobasenpaaren und der stromabwärtsliegenden Einheit mit 0,4 Kilobasenpaaren.
Für diesen Zweck wurden das EcoRI/EcoRI-Fragment (1671 Basenpaare), enthaltend das Gen der 50 kDa-Untereinheit mit der gesamten Länge (Nakagawa, K., Morishima, N. und Shibata, T. J., Biol. Chem. 266, 1977–1984 (1991)), und das PstI/EcoRI-Fragment (534 Basenpaare), enthaltend die stromabwärtsliegende Einheit des Gens der 50 kDa-Untereinheit, getrennt in das Phagmid pUC118 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) cloniert und als Plasmide pEN1.7 bzw. pEN0.5 bezeichnet (3). Diese Phagmide wurden zur Transformation in die E. coli-Stämme CJ236 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) eingeführt. Die E. coli-Transformanten-Stämme wurden 12 Stunden oder länger bei 37°C einer Schüttelkultur unterzogen, um Vorkulturlösungen herzustellen. 20 μl jeder Vorkulturlösung wurden 2 ml 2 × YT-Kulturmedium zugegeben, enthaltend Ampicillin (100 μg/ml) (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: a laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)) und 1 Stunde bei 37°C gezüchtet. Jedem Medium wurde der Helferphage M13KO7 (2,0 × 10¹² plaquebildende Einheit (PBE); Takara Shuzo, Co., Ltd.) zugegeben, so dass er 0,4 Vol.-% des Mediums ausmachte, und das Ergebnis wurde 1 Stunde bei 37°C gezüchtet. Danach wurde Kanamycin (100 μg/ml) zugegeben und das Ergebnis wurde 14 Stunden bei 37°C gezüchtet. Die während der Züchtung aus E. coli in das Medium freigesetzten Phagenpartikel wurden gewonnen. Genau gesagt wurden 1,5 ml jeder Kulturlösung in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert (14,000 UpM, 5 min). 1,2 ml Überstand wurden gesammelt und unter denselben Bedingungen zentrifugiert, um die Zellen vollständig zu entfernen, so dass 1,0 ml Überstand erhalten wurde. Das anschließende Verfahren zur Herstellung der DNA erfolgte nach der in der Versuchsanleitung von J. Sambrook et al. (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: a laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)) zusammengefassten DNA-Reinigung des Bakteriophagen M13.
Beispiel 2: Synthese der Oligonucleotide zur Einführung der ortsgerichteten Mutation
(i) Synthese des Einzelstanges
Das Gen der 50 kDa-Untereinheit ENS2 wird vom Mitochondriumgenom codiert und schließt daher den genetischen Code ein, der für Mitochondrien einzigartig ist (Tabelle 1). Um ENS2 einem allgemeinen Expressionssystem in großem Maßstab zu unterziehen, müssen diese einzigartigen Codons substituiert werden, damit sie mit dem Universalcode übereinstimmen. Nach Beispiel 2 werden die Basen unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens von T. Kunkel (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488–492 (1985)) substituiert. Während beim allgemeinen Kunkel-Verfahren nur ein oder zwei Oligonucleotide zur Modifikation verwendet werden, werden beim vorliegenden Verfahren maximal 16 Oligonucleotide zur effizienten Substitution an multiplen Positionen verwendet.
Es wurden 33 Oligonucleotide konstruiert, die jeweils die zu substituierende Base enthielten, die von etwa 10 bis 15 Basen flankiert wurde (Tabelle 3).
Tabelle 3
In Tabelle 3 stellt/stellen die Base(n) in Klammern unter jeder Sequenz die ursprüngliche(n) Base(n) dar, die durch die unterstrichene(n) Base(n) substituiert wurde(n). Die in Kleinbuchstaben dargestellten Basen stellen diejenigen dar, bei denen bereits das ursprüngliche Oligonucleotid substituiert wurde.
Die Längen der Oligonucleotide variieren innerhalb des Bereiches von 18 bis 52 Basen, und sie schließen die Mutation von einem bis maximal 4 Resten ein. Diese Oligonucleotide wurden zur Substitution von 50 Basenpaaren des 1431 bp großen Gens der 50 kDa-Untereinheit verwendet, um 37 Codons zu modifizieren. Das 5'-Ende jedes Oligonucleotids wurde phosphoryliert, so dass die später beschriebene DNA-Ligase-Reaktion erfolgen konnte. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die Phosphorylierung ist nachstehend dargestellt:
Das Reaktionsgemisch wurde einer 15-minütigen Phosphorylierungsreaktion bei 37°C unterzogen, und dann wurde das Enzym durch eine 10-minütige Behandlung bei 70°C inaktiviert.
(ii) Synthese des Komplementärstranges
Die in (i) erhaltenen Oligonucleotide wurden wie folgt behandelt, um Doppelstränge zu erhalten. Die Zusammensetzungen des Anlagerungspuffers und des Verlängerungsreaktionspuffers sind nachstehend dargestellt.
Anlagerungspuffer
Verlängerungsreaktionspuffer
Zu 1 μl Anlagerungspuffer und 0,2 pMol der einzelsträngigen Matrizen-DNA wurde destilliertes Wasser gegeben, was zu einer Gesamtmenge von 10 μl führte. 1 μl der Lösung wurde dispergiert, so dass sie mit 1 μl der phosphorylierten Oligonucleotidlösung gemischt wurde. Das sich ergebende Gemisch wurde 15 min bei 65°C und dann 15 min bei 37°C stehengelassen, wobei sich das Oligonucleotid an die einzelsträngige DNA anlagerte. Der Lösung wurden 25 μl Verlängerungspuffer, 60 Einheiten E. coli-DNA-Ligase und 1 Einheit T4-DNA-Polymerase zugegeben und 2 Stunden bei 25°C stehengelassen, so dass ein Komplementärstrang synthetisiert wurde. 3 μl 0,2 M Ethylendiamintetraessigsäuretetranatriumsalz (pH 8,0) wurden zugegeben, um die Enzymreaktion zu beenden, nach der das Enzym durch 5-minütige Behandlung bei 65°C inaktiviert wurde. Diese Reaktionslösung wurde direkt für die nachstehende Transformation verwendet.
Beispiel 3: Transformation
E. coli BMH71-18-mutS (Takara Shuzo, Co., Ltd.) wurde so verwendet, dass die Nucleotidsequenz des Wildtyp-DNA-Stranges (die einzelsträngige DNA, die mit CJ236 hergestellt wurde) in der doppelsträngigen Plasmid-DNA, die durch Komplementärstrangsynthese erhalten wurde, durch einen Mutantentyp substituiert wurde. In diesem E. coli-Stamm wurde Desoxyuracil, das in der mit CJ236 hergestellten einzelsträngigen DNA enthalten war, durch das Enzym Uracil-DNA-Glycosylase hydrolysiert und dann unter Verwendung des DNA-Stranges erneut synthetisiert, der die substituierte Base als Matrize enthielt (Lindahl, T., Ann. Rev. Biochem. 51, 61–87 (1982)).
Das gesamte Reaktionsgemisch mit dem synthetisierten Komplementärstrang wurde der 100 μl-Lösung zugegeben, die die kompetenten Zellen von BMH71-18 mutS enthielt. Kompetente E. coli-Zellen wurden nach dem Verfahren von H. Inoue et al. (Inoue, H., Nojima, H. und Okayama, H., Gene 96, 23–28 (1990)) hergestellt.
Der Lösung wurde Medium zugegeben und 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Dann wurden 30 μl des Helferphagen (a. a. O.) zugegeben und weitere 30 min bei 37°C stehengelassen, damit die Infektion stattfand. 40 μl der BMH71-18-Kulturlösung, die intrazellulär sowohl den Helferpagen als auch das Plasmid enthielt, wurde fraktioniert und 2 ml des 2 × YT-Mediums, enthaltend Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (100 μg/ml), zugegeben. Das sich ergebende Medium wurde 16 bis 20 Stunden bei 37°C einer Schüttelkultur unterzogen, um einen Phagen herzustellen.
Die mikrobielle Zelle wurde durch Zentrifugation (14.000 UpM, 5 min) entfernt. Der Überstand, der den Phagenpartikel enthielt, der die einzelsträngige DNA des Plasmids mit der substituierten Base einbaut, wurde entfernt. Mit 20 μl Überstand wurden 80 μl des Stammes MV1184 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) gemischt, der 12 Stunden oder länger gezüchtet worden war, und man ließ ihn 10 min bei 37°C stehen, damit die einzelsträngige DNA des Phagen in die Zelle injiziert wurde.
Der Stamm MV1184, der das sich aus der Replikation der integrierten einzelsträngigen DNA ergebende Plasmid enthielt, wurde zur Selektion auf einem LB-Agarmedium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, angeimpft (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: a laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (1989)). Die Nucleotidsequenzen der Gene der 50 kDa-Untereinheit wurden bei einigen Clonen mit einem automatischen Sequenziergerät ALF (Pharmacia) analysiert, um den Einbau der vorbestimmten Substitutionen zu bestätigen. Der Fluoreszenzprimer für die Analyse der Nucleotidsequenz wurde von Pharmacia (Uppsala, Schweden) erworben. Die DNA-Sequenzierreaktion basierte auf dem Sanger-Verfahren (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463–5467 (1977)) nach der Vorschrift von Pharmacia.
Für das Ausgangsmaterial, Plasmid pEN1.7, wurden 40 Nucleotidsubstitutionen mittels 9 Zyklen des Mutageneseverfahrens durchgeführt, während 10 Nucleotidsubstitutionen für pEN0.5 mittels 4 Zyklen eines derartigen Verfahrens durchgeführt wurden.
Waren einmal alle Substitutionen bestätigt, wurden die stromaufwärtsliegenden und stromabwärtsliegenden Einheiten an die PstI-Schnittstelle gebunden, so dass ein Gen erhalten wurde, das die 50 kDa-Untereinheit mit vollständigen Substitutionen codiert (4, SEQ ID NR: 2).
Beispiel 4: Konstruktion des Expressionsplasmids für die 50 kDa-Untereinheit
Um die Bindung zwischen dem modifizierten Gen der 50 kDa-Untereinheit und dem Vektor zur Induktion ihrer Expression zu ermöglichen, wurden die Restriktionsschnittstellen in die 5'- und 3'-Enden des modifizierten Gens über die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingeführt. Die Reaktion erfolgte unter Ver wendung von Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo, Co., Ltd.) nach der Vorschrift des Herstellers. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind nachstehend dargestellt.
Die unterstrichenen Teile sind die neu eingeführten BamHI- und SalI-Erkennungssequenzen. Die Reaktion erfolgte mit 25 Zyklen: 1 min bei 94°C; 2 min bei 45°C; und 3 min bei 72°C.
Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment (1447 Basenpaare) wurde über (0,8%) Agarose-Gelelektrophorese (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: a laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)) aufgetrennt und zur Bestätigung mit Ethidiumbromid gefärbt. Das Fragment wurde aus dem Agarosegel unter Verwendung des Geneclean-Kits (BIO101, Kalifornien, USA) gewonnen.
Das gewonnene DNA-Fragment wurde mit BamHI und SalI behandelt und in pRSET (Invitrogen Corp.) und pTZ19R (Pharmacia) subcloniert, so dass pSC50 bzw. pTZSC50 erhalten wurde. Das Plasmid pSC50 wurde zur Induktion der Expression verwendet. Plasmid pTZSC50 wurde einer DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Fluoreszenzprimers (a. a. O.) unterzogen, so dass bestätigt wurde, dass keine zusätzliche Mutation während der PCR eingeführt worden war.
Beispiel 5: Einführung der Expression der 50 kDa-Untereinheit
Das Expressionsplasmid pSC50 wurde in kompetente E. coli BL21 (DE3) pLysS-Zellen (Invitrogen Corp.) eingeführt. Die Transformantenzelle wurde über Nacht bei 37°C über eine Schüttelkultur in einem flüssigen LB-Medium, enthaltend Ampicillin (150 μg/ml) und Chloramphenicol (34 μg/ml) vorgezüchtet (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: a laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Die vorgezüchtete Lösung (4 Vol.-% einer sich ergebenden Kultur) wurde zentrifugiert (2.500 × g, 10 min), um die mikrobielle Zelle zu gewinnen. Dieses Präzipitat wurde in einer kleinen Menge frischem Medium suspendiert, das dann einem flüssigen Medium zugegeben wurde. Die Schüttelkultur (37°C) erfolgte, bis der Suspensionsspiegel von etwa 0,5 bei 600 Nanometer (nm) (OD600) erhalten wurde. Anschließend wurde die Schüttelkultur bei 18°C fortgesetzt. Wenn die OD600 etwa 0,8 erreichte, wurde Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG) bis zur Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben, um die Induktion der Expression der 50 kDa-Untereinheit zu initiieren. Nachdem E. coli weiteren 12 Stunden einer Schüttelkultur bei 18°C unterzogen wurde, wurde er durch Zentrifugation rückgewonnen, schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Beispiel 6: Reinigung der 50 kDa-Unterinheit aus E. coli.
Die bei –80°C gelagerte mikrobielle Zelle wurde bei Raumtemperatur aufgetaut. Die anschließenden Behandlungen wurden bei 4°C oder auf Eis durchgeführt. Die mikrobielle Zelle wurde in Puffer A (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 500 mM Natriumchlorid, 5 mM Imidazol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF; Sigma Aldrich Japan K. K., Tokio, Japan), 0,1% NP-40 (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan)) suspendiert. Die sich ergebende Suspension wurde schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren und unter laufendem Wasser aufgetaut, um E, coli aufzuschließen. Die Suspension wurde 5-mal 30 sec mit einem Ultraschallgerät (UR-200P, Tomy Seiko Co., Ltd., Tokio, Japan) bei maximaler Leistung behandelt.
Die behandelte Lösung wurde bei 4°C (39.000 × g, 20 min) zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch einen 0,45 μm-Mylex-Filter (Millipore, Massachusetts, USA) filtriert. Die Probe wurde auf eine Säule (ø10 mm, 2,0 ml) aufgetragen, die mit Probond Nickelchelate Resin (Invitrogen Corp.) beladen war, das mit Puffer A äquilibriert worden war. Dann wurde die Probe mit 20 ml Puffer A (10-faches Volumen des Harzes) gewaschen. Nach einem weiteren Waschschritt mit 12 ml Puffer A, enthaltend 60 mM Imidazol (6-faches Volumen des Harzes), wurde das Ergebnis einer Gradientenelution mit 60–50 mM Imidazol enthaltendem Puffer A (Gesamtmenge 80 ml) unterzogen. Die eluierte Fraktion wurde einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (Laemmli, U. K. Nature, 227, 680–685 (1970)) unterzogen und mit Coomasie Brilliantblau gefärbt, um das Vorliegen der 50 kDa-Untereinheit zu bestätigen. Die 50 kDa-Untereinheit enthaltende Fraktion wurde gegen Puffer B (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 300 mM Natriumchlorid, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäuretetranatriumsalz, 1 mM Dithiothreit) dialysiert. Das gereinigte Protein wurde unter Verwendung eines Mittels zum Proteintest (Bio-Rad, Kalifornien, USA) nach dem Mikrotestverfahren des Herstellers quantifiziert. Als Standardprotein wurde Rinderserumalbuminlösung (Sigma Aldrich Japan K. K.) verwendet. Infolgedessen wurden 300 μg gereinigtes Protein aus 25 g (Nassgewicht) der mikrobiellen Zelle erhalten.
Beispiel 7: Messung der Endonucleaseaktivität
Ein Substrat zur Messung einer Endonucleaseaktivität der 50 kDa-Untereinheit wurde wie folgt hergestellt. Ein EcoRI/EcoRI-Fragment, das den oli2-Bereich auf Mitochondrium-DNA enthielt, von dem bekannt ist, dass Endo. SceI darin spaltet (1671 Basenpaare; Nakagawa, K. et al., EMBO J. 11, 2707–2715 (1992)), wurde in das Phagemid pUC119 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) subcloniert, wobei das Ergebnis als pY673L (2) bezeichnet wurde. Plasmid pBR322 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) wurde als Kontroll-DNA-Substrat verwendet. Die Plasmide pY673L und pBR322 wurden verwendet, um E. coli zu transformieren. Dann wurden die Plasmide aus E. coli extrahiert und unter Verwendung einer Qiagen-Säule gutgereinigt (Qiagen Japan, Tokio, Japan).
Die Zusammensetzung der für die Messung der Endonucleaseaktivität der 50 kDa-Untereinheit verwendeten Reaktionslösung ist nachstehend dargestellt.
Nach Durchführung der 30-minütigen DNA-Spaltungsreaktion bei 37°C wurden Ethylendiamintetraessigsäuretetranatriumsalz und Natriumdodecylsulfat bis zu Endkonzentrationen von 10 mM bzw. 0,3% zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Die gespaltene DNA wurde einer 0,8%-igen Agaroseelektrophorese entweder direkt oder nach der Konzentrierung der DNA durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation unterzogen.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid (Sigma Aldrich Japan K. K.) oder SYBR-Green (Takara Shuzo, Co., Ltd.) gefärbt, um die Spaltung der DNA zu bestätigen. Die DNA wurde unter Verwendung eines FMBIO Imaging-Gerätes (Takara Shuzo, Co., Ltd.) nachgewiesen, um die DNA-Spaltung zu bestimmen.
Beispiel 8: Nachweis der sequenzspezifischen Endonuclease
Die dimere Endo. SceI erkennt und spaltet in vivo und in vitro 26 Basenpaare, die der Consensussequenz innerhalb des oli2-Genbereichs auf der Mitochondrium DNA ähneln (Nakagawa, K., Morishima, N. und Shibata, T., EMBO J. 11, 2707–2715 (1992)) (2). Die gereinigte 50 kDa-Untereinheit von Endo. SceI spaltete eine spezifische Sequenz selbst (SEQ ID NR: 1).
Die spezifische Spaltung von oli2 mit der 50 kDa-Untereinheit unter Verwendung von Plasmid pY673L, das oli2 als Substrat enthält, wurde bestätigt (5A). Bezugnehmend auf 5A sind die Spuren 1 bis 8 die Ergebnisse, die mit 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0, 32,0 bzw. 64,0 ng der 50 kDa-Untereinheiten erhalten wurden. Mit 64 ng der 50 kDa-Untereinheit wurden 60% von pY673L (25 ng) in der Reaktionslösung sequenzspezifisch bei 37°C innerhalb von 30 min gespalten, wobei DNA-Fragmente mit 3,4 und 1,4 Kilobasen nachgewiesen wurden.
Die DNA wurde nicht mit der 50 kDa-Untereinheit unter Verwendung von Plasmid pBR322 als Substrat gespalten, und es wurde kein Spaltungsfragment nachgewiesen. Bezugnehmend auf 5B sind die Spuren 1 bis 7 die Ergebnisse, die mit 2,3, 4,5, 9,0, 18,0, 36,0, 72,0 bzw. 144 ng der 50 kDa-Untereinheiten erhalten wurden. Bei Verwendung einer Überschussmenge (200 ng) der 50 kDa-Untereinheit fand man keine Spaltung bei pBR322 oder anderen DNAs (Mitochondrium-DNA (80 Kilobasenpaare) aus einem knospenden Hefestamm, DNA des E. coli-Phagen λ (47 Kilobasenpaare) und DNA des Bacillus-Phagen ø105 (38 Kilobasenpaare), die keine spezifische Sequenz (26 Basenpaare) innerhalb des oli2-Genbereichs enthielten.
Beispiel 9: Massenproduktion der 50 kDa-Untereinheit aus Saccharomyces uvarum und Nachweis ihrer Aktivität
Die Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit, ein homologes Protein der Endo. SceI-50 kDa-Untereinheit aus Saccharomyces cerevisiae liegt in Saccharomyces uvarum vor (Nakagawa, K., Morishima, N. und Shibata, T., J. Bio. Chem. 266, 1977–1984 (1991)). Beide Untereinheiten besitzen 476 Aminosäurereste, aber auf der Aminosäureebene gibt es zwei Unterschiede zwischen ihnen. Die Unterschiede bei den Aminosäuren zwischen der Endo. SceI- und der Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit sind in 6A dargestellt.
Für die Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit wurde ein Gen zur Expression in großem Maßstab durch Einführung zweier zusätzlicher Modifikationen in das modifizierte Gen für die Endo. SceI-50 kDa-Untereinheit hergestellt. Die für die Substitutionen verwendeten Oligonucleotide der Aminosäuren für die Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit sind in 6B dargestellt. Bezugnehmend auf 6B entsprechen die Basen in Klammern der Nucleotidsequenz der Endo. SceI-50kDa-Untereinheit. Für diesen Zweck wurden zwei Oligonucleotide neu synthetisiert, um Mutationen nach dem vorstehend beschriebenen Genmodifikationsverfahren einzuführen. Die Mutation wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das modifizierte Gen wurde in den pRSET-Vektor (Invitrogen Corp.) subcloniert, der dann durch das Transformationsverfahren in E. coli BL21 (DE3) pLys eingeführt wurde.
Die Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren exprimiert und gereinigt, das für die Endo. SceI-50 kDa-Untereinheit angewandt wurde. Die gereinigte Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit wurde verwendet, um Plasmid pY673L spezifisch zu spalten.
Folglich war die Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit bei der sequenzspezifischen Spaltung der Schnittstelle für die Endo. SceI-50 kDa-Untereinheit auf Plasmid pY673L ähnlich wirksam (7A).
Dagegen spaltete die Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit das Plasmid pBR322 überhaupt nicht (7B). Auch andere DNAs (Mitochondrium-DNA von knospender Hefe, DNA des Bacillus-Phagen ø105 und DNA des E. coli-Phagen λ, die den oli2-Genbereich nicht enthielten) wurden von der Endo. SuvI-50 kDa-Untereinheit nicht gespalten.
In den 7A und 7B sind die Spuren 1 bis 7 die Ergebnisse, die mit 2,3, 4,5, 9,0, 18,0, 36,0, 72,0 bzw. 144 ng der 50 kDa-Untereinheiten erhalten wurden.
Dementsprechend werden eine ortsspezifische Endonuclease, die eine spezifische Nucleotidsequenz erkennen kann, ein die Nucleotidsequenz codierendes Gen, ein rekombinanter, das Gen enthaltender Vektor, eine den Vektor enthaltende Transformante und ein Verfahren zur Herstellung der Endonuclease bereitgestellt. Da die Endonuclease eine spezifische Sequenz aus 26 Basen erkennen kann, ist sie bei der Modifikation und Kartierung von DNA in einem großen Anwendungsbereich, d.h. Plasmid bis Genom, auf dem Gebiet der Gentechnik und Biochemie nützlich.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Spalten von DNA umfassend, die Sequenz aus 26 Nucleotiden: GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC (SEQ ID NO: 1), wobei das Verfahren umfasst: Reagieren der DNA mit: (i) einem Endonuclease-Protein, das die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; oder (ii) einem Endonuclease-Protein, das eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution von Gly mit Lys bei Aminosäure 217 und Asn mit Asp bei Aminosäure 346 abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst, wobei die DNA innerhalb der Sequenz aus 26 Nucleotiden: GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC gespalten wird, um gestufte Enden zu erzeugen.