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Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Sarcosinoxidasen, Gene und rekombinante DNAs davon und Verfahren zur Herstellung derselben.
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Sarcosinoxidasen sind Enzyme, deren katalytische Aktivität in der Hydrolyse von Sarcosinen in Glycin und Formaldehyd besteht. Diese können zur Bestimmung der Menge an Kreatinin in menschlichem Serum oder Urin verwendet werden oder als Diagnosemittel für verschiedene Erkrankungen, beispielsweise eine Erkrankung der Nieren.
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Von Sarcosinoxidasen wurde kürzlich bekannt, daß diese von Bakterienstämmen produziert werden, beispielsweise von der Gattung Corynebakterium (siehe J. Biochem., 89 (1981), 599), Bacillus (siehe das veröffentlichte
japanische Patent Nr. 54-52789 (nicht geprüfte Anmeldung)), Cylindrocarbons (siehe das veröffentlichte
japanische Patent Nr. 56-92790 (nicht geprüfte Anmeldung)), Pseudomonas (siehe das veröffentlichte
japanische Patent Nr. 60-43379 (nicht geprüfte Anmeldung)), Arthrobacter (siehe das veröffentlichte
japanische Patent Nr. 2-265478 (nicht geprüfte Anmeldung)). In typischen für Kreatin quantitativen Reaktionen im leicht alkalischen Bereich (pH-Wert 7,5 bis 8,0) beeinflußt jedoch Bilirubin den Meßwert, wodurch Schwierigkeiten bei der Messung hervorgerufen werden. Genetisch modifizierte Enzyme mit optimalem pH-Wert im leicht sauren Bereich, die durch Modifikation von Sarcosinoxidasegen von der Gattung Bacillus produziert werden und auf die Messung im leicht sauren Bereich gerichtet sind, wo die Auswirkungen von Bilirubin geringer sind, sind heute ebenfalls bekannt (siehe das veröffentlichte
japanische Patent Nr. 2000-175685 (nicht geprüfte Anmeldung)). Diese modifizierten Enzyme waren jedoch aufgrund ihrer Instabilität im leicht sauren Bereich praktisch nicht anwendbar.
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In
JP 05115281 A ist die genomische DNA des Gens der Sarcosinoxidase aus der Gattung Bacillus beschrieben. Außerdem ist eine Sarcosinoxidase aus Arthrobacter sp. TE1826 in Nishiya, et al., Applied and Environmental Microbiology 62(7): 2405–2410 (1996) beschrieben, bei der gegenüber der in
JP 2001 120 273 A offenbarten Wildtypsequenz eine oder zwei Aminosäure(n) ausgetauscht sind.
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Wie vorstehend ausgeführt, wird die Zuverlässigkeit bei der enzymatischen Quantifizierung von Kreatinin oder Kreatin verringert, wenn Substanzen, wie zum Beispiel Bilirubin, diese beeinflussen, da die Mengen an diesen beiden Substanzen im Serum oder Blut äußerst gering sind. Es ist auch bekannt, daß bei Durchführung von Messungen im leicht sauren Bereich, bei dem die Auswirkungen von Bilirubin etc. gering sind, eine Verminderung der Stabilität eintritt. Um diese Probleme mittels Verbesserungen zu Lösen, die nicht enzymatischer Natur sind, mußte die Menge an Sarcosinoxidase in der aktiven Formulierung über das normalerweise verwendete Maß hinaus erhöht werden, geeignete Puffer mußten ausgewählt werden oder es mußten Additive zugegeben werden. Allerdings könnten auf solchen Vorgehensweisen beruhende Verbesserungen die Kosten der für die Messung verwendeten Reagenzien erhöhen und diese sind somit praxisfremd.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Sarcosinoxidasen mit optimalen pH-Wert und hoher Aktivität im leicht sauren Bereich, die auch eine verbesserte Stabilität aufweisen.
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Deshalb untersuchten die Erfinder das vorstehend erwähnte Problem weiter und es gelang ihnen, Sarcosinoxidasen mit verbesserter Aktivität im leicht sauren Bereich und verbesserter Stabilität als Ergebnis der genetischen Modifikation von Sarcosinoxidase-Genen aus der Gattung Bacillus (gezeigt in SEQ ID NR:2 des veröffentlichten
japanischen Patents Nr. 5-115281 (nicht-geprüfte Anmeldung) (SEQ ID NR:2) zu erhalten, wodurch die vorliegende Erfindung zum Abschluß gebracht wurde.
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Die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit:
- 1. Modifizierte Sarcosinoxidase dadurch gekennzeichnet dass:
(a) das Protein aus der durch SEQ ID NR. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist; oder
(b) das Protein aus einer Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist, bei der eine Aminosäure der durch SEQ ID NR. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz deletiert, ausgetauscht oder zugefügt ist, wobei das Protein Sarcosinoxidase-Aktivität hat.
- 2. Sarcosinoxidase-Gene, die modifizierte Sarcosinoxidase codieren, die dadurch gekennzeichnet ist, dass
(a) das Protein aus der durch SEQ ID NR. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist; oder
(b) das Protein aus einer Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist, bei der eine Aminosäure der durch SEQ ID NR. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz deletiert, ausgetauscht oder zugefügt ist, wobei das Protein Sarcosinoxidase-Aktivität hat.
- 3. Rekombinante DNA dadurch gekennzeichnet, dass das Sarcosinoxidase-Gen gemäß 2 in eine Vektor-DNA inseriert ist.
- 4. Transformante oder Transduktante, die rekombinante DNA gemäß 3 umfassend.
- 5. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Sarcosinoxidase, das durch Kultivierung der Transformante oder Transduktante gemäß 4 in einem Medium gekennzeichnet und Gewinnung einer Sarcosinoxidase aus der Kultur ist.
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Außerdem ist im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung folgendes, unter den Punkten (1) bis (10) beschriebene, offenbart.
- (1) Eine modifizierte Sarcosinoxidase mit im Vergleich zu Wildtyp-Sarcosinoxidasen verbesserter Stabilität im sauren Bereich.
- (2) Die modifizierte Sarcosinoxidase gemäß Punkt (1) mit einer Restaktivität von 90% oder mehr nach fünfstündiger Hitzebehandlung bei einem pH-Wert von 6.0 und 25°C und 70% oder mehr nach einer 17-stündigen Hitzebehandlung bei einem pH-Wert von 6.0 und 25°C.
- (3) Die modifizierte Sarcosinoxidase gemäß Punkt (2), wobei eine Aktivität gegenüber Sarsosin im sauren Bereich im Vergleich zu einer Wildtyp-Sarcosinoxidase verbessert ist.
- (4) Die modifizierte Sarcosinoxidase gemäß Punkt (3) mit einem Km-Wert unter 6 mM gegenüber Sarcosin bei einem pH-Wert von 6,5.
- (5) Eine modifizierte Sarcosinoxidase mit folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
(a) Wirkung: Hydrolyse von 1 mol Sarconsin zur Produktion von 1 mol Glycin und 1 mol Formaldehyd
(b) optimaler pH-Wert: um 6,5
(c) stabiler pH-Bereich: zwischen 6,0 und 11,0
(d) optimale Temperatur: 60°C
(e) Thermostabilität: um 50°C (pH-Wert 7,5)
(f) Stabilität bei einem pH-Wert von 6,0: Restaktivität von 90% oder mehr bei 25°C, pH-Wert 6,0, 5 Stunden; 70% oder mehr bei 25°C, 17 Stunden
(g) Molekulargewicht: ca. 43.000 (SDS-PAGE)
(h) Km-Wert: 5,9 mM gegenüber Sarcosin (pH-Wert 6,5)
- (6) Eine modifizierte Sarcosinoxidase wie nachstehend in (a), (b) oder (c) definiert:
(a) Protein, das aus der durch SEQ ID NR:1 repräsentierten Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist;
(b) Protein, das aus einer Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren von der durch SEQ ID NR:1 repräsentierten Aminosäuresequenz deletiert, ausgetauscht oder zugefügt sind, wobei das Protein Sarcosinoxidase-Aktivität aufweist;
(c) Protein, das aus einer Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist, die 80% Homologie zu der durch SEQ ID NR:1 repräsentierten Aminosäuresequenz oder mehr zeigt, wobei das Protein Sarcosinoxidase-Aktivität aufweist.
- (7) Ein Sarcosinoxidase-Gen, das eine modifizierte Sarcosinoxidase wie nachfolgend in (a), (b) oder (c) definiert codiert:
(a) Protein, das aus der durch SEQ ID NR:1 repräsentierten Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist;
(b) Proteine, die aus einer Aminosäuresequenz zusammengesetzt sind, wobei eine oder mehrere Aminosäuren von der durch SEQ ID NR:1 repräsentierten Aminosäuresequenz deletiert, ausgetauscht oder zugefügt sind, wobei das Protein Sarcosinoxidase-Aktivität aufweist;
(c) Proteine, die aus einer Aminosäuresequenz zusammengesetzt sind, die 80% Homologie zu der durch SEQ ID NR:1 repräsentierten Aminosäuresequenz oder mehr zeigt, wobei das Protein Sarcosinoxidase-Aktivität aufweist.
- (8) Eine rekombinante DNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß das Sarcosinoxidase-Gen gemäß Punkt (7) in Vektor-DNA inseriert ist.
- (9) Eine Transformante oder Transduktante, die die rekombinante DNA gemäß Punkt (8) umfaßt.
- (10) Ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Sarcosinoxidase, das durch die Kultivierung der Transformante oder Transduktante gemäß Punkt (9) in einem Medium und die Gewinnung einer Sarcosinoxidase aus der Kultur gekennzeichnet ist.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung können Sarcosinoxidasen, insbesondere Sarcosinoxidasen mit optimalem pH-Wert und hoher Aktivität im leicht sauren Bereich und verbesserter Stabilität wirksam hergestellt werden. Somit ist die Ausführung der vorliegenden Erfindung von industrieller Bedeutung.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 zeigt den stabilen pH-Bereich der modifizierten Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung.
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2 zeigt den optimalen pH-Wert der modifizierten Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung.
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3 zeigt die optimale Temperatur der modifizierten Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung.
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4 zeigt die Thermostabilität der modifizierten Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung.
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5 zeigt die Aktivität der modifizierten Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung und von Wildtyp-Sarcosinoxidase.
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Die Beschreibung beinhaltet den gesamten Inhalt, wie in den Beschreibungen der
japanischen Patentanmeldungen Nr. 2003-121533 ,
2003-396807 und
2004-116345 offenbart, oder Teile davon, wobei diese Patentanmeldungen die Basis für die Prioritätsansprüche der vorliegenden Anmeldung sind.
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Die Erfindung wird nachfolgend ausführlich beschrieben.
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Die Sarcosinoxidasen der vorliegenden Erfindung können durch Modifikation von Genen erhalten werden, die Sarcosinoxidasen codieren. Für eine Modifikation verwendete Sarcosinoxidasen codierende Gene unterliegen keiner besonderen Einschränkung. Spezifische Beispiele für solche Gene beinhalten zum Beispiel ein Sarcosinoxidase-Gen von der Gattung Bacillus (beschrieben in dem veröffentlichten
japanischen Patent Nr. 5-115281 (nicht-geprüfte Anmeldung) (SEQ ID NR:2).
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Alle bekannten Verfahren können als Hilfsmittel zur Modifikation der vorstehenden Gene verwendet werden und zu diesen Verfahren zählen beispielsweise das Inkontaktbringen eines Sarcosinoxidase-Expressionsplasmidvektors (pSOM1), der ein Sarcosinoxidase-Gen von der Gattung Bacillus (beschrieben in dem veröffentlichten
japanischen Patent Nr. 5-115281 (nicht-geprüfte Anmeldung)) umfaßt, mit einem chemischen Mutagen, zum Beispiel Hydroxylamin und salpetrige Säure; ein Verfahren, bei dem dieses Gen einer Punktmutation unterworfen wird, beispielsweise durch Zufallsmutagenese unter Verwendung von PCR oder ortspezifischer Mutagenese, bei der es sich um eine bekannte Technologie der ortsgerichteten Substitution- oder Deletionsmutation handelt, bei der im Handel erhältliche Kits verwendet werden; ein Verfahren zur selektiven Spaltung dieser rekombinanten Plasmid-DNA, der anschließenden Entfernung oder Zugabe des ausgewählten Oligonukleotids und anschließender Verbindung des Plasmids; und ein Verfahren der Oligonukleotid-Mutagenese.
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Im Anschluß daran werden die wie vorstehend beschrieben behandelten rekombinanten DNAs unter Verwendung demineralisierter Säulen, wie z. B. QIAGEN (Funakoshi) zum Erhalt verschiedener rekombinanter DNAs gereinigt.
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Unter Verwendung so erhaltener verschiedener rekombinanter DNAs können zum Beispiel E. coli K12, vorzugsweise E. coli DH5α, E. coli JM109 (TOYOBO), XL1-Blue (STRATAGENE) transformiert oder transduziert werden, wobei Transformanten oder Transduktanten erhalten werden, die Sarcosinoxidase-Gene mit verschiedenen eingeführten Mutationen tragende rekombinante DNAs umfassen.
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Außerdem können zum Beispiel im Fall von Transformanten die folgenden nichtbeschränkenden Verfahren zum Erhalt von Stämmen von den erhaltenen Transformanten verwendet werden, die Sarcosinoxidase mit den geplanten Eigenschaften produzieren, wobei diese Transformanten rekombinante Plasmid-DNAs enthalten, die verschiedene, mutierte Sarcosinoxidase-Gene umfassen.
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Zuerst werden die erhaltenen Transformanten bezüglich jeder Kolonie auf TY-Agarmedien transferiert und gezüchtet. Agenzien wie Ampicillin können zu diesem Zeitpunkt, falls erforderlich, zugegeben werden. Nach der Züchtung werden die Kolonien auf zwei TY-Agarmedien wie vorstehend beschrieben transferiert, wobei Transfermembrane verwendet werden. Zur Produktion von Sarcosinoxidasen wird dann etwa 20 Stunden gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt können, falls erforderlich, Induktoren, wie beispielsweise IPTG zugegeben werden. Nach der Züchtung werden die Kolonien auf jeder Platte mit einem Filter bedeckt, zum Beispiel Hypond N+ (Amersham Pharmacia) und an den Filter angeheftet. Danach werden zur Lyse-Behandlung die Filter mit den Kolonien auf Filterpapiere transferiert, die mit Detergenzien befeuchtet sind. Um ein Zerfließen der Kolonien zu verhindern, werden die Filter nach der Lyse-Behandlung getrocknet.
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Zum Screenen werden die beiden getrockneten Filter dem folgenden Verfahren unterzogen. Zuerst wird einer der Filter auf ein Filterpapier gelegt, das mit MES-Puffer, pH-Wert 6,0 befeuchtet ist, und das ganze über Nacht liegen gelassen. Nach Trocknen des Filters und dessen Einweichen in 500 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,7), der Sarcosin, Peroxidase (oder POD), Toos (oder N-Ethyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)-3-Methylanilin, Natriumsalz, Dihydrat) und 4-Aminoantipyrin enthält, wird die Intensität einer violetten Färbung beobachtet. Der andere Filter wird in der gleichen Lösung eingeweicht (außer, daß 100 mM MES-Puffer, pH-Wert 6,5, verwendet wird) und die Intensität der violetten Färbung beobachtet.
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Die von den vorstehenden zwei Filter nachgewiesenen Ergebnisse werden miteinander verglichen und Kolonien, die in beiden Puffer Aktivität zeigen, abgepickt. Die daraufhin erhaltenen Kolonien werden kultiviert, zur Gewinnung der Bakterien zentrifugiert und durch Ultraschall-Behandlung homogenisiert, wobei Kulturüberstände erhalten werden. Zum Erhalt der gewünschten Mutante werden in diesem Ultraschall-behandelten Kulturüberstand die Restaktivität nach Behandlung bei einem pH-Wert von 6,0 und die Aktivität gegenüber Sarcosin bei einem pH-Wert von 6,5 gemessen. Auf diese Weise können die erfindungsgemäßen mutierten Sarcosinoxidasen erhalten werden.
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Außerdem umfaßt das für die Kultivierung der vorstehenden Microorganismen verwendete Medium zum Beispiel eine oder mehrere Stickstoffquellen aus Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnen- oder Weizen ”Koji”-Exudate, ein oder mehrer anorganische Salze wie Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenchlorid, Eisensulfat oder Mangansulfat und außerdem geeignete Zucker und Vitamine etc., falls erforderlich.
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Außerdem ist es angebracht, den anfänglichen pH-Wert des Mediums zu regulieren, beispielsweise von 7 zu 9. Außerdem ist die Durchführung der Kultivierung beispielsweise zwischen 30 und 42°C, vorzugsweise bei etwa 37°C über einen Zeitraum von 6 bis 24 Stunden bevorzugt, zum Beispiel durch Flüssigkeitskultivierung mit Lüftung unter Rühren, Schüttelkultivierung oder stationäre Kultivierung. Nach der Kultivierung können zur Gewinnung der Enzyme gewöhnliche Maßnahmen verwendet werden, wobei damit modifizierte Sarcosinoxidasen aus diesen Kulturen gewonnen werden können.
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Die kultivierten Zellen werden durch Verfahren, zu denen Filtration und Zentrifugation zählen, aus den Kulturen abgetrennt und gewaschen. Vorzugsweise werden modifizierte Sarcosinoxidasen aus diesen Zellen gewonnen. Die Zellen können ohne weitere Behandlung so wie sie sind verwendet werden, allerdings sind zur Gewinnung der modifizierte Sarcosinoxidasen aus den Zellen verschiedene Verfahren zum Aufbrechen der Zellen bevorzugt, wie beispielsweise mittels eines Beschallungshomogenisators, einer French-Presse und Dyna-Mill, Verfahren zur Lyse der Zellwände unter Verwendung von Enzymen, die die Zellwand degradieren, zum Beispiel Lysozym, oder Verfahren zur Extraktion von Enzymen aus den Zellen unter Verwendung von Detergenzien, wie beispielsweise Triton X-100.
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Zur Isolierung der so aus Roh-Enzymlösungen erhaltenen modifizierten Sarcosinoxidasen können gewöhnliche Verfahren zur Reinigung von Enzymen verwendet werden. Beispielsweise ist die Verwendung einer Ammoniumsulfatpräzipitation bevorzugt, eine Präzipitation mit organischen Lösungsmitteln, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Adsorptionschromatographie, Elektrophorese oder geeignete Kombinationen davon.
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(Enzymaktvität)
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Messungen der Aktivität der Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Die Enzymaktivität, die 1 μmol Harnstoff pro Minute erzeugen kann, ist als 1 Einheit definiert.
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(Herstellung von Reagenzien)
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Die folgenden Lösungen wurden als Reaktionsreagenzien präpariert.
- 1) 0,2 M Sarcosin, 100 mM Tris-HCl, 2 mM KCl, 0,05% Triton-X100, pH-Wert 7,7 (Lösung für Aktivitätsmessung)
- 2) 80 E/ml POD-Lösung
- 3) 0,2% Phenol-Lösung
- 4) 0,2% 4-Aminoantipyrin-Lösung
- 5) 0,3% SDS-Lösung
- 6) 20 mM Tris-HCl, 1 mM KCl, 0,2% RSA, pH-Wert 7,7 (Enzym-Verdünnungsmittel)
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Danach wurden zur Herstellung einer Lösung für Aktivitätsmessung die vorstehenden Lösungen in den folgenden Mengen gemischt.
- 1) 5 ml
- 2) 1 ml
- 3) 2 ml
- 4) 1 ml
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Die Messungen wurden folgendermaßen durchgeführt:
- 1) 0,95 ml der Lösung für die Aktivitätsmessung wird 5 Minuten bei 37°C vorinkubiert.
- 2) 0,05 ml der Enzymlösung (eingestellt auf 0,04 E/ml bis 0,16 E/ml mit dem Enzym-Verdünnungsmittel) wird zugegeben und vermischt.
- 3) Die Reaktion wird 10 Minuten bei 37°C durchgeführt.
- 4) Nach der zehnminütigen Reaktion wird die vorstehend beschriebene 0,3%ige SDS-Lösung eingemischt.
- 5) Nachdem das Ganze 10 Minuten bei 25°C stehen gelassen worden ist, wird die Absorption bei 495 nm gemessen (OD-Probe).
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Leerwerte werden durch Einmischen einer 0,3%igen SDS-Lösung vor Zugabe der Enzym-Lösung gemessen (OD-Leerwert).
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(Aktivitätsumwandlungsformel)
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E/ml = (OD-Probe – OD-Leerwert) × 0,95
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Die vorliegende Erfindung wird nun des weiteren anhand der Beispiele ausführlich beschrieben.
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Beispiel 1
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Rekombinante Plasmid-DNA (pSOM1) (FERM BP-3604) enthaltende E. coli JM109 (pSOM1) wurden in LB-Medium (DIFCO) kultiviert. Nach Gewinnung der bakteriellen Zellen wurde das rekombinante Plasmid pSOM1 extrahiert und unter Verwendung von QIAGEN (QIAGEN) aus diesen Zellen gereinigt. Es wurden ungefähr 100 μg Plasmid erhalten.
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Unter Verwendung des erhaltenen Plasmids wurde mit N-terminalen und C-terminalen Primern (SEQ ID-Nr. 3 und 4) eine zu Fehlern neigende („error-prone”) PCR durchgeführt. Dazu wurde Ex-taq (TAKARA SHUZO) unter Verwendung dieser Primer zur PCR-Amplifikation von pSOM1 bei einer Mangankonzentration von 0,075 mM verwendet.
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Nach Beendigung der Reaktion wurden amplifizierte Fragmente von Sarcosinoxidase-Genen mit verschiedenen eingeführten Mutationen mit den Restriktionsenzymen BamHI und Spe I behandelt und im Anschluß daran wurden diese in das Vektorfragment (das längere Fragment) der Bam HI- und Spe I-Spaltungen von nicht-mutiertem pSOM1 unter Verwendung von T4-Ligase (Boehringer) ligiert.
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Nach Beendigung der Ligation wurden zur Herstellung der Mutanten-Genbank kompetente Hi E. coli JM109 (TOYOBO) mit der Reaktionslösung transformiert.
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Danach wurde die Mutanten-Genbank auf Platten mit TY-Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, transferiert und für einen Tag und eine Nach bei 37°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden auf zwei Platten mit TY-Agarmedium (das 50 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt) unter Verwendung sterilisierter Transfermembranen Replika-Platten hergestellt, danach wurde einen Tag und eine Nacht lang bei 37°C kultiviert.
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Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Platten 20 Minuten auf 4°C abgekühlt, mit Hybond N+ (Amersham Pharmacia) bedeckt und die Kolonien wurden auf Filter transferiert. Zur Lyse der Bakterien wurden die Filter mit den transferierten Kolonien auf ein Filterpapier gelegt, das mit BugBuster (TAKARA SHUZO) befeuchtet war. Die lysierten Filter wurden bei 37°C in einem Thermostat getrocknet.
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Eines der getrockneten Filter wurde auf ein Filterpapier gelegt, das mit 100 mM MES-Puffer, pH-Wert 6,0, befeuchtet war und das Ganze wurde über Nacht bei 25°C stehen gelassen. Nach dieser Prozedur wurde das Filter getrocknet, danach wurde eine Anfärbereaktion durchgeführt, wobei eine Lösung aus 100 mM Sarcosin (TOKYO KASEI KOGYO), 500 mM Tris-HCl (WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES), pH-Wert 7,7, 0,2 mM Toos (DOJINDO LABORATORIES), 0,16 mM 4-Aminoantipyrin (TOKYO KASEI KOGYO) und 10 E/ml POD (KIKKOMAN) verwendet wurde. Stämme, die im Vergleich zu den Kontrollstämmen eine intensivere Färbung auf dem Filter zeigten wurden als Kandidatenstämme, die Enzyme mit ausgezeichneter Stabilität unter sauren Bedingungen produzieren, ausgewählt.
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Das andere Filter wurde auf einem Filterpapier einer Anfärbereaktion unterzogen, das mit einer Lösung aus 0,12 mM Sarcosin (TOKYO KASEI KOGYO), 100 mM MES (DOJINDO LABORATORIES), 0,2 mM Toos (DOJINDO LABORATORIES), 10 E/ml POD (KIKKOMAN) und 0,16 mM 4-Aminoantipyrin (TOKYO KASEI KOGYO) (pH-Wert 6,5) befeuchtet war. Die Stämme, die als Erste eine Steigerung in der Färbung zeigten, wurden als Enzyme mit ausgezeichneter Aktivität unter sauren Bedingungen produzierende Kandidatenstämme ausgewählt. Mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurden Stämme mit ausgezeichneter Stabilität und ausgezeichneter Aktivität unter sauren Bedingungen selektiert.
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Die selektierten Stämme wurden in 2 ml TY-Medium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt. Nach Kultivierung für 18 bis 24 Stunden wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugation gewonnen, das Medium gegen eine Lösung aus 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM KCl, pH-Wert 7,7, ersetzt, eine Homogenisierung mittels Ultraschallbehandlung durchgeführt und zentrifugiert (12000 UpM, 3 Minuten). Die Aktivität des aus der Homogenisierung erhaltenen Überstands wurde unter pH-Wertbedingungen von 7,7 und 6,5 gemessen und die Mutanten, die bei einem pH-Wert von 6,5 einen Aktivitätswert zeigen, der in der Nähe des Aktivitätswerts bei einem pH-Wert von 7,7 war, wurden ausgewählt.
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Danach wurde unter Verwendung des Homogenisationsüberstands des Stammes mit hoher Aktivität bei einem pH-Wert von 6,5 die Stabilität im leicht sauren Bereich bestimmt. 0,1 ml Homogenat wurden zu 0,9 ml einer Lösung aus 100 mM MES, pH-Wert 6,0, gegeben und danach 15 Stunden bei 25°C behandelt. Nach Beendigung der Behandlung wurden 0,1 ml der behandelten Lösung zehnfach mit 0,9 ml einer Lösung aus 200 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,7), 1 mM KCl und 0,2% RSA verdünnt, und die Aktivität wurde bestimmt.
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Mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurden mutierte Enzyme mit verbesserter Aktivität und Stabilität bei einem pH-Wert von 6,5 präpariert. Die modifizierten Sarcosinoxidase-Gene der vorstehenden Mutanten tragende Plasmide wurden mit pSOM3 bezeichnet. Das Plasmid pSOM3 wurde bei dem „International Patent Organism Depository Department at National Institute of Advanced Industrial Science and Technology” als FERM BP-8370 hinterlegt.
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Anhand der Bestimmung der Basensequenz der von den vorliegenden Plasmiden kodierten Sarcosinoxidasen mittels des ”CEQ 2000 DNA Sequencing System” (Beckman Coulter), stellte sich heraus, dass die Sarcosinoxidasen der vorliegenden Erfindung folgende Substitutionen aufwiesen: Der Glutaminsäurerest an Aminosäureposition Nr. 61 zu einem Lysinrest, der Asparaginsäurerest an Aminosäureposition 241 zu einem Glycinrest und der Glutaminsäurerest an Aminosäureposition 324 zu einem Histidinrest (gezeigt in SEQ ID NR. 1).
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Beispiel 2
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E. coli JM109 (pSOM3), die wie vorstehend beschrieben erhaltene modifizierte Sarcosinoxidase-Gene umfassen, wurden unter Schütteln in 100 ml TY-Medium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 0,5% NaC1, pH-Wert 7,5), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, 16 Stunden kultiviert, und danach wurden 10 ml in 1 L TY-Medium, das ähnlich hergestellt worden war (außer, dass es 1 mM IPTG enthielt) eingeimpft. Nach der Impfung wurde das Ganze ungefähr 20 Stunden lang bei 120 UPM und 37°C kultiviert.
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Schritt 1 (Enzym-Rohlösung)
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Nach Beendigung der Kultivierung wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugation von 1 L der Kultur gewonnen und in 50 ml einer Lösung aus 20 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 8,0, suspendiert. Die so erhaltene Zellsuspension wurde durch Ultraschallbehandlung homogenisiert, wobei die Enzym-Rohlösung erhalten wurde.
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Schritt 2 (Ammoniumsulfat-Präzipitation)
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Die Ammoniumsulfat-Präzipitation wurde durch Zugabe von 20% Ammoniumsulfat zu 50 ml Enzym-Rohlösung, die wie vorstehend beschrieben erhalten worden war, durchgeführt. Nach der Ammoniumsulfat-Präzipitation wurde das Präzipitat in einem Puffer aus 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl und 2 mM EDTA gelöst.
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Schritt 3 (DEAE-TOYOPEARL-Ionenaustausch-Chromatographie)
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Die vorstehende Enzym-Rohlösung wurde an eine Säule absorbiert, die mit 300 ml DEAE-TOYOPEARL (TOSO) gepackt war, mit 600 ml einer Lösung aus 100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH-Wert 8,0, gewaschen und danach mit einer Lösung aus 150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH-Wert 8,0 eluiert. Nach Beendigung der Elution wurden die Fraktion mit hoher Reinheit gewonnen, konzentriert und dann gegen 50 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, der 150 mM KCl und 2 mM EDTA enthielt, dialysiert.
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Schritt 4 (Sephadex-G-75-Gelfiltration)
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Zur Durchführung der Gelfiltration wurde eine Säule mit 15 ml Enzymlösung aus Schritt 3 beladen, die mit 200 ml Sephadex G-75 (Pharmacia) gepackt und mit 50 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, gepuffert war, der 150 mM KCl und 2 mM EDTA enthielt. Die Aktivität des erhaltenen gereinigten Enzyms pro OD 280 nm betrug etwa 25 E. Die physikalischchemischen Eigenschaften der erhaltenen Sarcosinoxidase sind nachstehend beschrieben.
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Beispiel 3
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pH-Stabilität
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Nach fünfstündiger Behandlung des vorliegenden Enzyms bei jeweils 25°C in einem der folgenden Puffer wurden die Restaktivitäten gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Aus 1 ist ersichtlich, dass der stabile pH-Bereich zwischen einem pH-Wert von 6,0 und 11,0 lag.
50 mM MES-NaOH (pH-Wert 5,5, 6,0, 6,5)
50 mM Calciumphosphat-Puffer (pH-Wert 6,5, 7,0, 7,5, 8,0)
50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0, 8,5, 9,0)
50 mM CHES-NaOH-Puffer (pH-Wert 9,0, 9,5, 10,0)
50 mM CAPS-NaOH (pH-Wert 10,0, 10,5, 11,0)
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Optimaler pH-Wert
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Bei Durchführung der Enzymreaktionen in Gegenwart von 100 mM Sarcosin, 0,2 mM Toos, 0,16 mM 4-Aminoantipyrin und 10 E/ml Peroxidase in einem der folgenden Puffer wurden die in 2 gezeigten Ergebnisse erzielt. Aus 2 ist ersichtlich, dass der optimale pH-Wert um 6,5 lag.
50 mM MES-NaOH (pH-Wert 5,5, 6,0, 6,5)
50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert 6,5, 7,0, 7,5, 8,0)
50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0, 8,5, 9,0)
50 mM CHES-NaOH-Puffer (pH-Wert 9,0, 9,5, 10,0)
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Optimale Temperatur
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Bei Durchführung der Enzymreaktionen mit 100 mM Sarcosin in Gegenwart von 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,7) bei verschiedenen Temperaturen ergaben sich die in 3 gezeigten Ergebnisse. Aus 3 ist ersichtlich, dass die optimale Temperatur um 60°C lag.
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Thermostabilität
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Zur Bestimmung der Thermostabilität wurden zehnminütige Hitzebehandlungen bei verschiedenen Temperaturen unter Verwendung von 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert 7,5) durchgeführt. Die Ergebnisse bezüglich Thermostabilität sind in 4 gezeigt. Das vorliegende Enzym war bis zu etwa 50°C stabil.
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Km-Wert
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Die Km-Werte bei verschiedenen pH-Werten, die anhand des „Lineweaver-Burk”-Berechnungsverfahrens errechnet wurden, sind nachstehend angegeben. Außerdem wurde die Reaktion unter Verwendung von 50 mM MES-Puffer (für die pH-Werte 6,5 und 7,0) oder Tris-HCl-Puffer (für einen pH-Wert von 7,7) durchgeführt, wobei als Anfärbemittel eine Lösung aus 0,2 mM Toos, 0,16 mM 4-Aminoantipyrin und 10 E/ml Peroxidase verwendet wurde. Es ergaben sich für die verschiedenen pH-Werte Km-Werte von 5,9 mM (pH-Wert 6,5), 3,8 mM (pH-Wert 7,0) und 3,9 mM (pH-Wert 7,7).
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Beispiel 4
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Jeweils 1,2 E/ml Wildtyp-Sarcosinoxidase und modifizierte Sarcosinoxidase wurden bei 37°C und einem pH-Wert von 6,5 einer Reaktion mit 5 μM Sarcosin unterworfen. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung war 50 mM MES, 60 mM NaCl, 0,2 mM Toos, 0,16 mM 4-Aminoantipyrin und 20 E/ml Peroxidase. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Aus 5 ist ersichtlich, dass modifizierte Sarcosinoxidase im Vergleich zum Wildtyp eine signifikant gute Aktivität bei einem pH-Wert von 6,5 aufwies.
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Beispiel 5
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Wildtyp-Sarcosinoxidase und modifizierte Sarcosinoxidase wurden 17 Stunden lang in 100 mM MES (pH-Wert 6,0) bei 25°C stehen gelassen. Die Restaktivität nach der Behandlung war 13,6% für das Wildtyp-Enzym und 72,8% für das modifizierte Enzym.
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Alle hier zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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