CN110029094B

CN110029094B - 一种突变的肌氨酸氧化酶及其在肌酐检测中的应用

Info

Publication number: CN110029094B
Application number: CN201910157664.1A
Authority: CN
Inventors: 华权高; 梁艳; 龚婷; 吴年芬; 伍卫姣; 黄爱; 沈鹤霄; 赵畅
Original assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Current assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: CN110029094A

Abstract

一种低Km值的突变型肌氨酸氧化酶及其在血清肌酐检测试剂盒中的应用,该突变型肌氨酸氧化酶在野生型变铅青链霉菌肌氨酸氧化酶基础上就行了优化，其相对于现有试剂盒所用的肌氨酸氧化酶，极大的降低了酶的Km值，提高了单位酶的活性和亲和力，缩短了试剂盒的反应时间，极大的提高了检测效率。

Description

一种突变的肌氨酸氧化酶及其在肌酐检测中的应用

技术领域

本发明涉及临床医学检验领域，具体涉及一种突变的肌氨酸氧化酶及其在血清肌酸酐检测试剂盒中的应用。

背景技术

肌酐(Cr)是一种低分子量含氮化合物，是肌肉在人体内的代谢产物。血清肌酐通常用于晚期肾脏疾病的临床检测。测定Cr的方法主要有化学法和酶法，化学法主要是苦味酸法，特异性较差；酶法主要有三种：肌酐氨基水解酶法、肌氨酸氧化酶法、肌酐亚氨基水解酶法。酶法特异性较好，可消除内源性肌酐的干扰。

肌酐在肌酐氨基水解酶的作用下水解成肌酸，肌酸在肌酸脒基水解酶的作用下生成肌氨酸和尿素，其中产物肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下生成肌氨酸、过氧化氢和甲醛。最后过氧化氢在过氧化物酶的催化下与色原底物4-氨基安替比林和N-乙基-N-磺丙基-间甲苯胺反应生成红色化合物醌亚胺。由于醌亚胺在波长546nm处有最大吸收峰,所以在一定底物浓度范围内, 546nm处吸光度的变化值与样本中肌酐的含量成正比。

为了满足人们对测定用酶的需求,降低肌氨酸氧化酶在工业生产中需要诱导物的成本。人们从两个角度来寻找克服这一问题的办法: 一是筛选产肌氨酸氧化酶的突变菌株: 二是研究肌氨酸氧化酶基因s( ox )结构, 经克隆后构建高产菌株。此外还希望通过对基因的改造, 改善酶学性质, 从而得到产酶量高、K m 值小、酶性质稳定的菌株, 以满足实际的需要。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题而提供。

本发明通过以下技术方案实现：根据文献中说明，来自变铅青链霉菌的野生型肌氨酸氧化酶的酶活性是最高的，Km值是目前的所有肌氨酸氧化酶最低的，这一点可以应用到肌酐检测试剂盒上，但是由于该酶的野生型特异性不高，除了对肌氨酸有催化活性外，还能作用于其他N -甲基氨基酸，其中以肌氨酸为底物的K m值为0.91mmol/L。本发明采用变铅青链霉菌野生型肌氨酸氧化酶基因为模板，克隆后采用基因定向进化进行定向突变处理，即进行连续随机突变和DNA改组实验，得到一种高活性高度特异性的突变型肌氨酸氧化酶基因，结合基于T7噬菌体裂解-过氧化物酶偶联活性筛选技术，最终获得催化效率提高2倍高度特异性的新型肌氨酸氧化酶突变体。

该基因的核苷酸序列全长为1710bp，编码389个氨基酸。本发明的突变点的位置和突变方式是采用定向进化后的基因筛选得到高活性和高特异性的突变体，根据该基因的测序结果，发现突变肌氨酸氧化酶在野生型的基础上含有以下位置的突变，I8C,S45G,E71Q,V84I,G89D,V137A,A155S,V173E,P228R,K264E,T320S,K349Q,G372R，得到的突变体酶在特异性上得到了优化，不再对其他N -甲基氨基酸有催化作用，只单一的针对溶液中的肌氨酸起催化作用，可用于肌酐检测试剂盒的检测。将得到的肌氨酸氧化酶突变体编码基因连接到载体pGEX-6p-1，转化到E.coli BL21，利用GST亲和层析系统纯化该蛋白，利用过氧化物酶偶联活性筛选法测定其对肌氨酸催化活性，发现该蛋白质对肌氨酸的比活力为5U/mg，底物亲和力为Km =0.43mM。说明该突变体有非常好的肌氨酸催化活性，在肌酐检测试剂盒方面有较大的应用价值。

获取变铅青链霉菌肌氨酸氧化酶编码基因（SOX）的原始序列。根据GenBank数据库中已报道相关序列设计特异性引物，利用CTAB/NaCl法抽提变铅青链霉菌的基因组DNA，以其为模板，进行PCR扩增，得到长度为1.7kb的目的基因（SOX），回收后经BamHI和XhoI双酶切，连接到表达载体pGEX-6p-1上，得到重组质粒pGEX-6p-1-SOX，测序验证后转入E.coliBL21进行蛋白诱导表达，纯化。其表达的蛋白质为肌氨酸氧化酶（Sarcosine oxidase,SOX），长度为389个氨基酸。为确定该基因具有肌氨酸催化活性，所以测定了此酶的相关活性。

为了提高肌氨酸氧化酶对肌氨酸的酶活和特异性，对其进行体外定向进化，其操作过程如下：以重组质粒pGEX-6p-1-SOX作为随机突变模板，进行易错PCR反应，获得的随机突变基因片段，连接到pGEX-6p-1载体上，转入大肠杆菌DH5α，构建得到突变文库。挑取克隆子至96孔深孔板液体培养到对数生长期，加入T7噬菌体和IPTG（至终浓度为0.1mM），在37℃条件下振荡培养6h后，吸取上清159μL加入到96孔微孔板中，加入肌氨酸至终浓度50mM，以及1μL 5unit/mL辣根过氧物酶、20μL 0.32mg/mL肌氨酸或者N-甲基-D-天冬氨酸，N-甲基-D (L)-丙氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、N-甲基-D (L)-缬氨酸，2.5mmol/L 4-氨基安替比林1μL和1.2mmol/L二水合N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐5μL，混匀后放置25℃反应8h。利用酶标仪检测546nm吸光值，分别选取高于对照组（野生型SOX）的克隆子和只针对肌氨酸特异性催化的克隆子，进行下一轮复筛和诱变。筛选了3000个突变体后，得到8个活性高于野生型的突变体和12个特异性针对肌氨酸催化的突变体。以该20个突变体为亲本序列，利用DNA shuffling技术构建重组文库，再次筛选了500个克隆子后，得到3个突变体，命名为SOX1、SOX2、SOX3，分别对其进行酶活测定，实验结果表明，活性最高的突变体为SOX3，鉴于其底物催化活性已从所有N-甲基氨酸转变成只针对肌氨酸，将该蛋白质命名为肌氨酸氧化酶S3。

与现有发明相比，申请人获得的肌氨酸氧化酶具有独特表现，该酶对肌氨酸的比活力为5U/mg，底物亲和力为Km =0.43mM，说明此酶具有较高活性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1：变铅青链霉菌肌氨酸氧化酶SOX原始基因的克隆

变铅青链霉菌基因组DNA为模板，进行PCR反应。反应体系：模板DNA 3μL(1ng)、上游引物（F1）2μL、下游引物(R1)2μL、10×Buffer 5μL、MgCl2（2.5mmol／L）4μL、dNTPs 4μL、rTaq DNA聚合酶0.5μL、加重蒸水至50μL。94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。引物序列如下：

F1:5’-AATGGATCCGTGTCCCCCACCTACGACGTG-3’

R1: 5’-TATCTCGAGTCATGGCTGGACTCCTCG-3’

实施例2：利用易错PCR构建随机突变体库

采用提高基因扩展模板浓度和增加PCR循环数的方式来提高扩增错配率，易错PCR反应程序为：实施例1得到的DNA扩增产物为模板，进行PCR反应。反应体系同实施例1，共45个循环，其中所用的基因组模板DNA量为50ng。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。易错PCR产物回收后，经BamHI-XhoI双酶切、酶连到pGEX-6p-1-BamHI-XhoI双切载体上，转入大肠杆菌E.coli DH5α，构建得到随机突变文库。

实施例3：初筛筛选酶高度特异性的突变体和酶活性提高的突变体

突变文库的筛选方法按以下两种方法分别操作进行：1).筛选高特异性突变体，挑取克隆子至96孔深孔板液体培养到对数生长期，加入T7噬菌体和IPTG（至终浓度为0.1mM），在37℃条件下振荡培养6h后，吸取上清159μL加入到96孔微孔板中，先后加入20μL 0.32mg/mL的 N-甲基-D-天冬氨酸，N-甲基-D (L)-丙氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、N-甲基-D (L) -撷氨酸和肌氨酸至终浓度50mM，以及1μL 5U/mL辣根过氧物酶、4-氨基安替比林2.5mmol/L和二水合N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐1.2mmol/L，混匀后放置25℃反应8h。利用酶标仪检测450nm吸光值，筛选出只针对肌氨酸特异性催化的克隆子。经过筛选了1000克隆子后，筛选获得了12个对肌氨酸氧化特异性性提高的突变体SOX1-12。2). 筛选高活性的突变体，将待测的菌体细胞用超声波进行破壁,离心(15min )后取上清酶液0.l m L加入到0.9 mL ( p H 8.0 , 25℃)含有0.l mol/L肌氨酸的焦磷酸钠缓冲溶液( 0.l mol/L)中,于37℃反应10 min后加入0.25 m L浓度为1.0 mol/L的醋酸终止反应, 并加入1.5m L含有0.04% 乙酰丙酮的20% 乙酸铵溶液, 于37℃保温40 min后在410 nm处测定O D值。酶活定义为: 37℃每分钟分解1μmol 肌氨酸的酶量为一个酶活单位，获得了8株酶活性提高的突变体H1-8。

实施例4利用DNA shuffling技术重组有益突变位点

对随机突变文库按实施例3操作筛选了8个活性提高的克隆子和12个特异性专一的12个克隆子后，以此20个DNA为模板基因，进行DNA shuffling实验以重组有益突变位点，筛选获得了3个特异性对肌氨酸催化活性提高的突变体，分别命名为SOX1、SOX2、 SOX3。具体步骤如下所述：

（一）模板基因的扩增

使用Taq DNA聚合酶扩增筛选得到的不同突变体SOX基因，以pGEX-6p-1多克隆位点两端的序列设计通用引物，该通用引物名称及DNA序列如下：

F1:5’-AATGGATCCGTGTCCCCCACCTACGACGTG-3’

R1: 5’-TATCTCGAGTCATGGCTGGACTCCTCG-3’

PCR反应体系见实施例1，PCR的循环程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。产物回收经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用微量紫外分光光度计测定片段浓度，等量混合后放入60℃温箱6h，烘干水分至浓度达到40ng/μL。

（二）酶切DNA片段

本实施例采用酶切法进行DNA片段的打断和重排。

1）以构建获得的重组质粒为模板，分别用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对20个重组质粒进行双酶切，回收基因片段，下一步选择限制性内切酶①BseX3Ⅰ、②NIaⅢ对回收的基因片段进行酶切，酶切后采用1.5％琼脂糖凝胶电泳。

（三）无引物PCR 上步获得的酶切片段作为模板进行一次无引物PCR。无引物PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，42℃退火30sec，72℃延伸20sec+1sec/循环，共进行70个循环；72℃保温10min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。再以上步无引物PCR产物混合为1管作为模板，进行2次无引物PCR（反应体系同上步），1.5％琼脂糖凝胶电泳。

（四）有引物PCR 以上一步二次无引物PCR产物作为模板，进行有引物PCR，获得大小正确的目的条带，1.5％琼脂糖凝胶电泳。用DNA回收试剂盒回收纯化PCR产物，并经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切，分别连接到pTrc99a载体上，重组质粒pTrc99a利用CaCl2转化法转化至大肠杆菌JM109，构建随机突变体库。

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸70sec，共30个循环；72℃保温10min。反应结束后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。

（五）构建突变文库和筛选：

纯化后的有引物PCR扩增片段、质粒pGEX-6p-1分别用BamHI和XhoI进行双酶切反应。有引物PCR扩增片段、pGEX-6p-1-BamHI/XhoI载体经双酶切回收后，使用T4DNA Ligase于4℃连接过夜。构建含有肌氨酸氧化酶突变组合片段的重组质粒酶连体系，然后电击转化（使用0.2cm电击杯，电压2.5kV）E.coli DH5α高效感受态，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素抗性平板，倒置于37℃恒温培养箱。培养12小时后，随机挑取10个克隆子经液体LB培养基过夜培养后，提取重组质粒，经测序验证，获得DNA改组文库。突变文库的筛选方法按实施例3操作进行。对该DNA shuffling文库筛选了500个克隆子后，筛选获得了3个对肌氨酸氧化特异性和活性提高的突变体，按实施例3进行酶活测定以后，发现活性最高突变体为SOX3，将该突变体进行基因测序，得到突变的位点信息，序列如序列表所示。

实施例5，试剂盒的制备和使用

1）制备按照以下组成配置试剂盒R1组分和R2组分。

R1：检测试剂1

Good’s缓冲液 100mmol/L

肌氨酸氧化酶 18KU/L

肌酸脒基水解酶 40KU/L

抗坏血酸氧化酶 8KU/L

二水合N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐 1.2mmol/L

R2：检测试剂2

肌酐酰氨基水解酶 270KU/L

过氧化物酶 25KU/L

4-氨基安替比林 2.5mmol/L

2）使用方法：

空白（B）测定（U）校准（Ci）

蒸馏水（μl） 6 －－

样本（μl）－ 6 －

校准品（μl）－－ 6

试剂R1（μl） 270 270 270

混匀，37℃恒温5分钟，546nm波长，以空白管调零，测定吸光度A1

试剂R2（μl） 90 90 90

混匀，37℃恒温5分钟，空白管调零，波长546nm，测定吸光度A2。

计算ΔA＝A2-A1。

操作流程：37℃向比色杯中加入R1270μL、样本6μL，恒温3min后加入90μL试剂R2，反应3min钟后计算结果。

计算方法：肌酐（μmol/L）={[A测定2﹣A测定1×K]﹣[A空白2﹣A空白1×K]}/{[ A标准2﹣A标准1×K]﹣[A空白2﹣A空白1×K]}×校准物浓度；K=（标本体积﹢试剂Ⅰ体积）/反应液总体积=2050μl/3050μl=0.672。

实验例1.线性范围

按NCCLS的评价方案，选择低值(97μmol/L)和高值(8840μmol/L)样品各一份等量混匀产生中间值，再分别将中间值和低值，中间值和高值等量混匀，共产生5个不同值，在分析仪上用本试剂从低值到高值，然后从高值到低值对5个不同浓度的标本分别平行测定5次，经线性回归分析，得回归方程为：Y=0.9979x+2.3954，r2=1.0，说明本法试剂在肌酐浓度为2.4μmol/L -8840.0μmol/L范围内线性良好。

实验例2方法比较

按NCCLS P9-P1的评价方案，选择肌酐浓度在在25～8840μmol/L之间的临床样品60份，分别用本法(Y)和罗氏公司的肌酐测定试剂盒进行测定，将测定结果进行相关回归分析，结果本法(Y)和罗氏试剂比较，得回归方程为：Y=1.0054x+0.0973(r2=0.9992)说明二者具有良好的相关。

序列表

<110> 武汉生之源生物科技股份有限公司

华, 权高

<120> 一种突变的肌氨酸氧化酶及其在肌酐检测中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 389

<212> PRT

<213> Streptomyces lividans

<400> 1

Met Ser Pro Thr Tyr Asp Val Cys Val Ile Gly Leu Gly Gly Met Gly

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala His His Leu Ser Ala Arg Gly Ala Arg Val Leu Gly

20 25 30

Leu Glu Lys Phe Gly Pro Val His Asn Arg Gly Ser Gly His Gly Gly

35 40 45

Ser Arg Ile Thr Arg Gln Ser Tyr Phe Glu Asp Pro Ala Tyr Val Pro

50 55 60

Leu Leu Leu Arg Ala Tyr Gln Leu Tyr Glu Glu Leu Glu Arg Ala Thr

65 70 75 80

Gly Arg Asn Ile Ala Thr Leu Cys Asp Gly Val Met Ala Gly Pro Pro

85 90 95

Asp Ser Arg Thr Val Ser Gly Ser Leu Arg Ser Ala Thr Glu Trp Asp

100 105 110

Leu Ala His Glu Met Leu Asp Ala Lys Glu Ile Arg Arg Arg Phe Pro

115 120 125

Thr Leu Ala Pro Asp Asp Asp Glu Ala Ala Leu Phe Glu Ala Lys Ala

130 135 140

Gly Leu Leu Arg Pro Glu Asn Met Val Ala Ser His Leu Gln Leu Ala

145 150 155 160

Thr Arg Gln Gly Ala Glu Leu Arg Phe Glu Glu Pro Glu Leu Arg Trp

165 170 175

Glu Pro Tyr Arg Asp Gly Val Arg Val His Thr Gly Glu Asn Thr Tyr

180 185 190

Thr Ala Gly Gln Leu Val Ile Cys Pro Gly Ala Trp Ala Pro Gln Leu

195 200 205

Leu Ala Asp Ile Gly Val Pro Ile Thr Val Glu Arg Gln Ile Met Tyr

210 215 220

Trp Phe Gln Arg Lys Gly Gly Thr Gly Pro Phe Val Pro Glu Arg His

225 230 235 240

Pro Val Tyr Ile Trp Glu Asp Ala Asp Gly Val Gln Val Tyr Gly Phe

245 250 255

Pro Ala Ile Asp Gly Pro Glu Glu Gly Ala Lys Val Ala Phe Phe Arg

260 265 270

Lys Gly Gln His Thr Thr Pro Glu Thr Ile Asp Arg Thr Val His Ala

275 280 285

His Glu Val Arg Ala Met Ala Asp His Met Ser Ala Leu Ile Pro Asp

290 295 300

Leu Pro Gly Thr Phe Leu Lys Ala Ala Thr Cys Met Tyr Ser Asn Ser

305 310 315 320

Pro Asp Glu His Phe Val Ile Ala Arg His Pro Ala His Pro Glu Ser

325 330 335

Val Thr Val Ala Cys Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Gln Phe Val Pro

340 345 350

Val Val Gly Glu Ile Leu Ala Asp Leu Ala Leu Thr Gly Ala Thr Ala

355 360 365

His Pro Ile Arg Leu Phe Asp Pro Ala Arg Leu Thr Ala Pro Ala Ala

370 375 380

Arg Gly Val Gln Pro

385

<210> 2

<211> 1710

<212> DNA

<213> Streptomyces lividans

<400> 2

acgcgtggct cccggcgggc ctcgcccccg gcaccggcgt ccacatcgag tacttcggcg 60

agaaaatccc cgcgaccgtc gccgaggagc cgctgttcga cccggagatg acccgcatcc 120

gccgctgacg accggcacgg cacgacccca ggaggtccgc agaaatgtcc cccacctacg 180

acgtgctcgt catcgggcta ggcggcatgg gcagcgccgc cgcccaccat ctctccgcgc 240

gcggcgcgcg ggtgctcggg ctggagaagt tcggcccggt gcacaaccgg ggctccggcc 300

acggcggctc ccgcatcacc cggcagtcct acttcgagga cccggcgtac gtgcccctgc 360

tgctgagggc ctaccagctg tacgaggagc tggagcgggc caccggccgg aatatcgcca 420

ccctgtgcga cggagtgatg gccggtccgc cggactcccg taccgtctcc ggctcgctgc 480

gctcggccac cgagtgggac ctcgcccacg agatgctgga cgccaaggag atccgccgcc 540

gcttccccac cctggccccg gacgacgacg aggccgccct gttcgaggcg aaggcgggcc 600

tgctgcgccc ggagaacatg gtggcctccc atctccagct cgccacccgg cagggcgcgg 660

agctgcgctt cgaggagccg gagctgcgct gggagccgta ccgggacggg gtgcgcgtgc 720

ataccggcga gaacacgtac acggccgggc agttggtgat ctgccccggc gcgtgggcgc 780

cgcagctgct cgcggacatc ggggtgccga tcaccgtgga gcggcagatc atgtactggt 840

tccagcggaa gggcggcacc gggccgttcg tgccggagcg ccaccccgtc tacatctggg 900

aggacgcgga cggcgtccag gtgtatggct tcccggcgat cgacggaccc gaggagggtg 960

ccaaggtcgc cttcttccgc aaggggcagc acaccacgcc ggagaccatc gaccggaccg 1020

tgcacgcgca cgaggtccgg gccatggcgg accacatgtc cgcgctgatc cccgatctgc 1080

ccggcacctt cctgaaggcc gccacctgca tgtactccaa cagcccggac gagcacttcg 1140

tgatcgcccg gcaccccgcg cacccggagt cggtgaccgt ggcctgcggt ttctccgggc 1200

acggcttcca gttcgtgccc gtcgtcggcg agatcctggc cgacctggcg ctgaccggcg 1260

cgaccgcgca cccgatccgc ctgttcgacc ccgcccgcct caccgccccg gccgcccgag 1320

gagtccagcc atgacgacga ccccggtctc ccccagcctg atcgccaccc tccccggctc 1380

ctactacacc gaccccgagg tcttccggcg cgagcaggag gcgctactgg agtcgatgtg 1440

gttctgcgcg gtgcgcagcg ccgacctgga ccggcccggc gccttccgta ccgtccaggt 1500

cggccgggag acgtcctcgt cacccgcgac cgcaccggcg cgctgcgtgc cttcctcaac 1560

gtctgccgcc accggggcgc ccggctgtgc accgaggacg tccggcgagg tccgccgcag 1620

tctgcaatgc ccgtaccacg cctggacgta cgggctcgtc ggccggctgg tcgccgcgcg 1680

cccaaggtga cgaagatgcc ggacgtcgac 1710

Claims

1.一种突变的肌氨酸氧化酶，其特征在于：氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码如权利要求1所述氨基酸序列的基因序列，其特征在于：能够编码如权利要求1所述的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的基因序列，其特征在于：序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种表达载体，其特征在于：含有如权利要求3所述的基因序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于：含有如权利要求4所述的表达载体。

6.用于测定肌酐的试剂盒，其特征在于：含有如权利要求1所述的肌氨酸氧化酶组分。

7.如权利要求1所述的肌氨酸氧化酶在制备用于测定肌酐的试剂中的用途。