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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine hitzestabile Kreatinamidinohydrolase
und eine Verfahren zu deren Herstellung.
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Die
Kreatinamidinohydrolase ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Kreatin
katalysiert, um Sarcosin und Harnstoff zu ergeben, das verwendet
werden kann, um eine Menge an Kreatin im menschlichen Serum oder
Urin zu bestimmen, was als ein diagnostisches Mittel für verschiedene
Krankheiten wie Nierenkrankheiten und dergleichen brauchbar ist.
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Aus
dem Grund, dass eine Kreatinamidinohydrolase von Alcaligenes, die
einen Km-Wert von ungefähr 13
mM und eine Hitzestabilität
von etwa 45°C
aufweist, einen niedrigeren Km-Wert zeigt, und darüber hinaus unter
Berücksichtigung
der Verteilung und der Umsätze
des Mittels in flüssiger
Form ist eine Kreatinamidinohydrolase gesucht worden, die eine Stabilität bei einer
erhöhten
Temperatur aufweist. Darüber
hinaus endeten Versuche, die Hitzestabilität der Kreatinamidinohydrolase
durch genetische Modifikation zu verbessern, konventionell häufig mit
den Ergebnissen, die denselben Km-Wert wie ein ursprünglicher
Stamm oder sogar einen verringerten Wert zeigen, und es hat keine
Fälle gegeben,
wo die Hitzestabilität
und der Km-Wert davon verbessert waren.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine hitzestabile Kreatinamidinohydrolase
und ein Verfahren zu deren Herstellung bereit zu stellen.
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Die
vorliegenden Erfinder haben weiterhin untersucht, das obige Problem
zu lösen,
und fanden, dass eine hitzestabile Kreatinamidinohydrolase durch
Modifizieren eines Gens einer Alcaligenes-Kreatinamidinohydrolase
verfügbar
war (
JP-A-8-89255 (1996)),
was so die vorliegende Erfindung vervollständigt.
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Genau
liefert die vorliegende Erfindung eine isolierte hitzestabile Kreatinamidinohydrolase,
die aus E. coli JM109 (pUCE100 B-40) (Hinterlegungsnummer FERM BP-6867)
erhältlich
ist, die die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:
- (a) hydrolysiert 1 Mol Kreatin, um 1 Mol Sarcosin
und 1 Mol Harnstoff zu ergeben;
- (b) hat eine Substratspezifität für Kreatin;
- (c) hat einen optimalen pH-Bereich von 7,0 bis 8,0;
- (d) hat einen stabilen pH-Bereich von 4,0 bis 11,0;
- (e) hat das Temperaturoptimum von etwa 45°C;
- (f) ist hitzestabil bei 53°C;
und
- (g) hat ein Molekulargewicht von 92.000 Da (bestimmt durch Gelfiltration).
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In
einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen
der hitzestabilen Kreatinamidinohydrolase, das Inkubieren eines
Mikroorganismus, der zum Herstellen der obigen Amidinohydrolase
fähig ist,
und Gewinnen dieser Amidinohydrolase aus der Kultur umfasst, wobei
der Mikroorganismus ein E. coli JM109-Stamm (pUCE100 B-40) (Hinterlegungsnummer
FERM BP-6867) ist.
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1 zeigt
das pH-Optimum des Enzyms der Erfindung.
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2 zeigt
den optimalen Temperaturbereich des Enzyms der Erfindung.
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3 zeigt
den stabilen pH-Bereich des Enzyms der Erfindung.
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4 zeigt
die Hitzestabilität
des Enzyms der Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung wird unten im Detail beschrieben werden.
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Die
Kreatinamidinohydrolase kann zum Beispiel wie folgt erhalten werden.
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In
einem Verfahren kann eine Mutante durch Aussetzen eines Alcaligenes-Bakteriums gegenüber einer
Bestrahlung wie einem UV-Licht oder durch Behandeln dieses Bakteriums
mit chemischen Mutagenen (wie salpetriger Säure, Hydroxylamin usw.), um
Mutanten zu erhalten, und Auswählen
einer Mutante, die die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase-Aktivität der vorliegenden
Erfindung aufweist, von den erhalten Mutanten gemäß eines
Verfahrens zum Bestimmen von Enzymeigenschaften wie des Verfahrens,
das unten erwähnt
ist, künstlich
hergestellt werden. Die Mutante mit der Aktivität von Interesse wird in einem
geeigneten Medium inkubiert, um die dadurch hergestellte hitzestabile
Kreatinamidinohydrolase zu gewinnen.
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In
einem alternativen Verfahren kann eine DNA, die die hitzestabile
Kreatinamidinohydrolase codiert, von einem Alcaligenes-Bakterium
oder einem mutanten Stamm davon gemäß üblichen Verfahren erhalten werden,
oder DNA, die die Kreatinamidinohydrolase codiert, kann mit einer
Mutagenese-Behandlung in DNA mutiert werden, die die hitzestabile
Kreatinamidinohydrolase codiert.
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Zum
Beispiel kann die DNA von Interesse wie folgt erhalten werden.
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Genomische
DNA oder mRNA wird vom obigen Bakterium genommen, und im Fall der
genomischen DNA wird diese DNA in eine geeignete Länge geschnitten,
um sie in einen geeigneten Vektor zu inkorporieren, um eine genomische
DNA-Genbank zu bilden, während
im Fall von mRNA mit einer reversen Transkriptase, gefolgt vom Durchführen einer
immunologischen Reaktion mit einem Anti-Kreatinamidinohydrolase-Antikörper, einer
Hybridisierung mit einer markierten Sonde mit einer spezifischen
Sequenz von einer bekannten Gensequenz für die Kreatinamidinohydrolase
oder einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern
mit dieser spezifischen Sequenz eine cDNA-Genbank gebildet wird,
wobei die DNA oder cDNA, die das Kreatinamidinohydrolase-Gen enthält, ausgewählt oder
selektiv amplifiziert werden kann. Wenn nötig, kann dieses Gen in einen
Vektor inkorporiert werden, um in einen bakteriellen Wirt transformiert
zu werden, der dann inkubiert wird, wodurch das Gen von Interesse
vermehrt wird. Darüber
hinaus wird, wenn erfordert, eine Restriktionskarte des erhaltenen
Gens gemacht, und dieses Gen wird unter Anwenden der Restriktionskarte
gespalten, um ein Fragment zu ergeben, das das Kreatinamidinohydrolase-Gen
enthält.
Daher ermöglicht
das Inkorporieren des erhaltenen Gens in einen geeigneten Vektor
(vorzugsweise ein Plasmid) und Anwenden einer Mutagenese darauf,
wie unten erwähnt,
dass die DNA, die die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase von Interesse
codiert, erhalten wird.
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Alternativ
kann, wenn eine bekannte Transformante, die ein Kreatinamidinohydrolase-Gen
enthält,
erhältlich
ist, ein Vektor (insbesondere ein Plasmid), der das Gen von Interesse
enthält,
davon gemäß den üblichen
Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel kann das Plasmid, das das
Gen von Interesse enthält,
von E. coli JM109 (pUCE 100) (das unter dem Budapester Vertrag mit
dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency
of Industrial Science and Technology (1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaragi,
Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4803 hinterlegt worden
ist), das eine rekombinante Plasmid pUCE100-DNA (
JP-A-8-89255 (1996)) bewahrt,
die ein Kreatinamidinohydrolase-Gen vom Alcaligenes sp. KS-85-Stamm
enthält,
der eine Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:1 codiert, durch Verwenden von QIAGEN (Funakoshi,
Japan) oder dergleichen extrahiert und gereinigt werden. Die DNA,
die die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase von Interesse codiert,
kann durch Mutagenese des erhaltenen Plasmids, wie unten erwähnt, erhalten
werden.
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Vektor-DNA,
die in der Erfindung verwendbar ist, schließt eine Bakteriophagen-Vektor-DNA,
eine Plasmid-Vektor-DNA usw. ein. Um genau zu sein, Vektoren wie
pUC118 (Takara Shuzo, Japan) und pBluescript (Stratagene, U.S.A.)
werden bevorzugt.
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Ein
Verfahren zum Erhalten eines hitzestabilen Kreatinamidinohydrolase-Gens
durch eine Mutagenese-Behandlung des rekombinanten Plasmids, das
eine DNA enthält,
die die Kreatinamidinohydrolase codiert, wie in den obigen Vorgehensweisen
erhalten, schließt
eine Punktmutation, wo die rekombinante Plasmid-DNA zufällig mit
einem chemischen Mutagen wie Hydroxylamin oder salpetriger Säure oder
durch PCR und orts-spezifische Mutagenese mutiert wird, wobei bekannt
ist, dass die Technik unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Kits orts-spezifische Mutationen bewirkt, die Substitutionen oder
Deletionen umfassen; ein Verfahren, wo die oben erwähnte rekombinante
Plasmid-DNA selektiv gespalten wird und die gespaltene DNA nach
einer Deletion oder Addition eines selektierten Oligonucleotids
verbunden wird; und ein Oligonucleotid-Mutagenese-Verfahren ein,
ist aber nicht darauf limitiert. Was das Mutagenese-Verfahren durch
Gentechnik betrifft, kann zum Beispiel auf J. Sambrook et al., Molecular
Cloning A Laboratory Manual (Zweite Aufl.), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989, Bezug genommen werden. So kann das Plasmid, dass eine DNA
enthält,
die ein Protein codiert, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Mutationen
(d.h. Deletionen, Substitutionen, Insertionen oder Additionen von
einem oder mehreren Aminosäurerest(en))
bezüglich
einer Aminosäuresequenz
von z.B. SEQ ID NO:1 umfasst und eine hitzestabile Kreatinamidinohydrolase-Aktivität aufweist,
erhalten werden.
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Die
rekombinante DNA, die wie oben behandelt wurde, kann unter Verwendung
einer entsalzenden Säule,
QIAGEN (Funakoshi, Japan), oder dergleichen gereinigt werden, um
verschiedene rekombinante DNAs zu erhalten.
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Unter
Verwendung der so erhaltenen DNAs können E. coli K12, vorzugsweise
E. coli JM 109 (TOYOBO, Japan) oder XL1-Blue (Funakoshi, Japan)
oder dergleichen transformiert oder transduziert werden, um transformierte
oder transduzierte Mikroorganismen zu erhalten, die rekombinante
DNAs enthalten, die verschiedene Kreatinamidinohydrolase-Genfragmente
tragen.
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Im
Fall der transformierten Mikroorganismen kann zum Beispiel das folgende
Verfahren angepasst werden, um von den erhaltenen Transformanten
(in denen die rekombinanten Plasmid-DNAs enthalten sind, die verschiedene
hitzestabile Kreatinamidinohydrolase-Gene umfassen) einen Stamm
zu erhalten, der die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase produziert,
die gewünschte
Eigenschaften hat (hitzestabil ist und einen gesenkten Km-Wert zeigt).
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Zuerst
wird jede Kolonie der oben erhaltenen Transformanten in einem flüssigen TY-Medium
(mit Zugabe von 50 μg
Ampicillin und 1 mM IPTG) inkubiert, um verschiedene Arten von hitzestabiler
Kreatinamidinohydrolase, die in den rekombinanten Plasmid-DNAs codiert
werden, induzierbar zu produzieren. Nach der Inkubation wird die
erhaltene Kultur einer Ultraschall-Desintegration und Extraktion
ausgesetzt, um den groben Enzymextrakt für 30 min bei 50°C hitzezubehandeln,
gefolgt von einer Messung der Rest-Aktivität und des Km-Werts durch den
Lineweaver-Burk-Plan. Darüber
hinaus werden die gemessenen Ergebnisse von jeder Mutante mit jenen
eines Wildtyp-Proteins verglichen, das auf dieselbe Weise extrahiert,
behandelt und gemessen worden ist, wodurch die Transformante von
Interesse ausgewählt
wird.
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Um
unter Verwendung der oben erhaltenen transformierten oder transduzierten
Mikroorganismen, die zum Herstellen der hitzestabilen Kreatinamidinohydrolase
fähig sind,
vorzugsweise unter Verwendung eines Stamms, der zur Gattung Escherichia
gehört,
eine hitzestabile Kreatinamidinohydrolase herzustellen, kann das
folgende Verfahren angewendet werden.
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Der
obige Mikroorganismus kann durch ein übliches Festkultur-Verfahren
inkubiert werden, aber die Anwendung eines Flüssigkultur-Verfahrens wird
bevorzugt.
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Ein
Medium, das für
das Inkubieren des obigen Mikroorganismus verwendbar ist, umfasst
mindestens eine Stickstoffquelle wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt,
starre Maisflüssigkeit,
das Ausströmen
von Sojabohne oder Weizen-Koji usw. mit Zugabe von mindestens einem
anorganischen Salz wie Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat,
Magnesiumsulfat, Eisenchlorid, Eisensulfat oder Mangansulfat oder optionell
Saccharid-Materialen, Vitaminen usw.
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Das
Anpassen des anfänglichen
pH-Werts des Mediums auf 7-9 ist angebracht. Die Inkubation wird vorzugsweise
bei 30°C-42°C, vorzugsweise
um 37°C,
für 6-24
Stunden durch eingetauchte Belüftungs-Bewegungs-Kultur,
Schwenk-Kultur,
statische Kultur usw. durchgeführt.
Nach der Inkubation können übliche Verfahren
zum Gewinnen von Enzymen verwendet werden, um die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase
aus der Kultur zu gewinnen.
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Die
Zellen werden aus der Kultur durch Aussetzen derselben gegenüber Filtration,
Zentrifugation und dergleichen separiert und dann gewaschen. Die
hitzestabile Kreatinamidinohydrolase wird vorzugsweise aus den Zellen
gewonnen. In solch einem Fall können
die Zellen verwendet werden wie sie sind, es wird jedoch bevorzugt,
die Kreatinamidinohydrolase daraus durch das folgende Verfahren
zu gewinnen; ein Verfahren, in dem die Zellen mit verschiedenen
Desintegratoren wie einem Ultraschall-Desintegrator, einer französischen Presse,
Dynamill usw. zersetzt werden; ein Verfahren, in dem die Zellwand
der Zellen mit solch einem Enzym wie Lysozym lysiert wird und; oder
ein Verfahren, in dem ein Enzym aus den Zellen mit einem oberflächenaktiven
Mittel wie TritonX-100 extrahiert wird.
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Um
die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase aus der so erhaltenen groben
Enzymlösung
zu isolieren, können übliche Verfahren
zum Reinigen eines Enzyms verwendet werden. Zum Beispiel wird eine
geeignete Kombination von Ammoniumsufat-Aussalzen, organischer Lösungsmittel-Präzipitation,
Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie,
Adsorptions-Chromatographie,
Elektrophorese usw. bevorzugt.
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Die
physikochemischen Eigenschaften der erhaltenen hitzestabilen Kreatinamidinohydrolase
sind wie folgt:
- (1) Wirkung: Das Enzym hydrolysiert
1 Mol Kreatin, um 1 Mol Sarcosin und 1 Mol Harnstoff zu ergeben;
- (2) Substratspezifität:
Das Enzym hat eine Substratspezifität für Kreatin;
- (3) pH-Optimum: Die Enzymreaktion bei 37°C für 10 min bei jedem pH-Wert
unter Verwendung der folgenden Puffer: 50 mM Natriumacetat-Essigsäure-Puffer
(pH 4,0-5,5), 50
mM MES-Puffer (pH 5,5-6,5), 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5-8,0), 50
mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0-9,0), 50 mM CHES-Puffer (pH 9,0-10,0)
und 50 mM CAPS-Puffer
(pH 10,0-11,0), weist auf die relative Aktivität hin, gezeigt in 1.
Wie daraus gesehen wird, ist das pH-Optimum des Enzyms 7,0-8,0.
- (4) Temperaturoptimum: Die Enzymaktivität, gemessen bei verschiedenen
Temperaturen unter Verwendung einer Reaktionslösung mit derselben Zusammensetzung
wie die, die im unten erwähnten
Test verwendet wird, ist in 2 gezeigt.
Wie daraus gesehen wird, ist das Temperaturoptimum um 45°C.
- (5) Stabiler pH-Bereich: Die Rest-Aktivität des Enzyms, bestimmt nach
einer Behandlung bei 25°C
für 17 Stunden
bei pH 4,0-11.0 unter Verwendung der folgenden Pufferlösungen:
50 mM Natriumacetat-Essigsäure-Puffer
(pH 4,0-5,5), 50 mM MES-Puffer (pH 5,5-6,5), 50 mM Phosphatpuffer
(pH 6,5-8,0), 50 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 8,0-9,0), 50 mM CHES-Puffer (pH 9,0-10,0) und 50 mM CAPS-Puffer
(pH 10,0-11,0), ist in 3 gezeigt. Wie daraus gesehen
wird, ist der stabile pH-Bereich pH 4,0-11,0.
- (6) Hitzestabilität:
Die Hitzestabilität,
gemessen nach der Behandlung bei jeder Temperatur für 30 min
unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), ist in 4 gezeigt.
Das Enzym der Erfindung ist bis zu ungefähr 53°C stabil.
- (7) Test zum Messen der Enzymaktivität: Die Enzymaktivität wird unter
den folgenden Bedingungen gemessen. Hierin zeigt eine verwendete
Einheit die Enzymaktivität
an, die 1 μMol
Urin pro Minute herstellt.
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(Vorbereitung der Reagenzien)
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Die erste Lösung: Substratlösung
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6,63
g Kreatin wird in 500 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,7) gelöst.
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Die zweite Lösung: Farbentwicklungslösung
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10
g p-Dimethylaminobenzaldehyd wird in 500 ml Ethanol von Spezial-Güteklasse gelöst, das
mit dem Gemisch von 575 ml Harz-behandeltem Wasser und 75 ml konzentrierter
Salzsäure
gemischt wird.
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(Messungs-Vorgehensweise)
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- 1) Vorinkubierung von 0,9 ml der ersten Lösung bei
37°C für 5 min.
- 2) Mischen von 0,1 ml einer Enzymlösung (angepasst auf ungefähr 1-2 E/ml)
dazu, um eine Reaktion bei 37°C
für 10
min zu erlauben
- 3) Mischen von 2 ml der obigen zweiten Lösung
- 4) Stehenlassen des Gemisches bei 25°C für 20 min, gefolgt von Messen
der Absorptionsfähigkeit
bei 435 nm (OD-Probe)
- 5) Der Leerwert wurde gemessen durch: Inkubieren von 0,9 ml
der ersten Lösung
bei 37°C
für 10
min; Dazumischen von 2 ml der obigen zweiten Lösung; weiteres Dazumischen
von 0,1 ml der Enzymlösung;
Stehenlassen des Gemischs bei 25°C
für 20
min; und Messen der Absorption bei 435 nm (OD Leer)
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(Berechnung der Aktivität)
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E/ml = Δ OD × 18,06 × Verdünnungsrate
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Hierin
ist Δ OD
= OD Probe-OD Leer, und 18,06 ist ein Koeffizient, der aus einer
Eichkurve von Urin berechnet wurde.
- (8) Km-Wert:
Der Km-Wert des Enzyms, gemessen mit dem oben erwähnten Testverfahren,
war 8,6 mM (für
Kreatin), bestimmt aus dem Lineweaver-Burk-Plan.
- (9) Molekulargewicht: 92.000 Da (bestimmt durch das Gelfiltrations-Verfahren).
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Die
Ausführungsformen
der Erfindung werden unten durch Illustration beschrieben werden,
aber der Rahmen der Erfindung soll nicht auf diese beschränkt sein.
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Beispiel 1
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(1) Herstellung einer rekombinanten Plasmid
pUCE100-DNA
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E.
coli JM109(pUCE100)(FERM BP-4803) wurde in 20 ml TV-Medium (1% Bacto-Trypton,
0,5% Pepton, 0,25% NaCl) beimpft, das bei 37°C für 18 Stunden unter Schwenken
inkubiert wurde, wodurch die Kultur erhalten wurde. Die Kultur wurde
dann einer Zentrifugation bei 6000 Upm für 10 min ausgesetzt, um die
Zellen zu ernten. Eine rekombinante Plasmid pUCE100-DNA wurde daraus
extrahiert und mit QIAGEN tip-100 gereinigt, um 70 μg der DNA
zu erhalten.
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(2) Mutagenese
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XL-1-RED
(STRATAGENE) (bei der Proliferation erfolgen leicht Fehler in der
Plasmid-Replikation, was in einer Mutagenese resultiert) wird mit
2 μg von
100 μg der
obigen rekombinanten Plasmid-DNA gemäß dem Verfahren von D.M. Morrison
(Method in Enzymology, 68, 326-331, 1979) transformiert, um ungefähr 1500 Transformanten
zu erhalten. Unter ihnen wurden 500 Kolonien gemeinsam in 20 ml
des TV-Mediums beimpft und bei 37°C
für 18
Stunden unter Schwenken inkubiert. Nach der Inkubation wurde die
Kultur einer Zentrifugation bei 6000 Upm für 10 min ausgesetzt, um die
Zellen zu ernten. Das Plasmid pUCE100 wurde daraus extrahiert und
mit QIAGEN tip-100 (Funakoshi, Japan) gereinigt, um 70 μg einer mutanten
rekombinanten Plasmid pUCE100-DNA zu erhalten. Der E. coli JM109-Stamm
(TOYOBO, Japan) wurde unter Verwendung von 5 μg dieses Plasmids transformiert,
um ungefähr
2000 Transformanten, die das mutierte Plasmid einbehalten, zu erhalten.
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(3) Screenen einer Mutante, die die verbesserte
Hitzestabilität
und die Reaktivität
für ein
Substrat aufweist
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Zuerst
wird jede Kolonie der Transformanten, die im Obigen erhalten wurden,
in 2 ml TV-Medium (mit Zugabe von 50 μg Ampicillin und 1 mM IPTG)
inkubiert, wodurch die Induktion der verschiedenen hitzestabilen Kreatinamidinohydrolase-Gene, die im Plasmid
enthalten sind, ermöglicht
wird. Nach der Inkubation wurde die erhaltende Kultur einer Ultraschall-Desintegration
und einer Extraktion ausgesetzt, und der grobe Enzymextrakt wurde
bei 50°C
für 30
min hitzebehandelt, um die Rest-Aktivität zu bestimmen;
und der Km-Wert wurde durch den Lineweaver-Burk-Plan in Bezug auf
die Enzyme mit guter Hitzestabilität gemessen. Weiterhin wurde das
gemessene Ergebnis von jeder Mutante mit jenem einer Wildtyp-Kreatinamidinohydrolase
verglichen, die auf dieselbe Weise extrahiert und gemessen wurde,
um eine Mutante auszuwählen,
die für
den Zweck adäquat war,
so wurde die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase aus einer Mutante,
E. coli JM109 (pUCE100 B-40),
erhalten.
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E.
coli JM109 (pUCE100 B-40) ist unter dem Budapester Vertrag mit dem
National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology (1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaragi, Japan)
unter der Hinterlegungsnummer von FERM BP-6867 hinterlegt worden.
(Diese Mikroorganismus-Hinterlegung wurde am 2. September, 1999
als eine internationale Hinterlegung von der nationalen Hinterlegung FERM
P-15971, hinterlegt am 28. November, 1996, transferiert).
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Beispiel 2
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Gewinnung des hitzestabilen Kreatinamidinohydrolase-Enzyms
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Die
Mutante E. coli JM109 (pUCE100 B-40), die im Beispiel 1 erhalten
wurde, wurde für
16 Stunden unter Schwenken in einer Sakaguchi-Flasche, enthaltend
100 ml TV-Medium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 0,5%
NaCl, pH 7,5), angereichert mit 1 mM Isopropyl-β-D-Galactosid, inkubiert, die
dann in einen 30 L-Fermentierer,
enthaltend 20 L TV-Medium, das auf dieselbe Weise hergestellt wurde,
Flammen-ausgesät
wurde. Nach dem Aussäen
wurde sie bei 37°C
bei 450 Upm für
20 Stunden unter einer Belüftung
von 20 L/min inkubiert.
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Nach
der Inkubation wurden die Zellen aus den 20 L des Kulturgemisches
unter Verwendung von Microza (Asahi Chemical Industry, Japan, PW-303)
geerntet und mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen, dann in
10 L desselben Puffers suspendiert.
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Schritt 1 (Herstellung der groben Enzymlösung):
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20
g Lysozym (in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 100 ml) und 1 L 0,55
M EDTA, pH 8,0, wurden zu der obigen Zellsuspension (10 L) zugefügt und gemischt,
die bei 30°C über Nacht
stehen gelassen wurde, dann behandelt, um die Nucleinsäuren durch
tropfenweises Zugeben von 500 ml 5% Protamin-Lösung in Wasser (pH 8,0) unter
Rühren
zu entfernen. Diese Lösung
wurde gegen 10 mM CAPS-NaOH-Puffer (pH 10,0) dialysiert (hierin
nachstehend als Puffer A bezeichnet).
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Schritt 2 (DEAE-Zellulose-Behandlung):
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Ungefähr 3 kg
(Nassgewicht) Zellulose wurden zu der dialysierten Lösung (ungefähr 28 L)
zugefügt und
gemischt, wodurch die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase daran
adsorbiert wurde, dann wurde die DEAE-Zellulose in Puffer A, enthaltend
5% Glycerin und 0,05% 2-Mercaptoethanol, gewaschen; und die hitzestabile
Kreatinamidinohydrolase wurde mit Puffer A, enthaltend 0,5 M KCl,
eluiert, gefolgt von einer Ultrafiltration.
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Schritt 3 (DEAE-Sepharose CL-4B (Pharmacia)-Behandlung):
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Ungefähr 1,0 kg
(Nassgewicht) von DEAE-Sepharose CL-4B, die in Puffer A gepuffert
wurde, wurde zu dem Kondensat (ungefähr 1,0 L) von Schritt 2 zugefügt und gemischt,
wodurch die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase daran adsorbiert
wurde; dann wurde die DEAE-Sepharose CL-4B in Puffer A, enthaltend
0,05 M KCl, gewaschen; und die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase
wurde mit Puffer A eluiert, gefolgt von einer Ultrafiltration.
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Schritt 4 (Sephacryl S-200 (Pharmacia)-Behandlung:
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Das
Kondensat (ungefähr
1,0 L) wurde auf Sephacryl S-200, gefüllt in einer Säule, molekulargesiebt, um
2,2 g der aktiven Fraktion zu gewinnen. Die spezifische Aktivität der Fraktion
war 9 E/OD280nm. Die Eigenschaften des erhaltenen Enzyms waren dieselben
wie jene, die im Obigen erwähnt
wurden.
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Die
vorliegende Erfindung brachte hervor, dass die hitzestabile Kreatinamidinohydrolase
effizient hergestellt werden kann.
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Während die
Erfindung durch Fachleute mit verschiedenen Modifikationen oder
Variationen innerhalb des Rahmens der Erfindung, der in den angefügten Ansprüchen oder Äquivalenten
davon beschrieben ist, ausgeführt
werden kann, sollen solche Modifikationen oder Variationen auch
in die vorliegende Erfindung eingeschlossen werden.
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Alle
Veröffentlichungen
und Patent-Anmeldungen, die hierin zitiert werden, sind hierin durch
Bezugnahme in ihrer Gänze
inkorporiert.
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